Aplicação de Técnicas de Ressonância Magnética Nuclear ao Estudo de Processos Dinâmicos em Solução

JOSÉ AUGUSTO CALDEIRA PEREIRA Lî€lMCIA80 1M llOQOlMICA (U.P.) APLICAÇÃO DE TÉCNICAS DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR AO ESTUDO DE PROCESSOS DINÂMICOS EM SOLUÇÃO Dissertação para Doutoramento em Química na Faculdade de Ciências da Universidade do Porto DEPARTAMENTO DE < FACULDADE DE CIÊNCIAS DO POETO FOITO 1994 APLICAÇÃO DE TÉCNICAS DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR AO ESTUDO DE PROCESSOS DINÂMICOS EM SOLUÇÃO JOSÉ AUGUSTO CALDEIRA PEREIRA LICENCIADO EM BIOQUÍMICA (U.P.) APLICAÇÃO DE TÉCNICAS DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR AO ESTUDO DE PROCESSOS DINÂMICOS EM SOLUÇÃO Dissertação para Doutoramento em Química na Faculdade de Ciências da Universidade do Porto DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FACULDADE DE CIÊNCIAS DO PORTO PORTO 1994 "Se pudéssemos (...) traduzir filosoficamente o duplo movimento que actualmente anima o espírito científico aperceber- -nos-íamos de que a alternância do a priori e do a posteriori é obrigatória, que o empirismo e o racionalismo estão ligados no pensamento científico, por um estranho laço, tão forte como o que une o prazer à dor." Gaston Bachelard, "Filosofia do Novo Espírito Científico" índice Prefácio xi Agradecimentos xiii I Enquadramento Teórico i 1 Aspectos da química biológica dos catiões bivalentes do grupo 12 3 1. A importância dos catiões metálicos para a vida 3 2.0 papel biológico do zinco 5 3. Aspectos biológicos da química do cádmio e do mercúrio 7 4. Aspectos da química de complexação dos catiões do grupo 12 11 5. Complexos ternários mistos e a sua importância para a química biológica 12 2 Ressonância Magnética Nuclear 15 1. Aspectos básicos da descrição semi-clássica de RMN 15 1.1 Fundamentos a nível nuclear 15 1.2 Fundamentos a nível macroscópico 16 Equações diferenciais de Bloch \ J 1.3 O desvio químico 22 1.4 Acoplamento intemuclear indirecto 24 1.5 Permuta química 25 1.6 Relaxação 26 1.7 Aspectos práticos instrumentais 29 2. Formalismo de operadores para a descrição de experiências de RMN 32 2.1 Operadores de spin 32 2.2 Hamiltoniano de spin nuclear 32 2.3 O operador densidade 33 Expansão do operador densidade em operadores produto 34 Evolução dos operadores produto 3 5 Mapas de ordem de coerência 36 3. Descrição semi-clássica da relaxação em RMN 38 3.1 Teoria BPP da relaxação em RMN 38 3.2 Superoperador de relaxação 39 HamUtonianos de interacção 42 4. Algumas técnicas relevantes de RMN-FT 44 4.1 Supressão do sinal do solvente 44 4.2 Espectros bidimensionais 45 4.3 Medição de 7, e de T2 46 3 Constantes de equilíbrio químico e sua determinação por RMN 49 1. Constantes de estabilidade de complexos 49 Terminologia 49 Complexos ternários mistos 50 Aspectos termodinâmicos do equilíbrio químico $ 1 Estado de referência 53 viii ÍNDICE 2. Cálculo de constantes de estabilidade por RMN 54 2.1 Regressão sobre os desvios químicos de RMN 55 Regressão linear 55 Regressão não linear 60 2.2 Regressão sobre as constantes de tempo de relaxação 61 II Determinação de Constantes de Estabilidade por RMN 63 4 Condições experimentais gerais e métodos de cálculo 65 1. Solventes e reagentes 65 2. Preparação de amostras para RMN 66 Medição do pH 67 3. Condições experimentais utilizadas na obtenção dos espectros de RMN 68 4. Escolha da referência interna 69 5. Os dados experimentais e o cálculo das constantes de equilíbrio 72 5.1 Os conjuntos de pontos experimentais: critérios usados na sua selecção 73 5.2 A escolha dos modelos 74 5.3 A apresentação dos valores calculados para as constantes de equilíbrio 76 5.4 O cálculo de constantes de equilíbrio para o modelo M + L ^* ML 76 5.5 Implementação do método geral de regressão não linear para o cálculo de constantes de equilíbrio 77 5 Associações intermoleculares e constantes de acidez da glicilglicina e da citidina 85 1. Citidina, glicilglicina e a sua interacção 85 1.1 Interpretação do espectro de RMN da citidina em H20 e D20 85 1.2 Interpretação do espectro de RMN da glicilglicina em H20 e em D20 88 1.3 Efeitos nos espectros de RMN da auto-associação da citidina e da interacção intermolecular entre a citidina e a glicilglicina 89 2. Constantes de acidez da citidina e da glicilglicina 90 2.1 Glicilglicina 92 Definição do estado de referência para as experiências de pH variável com glicilglicina 96 2.2 Citidina 98 Definição do estado de referência para as experiências de pH variável com citidina 99 3. Conclusão 100 6 Zinco e cádmio: complexos binários e ternários mistos com citidina e glicilglicina 101 1. Constantes de estabilidade para os complexos binários de Zn2+ e Cd2+ com citidina 102 1.1 Variação do desvio químico em função da concentração de catião metálico (pH fixo); efeito dos catiões e dos aniões 102 Cálculo de constantes de estabilidade 109 1.2 Variação do desvio químico em função do pH 114 2. Constantes de estabilidade para os complexos binários de Zn2+ e Cd2+ com glicilglicina 118 3. Constantes de estabilidade para os complexos mistos de Zn2+ e Cd2+ com glicilglicina e citidina 125 3.1 Variação do desvio químico em função da concentração de catião metálico (pH fixo) 127 Cooperatividade na formação dos complexos ternários 130 3.2 Variação do desvio químico em função do pH 132 4. Conclusão 136 ÍNDICE ix 7 Mercúrio: formação de complexos com citidina e glicilglicina 139 1. Glicilglicina 139 1.1 Estudo das espécies em solução 140 Em solução aquosa 140 Em solução de água deuterada (D,0) 147 Uma visão integrada 150 1.2 Constantes de equilíbrio para o sistema Hg2+/glicilglicina 152 Por medição da área de sinais em espectros de H (variação do pH e das concentrações) 152 Por medição dos desvios químicos (variação do pH) 154 2. Citidina 158 2.1 Estudo das espécies em solução 159 2.2 Constantes de equilíbrio para o sistema Hg27citidina 166 3. O sistema ternário Hg(N03)2 / Citidina / Glicilglicina 174 3.1 Estudo das espécies em solução 174 4. Conclusão 175 IH Cálculo Teórico e Determinação Experimental de Constantes de Relaxação Transversal em RMN 179 8 Cálculo teórico e determinação de constantes de tempo de relaxação transversal, T2 181 1. Cálculo teórico de T2 182 1.1 Método 182 1.2 Computação 185 1.3 Resultados 186 2. Medição de T2 para transições de quantum nulo e quantum duplo num sistema AX 188 2.1 Condições experimentais 192 2.2 Sequências de impulsos 192 2.3 T2QN e 72QD para os núcleos H-5 (A) e H-6 (X) da citosina 196 Apêndice 199 Resumo 231 Résumé 232 Abstract 233 Bibliografia 235 Prefácio A ESPECTROSCOPIA DE RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) é um método instrumental privilegiado para o estudo de muitos processos dinâmicos que ocorrem em solução. Devido à escala de tempo característica desta espectroscopia, que utiliza frequências da ordem dos megahertz, é possível em muitos casos obter espectros RMN que podem fornecer, directa ou indirectamente, informação sobre equilíbrio químico, fenómenos de permuta, movimentação intramolecular e relaxação nuclear. A criação, desenvolvimento e aplicação de técnicas de RMN para o estudo destes fenómenos são actividades de investigação vastas e ainda em grande expansão. Uma das áreas de particular interesse e dificuldade é a química biológica, nomeadamente a bioinorgânica e a química das macromoléculas, assuntos em que as técnicas instrumentais têm vindo a ganhar cada vez maior importância. O estudo do papel dos catiões metálicos na matéria viva tem revelado a sua importância fulcral para muitos processos bioquímicos essenciais, com funções reguladoras, estruturais ou coenzimáticas. Os catiões metálicos como cofactores enzimáticos encontram-se invariavelmente coordenados a proteínas, numa grande variedade de geometrias, através dos aminoácidos das cadeias polipeptídicas ou de coenzimas específicas. E portanto de grande interesse o estudo do equilíbrio de complexação dos catiões metálicos com ligandos biológicos, nomeadamente com mistura de diferentes tipos de grupos coordenantes, tendo em vista o estabelecimento de modelos para a sua actuação e considerando que a regulação da sua actividade está intimamente relacionada com aspectos do equilíbrio de associação a esse tipo de ligandos. A estereoespecificidade e a dinâmica intramolecular são também aspectos essenciais para o funcionamento de macromoléculas como as proteínas enzimáticas ou os ácidos nucléicos e o seu estudo em solução tem-se tornado cada vez mais necessário para compreender certos aspectos do seu modo de funcionamento, uma vez que a informação estrutural obtida através da técnica de difracção de raios X está limitada ao estado sólido. xii PREFÁCIO Numa tentativa para contribuir para o estudo de alguns aspectos da química biológica focados nos dois últimos parágrafos, e aproveitando as já referidas potencialidades da ressonância magnética nuclear para o estudo de processos dinâmicos em solução, foi estudado no trabalho descrito nesta dissertação o equilíbrio de complexação de dois ligandos biológicos, citidina e glicilglicina, com os catiões bivalentes do grupo 12 (Zn(II), Cd(II) e Hg(H)), metais com um papel relevante em química biológica. Foram também desenvolvidos instrumentos teóricos e práticos para o estudo da relaxação nuclear, tendo em vista a dependência daquele fenómeno da movimentação molecular e a utilização dos parâmetros de relaxação (Tt e T2) para o seu estudo. Esta dissertação está dividida em três Partes; na Parte I é esboçado o quadro de referência teórico e são definidos os conceitos básicos para a compreensão e execução do trabalho experimental. Esta Parte é constituída por três Capítulos dedicados à descrição de alguns aspectos da química biológica dos catiões metálicos do grupo 12 (Capítulo 1), da espectroscopia de RMN (Capítulo 2), e da metodologia utilizada para a determinação de constantes de equilíbrio por RMN (Capítulo 3). Na Parte H, dividida em quatro Capítulos, é apresentado o estudo da formação dos complexos binários e ternários mistos de citidina e glicilglicina com zinco(II), cádmio(II) e mercúrio(II). No Capítulo 4 são discutidos aspectos relacionados com a definição dos estados de referência, com a escolha do padrão de referência interna para os desvios químicos e com a aplicabilidade dos métodos utilizados para o cálculo das constantes de equilíbrio. Nos três Capítulos seguintes são apresentados os resultados do cálculo das constantes de acidez dos ligandos referidos (Capítulo 5) das constantes de estabilidade dos complexos formados com zinco(II) e cádmio(II) (Capítulo 6), e das constantes de estabilidade dos complexos formados com mercúrio(II), utilizando espectros de equilíbrio de cinética lenta e rápida na escala de tempo de RMN (Capítulo 7). Na Parte IH (Capítulo 8) é apresentado um método, e respectiva aplicação computacional, para o cálculo de constantes de tempo de relaxação transversal, T2, para um sistema com qualquer número de núcleos, e duas sequências de impulsos para a determinação experimental dessas constantes para as transições de quantum duplo e quantum nulo de um sistema de dois núcleos não acoplados ou fracamente acoplados. 6 CAPÍTULO 1 A estabilidade do seu estado de oxidação +2 é suficiente para impedir um envolvimento directo em reacções de oxidação-redução e, por outro lado, a sua dureza intermédia permite que forme ligações com uma grande variedade de grupos orgânicos de uma forma pouco selectiva. O catião zinco tem um papel essencial na organização da estrutura dos cromossomas nos eucariotas, onde se liga aos nucleotídeos do ADN, bem como na regulação da expressão genética através dos receptores/promotores dedos-de-zinco (zinc-fingers: coordenação do zinco a cadeias polipeptídicas e ácidos nucléicos), na síntese das bases nucleotídicas (aspartato transcarbamilase) e do ADN e ARN (ADN- -polimerase e ARN-polimerase). Está assim intimamente relacionado com o crescimento e desenvolvimento celular e a sua deficiência na dieta provoca crescimento retardado (mental e físico) e malformações corporais. Nas proteínas de armazenamento e transporte de catiões metálicos, como na metalotionina, o zinco está coordenado por quatro átomos de enxofre (resíduos de cisteína) numa geometria aproximadamente tetraédrica. Esta geometria de coordenação também se encontra em proteínas onde o zinco tem uma função estrutural ou reguladora, envolvendo átomos de azoto e enxofre como dadores (Figura 1.2). Nas enzimas em que o zinco tem uma função catalítica (no centro activo) a esfera de coordenação é constituída por átomos de azoto (anel imidazola da histidina), oxigénio (grupos carboxílicos de vários aminoácidos) ou enxofre (cisteína), ficando sempre uma ou duas posições de coordenação livres para a ligação do substrato (geometria tetra-, pentaou hexa-coordenada após a ligação do substrato). (HÍO),., (HÍO),^ ? O' ' \ N S(N) (N) S Z"\ .Zn Figura 1.2— Alguns tipos de grupos dadores e da geometria de coordenação do zinco(ll) em proteínas; a geometria é condicionada sobretudo pela macromolécula quelante. N representa um resíduo de histidina e S pode representar tiolato ou um resíduo de cisteína. (Reproduzido da referência 2) ASPECTOS DA QUÍMICA BIOLÓGICA DOS CATIÔES BIVALENTES DO GRUPO 12 7 A constante de ligação de Zn + às enzimas tem um valor alto, tipicamente da Q ordem dos 10 , mas essa ligação é no entanto bastante lábil, como também o é a ligação do substrato ao catião metálico. O catião Zn(II) tem uma configuração de valência 3d , praticamente não polarizável, e assume várias geometrias de coordenação. Estas características, aliadas à não rigidez dos grupos que ligam o catião zinco às enzimas, tornam possível pequenas variações na sua geometria de coordenação que permitem aumentar a velocidade das reacções catalisadas [2]. As reacções catalisadas pelas enzimas que contêm zinco(II), que é um ácido de Lewis forte, tiram partido da sua capacidade de captação de electrões para a activação dos substratos, aumentando a sua electrofilicidade. Encontra-se assim no centro activo de enzimas intracelulares e extracelulares de degradação hidrolítica de proteínas (carboxipeptidases, aminopeptidases e colagenases) e de ligações fosfato (fosfatases) [3]; uma representação esquemática da configuração do centro activo da enzima carboxipeptidase A pode ser observado na Figura 1.3. 3. Aspectos biológicos da química do cádmio e do mercúrio Os CATIÕES CÁDMIO(II) E MERCÚRIO(II) são prejudiciais para o bom funcionamento celular sobretudo devido ao facto de poderem substituir o catião zinco(II) em muitas enzimas, substituição que reduz drasticamente ou inibe a actividade dessas enzimas por alteração da conformação, e logo da reactividade, do centro activo. Estes iões, sendo mais macios, apresentam grande tendência para se ligarem a átomos de azoto e enxofre e originam geometrias de coordenação diferentes do zinco: o catião Cd(II) prefere formar complexos octaédricos enquanto que o catião Hg(II) tem tendência para formar complexos lineares. Tanto o cádmio(II) como o mecúrio(II) podem coordenar à carboxipeptidase A no mesmo local que o catião zinco(II) mas, como não preservam uma geometria de coordenação tetraédrica, tornam muito pouco favorável a ligação do substrato (grupo carbonilo de um aminoácido numa proteína ou peptídeo), inactivando assim a enzima. Do mesmo modo, o catião cádmio compete favoravelmente com o catião zinco para a ligação à metalotionina desregulando o metabolismo do zinco [4]. 8 CAPÍTULO 1 Figura 1.3 — Disposição dos grupos que coordenam o catião zinco na enzima carboxípeptídase A; a cheio é mostrado o substrato gliciitirosina. (Reproduzido de Biochemistry, L. Stryer, W. H. Freeman and Company, 1981) O mercúrio ocorre naturalmente na crosta terrestre proveniente da dissolução de minerais contendo mercúrio em cursos de água e também devido à acção do Homem, através da mineração, da combustão de combustíveis fósseis e da sua utilização na indústria e na agricultura. O catião mercúrio(II) é muitas vezes metabolizado por microorganismos e plantas a compostos de organomercúrio (R-Hg, R-Hg-R, R-Hg-X, R=alquil, aril, sendo o mais vulgar -CH3 por transferência da metilcobalamina, X=halogeneto, acetato, etc) que, por serem compostos voláteis, se libertam desses microorganismos sob a forma de vapor (Figura 1.4). Estes compostos têm uma acção tóxica muito superior à do catião Hg + nos organismos superiores, devido às características lipossolúveis que lhes permitem atravessar facilmente as membranas celulares e serem absorvidos no intestino. Também ocorrem por vezes outros estados de oxidação do mercúrio para além do divalente, como Hg+ e Hg0, como resultado de reacções biológicas principalmente devidas a microorganismos. ASPECTOS DA QUÍMICA BIOLÓGICA DOS CATIÕES BIVALENTES DO GRUPO 12 9 10 CAPÍTULO 1 Os compostos de mercúrio têm um tempo de semi-vida de vários meses no Homem e actuam por desestabilização das membranas fosfolipídicas, por ligação a todas as proteínas com grupos -SH, destruindo a sua estrutura, bem como substituindo o catião zinco no centro activo de muitas enzimas. Liga-se também fortemente às bases e aos grupos fosfato dos ácidos nucléicos, introduzindo grandes alterações na estrutura do material genético. Todas estas acções do mercúrio e a dificuldade na sua excreção tomam-no tóxico mesmo em pequena concentração, provocando inicialmente alterações do sistema nervoso (encefalite e neurite). O catião mercúrio(II) pode ligar-se nos organismos vivos a hidratos de carbono [5], por exemplo, mas a sua principal acção é a ligação aos grupos amina e tiol das proteínas e ácidos nucléicos. A sua maior tendência é para a coordenação a aminoácidos que contenham átomos de enxofre disponíveis [6-9] mas a sua ligação a aminoácidos através dos seus grupos amina é também importante [10,11]. Talvez o papel mais nocivo do mercúrio nos seres vivos, normalmente sob a forma de metilmercúrio, é o seu efeito mutagénico e desnaturante sobre o ADN por via da sua ligação aos ácidos nucléicos, assunto que tem sido largamente estudado [12-16]. Os complexos de mercúrio e metilmercúrio com aminoácidos, peptídeos e moléculas análogas tem sido muito estudado desde que foi descoberto o seu efeito nocivo nos seres vivos. Tanto a química organometálica como inorgânica do mercúrio e do metilmercúrio desempenham um papel importante em aspectos relacionados com a poluição e toxicidade [17,18] e a procura de antídotos para os envenenamentos por mercúrio têm constituído uma parte importante dos estudos realizados sobre a acção destas espécies mercuriais [19]. O catião cádmio(II) ocorre em menor quantidade que o mercúrio sendo também menos absorvido a nível intestinal. Para além de provocar uma desregulação no metabolismo do Ca2+ e de outros catiões essenciais, tem um efeito nocivo sobre a estrutura das biomembranas, substitui o zinco como ácido de Lewis em muitas enzimas, alterando o seu funcionamento, e liga-se, tal como o mercúrio, aos grupos tiol das proteínas, provocando sintomas de alteração do funcionamento renal [20]. A propensão do catião cádmio para a ligação aos ácidos nucléicos é também bem conhecida, resultando numa acção mutagénica e desreguladora do metabolismo [1]. ASPECTOS DA QUÍMICA BIOLÓGICA DOS CATIÕES BIVALENTES DO GRUPO 12 11 4. Aspectos da química de complexação dos catiões do grupo 12 As CONSTANTES DE EQUILÍBRIO, K, para a formação de um complexo de um catião metálico M com um ligando L segundo a equação (as cargas estão omitidas) ML2nhl...+mLl^MLlmL2nLl... onde nj),... são maiores ou iguais a zero e m é maior que zero, será designada em geral como constante de associação ou constante de estabilidade. A relação desta quantidade com a energia de Gibbs (energia livre da reacção) faz com que ela traduza não só a força das ligações formadas como também a contribuição entrópica para a reacção. Em solução aquosa os catiões metálicos possuem uma esfera de hidratação, ou seja, moléculas de água coordenada, que são substituídas pelos ligandos que entram na (primeira) esfera de coordenação por mecanismos dissociativos (SN1) ou associativos (SN2). Embora condicionado pelo tipo de ligandos que entram e que saiem da primeira esfera de coordenação, são esperados mecanismos dissociativos, principalmente para Zn + e para Cd +, embora para o mercúrio(II) sejam possíveis também mecanismos associativos devido ao seu maior tamanho [21]. As reacções de substituição são rápidas, devido à configuração de valência d10 dos catiões dipositivos do grupo 12 que torna a energia de estabilização do campo do ligando nula, o que determina que as alterações na geometria de coordenação associadas à passagem para o estado de transição ocorram sem grande diferença de energia relativamente ao estado inicial. A velocidade destas reacções é essencialmente determinada pela velocidade da troca com o solvente de moléculas de água coordenada, sendo essa velocidade maior para o zinco e menor para o mercúrio [20]. Os catiões Zn +, Cd + e Hg + são ácidos de Lewis fortes, com um grau de dureza crescente do catião mercúrio(II) para o catião zinco(II). Assim, tanto o cádmio como o mercúrio ligam-se mais fortemente (maiores constantes de equilíbrio) a átomos dadores como o azoto e o enxofre do que o zinco, que se liga mais fortemente a grupos com átomos de oxigénio do que os outros elementos do seu grupo; o catião mercúrio(II) forma ligações estáveis com átomos de carbono ao contrário do que acontece com os catiões cádmio(II) e zinco(II). 12 CAPÍTULO 1 As geometrias de coordenação variam bastante ao longo do grupo: enquanto que o catião zinco forma preferencialmente complexos com geometria tetraédrica (embora também se observem complexos octaédricos deste catião) o cádmio apresenta uma coordenação octaédrica e, mais raramente, tetraédrica. O mercúrio(II) difere radicalmente dos outros catiões do grupo por preferir uma geometria linear de coordenação em complexos com ligandos biológicos, embora sejam conhecidos alguns complexos tetraédricos. A estabilidade dos complexos é condicionada não só pelas características do metal e do ligando (a possibilidade de formação de ligações TC, a carga dos ligandos e do catião, a compatibilidade entre os graus de "dureza" do metal e dos ligandos, a formação de quelatos, etc.), mas para a formação de complexos ternários mistos há que atender à contribuição de factores de estabilidade de natureza essencialmente estatística. Este tipo de complexos, formados por um catião metálico e dois ligandos diferentes, é frequentemente encontrado na química biológica e alguns dos seus aspectos mais importantes serão tratados na secção seguinte. 5. Complexos ternários mistos e a sua importância para a química biológica A QUÍMICA DE COORDENAÇÃO DE CATIÕES metálicos com ligandos de origem biológica tem sido bastante estudada dada a sua importância para a química biológica. Nas secções introdutórias dos capítulos que compõe Parte II desta tese é citada e analisada bibliografia relacionada com a química de coordenação dos catiões do grupo 12 com aminoácidos, peptídeos e nucleotídeos. No Capítulo 3 é dada uma perspectiva matemática da probabilidade de formação de complexos mistos e da sua estabilidade relativa. A observação de que muitos catiões de metais de transição actuam como cofactores enzimáticos levou à procura de modelos in vitro que explicassem o seu modo de actuação na catálise biológica. Foi reconhecido que as esferas de coordenação desses catiões nos centros activos das enzimas, que na sua maioria podem ser designados como "macroquelatos", alguns bastante rígidos, contêm frequentemente uma mistura de diferentes grupos coordenantes e que, devido à imposição estereoquímica (entática) da macromolécula, as geometrias de coordenação são em ASPECTOS DA QUÍMICA BIOLÓGICA DOS CATIÕES BIVALENTES DO GRUPO 12 13 geral muito distorcidas relativamente às geometrias encontradas com ligandos unidentados ou bidentados in vitro. Um outro aspecto importante e particular é a mistura de diversos tipos de ligandos na esfera de coordenação do catião metálico. Foi postulado que a relativa rigidez da proteína coordenante destinar-se-ia a tornar cineticamente estável o complexo de catião metálico para compensar a instabilidade termodinâmica introduzida pela distorção da esfera de coordenação. Essa instabilidade permitiria no entanto aumentar a reactividade e labilidade das posições de coordenação disponíveis para a ligação do substrato, substrato esse que muitas vezes interactua hidrofobicamente ou através de pontes de hidrogénio com outros resíduos de aminoácidos ou coenzimas da proteína. Põe-se assim a questão da importância da interacção entre ligandos para a formação do complexo enzimático bem como da influência dos ligandos da enzima sobre as propriedades químicas do catião, nomeadamente acidez de Lewis e estereoespecificidade, que poderão interferir sobre a ligação de um terceiro ligando (substrato) [21]. Embora não esteja positivamente demonstrado que as características especiais de estabilidade dos complexos ternários estejam directamente relacionadas com a formação dos complexos enzimáticos, esse tipo de complexos ocorre frequentemente na química biológica. Na Parte II é apresentado um estudo sobre a formação de complexos ternários mistos de catiões divalentes do grupo 12 com um nucleotídeo (citidina) e um dipeptídeo (glicilglicina) onde foi avaliada a sua estabilidade relativamente aos correspondentes complexos binários e a eventual presença de cooperatividade. E de realçar que nestes casos não é esperada a presença de interacções hidrofóbicas ou de empilhamento entre os ligandos para a estabilização dos complexos mistos. 2 Ressonância Magnética Nuclear A TEORIA DA RESSONÂNCIA MAGNÉTICA nuclear de transformada de Fourier tem sido abundantemente descrita na literatura, sob os seus diversos aspectos, e o exposto neste capítulo é uma compilação e adaptação de partes de alguns livros de texto [22-27], tendo como critério a selecção dos temas e aspectos fundamentais, e também alguns mais específicos, com relevância para o trabalho experimental. 1. Aspectos básicos da descrição semi-clássica de RMN 1.1 Fundamentos a nível nuclear Os NÚCLEOS ATÓMICOS de muitos nuclídeos possuem um momento angular intrínseco, a, cuja magnitude a é dependente do número quântico de spin 7 : a = [I(I+l)]lrzh/(2K) (2.1) onde h é a constante de Planck. Sendo o momento angular uma grandeza vectorial é necessário definir, para além da sua magnitude, a sua orientação relativamente a uma determinada direcção z, orientação essa que é caracterizada pelo número quântico direcional m/ que pode tomar valores -/ , -7+1,..., 7-1, 7, sendo az = m,h/(2jt) (2.2) No que se segue considerar-se-á apenas o caso de núcleos que no estado fundamental possuam 7 = 1/2. Os núcleos atómicos possuem também um momento magnético intrínseco proporcional ao seu momento angular de spin: M- = /a (2.3) onde 7 é a chamada relação magnetogírica que é característica de cada tipo de núcleo. Para os núcleos utilizados neste trabalho, 13C e 'H, y é positivo com valores de, respectivamente, 6,7283 x IO7 rad TV1 e 26,7519 x IO7 rad TV1. 16 CAPÍTULO 2 Na ausência de um campo de indução magnética externo, B0 (que ao longo deste texto será denominado apenas por campo magnético), ambos os estados de spin nuclear são energeticamente degenerados. A interacção dos dipolos magnéticos nucleares |i com um campo magnético externo homogéneo e estático Bo, paralelo a uma direcção z, introduz uma diferença entre as energias desses estados como resultado do alinhamento da componente fj? paralela ou antiparalelamente com o campo magnético. As componentes fj.x e fly têm uma orientação aleatória (indeterminada), sendo possível considerar, recorrendo a uma analogia com a mecânica clássica, que existe precessão de \i em torno de B0. As energias E dos estados de spin, conhecidas por energias de Zeeman, são proporcionais ao campo de indução magnética aplicado, B0: E = -\L • B0 = -ym, hlÇLn ) B0. (2.4) Para / = 1/2 temos que: AE = hv = Ep-Ea = E.i/2- £+i/2 = yhl{2%) B0. (2.5) Assim, a diferença de energia entre os dois estados de spin e, portanto, a frequência v da radiação electromagnética capaz de provocar transições entre eles, é também uma função da magnitude do campo magnético aplicado e da relação magnetogírica, sendo a regra de selecção para as transições Ami - il1.2 Fundamentos a nível macroscópico EM MECÂNICA QUÂNTICA pode ser demonstrado que o conhecimento de, por exemplo, a componente mz para um núcleo individual introduz uma indeterminação nos valores das outras componentes do momento magnético de spin desse núcleo. No entanto, é possível conhecer com precisão todas as componentes da magnetização total de uma amostra macroscópica que resulta das contribuições dos momentos magnéticos de cada núcleo individual dessa amostra. A justificação deste facto é dada pelo teorema do limite central cujo resultado principal afirma que, independentemente do grau de incerteza relativo ao valor de uma determinada variável para um objecto individual, o seu valor total para um conjunto grande de objectos pode ser conhecido com grande precisão. O comportamento magnético a nível macroscópico de um conjunto muito grande de núcleos pode portanto ser descrito pelos meios da física clássica. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 23 B' = -crBo (2.26) sendo o* a constante de protecção magnética que pode ser diferente de núcleo para núcleo numa mesma molécula. A constante deprotecção magnética o~ varia com a orientação das moléculas relativamente ao campo magnético, devido à anisotropia da distribuição dos electrões, sendo de facto uma quantidade tensorial que depende da estrutura da molécula. No entanto, em situações de rápido movimento molecular em gases e líquidos, o núcleo sente apenas o valor médio da protecção magnética o que permite obter espectros de grande resolução. Uma grande anisotropia de protecção electrónica pode no entanto ser fonte de alargamento de banda e de relaxação para alguns núcleos, mesmo em líquidos ou soluções. Considerando uma amostra fluída, temos para um núcleo i 5z' = (l-o-')50 (2.27) e para a condição de ressonância v1' = \y\ BÍI(2n) = lyl (1 - al)BQ/ (2x) = v0(l - cr') (2.28) Assim, uma maior protecção magnética corresponde a uma diminuição da frequência de ressonância relativamente à frequência na ausência de protecção electrónica, v0. O desvio químico é uma quantidade relativa e define-se como a diferença Vij = Vi - vj = lyl (o-; - cr' )B0/ (2n) = v0 ((7J - <T' ) (2.29) entre um núcleo i e um núcleo ;', que é dependente do campo BQ. A forma mais frequente de definir desvio químico usa a expressão ôij =(Vi-Vj)/Vj =GJ-al (2.30) que é independente do campo magnético e que se exprime geralmente em partes por milhão (ppm). Existem muitas substâncias que são utilizadas como referência interna para RMN, ou seja, substâncias que são dissolvidas na amostra e cuja frequência de ressonância serve como padrão para a medição dos desvios químicos. Estas substâncias padrão devem obedecer a determinados requisitos como por exemplo não interactuarem com a substância em estudo, terem, se possível, apenas uma frequência de ressonância e serem solúveis no solvente utilizado na amostra. Em certos casos é necessário usar uma referência externa que é colocada num suporte estanque, geral- 24 CAPITULO 2 mente um tubo capilar selado, dentro da amostra. Este procedimento não é equivalente a ter uma referência interna porque sendo B0 = \i H0, a permeabilidade magnética do meio, fj., é diferente da amostra para a referência, sendo o desvio químico da referência diferente nos dois meios. 1.4 Acoplamento intemuclear indirecto O ACOPLAMENTO DIRECTO (através do espaço) médio entre os dipolos nucleares é nulo, em termos da contribuição para subdivisão dos níveis de energia, para regimes de rotação rápida e isotrópica das moléculas, proporcionando no entanto um mecanismo de relaxação. Existe, no entanto, um mecanismo indirecto de acoplamento dipolar nuclear por intermédio dos electrões das ligações químicas. Este acoplamento tem como resultado uma pequena contribuição para o campo magnético sentido pelos núcleos acoplados que se traduz no desdobramento dos seus sinais de RMN devido ao desdobramento dos níveis de energia. Os níveis de energia (em unidades de frequência) para os núcleos de uma molécula em movimento isotrópico são obtidos da equação h'xE = -Z, Vj mj + E/<* /;* rrij mk (2.31) onde Vj =\jj I (1 - a1) B0/ (2n) (ver a equação 2.28) e / é a constante de acoplamento escalar entre dois núcleos. O segundo termo da equação 2.31 refere-se precisamente ao acoplamento escalar, sendo as regras de selecção para as transições: Amj = ±1 e Amk=0(k*j). Se um núcleo está acoplado com n núcleos equivalentes (com o mesmo desvio químico e as mesmas constantes de acoplamento) o seu sinal de RMN será desdobrado num multipleto com 2n + 1 sinais de frequências diferentes. As proporções entre as intensidades desses sinais para núcleos de spin 1/2 obedece aos números do triângulo de Pascal para os coeficientes do desenvolvimento da potência n de um binómio. A distância em Hertz entre os sinais do multipleto é, aproximadamente, a constante de acoplamento, /, que é independente do campo magnético B0. A constante de acoplamento toma valores que vão desde zero até às centenas de Hertz, podendo ser negativa ou positiva (embora isso não se reflita num espectro normal) e depende da distância entre os núcleos (número de ligações químicas entre eles) e da estrutura molecular. RESSONÀMCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 25 A equação 2.31 é válida para espectros de 1ordem, ou seja, para espectros em que ôi - ôj » Jij. Diz-se nesse caso que os núcleos estão fracamente acoplados e são por vezes representados simbolicamente por letras afastadas do alfabeto (ex.: AX, AMX). Os espectros que não obedecem à condição 5, - ôj » Jy dizem-se de 2â ordem e apresentam distorções na intensidade e na composição dos sinais dos multipletos. Diz-se então que os núcleos estão fortemente acoplados e representam-se simbolicamente por letras contíguas do alfabeto: AB, A2BC. O desacoplamento entre núcleos ocorre naturalmente, por vezes, mas também pode ser provocado. Quando um de dois núcleos acoplados está em permuta rápida intra ou intermolecularmente (com o solvente por exemplo), o outro sente apenas o valor médio dos estados de spin do primeiro, valor esse que é sempre zero. O desacoplamento pode ser induzido artificialmente através da saturação selectiva de um dos núcleos, que se obtém irradiando um dos multipletos com uma radiofrequência contínua de baixa potência. Este desacoplamento selectivo é geralmente usado entre núcleos da mesma espécie (desacoplamento homonuclear) mas também pode ser heteronuclear. Refira-se também que o desacoplamento pode não ser selectivo, como quando se pretende desacoplar os núcleos de 13C de uma amostra dos núcleos de hidrogénio (desacoplamento heteronuclear). 1.5 Permuta química O EFEITO DE PROCESSOS DINÂMICOS a nível molecular têm muitas vezes reflexo nos espectros de RMN se ocorrerem próximo da sua escala temporal (Figura 2.3). A permuta intermolecular entre locais magneticamente não equivalentes em equilíbrio termodinâmico é um desses processos e os seus efeitos nos espectros de RMN podem ser utilizados para a medição de constantes de equílibrio, constantes de velocidade ou parâmetros termodinâmicos do processo, e, em casos favoráveis, para obter informação sobre o próprio mecanismo da permuta. No chamado regime de troca muito lenta, cada uma das espécies em solução mostra um espectro específico, apesar de se poderem interconverter (Figura 2.4). O espectro total é apenas a soma dos espectros individuais e a largura das bandas é proporcional a (l/72) + (1/T2)mst. (largura natural da banda mais a contribuição da 26 CAPÍTULO 2 não homogeneidade do campo). No regime de troca lenta, embora os espectros das diferentes espécies em troca permaneçam separados podem ser observados alargamento de banda que são proporcionais a (1/ T2) + (1/ r2)inst. + (1/ T^trocaNo regime intermédio de troca os espectros individuais das espécies que se interconvertem desaparecem para coalescer num espectro médio (desvios químicos e constantes de acoplamento médios). Próximo deste regime as larguras de banda são muito elevadas (a detecção do espectro pode mesmo desaparecer) e traduzem fundamentalmente as características cinéticas da permuta. No regime de troca rápida apenas o espectro médio é observado mas com alargamento de bandas devido à permuta, alargamento esse que desaparece no regime de troca muito rápida. Cada núcleo de uma molécula pode ter o seu regime de troca específico no espectro de RMN, para determinadas condições, uma vez que ele é função também da diferença de desvios químicos entre as espécies que se interconvertem. É muitas vezes possível alterar o regime relativamente à escala de tempo RMN fazendo variar, por exemplo, as concentrações das espécies, a magnitude do campo magnético ou a temperatura. 1.6 Relaxação COMO FOI JÁ REFERIDO, O trabalho efectuado por B! sobre a magnetização provoca um aumento da energia do sistema de spins (diminuição de M2 ) devido às transições de estado de spin. Tem também como efeito aumentar a coerência de fase no plano xy A(s') L. 10-4 ler3 TO'2 10'1 10° io1 io2 io3 10* Perfil de banda 13C Perfil de banda'H Transf. de saturação Relaxação 1H Relaxação 1 C Figura 2.3 — Constantes de velocidade e métodos de RMN aplicáveis na sua medida. (Reproduzido da referência 22) RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 27 a)L b) c) d) e) # & Si + <5R <5C B Figura 2.4 — Esquematização de um espectro de RMN de um núcleo i, sem acoplamento escalar, presente nas espécies A e B que se interconvertem; a) cinética muito lenta; b) cinética lenta; c) e d) regimes intermédios; e) cinética rápida; f) cinética muito rápida.: 28 CAPÍTULO 2 que se traduz no aumento de Mx e de My e, consequentemente, numa diminuição da entropia do sistema. O processo de relaxação, que conduz o sistema a uma distribuição de populações de Maxwell-Boltzmann, não ocorre por emissão expontânea de energia. As transições entre as orientações do momento magnético dos núcleos necessárias para o restabelecimento do equilíbrio são provocadas por campos magnéticos aleatórios e flutuantes que existem próximo dos núcleos. O campo magnético isotrópico aleatório total sentido por um certo núcleo é em média nulo e provém da própria molécula ou de moléculas vizinhas em movimento Browniano. Este campo local, que depende de B0, é oscilante sendo composto por um certo intervalo de frequências; a sua componente no plano xy eficaz na promoção de transições é a que oscila com a frequência de Larmor. Esta é a chamada contribuição não-adiabática ou não-secular para a relaxação longitudinal e transversal. A alteração das populações provocado por este mecanismo implica a relaxação de Mz que é um processo dependente de T{ . A incerteza introduzida no estado de spin tem como resultado o aumento da largura de banda e logo contribui para a relaxação transversal, ou seja, para T{ . A componente longitudinal do campo aleatório local não induz transições de spin mas soma-se a B0 provocando assim um alargamento de banda directo por introduzir flutuações nos níveis de energia. Esta é a chamada contribuição adiabática ou secular para a relaxação transversal e consequentemente para T2~l. Existem diversos tipos de mecanismos que levam à relaxação nuclear. Dentre eles, os mais importantes são as interacções dipolo-dipolo (DD), a anisotropia de desvio químico (ADQ), as interacções spin-rotação (SR) e as interacções de acoplamento escalar (AE) (não será aqui feita referência ao efeito de núcleos com momento quadrupolar ou de espécies paramagnéticas na relaxação). Passa-se a descrever brevemente os mecanismos acima referidos; uma descrição mais detalhada será encontrada noutras secções. DD - A interacção dipolar entre núcleos é muitas vezes o mecanismo mais importante de relaxação e tem origem na translação e rotação dos spins na amostra que, ao criarem campos magnéticos aleatórios locais, contribuem para a relaxação nuclear. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 29 ADQ - Como já foi referido, a anisotropia de protecção electrónica provoca variações no campo total sentido pelos núcleos, dependendo da orientação da molécula relativamente a B0. Devido ao movimento molecular cria-se um campo magnético oscilante capaz de provocar transições concorrentes para a relaxação. Esta contribuição depende assim da simetria de distribuição da densidade electrónica em torno do núcleo. SR - A rotação molecular cria um campo magnético com origem nos electrões, que acopla com o spin nuclear. O mecanismo de relaxação é proporcionado neste caso por colisões que interrompem o acoplamento e a sua eficácia depende de um tempo de correlação tSR relacionado com o tempo médio entre colisões. AE - O acoplamento indirecto entre dois núcleos baseia-se na interacção mútua dos seus campos magnéticos e por isso a variação com o tempo de um deles cria um mecanismo de relaxação para o outro. Isto pode ocorrer por duas vias: por troca química (relaxação AE de primeiro tipo) ou por relaxação de um dos spins (relaxação AE de segundo tipo). As constantes de velocidade de relaxação provenientes de cada mecanismo contribuem aditivamente para T{ e T2~. 1.7 Aspectos práticos instrumentais NUM ESPECTRÓMETRO DE RMN-TF (transformada de Fourier) de alta resolução a amostra encontra-se dentro de uma sonda que contém os filtros, circuitos ressonantes e solenóides necessários para a emissão e recepção das ondas de radiofrequência. Contém ainda a possibilidade de aceitar um fluxo de gás e um termopar para o controlo da temperatura da amostra. A sonda encontra-se por sua vez no eixo central de um solenóide supercondutor que gera o campo magnético B0. Estes espectrómetros possuem também electromagnetes (shims) que permitem fazer variações em B0 para a correcção da sua não homogeneidade dentro do volume de amostra a analisar. É também possível fazer rodar a amostra em torno do seu eixo vertical, por meio de um fluxo de ar, com o objectivo de minorar o efeito das variações de B0 no plano xy sobre as formas de banda. 30 CAPÍTULO 2 Pequenas variações de B0 com o tempo (drifting) podem ser detectadas e controladas pelo espectrómetro através da análise da variação da frequência de um núcleo que exista abundantemente na amostra. Devido à utilização frequente de solventes deuterados, com o fim de evitar o aparecimento de fortes sinais de solvente 1 2 nos espectros de H, o núcleo de H é frequentemente utilizado pelos espectrómetros para fazer o encravamento campo-frequência (lock). O computador tem um papel central num espectrómetro de RMN-TF pois é ele que controla a temporização dos acontecimentos pré-programados pelo operador através de interfaces adequados. Os passos para obter um espectro unidimensional simples são: 1-definir uma série de parâmetros que vão ser necessários ao computador para levar a cabo a experiência (largura espectral ou o número de aquisições por exemplo); 2aquisição do FID (evolução e acumulação); 3processamento do FID (apodizações, etc.); 4-transformação de Fourier do FED para obter o espectro de RMN; 5processamento do espectro (ajuste de fase, ajuste da referência, correcção da linha de base, etc.). No passo 1 é necessário definir o número de pontos que vão ser usados para armazenar os FTD's bem como o número de pontos da transformada de Fourier, a largura espectral, a frequência do transmissor, o tempo de relaxação entre dois impulsos e o número de acumulações, entre outros parâmetros. A largura espectral é limitada pela velocidade máxima de amostragem do conversor analógico-digital, como consequência do teorema de Nyquist [30]. O passo 2 é executado automaticamente pelo espectrómetro e inclui a repetição da seguinte sequência: tempo de relaxação - excitação (impulso de radiofrequência) - tempo de espera - aquisição (detecção e armazenamento). O tempo de espera é muito curto e é em geral necessário para possibilitar aos circuitos electrónicos a comutação entre emissão e recepção. Este atraso é responsável por distorções de fase que podem ser corrigidas no passo 5. O passo 3 destina-se a fazer modificações no FDD antes da sua transformação. Em geral procede-se a uma multiplicação do FID por uma função paramétrica com o fim de aumentar a relação sinal/ruído ou aumentar a resolução do espectro. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 31 Após a transformação de Fourier, o espectro resultante mostra quase sempre distorções de fase. Existem distorções não dependentes da frequência, ditas de primeira ordem, e dependentes da frequência (segunda ordem). Estas distorções são corrigidas automaticamente ou manualmente por ajuste numérico. É frequente também ter necessidade de corrigir a linha de base para o nível zero. A intensidade dos sinais é o integral da sua função de frequência e a medição pode ser feita numericamente pelo computador do espectrómetro. As quantidades relativas de cada tipo de núcleo são proporcionais aos seus integrais se não houver truncagem da relaxação ou transferência de polarização por EON (efeito Overhauser nuclear) diferentes de núcleo para núcleo. Esta é uma razão pela qual é quase sempre fácil fazer essa determinação para H e nem sempre o é para C por esta última espécie de núcleo ter maiores e mais variados tempos de relaxação. Factores de erro nesta medição vêm de distorções da linha de base e sobreposição de bandas, por exemplo, sendo difícil alcançar margens de erro inferiores a 5%. Se os integrais forem utilizados para determinações analíticas toma-se necessário recorrer a várias medições para calcular uma média e o respectivo desvio padrão. A sobreposição de bandas implica fazer uma análise da sua forma (lorentziana ou gaussiana) e recorrer a um ajuste paramétrico para calcular os integrais. O método de RMN de onda pulsada tem como vantagem relativamente ao método mais antigo de onda contínua a irradiação simultânea de todas as frequências dentro de um determinado intervalo o que permite obter espectros com maior rapidez. A digitalização e armazenamento permitem somar FID's sucessivos, obtidos com impulsos intervalados de um certo tempo para aquisição e relaxação, o que proporciona um ganho em sensibilidade. A intensidade do sinal RMN é proporcional ao número de acumulações (em condições boas de relaxação) enquanto que a intensidade do ruído é apenas proporcional à raiz quadrada desse número. Outra vantagem do método de onda pulsada é a possibilidade de controlar a orientação da magnetização das mais variadas maneiras. Isso determinou o aparecimento de sequências de impulsos que permitem obter espectros com informação que anteriormente era impossível de obter directa ou indirectamente [31]. 32 CAPÍTVW 2 2. Formalismo de operadores para a descrição de experiências de RMN 2.1 Operadores de spin O MOMENTO ANGULAR DE SPIN de um núcleo ou de um conjunto de núcleos, a que corresponde o operador /, pode ser representado por três componentes com os res2 2 2 2 pectivos operadores Ix, Iy e /„ sendo que I ~IX + Iy +I2 . Definem-se ainda os operadores de subida e descida /+ e /. da seguinte forma: /+ = Ix+ \Iy e /. = Izily. As propriedades destes operadores na base la), 1/3) (representação simbólica para \l, mt) com valores |l/2, 1/2) e |l/2, -1/2) respectivamente) podem ser resumidas pelas matrizes de Pauli, Figura 2.5. 2.2 Hamiltoniano de spin nuclear O HAMILTONIANO DE SPIN NUCLEAR, H, para sistemas em fase líquida com movimento isotrópico, actua apenas, tal como o como o nome indica, sobre as variáveis do spin nuclear e pode ter várias contribuições aditivas, dependentes ou independentes do tempo. Os estados estacionários deste Hamiltoniano são obtidos por combinação linear dos produtos entre os estados de spin (a ou j3 ) das funções de onda de todos os núcleos do sistema. O Hamiltoniano de spin nuclear não dependente do tempo, H0, pode ser expresso como a soma de duas contribuições independentes: uma descrevendo a interacção do spin nuclear com Bo (interacção Zeeman) e a outra relacionada com o acoplamento escalar entre spins: <j3lOt/3> (jSlOtc \a\0\P) {c r = 3/4 4 = 1/2 fi\0\aT\ a\0\a)\ c'a '-pa '-[Ô3 Figura 2.5 — Definição da matriz de Pauli para um operador genérico O e para os operadores de spin cartesianos e de subida e descida na base( la), I/3)) definida no texto. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 39 chamada condição de estreitamento extremo onde J(QÍ) ~ TC que é a situação mais vulgar para pequenas moléculas em solventes muito pouco viscosos. Para macromoléculas, no entanto, Ti tem valores menores (relaxação mais rápida) uma vez que tc pode atingir valores mais elevados e a aproximação J(co) ~ TC não é válida. Para T{ existe contribuição secular e não secular o que permite deduzir a expressão 7Ï1 = (27,)-1 + (1/2) y2 (Bx\2 /(O) (2.47) Uma vez que Bz não provoca transições, o último termo de 2.47 depende de 7(0). A teoria BPP é válida apenas no regime de colisões fracas em que Tc < T2. 3.2 Superoperador de relaxação Para a equação de variação de o~ com o tempo é necessário usar um Hamiltoniano que seja a soma do termo da interacção de Zeeman e da interacção indirecta (acoplamento escalar) com uma componente que descreve o acoplamento do sistema de spins com a rede, conducente à relaxação. O fenómeno da relaxação pode ser considerado como tendo origem numa perturbação aleatória e dependente do tempo que contribui uma componente estacionária Hi(t) para o Hamiltoniano total: H = H0+ Hi(t). Assim temos que: d cr/dr = -i [H0 + Hi(t), cr] (2.48) O desenvolvimento do comutador permite escrever a equação 2.48 sob a forma d cr/dr = -i [Ho, o] - i [H~Ãtj, cr] (2.49) O termo [H0, cr] pode ser considerado como um superoperador H gerado por 770 que tem como funções próprias combinações lineares de operadores produto (representação de o) [36]. No caso dessas combinações representarem transições, os valores próprios serão as frequências das transições respectivas. O termo [H\(t), <J] representa a interacção do sistema de spins com a rede e pode igualmente ser considerado como o superoperador de relaxação T gerado por Hi(t) que actua sobre a e cujos valores próprios são as probabilidades de transição entre dois elementos da matriz densidade. A expressão do movimento de a na base de H0 permite assim obter a equação matricial d a làt = (-ÍH - R) a (2.50) 40 CAPÍTULO 2 onde H é a supermatriz do Hamiltoniano independente do tempo e R é a supermatriz de relaxação cujos elementos determinam o decaimento dos elementos do operador densidade para o seu valor de equilíbrio, OQ e que, devido à estacionaridade de Hx{t), são constantes no tempo. É de notar que este decaimento pode não ser monoexponencial, como geralmente se admite. A equação 2.50 pode muitas vezes ser simplificada se for sujeita a uma transformação unitária [37,38] Xda/dr = X(-iH - R)X_1 Xe (2.51) que diagonaliza H e transforma os produtos de operadores (na expansão de <7 referida anteriormente) em operadores de transição e os elementos de R nas suas velocidades de relaxação. Para o cálculo dos elementos de R podemos expandir o Hamiltoniano de interacção com a rede da seguinte forma: H,(t) = 2Z<,K{q¥q\t)V(q) (2.52) onde V-q) (V'q) = V-q)t) são operadores que actuam apenas no sistema de spins, Y^q) (F (f) = T (t)) são funções aleatórias clássicas representando o tipo de movimento da rede e K q é uma constante de interacção. O índice q distingue as componentes dos tensores irredutíveis que definem as diversas interacções que se podem considerar. Esta forma de exprimir a interacção do sistema de spins com a rede, que traduz o carácter semi-clássico da teoria, permite definir vários tipos de mecanismos de relaxação (dois exemplos serão considerados detalhadamente mais adiante). Nesta formulação semiclássica não se consideram estados discretos na rede e o seu acoplamento com o sistema de spins, este sim descrito por operadores adequados à interacção, é dado por funções aleatórias reais dependentes do tempo. A equação 2.48 pode ser modificada para a sua representação de interacção usando as substituições (ynt = e^(Je-^ (2.53) //1(r)int = ei/v//1(r)e"i"0' (2.54) obtendo-se: dc^Vdr = -i[//1(í)'m, Ó (2.55) Integrando 2.55 por aproximações sucessivas até segunda ordem (variáveis 11 î') t diferenciando novamente usando uma substituição de variável (t -1' = x) obtém-se: RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 41 do^/df = - Jo°°[//1(r)mt,[//1(í-T)mt,oínt(r)-ob]] dr (2.56) onde a linha superior indica, como foi definido anteriormente, a média entre todos os sistemas da amostra macroscópica no intervalo de tempo T. Na obtenção de 2.56 foi considerada desprezável a correlação entre H^(t)mt e (j ao fazer a média sobre todo o volume; (f11 representa agora essa média. A dedução feita para obter 2.56 é válida para íc « t, Tu T2 onde tcéo tempo de correlação dos processos aleatórios descritos por Y. Para reescrever 2.56 na forma de operador considera-se a expansão de H\(f) na sua forma de interacção: Hi®" = e** Hi(t) e w<* = I,X? IÓq) ^(t) Vp(q) è °>M '. (2.57) Uma vez que Vp(q) são operadores próprios do superoperador Hamiltoniano, o índice p relaciona estes operadores com as frequências (ûp que são os valores próprios do superoperador. A substituição de H\(t)m em 2.56 implica a definição da função de auto-correlação de Y g{q-q\x) = y^o y^V*), (2.58) que é uma função real e par, bem como da função da potência de densidade espectral gerada por F, que se pode calcular fazendo a transformada de Fourier de 2.58: J(q'q\co) = \~g{q-q\x)ciú*dt (2.59) Obtém-se assim uma expressão geral para o superoperador de relaxação do^/dr = -£? Ay /** (cop{q)) [V/\[Vp{q), <f\t)-G^. ]] pP«** (2.60) que é a equação de relaxação de (f11 na forma de operador. Duas simplificações nesta equação são justificáveis [35]. A primeira pressupõe que, ao fazer a média, as funções r (t) são estatisticamente independentes, ou seja, que g{q'-q\i) = K<8{q\i) (2-61) J{q--q\(0) = òqrqSq\có) (2.62) o que permite elimina a variável q' no somatório da equação 2.60. A outra vai restringir a equação 2.60 aos termos seculares, ou seja, àqueles para os quais Cùp = -(ûp- (e ^ ^ = 1). Esta condição apenas se verifica para p=p, o que elimina p' do somatório em 2.60. Obtém-se assim a forma simplificada de 2.60 dcTVdr = -SA /q) (ÛV(,)) [VW • ^(O-ok,. ]]. (2.63) 42 CAPÍTULO 2 Tal como Ho, o superoperador de relaxação é invariante quanto à transformação do referencial rotativo para o referencial do laboratório. É agora possível reescrever 2.49 como dcr(f)/df = -iH{a(t)} - r{ o-(í)-o-0} (2.64) onde H {cr} = [H0,a] e H cr} = lqlp ./<«> (0^) [V^\[V^ , C7]] (2.65) Estas equações formam a base da análise quântica dos espectros de RMN. A equação 2.65 foi usada para o cálculo computacional de constantes de relaxação transversal na terceira parte deste trabalho. Representando a equação 2.56 numa base do Hamiltoniano H0, com funções próprias loc> e l(3>, obtém-se a equação generalizada da variação da matriz densidade com o tempo, equação de Redfield [34]: dcw^/dr = ILpp e-i(fl*^' R^ pp (cr^^-Ofljeq.) (2.66) onde Root pp são os elementos da matriz de relaxação de Redfield. A restrição do somatório aos termos seculares ((%-<%« = 0) torna 2.66 invariante quanto à mudança de referencial permitindo obter dCW/d/ = -iCOadGatiiO + £/3/? Roei ffl (Gffl-Oppeq) (2.67) que é a representação matricial de 2.64. A evolução, na representação de interacção, do valor macroscópico observado Q(t) de um operador Q que actua sobre um sistema S é dada por [26]: d(0/dí = tr{(2doint/dí} = !,£, /%*«) ( <[y/?),[v/?),2]]> - ([V^AV^mU ) (2.68) ImpKcitas nas equações de Bloch (2.10) estão as relações d</z>/dí = -«/2)-</z>eq.)/r1 (2.69) à(Ix,y)/dt = -(Ix,y)/T2 (2.70) É assim evidente que se se substituir Q por Ix, Iy ou Iz em (2.68) e a sua simplificação conduzir a (2.69) ou (2.70) as velocidades de relaxação serão os coeficientes do membro direito de (2.68) [25]. Hamiltonianos de interacção Os elementos da expansão do Hamiltoniano de relaxação dependem do tipo de interacção e do tipo de movimento molecular. Este Hamiltoniano pode ser dividido RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 43 em várias parcelas em que cada uma representa um tipo de relaxação: H\ = HVD + H&DQ + H&E + ... (2.71) Para a energia potencial mútua de interação entre dois dipolos magnéticos temos classicamente: U = {(n*-|i/)/rtí3 - 3(^.rtí)(nrrtí)/r5} /JJ(4K) (2.72) onde rtí é o vector distância entre os dois dipolos (núcleos) k e / (ver Figura 2.6), com módulo ru, e jio é a constante de permeabilidade magnética do vazio. O Hamiltoniano correspondente é obtido fazendo a substituição (i = y(hl{2n)) I: #DD = r3 ykyi Wm?jUo/(4?r) {(I*-I/) - IQvràÇLrràlru) (2.73) Expandindo os produtos escalares em coordenadas polares, Figura 2.2, e generalizando para um número N de spins, obtém-se a expressão deste Hamiltoniano em termos de um tensor esférico irredutível de operadores [25]: #DDW = Sfc-i/r-i^wt</Z,-.W Du Y2JJq\dki(t),(pki(t)) VH(<,) (2.74) com Vtí{0) = lXl - (l/4)(//// + /*/+'), Vtí{±l) = -(3/2)(///±' + í±%1) e Vtí(±2) = -(3/4) M onde du e (pu são os ângulos formados pelo vector internuclear rtí e a direcção do eixo dos zz (ver Figura 2.2) e em que Dtí = rtí*3 %y {hl{2z)f /V(47c) é por vezes designada constante de acoplamento dipolar. O Hamiltoniano HDD é flutuante devido ao movimento molecular rotacional, considerado neste trabalho como aleatório e isotrópico, que modula as funções Y2jdq) que possuem valor médio 0 e média r.m.s. 1. A potência do campo magnético x s Figura 2.6 — Definições geométricas para a interacção dipolo-dipoto entre dois núcleos ke I. 44 CAPÍTULO 2 aleatório gerado por este movimento para interacções intramoleculares pode ser relacionado com o seu tempo de correlação rotacional TC) sendo proporcional a J(a>) tal como foi definido em 2.46. O Hamiltoniano de relaxação por anisotropia de desvio químico é por natureza intramolecular e flutuante, gerado pela reorientação molecular da molécula relativamente ao campo magnético B0. Relativamente ao referencial do laboratório, este Hamiltoniano, à semelhança de HOD, pode escrever-se da seguinte forma HADQ, = E^I^-u Ck Y2}q\ôk{t\(pk{t)) Vk(q) (2.75) com Vk{0)= 2 //, Vk{l)= (6"1/2/2) /+* e Vk{A)= (6"1/2/2) /.*. Para uma simetria cilíndrica do campo de protecção magnética gerado pelos electrões que envolvem o núcleo k, Ck é definido por yk B0 Aç, onde Aç* é a diferença entre a protecção electrónica transversal e longitudinal relativamente ao único eixo de simetria do tensor de anisotropia. A parte geométrica de #ADQ, funções Y2^q\dk(t),(pk(t)), é semelhante à do Hamiltoniano de interacção dipolar, envolvendo dois ângulos que definem a orientação do eixo de simetria cilíndrico relativamente ao campo magnético B0. As características de frequência destas funções, para rotação aleatória e isotrópica, dependem também de TC e são proporcionais a J(cû) [38]. 4. Algumas técnicas relevantes de RMN-FT 4.1 Supressão do sinal do solvente A SUPRESSÃO DO SINAL DO SOLVENTE é muitas vezes necessária devido à grande diferença de intensidade entre os sinais da amostra e o sinal do solvente. Esta diferença faz com que os sinais do soluto desapareçam ou fiquem com uma intensidade muito menor que o esperado (mesmo tendo uma concentração razoável) devido à limitação da resolução e da gama dinâmica do conversor analógico-digital. Na maioria das experiências deste trabalho o solvente utilizado foi a água por ser mais económica que o correspondente óxido de deutério e por possibilitar a observação de sinais de protões em regime de troca com o solvente. Para a supressão do sinal da água podem ser utilizados métodos de pré-saturação ou de relaxação diferencial (WEFT, WATR [39]) mas o método escolhido foi a excitação selectiva devido ao seu bom desempenho no espectrómetro utilizado [40]. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 45 A sequência de impulsos utilizada é conhecida por 1-3-3-1 devido à proporção entre os tempos dos quatro impulsos que a compõem (o superlinhado significa um desvio de fase de 180o): a-1-3a-1-3a-1aaquisição, onde 8a= 90°. A utilização de atenuação na potência do transmissor permite alcançar melhores resultados. O espectro resultante mostra um ponto de excitação nula no centro do espectro, que se faz coincidir com a frequência do sinal da água, e uma distância até ao máximo de excitação igual a l/(2í ). O espectro alterna de fase 180° após cada nulo. 4.2 Espectros bidimensionais Os ESPECTROS BIDIMENSIONAIS são conseguidos usando dois domínios de tempo (t\ e r2) em vez de um (r2) nas sequências de impulsos que os produzem, sendo feitas portanto duas transformações de Fourier para cada um desses domínios. Um dos espectros bidimensionais usados neste trabalho para elucidação de atribuição foi do tipo de correlação de desvio químico heteronuclear. Este tipo de experiência baseia-se na transferência de coerência entre *H e 13C (partindo de uma sequência DEPT ou INEPT [31 e referências aí contidas]). Durante tx os sinais dos núcleos de C são modulados com a frequência dos protões a eles adjacentes, devido ao seu acoplamento, estabelecendo-se assim a correlação entre os seus desvios químicos. O resultado são sinais de correlação entre a dimensão f\ (transformada de t{), onde teremos os desvios químicos de !H, e/2, onde se encontram os desvios químicos do espectro de 13C. Noutros espectros bidimensionais, usadas para a medição de tempos de relaxação de quantum nulo, decorrido o tempo t\ dá-se a transferência de coerência homonuclear entre coerências de quantum zero e quantum único através do acoplamento homonuclear HH. Estes espectros foram adquiridos usando o método TPPI (time proporcional fase incrementation) que consiste no incremento de 90° da fase do primeiro impulso da sequência para cada incremento de t\ [41]. Após a transformada de Fourier real dos pontos da dimensão t\, o espectro obtido é equivalente à execução de detecção em quadratura nas duas dimensões (se for usada a detecção em quadratura usual em t2). Neste modo de detecção torna-se necessário preservar, através dos ciclos de fase apropriados, tanto as coerências de sinal positivo como as de sinal negativo. 46 CAPÍTULO 2 43 Medição de 7\ e de T2 UM IMPULSO DE 180° COLOCA a magnetização em -z o que permite a existência de relaxação puramente longitudinal. Após um tempo t a variação de Mz devida à relaxação pode ser medida aplicando um impulso de 90° para colocar a magnetização no plano xy e medir a sua intensidade. Este é o chamado método da inversãorecuperação uma vez que se baseia na inversão da magnetização e respectiva relaxação de volta ao equilíbrio. O seu decaimento é essencialmente exponencial seguindo a expressão 2.21 para Mz(0) = -M0: MAt)-M0 = -2M0e"Tl (2.76) Para a medição de T2, a magnetização deve ser colocada no eixo dos yy por intermédio de um impulso de 90°*. A dissipação da coerência da magnetização no plano xy do referencial rotativo como resultado da relaxação transversal tem duas contribuições, como já foi referido: a falta de homogeneidade de Bo e os processos aleatórios que criam os campos magnéticos oscilantes responsáveis pela chamada "relaxação natural". A aplicação de um impulso de 180°^ após um tempo t produz, t segundos depois, uma refocagem dos vectores (eco de spin de Hahn [42]) que se dispersaram devido a terem diferentes frequências por experimentarem diferentes campos magnéticos causados pela inhomogeneidade de B0. Esta refocagem dos desvios químicos também elimina os efeitos da relaxação longitudinal que entretanto ocorre bem como imperfeições na duração dos impulsos. Ao fim de um tempo 2r a intensidade do vector magnetização em y é menor que após o impulso inicial de 90° devido à relaxação natural irreversível. Mais sequências de eco podem ser aplicadas em série para obter tempos de relaxação variáveis, experiência que é conhecida por Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) [43]. A intensidade dos ecos é dada por My'(2nt) = My'(0) e"2"/7"2 (2.77) onde n é o número de ecos de spin efectuados. Se a largura das bandas for proporcional apenas a 1/T2, ou seja, quando não existe apreciável contribuição da falta de homogeneidade do campo magnético ou de troca química, é possível medir a constante de tempo de relaxação transversal através da medição da largura das bandas. Inversamente, os valores teóricos para T2 podem ser usados para fazer a simulação dos sinais de um espectro de RMN. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 47 A medição da constante de tempo transversal para coerências de quantum múltiplo pode ser executada da mesma forma, substituindo o impulso de excitação de 90°x pela sequência 90%-1180°*-190°x que produz termos não observáveis de quantum múltiplo. Após a sequência CPMG, durante a qual esses termos diminuem de intensidade devido à relaxação, essa componente da magnetização pode ser observada por transferência de coerência para termos observáveis (quantum único). Deve ser referido que, embora os desvios químicos sejam refocados pela sequência de impulsos CPMG o mesmo não acontece com a evolução do acoplamento escalar, o que se traduz em distorções de fase no espectro observado que serão tanto maiores quanto maior for Int. Isto aplica-se a todas as ordens de coerência afectadas de acoplamento. 3 Constantes de equilíbrio químico e sua determinação por RMN NESTE CAPÍTULO SÃO PRECISADOS alguns conceitos relacionados com o equilíbrio químico, nomeadamente no que respeita à formação de complexos de metais de transição, bem como alguns termos do vocabulário utilizado. Em seguida pretende-se dar uma panorâmica geral sobre as técnicas e os métodos de determinação de constantes de equilíbrio utilizando a espectroscopia de RMN, sendo descritas algumas técnicas gráficas e computacionais para essa determinação. 1. Constantes de estabilidade de complexos Terminologia A terminologia, as definições e os conceitos usados neste trabalho são correntes na área do estudo do equilíbrio químico. Vale a pena no entanto precisar o significado de alguns termos que são largamente utilizados ao longo do texto. O termo "espécie" é utilizado para designar uma molécula ou ião molecular que exista em solução. Em muitas equações químicas serão utilizadas abreviaturas que permitam identificar as diferentes espécies facilmente; essas designações serão clarificadas no texto quando necessário. O termo "forma" é usado relativamente a uma molécula para designar uma espécie que contém essa molécula. Como exemplo pode ser considerado o caso de uma solução de citidina (Cit) e nitrato de zinco (Zn(N03)2) em água; aí serão exemplos de espécies Cit, HCit+, ZnCit2+, Zn2+(aq0, ZnOH+, N03*(aq.), H20, H30+ e OH"; Cit, HCit+, ZnCit2+ são formas de citidina, ZnCit2+, Zn2+(aq.), ZnOH+, são formas de zinco(II) e ZnOH+, H20, H30+ e OH" são formas de água. Grande parte do presente estudo incidiu sobre um tipo de reacções químicas relativamente bem definido, ou seja, a associação molecular através da formação de 56 CAPÍTULO 3 o desvio químico do ligando, <5, num equilíbrio rápido, é dado teoricamente pela equação 3.4 <5=/L<5L+/ML<5ML (3.4) com /L = [L]/L,, /ML = [ML]/Lt e U = [L] + [ML], e onde & e 4a, são os desvios químicos das formas L e ML. A equação 3.4 pode ser reescrita como 8=fML(ôML-8ù + 8L. (3.5) Se se redefinir os desvios químicos relativamente a <5L através das relações A = <5 - <5L ^ML = <5 - 5ML é obtida a seguinte expressão para a equação 3.5: A=fMLAML- (3.6) Usando a expressão da constante de equilíbrio Kn na equação 3.3 obtém-se para a equação 3.6 a forma A = AMLKn[M]/(l+Ku[M]). (3.7) Esta equação pode ser linearizada de três formas: linearização de Benesi-Hildebrand VA = 1/(4ML K,, [M]) + IMML (3.8a) linearização de Scott [M]/A = [M]MML + 1/(4ML Kn) (3.8b) e linearização de Scatchard A/[M] = -KnA + AMLKu (3.8c) Para qualquer destas equações, a regressão linear sobre os pontos experimentais fornece os valores de AML e de K\\ a partir do declive e da ordenada na origem, ver Figura 3.1. Em geral, estas equações aplicam-se quando a concentração total de M (Mt) é muito maior que a concentração de L, o que permite substituir [M] por Mt. Como pode ser observado nos gráficos da Figura 3.1, as três linearizações referidas não são equivalentes no que respeita à distribuição dos pontos experimentais no gráfico e por essa razão a aquisição dos valores experimentais deve prever esse facto para não valorizar um determinado intervalo de concentrações em detrimento de outros. Quando a aproximação [M] = Mt não é válida, é possível usar a regressão linear iterativamente, tal como foi proposto por Nakano et ai. [46]. O método de Nakano é um método iterativo de regressão linear, inicialmente desenvolvido sob CONSTANTES DE EQUILÍBRIO QUÍMICO E SUA DETERMINAÇÃO POR RMN 57 vM co <3 CD .£*. o ao m «:;;; - n ■■■.£■ <D í: ■Os;. 0¥: MSS _N "ÎZ2:. co <s c: CO T3 C CO k. -O CD "O CD C. CD CO a> O O >& CO .H « CD c. <0 ao cd _IOK:;: "D r .O'--'- ca i— .O ■»■■■■■■ 0> O ■a f nu CO X "d W d) C CM 0) 03 Ï7t 2 I :is.í;l cri 01 o 1 3 10 CO T3 a. CO CO .o . w ■ Ol <fl CD >o OJ c CD Q. CD: I 1 2 S 3 CO O» a, U. "D 58 CAPÍTULO 3 forma gráfica, para estudar a formação de complexos 1:1. Quando Kn é menor que 1 mol^dm3 a aproximação A'nfM] « 1 (equivalente a dizer que Mt » [L]) lineariza a função do ajuste e a regressão linear fornece directamente o valor dos parâmetros desejados. O método de Nakano é baseado na execução iterativa da regressão linear para abranger os casos em que não é possível fazer essa aproximação e os seus traços gerais serão delineados seguidamente. Da equação da constante de equilíbrio e dos balanços materiais Kn = [ML]/([M][L]) (3.9a) Mt=[M] + [ML] (3.9b) Lt=[L] + [ML] (3.9c) pode ser deduzida, por substituição na equação 4.1, a equação MJ A = (Mt + L, - [ML])MML + WML*U) (3.10) onde Mt e Lt são, respectivamente, a concentração total de catião metálico e de ligando, [ML] é a concentração de complexo no equilíbrio e 4ML é igual a 5MLÕLAs experiências executadas são do tipo de variação da concentração de ião metálico onde, portanto, Lt é mantida constante e Mt é variada, sendo os dados experimentais constituídos pelos pares (Mt,Á). Um gráfico de MJ A em função de (Mt + Lt) fornece uma primeira estimativa de /IML (recíproco do declive), valor este que é usado para calcular [ML] = L,(4MML) para cada ponto experimental. A repetição da regressão linear sobre os pontos (MJA; Mt+Lt-[ML]), em que [ML] é calculado para cada iteração pela fórmula apresentada atrás, fornece, por seu turno e de acordo com a equação 3.10, sucessivos valores de AML (declive) que convergirão para um valor constante até ao nível de precisão requerido. Depois de atingido esse valor, Kn é calculado a partir da ordenada na origem da função 3.10. Todo este processo de cálculo está exemplificado esquematicamente na Figura 3.2. Os cálculos de constantes de estabilidade pelo método de Nakano mostraram uma elevada rapidez de convergência do processo iterativo mas este método revelou instabilidade ou não convergência para casos em que os erros aleatórios relativos dos pontos experimentais são elevados. Os métodos de regressão linear foram aplicados a casos mais complexos que a associação 1:1 [49,53,54] mas os métodos de regressão não linear são muitas vezes CONSTANTES DE EQUILÍBRIO QUÍMICO E SUA DETERMINAÇÃO POR RMN 59 ■-:■■;■. 100- (a) . 80 ...:,:': 60 L, = 0,1 M L, = 0,1 M ■q .-:.. ., K,f=30M'1 40 4*. = 91 Hz 20 0-4 : C 1 1 1:1 1 1 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 M: (b) 0.008 0.007 0.006 ^ 0.005 2 0.004 0.003 0.002 0.001 o Declive aproximada = 1/4^ (Eq.2.10) i 1 1 1 1 1 r~ 0 0.1: 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 MI+L, (C) 0.008 0.006 [ML] > UÍ^ML) :;?*• Iteração Declive = 1/4»n. Ordenada: na origem = 1/(4^/^,) (Eq.2.10) Mt+L([ML] Figura 3.2 — Esquema de utilização do método de regressão linear iterativa (método de Nakano) descrito no texto, a) Simulação de uma experiência de variação de concentração de catião metálico; b) Gráfico utilizado para a primeira estimativa de A*.; c) Resultado após a primeira iteração com base na regressão linear da equação 2.10. 60 CAPÍTULO 3 mais convenientes para esses sistemas ou para os casos em que não se podem fazer as aproximações que conduzem à linearização das funções de desvio químico. Regressão não linear Este método tem a vantagem da generalidade uma vez que a função a ajustar é derivada das equações de desvio químico e balanços materiais sem ser necessário qualquer aproximação. Seguidamente é exemplificada a dedução da função de desvio químico para o caso 1:1. Das equações 3.9, e por substituição na equação 4.1 aplicada a um sistema 1:1, obtém-se A = Ô-SL = (\L]/U)A. + ([ML]/U)AML (3.11) Atendendo a que AL= 5^-5^=0, obtém-se, por resolução da equação de 2grau, A = (Mt + U + l/Ku - ((H + L, + 1/ATn)2 - 4MtLt)1/2)4MLi/2Lt (3.12) que é a equação do desvio químico em função de quantidades conhecidas e dos dois parâmetros a calcular, Ku e Z\ML» onde é evidente a dependência não linear de A com K\\. O cálculo dos parâmetros é feito por regressão não linear desta função sobre os dados experimentais (Mt,A), que pode ser implementada num programa comercial para microcomputador. Nos casos de equilíbrios mais complexos, em que o sistema em equilíbrio é descrito por um maior número de equações e de espécies (ver, por exemplo, o caso da Figura 4.3), o ajuste pelo método dos mínimos quadrados do conjunto de funções não linearmente dependentes que resulta desses sistemas, torna necessária a resolução de equações de 3S grau ou de grau superior ou mesmo de equações irracionais. Por uma questão de flexibilidade e de generalidade é conveniente optar, nesses casos, por um método iterativo de resolução desses sistemas de equações não lineares, que ocorrem sistematicamente nos cálculos de concentrações em equilíbrio quando a descrição do sistema contém mais que uma equação. Assim, um primeiro processo iterativo é utilizado para o cálculo das concentrações em equilíbrio, a partir dos quais é calculado o desvio químico; uma segunda iteração ajusta os parâmetros do equilíbrio para minimizar a diferença entre os desvios calculados e os observados. O programa descrito no Capítulo 4 para o cálculo de constantes de equilíbrio para qualquer sistema baseia-se nesta metodologia. CONSTANTES DE EQUILÍBRIO QUÍMICO E SUA DETERMINAÇÃO POR RMN 61 2.2 Regressão sobre as constantes de tempo de relaxação Tal como acontece com os desvios químicos, a variação dos tempos de relaxação devido à complexação pode dar indicações qualitativas e quantitativas. Os tempos de correlação tc do movimento nuclear em cada núcleo de uma molécula são obviamente sensíveis à formação de complexos; em princípio, a maior alteração será junto da zona de coordenação, cuja mobilidade diminuirá, conduzindo a um aumento de rc. Estas alterações de mobilidade podem ser medidas através dos valores de T{ e T2 devido à sua dependência de rc. De um ponto de vista quantitativo, a determinação das constantes de equilíbrio pode ser feita, tal como para os desvios químicos, por ajuste de uma função do equilíbrio à variação dos tempos de relaxação T, ou velocidades de relaxação, R = l/T, com a variação da concentração de uma espécie. No caso de um equilíbrio rápido de estequiometria de complexação 1:1 é válida a expressão análoga a (3.4) *=/IA+/MLKML (3.13) que com as substituições AR=R-RL ARML = R-RML permite obter AR = ARMLKn[M]/(l+Ku[M\) (3.14) que é análoga à equação 3.7. As técnicas já descritas para a linearização de (3.7) são aplicáveis a esta equação que, alternativamente, pode também ser usada para um ajuste não linear. II Determinação de Constantes de Estabilidade por RMN NA PARTE II DESTA DISSERTAÇÃO são apresentados os resultados experimentais referentes ao cálculo de constantes de equilíbrio por ressonância magnética nuclear para os sistemas compostos pelos catiões do Grupo 12, Zn", Cd2* e Hg2*, e por ligandos biológicos, principalmente citidina e glicilglicina. No Capítulo 4 são descritas as condições experimentais comuns a todas as experiências executadas no que se refere a reagentes, preparação de amostras, condições de obtenção dos espectros, programas de cálculo e critérios de apresentação de resultados. E discutida também a escolha da referência interna para os desvios químicos. Nos Capítulos 5 a 7 são expostos e comentados os resultados obtidos para o cálculo de constantes de equilíbrio em vários sistemas. O Capítulo 5 é dedicado ao estudo das interacções intermoleculares entre os ligandos (citidina e glicilglicina) e entre estes e o catião H*. No Capítulo 6 estão reunidos os resultados do estudo dos sistemas contendo os catiões mais leves do grupo 12, Zn* e Cd2*, com citidina e/ou glicilglicina (incluindo os complexos ternários mistos) devido à semelhança de resultados obtidos para esses catiões. No Capítulo 6 são também discutidas a influência da força iónica e dos aniões sobre os desvios químicos observados para os ligandos, as condições de aplicabilidade das técnicas de pH fixo e pH variável e a escolha do estado de referência. No Capítulo 7 são apresentados os resultados do estudo qualitativo e quantitativo dos sistemas contendo nitrato de mercúrio, citidina e/ou glicilglicina. Para esse estudo foram utilizado métodos para obter condições de equilíbrio de cinética lenta e rápida nos espectros de RMN com o objectivo de recolher mais informação sobre as espécies presentes em solução. 4 Condições experimentais gerais e métodos de cálculo NESTE CAPÍTULO SÃO DESCRITAS as condições gerais de obtenção dos dados experimentais, é explicada a aplicação dos métodos computacionais que serviram para o seu processamento e são definidos os critérios para a avaliação da qualidade dos resultados. As condições experimentais específicas usadas em cada experiência serão descritas, em pormenor, nos capítulos seguintes referentes aos resultados experimentais. 1. Solventes e reagentes Os SOLVENTES UTILIZADOS foram óxido de deutério (D20), com pureza isotópica de 99,9% (Aldrich), e água desionizada e bidestilada em quartzo, com uma resistividade superior a 4x 10 ohm cm. Os espectros de RMN da água não mostraram nenhum sinal proveniente de impurezas, pelo menos até ao número máximo de acumulações normalmente usado nos ensaios; o D20 apresentou apenas o sinal de HOD. Todos os reagentes foram obtidos comercialmente e utilizados sem qualquer purificação adicional, excepto quando especificamente mencionado nas secções seguintes. Os aminoácidos e derivados (glicina, glicilglicina, acetilglicina e glicilsarcosina) foram obtidos na Merck {pro analyst, p.a.), enquanto que a citidina (anidra) foi obtida na Aldrich. Os sais referidos seguidamente foram obtidos na Aldrich, com uma pureza igual ou superior a 98%: KN03, KC1, KBr, Ca(N03)2.4H20, CaCl2.2H20, CaBr2.2H20, Zn(N03)2.6H20, ZnCl2, ZnBr2, Cd(N03)2.4H20, CdCl2 e CdBr2.4H20. Os percloratos Ca(C104)2, Zn(C104)2.2H20 e Cd(C104)2.6H20 foram obtidos na Johnson Matthey/Alfa Products (Alfa) com um grau de pureza igual ou superior a 99,9%. O sal anidro Hg(N03)2 (97%) foi obtido na Fluka. 66 CAPÍTULO 4 Foram preparadas soluções aquosas aproximadamente 1 M dos sais referidos no parágrafo anterior, e o título foi determinado por complexometria de EDTA (Merck Titrisol) [55], com a excepção das soluções de KN03, KC1 e KBr, que foram preparadas por pesagem e dissolução rigorosas dos sólidos condicionados (triturados e mantidos durante 12 horas em estufa a 110°C). O ajuste de pH das soluções aquosas foi feito utilizando quer soluções de um dos seguintes ácidos concentrados (Merck, p.a.): HNO3 65%, HC1 37%, HBr 47%, HCIO4 70%-72%, quer uma solução aquosa a 10% p/p de NaOH (Pronalab) descarbonatada. O ajuste de pD foi feito com soluções, em D20, de DN03 65% p/p e de NaOD 40% p/p, ambas com pureza isotópica de 99% e adquiridas na Aldrich. Como referência interna para RMN foram utilizados rm-butanol (Merck, p.a.; bidestilado e seco sobre sódio), /?-dioxano (Merck, p.a.) e nitrato de tetrametilamónio (TMA; Alfa, 99%). 2. Preparação de amostras para RMN TODAS AS SOLUÇÕES AQUOSAS destinadas a serem estudadas por RMN foram preparadas em balões volumétricos classe A de 2,00 ±0,02 cm , a partir dos volumes necessários de soluções 0,50 M de glicilglicina e/ou de citidina (preparadas na altura da utilização); para os estudos que envolvem catiões metálicos foi também adicionada uma toma de um volume rigoroso (seringa Hamilton de 500 (il) de uma solução de concentração conhecida de um sal desse catião. Foi adicionada a todas as soluções, antes da medição do pH final, uma referência interna para RMN, normalmente íerr-butanol, na quantidade mínima possível (concentração sempre inferior a 0,05 M) que permitisse a detecção do seu sinal nos espectros de C com uma relação sinal/ ruído melhor que 5:1 para o número de acumulações normalmente utilizado (ver secção 4.3). Finalmente, após o ajuste do pH da solução (com ácido ou base concentrados) para um valor próximo do valor requerido, o volume foi completado com água e foi medido o pH final da solução. As soluções em D20, usadas apenas no estudo dos sistemas com Hg2+, foram preparadas em balões volumétricos de 2,00 ±0,02 cm , como descrito no parágrafo anterior, por dissolução de uma quantidade pesada rigorosamente de Hg(N03)2 e CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS GERAIS E MÉTODOS DE CÁLCULO 73 concentração inicial de catião metálico. Este tipo de experiências foi usado no cálculo de algumas constantes de complexação, nomeadamente com a citidina. Foram também usadas para avaliar o efeito da variação da força iónica e da presença de aniões (concentração e tipo) sobre (a) os desvios químicos da citidina e (b) o valor calculado para as suas constantes de complexação com catiões metálicos. No estudo da complexação da glicilglicina por variação de concentração de ião metálico não foi observada coerência interna entre os valores das constantes de equilíbrio calculadas a partir dos desvios químicos de cada um dos seus núcleos. Esta observação, que será discutida mais adiante, impediu a utilização de experiências de pH constante para o estudo dos sistemas com glicilglicina. 5.1 Os conjuntos de pontos experimentais: critérios usados na sua selecção O ALGORITMO QUE É UTILIZADO pelo programa geral de cálculo descrito na secção 4.5.5 (método de regressão não linear), exige a utilização de um número de pontos experimentais superior, em pelo menos uma unidade, ao número de parâmetros a optimizar [63]; neste trabalho, o número de pontos experimentais utilizado foi sempre, pelo menos; triplo do número de parâmetros contidos na função que representa o modelo (constantes de equilíbrio e desvios limite). Em todas as experiências com pH variável procurou-se que os pontos experimentais se situassem essencialmente na zona de pH onde a concentração das espécies intervenientes nas reacções do modelo fosse elevada, ou seja, onde era esperada uma maior contribuição das espécies contidas no modelo para o desvio químico observado. Para tentar minimizar os erros sistemáticos, os resultados experimentais, constituídos por pares de valores concentração-desvio químico ou pH-desvio químico, foram obtidos em pelo menos duas experiências independentes, ou seja, realizadas em alturas diferentes, a partir de diferentes soluções iniciais preparadas independentemente e fazendo uma recalibração do sistema de medição de pH [64]. Os conjuntos de pontos experimentais assim obtidos foram comparados entre si através (a) da sua representação gráfica, que permitiu detectar eventuais diferenças grosseiras, e (b) por um ajuste da função modelo a cada um dos conjuntos, para avaliar sobre a sua concordância. Os conjuntos concordantes foram integrados num só conjunto para 74 CAPÍTVLO 4 execução dos cálculos e obtenção dos valores finais dos parâmetros do modelo. O grupo de desvios químicos de cada núcleo observado do ligando vai constituir um conjunto de dados experimentais. Os espectros de 13C e de 'H dos ligandos estudados neste trabalho apresentam vários sinais, com frequências diferentes, cujos desvios químicos podem, em princípio, ser utilizados para o cálculo de constantes de equilíbrio; no entanto, por razões que serão explicadas seguidamente, só um subconjunto desses núcleos, que pode variar de caso para caso, foi utilizado. Como regra geral foram excluídos os núcleos pouco sensíveis, em termos de variação de desvio químico, à presença do protão e/ou do catião coordenante, essencialmente aqueles que estão distantes, em termos do número de ligações químicas, da posição de coordenação antecipada como a mais provável. Núcleos situados longe dessa posição mas que exibiam desvios consideráveis, foram também eliminados por forneceram em geral valores pouco concordantes com aqueles núcleos que se situam na proximidade da posição de coordenação. Estes critérios permitiram obter subconjuntos de núcleos para os quais os valores calculados de constantes de equilíbrio formam um conjunto homogéneo, e ao mesmo tempo eliminar dos desvios químicos perturbações não relacionadas directamente com a coordenação do catião, permitindo, assim, obter uma menor dispersão dos resultados. Nas secções seguintes, respeitantes aos resultados experimentais, são discutidas as condições particulares utilizadas para cada experiência e referentes, quer à obtenção dos pontos experimentais, quer à escolha do subconjunto de núcleos que foram utilizados para efectuar os cálculos de constantes de equilíbrio. 5.2 A escolha dos modelos NESTE TRABALHO o CONCEITO de modelo é interpretado como o conjunto de equações químicas que pretende descrever o comportamento do sistema em solução; na sua definição procurou-se que o número de espécies fosse igual à soma do número de constantes de equilíbrio linearmente independentes (derivadas das equações químicas do modelo) com o número de balanços materiais (derivados das concentrações totais conhecidas). CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS GERAIS E MÉTODOS DE CÁLCULO 75 No espectro de RMN de um ligando L, o desvio químico de um núcleo i relativamente a uma referência interna, em regime de equilíbrio rápido na escala de tempo de RMN entre as suas diferentes formas lf, podem ser simulados recorrendo à equação geral ^ic^^uQL'l/L,)^ (4.1) designada por equação de desvio químico, onde néo número de formas do ligando L em solução, com desvios químicos 5L- (desvios limite). A utilização da equação 4.1 implica conhecer, ou estimar, os valores de 5*Le das concentrações das espécies 1/ em equilíbrio. Estas concentrações podem ser calculadas, para um determinado conjunto de constantes de equilíbrio (conhecidas e/ou ajustáveis) e de concentrações totais, resolvendo o sistema de equações não lineares definido pelas equações das constantes de equilíbrio e pelos balanços materiais. As constantes de equilíbrio e os desvios limite de valor não conhecido vão formar um conjunto de parâmetros ajustáveis na minimização da função soma dos quadrados dos resíduos para cada núcleo S = £<k=l,m (<5obs - <5obS)2 (4-2) onde m é o número de pontos experimentais e 50bS é o desvio químico observado. A qualidade de um ajuste iterativo, e, consequentemente, do modelo, poderia ser medida através do valor da função S, de que se procura o mínimo absoluto, e do valor da variância dos parâmetros ajustáveis no fim da iteração, que se espera seja o menor possível. No entanto, o cálculo da variância de parâmetros calculados por regressão não linear não tem uma base teórica sólida, uma vez que apenas pode ser estimado [65], e o valor dessa variância não pode ser interpretado de uma forma rigorosa [66]. Por outro lado, o nível de ajuste de uma função modelo a um conjunto de pontos experimentais aumenta com o número de parâmetros usado, independentemente da qualidade do modelo. Assim, os modelos não foram utilizados para provar a existência de espécies em solução, nem a qualidade dos ajustes foi usada para provar a validade de um modelo. A escolha dos modelos foi baseada sempre em considerações relacionadas com o tipo de ligando e de metal, e de informação publicada sobre os seus comportamentos como base/ácido de Lewis [67-70,71,72], por forma a utilizar um número de parâmetros ajustáveis correspondente ao número mínimo de equações químicas necessário para descrever as principais características do sistema em 76 CAPÍTULO 4 solução [46]. Nesse sentido, não se aumentou o tamanho do modelo (número de parâmetros) para encontrar um melhor ajuste aos pontos experimentais (menor soma do quadrado das diferenças) quando esse aumento não foi considerado corresponder ao comportamento esperado do sistema nas condições usadas nas experiências. Nas secções seguintes, respeitantes aos resultados experimentais, serão discutidos os modelos aplicáveis a cada caso. 53 Á apresentação dos valores calculados para as constantes de equilíbrio O RESULTADO FINAL de um processo iterativo de cálculo por regressão não linear foi aceite sempre que um mínimo foi atingido e que o vector final dos parâmetros (valores das constantes de equilíbrio e dos desvios limite) se mostrou independente do vector de parâmetros usado para iniciar os cálculos (na secção 4.5.5 estão indicados os critérios usados pelo programa de regressão não linear para indicar a localização de um mínimo na função soma e interromper as iterações). Os valores das constantes de equilíbrio obtidas neste trabalho são apresentadas de duas formas distintas, dependendo da dispersão dos valores obtidos para os núcleos observados para cada ligando. No caso em que os valores calculados para o subconjunto de núcleos mostram uma pequena dispersão, será apresentada a média aritmética desses valores e o intervalo que traduz os limites dentro dos quais eles se encontram [73]. Por outro lado, para além dos erros aleatórios acumulados ao longo da prossecução de cada experiência, os factores que condicionam os desvios químicos de cada núcleo nas moléculas estudadas intervêm nos valores obtidos para as constantes de equilíbrio de uma forma que pode ser sistematicamente diferente de núcleo para núcleo. Quando o modelo usado na simulação dos desvios dos pontos experimentais fornece valores para cada um dos diferentes núcleos observados com uma dispersão maior do que 0,5 unidades logarítmicas, considera-se que estes refletem influências que não estão incluídas no modelo e por essa razão procurar-se-à apresentar e discutir esses valores individualmente para cada núcleo. 5.4 O cálculo de constantes de equilíbrio para o modelo M + L^ ML O MODELO ASSOCIADO à equação química M + L =5* ML, com K\\ = [ML]/([M][L]) (M é o catião metálico, Léo ligando não complexado e ML o complexo), é o mais CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS GERAIS E MÉTODOS DE CÁLCULO 77 simples que foi utilizado neste trabalho e permite a dedução analítica de uma função resolvente. Foram usados dois métodos iterativos para o cálculo de Ku, cujos princípios foram apresentados no Capítulo 3: um método de regressão linear (método de Nakano) e um método de regressão não linear. Estes métodos, por serem aplicados a um modelo simples que permite a dedução de uma função analítica dos desvios químicos, foram implementados em programas comerciais para microcomputador. 5.5 Implementação do método geral de regressão não linear para o cálculo de constantes de equilíbrio A ESTRATÉGIA PARA CONSEGUIR calcular, por regressão não linear, as constantes de equilíbrio para um sistema com um número arbitrário de equações químicas foi delineado na secção 3.2.1 e seguidamente expõe-se a sua implementação computacional. Na Figura 4.2(a) é apresentado o esquema geral do programa utilizado para a execução dos cálculos onde cada unidade do esquema representa uma subrotina com uma função específica, com destaque para os processos de iteração que foram executados com subrotinas da biblioteca NAG (Numerical Algoritms Group) [63]. Este programa foi escrito em Fortran 77 e executado no computador Cyber 830 do Centro de Informática da Universidade do Porto. No ficheiro de entrada, exemplificado na Figura 4.3(a), é fornecido ao programa o conjunto dos pontos experimentais (X„5óbs)i=i^, onde n é igual ao número de pontos experimentais, X, é o pH ou uma concentração inicial de catião metálico e <5óbS o valor experimental do desvio químico, em Hz, para o ponto i. São ainda fornecidos (a) um conjunto de c parâmetros constantes, C^i^, que são os valores das concentrações totais e das constantes de equilíbrio conhecidas e (b) um vector contendo valores iniciais para p parâmetros ajustáveis, Pj-,j=\f. O ficheiro de entrada contém ainda todos os identificadores alfanuméricos dos valores nele contidos bem como uma constante D, que é o último valor na lista do ficheiro de entrada e cuja finalidade será explicada mais adiante. Todos estes valores são introduzidos na subrotina E04FDF que utiliza, directa ou indirectamente, todas as outras subrotinas representadas na Figura 4.2 para calcular o conjunto de pontos (X,,5^ic) e depois o valor da função S = Z, (ô'obs - (SUIJÍI,*, a minimizar. A subrotina E04FDF, utiliza o método de Gauss [74] para minimizar a 78 CAPÍTULO 4 a) ' Ficheiro de entrada ' I 1 I Valores Identificadores | I numéricas 'alfanuméricos | I J_ I E04FDF(NAG) Decisões sobre a variação dos parâmetros e aplicação do critério de convergência I t LSFUNí Cálculo de: — ( 'aicli-íjt I! II FCN Definição do sistema de equações não lineares representando o modelo X15 Cont rolo d a con ve rg é neta no cálculo das concentrações; geração de valores iniciais para o cálculos f t C05NBF(NAG) Cálculo das concentrações: resolução do sistema de equações não lineares ■ Ficheiro de saída ' Resultados I t G05CCF/G05CAF(NAG)í geração de número aleatória b) SUBROUTINE FCN(NEQO, CONC, ZERO, I FLAG).:; ;:::; :^ COMMON HMS(30) , HOM (3 0),DOBS < 30 >:,DCAL (30),CONS(30) ,DIV,CONT, * CW;NCON . ' ■ COMMON PR(10),CONS(30),IE DIMENSION ZERO(20),CONC(;20) ZERQ(1) = C0NS(6) * CONC(l)**2 - CONC(2)**2 * HMS(IE) ZERO(2) = CONS(7)::* CONC (2) **2 -: CONC (3) **2: * : HMS(IE) : ■[ ZŒ»0;-(3:i»-:aO:i**PR;:{Î);.:' * CONC(7)**2: * CONC(3)**2 - CONC(5)**2 ZERO(4)= 10.**PR(2) * CONC(5)**2::*:: CONC<3)**2 - ■ * CONC ( 6 ). * * 2: * -HOM (IE ) ZERO (5)-CONS (8) * CONC(4}**2 * HOM (TE): - CONC(7)**2 ZERO (6);= CONS (9) * CONC(4>**2 * HOM(IE) **2 - CONC(8> **2 ZERO(7)= CONC (1);**2 + CONC (2) **2 : + CONC (3) **2 + CONC (5) **2. * + 2.*CONC(6>**2 - CONS(5) ZERO(8)= CONC(4.) **2:.+ CONC(5) **2: + CONC(6).**2 + CONC(7)**2 * + CONC (8.) * * 2 - CONS ( 4 ) : RETURN END s Figura 4.2 —■a); Esquema das subrotinas do programa de ajuste não linear a um modeto arbitrário; b) Exemplo da subrotina FCN para acaso definido nos ficheiros de entrada e saída da Figura 4.3 CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS GERAIS E MÉTODOS DE CÁLCVLO 79 SISTEMA::. : REACÇÕES: : H2L <> H + HL . HL '<->: H + L M < OH ) + L:'<=■>': M(QH } L M(OH)L+■ I, <> ML2 + M + OH <> M(OH) M + 20H <> M(OH)2 C0NC(1H2L 2.HL 3~L HG(N03) 2/GLIGLl: ■ PH > 4.7 KA1C0NS ( 6 > DH2LCOÎJS ( 1 ) DHLCONS ( 2} KA2.CONS(7) DLCONS(3) LOG KlPARA(l) DMLPARA(3) OHÍ!!LCiG?:K2 PARA ( 2 > DML=PARA ( 4 ) K01CONS(8) MO=CONS(4) ■ ,..: ;; K02=CONS(9) LO=CONS(5) 4M 5=M(OH)L 6ML2 7M{OH}í 8=M(OH)2) HG (N03) 2/GLIGLX: RESH1 13.99 13 " ""'"""] ' "":'"': 4.73 529.6 " U001+U004 ■>:—— 6. 6. 6. 7. 7 7 8; 8. 8. 9 ?10 04 75 85 09 57 79 35 68 99 26 08 ÎO. 77 9 —— 529.0 526.4 525.6 523.7 514.0 507.6; 488.0 478.Í: 4 65.8 4 60.2 449.Í 440. Pontos experimentais: {X,, Ooh,)/, í/t DH2L 537 DHL:.: :527: D~L, . ';:*28f: ■MOí .■ 0.05 0.2 IKAÍII 0.000676 KA2:::. ::,:;; 5.49E09 KOI 1..58E+10 K02 1.58E21 __ '::4:_ _ Designações das constantes a seus valores: Gt.i-M.cLOG Ki r: ■ 14..::- .■;":•'• LOG K2: -1. VDML2: 530. DM(OH)L 4a4. 1000 Designações dos parâmetros ajustáveis e seus valores iniciais: MJ> Definição do sistema Nome do • ficheiro de saída Valor de pK". da água: Número de pontos experimentais Número de constantes Número de parâmetros Divisor dos resíduos Figura 4.3(a) — Exemplo de um ficheiro de entrada para o programa de cálculo de constantes por regressão não linear. A tradução computacional do sistema de equações para este ficheiro é a transcrita na Figura 4.2(b) 80 CAPÍTULO 4 —— HG(N03)2/GLIGLI 0OO1+UOO4 SISTEMA^: :í:;|. HG(N03 ) 2 /GL IGLI.. : : P H ; :> ; 4. ^i; REACÇÕESH2L <=> H + HL : HL <> H + L MÍ.OH)• ■+ L<=> M(OH)L M {OH ) L + L ; <=> ML2 +; OH: M + OH <> M(OH) M: + 2 OH <> M(OH)2 KAl=CONS(6) KA2«CONS(7> LOG KlPARA(l) LOG K2=PARA(2) K01CONS(8> K02CONS<9> DH2LC0NS(1) DHLCONS'(2) DLCONS(3) DM(ÒH)LPARA<3) DML2=PARA(4) MO~CONS(4) LOCONS(5) PK : HIDROLISE?: :DA:: AGUA 13.99 : CONSTANTES DH2L;::; =537. ■■ DHL ;:  527.: ■■■., DL = 428. MO WÊB ^os ■ LO =■ .2 ■KA1  .000676 KA2 : =; :5:49E9 ::;:: KOI  ■' .rv58E+I0'V K02 : = lA8E*2i^ï$ ——PARÂMETROS LOG Kl = 8.502360911418  5.125843440164 = 541.41652 62882: := 534.503579933 = 556.3523664319 1.211847173177 ■ DES.OBS. .. LOG K2 DM(OH)L DML2 :.:■'.: : DESV.PADR PH • 7:31 .04::: .75 85 .09 57 .79 .35 . 681 8,99 9 26 10.08: 1Q.77 529.600 529.000 526.400: 525.600 523.700 514.000 507.600 488.000 478.100 465.800 4 60.200 44 9.900 440.500 IFAIL0 DES.CALC. 529.667 527 667 525.845: 525.295 523.399 515.673 509.636 488:096 475.383 466.300 ||: 4 60\819 ; 450.402 ; : 440.141 DIVISOR DOS:RESÍDUOS: (JA CONSIDERADO)' :'■■. 434.911: CP"SECONDS EXECUTION-TIME 1000. C0NC(1=H2L 2HL 3L 4M 5=M(OH)L 6ML2 7=M (OH); 8=M(OH}2);: RESÍDUOS .067 1.333 .555  305 .301 1. 673;:::: 2.036 .096 2.717 :: • 500 ♦ 619 .502 .359 Figura 4.3(b)— Exemplo de um ficheiro de saída do programa de regressão não linear para o cálculo de constantes de equilíbrio; o seu conteúdo corresponde ao ficheiro de entrada listado na Figura 4.3(a). CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS GERAIS E MÉTODOS DE CÁLCULO 81 soma do quadrado das diferenças (S) através da modificação dos parâmetros variáveis do modelo (constantes de equilíbrio e desvios químicos limite a calcular) e não requer a expressão analítica da primeira derivada do conjunto de funções em causa, fazendo a sua aproximação numérica; isto evita ter de definir para cada caso a expressão analítica das referidas funções [63]. O valor da primeira derivada da função S, em ordem a cada parâmetro Pj, é utilizado para decidir sobre a alteração a introduzir em cada um desses parâmetros. O valor da função S é novamente calculado e o ciclo repete-se até que os critérios definidos internamente na subrotina para terminar a iteração sejam atingidos. Como a subrotina E04FDF funciona melhor quando o valor de S se encontra entre 0 e 1, é utilizado um divisor D dos resíduos, introduzido através do ficheiro de entrada, com o fim de tentar colocar S na zona óptima. O valor de D é determinado a partir de um cálculo preliminar de S para o vector inicial de parâmetros ajustáveis (usando D igual ale zero iterações neste cálculo). Para o cálculo dos parâmetros que minimizam S usa-se assim D igual ao valor de S obtido no cálculo preliminar; assumindo que S irá diminuir no decurso do cálculo dos parâmetros ajustáveis, o seu valor será sempre menor que 1. A utilização da forma logarítmica das constantes de equilíbrio dos parâmetros ajustáveis provou ser bastante eficiente por diminuir o intervalo de valores usado pela subrotina e por evitar o aparecimento de valores negativos para as constantes durante a iteração. A subrotina E04FDF não estima os valores das variâncias que afectam os valores dos parâmetros calculados. O ficheiro de saída do programa, de que se mostra um exemplo na Figura 4.3(b), contém portanto os valores finais dos parâmetros e uma indicação sobre a convergência do processo iterativo, codificada no valor da variável IF AIL. Os resultados só foram aceites quando essa variável indicou que um mínimo da função S tinha sido atingido, sendo os parâmetros ajustados até ao limite de resolução do computador Para obter o valor de <5Jaic é necessário conhecer as concentrações em equilíbrio para cada vector Pj, que são calculadas por um subprocesso iterativo por forma a não ser necessário deduzir expressões analíticas para cada caso (o que por vezes é impossível) e a cumprir o objectivo de generalidade de aplicação do programa a qualquer 82 CAPÍTULO 4 sistema químico em equilíbrio. O sistema de equações que constituem o modelo é representado na subrotina FCN, ver exemplo em 4.2(b), sob a forma de um sistema de equações das constantes de equilíbrio e dos balanços materiais que lhe correspondem. Para um dado conjunto de constantes de equilíbrio e de concentrações totais, a subrotina C05NBF resolve esse sistema de equações não lineares para obter as concentrações em equilíbrio, que por sua vez são utilizadas para calcular S. O subprocesso iterativo de cálculo das concentrações em equilíbrio, levado a cabo pela subrotina C05NBF, condiciona o prosseguimento da iteração principal (cálculo dos parâmetros ajustáveis) e por isso deve convergir sempre e ser o mais possível, eficiente. É de notar que o valor das constantes de equilíbrio do vector de parâmetros ajustáveis usadas para o cálculo das concentrações pode abranger um intervalo muito alargado dependendo do decurso da iteração principal, o que é desfavorável às condições de convergência e de eficácia referidas acima como essenciais para o bom funcionamento do subprocesso de cálculo das concentrações. Devido à dificuldade e à morosidade de estimar um bom vector de concentrações iniciais para o subprocesso iterativo recorreu-se a uma função de números aleatórios, G05CCF/ G05CAF (NAG), como fonte para esses valores que foram limitados a um intervalo entre zero e as concentrações máximas esperadas. Desta forma diversos valores iniciais são tentados até ser atingida a convergência. Tal como na subrotina E04FDF, em C05NBF existe um parâmetro cujo valor no ficheiro de saída qualifica a convergência atingida. Só uma das soluções do sistema de equações não lineares contém as concentrações requeridas, sendo frequente o aparecimento de vectores resultado com valores negativos para as concentrações. Este problema foi obviado utilizando não concentrações mas as suas raizes quadradas: esta alteração de variáveis, para além de aumentar as soluções possíveis para o sistema e concomitantemente a eficiência do processo iterativo, assegura que os vectores resultado são positivos, o que se revelou, também, muito eficiente na prática. Por outro lado, o uso de valores absolutos ou da raiz quarta não mostrou ser mais eficiente. Este programa é aplicável a qualquer sistema químico, bastando para tal escrever as equações pertinentes na subrotina FCN e, obviamente, preparar um ficheiro de 90 CAPÍTULO 5 A influência da interacção glicilglicina / citidina sobre os desvios químicos da citidina foi estudada neste trabalho, uma vez que esses desvios vão ser utilizados em outras experiências para calcular as constantes de estabilidade dos complexos mistos, embora não fosse de esperar uma interacção significativa em água entre estes dois ligandos. Assim, compararam-se os desvios químicos da citidina numa solução contendo 0,10 mol dm"3 de citidina com os de uma outra contendo também 0,10 mol dm" de glicilglicina e em que foi utilizado, em ambos os casos, íerí-butanol como referência interna e pH 6,8. A este pH a glicilglicina encontra-se na sua forma de ião dipolar (zwitterion) e a citidina não está protonada em N-3. As diferenças observadas foram pequenas, menores que 0,5 Hz (0,0025 ppm), 1 13 para os sinais de H e menores que 1,2 Hz (0,025 p.p.m.) para os sinais de C. Estes resultados permitem desprezar a interacção intermolecular glicilglicina / citidina em água para o cálculo das constantes de formação dos complexos mistos. Na secção 5.2.1 será discutido o efeito da interacção glicilglicina / glicilglicina em solução aquosa (hipoteticamente de cariz iónico) sobre o valor das suas constantes de acidez. 2. Constantes de acidez da citidina e da glicilglicina As CONSTANTES DE ACIDEZ da citidina e da glicilglicina têm sido bastante estudadas, em vários solventes e por várias técnicas [73,79,87,88]. Uma vez que todos os cálculos de constantes de formação foram feitos em água e os catiões metálicos coordenantes competem com o ião H+ para as posições de coordenação na citidina e na glicilglicina, os desvios químicos destes ligandos vão ser uma função da coordenação dos catiões metálicos e da coordenação de H+. A determinação prévia das constantes de acidez para a citidina e a glicilglicina permite introduzi-las como constantes conhecidas, e não como parâmetros ajustáveis, nos cálculos das constantes de complexação daquelas moléculas com catiões metálicos. Este facto impõe que sejam determinadas em condições que reproduzam as condições de força iónica e tipo de referência que existirão nas experiências onde estão presentes catiões metálicos coordenantes. Algumas tentativas foram feitas por outros autores para criar modelos que descrevam o efeito de electrólitos sobre as constantes de acidez [89] ASSOCIAÇÕES INTERMOLECULARES E CONSTANTES DE ACIDEZ DA CUCILGUCINA E DA CITIDINA 91 mas, neste trabalho, pretende-se apenas determinar essas constantes nas condições mais próximas possíveis daquelas que serão encontradas nas experiências para o estudo da complexação dos catiões metálicos Zn2+, Cd2+ e Hg2+, ou seja, procurar um estado de referência que inclua as protólises da citidina e/ou da glicilglicina em condições bem definidas de força iónica e referência interna. A determinação de constantes de protólise por RMN é uma técnica bem desenvolvida e que tem sido largamente aplicada [90-92]. O primeiro passo para a determinação de constantes de acidez (constantes de dissociação de H+) por RMN consiste em recolher pontos experimentais constituídos pelos desvios químicos correspondentes aos núcleos do ligando em causa em função do pH da solução (pH, <5); experiências do tipo pH variável. Estes desvios químicos são simulados teoricamente, para cada núcleo /, pela equação seguinte, deduzida a partir da equação 4.1 <5' = ([L]/Lt)<5'L + L, ([HJL]/Lt)SÍy. (5.1) onde L representa o ligando completamente desprotonado e H„L as formas protonadas do ligando. A transformação das concentrações da equação 5.1 em quantidades dependentes apenas dos valores de pA^ e do pH, através do uso das expressões que definem as constantes de acidez e dos balanços materiais, permite concluir que, no caso ideal, em que não se considera a auto-associação do ligando ou outras interacções intermoleculares, os desvios químicos são independentes da concentração inicial de ligando. O ajuste desta equação aos pontos experimentais pelo método de regressão não linear pode ser feito muitas vezes optimizando apenas os valores de p£an (AT3n são as constantes de acidez para as dissociações H„L =^ H„.iL + H+) desde que <5'L e (5H„L possam ser medidos directamente, situação que está representada na Figura 5.3. Nesta Figura é mostrada a variação de desvio químico para os núcleos de 'H e 13 C da glicilglicina e da citidina. A interpretação da variação destes desvios é trivial uma vez que os desvios observados são directamente proporcionais às concentrações das espécies protonadas e não protonadas, constituindo assim curvas de titulação de ácido/base, em que os pontos de inflexão das curvas dão uma indicação gráfica dos valores de pKa. 92 CAPÍTULO 5 2.1 Glicilglicina NA FIGURA 5.3(A) PODEM ser observadas curvas típicas da variação do desvio químico dos núcleos da glicilglicina em função do pH; os valores de pKíx e pK^ em diversas condições experimentais são apresentados na Tabela 5.1. A protonação da glicilglicina num dos seus grupos extremos provoca grandes desvios na direcção de maior frequência, menor protecção electrónica, nos núcleos de C próximos do local de protonação, sobretudo nos núcleos que não estão ligados a átomos de hidrogénio, como é o caso de C2 e C4. Esta observação aparece como consequência da já esperada transferência de densidade electrónica para o ião H+. Pelo contrário, os núcleos de hidrogénio Hl e H3 apresentam desvios para menor frequência. Os núcleos mais distantes de uma determinada zona de protonação podem apresentar desvios positivos ou negativos que, no entanto, são sempre de menor amplitude. a) [ KN03] 1 0 <0 t 0,1 0,10,2 0 ;/i;:; 0,20,4 06 0,80,9 0,6 0,80,9 [GG] 0,20 0,005 wm 3,20±0,03 3,28±0,042 3,23±0,03 P^ ?K*X 8,20 ±0,03 8,23±0,042 _8J32±0,02 3.14+0.081 3,29±0,03 WÊ 8,15± 0,01 8,18± 0,02 Ref. tB tB IPBII tB/pD TMA Vatores Mividuaie:.C1:3,12; C2:3,10;C3:3,17; C4:3,16;H1:3,08: H3:3,ia Î-■.:■:•:•::■■ ■ . . Oa valores individuais de cada núdeo para este caso sao apresentados na Tabela 4.3. b) px», ?K^ I 3,13± 0,05 3,05 ±0,01 3,15 ±0,01 3,13" C 7,98 ±0,01 8,08 ±0,03 8,12 ±0,01 8,21 : 0,1 0,1 P,6 0,6 TTC); 20 25 25 25 i.3. ref método:::i ::i;;: : [881 [93};:;: ; [93]:: potenciometria potenciometria potenciometria [73] RMN1 0.2JWemglldlgllcína; releréncia interna: TMA; os valores de pK., a de pK^ foram obtidos a partir dos desvios químicos do nucteo H 1 e H-3 respectivamente. Tabela 5.1 — a) Valores medras de pK",, e de pK"., da: glicilglicina calculados neste trabalho em diversas condições experimentais (concentrações em mofdní3) a partir dos desvbs químicos dos núcleos C1, C2, C3, C4, H1 e H3 (o intervalo de erro compreende todos os valores obtidos); b) Valores publicados na literatura para essas constantes. ASSOCIAÇÕES INTERMOLECULARES E CONSTANTES DE ACIDEZ DA GUCILGLICINA E DA CITIDINA 93 -ô— H-3 -o-- HT 560540o-o--- H — Glicilglicina X 520- •••-• -§ 500H «Os 480460440420 • - -NH- " Í48ÒÍ:Í: a- -o - a- -oQ. e—ooo • • » •• K i • i '—rr ;.2í::.:::: 4 6 pH -1465 -1450; -1435: -142QS -1405 13901 o C-4 -e — C-2 7400 13 C—Glicilglicina 10 •-*- C-3 7500 7300N 7200o «O 710070006900 Figura 5.3(a) —Variação típica dos desvios químicos da glicilglicina coro o pH nas condições do estado de referência (ver texto e tabela 5.2). 94 CAPÍTULO 5 — H5 1010 1000 ■■990 ::;:N;S:V':::;.: £• 980 «0: ■iJCH °0 970 960 950I 940 ©— C4 e  C2 ■» C6 7000 6800 6600 N~ ■'';■::'■■'■•: £ 6400 ^ 6200 6000 5800 5600 H— Citidina 4 —r~ 5 pH 13 C — Citidina i 5 PH I ■!.. 7 : ■  o  H6 ''Í450íll 1430 1410 1390 1370 1350 1330 1310 8 A  C5 3400 3360 3320 3280 3240 3200 Figura 5.3(b)—Variação típica dos desvios químicos da citidina com o pH nas condições do estado de referência (ver texto e Tabela 5.4). ASSOCIAÇÕES INTERMOLECULARES E CONSTANTES DE ACIDEZ DA GLICILGLICINA E DA CITIDINA 95 Os valores de pK3 obtidos por RMN para a glicilglicina são significativamente mais altos que os obtidos por potenciometria [93], havendo normalmente uma diferença maior que 0,1 entre os valores publicados de pKa obtidos por essas duas técnicas. Esta diferença entre constantes de equilíbrio determinadas por RMN e por potenciometria parece ser uma observação geral quando altas concentrações de espécies carregadas, nomeadamente catiões metálicos, existem em solução. Uma explicação possível pode residir na diferença entre o que é observado num e noutro caso: os métodos potenciométricos reflectem alterações na actividade de H+ (ou indirectamente na concentração desse ião, se a força iónica estiver controlada) ou de outros iões em solução, enquanto que em métodos de RMN baseados na variação do pH são detectadas alterações nos desvios químicos induzidos pela remoção do protão. Na presença de altas concentrações de iões metálicos ou outras espécies carregadas em solução, a eventual ocorrência de efeitos de carga nos desvios químicos da forma carregada do ligando protonado / desprotonado podem mascarar o efeito da remoção do protão. Os valores das constantes de acidez da glicilglicina determinadas por RMN mostram também uma marcada dependência com a força iónica, como acontece em geral com os aminoácidos e com outras espécies iónicas em solução [89,94], embora o valor de pK^ seja menos sensível que o do pÂTa, a essas variações (Tabela 5.1). O sal usado para controlar a força iónica nestas experiências foi o KNO3 já que o ião Ca + tem uma grande tendência a ligar-se à glicilglicina através do grupo carboxílico [95] e por isso não pode ser incluído no estado de referência. A pH baixo, a importância da concentração de glicilglicina e de outras espécies carregadas em solução sobre o equilíbrio entre os estados de protonação ácido carboxílico / carboxilato é evidente se se reparar que: a) o pKãl determinado por RMN para soluções contendo só glicilglicina (0,20 mol dm"3), 3,20, é demasiado alto quando comparado com o valor potenciométrico: 3,13 [88]; b) o p/sTa, (RMN) para uma solução de 0,005 mol dm'3 em glicilglicina é de apenas 3,14; e que c) este valor aumenta para 3,29 quando KNO3 está presente em solução com a concentração de 0,10 mol dm"3. Da mesma forma, uma solução 0,20 mol dm"3 de glicilglicina e 96 CAPÍTULO 5 •a 0,60 mol dm" de KNO3 apresenta um valor para o pKAl de 3,28, em contraste com o valor de 3,20 obtido para uma solução contendo apenas glicilglicina 0,20 mol dm" , indicando claramente o efeito da concentração do sal. Estas observações mostram que em soluções puras de glicilglicina e a concentrações elevadas do dipeptídeo as interacções intermoleculares entre os grupos -COO" e -NH3+ são importantes e que os desvios químicos induzidos são menores porque passam a ser a média pesada dos desvios limites das formas protonada/ desprotonada/associada, o que conduz à determinação de um valor menor para a constante de acidez do grupo carboxílico. Para baixas concentrações de glicilglicina (0,005 mol dm" ) a extensão da associação é menor e o valor da constante de acidez aproxima-se do valor medido potenciometricamente. Como já foi referido, a adição de um sal não coordenante, KN03 0,10 mol dm" , a estas soluções diluídas de glicilglicina provoca um aumento do pÃfal de 3,14 para 3,29; esta diferença é demasiado grande para ser atribuída somente à pequena variação de força tónica entre as duas soluções, o que permite postular a existência de uma interacção tónica entre o sal e a glicilglicina, que se reflecte sobre os desvios químicos observados. A valores de pH elevados ocorre uma situação semelhante envolvendo uma neutralização parcial da carga do grupo amina protonado por um grupo carboxílico ou por algum anião presente na solução. Isso explica os elevados valores de pÂTa2 observados para soluções de glicilglicina 0,20 mol dm" na ausência (8,20) e na presença (8,23) de elevadas concentrações de iões, nomeadamente KNO3 0,60 mol dm"3 (o valor potenciométrico para o pATa2 da glicilglicina é de 8,08 ±0,03 para força tónica 0,1 M [88]). A importância da concentração de glicilglicina é evidenciada pelo facto de que, em soluções 0,005 mol dm" de glicilglicina o pK^ determinado é de apenas 8,15; na presença de KC1 ou KN03 (0,1 mol dm" ) o valor de p/sTa2 apenas sofre uma ligeira alteração (8,18). Definição do estado de referência para as experiências de pH variável com glicilglicina Sendo a determinação de constantes de estabilidade afectada em grande medida pelos valores de pKa e pelos desvios limite usados nos cálculos, a escolha das ASSOCIAÇÕES INTERMOLECVLARES E CONSTANTES DE ACIDEZ DA CUCILCUCINA E DA CITIDINA 97 condições em que estes valores são obtidos, ou seja, a escolha do estado de referência, é crítica quando elevadas concentrações de metal estão presentes. Os valores de constantes de acidez medidos em soluções cuja referência interna é TMA são diferentes dos obtidos para p-dioxano ou rm-butanol (Tabela 5.1), de acordo com o que já tinha sido referido na secção 4.4 sobre a sensibilidade do desvio químico do TMA à presença de glicilglicina a pH elevado, pelo que esta referência interna foi posta de parte. A já referida tendência do ião Ca + para coordenar à glicilglicina impediu que fosse considerado na definição do estado de referência, embora tivesse a vantagem sobre o ião K+ de ter carga eléctrica igual e tamanho mais próximo dos iões Zn2+, Cd + e Hg +. Também no que respeita à concentração dos aniões no estado de referência teria sido preferível usar o sal Ca(N03)2 em vez de KN03 por razões óbvias. O anião nitrato foi o único a ser usado nos estudos relacionados com a glicilglicina descritos no Capítulo 6 e portanto foi incluído no estado de referência. Numa tentativa para reduzir o efeito dos iões metálicos em interacções que não a coordenação, foram usadas as constantes de acidez aparentes da glicilglicina em soluções 0,60 mol dm" em KN03. Isto equivale a considerar esse tipo de solução como o estado de referência para RMN relativamente às experiências realizadas para o cálculo de constantes de associação da glicilglicina com catiões metálicos, descritas no capítulo seguinte. Na Tabela 5.2 são apresentados os valores de pATai, pK^, <5H2L, <5HL e ^L calculados para cada núcleo da glicilglicina e que foram usados no cálculo das constantes de equilíbrio de coordenação dos catiões metálicos Zn2+ e Cd2+. Núcleo p/C., pKH 5H2L H-1 3,17 8,26 537 H-3 3,22 3,49 8,00 570 C-1> 3,22 3,49 8,28 8,27 5554 C-2 3,39 8,28 8,27 6951 Ç-3 3^22: ; 8,24 8,34 5812 c-4; 3,21 8,24 8,34 7221 Tabela 5.2 — Parâmetros de RMN para o estado de referência relativamente às experiências de pH variável com glicilglicina: [glicilglicina] - 0,20 moldm'3; [KN03] = 0,6 M; referência interna - tertbutanol; 25° C. 527 428 516: 512 5590 7258 6916 7339 6900 6817 7383 7400 98 CAPÍTULO 5 22. Citidina NA FIGURA 5.3(B) ESTÃO REPRESENTADAS as variações típicas dos desvios químicos para 1 13 os núcleos de H e C da citidina com o pH (todos os desvios químicos foram medidos relativamente a íerrbutanol). A protonação do átomo de azoto N3 tem um efeito sobre os núcleos da base da citidina semelhante ao observado para a glicilglici na, apesar de serem moléculas muito diferentes. Os núcleos que apresentam maiores alterações nos desvios químicos são C2 e C4, os mais próximos de N3, desvios esses que ocorrem para maior frequência. Por outro lado, o núcleo de C6, o átomo 13 de C da base pirimidínica que fica mais distante de N3, tem um desvio menor e para menor frequência. Os núcleos de H5 e H6 apresentam também desvios para menor frequência. Na Tabela 5.3 estão indicados os valores para o pK3 da citidina (protonação em N3) em várias condições experimentais. Tal como no caso da glicilglicina, o valor do pKa determinado para a citidina por RMN é maior que o potenciométrico [93]. Os valores mencionados na literatura para o pKa desta molécula situamse entre 4,09 e a) Sai: KNCy KCt; Ca(N03)2 concentração 0,60 0,60 0,20 bjl II / 4,07±0,01 4,12± 0,04 4,09± 0,02 4,23± 0,005 4,20 ±0,04 4,15 :;0,1 ■0.6 fÒW 1 ■;o,5 <0,2 p/C 44010,01 4,36±0,02 4,36±0,02 4,15*0,02 7(°Q 25 25 20 ; 20 25 32 ref. [93] [93] [87]V [88]> [113]; [79] método potenciometria: potenciometria potenciometria potenciometria; UV RMN1 0.2M em citidina; referenda interna: («r-butanol; o valor de pX, foi cõtkfci a partir dos desvios quirracos dos núdeos H^5 e.H-6. Tabela 5.3;—a) Valores médios de p>Cada citidina calculados neste trabalho em diversas condições experimentais (concentrações em mol dm"3) a partir dos desvios químicos dos núcleos C 2, C4, C5, C6, H5 e H6 (o intervalo de erro compreende todos os valores obtidos). Referência interna: fe/tbutanol; [Citidina] = 0,10 mol dm"3; b) Valores publicados na literatura para essa constante. ASSOCIAÇÕES INTERMOLECVLARES E CONSTANTES DE ACIDEZ DA GUCILCUCINA E DA CITIDINA 99 4,23 a 20°C e para valores da força iónica compreendidos entre 0,1 e 1,0 M, determinados sobretudo por métodos potenciométricos [96]. Para uma temperatura de 25°C foram obtidos potenciometricamente os valores 4,07 e 4,12 para valores de força iónica 0,1 e 0,6 M [93]. Por RMN, um valor de 4,15 foi publicado para uma solução aquosa pura de citidina na concentração 0,20 mol dm"3 a 32°C [79]. Neste trabalho, para uma solução de citidina 0,10 mol dm" e força iónica inferior a 0,1 mol dm', na ausência de sais adicionados, calculou-se um valor de pKã de 4,09 + 0,01 (Tabela 5.3). No entanto, o valor de pKa calculado para uma solução de citidina 0,10 mol dm"3 a que foi adicionado KN03 ou KC1 (concentração final 0,6 mol dm"3) é bastante maior: 4,34 ±0,02. A influência do anião cloreto sobre a constante de acidez, relativamente à formação de um quelato inverso com a citidina discutido no Capítulo 6, é aqui semelhante à influência do anião nitrato, bem como a sua influência sobre os desvios limite <5HL e 5L, que são idênticos dentro da margem do erro experimental. A presença em solução de Ca(NOs)2 0,20 mol dm"3 permite obter um valor de 4,15 para o pKa do azoto N-3 da citidina, valor que é ainda ligeiramente superior ao que foi obtido por estudos potenciométricos, 4,12 ±0,04 [93], tal como se verificou para a glicilglicina. Definição do estado de referência para as experiências de pH variável com citidina A utilização de p-dioxano, TMA ou dos desvios dos núcleos da região ribosilo da citidina como referência para os desvios dos núcleos da região pirimidínica, nas experiências com KNO3 e Ca(N03)2, resultam na obtenção de valores que não diferem dos calculados usando rm-butanol, o que apoia a utilização desta substância no Núcleo 415 1000: 4 H-5 415 1000: 962 ; H-6 | 4 15 1378 ||31:6 C-2 lllil 5977 6438 C-4 4,15 6525: ; 6869 C-5 4,13 3292 3359 C-6 4,14 5763 5629 Tabela 5.4 — Parâmetros de RMN para o estado de referência em experiências com pH variável com citidina; [citidina] = 0,10 moldm3; [Ca(NOs)J - 0,2 M; referência interna = íert-butanol; 25" C 106 Capítulo 6 U» o -:<&:■■.■ \, ■Om F —CM: "O \ • * ° n V . \ b \ • *» CM v '• v V v U> :■:—. <^a • *v mtf^-y V ' s ■: O'-: ■ \\ '. \ V». V < \ V \ ■■■ifí:-y: ■ 1 1 1 1 1 1 4 ■ _.0:V : :á:ó ■ yV::■■: ■*>•';: '«■■ ''«Xv : t ■ (ZHI'V ZINCO E CÁDMIO: COMLEXOS BIÁRIOS E TERNÁRIOS MISTOS COM CITIDINA E GUCILGUCINA 107 o" ::Z::. O invG> • / a a To-: • / / 0 / / "3,1 /.' / 1.1/ 6 : 'CM0>—■ * Ò <—* : 3 UÏ *_» '\©: :"!' ! ; i / ! ■' '/ ""«" *• * 1 I 1 1 I ■:''ú)':':':ó -.O :■■■:;■: ::;.Q,:y:;'' »:íí' O o ;'«*■; O: : : Ó ■ í a \ O O \ Cl \ \ ■■■:■. 0;::>:::: I ::-:WV'*_«i.:': t"-' ■■■:■. 0;::>:::: I ::-:WV'*_«i.:': a ■ s à \ O i \ V> Nj» IA. O O s 1 1 1 1 : i i O s ïtW:-:: '.: *~ ' ■ *-■ Q o i O 8 o o ;o-: • f 1 i a o • i o' 1 1 ::«1ÏCÏ: ■7 ' J 'n T ' £:ajj:':w^ TB :::"■«■■. d / ' < 1 bo* / "o 1 1 i J :':'tn*x i0::;.x';.o: Ípy5':j:;:í (ZH)^V (ZH)WF « ■o <n O o 3 cr 10 > 0) <D "D <n O <B 0) o T3 k_ <n <9 <o a (0 a> ■a «v o <n > "O « "O 0) > ffl i_m > o im <> m CD O (0 r ,C:ï: ■■■■ 8 <A (0 O ffl -Q,'.'; a. ; o*;™ 5 .>■.■:■ ffl *•»■ o ffl Q. as £■■■"::■ T3 8 .■ti (SBií: O ffl <D ■D UJ U1 ó => ■ o CO CO-ívi ■* 10 O 3-Î'. ■ uv t: X à 05 « « es O O 2 c c (0 ffl!: o 0:'i .- ffl m a. a>> «v CD R .^.. .. U): . fc T CO oX' «) a;. ■■ O CB;Í:V::., CO O : : Q X ■ 1 E a> .o tami.:: ^* zs (O <x a «$ ■ k. C: ■:■. n» ■D u. O 108 Capítulo 6 Da observação da Figura 6.1(a) é possível concluir que os catiões se ordenam da seguinte forma relativamente à amplitude, em valor absoluto, dos desvios provoca dos: Cd > Zn > Ca > K. Esta ordenação é observada para todos os núcleos de *H e 13C da base da citadina e, por outro lado, é independente do anião, uma vez que foi veri ficada para os quatro aniões utilizados. A influência dos aniões nos desvios químicos, embora de pequena amplitude, é visível nos gráficos da figura 6.1(b), onde estão apresentados os desvios químicos resultantes de experiências que partilham um catião comum. Com base nestes desvios foi elaborado um diagrama semiquantitativo da 1 n influência relativa de catiões e aniões sobre os desvios químicos de H e C da base da citidina, apresentado na Figura 6.2. As sequências obtidas são independentes do contraião e têm como referência os desvios químicos da citidina pura em solução aquosa a pH 6,15. A sequência dos catiões é comum a todos os núcleos o que constitui uma indicação de um só local de coordenação (ou de ligação fraca) à citidina, local esse que provavelmente será a região (C2)0(N3) [112,114]. Convém, no entanto, referir que os desvios provocados por K+ e Ca + são pequenos quando comparados com os provocados por Zn + e Cd +. Aniões Catiões Núcleo H5 H&; C2 C4 Ç5 C6 H5 H6 C2 C4 C5 C6 cr cl: Br Br c/a, cr NO3 cio; Nov era; Br NO! maior NO;: cr Br menor frequência frequência Cd2* Zn2* Ca2* K* cio; NOÍ cr ; Br cio; NO3 cr Br* CIO, Zn2* ■Zn2* Ca2* Ca2* Cd2* Zn2* ■Zn2* Ca2* Ca2* K* K* Cd2* Zn2* ■Zn2* Ca2* Ca2* K* K* Zn2* ■Zn2* Ca2* Ca2* K* K* K* Ca2* Zn2* Cd2* K* Ca2* Zn2* Cd2* Cd2* Zn2* Ca2* K* Figura 6.2— Diagrama semiquantitativo da amplitude e do sentido do desvio químico: provocado por alguns aniões e catiões sobre os núcleos da região base da citidina, baseado nas experiências cujos gráficos são apresentados em parte na Figura 6.1. ZINCO E CÁDMIO: COMLEXOS BIÁRIOS E TERNÁRIOS MISTOS COM CITIDINA E GUCILGUCINA 109 O estabelecimento de uma sequência para os aniões baseada nos desvios químicos provocados não é tão fácil como para os catiões, devido provavelmente à ocorrência de interacções mais fracas e menos localizadas com a citidina. Os iões cloreto e brometo ocorrem sempre juntos nas séries da Figura 6.2, não havendo diferença clara entre o efeito produzido por cada um. O efeito destes aniões nos desvios químicos da citidina é maior para os núcleos de H-5, H-6, C-2 e C-4 e o segundo maior para C-5 e C-6, o que os permite classificar como os menos inertes para estudos em RMN. É nítida na Figura 6.2 a posição anómala do ião perclorato, que aparentemente apenas estende a sua influência à região C-5 / C-6 da citidina. Apesar dos iões nitrato e perclorato terem sido considerados como os menos interferentes com a citidina por Marzilli et ai. em estudos por RMN em DMSO [97], os gráficos da Figura 6.1 mostram inequivocamente a não inerticidade do perclorato relativamente a esses núcleos da citidina, e que é independente do catião presente em solução. O ião nitrato mostra-se, no conjunto dos resultados, pouco interferente relativamente aos núcleos considerados, embora os desvios químicos provocados por este anião sejam ligeiramente superiores aos provocados pelo perclorato, com excepção dos núcleos C-5 e C-6. Uma apreciação global do diagrama da Figura 6.2 permite concluir, atendendo à diferente ordem por que se distribuem para cada núcleo (ao contrário do observado para os catiões), que os aniões não devem ter um único local de associação com a citidina e que a sua interacção com esse nucleotídeo é menos específica e mais fraca do que no caso dos catiões Zn2+ e Cd2+. Cálculo de constantes de estabilidade A comparação do valor absoluto dos desvios químicos não indica todavia só por si a extensão da associação molecular presente, que, em rigor, só pode ser avaliada pela determinação da constante de equilíbrio dessa associação. O cálculo de constantes de equilíbrio é, em princípio, possível a partir dos desvios da Figura 6.1 e para isso foi postulado o modelo simples de associação 1:1 M + C ^ MC em que M representa um catião (ou um anião, em estudos de coordenação de aniões a citidina) e C a citidina. Como foi mostrado nos Capítulos 3 e 4, é possível, para 110 Capítulo 6 este modelo, deduzir uma equação para o desvio químico, que assume a forma Xb, = (Mt + Q + \IKxx - ((M, + Ct + UKxú1 - 4MtLt)r1/2^Mc/ 2C, (6.1) a partir da qual é feito um ajuste iterativo (regressão não linear) aos pontos experimentais para cada núcleo, optimizando os parâmetros desconhecidos Kn e /IMCNa equação 6.1, Mt representa a concentração total do catião metálico (ou do anião), Q a concentração total de citidina, Kn a constante de formação do complexo 1:1 ( /sTn=[MC] / ([M][C]) ), Xbs o desvio observado para o núcleo / para um conjunto de valores de Mt e Ct (Xbs = #*s - <5ò onde <5Ò é o desvio químico do núcleo i do ligando no estado de referência), e ^lMc o desvio químico do complexo 1:1 (XIC = <5MC- <5ò)- Foi também utilizado para o cálculo da constante Kn o método de Nakano, descrito em detalhe no Capítulo 3. Um aspecto a considerar nas experiências em que é variada a concentração de catião metálico é a existência de grandes variações de força iónica entre os pontos experimentais, o que torna menos claro o significado das constantes obtidas por variação dos desvios químicos. Por outro lado, a variação dos desvios químicos tal como está apresentada na Figura 6.1 é afectada simultaneamente pelo efeito dos catiões e dos aniões e por isso não poderia ser estritamente aplicado um modelo de associação 1:1. Embora de pequena amplitude, o efeito dos aniões altera a forma das curvas de desvios e, logo, interfere no valor das constantes obtidas a partir do modelo de associação 1:1 catiões / citidina. Para tentar minimizar o efeito da variação da força iónica e neutralizar os desvios provocados pelos aniões, foram calculadas novas variações de desvios químicos como (a) a diferença ponto a ponto entre os obtidos nas experiências com Ca2+, Zn2+ e Cd2+ e os obtidos nas experiências com K+ e em que o anião era o mesmo e (b) diferenças entre os desvios das experiências com Zn + e Cd + e os desvios das experiências com Ca +, também partilhando um mesmo anião. Os desvios químicos de referência, <5Ó, passam a ser os desvios químicos dos núcleos de citidina nas soluções com K+/A" ou Ca +/2A", onde A" representa um dos aniões Cl", Br", NO3 (o anião CIO4 não pôde ser usado para estes cálculos devido à limitada solubilidade em água dos percloratos de potássio, cádmio e zinco). Esta operação de ZINCO E CÁDMIO: COMLEXOS BIÁRIOS E TERNÁRIOS MISTOS COM CITIDINA E GUCILGUCINA 111 subtracção é plausível porque a associação entre os aniões e a citidina é de natureza muito fraca e ocorre em extensão previsivelmente reduzida. O efeito da força tónica não é porém completamente compensado pela utilização dos estados de referência mencionados devido à possível interacção localizada de K+ ou Ca2+ com a citidina e à interacção K+/aniões e Ca +/aniões. Devido à diferença de carga entre o ião potássio e os catiões do grupo 12, é necessário usar uma concentração dupla de sais de potássio, e logo concentração dupla de catiões potássio, para simular as condições de força tónica nas soluções com os catiões bivalentes. Este facto pode constituir uma objecção ao uso das soluções de sais de potássio no estado de referência. Com base nas referências mencionadas acima foi tentado o cálculo dos valores de Kn para todos os catiões bivalentes com citidina. As pequenas variações nos desvios químicos provocados pelo ião Ca2+ relativamente ao K+ não permitiram calcular uma constante de equilíbrio para a sua associação à citidina, mas para Cd + e Zn + foram obtidos os valores de Kn indicados na Tabela 6.2. Os resultados obtidos por regressão linear, segundo o método de Nakano, foram sempre muito próximos dos obtidos por regressão não linear e encontram-se dentro das margens de erro apresentadas para as constantes. O método de Nakano revelou instabilidade na convergência, em especial para o zinco, já que este catião produz pequenos desvios químicos e apresenta uma constante de estabilidade muito pequena. As grandes variações encontradas para os valores de Kn estão provavelmente relacionadas com a associação entre aniões e catiões, para além da influência dos erros experimentais nas concentrações, na medição dos desvio químico e na medição do pH, agravados pela soma dos erros associada com a operação de subtracção de desvios químicos. Apesar da dispersão dos resultados, pode ser verificado que a constante de formação do complexo binário com o catião zinco é consistentemente inferior à do cádmio. Os valores da Tabela 6.2 permitem estimar um valor de 0,6±0,4 M" para Kn no sistema Zn2+/citidina e de 10±6 M~l para Kn no sistema Cd +/citidina. Foi possível calcular mais valores individuais para Kn no sistema com o cádmio devido às maiores variações nos desvios químicos provocados pelo catião cádmio e à maior constante de estabilidade para a sua coordenação à citidina. 112 Capítulo 6 Núcleo Desvios H5 ^nONOjfe " &»«, ^d(NPj)j " §<NOj H6 2,2 C2 X4 0,2: 0,9 10,0 3,5 8,7 ; 0,8 3,6 5,7 14,3 11,5 0,5 6,1 3,6 5,9 7,0 0T7 5,1 4,8 14,3 11,0 C5 0,8 C6 0,3: 0,9 07 6,9 14,5 11.1 12,5 0,4 12,1 9,1 17 '■:2,5f 8,1 8,0 Zinco Cádmio Tabela 6.2 — Valores da constante X,, (M"') calculada para a associação entre os catiões cádmb(ll) ezinco(ll) e a atidína usando como referência os desvios químicos de soluções de catião potássio(l) e cálcío(ll). São assinalados com um traço os casos em não foi possível calcular um valor para K1t. Para os sistemas com o anião nitrato (ao contrário de sistemas com os outros aniões) foi possível ajustar a função teórica aos desvios de todos os núcleos e calcu lar a respectiva constante Kn. Os valores médios obtidos para as constantes de estabilidade dos complexos binários são 0,65 ±0,20 Af1 para o nitrato de zinco e 9,8 ±2,8 M" para o nitrato de cádmio, com base nos valores de Kn apresentados para cada núcleo na Tabela 6.2. Estes valores são quase idênticos às médias totais referi das no parágrafo anterior. Para a constante de estabilidade do complexo binário zinco/citidina obtiveramse valores maiores para os núcleos C5, H5 e H6 (0,75, 0,87 e 0,79 M~ , respectivamente) do que para os restantes núcleos de 13C, cujo valor se situou próximo dos 0,5 AT . No caso do cádmio a dispersão dos valores foi relativamente homogénea dentro do intervalo de erro especificado para a constante tendo sido obtidos valores desde 12,5 A/'1 para C5 até 7,0 A/"1 para C2. A disper são dos valores de Kn de núcleo para núcleo no caso do sais de nitrato foi menor que nos sais de cloreto e brometo, factor que, juntamente com o que já foi discutido sobre a posição do anião nitrato nas séries do diagrama semiquantitativo da Figura 6.2, ZINCO E CÁDMIO: COMLEXOS BIÁRIOS E TERNÁRIOS MISTOS COM CITIDINA E GLICILGUCINA 113 contribuiu para escolher este anião para as experiências de pH variável descritas nas secções seguintes. Os valores médios obtidos para Ku nos sistemas Zn(II)/citidina e Cd(II)/citidina concordam em certa medida com os valores obtidos por potenciometria para os mesmos casos por Kinjo et ai [113], 1,58 ±0,40 M~l e 8,12 ± 1,31 hfl respectivamente, para soluções a 25 *C e força iónica 0,5 M (NaN03). Relativamente à escolha do catião para o estado de referência, verificou-se que a utilização para esse fim dos desvios químicos da citidina em soluções com cálcio ou potássio permitem obter aproximadamente os mesmos resultados, com excepção dos cloretos e dos brometos de cálcio, os quais não funcionaram bem como referência para os cloretos e brometos de zinco (ver Tabela 6.2), devido talvez, por um lado, a uma maior interacção destes aniões com a citidina (efeito do quelato invertido, ver a seguir) e, por outro, aos pequenos desvios causados pelo catião zinco quando comparados com os causados pelo catião cádmio. Utilizando o princípio de subtracção já referido, foi possível isolar também o efeito dos aniões sobre os desvios químicos da citidina. Esse efeito não é superior a 2 Hz para a maioria dos aniões, relativamente aos desvios provocados pelo anião menos interferente para cada núcleo (nitrato ou perclorato), o que à partida não permite o cálculo de constantes de equilíbrio com boa precisão. É difícil de prever um modelo para a interacção da citidina com os aniões, dado o desconhecimento da forma e do local dessa interacção, embora para o anião cloreto tenha sido observado em DMSO e em misturas H20 : DMSO (até 26% : 74%) que este ião afecta os desvios químicos da região H-l / NH2 da guanosina, possivelmente pela formação de um quelato entre aquele anião e o nucleotídeo [114,115] (Figura 6.3). Dado que essa região é análoga à região H-5 / NH2 da citidina e que os desvios químicos de H-5 para soluções com ião cloreto são maiores que os para soluções de nitrato, poder-se-á supor a presença de um quelato semelhante no caso da citidina, esquematizado na Figura 6.3., servindo de apoio ao cálculo da constante de equilíbrio para essa associação. Foi possível estimar um valor médio de 1,2 ±0,8 M'x para a constante de estabilidade do quelato invertido formado entre a citidina e o ião cloreto, calculado com base nas diferenças entre os desvios químicos de H-5 nas soluções de 114 Capítulo 6 Ribosel H N -H tv :'.':"'.;.";?'";!:" O-" :í: Guanosina H Ribose I Citidina Figura 6.3 — Quelato invertido formado entre os nudeotídeos guanosina e cttidina e o anião clorefix cloretos e de percloratos, para todos os catiões usados. Embora os desvios químicos provocados pelo anião cloreto sejam um pouco menores que os causados pelo catião zinco, o valor da constante de estabilidade do quelato invertido é superior ao da coordenação entre o zinco e a citidina. Dada a semelhança entre os comportamentos dos aniões cloreto e brometo, foi postulada a existência de quelato invertido também no caso do ião brometo com citidina e foi calculado um valor de 1,3±0,7 M" para a constante Kn dessa associação molecular, nas condições já referidas para o ião cloreto. Tanto este valor como o obtido para a associação cloreto/citidina explicam a dificuldade em calcular Kn para o complexo binário zinco/citidina ( = 0,6 M~ ) usando os desvios da citidina causados pelo cloreto de zinco e pelo brometo de zinco, mesmo tendo como referência os desvios químicos da citidina em soluções de cloreto ou brometo de cálcio (potássio). De acordo com o que foi exposto até agora, é possível concluir que o método de variação de concentração de catião metálico não permite o cálculo preciso de constantes de equilíbrio muito pequenas em solução aquosa, embora possa fornecer valores indicativos para essas constantes e permita estabelecer uma ordem semi- -quantitativa para os efeitos relativos de espécies iónicas sobre os desvios químicos de uma espécie observada. 1.2 Variação do desvio químico em função do pH TAL COMO FOI REFERIDO na secção anterior, ao analisar os resultados de experiências em que o pH é mantido num valor fixo e é variada a concentração de uma espécie ZINCO E CÁDMIO: COMLEXOS BIÁRIOS E TERNÁRIOS MISTOS COM CITIDINA E GUCILGUCINA 115 iónica, é essencial encontrar um estado de referência para os desvios químicos que reproduza a variação da força iónica ao longo dessas experiências, o que, tal como foi observado, nem sempre é possível. A vantagem do método da variação do pH relativamente ao da variação da concentração de catião metálico reside no facto de que a força iónica é mantida dentro de limites estreitos sem ser necessário recorrer ao seu controlo específico. Convém referir que esse controlo, tal como é feito por exemplo em potenciometria, em que, devido à sensibilidade do método, as espécies em estudo [sal de catião metálico / ligando(s)] se encontram em reduzida concentração (< 10" M) e a força iónica é originada quase totalmente por um sal inerte, exigiria a utilização de concentrações muito baixas de reagentes em solução e tornaria pouco prática a obtenção dos espectros de RMN, sobretudo os de 13C. A citidina apresenta apenas uma posição de coordenação para os catiões Zn2+ e Cd +: o átomo de azoto endocíclico (imínico) N-3 [112,114], embora o envolvimento do átomo de oxigénio ligado a C-2 na coordenação ao catião metálico tenha sido postulado em DMSO [101]. Na Figura 6.4 estão representados em função do pH os desvios químicos relativos a rerr-butanol dos núcleos H-5, C-4 e C-5 de soluções 0,10 mol dm"3 em citidina e 0,20 mol dm" em nitrato de cálcio, nitrato de zinco ou nitrato de potássio. O gráfico de desvios de C-2 é idêntico ao de C-4 e os gráficos de C-6 e H-6 são idênticos ao de H-5, ou seja, a distribuição das três curvas nesses gráficos segue o mesmo padrão para C-2 e C-4 e para H-5, H-6 e C-6. O valor de pH máximo utilizado foi 6,3 devido à formação de hidróxidos dos metais acima de pH 7. Na zona de pH usada existem proporções variáveis de citidina protonada e não protonada, uma vez que o pÃTa da citidina tem um valor próximo de 4,2. Assim, o modelo de equilíbrio que foi considerado adequado para descrever o comportamento do sistema foi o seguinte: M2+ + C ^ MC2+ HC+ ^ H+ + C (com constantes de equilíbrio Kn e Ka respectivamente) onde M2+ representa Zn2+ ou Cd +, C representa a citidina neutra e HC+ a citidina protonada em N-3 e MC2+ 122 Capítulo 6 segunda protólise, o que permite prever uma constante maior para a coordenação ao grupo amina que ao grupo carboxílico. Os desvios de C-1 apresentam um comportamento invulgar uma vez que devia ser o núcleo mais sensível à coordenação no grupo amina; mas, pelo contrário, mostra desvios quase nulos até pH 6, relativamente aos desvios de referência, tanto para Zn + como para Cd +. Uma possível explicação para esta observação assume que o desvio de C-l da glicilglicina coordenada por um catião metálico no grupo amina é muito semelhante ao desvio de C-l para a glicilglicina não protonada no mesmo grupo o que implica que a coordenação do catião não provoque variações apreciáveis nos desvios químicos. A quase sobreposição dos desvios químicos causados pelos catiões zinco e cádmio com os desvios químicos do estado de referência não permitiu o cálculo de constantes para este núcleo. Para simular estes resultados experimentais foram usados modelos constituídos por subconjuntos do seguinte grupo de equações: M2+ + HGG* *•** HGGM2+ M2+ + GG" ^ MGG+ HGGH+ ^ HGG* + H+ HGG* ^ GG" + H+ onde se assume a formação de duas espécies de complexos em solução: MGG+ (coordenação em -NH2), com constante de equilíbrio /sTN=[MGG+]/([M2+][GG']), e HGGM + (coordenação em -COO"), com constante de equilíbrio Ko =[HGGM2+]/([M2+] [HGG*]). A possibilidade de coordenação simultânea de dois iões metálicos às duas posições de coordenação da glicilglicina não mostrou constituir um melhoramento ao modelo uma vez que não se obteve um valor inequívoco para a constante de tal equilíbrio; para além disso, a consideração desse equilíbrio nos modelos não provocou alteração nos valores calculados para K0 e KN. Pela mesma razão não se considerou a coordenação simultânea de duas moléculas de glicilglicina por um único catião metálico. Estes resultados não significam que estas espécies não existam em solução mas apenas que, nas condições experimentais usadas, não se formaram em concentrações ZINCO E CÁDMIO: COMLEXOS BIÁRIOS E TERNÁRIOS MISTOS COM CITIDINA E GUCILGUCMA 123 suficientemente elevadas para contribuírem de forma significativa para os desvios químicos observados. O núcleo C-l não apresenta, como já foi referido, desvios relativamente ao estado de referência que permitam a sua inclusão na execução dos cálculos. Os núcleos H-1 e C-2 são sobretudo sensíveis à coordenação em -NH2 e por isso os seus desvios foram simulados com um modelo contendo apenas as equações correspondentes às constantes K^ e KAv usando os pontos em que pH é superior a 4. Isto corresponde a usar a seguinte equação de desvio químico para esses núcleos da glicilglicina: 4b. = ([GŒ] /GGt) 4x3" + ([HGG*] /GGt) 4GG* + ([MGGl/GGt)4iGG* (6.3) O núcleo C-3 permitiu calcular simultaneamente KH e K0 devido à sua posição intermédia na molécula que o torna sensível à coordenação em ambos os extremos. Como no caso de C-3 se usou todo o intervalo de pH disponível, foram incluídos no modelo os equilíbrios de protonação para os dois grupos extremos: 4b. = ([GG1 / GGt) 4xr + ([HGG*] / GGt) 4GC± + ([HGGH+]/GGt)4KX3H+ + ([HGGM2+] /GGt) 4KK3M2+ + ([MGCT] /GGt) zW (6.4) O núcleo de C-4 é sobretudo sensível à coordenação no grupo carboxílico e por essa razão foram usados para a simulação unicamente os pontos experimentais obtidos a pH menor que 4 e os equilíbrios de K0 e Kiv Para este núcleo, na zona de pH referida, foi usada a seguinte equação de desvio químico: 4*. = ([HGG*] /GGt) 4ÍGG* + ([HGGtf] /GGt) 4ÍGGH* + ([HGGM2+]/GGt)4GGM2+ (6.5) Ao contrário do observado para C-3, para o núcleo de H-3 não foi possível encontrar um ajuste bom com os dois equilíbrios de coordenação e por isso o cálculo foi executado nas condições usadas para o núcleo de C-4 (equação 6.5). Na Tabela 6.4 estão sumarizados os valores obtidos para as constantes de estabilidade K0 e ÍTN, com valores médios de, respectivamente, 0,74 ±0,16 e 3,47 + 0,45 para o catião zinco e de 1,18 ±0,10 e 2,89 ±0,17 para o catião cádmio. Os desvios dos núcleos de hidrogénio permitiram calcular valores que estão de 124 Capítulo 6 acordo com os valores publicados por Rabenstein e Libich utilizando RMN de 'H [73], nomeadamente no caso do nitrato de zinco. Por outro lado, os valores de K0 e KH fornecidos pelos núcleos de C neste trabalho estão mais de acordo com os resultados obtidos por potenciometria [88,93,105] a força iónica mais baixa que a usada neste trabalho que é de aproximadamente 0,7 M. Os valores obtidos a partir dos espectros de C são sistematicamente maiores que os obtidos dos espectros de 1H, tanto no caso do zinco como no do cádmio, embora a diferença seja mais acentuada no valor da constante K^ para o zinco. Os valores desta constante mostra ram ser bastante sensíveis a variação no valor da constante de acidez usado nos cálculos, o que pode ser uma explicação para a sua dispersão. A utilização de um valor de constante de acidez único para todos os núcleos apenas acentuou as diferen ças entre os valores de KN calculados para cada núcleo. Se por um lado a constante de acidez deva ter um só valor, deve ser no entanto considerado que o estado de referência não inclui somente os efeitos nos desvios químicos relativos à coordena ção do protão em NH2 mas também outros efeitos, como o da força iónica, cuja influência se traduz numa alteração do valor calculado para o pKa de cada núcleo. Equação 6.3 6.5 6.3 6.4 6.5 Referência [73]r ifròfl [93f [88f Núcleo HT H3 C1 C2 C3 04 Zn2* \ogKo 0.64 0,90 0,67 k>gKH :3,02 3,81 3,58 Cd2 tog Ko 1,08: 1,26 1 19 *RMNífc0,6 Aí;'Potenciometria, í.0,15 «;'Potenciometria, fc0,15 A^'Potenciometrta, (.0,15 M logXN 2,73 3,05: 2,90 0,64±0,24 3,13+0,09 1,04±0,18 2,76±0,Í7 ■ "—■'": 3,43 :.:. ■ — . .': 2,95 — 3,40±0,04 — 3,02±0,05 — 3,44±0,01 — 2,90±0,05: Tabela 6.4 — Valores das constantes de equilíbrio para a coordenação dos catiões cádmio e zinco aos grupos carboxílico (Ko)e amina (Kn) da giicilglicina; valores dâííteratura para essas constantes. ZINCO E CÁDMIO: COMLEXOS BIÁRIOS E TERNÁRIOS MISTOS COM CITIDINA E GUCILGUCINA 125 Os valores das constantes Ko são pouco sensíveis à variação do valor de pATa, e são bastante mais pequenos que K^, como era esperado. Ao contrário do que acontece com KN, onde o zinco mostra maior tendência de coordenação que o cádmio, os valores de Ko são ligeiramente maiores no caso do cádmio que no caso do zinco. Mesmo neste caso a diferença é relativamente pequena e os dois catiões comportam- -se de forma muito semelhante relativamente à glicilglicina. 3. Constantes de estabilidade para os complexos mistos de Zn2+ e Cd2+ com glicilglicina e citidina A EXISTÊNCIA DO COMPLEXO ternário misto citidina/Zn2+/glicilglicina foi proposta por Li et ai. [79] com base na diferença dos desvios químicos do protão H-5 da citidina observada entre soluções de citidina (0,2 mol dm"3) e cloreto de zinco (0,6 mol dm"3), na presença e na ausência de glicilglicina (0,2 mol dm"3). Estes autores observaram a) que a constante de estabilidade do complexo de glicilglicina com zinco, medida potenciometricamente, tinha o mesmo valor na presença e na ausência de citidina em solução, e b) que os desvios químicos do núcleo H-5 da citidina, em soluções com concentração variável de ZnCl2 e pH fixo (foram executadas diferentes experiências entre pH 4,7 e pH 5,3) são sempre maiores quando a glicilglicina está presente em solução. Com base nestas observações concluíram que, em soluções equimolares de citidina e glicilglicina, só existe o complexo ternário. Como foi mostrado na secção anterior, a constante de estabilidade da citidina com o catião zinco é tão pequena que é pouco provável que seja possível detectar o seu efeito sobre o valor calculado para a constante de estabilidade do zinco com a glicilglicina, que, como já foi mostrado atrás, é três ordens de grandeza superior. Por outro lado, o desvio químico do núcleo H-5 depende não só da concentração de iões mas também do pH da solução. Na Figura 6.6 são mostrados os desvios químicos do núcleo de H-5 para soluções contendo concentração variável de Zn(N03)2 ou de ZnCl2, com citidina 0,10 mol dm"3 ou com citidina 0,10 mol dm'3 e glicilglicina na mesma concentração, a pH 5 e a pH 6. A pH 5 os desvios químicos de H-5 são maiores no caso do sistema misto do que para o sistema binário, tanto para o cloreto de zinco como para o nitrato de zinco; no entanto a pH 6, com a citidina praticamente 126 Capítulo 6 desprotonada em N3, os desvios químicos de H5 nas soluções com cloretos são maiores no caso do complexo binário que no caso do complexo misto. Para o nitrato, no entanto, a tendência mantémse para os dois valores de pH o que permite concluir que a diferença de comportamento é causada pelo anião. Uma possível explicação para esta observação reside na hipótese de que a quantidade de ião cloreto livre para a formação do quelato invertido com a citidina aumenta com a presença de glicilgli cina em solução que, ao coordenarse ao zinco em grande extensão, provoca uma diminuição da quantidade de pares iónicos Zn + / Cl" em solução, favorecendo a associação do anião cloreto à região (H5)NH2 da citidina. O exposto atrás mostra que o cálculo da constante de estabilidade do complexo misto deve ser executado com base nos desvios químicos da citidina e não nos da glicilglicina. Por outro lado, o controlo do pH das soluções é também, como seria de esperar, importante para a definição do modelo a aplicar, dada a existência de um equilíbrio entre o catião H+ e a citidina. O anião nitrato, como mostrado anterior mente e como referido na literatura [97], tem uma reduzida influência sobre os desvios químicos da citidina e por isso foi seleccionado para as experiências em que se tentou obter um valor para a constante de estabilidade dos complexos mistos com e—Zn(N03)2/Citidina ■■■■■:, a Zn(NO,)_/Citidina/Gliaigliana - - • - ZnClj/ Citidina - - 4ZnCt,/Otidma/Glialgiíana 974 &©: 972- ■r970Si: 968966964962960pH 5,00 -| r0.1 i r 0J2::::;::'. T pH 6,00 '.A "i r 0.3 0 Ot [Zn(N03)2] (M) —r—r 0.2 0.3 Figura 6*6 — Desvios químicos em solução aquosa do núcleo de H5 da citidina 0,1 M, em experiências com e sem glicilglicina 0,2 M obtidos por variação da concentração dos saís Zn(N03)2 eZnCtO^ Wa a)pH 5,00 e b) pH6,00;: ZINCO E CÁDMIO: COMLEXOS BIÁRIOS E TERNÁRIOS MISTOS COM CITIDINA E GLICILGUCINA 127 Zn + e Cd +. Nas duas secções seguintes irá ser apresentado o cálculo das constantes de estabilidade dos complexos mistos de citidina e glicilglicina com Zn2+ e Cd2+ pelos métodos de pH variável e pH fixo. 3.1 Variação do desvio químico em função da concentração de catião metálico (pH fixo) PARA O CÁLCULO DE CONSTANTES de estabilidade de complexos mistos de citidina e glicilglicina com os catiões Zn + e Cd2+ pelo método de pH fixo, partiu-se de soluções com concentrações iguais às utilizadas para o cálculo de Kn para a associação catião metálico/citidina (ver secção 6.1.1) mas com uma concentração de glicilglicina igual à de sal de nitrato de zinco ou nitrato de cádmio. Os desvios químicos de referência foram obtidos a partir dos espectros de soluções com concentração de Ca(N03)2 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25 e 0,30 mol dm"3 e concentração de citidina 0,10 mol dm'3 (Figura 6.1), com fm-butanol como referência interna. Embora o catião cálcio mostre uma pequena tendência para coordenar à citidina em DMSO [114] é de esperar que em água ocorra em reduzida extensão já que a solvatação do catião é maior [97]. O valor de pH escolhido para estas experiências foi o utilizado para o estudo dos complexos binários; 6,15 ±0,05. Com o objectivo de simplificar o modelo a aplicar no cálculo das constantes de estabilidade dos complexos mistos pelo método de variação de concentração de catião metálico foram feitas algumas aproximações, justificadas com base no valor de pH das experiências e nos diferentes valores das constantes de estabilidade dos complexos binários: a) a pH 6,15 tanto o catião zinco como o catião cádmio estão coordenados ao grupo amina da glicilglicina numa extensão superior a 85%, de acordo com as constantes apresentadas na secção anterior para essa associação, o que permite considerar a aproximação de que todos os catiões metálicos se encontram coordenados à glicilglicina; b) a quantidade de citidina coordenada a catiões não complexados com a glicilglicina é muito pequena, como pode ser inferido dos baixos valores das respectivas constantes de formação, o que torna possível não incluir este equilíbrio de complexação no modelo; e c) foi considerado que o complexo ternário em que o catião metálico se liga à glicilglicina através do grupo carboxílico não existe em solução, o que é justificado com base na pequena constante de estabilidade 128 Capítulo 6 desse complexo binário relativamente à constante da formação do complexo através do grupo amina. Assim, o modelo fica apenas constituído pelo equilíbrio da formação do complexo ternário misto CMGG+: MGG+ + C ^ CMGG+ com constante de equilíbrio Km, onde o índice m indica que a constante se refere a um complexo ternário misto e o índice N indica que o catião metálico se encontra ligado à glicilglicina através do seu grupo amina. Este modelo é análogo à formação de um complexo 1:1, que está na base da equação 6.1, e é aplicável aos dados experimentais obtidos em experiências em que se varia a concentração de catião metálico, aqui considerado como o complexo MGG+. Pelas razoes já discutidas anteriormente para complexos binários, os desvios químicos observados para as soluções com complexos mistos foram subtraídos dos desvios químicos das soluções de referência (já mencionadas no início desta secção); os desvios diferença, nos quais foram baseados os cálculos de K^, são apresentados 1 13 nos gráficos da Figura 6.7 para os núcleos de H e C da região da base da citidina. É possível observar que todos os núcleos apresentam desvios maiores quando a glicilglicina está presente em solução, tanto no caso do zinco como no caso do cádmio, com a maior diferença observada para C-4. A utilização de nitrato de cálcio nas soluções de referência utilizadas para o cálculo das constantes de complexos mistos, impediu que nelas fosse incluída a glicilglicina, devido à coordenação daquele catião ao dipeptídeo. Os resultados obtidos utilizando os desvios químicos de soluções de nitrato de potássio e citidina como referência (sem glicilglicina) foram de pior qualidade em termos da dispersão dos valores obtidos. É importante notar que, para soluções com a mesma força iónica e o mesmo anião, a concentração de catiões metálicos é duas vezes maior nas soluções de sais de potássio do que em soluções de catiões bivalentes, o que introduz uma diferença adicional entre o estado de referência e as soluções que contêm o sistema a estudar. A presença de glicilglicina nas soluções de referência, embora formalmente requerida, não é essencial pois, como já foi referido, aquele dipeptídeo não influencia os desvios químicos da citidina (secção 5.1.3). ZINCO E CÁDMIO: COMLEXOS BIÁRIOS E TERNÁRIOS MISTOS COM CITIDINA E GUCILGUCINA 129 H-6/binário H-6/misto • »■- I+-5/misto C-4ybináno 02/bináno C-6/btnário &5/tnnário - • « - ■ C-4/misto - -»- ■ G-2/misto ---■»-— C-6/misto àr~- C-5/misto -e— H-6/binário -et-f H^íbinário H-6/mtsto H-5/mtsto 10h8- : Xí 62Cd(NO, i—!—i—■—r 1H C-4/bináno — C-2/bináriò: :i ~: C'6/txnáno C-5/binário C-4/misto C-2/misto C-6/misto C-5/misto O.t 0.2 0 3 0.4 M (mol dm"' Figura 6.7—Desvios químicos da citidina em soluções de sistemas binários iguais aos apresentados na Figura 6.1 e em soluções de sistemas ternários com crtidíha 0,1: Af;!'nitrato de zinco ou nitrato de cádmio em concentração variável e glicilglicina na mesma concentração que os catiões metálicos, a pH 6,15 e tendo como referência interna fertbutanol. Os desvios químicos apresentados são relativos às soluções de referência mencionadas no texto, compostas por citidina e nitrato de cálcio (ver Figura 6.1). 130 Capítulo 6 Na Tabela 6.5 estão apresentados os valores obtidos para as constantes de associação dos complexos binários e ternários mistos. Verifica-se que as constantes calculadas para os complexos mistos com catião zinco são maiores que as dos complexos binários em todos os núcleos. Para este catião obteve-se uma média de 2,2 ±0,8 enquanto que para o cádmio se obteve um valor médio pouco superior ao do complexo binário, 10,8 ±4,0 mol" dm . Resultados semelhantes, embora com maior dispersão de valores, foram obtidos usando como referência os desvios químicos de soluções contendo KNO3, citidina e glicilglicina. Com a excepção dos núcleos C-2 e C-6, para os quais as constantes calculadas foram menores que as dos binários (os gráficos apresentam maiores desvios químicos, menor curvatura e maior desvio limite, ver Figura 6.7), todos os outros núcleos forneceram valores maiores para o complexo ternário com catião cádmio. A dispersão dos resultados é mais elevada para o caso dos complexos ternários que para o caso dos binários devido, provavelmente, à dificuldade de obter um bom estado de referência quando a quantidade de espécies em solução é maior. Cooperatividade na formação dos complexos ternários Uma forma de medir o grau de cooperatividade na formação de complexos ternários consiste em usar o método de A logK, no qual é comparada a diferença entre os logaritmos das constantes de estabilidade dos complexos binários e dos complexos Zn2 ÊÊMÊ& Cd* Zn2 ÊÊMÊ& Cd* Núcleo Zn2 ÊÊMÊ& Cd* Zn2 ÊÊMÊ& Cd* mm "m Kn k" mm "m Kn Am 0,87; 0,79 0,50 0,52 0,75; 0,47 0,65 H-5 0,87; 0,79 0,50 0,52 0,75; 0,47 0,65 1,37 2,79 2,955 1,42 : ; 2,75 1,77 2,2 8,7 Vi-i.,5':-_.';; :.: 7,6 : : 11,0 12,5 8,0 13,1 H-6 : 0,87; 0,79 0,50 0,52 0,75; 0,47 0,65 1,37 2,79 2,955 1,42 : ; 2,75 1,77 2,2 8,7 Vi-i.,5':-_.';; :.: 7,6 : : 11,0 12,5 8,0 11,9 ''.'C-2 : c-6 0,87; 0,79 0,50 0,52 0,75; 0,47 0,65 1,37 2,79 2,955 1,42 : ; 2,75 1,77 2,2 8,7 Vi-i.,5':-_.';; :.: 7,6 : : 11,0 12,5 8,0 6,6 12,9 13,2 7,2 Média 0,87; 0,79 0,50 0,52 0,75; 0,47 0,65 1,37 2,79 2,955 1,42 : ; 2,75 1,77 2,2 9,8: 10,8 Tabela 6.5 — Constantes de estabilidade calculadas peto método de variação de concentração de catião metálico para os complexos binários ( /Cir) e ternários mistos (K*) de citidina e glicilglicina com zinco e cádmio (nitratos), obtidas para cada núcleo da região base da citidina.: ZINCO E CÁDMIO: COMLEXOS BIÁJUOS E TERNÁRIOS MISTOS COM CITIDINA E GUCILGUCINA 131 ternários, com um valor crítico deduzido estatisticamente a partir dos potenciais locais de coordenação dos catiões metálicos e dos ligandos [116]. Este método é referido na primeira parte desta tese em mais pormenor, secção 3.1. A Tabela 6.6 mostra as hipóteses teóricas para os casos em estudo em que os ligandos são a glicilglicina e a citidina. Assumese um número de coordenação de quatro para o zinco, tal como se verifica em muitos complexos com nucleosídeos e seus derivados, e de seis para o cádmio [117]. Como já foi referido, tanto a citidina como a glicil glicina podem ter características ambidentadas na coordenação a catiões metálicos e esse facto também foi considerado na elaboração dos valores de A logST teóricos da Tabela 6.6. Para o caso do zinco temos que logKn = 0,20 ±0,15 e logK^ = 0,32 ± 0,20, o que permite calcular um valor experimental para A logK de 0,52 ± 0,35, onde os erros das duas parcelas foram somados para obter o erro do resultado. Analogamente, para o cádmio temos que logiTu = 0,98±0,15 e log^= 1,02 ±0,20 donde se obtém Alog/sT=0,04±0,35. A comparação dos AlogK teóricos e experimentais permite a) ligando geometria proporção AlogK mx mi B WÊÊË bi: Tetraédrica !" ' 1/6 0,78 bi bi Quadrada ; ;; 174 ■.;'■; 0,60 bi mono Tetraédrica : 2/6 0,48 bi mono Quadrada : 2/6 0,30 mona mono Tetraédrica ?:..v3/4;l;. 1 3/4 0,12 : mono mono Tetraédrica ?:..v3/4;l;. 1 3/4 0,12 b) ligando geometria proporção AlogK" ~ A B bi bi Octaódríca 5/12 0,38 bi mono Octaódríca 4/12 0,48 mono mono Octaédrica 5/6: 0,08 Tabela 6.6 — Valores.teóricos de Afogtfpara vários casos décomplexas ternários formados por dois ligandos A e B; a) Número de coordenação 4; geometria tetraédrica ou quadrada; b) Número de coordenação 6; geometria octaédrica. bi  ligando bidentado, mono  ligando monodentado. 138 Capítulo 6 apenas a partir da grandeza dos desvios químicos, como já foi tentado na literatura [79], uma vez que estes dependem não só dos desvios limite pertinentes mas também do estabelecimento de um correcto estado de referência. Apesar das limitações foi possível detectar a presença de cooperatividade entre a citidina e a glicilglicina na formação do complexo ternário. Foi possível também demonstrar que a espectrometria de RMN permite, com igual facilidade, quer a determinação de constantes muito pequenas, quer muito grandes em espectros de equilíbrio rápido. 7 Mercúrio: formação de complexos com citidina e glicilglicina NESTE CAPÍTULO SÃO APRESENTADOS OS resultados do estudo por RMN da química de coordenação do catião rnercúrio(II) à glicilglicina e à citidina. Para além da relevância que tem o estudo da química de coordenação de mercúrio a ligandos de interesse biológico é também importante comparar a coordenação deste catião com a dos catiões Zn + e Cd + para os ligandos referidos e já estudados no capítulo anterior. A possibilidade de escolher condições de cinética lenta ou de cinética rápida na escala de tempo do RMN, quer para sistemas binários nitrato de mercúrio/glicilglicina e nitrato de mercúrio/citidina, quer para o sistema ternário nitrato de mercúrio/ glicilglicina/citidina, através do controlo da temperatura, do pH e da concentração de outras espécies em solução, permitiu um estudo detalhado da formação das espécies mercuradas dos ligandos através da análise dos respectivos espectros de RMN. Devido à dependência do desvio químico das substâncias utilizadas como referência com a temperatura [119], não foram interpretadas em termos de concentrações (cálculo de constantes) as variações de desvio químico nas experiências com temperatura variável. Também como nota prévia deve ser referido que as medições de valores de pH ou pD menores que 3 foram realizadas com o sistema de medição de pH calibrado com os tampões 1,00; 3,00 e 7,00 já referidos no Capítulo 4. 1. Glicilglicina DADOS CRISTALOGRÁFICOS sobre a coordenação da glicilglicina ao catião metilmercúrio mostram que, dependendo da proporção entre os reagentes, ocorre quer formação de ligação entre uma molécula de metilmercúrio e o grupo amina terminal da glicilglicina, com probabilidade de formação de um quelato envolvendo o átomo de oxigénio 140 Capítulo 7 da ligação peptídica, quer ligação simultânea de duas moléculas de metilmercúrio a uma mesma molécula de glicilglicina através do grupo amina e do grupo carboxílico. No entanto, nunca foi encontrada evidência para o estabelecimento de ligação entre o ião metilmercúrio e o grupo carboxílico da glicilglicina em solução aquosa [120]. A aplicação de métodos de RMN e de potenciometria ao estudo de sistemas contendo mercúrio(II) e glicina em solução aquosa mostrou que este catião metálico tem tendência a formar complexos lineares (duas ligações colineares sp ou sp+sd [121]) com duas moléculas de glicina e com constantes de estabilidade elevadas; as moléculas de glicina estão coordenadas através do grupo amina e em nenhum caso foi detectada participação do grupo carboxílico [122,123]. Li et ai. descreveram a formação de um complexo 1:1 em D20 entre o catião Hg + e glicilglicina, coordenada pelo grupo amina e em que mais uma vez não foi encontrada evidência para a coordenação através dos átomos de oxigénio do grupo carboxílico [79]. Neste trabalho procurou-se determinar quais as espécies mais importantes presentes em soluções aquosas de nitrato de mercúrio(II) e glicilglicina e calcular as constantes de estabilidade dessas espécies, recorrendo à análise de espectros de RMN de !H e 13C, quer de equilíbrio lento, quer de equilíbrio rápido, obtidos num intervalo de pH alargado. 1.1 Estudo das espécies em solução Em solução aquosa Na Figura 7.1 estão representados os espectros de RMN de H de a) uma solução pura de glicilglicina 0,20 mol dm" a 25°C a pH 1,3; e, também, os de uma solução aquosa de glicilglicina 0,10 mol dm" e Hg(N03)2 0,1 mol dm" , a 25°C e b) pH 1,3 e (c) pH = 0,5. No espectro de glicilglicina pura são visíveis na região de campo baixo sinais dos protões do azoto peptídico (A) e do grupo amina (B) e em que áreas se encontram aproximadamente na razão de 1:3 como esperado para catião glicilglicínio. Contrariamente ao observado para os catiões Zn +, Cd + e H+, os espectros obtidos para soluções de glicilglicina/Hg + nas condições referidas em b) são também de permuta lenta, e é patente o desdobramento de todos os sinais do espectro (à semelhança do que acontece em soluções de Hg(NC»3)2 e glicina [123]), MECÚRIO: FORMAÇÃO DE COMPLEXOS COM CITIDINA E GUCILGUCINA 141 " H»'"» ■■' ' I I I I '" 533 '.433 !333 '.233 i >■■■ !33 1333 ar 933 HERTZ -V" 3aa 733 633 Figura 7.1 —Espectros de glicilglícina obtidos em H20 com excitação selectiva; desvios químicos em Hertz relativamente a rertbutanol. (a) 0,2 Mglicilglicina, pH. 1,3; (b) 0,1 M glicilglícina, 0,1 M Hg(N03)aí pH = 1,3; (c) 0,1 M glicilglícina, .0,1 MHg(N03)2, pH = 0,5. ■■:/■'.' 142 Capítulo 7 pelo que estes espectros de permuta lenta fornecem informação sobre as espécies presentes em solução a pH ácido e provam a existência de complexos mercurados de glicilglicina. É importante, no entanto, referir que os espectro de soluções de glicilglicina/nitrato de mercúrio a 25 °C e a pH menor que 0,8 são idênticos aos de soluções puras de glicilglicina, em que se observam apenas os sinais da glicilglicina livre (não coordenada a mercúrio mas quase totalmente protonada), deixando de se observar os sinais que pertencem a espécies coordenadas ao catião mercúrio [Fig.7.1(c)] , devido ao aumento de concentração de H+ que vai deslocar o catião Hg +, fruto da sua competição para as mesmas posições de coordenação. O valor de pH a que ocorre a transição de equilíbrio rápido para equilíbrio lento na escala de tempo de RMN, para uma temperatura de 25 °C e para soluções aquosas de equimolares de glicilglicina/Hg = 0.1 mol dm" , está situado entre 2 e 3 e depende, para cada núcleo em observação, da diferença entre os desvios químicos para as diferentes espécies em equilíbrio e das suas concentrações e tem origem na diminuição da quantidade de glicilglicina desprotonada devida ao aumento da concentração do catião H+ [123]. A transição entre regimes de equilíbrio rápido e de equilíbrio lento também pode ser provocada, no caso em análise, por diminuição da temperatura de 25 °C para =1°C, como se documenta na Figura 7.2 para os espectros de 'H e 13C, em que mesmo para um pH maior que 3 e uma razão molar glicilglicina/ Hg2+ maior do que um, é observado um regime de equilíbrio lento. No espectro de H, a separação dos sinais do átomo de hidrogénio da ligação peptídica e dos sinais do grupo amina é já visível, devido à diferença dos seus desvios químicos, enquanto que isso ainda não se observa para H-l e H-3; note-se também o desaparecimento do sinal do grupo amina a valores de pH superiores a = 4 devido à cinética de permuta de catiões H+ com a água. No espectro de C a 25° C apenas é possível detectar um banda por átomo de carbono, embora com ligeiro alargamento de alguns sinais, enquanto que a 1 °C algumas bandas apresentam-se desdobradas e em que os sinais do núcleo do carbono C-2 constituem o caso mais nítido. A dependência com o pH dos espectros obtidos a 25 °C e nas condições experimentais descritas está representada na Figura 7.3 e pode ser sumariada da seguinte forma: a) para valores de pH maiores que 3 o espectro da glicilglicina MECÚRIO: FORMAÇÃO DE COMPLEXOS COM CITIDINA E GUCILGUCINA 143 25°C ^m*^*h*^¥m^WW*i'**+'*n*it*<»t*>*\<#*%W*0t*HMh*».»»«WrwM*rn»iw+pii■*"■ i*w*m***m*¥*f( >WiW<*1lVW»frwww» -A 1°C <*bbW\l*>mMN>^ T^Wi/^W 25°C ■ ;ja ■ i j-j ! jaa 1°C va 52a ,dij un Figura 7.2 — Espectros de 1H (a) e 13C (b) daglicilglícina, a 1 °C e 25°C, de uma solução aquosa 0,20 Mdeglicilglfcinae 0,05 MdeHg(N03)2;pH = 1,9. 144 Capítulo 7 H6RTÍ Figura 7.3 — Espectro de1H daglicilglicina a 25°C em soluções aquosas 0,20 Mem glicilglicina e OyOSMem Hg(N03)2; pH variável, pressupõe a existência de um equilíbrio rápido entre as diversas espécies em solução; b) entre pH 2 e 3 ocorre a transição entre equilíbrio rápido e equilíbrio lento entre as espécies coordenadas e não coordenadas ao catião metálico; c) entre pH 0,8 e 2 são observados sinais diferenciados para as espécies de glicilglicina coordenada e não coordenada a Hg2+, mas em equilíbrio rápido com o ião H+; d) a pH menor que 0,8 observa-se apenas o espectro da glicilglicina em equilíbrio rápido entre as espécies protonada e não protonada. MECÚRIO: FORMAÇÃO DE COMPLEXOS COM CITIDINA E GUC1LGUC1NA. 145 Após esta breve descrição dos regimes de permuta dos sistemas giicilglicina/ nitrato de mercúrio vai ser feita a análise dos espectros de equilíbrio lento obtidos nas respectivas soluções. Recorde-se que a molécula de giicilglicina, que na sua forma completamente desprotonada (GG") pode ser representada como H2N— C'HΗÇ?0—NH—C^r—C400" possui, como já foi referido, duas posições com maior aptência para a coordenação de iões metálicos: o grupo amina e o grupo carboxílico. O catião Hg +, por seu lado, tem tendência para formar complexos lineares e apresenta uma marcada preferência por átomos "macios" como o enxofre, embora possa coordenar ao grupo amina (preferencialmente) ou ao grupo carboxílico da giicilglicina, com substituição de um ião H+ quando estes grupos estão protonados [122]. Uma solução aquosa de giicilglicina 0,2 mol dm"3 a pH 1,3 [Figura 7.1(a)] apresenta um espectro de H com dois singuletos largos a maior frequência que o sinal da água: um, mais estreito, atribuído ao protão do grupo -NH- (banda com 19 Hz de largura a meia altura) e outro, mais largo, devido aos protões equivalentes do grupo -NH3 (banda com 81 Hz de largura a meia altura); note-se que a razão entre as áreas destas duas bandas é de 1:3, como esperado. O espectro da Figura 7.1(a) apresenta ainda um dobleto e um singuleto a menor frequência que o sinal da água e que correspondem, respectivamente, (i) aos núcleos dos átomos de hidrogénio metilénicos (H-3) acoplados com o protão peptídico -NHe com constante de acoplamento de cerca de 5,5 Hz) e (ii) aos núcleos de H-l, para os quais não é observado acoplamento com os protões -NH3, embora estes, devido à permuta com o solvente, originem um visível alargamento do sinal de H-l. Na Figura 7.1(b) está representado o espectro de *H de uma solução aquosa 0,1 mol dm" em Hg(N03)2 e em giicilglicina a pH 1,3 e em que são visíveis novas bandas quando comparado com o de soluções puras de giicilglicina. Na região de campo baixo são observados dois sinais para o núcleo de hidrogénio do grupo -NH-, de largura aproximadamente igual a 17 Hz (depois de aumento de resolução em 3 Hz no processamento), afastados entre si de 26 Hz; destes sinais, o que se situa a maior frequência apresenta um desdobramento em tripleto devido ao acoplamento com os protões H-3 e com constante de acoplamento de aproximadamente 5 Hz, enquanto 146 Capítulo 7 que o sinal a menor frequência, com uma estrutura fina de tripleto muito pouco marcada e apenas ligeiramente visível com o aumento da resolução do espectro no processamento do FID, corresponde ao sinal observado para o grupo -NHno espectro de soluções puras de glicilglicina. Os núcleos de hidrogénio do grupo -NH3 apresentam um sinal largo (77 Hz após um aumento de resolução de 3 Hz no processamento) idêntico ao observado para a glicilglicina; observam-se ainda dois grupos de dois sinais, separados por 25 Hz em cada grupo e a menor frequência que o grupo -NH3 da espécie não coordenada a mercúrio (e afastados 210 Hz e 730 Hz deste sinal, respectivamente) e que são hipoteticamente atribuídos ao grupo amina coordenado ao catião mercúrio - o aparecimento de dois sinais em cada um dos grupos pode indicar que a coordenação do ião mercúrio(II) ao grupo amina toma os seus dois núcleos de hidrogénio não equivalentes. Observa-se ainda um outro sinal muito largo e pouco intenso (a 813 Hz relativo ao do grupo -NH3) e que pode estar relacionado com outra forma de glicilglicina complexando o catião Hg +. O sinal dos núcleos H-3 mostra uma estrutura em tripleto que poderá corresponder a dois dobletos sobrepostos, cada um com constante de acoplamento de aproximadamente 5,3 Hz. O sinal dos núcleos H-l apresenta uma estrutura complicada com cinco picos de intensidades não regulares que, como será visto a seguir, parecem corresponder a três sinais diferentes. O espectro de 13C de uma solução de Hg(N03)2 0,05 mol dm3 e glicilglicina 0,20 mol dm"3 a pH 1,9 apresentado na Figura 7.2(b) mostra apenas um sinal para cada núcleo da glicilglicina a 298K, mas a 1 °C é evidente o desdobramento de C-l e de C-2 em dois sinais (um dos sinais C-l aparece quase sobreposto com o de C-3). Numa tentativa para confirmar o número de espécies de glicilglicina com mercúrio, observou-se o espectro de THg com e sem glicilglicina a pH 1,5. Sem glicilglicina, pode ser observado um sinal na posição esperada para o nitrato de mercúrio em solução aquosa [124] mas ao adicionar apenas pequenas quantidades de glicilglicina à solução esse sinal sofre um grande alargamento e toma-se indetectável. Este fenómeno foi atribuído à grande anisotropia de desvio químico característica do núcleo de 199Hg e ao seu acoplamento com os átomos de hidrogénio [124,125,126]. Esta dificuldade só poderia ser contornada pela utilização de um campo magnético MECCRIO: FORMAÇÃO DE COMPLEXOS COM CITIDINA E GLIC1LGL1C1NA 147 mais baixo ou de temperatura mais alta ou ainda pela utilização de detecção inversa de Tig através do seu acoplamento com os átomos de :H, processo já usado para um estudo deste tipo [127]. Não se obteve sucesso neste trabalho com a elevação da temperatura até aos 90°C, provavelmente devido a problemas de relaxação [128]. Para verificar que os sinais atribuídos ao grupo amina da glicilglicina têm de facto essa origem, e não no grupo -NH-, foi obtido o espectro de 'H de uma solução aquosa a pH 1,3 de Hg(N03)2 0,10 mol dm"3 e glicilsarcosina (GS) 0,10 mol dm"3 cuja molécula pode ser representada por: H2N—C^y—C20—NCH3—C3H2—C400". Esta molécula é semelhante à glicilglicina com a diferença de que possui um grupo metilo a substituir o átomo de hidrogénio na ligação peptídica. O resultado obtido, apresentado na Figura 7.4(a), confirma a atribuição da banda a campo mais baixo ao grupo amina uma vez que o espectro é igual ao das soluções de glicilglicina com Hg(N03)2 nas mesmas condições, com a excepção dos sinais de -NH-, que a glicilsarcosina não apresenta, e com o aparecimento do sinal do grupo metilo =N-CH3 que aparece desdobrado nos sinais dos dois isómeros conformacionais da glicilsarcosina. O espectro de 'H de uma solução equimolar (0,05 mol dm" ) de acetilglicina (aG") CH3—C10—NH—C2H2— C300" e Hg(N03)2 [Figura 7.4(b)] não exibe desdobramento do sinal do átomo de hidrogénio da ligação peptídica. A ausência do grupo amina terminal na acetilglicina (substituído por um átomo de hidrogénio por comparação com a glicilglicina) permite concluir definitivamente que os sinais observados para o grupo amina e para o grupo -NHda glicilglicina têm origem na coordenação do catião Hg2+ ao grupo amina terminal. Nenhum sinal do espectro de H das soluções com acetilglicina e nitrato de mercúrio mostra desdobramento no intervalo de pH 1-3 nem diferenças significativas em termos de desvios químicos relativamente ao espectro da acetilglicina livre. Este resultado permite também excluir a presença de forte coordenação na ligação peptídica. Em solução de água deuterada (D20) No espectro de uma solução em D20 de Hg(N03)2 0,10 mol dm"3 e glicilglicina 0,10 mol dm" a pD 1,9 (Figura 7.5), podem ser observados três sinais para H-l, dois