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VALIDACIÓN DEL MÉTODO CUANTITATIVO DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA EN UN ENTORNO ACREDITABLE POR ENAC. VALIDATION OF THE QUANTITATIVE METHOD OF A PROTEIN DETERMINATION IN A CONTEXT ACREDITABLE BY ENAC. Au o /es And ea Pé ez Li e Di ec o /es Agus ín A iño Mone a, Jesús Be án Aso y An onio López Aliaga. Facul ad de Ve e ina ia 2021 T abajo Fin de G ado en Ciencia y Tecnología de los Alimen os Ag adecimien os Empecé la ca e a en el año 2010, con mucha ilusión sin sabe lo que el u u o me depa a ía, dos meses después, ecibí una ansiada llamada, mi p ime abajo en un labo a o io. Desde ese mismo día, luché po pode compagina los es udios con la jo nada comple a del abajo, ue ealmen e complicado en cie os momen os. Pe o desde luego sin la ayuda de muchos de los p o eso es que han pasado po mis años de g ado (8 ni más ni menos) hubie a sido imposible y sob e odo ag adece a los p o eso es de los úl imos años po las acilidades, la amabilidad y la comp ensión que han mos ado siemp e conmigo. Agus ín A iño da e las g acias po o ece e de mane a desin e esada en ayuda me con es e abajo. Y no puedo ol ida me de odos compañe os de clase, p ác icas… que he conocido en es a a en u a y ambién han apo ado su g ani o. ¡¡GRACIAS!! ¡¡GRACIAS!!, a mis compañe os del Labo a o io Ag oambien al, quienes siemp e me han is o como su “HIJICA”, me han animado siemp e a con inua cuando i aba la oalla, además de o ma me en odo lo elacionado con aspec os labo ales, son muchos y no pod ía nomb a los a odos, pe o en especial a An onio López y Jesús Be án po a en u a se (conociéndome) a ayuda me con el T abajo Fin de G ado, sin ellos no hubie a sido lo mismo. Finalmen e a mis pad es, mi ma ido y aho a mi u u o a bebe en camino, ¡¡MIL GRACIAS!!, po habe compa ido el su imien o conmigo, po seca las lag imas y po b inda los ap obados, pe o sob e odo po con ia has a el úl imo día que yo si que pod ía. ÍNDICE I- ÍNDICE DE TABLAS II- ÍNDICE DE FIGURAS 1- RESUMEN ……………………………………………………………..………………………………………………1 2- ABSTRACT ………………………………………………………….………………………………………………….2 3- INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………………….……………………..….3 3.1 ¿Qué es una alidación? ……………………………………………………………………………………3 3.2 P oceso de alidación …………………………………………………………………..…………………..4 3.3 En o no ac edi able …………………………………………………………………………………..……..5 3.4 Impo ancia del análisis de p o eína …………………………………………………………………5 3.5 Compa a i a del análisis de p o eína median e mé odo Dumas espec o a mé odo Kjeldahl………………………………………………………………………………………….......6 3.6 Requisi os del Sis ema de calidad..……………………………………………………………………6 3.7 Pa áme os de ca ac e ización de la alidación……………….………………………..………7 3.7.1 Exac i ud ………………………………..…………………………..………………………………….7 3.7.2 P ecisión…………………………………………………………….….……………………………….8 3.7.3 Lími e de de ección y cuan i icación…………………….…………………………………9 3.7.4 Ince idumb e…………………………………………………..…………………………………….9 3.8. C i e ios p e ios a la alidación ………………………………..…………………………………..10 4- JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS …………………………………………..……………………………………12 5- METODOLOGIA …………………………………………………………..……………………………….……..13 5.1 Desa ollo del mé odo analí ico Dumas de de e minación cuan i a i a de p o eína en p oduc os cá nicos. ……………………………………………………………………13 5.2 Ob ención de da os de alidación median e e isiones bibliog á icas de da os (Validación e ospec i a). ………………………………………………………………….…..…… 14 5.3 Ob ención de da os de esul ados de análisis expe imen ales ( alidación p ospec i a). ………………………………………………………………………………..……..……….16 5.4 Cálculos de los pa áme os de ca ac e ización del mé odo ……….………..…………23 5.4.1 Exac i ud, p ecisión e ince idumb e ……………………………………23 5.4.2 Lími es de de ección y cuan i icación……………….….……………….23 6- RESULTADOS Y DISCUSIÓN …………………………………………………………….……………..…….25 6.1 Ap obación y dis ibución del mé odo………………………………………………...…..25 6.2 Validación e ospec i a, cálculo de ince idumb e pa iendo de los da os ob enidos. ………………………………………………………………………………………………….…26 6.3 Validación p ospec i a, cálculo de ince idumb e pa iendo de los da os ob enidos y esul ados de los pa áme os de ca ac e ización ……………………….26 6.3.1 Exac i ud…………………………………………………..………………………………26 6.3.2 P ecisión……………………………………………………………………………………27 6.3.3 Lími es de de ección y cuan i icación…………………………………………28 6.3.4 Cálculo de la ince idumb e……………….………………………………………30 6.4 Valo ación de las ince idumb e de los dos mé odos de alidación.…………33 7- CONCLUSIONES ……………………………………………………………………….………………………….34 8- CONCLUSIONS ……………………………………………………………………….……………………………35 9- VALORACIÓN PERSONAL …………………………………………………………..…………………………36 10- BIBLIOGRAFIA …………………………………………………………..…………………………………………37 11- ANEXOS ………………………………………………………………………………………………………………39 Anexo I Compa a i a mé odos Dumas – Kjeldahl………………….………………………………39 Anexo II abla de la dis ibución -s uden ………………..…………………………………………44 Anexo III Mé odo de análisis cuan i a i o de p o eína po Dumas en p oduc os cá nicos …………………….…………………………………………………………………………………..……45 I- ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Valo es de p o eína pa a la alidación e ospec i a de ma e iales in e labo a o io desde 2009 a 2019 buscados en los cuade nos de in e labo a o ios del labo a o io. Tabla 2. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 3720/16 en el día 11/11/2020 Tabla 3. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 3720/16 en el día 12/11/2020 Tabla 4. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 3720/16 en el día 13/11/2020 Tabla 5. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 4484/17 en el día 11/11/2020 Tabla 6. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 4484/17 en el día 12/11/2020 Tabla 7. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 4484/17 en el día 13/11/2020 Tabla 8. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 4635/19 en el día 11/11/2020 Tabla 9. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 4635/19 en el día 12/11/2020 Tabla 10. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 4635/19 en el día 13/11/2020. Tabla 11. Fo ma o de cálculo de ince idumb e de acue do con (FT-UGC-425 e 1), pes aña Ma e ial de Re e encia 1- Rango Bajo. Fo ma o ac edi ado, p opio del Labo a o io Ag oambien al. Tabla 12. Valo es ob enidos en el p og ama del apa a o LECO de blancos con cápsula de es año pa a el cálculo de lími es de de ección y cuan i icación. Tabla 13. Resul ados ob enidos de la alidación e ospec i a de ma e iales de e e encia an iguos con el p og ama p opio del labo a o io ( PRG-UGC-03 e 1) ac edi ado po ENAC Tabla 14. Valo es ob enidos del o ma o (FT-UGC-427 e 1) pa a comp obación de la e acidad del mé odo de alidación. Tabla 15. Cálculo de -S uden desde los sesgos del alo e e encia y el alo medio de análisis en ango bajo. Tabla 16. Cálculo de -S uden desde los sesgos del alo e e encia y el alo medio de análisis en ango medio. Tabla 17. Cálculo de -S uden desde los sesgos del alo e e encia y el alo medio de análisis en ango al o. Tabla 18. Tabla con los esul ados de las de iaciones es ánda ob enidas según o ma o p opio del labo a o io (FT-UGC-425. Re 1) . Rango bajo – medio - al o Tabla 19. Valo es % de p o eína, des iación es ánda y media ob enidos del análisis de p o eína con mé odo Dumas del Ma e ial de Re e encia Medio pa a comp obación del lími e de de ección Tabla 20. Valo es % de p o eína, des iación es ánda y media ob enidos del análisis de p o eína con mé odo Dumas del Ma e ial de Re e encia Medio pa a comp obación del lími e de cuan i icación Tabla 21. Fo ma o de cálculo de ince idumb e de acue do con (FT-UGC-425 e 1), pes aña esumen. Fo ma o ac edi ado, p opio del labo a o io Ag oambien al. Tabla 22. Fo ma o de cálculo de ince idumb e de acue do con (FT-UGC-425 e 1), pes aña esumen. Fo ma o ac edi ado, p opio del labo a o io Ag oambien al. Tabla 23. Fo ma o de cálculo de ince idumb e de acue do con (FT-UGC-425 e 1), pes aña esumen. Fo ma o ac edi ado, p opio del labo a o io Ag oambien al. II- ÍNDICE DE FIGURAS Figu a 1. Esquema del p oceso de alidación (Du au e al, 2010). 1 1- RESUMEN El obje i o p incipal de es e abajo es la pues a a pun o y alidación de la de e minación de p o eína po el mé odo Dumas en el Labo a o io Ag oambien al del Gobie no de A agón. In e esa al Labo a o io la pues a en ma cha del mé odo en ma ices de p oduc os cá nicos pa a su pos e io ac edi ación po ENAC. El Labo a o io dispone de dos p ocedimien os analí icos pa a p o eína, el mé odo Kjeldahl y el mé odo Dumas, y ya se ha comp obado en o as ma ices que no p esen an di e encias signi ica i as en sus esul ados. Como p ime paso se ha edac ado la desc ipción del mé odo de análisis cuan i a i o de p o eína po Dumas en p oduc os cá nicos. Después, se desa olla un plan de alidación. Al a a se de un mé odo que se usa desde hace iempo en el Labo a o io, esul a posible compa a dos o mas de alidación: p ospec i a y e ospec i a. La alidación e ospec i a, ob eniendo esul ados que p o ienen de la pa icipación en eje cicios de in e compa ación. Se ealizó una búsqueda en los egis os de eje cicios de in e compa ación ealizados en los úl imos 10 años, encon ando más de 40 eje cicios. De es os, solo 22 eunían oda la in o mación necesa ia pa a es e ipo de alidación. La segunda o ma de alida , la p ospec i a, se lle a a cabo a a és de la epe ición analí ica, en al menos 3 días di e en es, de ma e iales de e e encia de alo conocido, ob eniendo esul ados que con un a amien o es adís ico pe mi en alida el mé odo. En ambas alidaciones ob enemos la e acidad, la p ecisión y inalmen e la ince idumb e, lo que pe mi e compa a las y conclui que los esul ados ob enidos son simila es. Todo el p oceso ha sido desa ollado en un Labo a o io ac edi ado po la En idad Nacional de Ac edi ación (ENAC), lo que hace posible que es e mé odo llegue a se ac edi ado. Se concluye que el mé odo Dumas es aplicable a la de e minación de p o eína en p oduc os cá nicos con unos pa áme os adecuados al uso p e is o. Palab as cla e: alidación, in e labo a o ios, mé odo Dumas, cá nicos, p o eína 2 2- ABSTRACT The main objec i e o his wo k is he de elopmen and alida ion o he p o ein de e mina ion by he Dumas me hod in he “Labo a o io Ag oambien al del Gobie no de A agón”. The Labo a o y is in e es ed in he implemen a ion o he me hod in ma ices o mea p oduc s o i s subsequen acc edi a ion by ENAC. The Labo a o y has wo analy ical p ocedu es o p o ein, he Kjeldahl me hod and he Dumas me hod, and i has al eady been p o en in o he ma ices ha he e a e no signi ican di e ences in hei esul s. As a i s s ep, a desc ip ion o he me hod o quan i a i e p o ein analysis by Dumas in mea p oduc s has been w i en. Then, a alida ion plan is de eloped. As his me hod has been used o a long ime in he labo a o y, i is possible o compa e wo o ms o alida ion: p ospec i e and e ospec i e. Re ospec i e alida ion, ob aining esul s om pa icipa ion in in e compa ison exe cises. A sea ch o he eco ds o in e compa ison exe cises conduc ed in he las 10 yea s ound mo e han 40 exe cises. O hese, only 22 had all he in o ma ion necessa y o his ype o alida ion. The second o m o alida ion, p ospec i e alida ion, is ca ied ou h ough he analy ical epe i ion, on a leas 3 di e en days, o e e ence ma e ials o known alue, ob aining esul s ha , wi h s a is ical ea men , allow he me hod o be alida ed. In bo h alida ions we ob ain he ueness, p ecision and inally he unce ain y, which allows us o compa e hem and conclude ha he esul s ob ained a e simila . The whole p ocess has been de eloped in a labo a o y acc edi ed by he Na ional Acc edi a ion En i y (ENAC), which makes i possible o his me hod o be acc edi ed. I is concluded ha he Dumas me hod is applicable o he de e mina ion o p o ein in mea p oduc s wi h pa ame e s sui able o he in ended use. Key wo ds: alida ion, in e labo a o y, Dumas me hod, mea , p o ein. 3 3- INTRODUCCIÓN 3.1 ¿Qué es una alidación? La alidación de un mé odo analí ico es un paso undamen al pa a asegu a que los esul ados en egados po dicho mé odo son con iables. Cuando se ealiza la alidación de un mé odo po pa e del labo a o io, lo que se busca es pode de e mina con undamen o es adís ico que el mé odo es adecuado pa a los ines p e is os. La alidación es el obje i o p incipal de es e abajo ya que es eque ida en no mas sob e sis emas de ges ión de la calidad, pa icula men e en la no ma ISO 17025 sob e equisi os gene ales pa a labo a o ios de calib ación y ensayo. Es impo an e que el labo a o io enga cla o an es de inicia la alidación cuales son los eque imien os del mé odo pa a es ablece el alcance de la alidación. Es esencial conoce el mé odo a alida y su aplicabilidad, es deci , el anali o, su concen ación (ni el, lími e de de ección, lími e de cuan i icación, e c.) y la ma iz (o ma ices) en las cuales se desea u iliza (Lazos y He nández, 2004). El esul ado de una alidación es una decla ación sob e el cumplimien o, o incumplimien o, de los equisi os pa a el uso o aplicación dada, sus en ada en e idencias, necesa iamen e obje i as. En la Figu a 1 se mues a un esquema de ipos de alidaciones según ipos de mé odos a alida . La alidación puede se compleja, pe o cuando se u iliza co ec amen e, puede aho a iempo y dine o a la go plazo pe mi iendo un abajo más iable y gene ando unos p ocesos más con olados y es ables. Conoce el p oceso ayuda á a educi los esul ados no con o mes y acili a á la demos ación en una audi o ía de que se iene el con ol de los p ocesos (López, 2012). Figu a 1. Esquema del p oceso de alidación (Du au e al, 2010). 10 𝐿í𝑚𝑖𝑡𝑒)𝑑𝑒)𝑐𝑢𝑎𝑛𝑡𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛=10)𝑥)𝑑𝑒𝑠𝑣𝑖𝑎𝑐𝑖ó𝑛)𝑒𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟)𝑑𝑒)10)𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜𝑠 Pa a ambas de e minaciones, se u ilizan blancos, que son cápsulas de es año que no con ienen el anali o de in e és, pe o que u iliza odos los pasos del p ocedimien o solo con los eac i os. 3.7.4 Ince idumb e: Rango de alo es en e los que se encuen a el esul ado co ec o con una de e minada p obabilidad (gene almen e el 95%). La No ma UNE/ISO/IEC 17025:2017 de “Requisi os gene ales ela i os a la compe encia de los labo a o ios de ensayo y calib ación” pone especial én asis en la necesidad de es ima la ince idumb e del ensayo (ISO 17025:2017, 2017) y po ello es un obje i o en la alidación. La ince idumb e se puede es ima en base al modelo “caja neg a”. Hay cie os é minos que con igu an la es imación de la ince idumb e po el modelo global o caja neg a, que son denominados “con ibuciones a la ince idumb e” (Reyes y Ce ezo, 2009): - Ince idumb e del ma e ial de e e encia - Di e encia en e del alo medio ob enido y el de e e encia del Ma e ial de Re e encia Ce i icado (MRC) ( ambién conocido como sesgo o ecupe ación) - Rep oducibilidad de la medición Po an o, los é minos a ene en cuen a son: i. Ince idumb e del MRC ii. Ve acidad o Exac i ud iii. P ecisión 𝑈𝑟𝑒𝑙) ( % ) =2𝑥 WX 𝐶𝑉 √ 𝑛)𝑑𝑖𝑎 Y !+𝑢)(%)+ [ 𝑅)(%) √ 3 ! Siendo: U el (%): ince idumb e expandida ela i a u (%): Ince idumb e ma e ial de e e encia CV: p ecisión aplicada como con ol de calidad R: sesgo máximo de la ecupe ación (%) n: nº de epe iciones día 11 La ince idumb e se exp esa asociada al alo cen al en los in o mes de esul ados. 3.8 C i e ios p e ios pa a la alidación An es de p ocede a la alidación, y en unción de las necesidades de uso de los esul ados, debe con a se con algún c i e io que debe á cumpli el mé odo pa a conside a lo adecuado. En ocasiones se dispone de c i e ios es ablecidos po la legislación, pe o en es e caso no disponemos de equisi os que sean de obligado cumplimien o. Al no dispone de esos c i e ios esul a más complicado es ablece obje i os de alidación, en es os casos la uen e de in o mación debe se , además de las di e en es e e encias bibliog á icas, la p opia expe iencia adqui ida en la pues a a pun o del mé odo, nues a expe iencia con mé odos simila es o la expe iencia del “me cado”. Se op a po es ablece un c i e io pa a la des iación es ánda de modo que sea meno de 0,91, que es el co espondien e al p omedio de las des iaciones es ánda de odos los ma e iales de e e encia ecopilados du an e los úl imos 10 años. 12 4- JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS La ealización de es e abajo busca, p incipalmen e, la ca ac e ización del mé odo Dumas de análisis de p o eína en p oduc os cá nicos, gene ando una alidación comple a, con la es imación de la ince idumb e, que nos indica á los lími es den o de los cuales se encuen a nues o da o con una p obabilidad del 95% (K=2 coe icien e de cobe u a). En el labo a o io donde se ealizan los análisis expe imen ales exis e un in e és especial en la implan ación del mé odo Dumas como al e na i a álida al mé odo Kjeldahl. Fundamen almen e po las mejo as que es a me odología apo a al día a día, como la apidez analí ica, las mejo as medioambien ales o la segu idad. El obje i o p incipal es la alidación del mé odo Dumas, compa ando dos mé odos de alidación ( e ospec i o y p ospec i o). Aunque pa a pode llega a una conclusión inal, es necesa io alcanza unos obje i os pa ciales: 1- Desa olla el mé odo de de e minación cuan i a i a de p o eína median e el mé odo Dumas en p oduc os cá nicos. 2- Ob ene da os de alidación median e e isiones bibliog á icas de da os (Validación e ospec i a), pa a p ocede a la alidación una ez ecopilados. 3- Ob ene esul ados de análisis expe imen ales (Validación p ospec i a), pa a p ocede a la alidación una ez ealizados los análisis y ob enidos los esul ados. 4- Calcula los pa áme os de ca ac e ización de ambas alidaciones median e la aplicación de he amien as es adís icas. 13 5- METODOLOGIA 5.1 Desa ollo del mé odo analí ico Dumas de de e minación cuan i a i a de p o eína en p oduc os cá nicos. El ensayo a alida es el análisis de p o eína po el mé odo Dumas, en ma iz de p oduc os cá nicos ( escos, en pa é, o cu ados). Es e mé odo de cuan i icación de p o eína no es el mé odo o icial (Boe.es, 1979), que es Kjeldahl, es un mé odo pe mi ido po la legislación en el caso de piensos po ejemplo, que iene la misma alidez que el mé odo o icial siemp e que puedas demos a que no exis en di e encias signi ica i as en e los esul ados ob enidos con ambos mé odos. El p ime paso ue demos a que no exis en di e encias signi ica i as en e ambos mé odos median e el análisis es adís ico de a ios esul ados de mues as analizadas an o po el mé odo o icial (Kjeldahl) como po el mé odo al e na i o (Dumas), e en (Anexo I). T as la búsqueda de los documen os y o ma os necesa ios según el ac ual sis ema de calidad implan ado en el Labo a o io Ag oambien al, gene a emos un mé odo que end á un código (MT-ALI-XX). La edacción de los mé odos en es e labo a o io iene que segui un igu oso o den ma cado po el índice, en el que se incluye: 1- OBJETO, 2- ALCANCE (campo de aplicación, obje o de ensayo y pa áme os), 3- SEGURIDAD E HIGIENE, 4- DESCRIPCIÓN, 5-REALIZACIÓN (equipos, ma e iales, condiciones, p ocedimien os, documen os, egis os…), 7- CONTROL DE CALIDAD ( azabilidad, epe ibilidad, endencias…), 8- RESPONSABILIDADES, 9- REFERENCIAS Y 10- ANEXOS. Inicialmen e se pa e de un mé odo simila ya desc i o (MT-ALI-010) con el i ulo de : “ni ógeno po combus ión y de ec o de conduc i idad é mica (mé odo Dumas) y p o eína b u a”. Es e mé odo solo aba ca a piensos y sus ma e ias p imas, ce eales y sus de i ados, pe o hay muchos apa ados comunes que podemos aplica a nues o nue o mé odo pa a p oduc os cá nicos. Una ez comple ados odos los apa ados an e io es, se comp ueba si exis en c i e ios ma cados en cuan o a epe ibilidad, ep oducibilidad… po alguna legislación igen e, pe o el p ocedimien o o icial de análisis del ni ógeno en ca ne (Boe.es, 1979), solo ma ca en el apa ado 5.5 que el po cen aje de p o eína o al se á: 6,25 x po cen aje de N o al. También hace e e encia a una no ma ISO R-937 (ISO 937:1978, 1978) que no indica más in o mación en cuan o a lími es de cuan i icación y de ección, epe ibilidad, e c. Po lo an o, se á el labo a o io p e ia expe iencia, el que ma que es os lími es necesa ios pa a el seguimien o de la alidación y de los pos e io es análisis dia ios. 14 Ac ualmen e se abaja en p oduc os cá nicos, pa a la acep ación de los esul ados, se ealiza cada mues a po iplicado y es os es alo es ienen que cumpli una epe ibilidad de 0,3% en ni ógeno, lo que co esponde a 1,88 % en p o eína. Además es obliga o io in oduci en cada anda de abajo un con ol (ma e ial de e e encia p oceden e de un eje cicio in e labo a o io) donde se aplica como ince idumb e 2 eces la des iación es ánda del ma e ial, debido a que en es e momen o, po no es a alidado el mé odo, se u iliza como ap oximación a la ince idumb e a aplica . Finalmen e, el p ocedimien o de análisis Dumas se basa en la combus ión (a 850°C) de una pequeña can idad de mues a (ap oximadamen e 0,3-0,5 g amos) pesada en una capsula de es año. En la combus ión se gene an di e sos gases que pasan po el ci cui o in e no del apa a o, has a llega a un de ec o de conduc i idad é mica que cuan i ica el ni ógeno , donde se ob end á la can idad de ni ógeno en milig amos, que con el peso in oducido p e iamen e y el ac o pa a con e sión de ni ógeno a p o eína (6,25), se ob iene el po cen aje de ni ógeno y p o eína. Se ealiza en p ime luga una limpieza del apa a o, dejando al apa a o unos 20 minu os pasando gases en acío, as es o dos análisis de blanco con cápsula y po úl imo una ec a de calib ado con ácido e ilendiamino e aacé ico (EDTA), se a a de un pa ón ce i icado, con un con enido de ni ógeno de 9,56 % ± 0,06, se u ilizan 5 pesos di e en es pa a es a ec a (0,05, 0,10, 0,15, 0,20 y 0,25 g amos), as el ecalib ación del apa a o odas las medidas de EDTA deben de cumpli que su po cen aje de ni ógeno a ié en e 9,50 y 9,62. Después de la acep ación de la ec a se p ocede á a pesa las mues as e inicia el análisis. El mé odo comple o al de alle se adjun a en Anexo III. Pa a que és e sea álido, y enga su codi icación, iene que se e isado y ap obado po el esponsable de la Unidad de Ga an ía de Calidad y po el di ec o del labo a o io, que jun o a la pe sona que lo ha elabo ado se hacen esponsables del mé odo. Una ez inalizado es e ámi e se á dis ibuido po el je e de la Unidad de Ga an ía de Calidad. 5.2 Ob ene da os de alidación median e ecopilación de da os his ó icos ( alidación e ospec i a). Validación e ospec i a, basada en la ecopilación de esul ados de eje cicios in e compa ación ealizados po el labo a o io en di e en es años. Es os da os incluyen el alo de consenso de p o eína, la des iación es ánda ob enida en e los esul ados de los di e en es labo a o ios pa icipan es en el eje cicio de in e compa ación. Y inalmen e el alo de p o eína in o mado po el labo a o io median e la écnica Dumas. 15 Es os da os se almacenan en el labo a o io, du an e a ios años (10-15 años) eniendo en cuen a que la echa de caducidad es de 5 años pa a cada ma e ial. Se a a de una búsqueda de los esul ados de di e en es eje cicios de in e compa ación en los que el Labo a o io ha pa icipado pa a es a de e minación y ma iz. Desde el año 2009 has a 2019 se encon a on un o al de 40 eje cicios; se o dena on en una hoja Excel los alo es de: esul ado epo ado po el labo a o io, esul ado de consenso de eje cicio, y la des iación es ánda . T as el es udio ealizado, solo 22 de los eje cicios an e io es ienen los 3 alo es eque idos, con los que se a a abaja (Tabla 1). Median e un p og ama Excel (PRG-UGC-03 Re 1), den o del sis ema de ges ión de calidad del Labo a o io Ag oambien al, se calculan los sesgos (es deci , la di e encia en e el alo emi ido po el Labo a o io y alo asignado po el p o eedo del eje cicio), y el z-sco e (que es la di isión del sesgo en e la des iación es ánda ) de cada eje cicio. Como úl imo paso, se calcula la ince idumb e del mé odo de p o eína Dumas, pa a ello se calcula cada con ibución a la ince idumb e: media y des iación es ánda de los sesgos. Con odos es os da os pod emos calcula : la ince idumb e, la p ecisión (como des iación es ánda o coe icien e de a iación), y la e acidad del p oceso (como ecupe ación). Tabla 1. Valo es de p o eína pa a la alidación e ospec i a de ma e iales in e labo a o io desde 2009 a 2019 buscados en los cuade nos de in e labo a o ios del labo a o io. Nº Nº DE INTERCOLABORATIVO VALOR ASIGNADO VALOR MEDIO SESGO 1 811/11 11,91 11,45 -0,46 2 3522/11 21,94 21,35 -0,59 3 4381/11 19,55 20,03 0,48 4 537/12 13,15 12,99 -0,16 5 341/13 12,71 11,79 -0,92 6 3803/14 24,89 25,7 0,81 7 813/15 9,58 7,78 -1,80 8 957/16 12,25 12,31 0,06 9 4247/15 28,86 21,65 -7,21 10 3804/14 9,81 9,54 -0,27 11 1374/17 13,12 12,63 -0,49 12 3521/13 22,83 23,34 0,51 13 3623/16 28,75 29,31 0,56 14 249/18 13,56 13,31 -0,25 16 15 2045/17 13,12 13,12 0,00 16 4484/17 13,01 12,94 -0,07 17 4486/17 9,89 10,02 0,13 18 1691/18 13,69 13,13 -0,56 19 2310/19 28,69 28,88 0,19 20 4635/19 28,85 29,33 0,48 21 3720/16 7,49 7,43 -0,06 22 4814/19 7,19 7,13 -0,06 5.3 Ob ene da os de esul ados de análisis expe imen ales ( alidación p ospec i a). Validación p ospec i a, basada en la epe ición de análisis de p o eína po el mé odo Dumas. Pa a la ob ención de alo es que sean signi ica i os se ealiza un plan de alidación. En es e plan se alo an los ma e iales disponibles en ese momen o, se comp ueba cual es el ango habi ual de abajo; que se es ablece desde 7 a 30 % p/p en p o eína, inalmen e se eligen 3 ma e iales de e e encia que es én en el ango bajo (7%), ango medio (13-15%) y un ango al o (28-30%), y se ecoge la in o mación necesa ia de cada ma e ial pa a el cálculo pos e io de la alidación: - Ma e ial de ango Bajo (nº de egis o labo a o io: 3720/16): Se a a de un p oduc o cá nico (Tocino en e e ado), son es os de un eje cicio in e labo a o ios del año 2016, de la en idad JUNAN ( JUNAN 13/16 M2), se ob iene el ce i icado en oc ub e de 2016, con una caducidad del p oduc o de 5 años, gua dando los es os de mues a en el congelado a -18°C. El alo eal o ce i icado de % de p o eína sob e ma e ia na u al es de 7,49 ± 1,50 % p/p p o eína sob e ma e ia na u al (smn). El alo que el labo a o io epo ó en ese eje cicio ue de 7,43 % p/p p o eína smn. Ob eniendo un z-sco e -0,07 y una des iación es ánda del eje cicio de 0,7491. - Ma e ial de ango Medio (Nº de egis o de labo a o io: 4484/17) : Se a a de un p oduc o cá nico (Jamón cocido), son es os de un eje cicio in e labo a o ios del año 2017, de la en idad JUNAN ( Ensayo 10/17 M1), se ob iene el ce i icado en no iemb e de 2017, con una caducidad del p oduc o de 5 años, gua dando los es os de mues a en el congelado a -18°C. El alo eal es de 13,01 ± 1,301 % p/p p o eína smn. El alo 17 que el labo a o io epo ó en ese eje cicio ue de 12,94 % p/p p o eína smn. Ob eniendo un z-sco e -0,11 y una des iación es ánda del eje cicio de 0,6505. - Ma e ial de ango Al o (nº de egis o labo a o io: 4635/19): Se a a de un p oduc o cá nico (Jamón cu ado), son es os de un eje cicio in e labo a o ios del año 2019, de la en idad Gabine e de se icios pa a la Calidad (GSC-MEAT/2019M1B), se ob iene el ce i icado en ene o de 2020, con una caducidad del p oduc o de 5 años, gua dando los es os de mues a en el congelado a – 18°C. El alo eal es de 28,85 ± 2,88 % p/p p o eína smn. El alo que el labo a o io epo ó en ese eje cicio ue de 29,33 % p/p p o eína smn. Ob eniendo un z-sco e 0,33 y una des iación es ánda del eje cicio de 1,44. Pa a que es a alidación sea ep esen a i a, se ealiza án 10 análisis dia ios de p o eína de cada ma e ial ( ango bajo, medio y al o) du an e 3 días di e en es, siguiendo el mé odo Dumas desc i o en el Anexo III, en o al es o se án 90 esul ados independien es. Se ecoge án los da os ob enidos y se o dena án en una hoja Excel pa a el pos e io a amien o de da os. Es os ma e iales se conse an congelados, po lo que un día an es se p ocede a man ene en e ige ación pa a su descongelación. Se aplicó el p ocedimien o al cual se desc ibe en el mé odo, omando pesos de pa ida de en e 0,300 y 0,500 g amos. P e iamen e a las pesadas se homogeneizo el ma e ial de e e encia con un molinillo adecuado pa a asegu a la homogeneidad de la mues a y, po an o, la epe ibilidad en los alo es del análisis. Con ca ác e p e io al uso del equipo, al como indica el mé odo, se p ocede a pone a pun o el ins umen o de medida de la ma ca (LECO) de análisis de ni ógeno po mé odo Dumas, median e la limpieza y calib ación, ob eniendo la ec a de calib ado. De es e modo se p ocedió cada día de análisis: Día 1: 11/No iemb e/2020; Día 2: 12/No iemb e/2020; Día 3: 13/No iemb e/2020. A. RANGO BAJO Se pesan 10 cápsulas del ma e ial y se in oducen en el au o-mues eado del LECO ob eniendo los da os de % de p o eína e lejados en las Tablas 2, 3 y 4 co esponden al ango bajo, las Tablas 5,6 y 7 al ango medio y po úl imo las Tablas 8, 9 y 10 al ango al o: DIA 1 18 Tabla 2. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 3720/16 en el día 11/11/2020. Nº de mues a Peso (g amos) % de ni ógeno ac o % de p o eína 3720-1 0,4352 1,0570 6,25 6,607 3720-2 0,4402 1,0115 6,25 6,322 3720-3 0,3876 1,1549 6,25 7,218 3720-4 0,4522 1,1003 6,25 6,877 3720-5 0,3224 1,0780 6,25 6,738 3720-6 0,4375 0,9969 6,25 6,231 3720-7 0,4000 0,9855 6,25 6,160 3720-8 0,3795 1,0417 6,25 6,511 3720-9 0,4188 1,1577 6,25 7,236 3720-10 0,3507 1,1934 6,25 7,460 DIA 2 Tabla 3. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 3720/16 en el día 12/11/2020. Nº de mues a Peso (g amos) % de ni ógeno ac o % de p o eína 3720-1 0,2642 0,9950 6,25 6,219 3720-2 0,4239 1,1773 6,25 7,358 3720-3 0,3215 1,0900 6,25 6,813 3720-4 0,3328 0,9806 6,25 6,129 3720-5 0,3318 1,1161 6,25 6,976 3720-6 0,2527 1,0208 6,25 6,380 3720-7 0,3857 1,0675 6,25 6,672 3720-8 0,3000 1,0282 6,25 6,426 3720-9 0,3156 0,9991 6,25 6,245 3720-10 0,3782 1,0390 6,25 6,494 DIA 3 Tabla 4. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 3720/16 en el día 13/11/2020. Nº de mues a Peso (g amos) % de ni ógeno ac o % de p o eína 3720-1 0,3360 1,1703 6,25 7,315 3720-2 0,3345 1,0432 6,25 6,520 3720-3 0,4225 0,9403 6,25 5,877 19 3720-4 0,5204 1,0392 6,25 6,495 3720-5 0,4180 1,0891 6,25 6,807 3720-6 0,4790 1,0385 6,25 6,491 3720-7 0,3638 1,0234 6,25 6,396 3720-8 0,3692 1,0095 6,25 6,309 3720-9 0,3959 0,9863 6,25 6,165 3720-20 0,2785 1,0152 6,25 6,345 B. RANGO MEDIO DIA 1 Tabla 5. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 4484/17 en el día 11/11/2020. Nº de mues a Peso (g amos) % de ni ógeno ac o % de p o eína 4484-1 0,3488 2,1061 6,25 13,16 4484-2 0,3289 2,1148 6,25 13,22 4484-3 0,3996 2,1388 6,25 13,37 4484-4 0,2752 2,1417 6,25 13,39 4484-5 0,4543 2,0943 6,25 13,09 4484-6 0,6105 2,0460 6,25 12,79 4484-7 0,3735 2,1166 6,25 13,23 4484-8 0,4562 2,1345 6,25 13,34 4484-9 0,4743 2,0780 6,25 12,99 4484-10 0,4042 2,1021 6,25 13,14 DIA 2 Tabla 6. Resul ados ob enidos del p og ama Leco pa a el ma e ial 4484/17 en el día 12/11/2020. Nº de mues a Peso (g amos) % de ni ógeno ac o % de p o eína 4484-1 0,5841 2,1002 6,25 13,13 4484-2 0,4533 2,1787 6,25 13,62 4484-3 0,6636 2,1636 6,25 13,52 4484-4 0,4291 2,2039 6,25 13,77 4484-5 0,2809 2,2099 6,25 13,81 4484-6 0,4846 2,1835 6,25 13,65 4484-7 0,4578 2,1794 6,25 13,62 26 Además de ob ene la ince idumb e, se comp ueba la e acidad con el es udio de - S uden , donde se ob iene una calculada de 1,278 y la abulada de 1,721 pa a una p obabilidad del 95 % y 21 g ados de libe ad ( ). Como la -calculada es in e io que la abulada, se con i ma la alidez a es e mé odo de alidación (Tabla 14). Tabla 14. Valo es ob enidos del o ma o (FT-UGC-427 e 1) pa a comp obación de la e acidad del mé odo de alidación. 6.3 Validación p ospec i a, cálculo de ince idumb e pa iendo de los da os ob enidos y esul ados de los pa áme os de ca ac e ización 6.3.1 Exac i ud Se compa an los alo es ob enidos con los alo es de e e encia, median e un es udio es adís ico del es -S uden alo a emos su ap i ud y alidez (Tabla, 15,16 y 17). Median e la abla del Anexo II, buscamos el alo de abulada pa a 9 g ados de libe ad ( =10-1) y un 95% de p obabilidad, el alo ob enido es de 1,833. o Rango bajo Tabla 15. Cálculo de -S uden desde los sesgos del alo e e encia y el alo medio de análisis en ango bajo. 3720/16 (7,49%) Día 1 Día 2 Día 3 To al de días Media ( % P/P p o eína) 6,74 6,57 6,47 6,635 Sesgo -0,63 -0,92 -1,02 -0,85 T calculada 0,522 0,753 0,842 1,26 o Rango medio Tabla 16. Cálculo de -S uden desde los sesgos del alo e e encia y el alo medio de análisis en ango medio. 4484/17 (13,01%) Día 1 Día 2 Día 3 To al de días VERACIDAD cal 1,278 ab 1,721 27 Media ( % p o eína) 13,17 13,60 13,33 13,39 Sesgo 0,16 0,59 0,32 0,38 T cal 0,273 0,971 0,592 1,01 o Rango Al o Tabla 17. Cálculo de -S uden desde los sesgos del alo e e encia y el alo medio de análisis en ango al o 4635/19 (28,85%) Día 1 Día 2 Día 3 To al de días Media ( % p o eína) 29,93 29,87 30,24 30,00 Sesgo 1,08 1,02 1,39 1,15 T cal 1,308 0,526 1,218 0,796 Todos los alo es de calculadas es án po debajo de la abulada, po lo que no exis en di e encias signi ica i as al 95% de p obabilidad en e los di e en es días de análisis y el ma e ial de e e encia u ilizado. Po lo an o la exac i ud de es e mé odo es acep able. 6.3.2 P ecisión Se calcula la des iación es ánda de las medias de los 3 días, es os da os se ob ienen desde el p og ama in e no del Labo a o io (FT-UGC-425. Re 1): Rango bajo = 0,133 Rango medio = 0,217 Rango Al o = 0,211 o Repe ibilidad: Des iación es ánda ob enida al analiza una misma mues a a ias eces, en un pe iodo co o de iempo, sin cambia de equipo de medida, eac i os o analis a. Válido pa a las epe iciones dia ias (Tabla 18). Tabla 18. Tabla con los esul ados de las de iaciones es ánda ob enidas según o ma o p opio del labo a o io (FT-UGC-425. Re 1) . Rango bajo – medio – al o. 3720/16 (7,49% p/p) Tanda día 1 Tanda día 2 Tanda día 3 Des iación es ánda 0,454 0,386 0,383 4484/17 (13,01% p/p) Tanda día 1 Tanda día 2 Tanda día 3 28 Des iación es ánda 0,185 0,192 0,171 4635/19 (28,85% p/p) Tanda día 1 Tanda día 2 Tanda día 3 Des iación es ánda 0,261 0,613 0,361 o Rep oducibilidad Es a des iación co esponde a la se ie comple a de los 30 análisis en conjun o, donde cambian an o los días de análisis, como las ec as de calib ado. Rango bajo = 0,410 Rango medio = 0,252 Rango Al o = 0,457 En odos los casos es as des iaciones son bas an e in e io es de 0,91 que es el alo obje i o p opues o inicialmen e, como no exis e una legislación que ma que ningún pa áme o, se decidió coge la des iación es ánda media de odos los ma e iales de e e encia abajados en la alidación e ospec i a. El esul ado es muy posi i o en es e aspec o. Se puede conclui diciendo que es un mé odo que demues a ene una al a p ecisión. 6.3.3 Lími es de de ección y cuan i icación. Des iación es ánda absolu a del % de p o eína ob enida de los alo es Tabla 12: 0,0689 Lími e de De ección= 3 x des iación es ánda absolu a = 1,29 % en p o eína Lími e de Cuan i icación= 10 x des iación es ánda absolu a = 4,31 % en p o eína Los alo es calculados de lími es de de ección se án 1,29% y pa a el lími e de cuan i icación 4,31%. Se p ocede a la comp obación de los lími es ma emá icos con mues as eales, según la me odología desc i a, ob eniendo los siguien es alo es (Tabla 19 y 20). Tabla 19. Valo es % de p o eína, des iación es ánda y media ob enidos del análisis de p o eína con mé odo Dumas del ma e ial de e e encia pa a comp obación del lími e de de ección. Nº de mues a Peso (g amos) % de ni ógeno ac o % de p o eína Ma e ial de e e encia 0,9100 0,21325 6,25 1,333 29 Ma e ial de e e encia 0,9750 0,20747 6,25 1,297 Ma e ial de e e encia 0,9360 0,20488 6,25 1,281 Des iación es ánda 0.0266 Media de los alo es 1,30% Tabla 20. Valo es % de p o eína, des iación es ánda y media ob enidos del análisis de p o eína con mé odo Dumas del ma e ial de e e encia pa a comp obación del lími e de cuan i icación. Nº de mues a Peso (g amos) % de ni ógeno ac o % de p o eína Ma e ial de e e encia 0,4731 0,7251 6,25 4,532 Ma e ial de e e encia 0,4434 0,7163 6,25 4,477 Ma e ial de e e encia 0,4362 0,7000 6,25 4,375 Des iación es ánda 0,0797 Media de los alo es 4,46% Se concluye que los lími es de de ección y cuan i icación calculados ma emá icamen e ob enidos de los esul ados del análisis de blancos con cápsula po el mé odo Dumas son da os iables, po que as la ealización de la comp obación con mues a eal se de ec a una media de 1,30 % de p o eína (cuando el lími e de de ección calculado es 1,29 %) y en el lími e de cuan i icación una media de 4,46 % (siendo el alo calculado de 4,31%). Finalmen e p oponemos que el ango de abajo sea po encima de 5% p/p p o eína, y po debajo de ese alo no podemos asegu a que el esul ado sea álido y cuan i icable con ce eza po el mé odo Dumas. 6.3.4 Cálculo de la ince idumb e 30 Con el mismo p og ama que hemos es ado abajando an e io men e (FT-UGC-425 e 1) se ob ienen los esul ados de las ince idumb es de los di e en es angos de abajo, ecogidas en las Tablas 21, 22 y 23 que se mues an a con inuación. - Rango bajo: Se ob iene un alo de ince idumb e ela i a de 20,67% y una ecupe ación de 88,02% . Tabla 21. Fo ma o de cálculo de ince idumb e de acue do con (FT-UGC-425 e 1), pes aña esumen. Fo ma o ac edi ado, p opio del labo a o io Ag oambien al. MATERIAL DE REFERENCIA (1) Rango bajo PRECISIÓN REPETIBILIDAD TANDA 1 TANDA 2 TANDA 3 MEDIA 6,736 6,571 6,472 DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,454 0,386 0,383 COEFICIENTE DE VARIACIÓN (%) 6,73 % 5,87 % 5,92 % REPRODUCIBILIDAD CONSIDERANDO MEDIAS CONJUNTO VALORES MEDIA 6,593 6,593 DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,133 0,410 COEFICIENTE DE VARIACIÓN (%) 2,02 % 6,22 % RECUPERACIONES RECUPERACION MEDIA 88,02 % RANGO 99,60 % 78,46 % INCERTIDUMBRE INCERTIDUMBRE DE ENSAYO (CON COEFICIENTE DE PROBABILIAD DEL 95%) 1,363 INCERTIDUMBRE RELATIVA (%) 20,67 % - Rango medio: Se ob iene un alo de ince idumb e ela i a de 6,36 % y una ecupe ación de 102,76% 31 Tabla 22. Fo ma o de cálculo de ince idumb e de acue do con (FT-UGC-425 e 1), pes aña esumen. Fo ma o ac edi ado, p opio del labo a o io Ag oambien al. MATERIAL DE REFERENCIA (2) Rango medio PRECISIÓN REPETIBILIDAD TANDA 1 TANDA 2 TANDA 3 MEDIA 13,172 13,601 13,334 DESVIACION ESTANDAR 0,185 0,192 0,171 COEFICIENTE DE VARIACION (%) 1,40 % 1,41 % 1,28 % REPRODUCIBILIDAD CONSIDERANDO MEDIAS CONJUNTO VALORES MEDIA 13,369 13,369 DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,217 0,252 COEFICIENTE DE VARIACIÓN (%) 1,62 % 1,89 % RECUPERACIONES RECUPERACION MEDIA 102,76 % RANGO 106,15 % 98,31 % INCERTIDUMBRE INCERTIDUMBRE DE ENSAYO (CON COEFICIENTE DE PROBABILIDAD DEL 95%) 0,8501 INCERTIDUMBRE RELATIVA (%) 6,36 % - Rango al o: Se ob iene un alo de ince idumb e ela i a de 6,77% y una ecupe ación de 104,00% Tabla 23. Fo ma o de cálculo de ince idumb e de acue do con (FT-UGC-425 e 1), pes aña esumen. Fo ma o ac edi ado, p opio del labo a o io Ag oambien al. MATERIAL DE REFERENCIA (3) Rango Al o PRECISIÓN REPETIBILIDAD TANDA 1 TANDA 2 TANDA 3 MEDIA 29,932 29,836 30,240 32 DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,261 0,613 0,361 COEFICIENTE DE VARIACIÓN (%) 0,87 % 2,05 % 1,19 % REPRODUCIBILIDAD CONSIDERANDO MEDIAS CONJUNTO VALORES MEDIA 30,003 30,003 DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,211 0,457 COEFICIENTE DE VARIACIÓN (%) 0,70 % 1,52 % RECUPERACIONES RECUPERACION MEDIA 104,00 % RANGO 107,80 % 101,59 % INCERTIDUMBRE INCERTIDUMBRE DE ENSAYO (CON COEFICIENTE DE PROBABILIDAD DEL 95%) 2,031 INCERTIDUMBRE RELATIVA (%) 6,77 % Con la ob ención se de las es ince idumb es ela i as co espondien es a los di e en es angos que hemos abajado, se calcula su media, y es e alo es la ince idumb e media ela i a de nues o mé odo de p o eína Dumas. % de INCERTIDUMBRE MEDIA RELATIVA 11,27% Se obse a cla amen e una disco dancia en los esul ados de % de ince idumb e ela i a de ango bajo espec o a los del ango medio y al o, pues es e alo es 3 eces mayo . Con es os esul ados la mejo opción es hace una alidación po angos, abajando con una ince idumb e exclusi a pa a ango bajo (po ejemplo alo es de % p/p p o eína meno es del 10%, aplica án un % de ince idumb e del 20,67%), y o a ince idumb e pa a el es o de angos (po ejemplo alo es de % p/p p o eína mayo es del 10%, aplica án un % de ince idumb e del 6,77%). Po comodidad y po que el obje i o del abajo es compa a los dos di e en es mé odos de alidación, se abaja con la ince idumb e media de 11,27%. El p incipal p oblema que puede causa usa una única ince idumb e es que los con oles dia ios de abajo que se encuen en con alo es meno es del 10% no cumplan con el alo obje i o, y se enga que epe i la anda de abajo. 33 6.4 Valo ación de las ince idumb es de los dos mé odos de alidación ( e ospec i a y p ospec i a). Es el momen o de llega al obje i o p incipal de es e abajo, que además de la ealización del mé odo de análisis de p o eína po Dumas pa a p oduc os cá nicos, consis e en su alidación. El obje i o es compa a las dos o mas de alidación pa a conclui cual es más p ecisa, y más iable de u iliza , y es o se puede compa a con dos esul ados que se ob ienen en ambas alidaciones: % ince idumb e ela i a y % de ecupe ación. Resul ados inales: - Validación e ospec i a: ince idumb e ela i a media 11,98 % y % de ecupe ación medio: 97,35% - Validación p ospec i a: ince idumb e ela i a media 11,27% y % de ecupe ación media: 98,26%. Se puede conclui que las ince idumb es ela i as son simila es an solo exis e una di e encia de 0,71%, y en el po cen aje de ecupe ación los esul ados igualmen e son muy simila es con una di e encia de 0,91%. Ambos mé odos de alidación han demos ado su u ilidad sin apo a g andes di e encias en los esul ados inales. Las mayo es di e encias que se ap ecian en e los dos mé odos de alidación son el iempo que cues a ealiza las alidaciones: pa a el caso de alidación e ospec i a, el iempo es co o, pe o es necesa io dispone de mucha in o mación documen al, ambién es necesa io que el labo a o io pa icipe en eje cicios in e compa ación pa a el análisis que se quie a alida ; además no malmen e es di ícil encon a muchos alo es ú iles pa a la alidación, po lo que en algunos casos las alidaciones no suelen se ep esen a i as. Pa a las alidaciones p ospec i as, es necesa io con a con ma e iales de e e encia ce i icados con la can idad su icien e pa a ealiza las andas de abajo. Asimismo, dispone de un buen plan de alidación, aco a ía los iempos de abajo, aunque el iempo depende de los mé odos que alida no es lo mismo alida un análisis di ec o (Ej. pH) que un mé odo que necesi e diges iones…(Ej. análisis de espec o o ome ía), lo que puede a ia de unos pocos días a a ias semanas. Pe o, independien emen e del iempo, es e ipo de alidación pe mi e la ob ención de muchos esul ados di e en es, que apo an muchos da os a la alidación. 34 7- CONCLUSIONES Como p incipales conclusiones del abajo se des aca: • T as la cons a ación de que no exis en di e encias signi ica i as en e los dos mé odos de análisis de p o eína (Dumas y Kjeldahl), se edac a, e isa y alida el mé odo cuan i a i o de análisis de p o eínas po combus ión y conduc i idad é mica (Dumas) pa a p oduc os cá nicos. Es e mé odo se inco po a á así al lis ado de mé odos in e nos del Labo a o io Ag oambien al. • T abaja con un labo a o io que iene implan ado un sis ema de calidad obus o ha acili ado an o la ob ención de esul ados de p o eína, p oceden es de su pa icipación en eje cicios in e labo a o io, como la ealización con esos esul ados de la alidación e ospec i a a a és de sus p opios o ma os in e nos ac edi ados. Finalmen e se ha ob enido una ince idumb e álida con los da os de análisis de p o eína ecopilados de 22 eje cicios in e compa ación. Es e p ocedimien o de alidación no supone un cos e adicional, pues o que el abajo es aba ya ealizado como pa e del con ol de calidad. • La alidación p ospec i a pe mi e ob ene la ince idumb e po angos de abajo, y es ima el lími e de de ección y el lími e de cuan i icación. Sin emba go, es e ipo de alidación, al necesi a ob ene los da os median e un abajo expe imen al en el labo a o io, equie e un iempo de abajo ex a, e implica además un consumo de eac i os y ma e iales de e e encia, lo que supone un cos e adicional. • Se ha comp obado que pa a alida el mé odo de análisis de p o eína po Dumas, los dos sis emas u ilizados ( e ospec i o y p ospec i o), o ecen esul ados simila es, y se pueden u iliza indis in amen e según los obje i os plan eados. • Finalmen e, queda documen ado y alidado el p ocedimien o pa a la de e minación de p o eína po el mé odo Dumas, con unos pa áme os de ca ac e ización que son acep ables pa a el uso p e is o de los esul ados. 35 8- CONCLUSIONS The main conclusions o he wo k a e as ollows: • Following he inding ha he e a e no signi ican di e ences be ween he wo p o ein analysis me hods (Dumas and Kjeldahl), he quan i a i e me hod o p o ein analysis by combus ion and he mal conduc i i y (Dumas) o mea p oduc s is d a ed, e ised and alida ed. This me hod will hus be inco po a ed in o he lis o in e nal me hods o he “Labo a o io Ag oambien al”. • Wo king wi h a labo a o y ha has a obus quali y sys em in place has acili a ed bo h he ob aining o p o ein esul s om i s pa icipa ion in in e labo a o y exe cises and he use o hese esul s o e ospec i e alida ion h ough i s own in e nal acc edi ed o ma s. Finally, a alid unce ain y has been ob ained wi h he p o ein analysis da a collec ed om 22 in e compa ison exe cises. This alida ion p ocedu e does no in ol e any addi ional cos , since he wo k was al eady done as pa o quali y con ol. • P ospec i e alida ion makes i possible o ob ain he unce ain y by wo king anges, and o es ima e he limi o de ec ion and he limi o quan i ica ion. Howe e , his ype o alida ion, since i equi es ob aining he da a h ough expe imen al wo k in he labo a o y, equi es ex a wo k ime, and also in ol es he consump ion o eagen s and e e ence ma e ials, which en ails an addi ional cos . • I has been p o en ha o alida e he p o ein analysis me hod by Dumas, he wo sys ems used ( e ospec i e and p ospec i e), o e simila esul s, and can be used indis inc ly acco ding o he objec i es se . • Finally, he p ocedu e o p o ein de e mina ion by he Dumas me hod is documen ed and alida ed, wi h cha ac e iza ion pa ame e s ha a e accep able o he in ended use o he esul s. 42 -0,01 -0,23 0,40 -0,35 -0,09 -0,42 0,25 -0,03 0,84 -0,37 0,38 -0,17 0,67 -0,40 0,19 -0,24 0,09 -0,27 0,65 -0,86 0,25 -0,22 0,03 -0,02 0,17 -0,14 1,89 -0,39 0,15 -0,20 0,33 -0,30 0,07 -0,04 0,52 -0,41 1,81 -0,43 0,97 -0,31 0,64 -0,43 0,92 -0,78 0,75 -0,34 0,02 -0,07 0,01 -0,07 0,61 -0,23 1,04 -0,24 0,23 -0,60 0,66 -0,19 0,07 -0,27 0,63 -1,15 0,25 -0,22 0,51 -0,05 43 1,63 -0,09 1,34 -0,39 0,52 -0,15 Tabla 27. Aplicación del es es adís ico -s uden y alo es de calculada y abulada pa a una p obabilidad del 95% y 38 g ados de libe ad Media 0,52 -0,31 Des iación es ánda 0,501 0,244 nº da os 39 39 calculada 0,165 0,202 abulada 2,024 2,024 En ambos casos las calculadas mues as alo es in e io es a las abuladas, po lo que no hay di e encias signi ica i as en e los mé odos de análisis de p o eína. Dumas e sus Kjeldahl Dumas e sus Kjeldahl di e encias EN LABORATORIO di e encias CON VALORES CONSENSO 44 Anexo II: Tabla de la dis ibución -s uden , donde al a co esponde a la p obabilidad y co esponde a los g ados de libe ad. 45 Anexo III Mé odo de análisis de p o eína po mé odo Dumas en p oduc os cá nicos. LABORATORIO AGROAMBIENTAL MÉTODOS DE ENSAYO NITRÓGENO Y PROTEÍNA BRUTA POR EL MÉTODO DUMAS EN DERIVADOS CÁRNICOS. Documen o: MT-XXX-XX Re isión: 0 Fecha ap obación: Pagina 1 de 11 Elabo ado po : And ea Pé ez Li e y An onio López Aliaga Fi ma: Re isado po : Jesús Be án Aso Fi ma: Ap obado po : Nicolás Abancens Teje o Fi ma: Dis ibuido po el je e de la Unidad de Ga an ía de Calidad. CAMBIOS INTRODUCIDOS RESPECTO A LA REVISIÓN ANTERIOR: Respec o a las pe sonas cuali icadas pa a la e isión an e io , ESTA REVISIÓN: ¿REQUIERE RECUALIFICACIÓN?: x NO (Cambios meno es que se les comunican) □ SI (Sólo pa a el caso de mé odos) ¿SE REQUIERE REVISIÓN DE LA VALIDACIÓN?: x NO □ SI Fecha: ________ ¿CAMBIA EL PLAN DE CONTROL DE CALIDAD?: x NO □ SI Fecha: ________ 46 0.ÍNDICE 1. OBJETO. 3 2. ALCANCE. 3 2.1.-) Campo de aplicación. 3 2.2.-) Obje o some ido a ensayo. 3 2.3.-) Pa áme os y magni udes a de e mina . 3 3. SEGURIDAD E HIGIENE. 3 4. DEFINICIONES. 3 5. DESCRIPCIÓN. 4 6. REALIZACIÓN. 6.1.-) Equipos. 4 6.2.-) Ma e iales y eac i os. 4 6.3.-) Condiciones de ealización. 5 6.4.-) P ocedimien os elacionados. 5 6.5.-) Documen os eque idos. 5 6.6.-) Regis os gene ados. 5 6.7.-) Aplicaciones in o má icas 5 6.8.-) P ocedimien o o ealización 6 7. CONTROL DE CALIDAD. 9 7.1.-) Con ol de la azabilidad. 9 7.2.-) Repe ibilidad. 9 7.3.-) Análisis de endencias. 10 7.4.-) Ensayos de ap i ud. 10 8. RESPONSABILIDADES. 10 9. REFERENCIAS. 11 9.1.-) Documen os in e nos. 11 9.2.-) Documen os ex e nos. 11 10. ANEXOS. 11 47 1. OBJETO. Desc ibe el p ocedimien o pa a la de e minación de ni ógeno y su con e sión en p o eína po combus ión y de ec o de conduc i idad é mica. Mé odo de ensayo AOAC 990.03 2. ALCANCE. 2.1.-) Campo de aplicación. De e minación de ni ógeno (p o eína b u a) en odo ipo de p oduc os y de i ados cá nicos con un limi e in e io de abajo de 0.8 % de ni ógeno (5% en p o eína). 2.2.-) Obje o some ido a ensayo. De i ados y p oduc os cá nicos. 2.3.-) Pa áme os y magni udes a de e mina . El pa áme o a de e mina es el ni ógeno que al mul iplica lo po un ac o (se usa el ac o 6,25) nos da el con enido en p o eína. El esul ado se exp esa en % p/p, no malmen e sob e ma e ia na u al. 3. SEGURIDAD E HIGIENE. I p o is o de guan es 4. DEFINICIONES. - De i ados cá nicos: Son los p oduc os alimen icios p epa ados o al o pa cialmen e con ca nes o menudencias de los animales ci adas en el pun o 1.1 del anexo I del Reglamen o 853/2004 del Pa lamen o Eu opeo y del Consejo de 29 de ab il de 2004 po el que se es ablecen no mas especi icas de higiene de los alimen os de o igen animal y some idos a ope aciones especi icas an es de su pues a al consumo. Se án p epa ados o p oduc os cá nicos según lo es ablecido en la no ma i a comuni a ia de aplicación. 48 - Mé odo Dumas: Mé odo de de e minación del ni ógeno po combus ión de la mues a. Es una al e na i a muy iable, segu a y limpia al mé odo Kjeldahl (mé odo o icial po RD 2257/1994 no6). - P o eína: Mac omolécula o gánica cons i uida po aminoácidos, cuya composición elemen al incluye Ca bono, Hid ógeno, Oxigeno y Ni ógeno, y en muchos casos ambién Azu e. Son componen e undamen al de los se es i os, y son esenciales en la alimen ación de los animales. Po e mino medio con ienen un 16 % de ni ógeno, po lo que 6,25 g de p o eína con ienen 1 g de ni ógeno. De es e modo, el ac o 6,25 se u iliza con ecuencia pa a ob ene la p o eína a pa i del con enido de ni ógeno. - P o eína B u a: To al de p o eína con enida en odos los componen es de la mues a, ob enida a a és del ni ógeno o al en la mues a. 5. DESCRIPCIÓN. La mues a se combus iona a 850oC, en el p oceso de combus ión se gene a CO2,H2O,N2, NOx. P ime o los gases se hacen pasa po cob e calien e pa a qui a el oxígeno y educi los óxidos de ni ógeno a ni ógeno molecula . A con inuación los gases se pasan po un p ime il o (Lecoso b) donde se queda e enido el dióxido de ca bono, seguidamen e se hacen pasa po un segundo il o (Anhid ona) donde se e iene el agua apo . Finalmen e el ni ógeno molecula con helio po ado es medido en una celda de e mo conduc i idad di e encial. El esul ado inal se mues a como po cen aje en peso de ni ógeno con el ac o que le in oduces al p og ama e calcula el % de p o eína. 6. REALIZACIÓN. 6.1.-) Equipos. • - Analizado de ni ógeno LECO FP-528 • - Balanza con esolución de 1mg. 6.2.-) Ma e iales y eac i os. • - Res os de mues a de eje cicios de in e compa ación (pa a usa como e e encia). • - Capsulas de la ón o es año: D.20mm • - EDTA- 9,56 % de ni ógeno ±0.06 • - Gases: Gas po ado – He o A (40psi) Gas de combus ión – O2 (40psi) y Gas neumá ico – ai e comp imido lib e de agua y acei e (40psi). 49 - Reagen ube epacking: Glass wool Anhyd ona Lecoso b - Fu nace il e ube: Qua z wool s ips S eel wool - Reduc ion hea e ube epacking: Coppe s icks Coppe u nings N-Ca alys - Combus ion ube: Honeycomb ce amic Qua z wool s ips Fu nace eagen magnesium oxide beads Fu nace eagen Alumina oxide pelle s 6.3.-) Condiciones de ealización. No se equie en condiciones ambien ales especiales. 6.4.-) P ocedimien os elacionados. • - Ins ucción Técnica de calib ación y e i icación de balanzas (IT-GEN-301) • - Ins ucción Técnica de p epa ación de mues as (IT-ALI-101). 6.5-) Documen os eque idos. • - Hoja de abajo (FT-ALI-010). • - Lib o de equipo de la balanza. • - Lib o de equipo del Analizado de ni ógeno LECO FP-528 (AN-ALI-01). • - E aluación de los con oles de calidad (FT-ALI-303). 6.6-) Regis os gene ados. • - Hoja de abajo (FT-ALI-010). • - Bole ín de análisis (FT-UGC-023). 50 - E aluación de los con oles de calidad (FT-ALI-303) 6.7-) Aplicaciones in o má icas. • - So wa e del Analizado de ni ógeno LECO FP-528 • - P og ama in o má ico pa a e aluación de los con oles de calidad (PRG-ALI-008) 6.8.-) P ocedimien o o ealización. a) Con oles p e ios. Encende el equipo, posee un in e up o en la pa e on al con dos posiciones On y O , y el o denado . Deja que el sis ema se calien e y es abilice du an e una o dos ho as. Encende el so wa e. An es de comenza con el análisis de las mues as se debe comp oba una se ie de pun os: Tempe a u a del ho no de combus ión: debe se ap oximadamen e 850 oC. Tempe a u a del ubo de educción: debe se ap oximadamen e 750 oC. Si es o no es así deja que el equipo se es abilice y alcance dicha empe a u a. Menú Con igu a ion – Sys em : • - Combus ion u nace empe a u e: pone 850 oC • - Reduc ion Hea e : pone 750 oC Bo ón Acep a . Pa a comp oba la empe a u a: Menu Diagnos ics – Ambien s, allíˆ emos las empe a u as. 2. Posibles ugas de los gases en el sis ema, an o de oxígeno como de helio, pa a ello hay que ealiza un es de ugas pa a cada uno de los gases. Tes de ugas (Leak Check): A) ab i las lla es de los gases, comp oba en el manóme o que la p esión sea 2,5 ba es (es a ma cado con una aya neg a) y el paso de los mismos (F8 ON) B) Menu Diagnos ics – Leak Check – pes aña Leak Check C) Oxygen: bo ón Oxigen Leak Check Helio: bo ón Helium Leak Check b) P epa ación de la mues a. 51 La mues a pa a la ealización del análisis, se p epa a según ins ucción écnica IT-ALI-101. c) P ocedimien o. 1- Blancos Realiza una se ie de blancos (sin cápsula, solamen e pasando los gases), has a e que el con enido de ni ógeno es in e io al 0.04% ni ógeno. Realiza dos blancos más con capsulas sin mues a. Pa a el análisis de blancos en el equipo: Menú Sample – Login. Rellena odos los campos (Nomb e mues a, peso, mé odo habi ual y ac o de p o eína). Seleccionamos los esul ados de los blancos con la cápsula y amos a: Menú con igu a ion-blank y acep a , el equipo end ሠen cuen a el alo de es os blancos a la ho a de calcula el ni ógeno de las mues as Una ez el equipo es á a pun o, se han comp obado las empe a u as, se ha hecho el chequeo de los gases y se han ealizado los blancos, amos a calib a el equipo. 2- Calib ación Ob ención de la ec a de calib ado Pa a ob ene la ec a de calib ado pesamos al ededo de 0.050g, 0.100g, 0.150g, 0.200g, 0.250 g, de EDTA, en sus espec i as cápsulas de la ón se cie an y se in oducen en el ca usel pa a su análisis (pa a comenza el análisis p esiona el bo ón Analyze F5). Tipo de cu a----De p ime o den (sin ija en el o igen) Peso----1/ce i icado. La calib ación se conside a co ec a cuando en odos los pun os que o man pa e de la ec a, el % de ni ógeno del EDTA, es é comp endido en el in e alo 9.56 ± 0.06%. Si alguno de los pun os no cumple es e equisi o se pod ሠelimina siemp e y cuando queden al menos 4 pun os, o en o o caso se debe ሠepe i la calib ación, (pendien e ec a en e 0.900 y 1.100).