Imunossupressores na doença inflamatória intestinal: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença

Dissertação | Trabalho de Projeto – Relatório de Execução Mestrado Integrado em Medicina 2012/2013 I IM MU UN NO OS SS SU UP PR RE ES SS SO OR RE ES S N NA A D DO OE EN NÇ ÇA A I IN NF FL LA AM MA AT TÒ ÒR RI IA A I IN NT TE ES ST TI IN NA AL L: : A An ná ál li is se e d da a c ca as su uí ís st ti ic ca a d do o C Ce en nt tr ro o H Ho os sp pi it ta al la ar r d do o P Po or rt to o e e c co on nt tr ri ib bu ut to o p pa ar ra a o o e es sc cl la ar re ec ci im me en nt to o d da a f fi is si io op pa at to ol lo og gi ia a d da a d do oe en nç ça a. . Rita Ribeiro Dias Orientador (a): Doutora Paula Lago Porto, 2013 IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução i IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Aluno (a): Rita Ribeiro Dias Aluna do 6º ano do Mestrado Integrado em Medicina do Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto. E-mail: [email protected]; Telemóvel: 911542805 Orientador: Doutora Paula Maria Lago Vieira Santos Médica, especialista em Gastrenterologia, assistente hospitalar graduada Centro Hospitalar do Porto / Hospital Geral de Santo António. E-mail: [email protected]; Telemóvel: 962860392. Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto Rua de Jorge Viterbo Ferreira, n.º228, 4050-313 PORTO Telefone: 220 428 000 IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução ii PREÂMBULO Este trabalho, apresentado para fins de obtenção do grau de Mestre em Medicina, integra um projeto desenvolvido no âmbito da Disciplina de Iniciação à Investigação Científica (DIIC) do Curso de Mestrado Integrado em Medicina (MIM) do Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto (ICBAS/UP) e do Centro Hospitalar do Porto (CHP) e está estruturado em duas partes: proposta de projeto de investigação e respetivo relatório de execução A proposta de projeto foi elaborada durante o ano letivo 2011/2012 e o projeto foi executado durante o ano letivo 2012/2013. O projeto foi executado no Serviço de Gastrenterologia e de Hematologia Clinica, nomeadamente no Laboratório de Citometria do Centro Hospitalar do Porto sob orientação da Doutora Paula Lago, médica especialista em Gastrenterologia, e sob supervisão da Professora Doutora Margarida Lima, responsável pela DIIC. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução iii AGRADECIMENTOS À Dra. Paula Lago, pela disponibilidade para me orientar neste trabalho, pelo apoio e tempo que dedicou, pelos esclarecimentos e por toda a motivação e confiança que me transmitiu À Professora Doutora Margarida Lima, por ter criado as condições para a conceção deste trabalho, pela dedicação e pela incansável paciência, por toda a ajuda em todos os momentos, e por me ter feito gostar ainda mais da investigação. Ao Dr. João Rodrigues, Técnico Superior de Saúde, pela ajuda no laboratório de citometria. À minha família e amigos, por me terem compreendido e apoiado nos dias menos bons, e por contribuírem tanto para que seja quem sou e tenha chegado onde cheguei. Em especial à Vânia, por me fazer ver as dificuldades como um desafio, por acreditar e me fazer acreditar, por tudo e porque sem ela eu também não teria conseguido. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução iv RESUMO Introdução A Doença Inflamatória Intestinal (DII) está ainda envolta em muitas interrogações, quer no que respeita à fisiopatologia, quer em relação ao tratamento. A fisiopatologia desta doença, parece envolver múltiplos fatores genéticos e ambientais que condicionam um desequilíbrio imunológico determinante para a génese da doença; a este respeito, existem algumas evidências de que os monócitos CD14+CD16+, devido à sua maior capacidade de apresentação antigénica e ao seu perfil de secreção de citocinas, tenham um papel na perpetuação da inflamação. No que respeita ao tratamento, os imunossupressores têm evoluído como uma importante arma terapêutica, sendo importante um adequado conhecimento da sua aplicabilidade e limitações. Objetivos Este estudo teve como principais objetivos caracterizar a utilização de imunossupressores nos doentes com DII no Centro Hospitalar do Porto (CHP), e estudar a sua influência sobre a subpopulação de monócitos circulantes CD14+CD16+. Material e Métodos O projeto de investigação proposto é de natureza observacional e teve duas componentes: uma, de carácter transversal, que consistiu na caracterização da utilização de fármacos imunossupressores nos doentes seguidos na consulta de Doença Inflamatória Intestinal do CHP, através da consulta dos respetivos processos clínicos; e outra, longitudinal e prospetiva, que visou o estudo laboratorial de um grupo de doentes com indicações clínicas para terapêutica com imunossupressores, em que se pretendeu avaliar os níveis de monócitos CD14+ CD16+ em amostras de sangue, antes e três meses após o início do tratamento. Resultados Dos 914 doentes com DII, 385 (42.1%) necessitaram de tratamento com um 1º imunossupressor e 40 (10.4%) tiveram necessidade de tratamentos com um 2º imunossupressor. Em ambas as situações, os imunossupressores foram utilizados com mais frequência na Doença de Crohn (DC). O fármaco mais utilizado como primeiro imunossupressor foi uma tiopurina em 97,7% dos pacientes, enquanto o metotrexato (MTX) foi o mais utilizado como segundo imunossupressor em 97.5% dos pacientes. As reações adversas ocorreram sobretudo com o primeiro imunossupressor em 43.7% destes doentes e foram o principal motivo de suspensão ou substituição do fármaco. Os doentes com DII medicados com corticosteróides apresentavam uma depleção dos monócitos CD14+CD16+ no sangue periférico. Os indivíduos com DII, sem corticoterapia, tiveram uma diminuição estatisticamente significativa da percentagem IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução v (p=0.008) e do número absoluto (p=0.004) de monócitos CD14+CD16+ circulantes, durante o tratamento com azatioprina (AZA). Conclusão: Os imunossupressores convencionais, particularmente a tiopurina, continuam a ser uma importante estratégia terapêutica na DII. Os pacientes sob tratamento com estes fármacos devem ser avaliados regularmente, uma vez que eles acarretam um número considerável de reações adversas. A AZA parece influenciar a percentagem de monócitos CD14+CD16+ no sangue periférico de pacientes com DII, mas estudos randomizados e de maiores dimensões serão essenciais para melhor caracterizar o seu papel sobre estas populações. Palavras-chave: Doença inflamatória intestinal, Colite ulcerosa, Doença de Crohn, Imunossupressores, Azatioprina, Metotrexato, Monócitos CD14+CD16+. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução vi ABSTRACT Background There are still several uncertainties regarding Inflammatory Bowell Disease (IBD), either concerning its physiopathology or its treatment. The physiopathology of this condition seems to involve multiple genetic and environmental factors, conditioning an immunologic unbalance, which is paramount to IBD development. Respecting this matter, there is some evidence that CD14+CD16+ monocytes have a significant role perpetuating inflammation, due to their higher ability of antigenic presentation and to their cytokine secretion. Immunosuppressive drugs have evolved as an important therapeutic weapon in IBD, which justifies a further acknowledgement of their applicability and limitations. Objectives We aim to characterize use immunosuppressive drugs in patients with IBD from a central hospital and to investigate their influence on a subpopulation of circulating CD14+CD16+ monocytes. Material and methods This research project has an observational nature and it is divided in two components. It was used a cross-sectional approach in order to characterize use of immunosuppressive drugs in patients followed in IBD consultation at Centro Hospitalar do Porto. Data was collected by reviewing their medical history files. The other component of this study had a prospective longitudinal approach, aiming to assess CD14+CD16+ monocytes levels from blood samples, collected before treatment initiation and three months after, in a group of patients who had indication for immunosuppressive therapy. Results We evaluated 914 patients with IBD, of which 385 (42.1%) needed treatment with a first immunosuppressive drugs and 40 (10.4%) needed treatment with a second immunosuppressive drugs. In both cases, the immunosuppressive drugs were used mainly in CD. The drug most frequently used as first immunosuppressive drug was a thiopurine in 97.7% of patients, while metothrexate was used as second choice in 97.5% of patients. Adverse reactions occurred especially with the first immunosuppressive drug, in 43.7% of those patients and it was the main reason to stop or replace the treatment. CD14+CD16+ monocytes were depleted in patients treated with corticosteroids. Patients with IBD, without corticosteroid treatment, showed a significant decrease both in the percentage (p=0,008) and in the absolute count (p=0-004) of CD14+CD16+monocytes in peripheral blood, during the therapy with azathioprine (AZA). IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução vii Conclusions Traditional immunosuppressive drugs namely thiopurines, are still an important strategy in IBD therapy, but patients under this treatment should be regularly evaluated, because these drugs are associated with a considerable number of adverse reactions. AZA seems to influence CD14+CD16+ monocytes proportion in peripheral blood among patients with IBD. Despite these findings, the conduction of randomized controlled trials with larger sample size is paramount to further assess the role of AZA in this population. Keywords: Inflammatory Bowel Disease, Ulcerative Colitis, Crohn’s Disease, Immunossupressor, Azathioprine, Metothrexate, CD14+CD16+ monocytes IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução viii ÍNDICE PROPOSTA DE PROJETO DE INVESTIGAÇÃO ................................................. 1 PLANO CIENTIFÍCO ................................................................................................ 2 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 3 ENQUADRAMENTO TEÓRICO / ESTADO DA ARTE ................................................... 5 Doença inflamatória intestinal .................................................................................... 5 Etiopatogenia e fisiopatologia da doença inflamatória intestinal ................................. 8 Tratamento da doença inflamatória intestinal ............................................................11 FUNDAMENTOS DO ESTUDO ....................................................................................20 Problemas ................................................................................................................20 Questões ..................................................................................................................20 Objetivos do estudo ..................................................................................................20 INTERVENIENTES ......................................................................................................21 Instituições, Departamentos e Serviços ....................................................................21 Equipa de Investigação .............................................................................................21 METODOLOGIA ..........................................................................................................24 Critérios de revisão da literatura ...............................................................................24 Desenho do estudo ...................................................................................................24 PLANO DE TRABALHO ...............................................................................................26 Tarefas associadas ao projecto ................................................................................26 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................30 Revisão casuística ....................................................................................................30 Estudo laboratorial ....................................................................................................30 Análise estatística dos dados....................................................................................30 Equipamento ............................................................................................................30 Reagentes e outro material consumível ....................................................................30 CALENDARIZAÇÃO ....................................................................................................31 Duração ....................................................................................................................31 Datas de início e conclusão ......................................................................................31 CRONOGRAMA GLOBAL DAS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS .................................................31 Cronograma de execução do projeto ........................................................................32 INDICADORES DE PRODUÇÃO .................................................................................33 Comunicações orais e posters ..................................................................................33 Trabalhos escritos ....................................................................................................33 QUESTÕES ÉTICAS .............................................................................................. 34 INFORMAÇÃO DOS PARTICIPANTES E CONSENTIMENTO INFORMADO ..............35 Informação dos participantes ....................................................................................35 Consentimento informado .........................................................................................35 Outras questões com implicações éticas ..................................................................35 PLANO FINANCEIRO ............................................................................................ 36 ORÇAMENTO ..............................................................................................................37 FINANCIAMENTO........................................................................................................37 GLOSSÁRIO .......................................................................................................... 38 IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 5 ENQUADRAMENTO TEÓRICO / ESTADO DA ARTE A DII engloba a DC e a CU, duas patologias inflamatórias, crónicas e idiopáticas que atingem o trato gastrointestinal. As duas categorias nosológicas caracterizam-se por apresentarem aspetos clínico-patológicos que se sobrepõem, e outros dos quais diferem claramente. A patogénese da DII não está completamente compreendida. Parecem existir factores genéticos e ambientais, como a modificação das bactérias luminais e/ou aumento da permeabilidade intestinal, que desempenham um papel importante na má regulação da imunidade intestinal, levando à lesão gastrointestinal. Estas complexas desordens podem ter uma ampla gama de manifestações e complicações e o seu tratamento irá depender de vários factores distintos, tais como a localização da doença, a sua severidade, e a existência ou não de complicações. O tratamento dos pacientes com DII, deve ser individualizado e adequando a cada caso, com base no alívio sintomático e na tolerância a terapêuticas médicas específicas. O tratamento médico é sequencial, primeiro tratando a doença na sua fase aguda, e posteriormente, visando a manutenção da remissão. O tratamento cirúrgico pode ser necessário, e deve ser pensado perante a existência de estenoses obstrutivas, lesões cancerosas ou pré-cancerosas, complicações supurativas ou doença refratária à terapêutica médica. (13) No que respeita à terapêutica médica da DII, esta abrange os aminosalicilatos, corticosteróides, imunossupressores e fármacos biológicos, embora em alguns casos, nomeadamente, na terapêutica de curta duração da DC, se recorra ainda aos antibióticos (14). Nas últimas décadas, os avanços no conhecimento da fisiopatologia destas doenças, o surgimento de novos fármacos, bem como o conhecimento da existência de factores modificadores aquando do diagnóstico, e de factores predisponentes para doença complicada culminaram em alterações significativas na terapêutica da DII (5). Doença inflamatória intestinal Doença de Crohn A DC pode atingir qualquer parte do trato gastrointestinal, desde a boca até ao ânus, caracterizando-se por envolvimento focal e transmural, além de poder ainda apresentar manifestações extraintestinais. Muitos esforços têm sido feitos nos últimos anos, para melhor perceber a fisiopatologia desta doença, e assim tornar a sua classificação mais precisa, de formar a conseguir um melhor aconselhamento dos pacientes, prognóstico, e escolha da IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 6 terapêutica adequada a cada subtipo. A classificação atualmente usada para a DC, – classificação de Montreal, resultou de uma revisão da classificação de Viena, definida em 1998 (15). Mantendo os mesmos 3 parâmetros chave, já previamente estabelecidos, idade de diagnóstico, localização e comportamento da doença, a classificação de Montreal, distingue-se sobretudo pelas modificações realizadas em cada um destas componentes (16). (Quadro 1) Quadro 1. Classificação de Viena e de Montreal para a Doença de Crohn Fonte: J Satsangi, M.S.S., S Vermeire, J-F Colombel, The Montreal classification of inflammatory bowel disease: controversies, consensus, and implications. Gut, 2006. 55: p. 750 A doença pode atingir qualquer grupo etário, sendo mais frequentemente diagnosticada no final da adolescência e início da vida adulta (17). O diagnóstico baseiase em características endoscópicas, imagiológicas e histológicas, para além dos achados sintomáticos, físicos e laboratoriais (18). Apresenta uma elevada heterogeneidade de manifestações, podendo surgir insidiosamente, apresentar características que se sobrepõem a outras doenças inflamatórias ou apresentar-se inicialmente sem manifestações gastrointestinais, o que no seu conjunto contribui para a dificuldade inerente ao diagnóstico (19). Enquanto doença crónica, não é curável por via farmacológica nem cirúrgica, necessitando de intervenções terapêuticas para induzir e manter o controlo sintomático, melhorar a qualidade de vida e minimizar as complicações e toxicidade a curto e longo prazo (20). Os sintomas principais englobam diarreia crónica ou noturna, dor abdominal, perda de peso, vómitos, febre e/ou sangramento, e os sinais acompanhantes podem incluir palidez, caquexia, massa ou dor abdominal e/ou fistulas, fissuras ou abcessos perianais (21), (22). As manifestações clínicas que surgem com a DC, vão depender IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 7 sobretudo do comportamento da doença – estenosante, penetrante, ou não estenosante e não penetrante, e da localização – tubo digestivo alto ou baixo (íleon, íleon e cólon ou cólon), além da existência ou não de envolvimento perianal, da idade de início e da concomitância de manifestações extraintestinais (23), (24), (25). Os sintomas extraintestinais associados à DC podem advir do envolvimento de diferentes sistemas, desde músculo-esquelético, dermatológico, hepatobiliar, ocular, renal e pulmonar, o que constitui um enorme desafio para os profissionais que lidam com estes doentes (26). Colite Ulcerosa A CU é uma patologia crónica e recidivante, que se apresenta como inflamação intestinal não transmural, estando o atingimento do trato gastrointestinal limitado ao cólon, apesar de poder cursar, tal como a DC, com manifestações extraintestinais. A CU é a forma mais comum de doença infamatória intestinal em todo o mundo (27). É menos propensa a complicações, uma vez que o seu curso é leve em 40-50% dos pacientes. Contudo, os pacientes que apresentam um atingimento mais extenso pela doença, estão sob maior risco de necessidade de cirurgia (28). A classificação de Montreal para a CU, tem em conta a extensão da doença, que pode variar ao longo do tempo, e permite a sua classificação em três subgrupos (29), (30). Esta classificação é relevante em termos biológicos, sobretudo para efeitos de prognóstico de resposta à terapêutica. Outros importantes factores preditores de prognóstico e que apresentam relação com a classificação de Montreal incluem as taxas de utilização de medicação, a hospitalização, a colectomia e o risco de malignidade (16), entre outros. (Quadro 2) Quadro 2. Classificação de Montreal para a extensão da Colite Ulcerosa Fonte: J Satsangi, M.S.S., S Vermeire, J-F Colombel, The Montreal classification of inflammatory bowel disease: controversies, consensus, and implications. Gut, 2006. 55: p. 750 IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 8 O diagnóstico de CU efetua-se conjugando dados da apresentação clínica, endoscópicos e histológicos. É também fundamental excluir potenciais imitadores da doença, causadores de colite infecciosa, através da pesquisa de microrganismos infeciosos nas fezes (19), (31). As manifestações clínicas mais comuns, incluem tenesmo e diarreia sanguinolenta ou mucolenta e dor abdominal, e no que respeita às manifestações extraintestinais, são semelhantes às já referidas para a DC, sendo sobretudo reumatológicas, hepáticas, dermatológicas e oftalmológicas (32). Etiopatogenia e fisiopatologia da doença inflamatória intestinal Apesar dos esforços desenvolvidos para o esclarecimento da etiopatogenia e fisiopatologia da DII, os factores implicados na génese da doença e a forma como se estabelece, progride e perpetua a reação inflamatória, continuam a ser alvo de discussão na comunidade médica e científica. De facto, está ainda por esclarecer a real contribuição de diversos factores – agentes infeciosos, factores de natureza ambiental, genética, imunológica e até mesmo psicogénica. Uma das hipóteses mais apoiadas para justificar a patogenia da DII, é a do desenvolvimento de uma resposta imune excessivamente agressiva, a uma população de bactérias comensais entéricas, em indivíduos geneticamente suscetíveis, sendo o início e as recidivas da doença despoletadas por factores ambientais (33). Foram já identificados genes e mutações associados à DC. O gene mais extensivamente estudado é o NOD2, localizado no cromossoma 16 (34), (35), sendo a principal mutação envolvida a CARD15/NOD2 (36). Enquanto a doença estenosante, o surgimento precoce de manifestações e/ou as fistulas parecem ser mais comuns nos doentes com a variante NOD2 (37), a DC ileal associa-se mais frequentemente à variante CARD15 (33). Um outro gene que apresenta relação com a DII é o gene de resistência a múltiplas drogas tipo 1 (MDR1, do inglês Multiple Drug Resistance type 1), sobretudo no que respeita à CU (38). A sua importância reside sobretudo na associação que parece ter com a refratariedade à terapêutica (39), e no facto de se ter verificado que ratos nos quais o MDR1 fora deletado, desenvolveram CU (40). Está também demonstrado que a imunidade da mucosa dos pacientes com DII sofre importantes alterações (41). Quer a resposta imunitária inata, quer a adaptativa estão ativadas na DC e CU, verificando-se um maior recrutamento de células efetoras do sistema imunitário, e consequentemente libertação de citocinas pro-inflamatórias, culminando na perda de tolerância aos comensais entéricos (33). Além disso, a sobrevida destas células parece estar aumentada, como consequência da diminuição da apoptose celular (33). IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 9 A flora entérica microbiana parece agir como indutor da DII, por originar uma inflamação intestinal crónica (33). Vários estudos verificaram que animais criados sob condições isentas de flora microbiana, não desenvolviam inflamação intestina (42). Já nos seres humanos, tem sido demonstrada a existência de vários anticorpos séricos contra microrganismos, o que favorece a suspeita de uma reatividade imune contra microrganismos intestinais. Contudo, até à data, não está ainda completamente compreendido de que forma a flora entérica causa a inflamação crónica. Duas das hipóteses, incluem uma perda transitória da barreira da mucosa, que despoleta a doença, e num indivíduo geneticamente suscetível progride para a cronicidade, e a existência de uma infeção persistente ou transitória, que com a rutura da barreira, favorece o início do processo inflamatório (41). Vários factores ambientais são também conhecidos, como estando implicados na DII. Destes destacam-se o tabaco, protetor na CU, mas fator de risco na DC, a dieta, o uso de antibióticos e de anti-inflamatórios não esteroides (AINE), o stress e a infeção. Estes factores parecem agir sobre a integridade da barreira mucosa, a resposta imunológica e o microambiente luminal, exercendo assim a sua ação na alteração da suscetibilidade à inflamação (17). Apesar da etiologia da DC e CU ser ainda bastante incompreendida, sabe-se que, a infiltração da lâmina própria por linfócitos e leucócitos ativados parece ser um contributo bastante importante para o desenvolvimento da inflamação intestinal e para a sua perpetuação (43), (44) . Papel dos monócitos CD14+CD16+ Os monócitos desempenham importantes papéis na imunidade e defesa dos indivíduos. Exercem as suas funções através da fagocitose de microrganismos opsonizados, digestão, processamento e apresentação de antigénios estranhos; libertam também uma grande quantidade de moléculas intervenientes na inflamação (45). Nos humanos, os monócitos circulantes são divididos em duas subpopulações, com base na expressão de CD14, o recetor para o lipopolissacarídeo das bactérias Gram negativas (LPS, do inglês Lipolysaccharide), e de CD16, o recetor tipo III para o fragmento Fc da IgG (Fcγ RIII) (46). Estas subpopulações monocitárias expressam diferentes moléculas na membrana (recetores celulares, moléculas de adesão, etc.) e produzem diferentes mediadores da resposta imune, nomeadamente citocinas (47). A subpopulação clássica de monócitos, distintamente mais abundante no sangue periférico, expressa um alto nível de padrão de reconhecimento para o recetor CD14, sem coexpressar CD16, sendo por isso designada CD14+forteCD16ou, simplesmente, IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 10 CD14+CD16- (48). Esta população produz caracteristicamente citocinas anti-inflamatórias, como a IL-10 (45). Ziegler-Heitbrock et al, descreveram, em 1988, a existência de uma outra subpopulação de monócitos, que coexpressa CD16 e baixos níveis de CD14 (CD14+fracoCD16+ ou, simplesmente, CD14+CD16+), tendo esta sido estudada por citometria de fluxo (49). Um ano depois, uma descrição mais detalhada do fenótipo e função destas células, demonstrou que se tratava realmente de um tipo único de monócitos (46). Os monócitos CD14+CD16+ exibem um padrão de produção de citocinas distinto, com baixa produção de IL-10, mas altos níveis de produção de moléculas proinflamatórias, como TNF-α, IL-1 e IL-2, além de serem mais eficientes enquanto células apresentadoras de antigénios (APC, do inglês Antigen Presenting Cells), comparativamente aos monócitos CD14+CD16- (50), (51). Os monócitos CD14+CD16+ apresentam altos níveis de HLA-DR, o que permite predizer uma grande atividade de apresentação de antigénios nestas células (46). Para além disso, os monócitos podem diferenciar-se em macrófagos ou células dendríticas, sendo que, os monócitos CD14+CD16+ migram e originam preferencialmente células dendríticas, com uma capacidade de aloestimulação superior (52). Estas duas subpopulações de monócitos, CD14+CD16e CD14+CD16+, apresentam um perfil distinto de expressão de recetores de quimiocinas, o que lhes confere a capacidade para migrarem para diferentes tipos de tecidos e em diferentes condições fisiológicas, em resposta a diferentes quimiocinas. Assim, enquanto os monócitos CD14+CD16expressam altos níveis dos recetores de quimiocinas CCR1, CCR2 e CXCR2 e baixos níveis de CXC3CR1, os monócitos CD14+CD16+, expressam níveis elevados de CX3CR1 e baixos níveis de CCR2 (53) (54). Consequentemente, os primeiros respondem à quimiocina CCL-2 (também designada MCP-1, Monocyte Chemotactic Protein-1), enquanto os segundos parecem responder à quimiocina CX3CL1 (também designada fractalcina), tal como verificado em ensaios de migração transendotelial (54). Vários estudos mostraram que, a migração dos monócitos para os locais de inflamação, é mediada pela quimiocina CCL2 (50). No entanto, estudos in vivo relativos à migração desta população, verificaram que, a subpopulação CD14+CD16+, não migrava em resposta a CCR2, facto que é consistente com a ausência de CCR2 nestas células (53). Posteriormente, Ancuta et al, demonstraram que, os monócitos CD14+CD16+ migravam em resposta a CX3CL1 e CXCL12 (54), e observaram que estes monócitos aderiam mais fortemente ao endotélio, o que em parte seria mediado por CX3CL1, expresso na superfície das células endoteliais (55). IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 11 Com as descobertas feitas em torno dos monócitos CD14+CD16+, sugeriu-se que estes desempenhassem um importante papel na patogénese das doenças inflamatórias (56). Em várias doenças, foi entretanto observado uma expansão desta população celular, nomeadamente na sépsis bacteriana (57), e na artrite reumatoide (58), entre outras. Já vários estudos demonstraram aumentos significativos dos níveis de monócitos CD14+CD16+ em pacientes com DC ativa (56), facto que não foi verificado em pacientes com doença quiescente. No estudo de S. Koch et al, o sangue periférico de voluntários saudáveis e de pacientes com DC quiescente e ativa foi analisado por citometria de fluxo, tendo-se observado que nos indivíduos saudáveis, a contagem de monócitos CD14+CD16+ foi apenas de aproximadamente 10%, enquanto nos indivíduos com DC ativa foi de aproximadamente 18.9%, contrastando com os 12,1% dos pacientes com doença quiescente (56). No que diz respeito à CU, os dados até há data são relativamente controversos, com autores a negarem a elevação significativa desta subpopulação monocitária nos indivíduos com CU ativa, e outros a demonstrarem resultados vantajosos perante a leucaferese em pacientes com CU (59). Tratamento da doença inflamatória intestinal  Antibióticos A utilização dos antibióticos (ATB) na DII, baseia-se na evidência de que a flora bacteriana intestinal poderá estar implicada na patogénese da doença (60). Nestes pacientes, parece existir um número aumentado de bactérias agressivas, tais como Bacterioides, Escherichia coli e Enterococcus, e um número reduzido de bactérias protetoras como os Lactobacilos e Bifidobacterias (61). O conhecimento do importância das bactérias na indução e perpetuação da doença permitiu assim, colocar a hipótese de que a manipulação da flora microbiana poderia ser terapêutica, e estudar os antibióticos como armas no tratamento da DC e CU. O metronidazol é o ATB mais estudado para a DC. Não existem ainda evidências científicas consistentes, no que respeita à sua eficácia na indução de remissão, comparativamente a controlos e a outros ATB estudados (62), no entanto, ele parece reduzir o índice de atividade da doença (63). A ciprofloxacina é outro ATB utilizado na DC, cuja eficácia parece ser comparável à da mesalanina (64). Este fármaco mostrou-se também importante quando utilizado como terapia combinada, em pacientes com doença resistente (65). Para o tratamento da DC, os ATB estão indicados quando existem complicações sépticas, doença perineal e se estiver presente sintomatologia atribuível a um supercrescimento bacteriano (66). IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 12 A utilização de ATB’s na CU é ainda controversa, e não existem evidências científicas que a suportem. Contudo, eles são empregues com alguma frequência, sobretudo como terapia adjuvante na doença severa. O metronidazol é o principal ATB utilizado na CU, tendo apresentado resultados vantajosos na indução da remissão da doença grave, quando combinado com corticosteroides (67).  Derivados do ácido 5-aminosalicilico Os derivados do ácido 5-aminosalicilico (5-ASA), estiveram durante várias décadas, a par com os corticosteroides, na base da terapia farmacológica da DII (68). Parecem atuar localmente na mucosa intestinal, reduzindo a inflamação através de vários processos anti-inflamatórios. A sulfassalazina (salazopirina) é o fármaco protótipo do grupo dos aminosalicilatos, mas a messalazina é atualmente o aminosalicilato mais usado neste âmbito (69), (70). A sulfassalazina foi o primeiro fármaco do grupo dos 5-ASA a ser utilizada no tratamento da DII. Contudo, foi associada a reações alérgicas e a um número significativo de efeitos secundários, devido à intolerância ao seu componente sulfapiridina, o que limita a sua utilização. Por este motivo foi necessário desenvolver preparações que protegessem o 5-ASA da degradação gástrica. Uma das preparações consiste na incorporação do 5-ASA num pró-fármaco, no qual está covalentemente ligado a um transportador inativo, enquanto a outra compreende a sua incorporação num revestimento acrílico, sensível ao pH, que atrasa a sua libertação para o cólon distal (69). Os 5-ASA constituem um grupo de fármacos seguros, que podem ser administrados por via oral ou rectal, para tratamento da inflamação em diferentes zonas do trato gastrointestinal. São sobretudo utilizados no tratamento da CU leve a moderada, e como terapêutica de manutenção durante a remissão, mostrando-se geralmente eficientes e bem tolerados (70), (71). No que à DC diz respeito, apesar de em tempos terem sido largamente utilizados, aparentam ter um papel bastante mais limitado (68), não existindo estudos suficientes que permitam concluir sobre a sua utilização, nomeadamente em tratamento de manutenção (70), (72).  Corticosteróides Os corticosteróides são bastante usados no tratamento de uma ampla gama de doenças autoimunes e inflamatórias, entre as quais a CU e DC. São fármacos que atuam suprimindo a inflamação, através do bloqueio das suas manifestações iniciais. As consequências tardias resultantes da inflamação, como a ativação de fibroblastos, proliferação vascular e deposição de colagéneo, são também suspensas. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 13 Adicionalmente, os corticosteróides interferem ainda na resposta dos linfócitos T aos antigénios, diminuem a produção de citocinas inflamatórias e interferem com a produção do fator de necrose tumoral КB (73). Os corticosteróides podem ser usados por via oral e sob a forma de enemas, isoladamente ou em associação com outros fármacos, tendo aplicação quer na DC, quer na CU. Na CU, a corticoterapia continua a ser um ponto-chave da terapêutica médica, com aplicação sistémica na fase aguda da colite moderada a severa e utilizada topicamente e como segunda linha no tratamento agudo da proctite ou proctosigmoidite em pacientes intolerantes ou sem resposta à mesalanina (74). Não existem evidências que suportem a sua utilização como terapêutica de manutenção. Na DC os corticosteróides são também muito importantes na indução da remissão, sendo usados no tratamento da doença moderada a severa. O budesonido pode ainda ser utilizado na doença ileal ligeira ou ileo-cólica ligeira a moderada, e é frequentemente utilizado como complemento de outros fármacos (75). Os corticosteróides não são recomendados como terapêutica de manutenção e em alguns pacientes a doença pode ter uma evolução corticodependente ou corticorresistente (66).  Imunossupressores Azatrioprina e 6-Mercaptopurina A AZA e a 6-MP são os principais imunossupressores utilizados na DC e CU. Estes fármacos pertencentes à classe das tiopurinas, possuem um metabolismo complexo, ainda não completamente compreendido. A AZA é metabolizada a 6-MP, que por sua vez é metabolizada em 6-tioisonina 5’-monofosfato. Este último é convertido em 6-TGN, o metabolito ativo que conduz à inibição da síntese do DNA e RNA, e assim, à apoptose das células T. A 6-MP pode ainda ser metabolizada em ácido 6-tiourico pela enzima xantina oxidase ou em 6-metil mercaptopurina (6-MMP) pela enzima tiopurina metil-transferase (TPMT), dando assim origem a metabolitos inativos. As 3 enzimas que metabolizam a 6-MP estão em constante competição pelo substrato, sendo que os metabolitos originados dependem da concentração destas enzimas (76). A atividade da TPMT é determinada geneticamente (77). Em aproximadamente 0.3% da população geral, esta enzima encontra-se ausente ou apresenta baixos níveis de atividade, em 11% apresenta níveis intermediários de atividade, e 89% tem níveis normais ou elevados da TPMT. No entanto, estudos anteriores revelaram que apenas ¼ dos casos de leucopenia, tinham como causa este polimorfismo genético (76). A principal preocupação no que respeita aos efeitos secundários a curto prazo da 6-MP e AZA é a supressão medular, que ocorre em cerca de 2 a 5% dos pacientes IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 14 tratados com estes agentes, sendo a leucopenia a manifestação mais comum (78), (79). Este efeito relaciona-se com a dose, e é controlado com a sua redução, ou suspensão do fármaco, recomendando-se a monitorização rotineira através de contagem de células sanguíneas. Alguns autores aconselham a obtenção de um hemograma completo, que nas primeiras quatro semanas deverá ser obtido semanalmente, nas quatro seguintes, de duas em duas semanas, e posteriormente a cada 1 ou 2 meses, enquanto a terapêutica com estes imunossupressores se mantiver (80). A pancreatite tem sido referida como efeito secundário, que surge em cerca de 1.3%-3.3% dos pacientes tratados com 6-MP e AZA para a DII, manifestando-se normalmente nas primeiras 3-4 semanas de tratamento. Este efeito lateral é independente da dose, sendo normalmente resolvido quando o fármaco é descontinuado. Outras manifestações que podem ocorrer numa fase inicial, incluem náuseas, vómitos e dor abdominal, mas são usualmente leves, e melhoram após algum tempo ou com a redução da dose. Reações não específicas como febre, rash e artralgias, são habitualmente independentes da dose e resolvem com suspensão do fármaco (79), (80), (81), (82). Alguns indivíduos podem ainda desenvolver reações alérgicas com a 6-MP e tolerarem a subsequente administração de AZA (83) e vice-versa (84). A hepatotoxicidade é uma complicação rara destes fármacos (82). Algumas complicações infeciosas têm sido relatadas, em vários estudos, como estando associadas à utilização de AZA e 6-MP na DC e CU. Estas incluem infeção por citomegalovirus disseminada, abcesso hepático, pneumonia, encefalite por Listeria, herpes zóster, flebite séptica com artrite, hepatite vírica, febre Q e colite por Citomegalovirus, muitas delas ocorrendo na ausência de leucopenia (79), (85), (86). No entanto, um outro estudo relativamente recente, sugeriu que o recurso a AZA e 6-MP no pré-operatório para cirurgia intestinal eletiva, não está, por si só, associado a um aumento significativo do risco de complicações infeciosas pós-operatórias, estando no entanto, este risco aumentado quando há terapêutica combinada com corticosteróides pré-operativamente. Alguns estudos têm demonstrado um ligeiro aumento do risco de linfoma nos pacientes com artrite reumatoide, tratados com AZA ou 6-MP (87), (88) (89). Vários outros estudos que examinaram o risco de linfoma em pacientes com DII tratados com os mesmos imunomoduladores levaram a conclusões díspares, relativamente a esta relação (90), (91, 92). A AZA e a 6-MP têm sido usadas desde o início dos anos 70 para o tratamento da DII. Inicialmente, eram apenas utilizadas em pacientes com DC, mas hoje em dia são consideradas igualmente eficientes no tratamento da CU. No entanto, apesar de terem já IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 21 INTERVENIENTES Instituições, Departamentos e Serviços  Centro Hospitalar do Porto (CHP) o Hospital de Santo António (HSA)  Departamento de Medicina (DM)  Serviço Gastrenterologia (SGE) o Consulta de Gastrenterologia (CGE)  Serviço Hematologia Clínica (SHC) o Laboratório de Citometria (LC) Equipa de Investigação Constituição Aluno  Rita Dias (Rita Ribeiro Dias): aluna da Disciplina de Iniciação à Investigação Clínica (DIIC) do Curso de Mestrado Integrado em Medicina (MIM) do ICBAS/UP. Orientadores do projeto  Paula Lago, (Paula Maria Lago Vieira Santos), médica, especialista em Gastrenterologia, assistente hospitalar graduada, SGE do HSA/CHP (Orientador). Supervisor da DIIC  Margarida Lima (Margarida Maria de Carvalho Lima), médica especialista em Imunohemoterapia, assistente hospitalar graduada, responsável pelo LC do SHC do HSA/CHP; Professora Auxiliar Convidada do ICBAS/UP; Regente da DIIC. Outros investigadores  João Rodrigues (João Bernardo C P S Rodrigues) Técnico Superior de Saúde (TSS) do SHC do HSA/CHP, a exercer funções na Unidade de Biologia Molecular e no LC do SHC. Funções e responsabilidades  A conceção e elaboração da proposta e a execução do projeto são da responsabilidade da Aluna;  A Orientadora acompanhará a aluna na elaboração de proposta, na execução do projeto e na análise e interpretação dos resultados; IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 22  A Regente da DIIC supervisionará todas as fases do projeto, desde a sua conceção até à apresentação dos resultados, passando pela sua execução e análise/interpretação dos dados;  Os restantes investigadores colaborarão em aspetos específicos do projeto, conforme especificado adiante. Tempo dedicado ao projeto Nome e apelido Função % Tempo de dedicado ao projeto Nº de meses Pessoas * Mês Rita Dias Aluno 15,0% 22 3,30 Paula Lago Orientador 2,5% 22 0,55 Margarida Lima Supervisor 2,5% 22 0,55 João Rodrigues Investigador 10,0% 6 0,60 Total 5,00 Condições e motivações para a realização do estudo Capacidades instaladas e recursos disponíveis: A revisão dos processos clínicos eletrónicos será realizada no SGE do HSA/CHP, em sala e computador indicados pelo orientador. A revisão dos processos clínicos em papel será realizada no Arquivo Clínico (ex.CICAP), após requisição dos mesmos, em sala reservada para tal. A colheita do sangue dos pacientes selecionados será realizada na Sala de Colheitas (ex.CICAP), após consulta de GE e encaminhamento. A análise do sangue por citometria de fluxo realizar-se-á no Laboratório de Citometria do SHC do HSA/CHP. Mérito da equipa de investigação A orientadora, Dra. Paula Lago, é médica especialista em Gastroenterologia, e com uma grande experiência na área das Doenças Inflamatórias Intestinais, nomeadamente a Doença de Crohn e a Colite Ulcerosa. É uma das profissionais que realiza no CHP a consulta de Doença Inflamatória Intestinal e têm ainda uma vasta atividade científica, traduzida pela colaboração em projetos de investigação e estudos multicêntricos e pela publicação de vários artigos científicos. As suas atividades de investigação centram-se na área da Doença de Crohn e Colite Ulcerosa, pelo que esta experiência contribui para assegurar que o presente estudo será conduzido de acordo com as Boas Práticas. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 23 Motivações pessoais para a realização do estudo As minhas motivações para a realização deste projeto e posterior trabalho de investigação, passaram, por um lado, pelo desejo de obter mais conhecimentos acerca da investigação clinica e por outro, pela área e o tipo de patologia em questão. Com este trabalho pretendo contribuir para a nível para a minha aquisição de competências na área da investigação clinica, e ambientar-me com todo o processo de realização de um trabalho de investigação, desde o seu desenho à sua execução, e ainda procurar aumentar os conhecimentos especificamente no que respeita à amostra com a qual se trabalha no CHP, numa área da qual gosto (Gastroenterologia), e em relação a doenças crónicas. Considero de extrema importância a continua investigação em doenças crónicas, uma vez que são doenças que afetam seriamente a qualidade de vida dos doentes, pelo que tudo deve ser feito no sentido de diminuir a morbilidade e até mesmo, procurar a cura para estas doenças. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 24 METODOLOGIA Critérios de revisão da literatura A revisão da literatura foi realizada, consultando, através da PubMed, artigos originais e de revisão, redigidos em inglês, indexados na Medline e publicados entre 1980 e 2012. As principais palavras-chave usadas na pesquisa foram: Doença Inflamatória Intestinal; Doença de Crohn; Colite Ulcerosa; tratamento; imunossupressores; leucaferese; monócitos CD14+CD16+. Desenho do estudo Tipo de estudo Estudo institucional de série de casos, de carácter observacional e transversal, de natureza clínica, com um componente longitudinal, prospetivo e laboratorial num subgrupo de casos. Fases do estudo O estudo será desenvolvido em duas fases: Na 1ª fase (estudo de série de casos) será efetuada a revisão casuística dos doentes com DII seguidos na CGE do CHP. Na 2ª fase será efetuado o estudo laboratorial de um subgrupo de doentes com DII que iniciem tratamento com imunossupressores (azatioprina ou metotrexato), entre Junho e Dezembro de 2012, antes e 3 meses após o início do tratamento. Universo, população e amostra Universo  Doentes adultos com DII. População  Doentes adultos com DII, seguidos na CGE do CHP. Estimamos que sejam seguidos, atualmente, nesta consulta cerca de 900 doentes com DII.  Doentes adultos com DII, seguidos na CGE do CHP, tratados com imunossupressores. Estimamos que sejam seguidos, atualmente, nesta consulta cerca de 250 doentes com DII tratados com imunossupressores. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 25 Amostra  Na primeira fase do estudo, pretende-se que a amostra coincida com a população.  Na segunda fase do estudo, a amostragem será feita de forma não aleatória, por conveniência (consecutiva) estimando-se que sejam incluídos 20 doentes. Seleção dos participantes Para o estudo de série serão selecionados os doentes com DII seguidos na CGE do HSA/CHP entre 1980 e 2012. Para o estudo laboratorial serão selecionados os doentes com DII que iniciarem tratamento com imunossupressores entre Julho de 2012 e Novembro de 2012. Critérios de elegibilidade Critérios de inclusão 1ª Fase: Ter diagnóstico de DII estabelecido com base nos critérios de LennardJones (141, 142); ser seguido na Consulta de GE do CHP entre 1980 e 2012. 2ª Fase: Ter diagnóstico de DII estabelecido com base nos critérios de LennardJones (141, 142); ter idade igual ou superior a 18 anos; ser seguido na CGE; ter necessidade de iniciar tratamento com imunossupressor entre Julho e Novembro de 2012; nunca ter realizado tratamento com imunossupressor ou ter feito a sua suspensão há mais de 12 meses; assinar de forma livre e esclarecida o consentimento informado. Critérios de exclusão 1ª Fase: Inexistência de processo clínico e/ou insuficiência de dados no processo. 2ª Fase: Fazer tratamento com imunossupressor para outra patologia que não DII. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 26 PLANO DE TRABALHO Tarefas associadas ao projecto  Lista de tarefas Durante a execução do projeto estão previstas as seguintes tarefas: Designação Início Conclusão Duração 1 Estudo de série (revisão casuística) 01/06/2012 31/09/2012 4 meses 2 Identificação dos doentes que irão iniciar azatioprina 01/06/2012 31/09/2012 4 meses 3 Recrutamento de doentes para estudo laboratorial 01/07/2012 31/11/2012 5 meses 4 Colheitas de sangue 01/07/2012 29/02/2013 8 meses 5 Estudo dos monócitos do sangue 01/07/2012 29/02/2013 8 meses 6 Análise, interpretação e integração dos resultados 01/03/2013 30/04/2013 2 meses 7 Relatório de execução 01/05/2013 31/05/2013 1 mês  Descrição das tarefas Tarefa 1: Estudo de série (revisão casuística) Duração: 4 meses Data prevista para o início: 01/06/2012 Data prevista para a conclusão: 31/09/2012 Instituições, Departamentos e Serviços: CHP/HSA, DM, SGE Objetivos: Caracterizar, do ponto de vista clínico e analítico os doentes com DII seguidos na CGE entre 1980 e 2012. Descrição: Colheita de dados clínicos e analíticos dos processos clínicos; registo dos dados em ficheiro Excel anonimizado. Investigadores envolvidos: Rita Dias, Paula Lago Funções e responsabilidades dos investigadores: A colheita dos dados será efectuada pela aluna com a supervisão da orientadora. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 27 Tarefa 2: Identificação dos doentes que irão iniciar Azatioprina Duração: 4 meses Data prevista para o início: Dia/mês/ano: 01/06/2012 Data prevista para a conclusão: Dia/mês/ano: 31/09/2012 Instituições, Departamentos e Serviços: HSA/CHP, DM, SGE Objetivos: Identificar os doentes com indicação para iniciar imunossupressão com Azatioprina Descrição: Consulta do agendamento (SAM) Investigadores envolvidos: Paula Lago Funções e responsabilidades dos investigadores: Os procedimentos acima descritos serão da responsabilidade da Dra. Paula Lago Tarefa 3: Recrutamento dos doentes Duração: 5 meses Data prevista para o início: Dia/mês/ano: 01/07/2012 Data prevista para a conclusão: Dia/mês/ano: 31/11/2012 Instituições, Departamentos e Serviços: CHP/HSA, DM, CGE Objetivos: Informar os doentes, solicitar a participação na 2ª fase do estudo e obter o consentimento informado. Descrição: Informação dos doentes; entrega do folheto informativo; solicitação para participação no estudo; assinatura do termo de consentimento informado. Investigadores envolvidos: Paula Lago; Marta Salgado; Cidalina Caetano Funções e responsabilidades dos investigadores: Os procedimentos acima descritos serão da responsabilidade da Dra. Paula Lago. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 28 Tarefa 4: Colheitas de amostras de sangue Duração: 8 meses Data prevista para o início: 01/07/2012 Data prevista para a conclusão: 29/02/2013 Instituições, Departamentos e Serviços: CHP/HSA, Central de Colheitas Objetivos: Colher sangue para análise Descrição: Procedimento de colheita de sangue para estudo dos monócitos CD14+CD16+ Investigadores envolvidos: Técnicos da Central de Colheitas Funções e responsabilidades dos investigadores: Colheita de amostra de sangue (1 tubo de 4.5 ml; EDTA-K3) antes e 3 meses após início do tratamento. Tarefa 5: Estudo dos monócitos do sangue Duração: 8 meses Data prevista para o início: 01/07/2012 Data prevista para a conclusão: 29/02/2013 Instituições, Departamentos e Serviços: CHP/HSA, DM, SHC, LC Objetivos: Estudo dos monócitos sanguíneos por citometria. Descrição: Realização de análises; análise de resultados Investigadores envolvidos: Rita Dias, João Rodrigues Funções e responsabilidades dos investigadores: O Dr. João Rodrigues será responsável pela realização das análises e pela análise dos resultados da citometria; a aluna acompanhará o processo. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 29 Tarefa 6: Análise, interpretação e integração dos resultados Duração: 2 meses Data prevista para o início: 01/03/2013 Data prevista para a conclusão: 30/04/2013 Instituições, Departamentos e Serviços: CHP/HSA, DM, SGE Objetivos: Analisar, interpretar e integrar os resultados Descrição: Interpretação dos resultados laboratoriais, integrados no contexto clinico. Investigadores envolvidos: Rita Dias, Paula Lago. Funções e responsabilidades dos investigadores: A análise, interpretação dos resultados serão da responsabilidade da aluna, com a ajuda e a supervisão da orientadora. Tarefa 6: Relatório de execução Duração: 1 mês Data prevista para o início: 01/05/2013 Data prevista para a conclusão: 31/05/2013 Instituições, Departamentos e Serviços: CHP/HSA, DM, SGE Objetivos: Elaborar o relatório de execução do projeto, a integrar na dissertação de MIM Descrição: Resultados; Discussão; Conclusões Investigadores envolvidos: Rita Dias, Paula Lago. Funções e responsabilidades dos investigadores: A elaboração do relatório será da responsabilidade da aluna, com a ajuda e a supervisão da orientadora. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 30 MATERIAL E MÉTODOS Revisão casuística Para a colheita dos dados clínicos e analíticos será usado o formulário em anexo. Estudo laboratorial A imunofenotipagem dos monócitos de sangue periférico será efetuada por técnica de imunofluorescência direta. Resumidamente, as células (sangue total) serão incubadas à temperatura ambiente com a quantidade apropriada de anticorpos monoclonais específicos para diversos antigénios (CD14, CD16, CD36, CD45, etc.), conjugados com diferentes fluorocromos (FITC, PE, PerCP, APC, etc.). Após incubação, será feita a lise dos eritrócitos e fixação das membranas dos leucócitos (FACSlysing, Becton Dickinson, seguida de uma lavagem com tampão fosfato salino (PBS, do inglês Phosphate Buffered Saline), adição de PBS e leitura no citómetro de fluxo (FACSCanto, Becton Dickinson). A análise dos resultados será feita na aplicação informática Infinicyt (Cytognos). Análise estatística dos dados Os dados serão analisados utilizando o programa de análise estatística SPSS. Equipamento Tipo de equipamento Marca Modelo Local Contador hematológico Beckman Coulter LH780 LC do SHC do CHP Citómetro de fluxo Becton Dickinsom FACSCanto LC do SHC do CHP Reagentes e outro material consumível Descrição Finalidade Anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromos Imunomarcação dos monócitos (citometria de fluxo) Outros reagentes de laboratório Lavagem das células, lise dos eritrócitos e fixação dos leucócitos (citometria de fluxo) CD Gravação dos dados IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 37 ORÇAMENTO Não serão efetuadas consultas, internamentos, exames complementares de diagnóstico no CHP, especificamente no âmbito do projeto. As análises a realizar são análises de investigação e não constam na tabela de preços do Sistema Nacional de Saúde, pelo que se procederá à compra dos reagentes necessários. Custo estimado (€) Reagentes e material consumível de laboratório (anticorpos monoclonais, soluções para lavagem, lise e fixação de células, etc.) 2.000,00 Material administrativo (fotocópias, folhas, etc.) 00,00 Contratação de serviços 00,00 Pagamento de despesas aos participantes (deslocações) 00,00 Exames realizados no CHP (análises e outros meios complementares) 00,00 Taxas moderadoras de episódios (consultas, internamentos, etc.) 00,00 Taxas moderadoras de exames (análises, exames de imagem, etc.) 00,00 Impressão de poster para apresentação de resultados 50,00 Inscrição aluno em congresso médico 200,00 Organização das Jornadas de Iniciação à Investigação Clínica 50,00 TOTAL €2.300,00 FINANCIAMENTO O estudo será financiado pelo ICBAS/UP, através de uma bolsa atribuída à DIIC. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 38 GLOSSÁRIO IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 39 SIGLAS E ACRÓNIMOS  CC, Central de Colheitas.  CGE, Consulta de Gastrenterologia.  CHP, Centro Hospitalar do Porto  DIIC, Disciplina de Iniciação à Investigação Clínica.  DM, Departamento de Medicina.  HSA, Hospital de Santo António.  ICBAS, Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar.  JIIC, Jornadas de Iniciação à Investigação Clínica.  MIM, Mestrado Integrado em Medicina.  SGE, Serviço de Gastrenterologia.  SHC, Serviço de Hematologia Clínica  UP, Universidade do Porto. TERMOS TÉCNICOS  5-ASA, Ácido 5-aminosalicilico  6-MMP, 6-Metil Mercaptopurina  6-MP, 6-Mercaptopurina  AINE, Anti-inflamatórios não esteróides  Anti-TNFα, Anticorpo anti-Factor de Necrose Tumoralα (Tumor Necrosis Factor α)  AZA, Azatioprina  CsA, Ciclosporina A  CU, Colite Ulcerosa  DC, Doença de Crohn  DHFR, Dihidrofolato Redutase  DII, Doença Inflamatória Intestinal  IL, Interleucinas  LPS, Lipopolissacarídeo  MDR1, Gene de resistência a múltiplas drogas tipo 1 (Multiple Drug Resistance)  MTX, Metotrexato  TNFα, Factor de Necrose Tumoral α (Tumor Necrosis Factor α)  TPMT, Tiopurina Metil-transferase  γ-INF, InferferãoGama IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 40 ANEXOS Lista de anexos  Folha de rosto de estudo de investigação  Pedidos de autorização (Presidente do Conselho de Administração do CHP, Presidente da Comissão de Ética para a Saúde do CHP, Directora do Departamento de Ensino, Formação e Investigação do CHP).  Termos de responsabilidade (Aluno, Orientador, Regente da DIIC)  Autorizações locais (Departamentos e Serviços do CHP envolvidos no projecto)  Carta dirigida à Presidente da Comissão de Ética para a Saúde do CHP a solicitar dispensa de consentimento informado (1ª fase do estudo).  Termo de consentimento informado (2ª fase do estudo).  Folheto informativo para os participantes (2ª fase do estudo).  Formulário de recolha de dados clínicos. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 41 Lista de documentos para TRABALHOS ACADÉMICOS DE INVESTIGAÇÃO (que conferem grau) Data de entrega (ou NA, não aplicável) Secretariado (Assinatura) Documentos comprovativos Inscrição em Licenciatura, Mestrado ou Doutoramento NA Cartas do Aluno, a solicitar autorização institucional Presidente do Conselho de Administração X Presidente da CES X Director do DEFI X Termos de responsabilidade de Alunos e Orientadores Aluno X Orientador do Projecto X Supervisor do Projecto, Responsável pela DIIC X Termos de autorização local (no CHP) Responsáveis por Unidades / Gabinetes / Sectores X Directores de Serviço X Directores / Conselhos de Gestão de Departamentos X Proposta Folha de Rosto do Estudo de Investigação X Proposta de Trabalho Académico de Investigação X Anexos Curriculum Vitae do Aluno NA Termo de Consentimento Informado X Folheto com informação para dar aos Participantes X Carta a solicitar dispensa Consentimento Informado X (1ª fase estudo) Inquéritos / questionários ou guiões de entrevistas* NA Formulário para recolha de dados clínicos X Outros documentos NA SECRETARIADO: Data Assinatura ___/___/_____ _________________________ IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 42 FOLHA DE ROSTO DO ESTUDO DE INVESTIGAÇÃO TÍTULO IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. CLASSIFICAÇÃO Trabalho Académico de Investigação X (Mestrado Integrado em Medicina) Projeto de Investigação X VERSÃO Novo X CALENDARIZAÇÃO Data de início: 09/2011 (execução: 06/2012) Data de conclusão: 06/2013 (execução: 04/2013) Prazo a cumprir: 06/2012 ALUNOS E ORIENTADORES Aluno Rita Ribeiro Dias, aluna do 5º ano do Mestrado Integrado em Medicina do Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto; e-mail: [email protected]; Telemóvel: 911542805 Orientador do projeto Paula Lago, médica, especialista em Gastrenterologia do Serviço de Gastrenterologia do Centro Hospitalar do Porto; e-mail: [email protected]; Telemóvel: 962860392. Supervisor do projeto / Responsável pela DIIC Margarida Lima, médica especialista em Imunohemoterapia do Serviço de Hematologia Clínica do Centro Hospitalar do Porto, responsável pelo Laboratório de Citometria; Professora Auxiliar Convidada do Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar da Universidade do Porto, responsável pela Disciplina de Iniciação à Investigação Clínica; e-mail: [email protected]; [email protected]; Telemóvel: 966327115. OUTROS INVESTIGADORES Investigadores João Rodrigues, Técnico Superior de Saúde do Serviço de Hematologia Clínica do Centro Hospitalar do Porto, a exercer funções na Unidade de Biologia Molecular e no Laboratório de Citometria; e-mail: joaodrigue[email protected]; Telemóvel: 966425103 PROMOTOR O próprio X INSTITUIÇÕES E SERVIÇOS Unidades, Departamentos e Serviço do CHP CHP – Serviço de Gastroenterologia, Consulta de Gastroenterologia (proponente) CHP – Serviço de Hematologia Clinica, Laboratório de Citometria Outras Instituições intervenientes NA IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 43 CARACTERÍSTICAS do estudo Alvo do estudo Países / Instituições envolvidos Humanos X Nacional X Institucional X Natureza do estudo Características do estudo (desenho) Clínico X 1ª fase: Observacional X Terapêutico X Revisão casuística Descritivo X Laboratorial X 2ª fase: Observacional X Estudo laboratorial Analítico X Longitudinal X (Prospetivo) Participantes Existência de grupo controlo: Não X Seleção dos participantes: Não aleatória X Outros aspetos relevantes para a apreciação do estudo: Participação de grupos vulneráveis Não X Convocação de doentes / participantes Não X Consentimento informado Sim X (Segunda fase do estudo) Inquéritos / questionários Não X Entrevistas Não X Colheita de produtos biológicos Sim X (No CHP) Armazenamento de produtos biológicos Não X Criação de bancos de produtos biológicos Não X Realização de exames / análises Sim X (Análises de investigação; no CHP) Realização de estudos genéticos Não X Recolha de dados Sim X (Dados clínicos e laboratoriais) Criação de bases de dados Sim X (Ficheiro Excel anonimizado) Saída para outras instituições Não X ORÇAMENTO E FINANCIAMENTO Orçamento total: 2.300,00 euros Contrato financeiro em anexo: Não X Financiamento: Interno (CHP) 0,00 Euros Externo 2.300,00 euros Entidades financiadoras: ICBAS / DIIC INDICADORES Apresentação dos resultados nas Jornadas de Iniciação à Investigação; Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Data: Assinatura do proponente (Aluno): IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 44 PEDIDOS DE AUTORIZAÇÃO INSTITUCIONAL Título do trabalho: Imunossupressores na Doença Inflamatória Intestinal: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias, aluna da DIIC do curso de MIM do ICBAS/UP e do CHP. Presidente do Conselho de Administração do CHP Exmo. Senhor Presidente do Conselho de Administração do CHP Rita Ribeiro Dias, na qualidade de Aluna, vem por este meio, solicitar a Vossa Exa. autorização para realizar no Centro Hospitalar do Porto o Estudo de Investigação acima mencionado, de acordo com o programa de trabalhos e os meios apresentados. Data Assinatura ___/___/_____ _________________________ Presidente da Comissão de Ética para a Saúde do CHP Exma. Senhora Presidente da Comissão de Ética para a Saúde do CHP Rita Ribeiro Dias, na qualidade de Aluna, vem por este meio, solicitar a Vossa Exa. autorização para realizar no Centro Hospitalar do Porto o Estudo de Investigação acima mencionado, de acordo com o programa de trabalhos e os meios apresentados. Data Assinatura ___/___/_____ _________________________ Diretora do Departamento de Ensino, Formação e Investigação do CHP Exma. Senhora Diretora do Departamento de Ensino, Formação e Investigação do CHP Rita Ribeiro Dias, na qualidade de Aluna, vem por este meio, solicitar a Vossa Exa. autorização para realizar no Centro Hospitalar do Porto o Estudo de Investigação acima mencionado, de acordo com o programa de trabalhos e os meios apresentados. Data Assinatura ___/___/_____ _________________________ IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 45 TERMOS DE RESPONSABILIDADE Título do trabalho: Imunossupressores na Doença Inflamatória Intestinal: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias, aluna da DIIC do curso de MIM do ICBAS/UP e do CHP. Aluno Na qualidade de Aluna, comprometo-me a executar o Trabalho Académico de Investigação acima mencionado, de acordo com o programa de trabalhos e os meios apresentados, respeitando os princípios éticos e deontológicos e as normas internas da instituição. Nome Data Assinatura Rita Ribeiro Dias ___/___/___ _________________ Orientador do projeto Na qualidade de Orientadora, solicito autorização do Conselho de Administração para que a Aluna acima referido possa desenvolver no CHP o seu Trabalho de Investigação. Informo que me comprometo a prestar a orientação necessária para uma boa execução do mesmo e a acompanhar a Aluna nas diferentes fases da sua realização, de acordo com o programa de trabalhos e meios apresentados, bem como por zelar pelo respeito dos princípios éticos e deontológicos e pelo cumprimento das normas internas da instituição. Nome Data Assinatura Paula Lago ___/___/___ ____________________ Instituição Departamento Serviço / Sector CHP Medicina Gastrenterologia Supervisor do projeto / Responsável pela DIIC Na qualidade de Docente Responsável pela DIIC / Supervisor do Aluno no CHP, comprometo-me a prestar a orientação necessária para uma boa execução do Trabalho de Investigação, de acordo com o programa de trabalhos e meios apresentados. Mais declaro que acompanharei a Aluna, responsabilizando-me por supervisionar a execução do trabalho no CHP, bem como por zelar pelo respeito dos princípios éticos e deontológicos e pelo cumprimento das normas internas da instituição. Nome Data Assinatura Margarida Lima ___/___/___ _________________ Departamento: DEFI IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 46 TERMOS DE AUTORIZAÇÃO LOCAL Título do trabalho: Imunossupressores na Doença Inflamatória Intestinal: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias, aluna da DIIC do curso de MIM do ICBAS/UP e do CHP. Responsáveis por Unidades, Gabinetes ou Sectores Na qualidade de Responsável pela Unidade / Gabinete / Sector, dou parecer favorável à execução do Estudo de Investigação acima mencionado e comprometo-me a prestar as condições necessárias para a boa execução do mesmo, de acordo com o programa de trabalhos e os meios apresentados. Unidade / Gabinete / Sector Nome do Responsável Data Assinatura Laboratório de Citometria Margarida Lima ___/___/___ _____________ Diretores de Serviço Na qualidade de Diretor de Serviço, declaro que autorizo a execução do Estudo de Investigação acima mencionado e comprometo-me a prestar as condições necessárias para a boa execução do mesmo, de acordo com o programa de trabalhos e os meios apresentados. Serviço Nome do Diretor Data Assinatura Gastrenterologia Isabel Pedroto ___/___/___ ____________ Hematologia Clínica Jorge Coutinho ___/___/___ ____________ Diretores / Conselhos de Gestão de Departamento Na qualidade de Diretor do Departamento, declaro que autorizo a execução do Estudo de Investigação acima mencionado e comprometo-me a prestar as condições necessárias para a boa execução do mesmo, de acordo com o programa de trabalhos e os meios apresentados. Departamento Nome do Diretor Data Assinatura Medicina José Lopes Gomes ___/___/___ ___________ IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 53 A leucopenia foi definida pela contagem total de leucócitos < 4.000 células/mm³ e leucopenia grave quando os mesmos estivessem abaixo de 2.000 células/mm³; classificou-se trombocitopenia como a contagem de plaquetas < 130.000 células/mm³, neutropenia como a contagem de neutrófilos < 1.000 células/mm³ e linfopenia a contagem de linfócitos < 800 células/mm³. Considerou-se alterações das provas de função hepática quando houve aumento das aminotransferases acima de duas vezes o limite superior da normalidade, qualquer que fosse a ocasião da ocorrência de um destes eventos durante o tratamento com imunossupressor. Os motivos para a paragem do imunossupressor foram separados em 5 grupos: reação adversa, ausência de resposta, remissão prolongada, escalada para biológico, e outro. A resposta à imunossupressão foi avaliada nos indivíduos que mantiveram o tratamento durante pelo menos 6 meses e cuja indicação para imunossupressão foi a corticodependência ou corticorresistência, doença perianal ou manifestações extraintestinais. Quando a indicação para imunossupressão foi a corticodependência ou a corticorresistência, a resposta foi considerada completa quando a corticoterapia foi suspensa, e os pacientes se mantiveram sem necessidade de corticoide por pelo menos, dois anos; parcial se houve resposta clinica, mas necessidade de um ou mais ciclos de corticosteroides num período de pelo menos 2 anos; e ausente, se não houve melhoria clinica. Para os indivíduos que iniciaram imunossupressão por doença perianal fistulizante, a resposta foi classificada como completa, perante paragem total de supuração por um período igual ou superior a 2 anos; parcial, se houve redução da supuração mas necessidade de escalada terapêutica; e ausente se não houve melhoria clinica. Nos indivíduos que mantiveram o tratamento com imunossupressor por um período de tempo inferior a seis meses, a resposta foi classificada como não avaliável. Os pacientes cuja indicação para imunossupressão foi a profilaxia pós cirurgica, após resseção ileocólica, foram divididos em dois grupos: um correspondente àqueles que iniciaram imunossupressor até 3 meses após a cirurgia, e um segundo grupo relativo aos que iniciaram imunossupressor aquando da recidiva endoscópica. Análise Estatística: A análise descritiva foi realizada utilizando-se o programa SPSS 20.0 PASW (Statistical Package for the Social Sciences), e os dados apresentados sob a forma de média ± desvio padrão para as variáveis contínuas e frequência absoluta (percentagem) para as variáveis categóricas. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 54 2ª Fase: Quantificação e Caracterização dos Monócitos por Citometria de Fluxo Amostras: Os estudos imunofenotípicos para quantificação e caracterização dos monócitos foram feitos em sangue periférico colhido com anticoagulante (EDTA-K3), As amostras de sangue foram colhidas entre Agosto de 2012 e Maio de 2013 em pacientes selecionados de forma não aleatória, por conveniência. Foram incluídos nesta seleção, de forma consecutiva, os pacientes com diagnóstico de DII de acordo com os critérios de Lennard-Jonnes (141, 142), que cumprissem os seguintes critérios: ter idade igual ou superior a 18 anos; ser seguido na CGE; ter necessidade de iniciar tratamento com imunossupressor entre Julho e Janeiro de 2012; nunca ter realizado tratamento com imunossupressor ou ter feito a sua suspensão há mais de 12 meses; assinar de forma livre e esclarecida o consentimento informado. Para constituição do grupo de controlo, foram também colhidas amostras de sangue, em indivíduos saudáveis, dadores benévolos de sangue, selecionados de forma aleatória e emparelhados por idade e sexo, com os doentes. Foi realizada uma primeira colheita de sangue periférico, nos controlos, e nos pacientes com DII, tendo sido este momento, designado por Tempo 0. Posteriormente foi realizada uma segunda colheita de sangue, apenas nos doentes com DII, durante o tratamento com azatioprina, tendo sido este momento designado por Tempo 1. Imunofenotipagem: Foi usada uma técnica de imunofluorescência direta para a imunomarcação das células. De forma resumida, 100 µL de sangue contendo 0.5 to 2x106 leucócitos / ml, foram incubados durante 15 minutos, à temperatura ambiente e no escuro, na presença de concentrações saturantes de anticorpos monoclonais específicos para diferentes antigénios (CD14, CD16 e CD45), conjugados com diferentes fluorocromos: isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE) e complexo peridinina - proteína clorófila (PerCP). De seguida, a lise dos eritrócitos e a fixação dos leucócitos foram feitas adicionando 2 ml de FACS lysing solution [Becton/Dickinson Biosciences (BD), San Jose, CA] previamente diluída a 1/10 (v/v) em água destilada e incubando as células durante 10 minutos nas mesma condições. Finalmente, as células foram lavadas com tampão fosfato salino (PBS, phosphate buffered saline), por centrifugação a 540g, e suspendidas em PBS. Leitura das amostras: Para a leitura das amostras foi usado um citómetro de fluxo modelo FACScanto II (BD) equipado com 3 lasers: um laser azul (488 nm, 20 mW) e um laser vermelho (633-nm, hélio-néon, 17 mW), arrefecidos a ar, e um laser violeta (405 nm, 30 mW). A aquisição das amostras foi feita com o programa BD FACSDiva™ (BD). Foram IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 55 adquiridos no mínimo 2x105 eventos em cada amostra, que foram gravados como ficheiro de dados de tipo FCS3.0. Análise dos dados: Os dados foram analisados com o programa Infinicyte (Cytognos, Espanha). Sumariamente, os monócitos foram identificados com base na expressão de CD45 e de CD14. De seguida, e após seleção dos monócitos, foram identificadas as duas subpopulações principais, com base na expressão de CD14 e de CD16: monócitos CD14+CD16- (intensidade forte de expressão de CD14 e ausência de expressão de CD16) e monócitos CD14+CD16+ (expressão de CD14 e expressão de CD16). Procedeu-se à avaliação dos seguintes parâmetros: percentagem de monócitos, no total dos leucócitos; percentagem de monócitos CD14+CD16e CD14+CD16+, no total dos monócitos; densidade antigénica de CD14 e de CD16 em cada uma das subpopulações, avaliada pelas correspondentes intensidades médias de fluorescência (IMF); heterogeneidade de expressão, avaliada pelo respetivo coeficiente de variação (CV); tamanho e complexidade dos monócitos, avaliados pelas características de dispersão da luz (FSC, forward scatter e SSC, side scatter, respetivamente). Análise Estatística: A análise estatística foi realizada utilizando o programa SPSS 20.0 PASW (Statistical Package for the Social Sciences). As características clinicas e demográficas das amostras foram avaliadas por estatística descritiva. Foi utilizado o teste de Mann-Whitney para a análise transversal e o de Wilcoxon para a análise longitudinal. Foi considerada significância estatística para p<0,05 com um intervalo de confiança de 95%. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 56 RESULTADOS 1ª Fase: Caraterização da utilização de imunossupressores nos pacientes com DII Na consulta de DII do Serviço de Gastroenterologia do CHP, eram acompanhados, até 31 de Dezembro de 2012, 914 doentes com DII, dos quais 385, faziam ou fizeram em algum momento, tratamento com imunossupressor convencional, nomeadamente, tiopurina ou metotrexato. A tabela 1 descreve as principais características clinicas e demográficas destes pacientes. Tabela 1 - Caracterização dos doentes com DII seguidos na consulta de gastroenterologia do CHP. DC CU DIICNC CI Total Número de doentes 546 339 28 1 914 Género Feminino 312 (57.1%) 183 (54.0%) 18 (64.3%) 1 (100.0%) 514 (56.2%) Masculino 234 (42.8%) 156 (46.0%) 10 (35.7%) 0 (0.0%) 400 (43.8%) Doença Perianal 151 (27.7%) 0 (0.0%) 3 (10.7%) 0 (0.0%) 154 (16.8%) MEI Eritema Nodoso 21 (18.6%) 1 (2.9%) 1 (16.7%) 0 (0.0%) 23 (14.9%) Pioderma Gangrenoso 7 (6.2%) 1 (2.9%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 8 (5.2%) Articulares Periféricas 59 (52.2%) 15 (42.9%) 2 (33.3%) 0 (0.0%) 76 (49.4%) Articulares Centrais 23 (20.4%) 13 (37.1%) 2 (33.3%) 0 (0.0%) 38 (24.7%) Oculares 15 (13.3%) 1 (2.9%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 16 (10.4%) Estomatite Aftosa 18 (15.9%) 3 (8.6%) 2 (33.3%) 0 (0.0%) 23 (14.9%) CEP 2 (1.8%) 6 (17.1%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 8 (5.2%) HAI 5 (4.4%) 3 (8.6%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 8 (5.2%) Estados de Imunossupressão* 7 (1.3%) 7 (2.1%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 14 (1.5%) Doenças Autoimunes 11 (2.0%) 7 (2.1%) 1 (3.6%) 0 (0.0%) 19 (2.1%) Necessidade de cirurgia Intestinal 240 (44.0%) 15 (4.4%) 0 (0.0%) 1 (0.4%) 258 (28.0%) Abreviaturas: DII, Doença Inflamatória Intestinal; CHP, Centro Hospitalar do Porto; DC, Doença de Crohn; CU, Colite Ulcerosa; DIICNC, Doença inflamatória intestinal do colón não classificada; CI, Colite inespecifica; MEI, manifestações extraintestinais; CEP, Colangite esclerosante primária; HAI, Hepatite autoimune. Os valores estão apresentados sob a forma de frequência absoluta (percentagem). *Inclui: imunossupressão pós transplante-renal, imunossupressão pós transplante hepático, imunossupressão em doente HIV+, imunossupressão em doente HCV+, imunossupressão em doente HBV+ e quimioterapia por neoplasia IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 57 A idade média de diagnóstico da DC foi de 33.3 (± 0.6) anos e para a CU foi de 39.3 (± 0.8) anos, com uma diferença de 6 anos entre os dois tipos de DII. Os dois imunossupressores convencionais estudados foram as tiopurina (azatioprina e 6-MP) e o MTX. A forma de utilização destes fármacos foi dividida em: primeiro imunossupressor e segundo imunossupressor. No grupo do primeiro imunossupressor foram incluídos os doentes que nunca tinham sido expostos a terapêutica imunossupressora convencional, e no grupo do segundo imunossupressor foram incluídos os doentes que haviam sido expostos ao 1º imunossupressor, mas necessitaram de o substituir por um imunossupressor de classe diferente. O intervalo de tempo decorrido entre o diagnóstico da doença e o início do tratamento com o primeiro imunossupressor, foi, em média, de 5.4 (± 6.3) meses para a DC e de 4.2 (± 4.8) meses para a CU, com uma diferença de 1.2 meses entre ambas as condições. O tempo mínimo decorrido foi de 0 meses nas duas doenças, e o máximo foi de 38 meses para a DC e 20 meses para a CU. Para os pacientes que já suspenderam ou substituíram o primeiro imunossupressor, a duração média do tratamento foi de 32.3 (± 35.5) meses para a DC e de 18.2 (± 32.3) meses para a CU. Para aqueles que ainda mantêm esta terapêutica, a duração média do tratamento com o primeiro imunossupressor é de 52.7 (± 44.9) meses para a DC e de 56.2 (± 56.1) meses para a CU. A duração do tratamento com o segundo imunossupressor foi em média de 27.4 (±27.4) meses para a DC, com um mínimo de 2 e um máximo de 155 meses. Para o único paciente com CU que fez tratamento com o segundo imunossupressor, a duração do tratamento foi de 122 meses. A tabela 2 descreve a utilização de fármacos imunossupressores nas diferentes DII’s, de acordo com o número de vezes e o fármaco utilizado. Tabela 2 - Utilização de imunossupressores na DII DC CU DIICNC CI TOTAL 1º IM 329 (60.3%) 52 (15.3%) 4 (14.3%) 0 (0.0%) 385 (42.1%) Tiopurina 321 (97.6%) 51 (98.1%) 4 (100.0%) 0 (0.0%) 376 (97.7%) Metotrexato 8 (2.4%) 1 (1.9%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 9 (2.3%) 2º IM Tiopurina 1 (2.6%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 1 (2.5%) Metotrexato 37 (97.4%) 1 (100.0%) 1 (100.0%) 0 (0.0%) 39 (97.5 %) Terapêutica Combinada com BIO* 88 (16.1%) 12 (3.5%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 100 (10.9%) Abreviaturas: DII, Doença Inflamatória Intestinal; DC, Doença de Crohn; CU, Colite Ulcerosa; DIICNC, Doença inflamatória intestinal do colón não classificada; CI, Colite inespecifica, BIO, fármaco biológico (antiTNFα). Os valores estão apresentados sob a forma de: frequência absoluta (percentagem). *O fármaco biológico utilizado nestes doentes foi um agente anti-TNFα. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 58 Dos 914 pacientes em estudo, um total de 385 (42.1%) pacientes fizeram o primeiro imunossupressor. Verificou-se que a utilização do primeiro imunossupressor foi bastante mais frequente nos doentes com DC (60.3%), em comparação com os doentes com CU (15.3%). O segundo imunossupressor foi utilizado em 10.4% dos pacientes em estudo, tendo-se constatado que tal como para o primeiro imunossupressor, os indivíduos com DC foram os que mais o utilizaram (11.6%), comparativamente aos que tinham CU (1.9%). Como primeiro imunossupressor, os fármacos utilizados com mais frequência foram as tiopurinas, em 97.7% dos pacientes que necessitaram de imunossupressão. Para a utilização do segundo fármaco imunossupressor, esta relação inverteu-se, com o metotrexato a ser utilizado em 97.5% dos pacientes. As figuras 1 e 2 ilustram a evolução do tratamento com o 1º imunossupressor, de acordo com o fármaco utilizado. Figura 1 - Utilização das tiopurinas como primeiro imunossupressor _______________________________________________________________________ Abreviaturas: IM1, Imunossupressor 1; MTX, Metotrexato Os valores estão apresentados sob a forma de: frequência absoluta (percentagem). Figura 2 - Utilização do MTX como primeiro imunossupressor IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 59 _____________________________________________________________ Abreviaturas: IM1, Imunossupressor 1; MTX, Metotrexato Os valores estão apresentados sob a forma de: frequência absoluta (percentagem). Tabela 3 - Tratamento com imunossupressor e a classificação de Montreal da DII Tratamento com Imunossupressor CU – Extensão Sim Não E1 1 (1.1%) 0 (0.0%) E2 21 (13.5%) 134 (86.5%) E3 30 (31.6%) 65 (68.4%) DC - Localização L1 98 (53.8%) 84 (46.2%) L2 53 (46.1%) 62 (53.9%) L3 135 (70.7%) 56 (29.3%) L4* 43 (74.1%) 15 (25.9%) DC - Comportamento B1 139 (48.4%) 148 (51.6%) B2 101 (70.1%) 43 (29.9%) B3 89 (77.4%) 26 (22.6%) DC – Idade A1 24 (75.0%) 8 (25.0%) A2 241 (64.6%) 132 (35.4%) A3 64 (45.4%) 77 (54.6%) Doença Perianal 114 (75.5%) 37 (24.5%) Abreviaturas: DII, Doença Inflamatória Intestinal; CU, Colite Ulcerosa; DC, Doença de Crohn. Os valores estão apresentados sob a forma de frequência absoluta (percentagem). *Inclui qualquer L (L1 ou L2 ou L3) + L4. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 60 A tabela 3 caracteriza a necessidade de utilização de imunossupressores, de acordo a idade de diagnóstico, localização e comportamento da doença para a DC e de acordo com a extensão para a CU. Nos pacientes com DC, verificou-se uma maior utilização de imunossupressores nos casos de doença ileocólica e atingimento do tubo digestivo proximal, na doença de comportamento penetrante e estenosante, E nos pacientes diagnosticados mais precocemente. Nos pacientes com CU, verificou-se que a necessidade de utilização de fármacos imunossupressores foi mais frequente nos casos de doença extensa. A utilização de imunossupressores foi também consideravelmente mais frequente nos doentes com DC e manifestações perianais. Tabela 4 - Indicação para imunossupressão, de acordo com o fármaco utilizado. Indicação 1º Imunossupressor Tiopurina* MTX Total Gravidade Doença 118 (31.4%) 2 (1.7%) 120 (31.2%) Corticodependência 98 (26.1%) 1 (1.0%) 99 (25.7%) Corticorresistência 18 (4.8%) 0 (0.0%) 18 (4.7%) Profilaxia Pós-Cx 80 (21.3%) 0 (0.0%) 80 (20.8%) Doença Perianal 48 (12.8%) 0 (0.0%) 48 (12.5%) MEI 11 (2.9%) 6 (66.7%) 17 (4.4%) Abreviaturas: MTX, Metotrexato; Pós-Cx, Pós-cirurgica; MEI, manifestações extraintestinais. Os valores estão apresentados sob a forma de: frequência absoluta (percentagem). *Para 3 pacientes que fizeram tiopurina a indicação para o tratamento era desconhecida. Comparando as duas classes de fármacos utilizadas, verifica-se que dos pacientes que fizeram tiopurinas como primeiro imunossupressor, as indicações mais frequentes para o tratamento foram a gravidade da doença, a corticodependência e a profilaxia pós-cirurgica. Dos pacientes tratado com MTX, a principal indicação para o imunossupressor foi a existência de manifestações extraintestinais, nomeadamente a artropatia. Dos pacientes cuja indicação para imunossupressor foi a profilaxia pós cirurgica, 27.8% iniciou o imunossupressor até 2 meses após a cirurgia e 65.8% iniciou-o após evidência endoscópica de recidiva. Para 6.3% destes pacientes não existia informação reportada. A resposta ao 1º imunossupressor (completa, parcial ou ausente) foi analisada para as indicações corticodependência, corticorresistência, doença perianal e MEI (Tabela 5). IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 61 Tabela 5 - Resposta ao fármaco imunossupressor de acordo com a indicação para o tratamento Resposta ao IM** Indicação para Imunossupressor Corticodependência Corticorresistência Perianal MEI Total Completa 31 (36.5%) 7 (46.7%) 12 (26.7%) 5 (33.3%) 55 ( 34.4%) Parcial 41 (48.2%) 8 (53.3%) 26 (57.8%) 8 (53.3%) 83 (51.9%) Ausente 13 (15.7%) 0 (0.0%) 7 (15.6%) 2 (13.3%) 22 (13.8%) Abreviaturas: IM, Imunossupressor; MEI, Manifestações Extraintestinais. Os valores estão apresentados sob a forma de: frequência absoluta (percentagem). *Não estão contempladas as indicações “gravidade” e “profilaxia pós-cirurgica” por ausência de dados que permitam avaliar a resposta ao imunossupressor nestas condições. **Para um total de 24 indivíduos, não foi possível avaliar a resposta ao imunossupressor por ainda não terem completado um mínimo de 6 meses com o respetivo fármaco. Para todas as indicações analisadas, a resposta ao tratamento mais frequente foi a resposta parcial, verificada em mais de metade dos pacientes com indicação para imunossupressor por corticorresistência, doença perianal e MEI, e quase em metade dos pacientes com corticodependência como indicação. Dos pacientes que iniciaram imunossupressor por corticorresistência, nenhum apresentou ausência de resposta ao tratamento, e esta foi também a resposta menos frequente para as restantes indicações. A ocorrência de reações adversos verificou-se em 168 (43.6%) dos pacientes sob tratamento com o 1º imunossupressor e em 10 (25.0%) dos pacientes em tratamento com o 2º imunossupressor. Alguns indivíduos apresentaram mais do que um efeito adverso. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 62 Tabela 6 - Tipo de reação adversa com o 1º e 2º IM utilizados, na totalidade dos doentes que apresentaram reações adversas. Reação Adversa 1º Imunossupressor Tiopurina MTX Total Anemia 16 (9.8%) 1 (25.0%) 17 (10.1%) Leucopenia 59 (36.0%) 0 (0.0%) 59 (35.1%) Alteração PFH 26 (15.9%) 2 (50.0%) 28 (16.0%) Intolerância GI 25 (15.2%) 1 (25.0%) 26 (15.5%) Pancreatite aguda 21 (12.8%) 0 (0.0%) 21 (12.5%) Trombocitopenia 2 (1.2%) 0 (0.0%) 2 (1.2%) Reação de Hipersensibilidade* 12 (7.3%) 0 (0.0%) 12 (7.1%) Pancitopenia 16 (9.8%) 0 (0.0%) 16 (9.5%) Infeção Grave 5 (3.0%) 0 (0.0%) 5 (3.0%) Síndrome Mielodisplásico 1 (0.6%) 0 (0.0%) 1 (0.6%) Hepatite Colestática 1 (0,6%) 0 (0,0%) 1 (0,6%) 2º Imunossupressor Tiopurina MTX Total Anemia 0 (0.0%) 1 (2.6%) 1 (2.5%) Leucopenia 0 (0.0%) 2 (5.1%) 2 (5.0%) Alteração PFH 0 (0.0%) 3 (7.7%) 3 (7.5%) Intolerância GI 0 (0.0%) 4 (10.3%) 4 (10.0%) Abreviaturas: IM, Imunossupressor; MTX, Metotrexato; GI, gastrointestinal; PFH, Provas de função hepática Os valores estão apresentados sob a forma de: frequência absoluta (percentagem). *Nomeadamente febre e/ou rash, e/ou nódulos cutâneos, e/ou artralgias, e/ou mialgias. Com o primeiro imunossupressor, o efeito adverso mais frequente foi a leucopenia. A alteração das PFH, a intolerância GI e a pancreatite aguda também ocorreram num número considerável de pacientes. Todos os efeitos adversos que ocorreram com o primeiro imunossupressor foram mais comuns com a utilização de tiopurina (Tabela 6). Nos pacientes que fizeram o segundo imunossupressor, ocorreram efeitos adversos apenas nos indivíduos medicados com MTX, o fármaco mais usado neste segundo grupo, tendo sido a intolerância GI o efeito adverso mais comum (Tabela 6). No grupo de pacientes que apresentaram infeção grave como reação adversa, as situações verificadas foram dois casos de abcesso hepático, um caso de tuberculose pulmonar e um caso de sépsis. Foi ainda considerado neste grupo, um paciente com suspeita de tuberculose pulmonar, não confirmada até à data. Dos pacientes medicados com o primeiro imunossupressor, 35.8% interromperam o tratamento, transitória ou temporariamente e 10.4% substituíram-no por um fármaco de IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 69  Estudo dos Monócitos por Citometria de Fluxo Quantificação e caraterização dos monócitos do sangue periférico A percentagem de monócitos, obtida nos doentes com DII antes do início da AZA e nos controlos, determinada por citometria de fluxo (células CD45+CD14+), correlacionava-se positivamente com a obtida pela contagem automática de células em contador hematológico (p< 0.001; r=0.733) (Figura 3). Figura 3 - Correlação entre a contagem de monócitos por citometria de fluxo e a contagem de monócitos obtida no contador hematológico automático, observada no total dos indivíduos estudados (n=50). Teste t de Spearman, Os doentes com DII, não apresentaram alterações significativas na percentagem e no valor absoluto de monócitos (CD45+CD14+), comparativamente aos controlos. Contudo, verificou-se que nos pacientes com DII, a percentagem de monócitos próinflamatórios (CD14+CD16+) era significativamente inferior à observada nos controlos (p=0.003) (Tabela 13). IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 70 Tabela 13 - Percentagens e números absolutos de monócitos totais (CD45+CD14+) e de monócitos pró-inflamatórios (CD14+CD16+) do sangue periférico, avaliadas por citometria de fluxo, nos doentes com doença inflamatória intestinal antes do início do tratamento com azatioprina e nos controlos. Monócitos (CD45+CD14+) Monócitos pró-inflamatórios (CD14+CD16+) % Leucócitos X106/L % Monócitos x106/L Controlos (n=25) 6.8±2.8 5.5 3.1-13.8 431±183 395 188-1036 15.8±5.8 16.9 5.3-24.8 72±56 55 29-306 Doentes (n=25) 5.9±1.9 5.8 2.4-11.1 527±251 465 230-1259 10.4±5.3 11.6 0.2-18.7 33±42 50 2-128 P* NS NS 0.003 NS Abreviaturas: NS, estatisticamente não significativo (p>0.05) Os resultados são apresentados na forma de média ± desvio padrão, mediana e intervalo (mínimo e máximo). * Teste de Mann Withney. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando p<0.05. Para análise das subpopulações monocitárias, os pacientes com DII foram posteriormente agrupados de acordo com a toma ou não de corticosteróides, tendo-se verificado diferenças importantes, para as percentagens de monócitos CD14+CD16+, entre os doentes sob corticoterapia e aqueles que não estavam medicados com corticosteróides (Figura 4). Figura 4 – Gráficos biparamétricos (CD16 versus CD14), obtidos por citometria de fluxo, onde se representam as subpopulações de monócitos CD14+CD16- (pontos azuis) e CD14+CD16+ (pontos vermelhos) de um doente com DII não medicado com corticosteróides (painel A) e de um doente com DII medicado com corticosteróides (painel B). Os pontos cinzentos representam os restantes leucócitos do sangue periférico. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 71 De facto, os indivíduos que estavam medicados com corticosteróides previamente à introdução da AZA, tinham percentagens de monócitos CD14+CD16+ (média ± desvio padrão: 5.3±1.9%; mediana 2.1%; intervalo: 0.2-4.8%) muito inferiores aos indivíduos sem corticoterapia (13.0±2.6%; 12.3%; 7.1-18.7%) (p<0.001) (Figura 5, painel A). Estes resultados mantiveram a sua significância quando os valores absolutos dos monócitos CD14+CD16+, foram comparados, para os mesmos grupos (Figura 5, painel B). Figura 5 – Percentagem (painel A) e número absoluto (painel B) de monócitos CD14+CD16+, nos pacientes com DII a tomar (n=6) ou não (n=19) corticosteróides, previamente à introdução da azatioprina. A caixa (box plot) representa a amplitude interquartil, sendo que os seus limites, superior e inferior, correspondem respetivamente, ao percentil 75 e 25, e o segmento que a intersecta, à mediana. As extremidades das linhas verticais representam, o valor máximo (extremidade superior) e mínimo (extremidade inferior) observados. *Teste de Mann Whitney. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando p<0.05. De seguida, excluindo os casos medicados com corticosteróides, procedemos à comparação entre doentes com DC (n=14) e doentes com CU (n=5), tendo sido constatado que não havia diferenças estatisticamente significativas entre a percentagem de monócitos CD14+CD16+ nos doentes com DC (média ± desvio padrão: 12.8±2.5%; mediana: 12.8%; intervalo: 7.1-17.0%) e essa mesma percentagem nos doentes com CU (13.7±3.1%; 12.3%; 11.4-18.7%), antes da introdução da AZA (Figura 6, painel A). Contudo, quando foram comparados os valores absolutos, verificou-se que os indivíduos com CU apresentavam um maior número absoluto de monócitos CD14+CD16+ (média ± desvio padrão: 90±29x106/L; mediana: 91x106/L; intervalo: 60-128 x106/L), em relação aos indivíduos com DC (53±19 x106/L; 49 x106/L; 28-87 x106/L) (Figura 6, painel B). IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 72 Figura 6 – Percentagem (painel A) e número absoluto (painel B) de monócitos CD14+CD16+, nos pacientes com doença de Crohn (n=14) e nos doentes com Colite Ulcerosa (n=5) não medicados com corticosteróides, previamente à introdução da azatioprina. A caixa (box plot) representa a amplitude interquartil, sendo que os seus limites, superior e inferior, correspondem respetivamente, ao percentil 75 e 25, e o segmento que a intersecta, à mediana. As extremidades das linhas verticais representam, o valor máximo (extremidade superior) e mínimo (extremidade inferior) observados. *Teste de Mann Whitney. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando p<0.05. Finalmente, e também excluindo os casos medicados com corticosteróides, procedemos à comparação entre doentes com DCA (n=9) e doentes com DRC (n=10), antes da introdução da AZA, tendo-se verificado que não havia diferença estatisticamente significativa na percentagem de monócitos CD14+CD16+ entre os pacientes em remissão clínica (média ± desvio padrão: 13.2±2.7%; mediana: 14.1; intervalo: 7.1-17.0%) e aqueles com doença ativa (12.8±2.5%; mediana 11.6; intervalo: 11.0-18.7 (Figura 7, painel A). Havia, no entanto, uma tendência para valores absolutos de monócitos CD14+CD16+ mais elevados nos pacientes com DCA (média ± desvio padrão: 75±30 x106/L; mediana 67 x106/L; intervalo: 36-128 x106/L) em relação aos observados nos doentes com DCR (51±17; 49; 28-84) (p=0.065) (Figura 7, painel B). IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 73 Figura 7 – Percentagem (painel A) e número absoluto (painel B) de monócitos CD14+CD16+, nos pacientes com doença clinicamente ativa (n=9) e nos doentes com remissão clínica (n=10) não medicados com corticosteróides, previamente à introdução da azatioprina. A caixa (box plot) representa a amplitude interquartil, sendo que os seus limites, superior e inferior, correspondem respetivamente, ao percentil 75 e 25, e o segmento que a intersecta, à mediana. As extremidades das linhas verticais representam, o valor máximo (extremidade superior) e mínimo (extremidade inferior) observados. *Teste de Mann Whitney. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando p<0.05. Efeito do tratamento com azatioprina nos monócitos CD14+CD16+ A tabela 14 descreve as populações de monócitos dos pacientes com DII avaliados antes e depois do tratamento com AZA, independentemente da utilização de corticosteróides Tabela 14 - Contagem de monócitos e caraterização das populações monocitárias do sangue periférico dos doentes com doença inflamatória intestinal, avaliados antes e durante o tratamento com azatioprina. Antes de iniciar AZA (Tempo 0) Durante tratamento com AZA (Tempo 1) P Monócitos (CD45+CD14+) % dos leucócitos 6.0±2.0 5.9 (2.4-11-1) 7.8±4.5 6.8 (4.0-23.6) NS x106/L 548±272 463 (230-1259) 454±202 378 (224-967) NS Monócitos CD14+CD16+ % dos monócitos 10.4±5.6 11.8 (0.2-18.7) 9.6±4.1 9.4 (4.4-18.3) NS x106/L 51±35 41 (2-128) 43±20 42 (15-101) NS Abreviaturas: NS, estatisticamente não significativo (p>0.005) Os resultados são apresentados na forma de média ± desvio padrão, mediana e intervalo (mínimo e máximo). * Teste de Mann Withney. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando p<0.05. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 74 Uma vez que, tal como constatado anteriormente, a toma de corticosteróides influencia os valores de monócitos CD14+CD16+, procedeu-se a uma segunda análise dos resultados, ao tempo 0 e ao tempo 1, considerando separadamente os indivíduos com (n=5) e sem (n=15) corticoterapia prévia. A percentagem de monócitos CD14+CD16+ nos pacientes sob corticoterapia, antes e durante parte do tratamento com AZA, mostrou uma variação significativa entre os dois tempos de análise (Figura 8, painel A). No tempo 0, estes indivíduos estavam medicados com corticosteroide sistémico e apresentavam uma depleção de monócitos CD14+CD16+ (média ± desvio padrão: 2.0±1.5%; mediana: 1.9%; intervalo: 0.2-4.8%), contudo, no tempo 1, momento em que todos os pacientes tinham já suspendido o corticosteroide, a sua percentagem de monócitos CD14+CD16+ já tinha recuperado parcialmente (8.9±5.4%; 5.9%; 5.7-18.3%). Para os valores absolutos de monócitos CD14+CD16+, esta tendência mantem-se, contudo, sem significância estatística (Figura 8, painel B). Figura 8 – Percentagem (painel A) e número absoluto (painel B) de monócitos CD14+CD16+, antes (tempo 0) e durante (tempo 1) o tratamento com azatioprina, nos pacientes com DII medicados com corticosteróides, previamente à introdução deste imunossupressor (n=5). A caixa (box plot) representa a amplitude interquartil, sendo que os seus limites, superior e inferior, correspondem respetivamente, ao percentil 75 e 25, e o segmento que a intersecta, à mediana. As extremidades das linhas verticais representam, o valor máximo (extremidade superior) e mínimo (extremidade inferior) observados. Os pontos afastados constituem outliers. *Teste de Wilcoxon. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando p<0.05. Pelo contrário, nos pacientes que não estavam medicados com corticosteroides, observou-se uma diminuição significativa da percentagem de monócitos CD14+CD16+ (Figura 9, painel A), com uma acentuada redução destes valores, entre o tempo 0 IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 75 (média ± desvio padrão: 13.2±2.8%; mediana: 13.4%; intervalo: 7.1-18.7%) e o tempo 1 (9.8±3.8%; 10.5%; 4.4-15.8%) (p=0.080). O mesmo se observou para o número absoluto de monócitos CD14+CD16+, que também reduziu significativamente do tempo 0 (média ± desvio padrão: 65±29 x106/L; mediana: 64 x106/L; intervalo: 36-128 x106/L) para o tempo 1 (41±15 x106/L; 44 x106/L; 15-68 x106/L) (p=0.004) (Figura 9, painel B). Figura 9 – Percentagem (painel A) e número absoluto (painel B) de monócitos CD14+CD16+, antes (tempo 0) e durante (tempo 1) o tratamento com azatioprina, nos pacientes com DII não medicados com corticosteróides, previamente à introdução deste imunosupressor (n=15). A caixa (box plot) representa a amplitude interquartil, sendo que os seus limites, superior e inferior, correspondem respetivamente, ao percentil 75 e 25, e o segmento que a intersecta, à mediana. As extremidades das linhas verticais representam, o valor máximo (extremidade superior) e mínimo (extremidade inferior) observados. *Teste de Wilcoxon. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando p<0.05. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 76 DISCUSSÃO 1ª Fase: Caraterização da utilização de imunossupressores nos pacientes com DII O início precoce da terapêutica imunossupressora, aquando do diagnóstico da DII, parece afetar o curso da doença, em particular no que respeita á DC. Não existe até á data um grande número de estudos que suportem estas evidências, no entanto, estudos desenvolvidos na população pediátrica mostraram que o início precoce da imunossupressão permitiu um redução na utilização de corticoterapia nestes doentes, bem como uma redução da necessidade de internamento (143). No presente estudo, a duração média de tempo decorrido entre o diagnóstico da doença e o início de imunossupressor, foi bastante semelhante entre a DC e a CU, não excedendo os seis meses para nenhuma das duas. Esta abordagem poderá refletir a tentativa, por parte dos profissionais que lidam com esta doença, de atuar precocemente a fim de obter um rápido controlo da doença. A duração média do tratamento com o primeiro imunossupressor foi diferente para a DC e para a CU, respetivamente 32.3 e 18.2 meses. A duração do tratamento imunossupressor parece ser um importante preditor da resposta, sobretudo no que respeita à manutenção da remissão, na medida em que a dose cumulativa do fármaco desempenha um papel essencial. Pearson e col publicaram em 1995, a primeira metaanálise reconhecendo a eficácia das tiopurinas na indução da remissão na DC, tendo verificado também a influência da duração do tratamento com este fármaco na melhoria da resposta nos pacientes com doença ativa (93). Posteriormente vários estudos confirmaram estes achados. Um dos mais recentes, é um estudo multicêntrico europeu que confirma o papel dos imunossupressores na manutenção da remissão na DII, a longo prazo (144). Vários estudos têm demonstrado a eficácia das tiopurinas e do MTX na DII. No presente trabalho verificou-se que 60.3% dos pacientes com DC e 15.3% dos pacientes com CU iniciaram pelo menos um curso de tratamento com imunossupressores (tiopurina e MTX), e respetivamente 11.6% e 1.9% iniciaram um segundo curso com imunossupressor. A utilização dos imunossupressores na DC está mais bem estudada e relatada, em comparação com a sua utilização na CU, na qual parecem ser menos eficazes. A azatioprina foi o fármaco mais utilizado na primeira utilização de imunossupressores, em 97.7% dos pacientes que fizeram imunossupressor. No que respeita à utilização do segundo imunossupressor, a maioria dos pacientes fez MTX, nomeadamente 97.5%. A eficácia da azatioprina na indução e manutenção da DC está documentada em vários ensaios clínicos randomizados. Na última revisão de Cochrane, IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 77 verificou-se uma vantagem da azatioprina sob o placebo, com um odds ratio de 2.43 (95%CI: 1.62-3.64) na indução da remissão e de 2.32 (95%CI: 1.55-3.49) para a manutenção da remissão (145, 146). No que respeita à CU, as evidências relativamente ao benefício da utilização da azatioprina não são tão fortes, contudo mostram eficácia na manutenção da remissão. Uma meta-analise recente mostrou uma vantagem da azatioprina sob o placebo na prevenção da recidiva, com um odds ratio de 2.56 (95%CI: 1.51-4.34) (147). O MTX é a principal alternativa às tiopurinas, mas apesar de vários estudos terem já tentado esclarecer o papel deste fármaco na DII, o seu valor terapêutico permanece alvo de controvérsia, dependendo inclusive da via de administração utilizada (148). O MTX é normalmente reservado para os pacientes intolerantes ou não respondedores às tiopurinas, motivo pelo qual foi utilizado num pequeno número de pacientes como primeiro imunossupressor e na maioria dos pacientes como segundo imunossupressor. Dos pacientes que fizeram o 1º imunossupressor, verificou-se que 16.1% dos pacientes com DC e 3.5% dos pacientes com CU, necessitaram de tratamento combinado com um agente anti-TNFα, em algum momento após início do imunossupressor. No estudo GETAID, demonstraram-se os benefícios da utilização da terapêutica combinada com IFX nos pacientes com DC, comparativamente à utilização da AZA em monoterapia. Nos pacientes com terapia combinada verificou-se a existência de um maior número de remissões livres de corticoterapia, bem como, de cicatrização da mucosa, comparativamente á monoterapia (149) Estas evidências foram reforçadas, recentemente pelo estudo SONIC, que concluiu favoravelmente em relação às vantagens da terapêutica combinada com AZA e IFX, comparativamente à monoterapia com AZA, e à monoterapia com IFX, na manutenção da remissão clinica sem corticosteroides, em pacientes com DC moderada a grave (117). Os benefícios da terapêutica combinada com AZA e IFX, na CU moderada a grave, foram também recentemente demonstrados por um estudo, ainda não publicado (UC SUCCESS), que refere a superioridade do tratamento combinado, em comparação com a monoterapia com AZA ou com IFX na indução da remissão, sem corticosteróides, bem como na cicatrização da mucosa intestinal (150) Apesar da frequente utilização da AZA na DII, e da sua aplicação estar bem definida nas guidelines atuais, alguns estudos têm relatado a inexistência de significância estatística que confirme os seus benefícios. Esta diferença parece relacionar-se com alguns aspetos particulares do tratamento, nomeadamente a sua duração (151). No presente estudo, a duração média do tratamento foi bastante diferente para as duas DII consideradas, verificando-se uma duração média de tratamento de quase 3 anos para a DC e de menos de 2 anos para a CU. A maioria dos pacientes que interrompeu o tratamento antes dos 6 meses, fê-lo devido a reações adversas. Apenas um paciente IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 78 necessitou de fazer escalada para um agente anti-TNFα após um mês de tratamento, e outro suspendeu o imunossupressor ao terceiro mês por ausência de resposta e agravamento clinico. Na DC, os imunossupressores foram utilizados com maior frequência nos indivíduos que apresentavam localização ileocólica (L3) ou atingimento do trato digestivo proximal (L4), bem como naqueles com doença de comportamento penetrante ou estenosante. Ainda na DC, foram os pacientes com diagnóstico da doença em idade mais jovem (A1), que mais necessitaram de terapêutica imunossupressora. A existência de doença perianal nos pacientes com DC associou-se a uma necessidade aumentada de utilizar tratamento com imunossupressores. Na CU os indivíduos com doença extensa (E3) utilizaram imunossupressores com maior frequência. Estes dados podem ser explicados pelo facto dos fenótipos referidos se associarem a doença mais grave, e como tal, haver uma maior necessidade de recorrer a terapêutica de segunda linha. A localização da doença, na DC, parece ser um importante fator preditor da progressão da doença (152). Foi já verificado um maior risco de progressão para doença complicada nos indivíduos com doença do intestino delgado, comparativamente à do cólon (152, 153). O comportamento estenosante e o comportamento penetrante foram também associados a uma evolução mais agressiva, constituindo inclusive preditores da futura necessidade de cirurgia (154). A existência de manifestações perianais nos pacientes com DC constitui um outro preditor com forte correlação no risco de desenvolvimento de complicações nestes doentes (152, 153). Além disso, estudos envolvendo sobretudo a população pediátrica mostraram evidências dos benefícios do tratamento precoce com imunossupressor nos doentes que apresentam um maior risco de evoluir para doença agressiva. Para a CU, os preditores de mau prognóstico não se encontram bem avaliados por estudos de grande impacto. Contudo, alguns estudos de menores dimensões identificaram a extensão da doença como um indicador da necessidade hospitalização, bem como de colectomia (155, 156). A indicação mais frequente para imunossupressão, nos pacientes que utilizaram as tiopurina como primeiro fármaco, foi a gravidade da doença, seguindo-se a corticodependência e a profilaxia pós cirurgica. Nos pacientes que fizeram MTX como primeiro imunossupressor, destaca-se como principal indicação a existência de manifestações extraintestinais. Tendo em conta as evidências atuais de que algumas características da doença constituem preditores de curso mais agressivo, e se relacionam com a necessidade de cirurgia GI e de aumento do risco de cancro colo rectal, é lógico que a utilização precoce dos imunossupressores nos doentes que apresentam estas características pode ser uma importante arma para travar a progressão da doença. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 85 que estavam em remissão clínica; da mesma forma, os pacientes com CU apresentavam um aumento do número absoluto (mas não das percentagens) destes monócitos quando comparados com os pacientes com DC. O fato dos 5 pacientes com CU avaliados, mas apenas 4 dos 14 pacientes com DC, apresentarem doença clinicamente ativa, pode explicar os valores mais elevados dos números absolutos de monócitos CD16+ no primeiro caso. Existem alguns fatores que podem explicar as diferenças encontradas entre os diversos estudos publicados. Pensa-se que a infiltração preferencial dos tecidos inflamados, nomeadamente da mucosa intestinal por monócitos CD16+ pode resultar quer de um maior recrutamento dos monócitos CD16+ circulantes em resposta a quimiocinas produzidas localmente, quer de uma diferenciação local dos monócitos CD14+forteCD16em monócitos CD14+fracoCD16+ em resposta a citocinas e outros estímulos (56), contribuindo desta forma para a perpetuação da inflamação. A primeira hipótese aponta para a possibilidade de controlar a inflamação da mucosa intestinal atuando precocemente sobre os monócitos CD16+ circulantes, princípio este que está subjacente à utilização da leucaferese para tratamento da DIIC. De fato, a leucaferese com remoção dos monócitos CD16+ tem sido estudada e utilizada com sucesso variável no tratamento da DII, em particular na CU (206, 208, 209). Tendo em conta estes fatores, poderíamos pensar que os níveis de monócitos CD16+ no sangue periférico dependem de múltiplos fatores, incluindo o tempo de evolução da doença, a sua gravidade e fase de atividade, e a terapeutica instituída, que podem ser determinantes para uma maior ou menor grau de ativação das células do sistema imune, níveis de citocinas e quimiocinas, diferenciação destes monócitos em células dendríticas apresentadoras de antigénios e/ou migração para os tecidos inflamados.  Efeitos dos fármacos anti-inflamatórios, imunomoduladores e imunossupressores sobre os monócitos CD16+ No que respeita à ação dos fármacos imunossupressores sobre os monócitos, existem na literatura referências ao seu papel na redução dos níveis de monócitos CD16+, tendo sido sugerida a quantificação destes últimos como forma de monitorizar o tratamento (210). No entanto, os conhecimentos acerca dos efeitos dos diversos fármacos anti-inflamatórios, imunomoduladores e imunossupressores sobre os monócitos CD16+ são ainda escassos. Sabe-se, por exemplo, que os corticosteróides provocam uma depleção dos monócitos CD14+fracoCD16+ (211, 212), enquanto o efeito do tratamento com imunoglobulinas endovenosas em alta dose é controverso (213, 214); já o efeito dos diversos tipos de imunossupressores, como os análogos das tiopurinas, sobre estas células é praticamente desconhecido. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 86 Os corticosteróides são amplamente utilizados pelo seu efeito anti-inflamatório e atuam de várias formas nas células hematológicas e no sistema imunitário (215). Entre outros, aumentam a hemoglobina e o hematócrito e a contagem de plaquetas, ao mesmo tempo que afetam os leucócitos circulantes, aumentando os neutrófilos e diminuindo os linfócitos, os eosinófilos e os basófilos, efeitos estes que dependem da dose e do tempo de administração; no que respeita aos monócitos, após a está descrita a ocorrência de monocitopenia transitória, que pode ser seguida de monocitose (216, 217). Crê-se que os efeitos dos corticóides sobre os leucócitos resultam, pelo menos em parte, de uma redistribuição das células; com desmarginalização dos neutrófilos e inibição do recrutamento dos neutrófilos e dos monócitos para os tecidos (218); por outro lado, foi demonstrado que os corticosteróides induzem a apoptose dos linfócitos, sendo este efeito mais pronunciado nos linfócitos T (219). No presente estudo, os doentes medicados com corticosteróides estavam já em fase de “desmame” da corticoterapia, pelo que seria de esperar que as alterações acima descritas, a ocorrerem, fossem discretas. Apesar disso, constatamos a existência de contagens mais elevadas de leucócitos, neutrófilos e monócitos e plaquetas nos doentes que estavam a fazer corticoterapia, em relação àqueles que não estavam medicados com corticosteróides; já a contagem de linfócitos era idêntica nos dois grupos, apesar da diminuição da sua percentagem nos doentes medicados com corticosteróides. Finalmente, era evidente uma redução acentuada da subpopulação de monócitos CD16+ nos doentes com DIIC medicados com corticosteróides, o que está de acordo com outros estudos previamente publicados (211, 212). Tendo em conta o desequilíbrio imunológico que ocorre na DII e o fato da azatioprina (AZA) ser um dos imunossupressores de eleição para o tratamento dos doentes com DII, o esclarecimento do seu mecanismo de ação é importante, não só para otimizar a terapêutica, mas também para uma melhor compreensão da fisiopatologia da doença. Sabe-se que a AZA dá origem a nucleotídeos tri e bifosfatados de 6-tioguanosina e a produtos metilados do seu metabolismo, que têm atividade anti-proliferativa e próapoptótica (220) . Por um lado, inibem a síntese das purinas, necessárias à proliferação celular; por outro, induzem a apoptose dos linfócitos T (221). No entanto, os efeitos da AZA sobre os monócitos, e em particular sobre os monócitos CD16+ são ainda desconhecidos. Comparando os resultados antes e durante o tratamento com AZA, verificamos uma redução significativa da percentagem e do número absoluto de monócitos CD16+ nos doentes que não estavam a fazer corticoterapia quando iniciaram o tratamento com este imunossupressor. Pelo contrário, nos doentes que estavam medicados com corticosteróides quando iniciaram a AZA observamos um aumento da percentagem e do IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 87 número absoluto dos monócitos CD16+, resultante, com grande probabilidade, não de um efeito da AZA, mas sim da suspensão dos corticosteróides, que ocorreu em todos os doentes entre os dois tempos da avaliação. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 88 CONCLUSÕES Apesar do advento de novos fármacos e terapêuticas para a DII, os imunossupressores convencionais, continuam a ser importantes para estes pacientes, e utilizados em grande escala. A sua utilização tem contudo algumas limitações, sobretudo no que respeita às reações adversas que podem causar, e à ausência de resposta em alguns indivíduos. Como tal, durante o tratamento com estes fármacos os pacientes devem ser vigiados e monitorizados, regularmente permitindo intervir rapidamente, reduzindo, suspendendo ou substituindo o imunossupressor, assim que justificável. Em conclusão, os monócitos circulantes CD16+ são células potencialmente úteis como biomarcadores na DII, que no que respeita à avaliação da atividade da doença, quer no que concerne à monitorização da terapêutica com anti-inflamatórios (corticosteróides) e imunossupressores (nomeadamente a azatioprina). PONTOS FORTES Este estudo serviu-se de um grande número de doentes para caracterizar a utilização de imunossupressores na DII, num hospital central da região norte do país. Tanto quanto é do nosso conhecimento, este é também o primeiro estudo em que se avalia o efeito da AZA sobre os monócitos CD16+, tendo sido encontrada uma redução da fração e do número absoluto destes monócitos nos doentes com DII tratados com este imunossupressor, na ausência de corticoterapia. Confirmamos ainda que os doentes com DII tratados com corticosteróides apresentam uma profunda depleção dos monócitos CD16+ no sangue periférico, que é reversível com a suspensão dos mesmos, ainda que, quando os doentes são tratados com AZA, não cheguem a atingir os observados nos indivíduos normais e nos doentes com DII não tratados corticosteróides. Para além disso, verificamos que os pacientes com DIIC com DCA apresentavam um número absoluto de monócitos CD16+ significativamente superior ao dos doentes com DCR e que os doentes com CU tinham um número absoluto de monócitos CD16+ superior ao do encontrado na DC; salientamos, no entanto, que é possível que esta última observação resulte do fato de todos os doentes com CU avaliados, mas apenas parte dos doentes com DC, terem DCA. PONTOS FRACOS Tendo em conta a natureza retrospetiva da primeira fase deste estudo, alguns parâmetros importantes não puderam ser avaliados. Destacam-se aqui os índices de atividade clinica e a cicatrização da mucosa intestinal. Este facto pode também estar na base de algumas variações encontradas, comparativamente aos dados existentes na IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. Rita Ribeiro Dias | Dissertação de Mestrado – Trabalho de Projeto: Relatório de Execução 89 literatura, contudo, uma vez que existem poucos estudos que incluam a população portuguesa, uma comparação direta raramente foi possível. No que respeita à segunda fase do estudo, uma das limitações encontradas foi o número reduzido de doentes estudados, particularmente no que se refere ao grupo de doente com CU, assim como o fato de quase metade dos pacientes terem DRC quando foram avaliados. Não tendo sido o objetivo principal, é ainda necessário considerar que a atividade da doença não foi caraterizada com recurso aos índices existentes para a monitorização das DII, mas apenas de acordo com a existência ou não de manifestações clínicas. Outras variáveis, como a duração da doença, a atividade endoscópica e a classificação de Montreal, que poderiam contribuir para uma melhor diferenciação entre grupos de pacientes com diferentes graus de atividade da doença, não foram discriminados. A estas limitações acresce a variabilidade terapêutica, decorrente de cerca de 1/4 dos doentes estarem a fazer corticosteróides quando iniciaram a AZA, embora em redução de dose com posterior suspensão; bem como do fato de alguns doentes terem feito outros tratamentos enquanto estavam medicados com o imunossupressor. Estas são as fragilidades impostas por um estudo que, apesar de prospetivo, foi assumido como sendo de natureza observacional e que, portanto, em nada interferiu com as decisões clínicas. PERSPETIVAS FUTURAS O conhecimento da prática clinica atual, aliado aos alicerces teóricos sobre a utilização de imunossupressores na DII, será um dado importante na optimização e monitorização do tratamento destes doentes. Seria importante continuar a segunda fase do estudo, alargando-a a um maior número de doentes com DII (DC e CU), quer em fase de doença ativa, quer em fase de doença quiescente, tendo em consideração outros índices de atividade da doença que não exclusivamente a existência ou não de manifestações clínicas. Por outro lado, sendo a AZA um fármaco com ação retardada, cujos efeitos imunossupressores só se atingem em pleno alguns meses após o início do tratamento, é possível que avaliando um tempo posterior após atingir doses terapêuticas de AZA se obtivessem diferenças mais pronunciadas nos níveis de monócitos CD16+. Outro aspeto que importante a explorar é a quantificação diferencial dos dois subtipos de monócitos CD16 (CD14+forteCD16+ e CD14+fracoCD16+), uma vez que estes parecem ter propriedades funcionais distintas; assim como avaliar, por citometria de fluxo, a produção de diferentes tipos de citocinas anti-inflamatórias e pró-inflamatórias por estas subpopulações de linfócitos, em resposta a diferentes estímulos. IMUNOSSUPRESSORES NA DOENÇA INFLAMATÒRIA INTESTINAL: Análise da casuística do Centro Hospitalar do Porto e contributo para o esclarecimento da fisiopatologia da doença. 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