Repositorio Institucional de Documentos

2021 98 Javier Lázaro Sierra MicroRNA exosomales circulantes en obesidad mórbida con y sin apnea obstructiva del sueño. Efecto del tratamiento con presión positiva y cirugía bariátrica Director/es Marín Trigo, José María Sanz Rubio, David © Universidad de Zaragoza Servicio de Publicaciones ISSN 2254-7606 Javier Lázaro Sierra MICRORNA EXOSOMALES CIRCULANTES EN OBESIDAD MÓRBIDA CON Y SIN APNEA OBSTRUCTIVA DEL SUEÑO. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON PRESIÓN POSITIVA Y CIRUGÍA BARIÁTRICA Director/es Marín Trigo, José María Sanz Rubio, David Tesis Doctoral Autor 2020 Repositorio de la Universidad de Zaragoza – Zaguan http://zaguan.unizar.es UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Escuela de Doctorado Programa de Doctorado en Medicina microRNA EXOSOMALES CIRCULANTES EN OBESIDAD MÓRBIDA CON Y SIN APNEA OBSTRUCTIVA DEL SUEÑO. EFECTO DEL TRATAMIENTO CON PRESIÓN POSITIVA Y CIRUGÍA BARIÁTRICA Doctorando Javier Lázaro Sierra Director Dr. José María Marín Dr. David Sanz Rubio J ULIO DE 2020 DEPARTAMENTO DE MEDICINA FACULTAD DE MEDICINA UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA Este proyecto de investigación ha sido becado por FIS (15/01940), Sociedad Española de Patología del Aparato Respiratorio (SEPAR-2017) y Sociedad Aragonesa del Aparato Respiratorio (SADAR 2016). El Dr. D. José María Marín Trigo, Profesor Titular del Departamento de Medicina de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zaragoza y el Dr. D. David Sanz Rubio del Instituto de Investigación Sanitaria de Aragón. CERTIFICAN QUE: D. Javier Lázaro Sierra ha realizado, bajo nuestra dirección, los trabajos correspondientes a su tesis doctoral titulada microRNA exosomal circulantes en Obesidad Mórbida con/sin Apnea Obstructiva del Sueño. Efecto del tratamiento con Presión Positiva y Cirugía Bariátrica que corresponde con el proyecto de tesis aprobado por la Comisión de Doctorado en el curso 2015/16 y cumple los requisitos mínimos exigidos para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Zaragoza, por lo que autorizan su presentación para que pueda ser juzgado por el Tribunal correspondiente. Lo que suscribimos como directores del trabajo en Zaragoza, a 28 de Julio de 2020. Fdo: Dr. José María Marín Trigo Fdo: Dr. David Sanz Rubio A mis padres, Antonio y M.ª Pilar. A Carmen, mi mujer y principal apoyo. A mis hijos, Carmen y Juan. J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 12 | P á g i n a 4. MÉTODOS 67 4.1. D ISEÑO DEL ESTUDIO 69 4.2. P OBLACIÓN EN ESTUDIO 69 4.3. T AMAÑO MUESTRAL 69 4.4. C RITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN 70 4.5. P ROCEDIMIENTOS 70 4.6. C RONOGRAMA 71 4.7. V ARIABLES DE ESTUDIO 72 4.7.1. H ISTORIA CLÍNICA 72 4.7.2. A NTROPOMETRÍA 73 4.7.3. P RUEBAS COMPLEMENTARIAS 73 4.8. D ETERMINACIÓN DEL MICRO -RNA EXOSOMAL 74 4.8.1. A ISLAMIENTO DE LOS EXOSOMAS PRESENTES EN EL PLASMA 75 4.8.2. E XTRACCIÓN DEL RNA TOTAL 75 4.8.3. D ETERMINACIÓN DEL MICRO -RNA MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN TIEMPO REAL ( RT PCR) 76 4.8.4. D ETERMINACIÓN DE LA CANTIDAD RELATIVA DE MICRO -RNA 76 4.8.5. S ELECCIÓN DE MICRO -RNA PARA EL ESTUDIO 76 4.9. A NÁLISIS ESTADÍSTICO 77 5. RESULTADOS 81 5.1. V ISITA BASAL 82 5.1.1. D ESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA 82 5.1.2. D IFERENCIAS EN LA EXPRESIÓN DE MICRO -RNA EXOSOMALES CIRCULANTES 86 5.1.3. R ELACIÓN DE LOS MICRO -RNA EXOSOMALES CON LOS PARÁMETROS DEL SUEÑO Y GASOMÉTRICOS 88 5.1.4. R ELACIÓN DE LOS MICRO -RNA EXOSOMALES CON LOS PARÁMETROS ANTROPOMÉTRICOS Y BIOQUÍMICOS 91 5.2. V ISITA A LOS 6 MESES PRECIRUGÍA : EFECTO DEL TRATAMIENTO CON PRESIÓN POSITIVA CONTINUA EN LA VÍA AÉREA 96 5.2.1. D ESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA EN LA SEGUNDA VISITA 96 5.2.2. E VOLUCIÓN EN LA EXPRESIÓN DE MICRO -RNA EXOSOMALES EN LA SEGUNDA VISITA 97 5.2.3. R ELACIÓN DE LOS MICRO -RNA EXOSOMALES CON LOS PARÁMETROS ANTROPOMÉTRICOS Y BIOQUÍMICOS 102 5.3. V ISITA A LOS 12 MESES POSTCIRUGÍA : EFECTO DE LA CIRUGÍA BARIÁTRICA 108 5.3.1. D ESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA EN LA TERCERA VISITA 108 5.3.2. E VOLUCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE MICRO -RNA EN LA ÚLTIMA VISITA 111 5.3.3. R ELACIÓN DE LOS MICRO -RNA EXOSOMALES CON LOS PARÁMETROS ANTROPOMÉTRICOS Y BIOQUÍMICOS 115 6. DISCUSIÓN 119 6.1. I NTERPRETACIÓN GENERAL 121 6.2. I NFLUENCIA DE LA PRESENCIA DE APNEA OBSTRUCTIVA DEL SUEÑO EN LA CARGA DE MICRO -RNA EXOSOMAL 122 ––––––––––––––––– Í NDICES P á g i n a | 13 6.3. I NFLUENCIA DE LA APNEA OBSTRUCTIVA DEL SUEÑO SOBRE LA RELACIÓN DE LOS PARÁMETROS ANTROPOMÉTRICOS Y BIOQUÍMICOS CON LA EXPRESIÓN DE MICRO -RNA EXOSOMAL CIRCULANTE 124 6.4. E FECTO DEL TRATAMIENTO CON PRESIÓN POSITIVA CONTINUA EN LA VÍA AÉREA SOBRE LA CARGA DE MICRO -RNA EXOSOMAL 127 6.5. E FECTO DE LA CIRUGÍA BARIÁTRICA SOBRE LA CARGA DE MICRO -RNA EXOSOMAL 131 6.6. L IMITACIONES DEL ESTUDIO 135 7. CONCLUSIONES 137 BIBLIOGRAFÍA 141 ANEXOS 165 A NEXO 1: A PROBACIÓN DEL C OMITÉ DE É TICA E I NVESTIGACIÓN C LÍNICA DE A RAGÓN 167 A NEXO 2: H OJA DE INFORMACIÓN SOBRE EL ESTUDIO EPIMOOSA 168 A NEXO 3: C ONSENTIMIENTO INFORMADO 171 A NEXO 4: T EST DE E PWORTH 173 A NEXO 5: P ROTOCOLO DE MEDICIÓN DE LA PRESIÓN ARTERIAL 174 A NEXO 6: D IFERENCIAS EN LA EXPRESIÓN DE MICRO -RNA EN PACIENTES CON OBESIDAD MÓRBIDA CON Y SIN APNEA OBSTRUCTIVA DEL SUEÑO 175 A NEXO 7: R ELACIÓN ENTRE LOS PARÁMETROS ANTROPOMÉTRICOS Y DEL SUEÑO 178 A NEXO 8: E VOLUCIÓN DE LAS VARIABLES TRAS LA CIRUGÍA BARIÁTRICA RESPECTO A LA VISITA DE LOS 6 MESES PRECIRUGÍA 179 A NEXO 9: D IFERENCIAS EN LA EXPRESIÓN DE MICRO -RNA EXOSOMALES EN PACIENTES HIPERTENSOS CON Y SIN DIABETES MELLITUS 180 A NEXO 10: E XPRESIÓN DE MICRO -RNA EXOSOMALES EN PACIENTES PROCEDENTES DE EPIMOOSA Y EPIOSA 181 A NEXO 11: P UBLICACIONES 182 P á g i n a | 15 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Sintomatología de la apnea obstructiva del sueño 29 Tabla 2. Criterios de clasificación de la obesidad en función del índice de masa corporal (IMC) según la Organización Mundial de la Salud (OMS) y según la Sociedad Española para el estudio de la Obesidad (SEEDO). 35 Tabla 3. Criterios de selección de pacientes con obesidad mórbida para cirugía bariátrica 41 Tabla 4. Revisión bibliográfica de trabajos publicados sobre pacientes con obesidad mórbida y micro-RNA. 55 Tabla 5. Selección de micro-RNA para el estudio 77 Tabla 6. Variables de la visita basal del total de la muestra (n = 70) y de los que completaron el estudio (n = 24) 84 Tabla 7. Descripción de las muestras de EPIOSA y EPIMOOSA 85 Tabla 8. Descripción de la muestra en la segunda visita 96 Tabla 9. Impacto tras 6 meses de tratamiento con presión positiva continua en la vía aérea sobre los parámetros antropométricos y bioquímicos. 97 Tabla 10. Descripción de la muestra en la última visita 109 Tabla 11. Impacto de la cirugía bariátrica en la última visita respecto a la primera visita 110 Tabla 12. Protocolo de medición de la presión arterial 174 Tabla 13. Impacto de la cirugía bariátrica en la última visita respecto a la visita de los 6 meses precirugía 179 P á g i n a | 17 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Incidencia de eventos cardiovasculares mortales y no mortales en pacientes con y sin apnea obstructiva del sueño e impacto del tratamiento con presión positiva continua en la vía aérea 26 Figura 2. Fisiopatología cardiovascular de la apnea obstructiva del sueño 28 Figura 3. Ejemplo de estudio polisomnográfico completo 31 Figura 4. Captura de pantalla de un estudio con dispositivo de poligrafía respiratoria domiciliaria de Apnea Link® 32 Figura 5. Diagnóstico del síndrome de apnea-hipopnea del sueño (SAHS) según la Sociedad Española de Patología del Aparato Respiratorio (SEPAR) 33 Figura 6. Tratamiento con presión positiva continua en la vía aérea (CPAP) 34 Figura 7. Evolución de la obesidad y el sobrepeso entre 1987 y 2017. Obtenido de ENSE 2017 (57) 36 Figura 8. Esquema de la fisiopatología de la obesidad y sus comorbilidades 37 Figura 9. Tipos de técnicas quirúrgicas en cirugía bariátrica 41 Figura 10. Técnicas malabsortivas 42 Figura 11. Técnicas mixtas 43 Figura 12. Técnicas Restrictivas 43 Figura 13. Mecanismos básicos de comunicación intercelular 45 Figura 14. Esquema de la formación de vesículas extracelulares 47 Figura 15. Imagen obtenida por microscopía electrónica de dos exosomas 48 Figura 16. Biogénesis y contenido de los exosomas. 50 Figura 17. Biogénesis del micro-RNA. 52 Figura 18. Hipótesis de trabajo 62 Figura 19. Cronograma del estudio 71 Figura 20. Proceso de aislamiento de los exosomas 75 Figura 21. Extracción del RNA total de los exosomas purificados 76 Figura 22. Flujograma de pacientes a lo largo del estudio 82 Figura 23. Diferencia en la expresión de micro-RNA exosomal en pacientes con obesidad mórbida con y sin apnea obstructiva del sueño 86 Figura 24. Diferencia en la expresión de micro-RNA exosomal circulante en pacientes con obesidad mórbida con y sin apnea obstructiva del sueño en función de los factores de riesgo cardiovascular 87 Figura 25. Relación del miR16 y el miR145 exosomales con los parámetros del sueño en la primera visita 88 Figura 26. Relación de los miRNA exosomales con los parámetros gasométricos en la primera visita 89 Figura 27. Relación de los micro-RNA exosomales con los parámetros gasométricos en pacientes con obesidad mórbida y apnea obstructiva del sueño en la primera visita 90 Figura 28. Relación del miR146 con los parámetros antropométricos en la primera visita. 91 J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 18 | P á g i n a Figura 29. Relación del miR146 con los parámetros antropométricos en pacientes con obesidad mórbida (OM) sin y con apnea obstructiva del sueño (AOS) 92 Figura 30. Relación del perfil glucémico con los micro-RNA exosomales en pacientes con obesidad mórbida (OM) con apnea obstructiva del sueño (AOS) y sin AOS 93 Figura 31. Relación de los parámetros lipídicos en el conjunto de la muestra de pacientes con obesidad mórbida (OM) y en los pacientes con OM y apnea obstructiva del sueño (AOS) durante la primera visita 95 Figura 32. Variación de la expresión de miRNA exosomal entre primera y segunda 99 Figura 33. Variación de la expresión de micro-RNA exosomal entre la primera y la segunda visita en los pacientes con obesidad mórbida (OM) sin apnea obstructiva del sueño (AOS) y con AOS en tratamiento con presión positiva continua en la vía aérea (CPAP) 101 Figura 34. Efecto del tratamiento con presión positiva continua en la vía aérea en pacientes no obesos sin apnea obstructiva del sueño (AOS) y con AOS, y pacientes con obesidad mórbida (OM) sin AOS y con AOS. 102 Figura 35. Relación de la concentración de glucosa con la expresión de micro-RNA exosomales en pacientes con obesidad mórbida en la segunda visita 103 Figura 36. Relación entre la expresión de micro-RNA exosomales y los parámetros del perfil glucémico en pacientes con obesidad mórbida (OM) sin apnea obstructiva del sueño (AOS) y con AOS en la segunda visita 104 Figura 37. Relación de los parámetros del perfil lipídico con la expresión de micro-RNA exosomales en el conjunto de los pacientes con obesidad mórbida en la segunda visita 105 Figura 38. Relación de los parámetros del perfil lipídico con los micro-RNA exosomales en pacientes con obesidad mórbida (OM) sin apnea obstructiva del sueño (AOS) y con AOS en la segunda visita 107 Figura 39. Evolución de la expresión de micro-RNA en las distintas visitas en los pacientes con obesidad mórbida sin apnea obstructiva del sueño (AOS) y con AOS. Efecto del tratamiento con presión positiva continua en la vía aérea y cirugía bariátrica 112 Figura 40. Relación entre la pérdida de peso relativo tras la cirugía bariátrica y los cambios en la expresión de micro-RNA 113 Figura 41. Relación de la variación relativa de los parámetros del sueño tras la cirugía bariátrica y los cambios en la expresión de micro-RNA en pacientes con obesidad mórbida (OM) sin apnea obstructiva del sueño (AOS) y con AOS 114 Figura 42. Relación de la expresión del miR223 exosomal con los parámetros del sueño en la última visita 115 Figura 43. Relación de la expresión de micro-RNA exosomales con los parámetros antropométricos en la última visita 116 Figura 44. Relación de los parámetros del perfil glucémico con micro-RNA exosomales en la última visita 117 Figura 45. Relación de los parámetros del perfil lipídico con la expresión de micro-RNA exosomales en la última visita 118 Figura 46. Diferencias en la expresión de micro-RNA en pacientes con obesidad mórbida con apnea obstructiva del sueño (AOS) y sin AOS (I) 175 ––––––––––––––––– Í NDICES P á g i n a | 19 Figura 47. Diferencias en la expresión de micro-RNA en pacientes con obesidad mórbida con apnea obstructiva del sueño (AOS) y sin AOS (II) 176 Figura 48. Diferencias en la expresión de micro-RNA en pacientes con obesidad mórbida con apnea obstructiva del sueño (AOS) y sin AOS (III) 177 Figura 49. Relación entre los parámetros antropométricos y el índice de apneas e hipopneas (IAH) 178 Figura 50. Diferencias en la expresión de micro-RNA exosomal en pacientes con obesidad mórbida y sin ella 181 P á g i n a | 21 ÍNDICE DE ABREVIATURAS AASM American Academy of Sleep Medicine AOS a pnea o bstructiva del s ueño Apo A Apolipoproteína A CB c irugía b ariátrica CIL c uerpos i ntraluminales CMV c uerpo m ultivesicular CPAP pres ión positiva continua en la vía aérea (c ontinous p ositive a irway p ressure ) CT 90 porcentaje de tiempo con saturación de oxígeno por debajo del 90 % DLP D islipemia DM d iabetes m ellitus DNA á cido d esoxi rr ibonucleico (deoxyribonucleic acid) EDTA ácido edé tico (ethylenediaminetetraacetic acid) ENS E Encuesta Nacional de Salud en España EPIMOOSA [estudio] Epigenetics Morbid Obesity Obstructive Sleep Apnea EPIOSA [estudio] ] Epigenetics Obstructive Sleep Apnoea ESCRT endosomal sorting complex required for transport ESD e xcesiva s omnolencia d iurna ET e ndosoma t emprano FC tasa de cambio (fold change) HCI h ipoxia c rónica i ntermitente HDL lipoproteína de alta densidad (h igh d ensity l ipoprotein ) HIF - 1 α factor inducible por hipoxia tipo 1 α (h ypoxia i nducibl e f actor type 1 α ) HTA h ipertensión a rterial IAH í ndice de a pnea s e h ipopnea s IAR í ndice de a lteración r espiratoria IFSO International Federation for de Surgery of Obesity and Metabolic Disorders IL I nterleu c ina IMC í ndice de m asa c orporal LDL lipo proteína de baja densidad (l ow d ensity l ipoprotein ) miRISC microRNA i nduc ed s ilencing c omplex miRNA micro - RNA MP m embrana p lasmática NF - κ B f actor n uclear κ B OM o besidad m órbida P a CO 2 presión parcial arterial de dióxido de carbono PCR p roteína C - r eac tiva PSG p olisomnografía REM r apid e ye m ovement RISC RNA induced silencing complex RNA á cido r ibonucleico (ribonucleic acid) rtPCR reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (real time polymerase chain reaction) SAHS sí ndrome de a pnea - h ipopn ea del s ueño J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 28 | P á g i n a Figura 2. Fisiopatología cardiovascular de la apnea obstructiva del sueño SAHS Síndrome de apnea hipopnea del sueño. CV cardiovascular. Adaptado de Teran Santos et al. (16). La HCI y la fragmentación y la pérdida de sueño disparan la producción de mediadores inflamatorios (17, 18). Se ha postulado que la liberación de esos mediadores es la responsable de los efectos cardiovasculares y metabólicos deletéreos a medio y largo plazo. Estos mediadores desencadenan una respuesta inmunitaria celular con activación de monocitos, neutrófilos y plaquetas (19, 20). Del mismo modo, se produce una diferenciación de linfocitos T hacia un fenotipo proinflamatorio con un aumento de la ratio entre linfocitos T colaboradores de tipo 1 (T h 1) y 2 (T h 2) (21). El exceso de actividad de T h 1 promueve la actividad de los monocitos y las moléculas de adhesión endotelial, lo que da lugar a la disfunción endotelial. Es el primer paso en el desarrollo de aterosclerosis y podría, en pacientes con AOS grave, desencadenar un fenómeno de aterosclerosis subclínica sin necesidad de otros cofactores de riesgo cardiovascular. La evidencia disponible apunta a la AOS como factor de riesgo independiente para aterosclerosis. Recientes estudios lo señalan como mediador en el daño endotelial y la elevada producción de mediadores inflamatorios en pacientes obesos, además de indicar que estas alteraciones se revierten con un correcto tratamiento de la AOS (22-24). Por otro lado, en modelos animales de HCI, se ha demostrado que los episodios repetidos de desoxigenación y reoxigenación aumentan la actividad simpática, la liberación de catecolaminas, la presión arterial, la disfunción hepática, el déficit en los procesos de aprendizaje y el daño en las neuronas corticales y del hipocampo (25). La HCI activa la transcripción del factor nuclear κB (NF-κB) desde el citoplasma hasta el núcleo celular, donde es capaz de activar genes proinflamatorios (19) y aumentar la actividad del factor inducible por hipoxia tipo 1α (HIF- ––––––––––––––––– 1. I NTRODUCCIÓN P á g i n a | 29 1α) (26). La activación del HIF-1α desencadena la liberación de multitud de hormonas (como la eritropoyetina), incrementa la liberación de catecolaminas y aumenta la presión arterial y la concentración de triglicéridos (26). La HCI también desencadena la liberación de radicales libres de oxígeno (27), como ocurre en los episodios de reperfusión de los eventos isquémicos (28). Una señal clara de estimulación del NF-κB es la elevación en plasma de las citocinas proinflamatorias, como la interleucina 6 (IL-6) y el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), y moléculas de adhesión, como la molécula de adhesión intracelular tipo 1 (ICAM1) (29, 30). La fragmentación del sueño parece jugar un papel adicional que explica parcialmente la inflamación sistémica en el AOS. Diversos estudios han demostrado su relación con un incremento de la actividad simpática, la presión arterial, la liberación de cortisol y lípidos, la ganancia de peso y la resistencia a la insulina (31-34), así como el aumento de citocinas inflamatorias, como la IL-6, el TNF-α (18) y la proteína C-reactiva (PCR) (17). En resumen, el incremento de la actividad simpática y de la respuesta inflamatoria son consecuencias tanto de la HCI como de la fragmentación del sueño, mientras que el estrés oxidativo es consecuencia en exclusiva de la HCI. 1.1.5. Manifestaciones clínicas de la apnea obstructiva del sueño Como en otras ramas de la medicina, el proceso diagnóstico nace de una sospecha clínica. En el caso de la AOS, la sospecha clínica suele aparecer por la presencia de tres síntomas que forman ya una tríada clásica: roncopatía, pausas de apnea nocturna e hipersomnia diurna (2). Estos síntomas aparecen en la mayoría de los pacientes, pero no son los únicos, ya que se pueden presentar otros síntomas, tanto diurnos como nocturnos (Tabla 1). Tabla 1. Sintomatología de la apnea obstructiva del sueño SÍNTOMAS NOCTURNOS SÍNTOMAS DIURNOS Ronquidos Excesiva somnolencia diurna Apneas observadas Sensación de sueño no reparador Episodios asfícticos Cansancio crónico Movimientos anormales Cefalea matutina Diaforesis Irritabilidad Despertares frecuentes Apatía Nicturia Depresión Pesadillas Dificultades de concentración Sueño agitado Pérdida de memoria Insomnio Disminución de la libido J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 30 | P á g i n a La ESD plantea un problema diagnóstico, ya que, como todo síntoma, resulta subjetiva y, por tanto, es difícil de cuantificar. La American Academy of Sleep Medicine (AASM) define esta hipersomnolencia diurna como «una necesidad imperiosa de dormir o por la presencia de periodos de sueño durante el día» (35). Se han validado distintos cuestionarios (36, 37), aunque el más utilizado es la escala de somnolencia de Epworth (38). En la última guía de la AASM (39), se revisan los estudios sobre los distintos cuestionarios existentes hasta la fecha y se establece la recomendación sobre su uso. De las recomendaciones de esa guía se extrae que el uso de cualquier cuestionario debe ir acompañado siempre de una prueba que objetive las apneas; y que, pese a existir algunas diferencias entre los distintos cuestionarios, no hay ninguno que identifique inequívocamente a pacientes con y sin AOS (39). 1.1.6. Diagnóstico de la apnea obstructiva del sueño Una vez establecida la sospecha clínica, se deben objetivar las apneas mediante un registro nocturno. Para ello se han desarrollado distintos tipos de polígrafos de mayor o menor complejidad en función de las variables que analizan. La AASM los clasifica en cuatro tipos atendiendo a los parámetros neurofisiológicos y cardiorrespiratorios, los movimientos musculares, la posición corporal, la necesidad de un técnico que supervise el desarrollo de la prueba durante la noche y la posibilidad de intervenir durante la noche (40). De esta forma, los tipos de estudios se clasifican de 1 a 4, con el grupo 1 como el de mayor complejidad. El método diagnóstico establecido como gold standard es la polisomnografía (PSG) (2, 39, 41). En ella se registran la actividad eléctrica cerebral y parámetros cardiorrespiratorios y se identifica los eventos respiratorios, así como su repercusión cardiorrespiratoria y neurofisiológica, lo que permite evaluar la calidad del sueño (Figura 3). La PSG puede realizarse en el domicilio (PSG no vigilada) o en el ámbito hospitalario (PSG vigilada). El registro debe ser nocturno o en el horario habitual de sueño del paciente, durante un mínimo de 6 horas que incluyan al menos 180 minutos de sueño. ––––––––––––––––– 1. I NTRODUCCIÓN P á g i n a | 31 Figura 3. Ejemplo de estudio polisomnográfico completo El registro de los parámetros cardiacos y respiratorios incluye la saturación de oxígeno (SatO 2 ) por pulsioximetría, el registro del esfuerzo respiratorio mediante bandas toracoabdominales y la medida del flujo nasobucal por neumotacógrafo o termistores. El termistor es un excelente detector de apneas, pero no es un buen sistema para la detección de hipopneas (36). Otro sistema de determinación semicuantitativo son las cánulas nasales conectadas a un transductor de presión y a un amplificador. La combinación de las cánulas nasales y el termistor son el mejor método para detectar las apneas. En 1997 se demostró que la supresión de las variables neurofisiológicas no cambiaba sensiblemente el diagnóstico (42), lo que abría las puertas a la simplificación del diagnóstico. Para el diagnóstico de la mayor parte de los pacientes con sospecha de AOS se utilizan estudios simplificados clasificados en el nivel 3 de la AASM, en particular la poligrafía respiratoria (PR) (Figura 4). Estos estudios pueden realizarse en medio hospitalario o a domicilio. El uso de estos estudios domiciliarios ha sido aceptado y recomendado para individuos con una probabilidad pretest elevada de padecer AOS (2, 39). El uso de sistemas supersimplificados (monitores del tipo 4 en la clasificación de la AASM) no ha sido validado para el diagnóstico; sin embargo, existen estudios que sugieren que dichos monitores podrían tener un papel en el screening (43, 44). En aquellos casos en los que se sospechen otros trastornos del sueño asociados, se deberá realizar una PSG. J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 32 | P á g i n a Figura 4. Captura de pantalla de un estudio con dispositivo de poligrafía respiratoria domiciliaria de Apnea Link® A. Línea de flujo: en rosa se señalan los episodios de apnea de tipo obstructivo. B. Línea de ronquido. C. Línea de esfuerzo torácico. D. Línea de frecuencia cardiaca. E. Línea de saturación de oxígeno: en azul se marcan las caídas superiores al 3%. Se considera que puede existir una AOS cuando el IAH es superior a 5. Este hallazgo debe ir acompañado de otra sintomatología, y en ese acaso hablamos de un síndrome de apneahipopnea del sueño (SAHS). El criterio del IAH puede ser sustituido por el IAR. Para ello, el dispositivo de análisis del sueño debe ser capaz de identificar los esfuerzos respiratorios asociados a microdespertares. Estos esfuerzos se identifican mediante PSG y la medición de la presión esofágica, y se definen como un incremento en esta última que finaliza con un microdespertar. Otro método, más rudimentario, accesible y cómodo para el paciente, consiste en identificar la atenuación transitoria de la señal del flujo oronasal o el esfuerzo toracoabdominal acompañado de un microdespertar (2). Según las recomendaciones de la SEPAR el diagnóstico requiere de la presencia de un IAH o IAR superior a 5 y una clínica acompañante (Figura 5). 1.1.7. Tratamiento de la apnea obstructiva del sueño El componente multifactorial que desencadena la obstrucción hace que el tratamiento etiológico sea, en muchas ocasiones, difícil de alcanzar (15). El objetivo del tratamiento es liberar la vía aérea de las obstrucciones repetidas que ocurren durante la noche, manteniendo una correcta ventilación pulmonar durante el sueño. ––––––––––––––––– 1. I NTRODUCCIÓN P á g i n a | 33 Figura 5. Diagnóstico del síndrome de apnea-hipopnea del sueño (SAHS) según la Sociedad Española de Patología del Aparato Respiratorio (SEPAR) IAR: índice de alteración respiratoria. Adaptado de Lloberes et al. (2). Hasta la década de los ochenta del siglo pasado el tratamiento se reducía a la pérdida de peso junto con la administración de oxígeno a dosis bajas o, incluso, al uso de progestágenos con el objetivo de desencadenar una hiperventilación (45). En los casos más graves se realizaba una traqueotomía, lo que mejoraba significativamente la sintomatología y los parámetros hemodinámicos y gasométricos (46, 47). En los casos en los que se observaba que el origen era un trastorno anatómico (como una hipertrofia amigdalar) también se corregía con cirugía. Los «padres» del tratamiento de la AOS con dispositivos de presión positiva continua en la vía aérea (CPAP, del inglés continous positive airway pressure) fueron Christian Guilleminault y Collin Sullivan. En el año 1981, Sullivan da un gran empujón en el tratamiento de la AOS al tratarla por primera vez con esa terapia (48). Para su aplicación se basó en la descripción fisiopatológica que Guilleminault realizó de la apnea (49). De este modo, planteo la hipótesis de que al aplicar presión positiva a través de la nariz se desplazaría el paladar blando y la base de la lengua de la pared posterior de la orofaringe, evitando así su colapso (48). En ese estudio, Sullivan et al. aplican presión positiva a 5 pacientes con AOS grave. Los resultados fueron excelentes y se consiguió una mejora inmediata y sostenida de la saturación de oxígeno durante toda la noche. También se observó una normalización de la actividad eléctrica J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 34 | P á g i n a cerebral, con un aumento considerable de las fases de sueño profundo no REM. El tratamiento con presión positiva corrige la apnea, pero no erradica la causa. A finales de esa década se publica el primer ensayo clínico que demuestra la superioridad de la CPAP frente a placebo (50). A día de hoy, la CPAP se considera el tratamiento de primera línea y es el más utilizado, ya que consigue resultados inmediatos en la prevención de las apneas y de todos sus efectos asociados (Figura 6). Sin embargo, la CPAP también tiene sus sombras, ya que presenta una alta tasa de incumplimiento, que se ha cifrado en torno al 2030 % (51). Figura 6. Tratamiento con presión positiva continua en la vía aérea (CPAP) VAS: vía aérea superior. El efecto de la CPAP sobre la mortalidad en pacientes con AOS es controvertido. Por un lado, los estudios observacionales, incluido el de nuestro grupo, indican que la CPAP reduce la incidencia de eventos cardiovasculares mortales y no mortales (5, 11, 12). Por otro lado, el estudio SAVE, un ensayo internacional, multicéntrico y aleatorizado de CPAP frente a placebo, realizado con pacientes con antecedentes de enfermedad cardiovascular previa, fue negativo (52). Este estudio, sin embargo, incluyó preferentemente pacientes chinos, con AOS leve, escasa sintomatología diurna, escaso seguimiento (media de 3 años) y escaso cumplimiento (2,7 horas de CPAP/noche). 1.2. O BESIDAD 1.2.1. Definición La obesidad es una patología crónica multifactorial que se produce por un exceso de grasa corporal y resulta de la interacción de causas ambientales con el genotipo individual. El método más aceptado para medir la obesidad es el índice de masa corporal (IMC), que resulta ––––––––––––––––– 1. I NTRODUCCIÓN P á g i n a | 35 del cociente del peso en kilogramos y el cuadrado de la altura en metros. Dicho índice ha demostrado una correlación aceptable con el porcentaje de grasa corporal (53), si bien presenta ciertas limitaciones, como es la sobreestimación en el caso de deportistas o la infravaloración en las personas con bajo porcentaje de masa muscular, como es el caso de los ancianos. La Organización Mundial de la Salud (OMS) (22, 54) ha establecido los conocidos puntos de corte para definir y graduar la obesidad (Tabla 2). Tabla 2. Criterios de clasificación de la obesidad en función del índice de masa corporal (IMC) según la Organización Mundial de la Salud (OMS) y según la Sociedad Española para el estudio de la Obesidad (SEEDO) Clasificación según OMS IMC (kg/m 2 ) Clasificación según SEEDO IMC (kg/m 2 ) - - Peso insuficiente <18,5 Normopeso 18,5-24,9 Normopeso 18,5-24,9 Sobrepeso 25-29,9 Sobrepeso grado I 25-26,9 Obesidad grado 1 30-34,9 Sobrepeso grado II 27-29,9 Obesidad grado 2 35-39,9 Obesidad tipo 1 30-34,9 Obesidad grado 3 ≥40 Obesidad tipo 2 35-39,9 - - Obesidad tipo 3 (mórbida) 40-44,9 - - Obesidad tipo 4 (extrema) >45 OMS: Organización Mundial de la Salud; SEEDO: Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad. 1.2.2. Epidemiología La obesidad está considerada a día de hoy como una epidemia mundial por las dimensiones adquiridas y su impacto sobre la morbimortalidad, la calidad de vida y el gasto sanitario (55, 56). Según los datos de la última Encuesta Nacional de Salud en España (ENSE), del año 2017 (57), más de la mitad (54,5 %) de los adultos tiene exceso de peso (sobrepeso y obesidad). Según información de la ENSE 2017, «la obesidad es más frecuente en hombres (18,2 %) que en mujeres (16,7 %) […] y su prevalencia en adultos se ha multiplicado por 2,4 pasando del 7,4 % en 1987 al 17,4 % en este ENSE». La diferencia por sexo en adultos es a expensas de los hombres menores de 65 años, ya que las mujeres superan a los hombres a partir de esa edad. El sobrepeso, al igual que la obesidad, es más frecuente en hombres, pero la diferencia es mucho mayor (44,3 % en los hombres frente a 30 % en las mujeres) y se mantiene en todos los grupos de edad (Figura 7). J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 36 | P á g i n a Figura 7. Evolución de la obesidad y el sobrepeso entre 1987 y 2017. Obtenido de ENSE 2017 (57). 1.2.3. Comorbilidades asociadas a la obesidad El sobrepeso y la obesidad se asocian con un aumento de la morbilidad y la mortalidad del individuo que la padece. Las complicaciones más importantes son la DM, la HTA, la DLP, la hiperuricemia y el síndrome metabólico o síndrome X (Figura 8) (58). El incremento del riesgo está determinado por un incremento del IMC y del perímetro del abdomen por encima de 102 cm en el caso de los hombres y de 88 cm en el caso de las mujeres. Así pues, la pérdida de peso corporal es una indicación para todas aquellas personas con IMC > 30 kg/m 2 , o bien en aquellas que presenten un IMC > 25 kg/m 2 o un perímetro abdominal elevado (>102 cm en los hombres, >88 cm en las mujeres) y que además presenten más de dos factores de riesgo cardiovascular (53). El tratamiento básico para conseguir la pérdida de peso consiste en la reducción en la ingesta calórica, un aumento en el consumo energético y terapia conductual. Sin embargo, el problema de este tipo de tratamiento son sus resultados a largo plazo, ya que en muchas ocasiones no se logra mantener la pérdida de peso (59). La obesidad debe ser considerada como una enfermedad crónica. Se han buscado soluciones alternativas o complementarias a la pérdida de peso convencional. La cirugía bariátrica (CB) es el método no convencional que mejores resultados ha presentado en el tratamiento a largo ––––––––––––––––– 1. I NTRODUCCIÓN P á g i n a | 37 plazo de la obesidad y en la corrección de las complicaciones metabólicas dependientes de ella. La CB se plantea, fundamentalmente, en todos aquellos pacientes con IMC > 40 kg/m 2 o bien en aquellos con IMC > 35 kg/m 2 con comorbilidades graves, siempre que se haya intentado la pérdida de peso por otros medios sin resultados satisfactorios. Figura 8. Esquema de la fisiopatología de la obesidad y sus comorbilidades Recuperado de Heymsfield et al. (58). J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 44 | P á g i n a hacen que para su elección se deban tener en cuenta distintos factores, como el IMC, la edad, el patrón alimentario, la clasificación de la American Society of Anesthesiologists (ASA) de riesgo quirúrgico y la presencia y el tipo de comorbilidades (85). Las técnicas más indicadas son las restrictivas y las mixtas, mientras que las malabsortivas puras se han restringido únicamente para pacientes muy obesos con IMC > 60 kg/m 2 . La pérdida de peso varía en función de la técnica utilizada y oscila entre el 43,5 % de la banda gástrica hasta el 70 % de las técnicas mixtas (86). Los resultados de la CB a muy largo plazo, en comparación con las opciones no quirúrgicas, son los más satisfactorios. Recientemente se ha revisado el estado de salud de un grupo de pacientes intervenido en Estados Unidos en el año 2000 y se ha demostrado que la derivación gástrica en Y de Roux consigue una mayor pérdida de peso, mantenida en el tiempo y con una clara mejora en la incidencia de complicaciones en comparación con aquellos pacientes no sometidos a técnicas quirúrgicas (87). La CB es un procedimiento seguro, con una mortalidad en torno al 0,3 % (85, 88). Según el Registro Informatizado de Cirugía Bariátrica (RICIBA) de nuestro país, la tasa de complicaciones, mayores y menores, se sitúa en el 10,6 %; dentro de las complicaciones mayores, la más frecuente fue la fuga de la anastomosis (2,3 %) y el sangrado gastrointestinal (1,8 %); la complicación menor más frecuente fue la infección de la herida quirúrgica (2,3 %) (85). Los efectos de la pérdida de peso producto de la CB suponen una mejora en las distintas comorbilidades asociadas a la obesidad. Lo mismo ocurre con el AOS, y en un metaanálisis en el que se comparaban la influencia de la pérdida de peso mediante CB y la terapia médica, se demostró que en el caso de la obesidad mórbida (OM) la pérdida de peso secundaria a la CB ofrecía resultados más satisfactorios (89). 1.3. C OMUNICACIÓN INTERCELULAR La comunicación intercelular en los organismos pluricelulares se lleva a cabo de manera directa o mediante la liberación de distintos elementos de señalización. Dichas moléculas permiten transmitir información a otras células tanto cercanas como más lejanas. Su acción sobre las distintas células diana dependerá del receptor de membrana al que se unan y el estado de la célula, alterando diferentes parámetros, como su metabolismo, su forma, su movimiento o la expresión génica. De esta forma, se conocen cuatro tipos de señalización celular para la comunicación intercelular (Figura 13) (90): ––––––––––––––––– 1. I NTRODUCCIÓN P á g i n a | 45 1. Contacto directo. Una proteína de membrana de la célula efectora interactúa directamente con un receptor en la célula diana. 2. Sinapsis. Este tipo de conexión se da únicamente entre las células del sistema nervioso. En ellas se produce la transmisión de un impulso eléctrico a lo largo de toda su membrana, lo que produce la liberación de un determinado neurotransmisor al espacio sináptico. Este sistema de señalización permite poner en contacto células muy distantes entre sí gracias a la longitud del terminal axonal de la neurona. 3. Comunicación paracrina. Se liberan sustancias al espacio extracelular con una acción local sobre las células cercanas. 4. Comunicación endocrina. Se envían las señales a larga distancia y no es necesario que la célula emisora y la diana se encuentren próximas entre sí. Utiliza sustancias que se liberan al torrente circulatorio. Las más conocidas son las hormonas, pero hay una amplia variedad de moléculas que participan de esta comunicación a distancia. J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 46 | P á g i n a Figura 13. Mecanismos básicos de comunicación intercelular Recuperado de Alberts et al. (90) Los cambios epigenéticos más conocidos son la metilación del DNA, la acetilación de las histonas, el remodelado de la cromatina y la producción de micro-RNA (miRNA) (91). La presencia de estos cambios en determinados genes conlleva una expresión modificada de sus proteínas. La producción de miRNA supone una novedosa forma de comunicación intercelular. 1.4. V ESÍCULAS EXTRACELULARES En los últimos años se ha puesto el foco en un nuevo mecanismo de comunicación intercelular: las vesículas extracelulares (VE). En su contenido distintos tipos de moléculas biológicas (DNA, RNA, proteínas, lípidos…). La producción de las VE ocurre tanto en condiciones fisiológicas como fisiopatológicas y se han aislado en la práctica totalidad de los fluidos biológicos (plasma, líquido ascítico, leche materna, orina, lavado broncoalveolar…) (92). La identificación de pequeñas vesículas que se liberan de la superficie de muchos tipos celulares se conoce desde hace décadas. De esta manera, se trató de diferenciar las diferentes VE del organismo por su tamaño, su densidad, su fuente y su proceso de formación (93). Actualmente se conocen distintos tipos de pequeñas vesículas con diferentes biogénesis, tamaño y función: exosomas, microvesículas, ectosomas o cuerpos apoptóticos (Figura 14) (94). La nomenclatura para definir los distintos tipos de VE continúa siendo actualmente materia de debate en la comunidad científica. Originalmente se pensó que la función principal de los exosomas era la eliminación de sustancias de deshecho; sin embargo, trabajos posteriores han demostrado su importancia en la comunicación célula-célula. Estudios en animales han demostrado que las VE liberadas por las células se encuentran moduladas por el tipo de enfermedad (95). De ahí que exista un manifiesto interés en el estudio de los exosomas y de su función en el cuerpo para desarrollar aplicaciones clínicas en el diagnóstico y el tratamiento. ––––––––––––––––– 1. I NTRODUCCIÓN P á g i n a | 47 Figura 14. Esquema de la formación de vesículas extracelulares Recuperado de Kalra et al. (92). 1.4.1. Ectosomas Son estructuras (100-1000 nm) formadas por la evaginación de una porción de la membrana plasmática (MP). Se observaron por primera vez desprendiéndose de la membrana de neutrófilos activados (96). La producción y el contenido de estas vesículas varía en función del estado de actividad de la célula, así como de su estirpe. Los ectosomas suelen transportar distintas proteínas; básicamente, metaloproteasas, integrinas y glicoproteínas (92). 1.4.2. Cuerpos apoptóticos Fueron las primeras VE descritas (97) y conforman un grupo heterogéneo de vesículas que se forman durante el proceso de apoptosis celular. Dicho proceso ocurre en células de gran tamaño que no pueden ser fagocitadas (98). En esos casos, la célula sufre un proceso de desmantelamiento progresivo que culmina con la formación de estos cuerpos apoptóticos. La formación está mediada por una familia de enzimas proteolíticas denominadas caspasas. J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 48 | P á g i n a 1.4.3. Exosomas Los exosomas son pequeñas vesículas de 50 a 100 nm (Figura 15) que contienen material genómico y diferentes proteínas y lípidos, y que son liberadas por las células ante diferentes estímulos mediante un complejo mecanismo. En los últimos años se las ha puesto en la diana de biomarcadores para distintas enfermedades, ya que tienen un papel muy relevante en la comunicación intercelular (99).Todas las células del organismo presentan un ciclo de endocitosis-exocitosis, de tal forma que la MP se encuentra en continuo movimiento, manteniendo su tamaño y el volumen celular en todo momento. Figura 15. Imagen obtenida por microscopía electrónica de dos exosomas Cortesía del Dr. Sanz Rubio. ––––––––––––––––– 1. I NTRODUCCIÓN P á g i n a | 49 La formación de los exosomas comienza con un proceso conocido como picnocitosis, en el que se producen pequeñas invaginaciones de la MP. Esas zonas de la MP se encuentran tapizadas por distintos tipos de proteínas, aunque las invaginaciones más frecuentas son las formadas por clatrina. En su interior se almacenan sustancias extracelulares, receptores y proteínas de membrana. En las proximidades de la superficie citosólica de la MP se produce la formación del endosoma temprano (ET) mediante la fusión de esas vesículas picnocíticas. El ET adquiere una morfología pleomórfica en el que se pueden identificar zonas vacuolares y otras tubulares. Este ET, además de recibir nuevas vesículas procedentes de la MP, también recibe vesículas procedentes del aparato de Golgi; pero también devuelve vesículas a la MP. El ET permanece bajo la superficie de la MP durante 5-10 minutos. Una vez formado, se desplaza en un movimiento errático a través de microtúbulos hacia la periferia nuclear, donde tendrá lugar la maduración del endosoma. Durante la maduración del ET este pierde sus zonas vacuolares y tubulares, y adquiere una morfología más esférica. Se modifican las proteínas de la membrana del endosoma (ubiquitinización) y comienza la formación de vacuolas o cuerpos intraluminales (CIL) (100). La biogénesis de los CIL no se conoce bien. Parece haber una doble vía que participa en su desarrollo: la vía de la ceramida y la vía de la endosomal sorting complex requiered for transport (ESCRT), aunque esta última es la más conocida. Durante su trayecto hasta la periferia del núcleo, los receptores y proteínas de membrana del ET sufren un proceso de ubiquitinización. El complejo ESCRT lo constituyen cuatro unidades: 0, I, II y III. La proteína ESCRT-0 clasifica y agrupa a las proteínas ubiquitinizadas y deja libres zonas ricas en una proteína transmembrana: la tetrapasnina. Esas zonas se denominan tetrapasnins enriched microdomains (101) que serán las zonas donde la membrana del endosoma se invaginará para dar lugar al CIL. De igual modo que la formación del CIL no ocurre de manera aleatoria, su contenido tampoco es azaroso. El contenido (proteínas, DNA, miRNA…) que llevarán los CIL procedente del citosol celular es seleccionado por ESCRTI y ESCRT-II. Tras la formación de los CIL, el ET ha evolucionado al endosoma tardío o cuerpo multivesicular (CMV). Una vez que se finaliza la formación del CMV, este se dirige nuevamente a la periferia celular. Allí se activará la maquinaria molecular necesaria para su fusión con la MP y la liberación de los CIL, que en ese momento pasan a denominarse exosomas. En la Figura 16 se muestra, esquemáticamente, este proceso. Los CMV pueden seguir un camino distinto, que, al igual que ocurre con la biogénesis del exosoma, no se conoce bien. La presencia de determinadas proteínas en la membrana del CMV durante su proceso de maduración produce la fusión con lisosomas procedentes del J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 50 | P á g i n a aparato del Golgi y el retículo endoplásmico, lo que da lugar al endolisosoma. Al igual que ocurre con el CMV, el endolisosoma también se fusiona con la MP y los restos moleculares se envían al espacio intercelular. El contenido de los exosomas es muy variado, y se ha descrito la presencia de proteínas, lípidos, moléculas de DNA, RNA, etc. En el año 2012 se desarrolló una herramienta de trabajo colaborativo dentro de la comunidad científica conocida como Vesiclepedia (102), que tiene como objetivo catalogar toda la información sobre los hallazgos moleculares en exosomas, cuerpos apoptóticos y ectosomas (última actualización, 15 de agosto de 2018) (103). De las moléculas encontradas en su interior, las que mayor trascendencia están alcanzando son las moléculas de RNA que, a su vez, se pueden clasificar en dos tipos: codificantes (RNA mensajero [mRNA]) y no codificantes (miRNA, long coding RNA [lcRNA], circular RNA [cirRNA], small nucleolar RNA [snoRNA], etc.) (104). Figura 16. Biogénesis y contenido de los exosomas Recuperado de Kalra et al. (92). La internalización de los exosomas liberados puede ocurrir por tres vías (105): fusión con la membrana celular y liberación del contenido del exosoma al citoplasma celular, endocitosis ––––––––––––––––– 1. I NTRODUCCIÓN P á g i n a | 51 del exosoma, o fusión con la membrana celular según la unión de proteínas de membrana exosoma-célula diana. Las células diana de los exosomas vienen determinadas por la célula procedente y por la situación fisiológica o fisiopatológica en la que se encontraba, si bien la expresión de proteínas de membrana en el exosoma no es específica de una única célula diana (106). 1.5. D EFINICIÓN DE MICRO - RNA Los miRNA son pequeñas cadenas de RNA no codificantes de entre 21 y 25 pares de bases similares estructuralmente a otros RNA no codificantes y que tienen la función de silenciar la expresión génica a un nivel postranscripcional (107). La historia de los miRNA se remonta a finales del siglo XX , cuando se describe por primera vez un miRNA, lin-4, en el nematodo Caenorhabditis elegans. Inicialmente se sospechaba que el gen lin-4 codificaba una proteína que actuaba sobre el gen lin-14, responsable del desarrollo larvario del nematodo. Sin embargo, Lee et al. describen que realmente el producto del gen lin-4 no da lugar a una proteína, sino a una pequeña molécula de RNA no codificante (108). Dicha molécula resulta ser complementaria con la secuencia de nucleótidos del gen lin-14, lo que produce su inhibición y, por tanto, reduce la producción de la proteína lin-14. 1.5.1. Biogénesis del micro-RNA Los miRNA son transcritos en el núcleo por la RNA-polimerasa II, que origina un miRNA primario (pri-miRNA) (109). Los pri-miRNA forman estructuras secundarias de horquilla que son cortadas por la enzima DROSHA ayudada por su cofactor PASHA, y originan el precursor del miRNA (pre-miRNA). Los pre-miRNA son transportados desde el núcleo al citoplasma por la proteína exportina 5 y en el citoplasma son procesados a miRNA cortos (22 nucleótidos) de doble cadena por la ribonucleasa de tipo III Dicer. Los miRNA maduros se incorporan en los complejos efectores microRNA inducedsilencing complex (miRISC) y es entonces cuando se forman los miRNA maduros de cadena sencilla (107). Mientras una cadena se mantiene incorporada en el complejo miRISC (donde ejercerá su función de silenciamiento), la otra cadena se degradará. El mecanismo por el cual un miRNA ejerce su función depende del grado de complementariedad entre el miRNA y la región 3’-UTR de su RNA mensajero (mRNA) diana. Si la complementariedad entre ambas secuencias es completa, el mRNA diana será degradado por el miRISC. Sin embargo, si el emparejamiento entre las bases no es perfecto, como ocurre con la mayoría de los miRNA en los mamíferos, J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 52 | P á g i n a se producirá la inhibición de la traducción. En la Figura 17 se muestra, esquemáticamente, el proceso de formación de los miRNA. Figura 17. Biogénesis del micro-RNA Recuperado de Gargalionis et al. (110) Un miRNA puede tener muchos mRNA diana y cada mRNA puede estar regulado por varios miRNA. En estudios bioinformáticos se ha estimado que los miRNA pueden regular hasta el 30 % de todos los genes humanos. Estas moléculas de miRNA juegan un papel fundamental en distintos procesos celulares, como son la diferenciación (111), la proliferación (112) y la apoptosis (113). Aunque la importancia clínica de los miRNA se encuentra en su papel como biomarcadores y como diana terapéutica, también realizan un papel fundamental en el desarrollo fisiológico del individuo (114-116). La expresión de los miRNA se ve alterada por numerosos factores tanto ambientales como genéticos (117). ––––––––––––––––– 1. I NTRODUCCIÓN P á g i n a | 53 1.5.2. Actividad biológica del micro-RNA exosomal Los miRNA pueden ser transportados por los exosomas y los ectosomas, pero también se han encontrado libres en el plasma o bien unidos a proteínas o lipoproteínas de alta densidad (HDL) (118, 119). Sin embargo, existe discrepancia en el porcentaje de miRNA transportado por cada uno de los medios. Unos autores afirman que la mayor parte van libres en el plasma formando complejos proteicos a partir del complejo miRISC: argonauta 2 (Ago-2), cuya función es evitar su degradación por las enzimas ribonucleasas extracelulares (120-122). Otros autores han demostrado que la mayoría del miRNA viaja protegido por la bicapa lipídica de las VE (123). Como señalan O’brien et al. (124), esas discordancias pueden deberse a las diferencias existentes entre las muestras y los tipos de miRNA analizados, y que el medio de transporte dependa del miRNA estudiado, la célula que lo emite y otros factores que afecten a su producción. En cualquier caso, los exosomas confieren estabilidad a los miRNA en distintas condiciones de almacenamiento y a lo largo del tiempo (125). En un estudio llevado a cabo en los descendientes de la cohorte de Framinghan se analizaron y compararon los miRNA presentes tanto en plasma como sangre total, y se obtuvo una discordancia entre ambas muestras probablemente debidas al contenido de miRNA de las células presentes en la sangre total (126). En el estudio publicado por Sanz-Rubio et al., se demostró en 7 adultos sanos que las concentraciones de miRNA exosomal se mantenían estables en cuatro determinaciones semanales, lo que sentaba las bases de su uso como biomarcador para distintas enfermedades (127). El almacenamiento y el transporte en los exosomas los protege frente a agresiones externas y hace que tengan dianas celulares selectivas según las proteínas de membrana de la bicapa (128), a diferencia de lo que ocurre con los miRNA que viajan por el plasma, que pueden actuar sobre cualquier célula. Los mecanismos por los que unos exosomas son cargados con unos miRNA y no con otros siguen sin conocerse, pero no se produce de manera aleatoria. Distintos estudios han demostrado que la incorporación de los miRNA a los exosomas varía en función de la enfermedad que afecta a la célula. El papel de los miRNA exosomales tiene su máximo exponente en las metástasis de las neoplasias malignas (129). P á g i n a | 61 2. JUSTIFICACIÓN E HIPÓTESIS DE TRABAJO La traslación a la clínica de los estudios in vitro o en animales sobre la relación entre hipoxia intermitente (o fragmentación del sueño) y disfunción metabólica o cardiovascular siempre va a ser cuestionable. En nuestra opinión, para dilucidar el papel por separado de la obesidad y de la AOS sobre los miRNA exosomales como agentes moduladores de morbilidad cardiovascular es necesario determinar el comportamiento de estos miRNA en los siguientes grupos: 1) cohortes de pacientes con AOS (sin y con obesidad), seguidas por un tiempo suficiente; 2) sujetos que reciben tratamiento del AOS (por ejemplo, mediante CPAP) sin y con obesidad asociada; y 3) personas obesas con o sin AOS tratados mediante CB. Con esta tesis se pretende aportar alguna luz a esta importante cuestión, ya que tenemos la oportunidad de poder estudiar a un amplio grupo de pacientes con OM antes de CB y tras ella. Planteamos un estudio prospectivo para evaluar cambios epigenéticos a nivel de los miRNA exosomales que sufren los pacientes obesos mórbidos con AOS y sin AOS antes y después de CB. Los resultados, además, se compararán con los obtenidos en pacientes no obesos sin comorbilidad con y sin AOS procedentes del estudio EPIOSA (155). Con todo lo expuesto, planteamos la siguiente hipótesis de trabajo: «Existe un perfil epigenético específico en pacientes con solapamiento OM y AOS que viene dado por la suma del efecto de la hipoxia crónica tisular sobre los adipocitos y por la hipoxia crónica intermitente debida a la AOS. Hipotetizamos que existen anomalías en los miRNA exosomales circulantes propias del estado de OM, que se modificarán tras la CB, y cambios en la carga exosomal de miRNA secundarios a la acción de la AOS, que se modificarán con el tratamiento de CPAP» (Figura 18). J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 62 | P á g i n a Figura 18. Hipótesis de trabajo P á g i n a | 63 3. O BJETIVO P á g i n a | 65 3. OBJETIVO 3.1. O BJETIVO PRINCIPAL En pacientes con OM candidatos a CB, determinar las diferencias en una batería de miRNA exosomales circulantes asociados a inflamación o riesgo cardiovascular, entre sujetos con y sin AOS asociado, y sus cambios tras tratamiento mediante CPAP y CB. 3.2. O BJETIVOS SECUNDARIOS 1. Determinar la prevalencia de AOS y el comportamiento de los factores predictores clásicos de AOS en pacientes con OM. 2. En pacientes con OM, establecer diferencias en la carga de miRNA exosomales circulantes en función de la presencia de AOS. 3. En pacientes con OM, valorar el impacto del tratamiento con CPAP en la expresión de los miRNA exosomales y sus diferencias con pacientes no obesos. 4. En pacientes con OM, valorar el impacto de la pérdida de peso inducida por la CB en la expresión de los miRNA exosomales. 5. En pacientes con OM, evaluar la relación de los parámetros antropométricos en función del diagnóstico de AOS y su relación con los miRNA exosomales. 6. En pacientes con OM, determinar la evolución de los parámetros bioquímicos (perfil glucémico y lipídico) y su relación con los miRNA exosomales. 7. En pacientes con OM, evaluar la influencia de la AOS en los parámetros gasométricos diurnos y poligráficos nocturnos y su relación con los miRNA exosomales. P á g i n a | 67 4. M ÉTODOS P á g i n a | 69 4. MÉTODOS 4.1. D ISEÑO DEL ESTUDIO Para comprobar la hipótesis de trabajo se ha planteado un estudio sobre una cohorte de pacientes con OM con y sin AOS, con carácter prospectivo y controlado. El estudio se considera de no intervención, ya que la decisión de recibir tratamiento con CPAP y la decisión quirúrgica no se aleatorizó, sino que se realizó de acuerdo con una decisión clínica no programada en el diseño del estudio. El protocolo del presente estudio se presentó ante el Comité de Ética e Investigación Clínica de Aragón y fue aceptado por él (anexo 1). Dicho protocolo ha sido registrado en ClinicalTrials.gov, de la US National Library of Medicine (Estados Unidos), bajo el título «Epigenetics dysfunction in morbid obesity with or without obstructive sleep apnea: The EPIMOOSA study» (ClinicalTrials.gov identifier: NCT03995836) (156). 4.2. P OBLACIÓN EN ESTUDIO Todos los pacientes incluidos en el estudio tenían una edad superior a 18 años, estaban diagnosticados de OM y en espera de CB en el Hospital Royo Villanova (Zaragoza). El reclutamiento de los pacientes se extendió desde el 1 de julio de 2014 hasta el 1 de julio de 2016. 4.3. T AMAÑO MUESTRAL El cálculo muestral se determinó en la hipótesis de que en un grupo de 30 pacientes con AOS grave el tratamiento con CPAP redujo de forma significativa el espesor de la capa íntima-media de las arterias carótidas tras 3 meses de terapia efectiva (157). Se conformaron dos grupos de pacientes: a) sujetos con OM y sin AOS; y b) pacientes con OM y AOS que requieren tratamiento con CPAP. La composición mínima de cada subgrupo fue de al menos 12 sujetos con un seguimiento de 2 años tras su inclusión en la visita basal. Este tamaño se calculó para demostrar diferencias significativas en las modificaciones epigenéticas entre subgrupos con AOS y el grupo control (objetivo principal). En un estudio previo, Kim et al. (158) demostraron diferencias significativas en la metilación del DNA de genes proinflamatorios entre dos subgrupos de 8 niños con AOS con PCR alta o baja. En nuestra propia cohorte, se evidenciaron diferencias significativas en los niveles de exosomas circulantes en grupos de 12 pacientes con AOS frente a los controles. Así pues, considerando una pérdida potencial del 10 % de casos durante el seguimiento, planteamos incluir 15 sujetos J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 76 | P á g i n a Figura 21. Extracción del RNA total de los exosomas purificados 4.8.3. Determinación del micro-RNA mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (rtPCR) El análisis del RNA se llevó a cabo mediante rtPCR. Dado que las moléculas para estudiar son RNA, el proceso se inicia con la retrotranscripción, para lo que se utilizó el kit comercial miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR Kit (Exiqon). La técnica utilizada para la cuantificación de las muestras de miRNA fue la rtPCR, siguiendo las especificaciones del fabricante del kit citado anteriormente. Los miRNA analizados en el presente estudio fueron los relacionados con episodios de hipoxia que mayor estabilidad presentaron en el análisis por nuestro grupo tras la congelación del plasma (127). 4.8.4. Determinación de la cantidad relativa de micro-RNA El análisis se llevó a cabo sobre los valores del ciclo umbral o cycle threshold (C t ), es decir, el número mínimo de ciclos de PCR necesarios para que se produzca una señal cuantificable, según el método C t , descrito por Livak et al. en 2001 (163). El cálculo de este valor requiere la determinación de dos diferenciales (. En primer lugar, el diferencial entre los C t del miRNA que se estudia y el miRNA considerado como normalizador. El segundo diferencial se obtuvo de la diferencia entre el C t medio de cada grupo de análisis y el del grupo de referencia de los demás grupos, obteniendo de esta forma el C t . Finalmente, según el desarrollo matemático propuesto por Livak, el valor definitivo se obtuvo tras la transformación exponencial de C t , es decir 2 −  Ct . 4.8.5. Selección de micro-RNA para el estudio Se realizó una búsqueda bibliográfica para la selección de miRNA relacionados con obesidad, hipoxia, inflamación y aterosclerosis. En la Tabla 5 se muestran los miRNA que se estudiaron ––––––––––––––––– 4. M ÉTODOS P á g i n a | 77 y el indicio de su relación con cada uno de los ítems seleccionados. La búsqueda se realizó en PubMed utilizando la combinación de los descriptores: «miRXXX» OR «circulating miRXXX» AND «Obesity», «hipoxia», «inflammation», «cardiovascular disease» y «atherosclerosis». Se han incluido, indistintamente, tanto los hallazgos relativos a miRNA circulantes como los hallados en otros tejidos (como el adiposo, las células endoteliales, las células de músculo liso vascular, los estudios in vitro…). Tabla 5. Selección de micro-RNA para el estudio miR 16 miR 21 miR 34 miR 126 miR 133 miR 145 miR 146 miR 155 miR 223 miR 320 Aterosclerosis ↓ (164) ↑ (165, 166) ↑ (165) ↓ (165, 167) ↓ (168, 169) ↓ (170) ↑ (101, 171) ↑ * (172) ↓ (173) ↑ * (168, 174) Inflamación ↑ (175) ↑ (176) ↑ * (177) ↓↑ (178, 179) ↑ (180) ↑ (181) ↑* (168) Hipoxia ↑ (182, 183) ↑ ** (147) ↓ (184, 185) ↑ (186) ↓ (187) ↑ ** (147) ↑ (188) ↑ (189) ↓ (190) ↑ (191193) Obesidad ↑ (194197) ↑ (198, 199) ↑(199) ↓ (200) ↑* (199, 201) ↓ * (202) ↑ (199) ↑ *** (203) ↓ Expresión disminuida ↑ Expresión aumentada * Estudios llevados a cabo sobre micro-RNA circulante. + Estudios llevados a cabo sobre micro-RNA exosomal. ** En hipoxia intermitente. *** En adipocitos con resistencia a la insulina. 4.9. A NÁLISIS ESTADÍSTICO Se han realizado los siguientes procedimientos estadísticos:  Descripción de poblaciones. Se expresaron en valores medios ± desviaciones estándar cuando las variables eran continuas. Para las variables cualitativas se obtuvieron su distribución de frecuencias.  Diferencias entre grupos: contrastes paramétricos t-Student o ANOVA si siguen una distribución normal, o mediante los contrastes U de Mann-Whitney o H de Kruskal Wallis si no se trabaja con dicha hipótesis. Para las variables cualitativas se utilizó el contraste habitual χ 2 , con el estudio de residuos estandarizados. J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 78 | P á g i n a  Relación entre variables clínicas e inflamación sistémica: correlación de Pearson o de Spearman según sea el comportamiento de normalidad de las variables estudiadas.  Efecto del tratamiento: test de t para datos pareados si se trabaja con el supuesto de normalidad, o test no paramétrico de Wilcoxon cuando la variable no sigue distribución normal.  El proceso de análisis de los marcadores epigenéticos se realizó mediante el paquete GOstats) (204).  Las diferencias entre los miRNA interindividuos se estableció por el coeficiente de variación. Los paquetes estadísticos utilizados fueron el GraphPad Prism 7 (GraphPad Software) y el SPSS version 20.0 (IBM). El IAH, como variable cuantitativa continua, se utilizó para crear los grupos con AOS y sin AOS, utilizando el valor 10 como punto de corte. La expresión numérica de los miRNA es el threshold cycle (C t ), que se podría traducir como señal o ciclo umbral, es decir, el ciclo de la reacción en cadena de la polimerasa en la que aparece por primera vez el miRNA que se estudia. Dado que este valor viene determinado por el momento en el que aparece la primera señal de un determinado miRNA, su interpretación es inversamente proporcional, es decir, a menor valor, mayor expresión del miRNA. Este valor por sí mismo no permite hacernos una idea de la expresión del miRNA, por lo que se debe normalizar. Como normalizador se seleccionaron el let-7a y el miR16, y tras aplicar la calculadora RefFinder (205) se decidió que el más estable era el let-7a, que fue el que finalmente se utilizó. De esta forma se calculó el C t : ΔC  =C  miRNA en estudio−C  let-7a La interpretación de este valor resulta compleja y poco intuitiva, ya que, cuanto más positivo es el resultado, menor es la expresión. Por ese motivo se opta por transformar los resultados utilizando la fold change o tasa de cambio (FC) o expresión relativa. Esta herramienta matemática nos permite relacionar el C t de un miRNA frente a la media de otro que utilizamos como control: ∆∆C  = ∆C    !− ∆C  "#$!  %!#!& ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Una vez calculado el C t , ya podemos calcular la expresión relativa: ––––––––––––––––– 4. M ÉTODOS P á g i n a | 79 FC= 2 *∆∆+ En nuestro estudio hemos utilizado como grupo control los pacientes con OM sin AOS para los análisis independientes, y la visita basal para las comparaciones dependientes, en las que vemos la evolución en los pacientes con y sin AOS a lo largo de las distintas visitas. Con esta fórmula se obtiene un guarismo positivo a partir de 0, donde 1 es el punto de corte:  FC > 1 implica una expresión positiva. Su interpretación será «el miRXXX experimentó un incremento de XX (>1) veces en su expresión».  FC < 1 implica una expresión negativa. El valor se expresará manteniendo su formato («el miRXXX experimentó un descenso de XX (<1) veces en su expresión») o bien como porcentaje de reducción de la expresión («el miRXXX redujo su expresión en XX % [(1 − FC) × 100]»). Los valores extremos o outliers de la expresión de los miRNA han sido eliminados del análisis utilizando el método robust regression and outlier removal (ROUT) con un Q = 1 % del paquete estadístico GraphPad Prism 7 (GraphPad Software). Tras la pérdida de peso experimentada en la última visita, se analizó el impacto que la variación de este peso, así como el cambio en los parámetros del sueño, había tenido en la variación de los miRNA. Para ello se calculó, por un lado, la diferencia de los miRNA entre la visita basal y la última (∆miRNA); por otro lado, se calculó la diferencia relativa de IMC, IAH y CT 90 (∆IMC, ∆IAH, ∆CT 90 ): ,- %.&−- /.& - %.& 0×100 P á g i n a | 81 5. R ESULTADOS P á g i n a | 82 5. RESULTADOS 5.1. V ISITA BASAL 5.1.1. Descripción de la muestra Entre el 1 de julio de 2014 y el 1 de julio de 2016 se realizaron cinco cortes de la lista de espera quirúrgica, cada 6 meses, para la inclusión de pacientes. Una vez aplicados los criterios de inclusión y exclusión, la muestra para su análisis se redujo a un total de 70 pacientes en la visita inicial y 24 tras completar todas las visitas (Figura 22). Figura 22. Flujograma de pacientes a lo largo del estudio AOS: apnea obstructiva del sueño; LEQ: lista de espera quirúrgica; CI: consentimiento informado; CV: cardiovascular. La prevalencia de AOS en aquellos pacientes que acudieron a la primera visita fue de 51,4 %. Dado que no todos los pacientes completaron todas las visitas, se han descrito ambas muestras estableciéndose las diferencias entre quienes presentaban AOS y quienes no la presentaban (Tabla 6). El análisis de los parámetros antropométricos, los parámetros del sueño, el perfil glucémico y el perfil lipídico se llevó a cabo en ambos grupos para asegurar su igualdad. Nuestro análisis, además, se comparó con los resultados presentados en la tesis ––––––––––––––––– 5. R ESULTADOS P á g i n a | 83 doctoral de David Sanz Rubio, Micro-RNAs de exosomas circulantes en apnea obstructiva del sueño (206), donde analiza la base de datos de EPIOSA (155). Para el análisis de miRNA se utilizaron las muestras de sangre de aquellos pacientes que completaron las tres visitas, y los resultados se compararon con los datos de la citada tesis. De esta forma, se pudo determinar el impacto de la obesidad, el tratamiento con CPAP y la CB en cada uno de los grupos. En ambos grupos, los pacientes con y sin AOS, morfológicamente, muestran el mismo IMC, pero los primeros tienen un mayor perímetro de cuello (media y desviación estándar: 44  3,7 frente a 40  3, p < 0,001) e incluyen a un mayor porcentaje de hombres (53 % frente a 15 %, p < 0,001). Los pacientes con AOS son mayores (48  8 años frente a 40,5  8 años, p < 0,001) y muestran una mayor prevalencia de comorbilidades. En el grupo de pacientes que completan el estudio, el grupo de AOS fueron mayores (49  9 años frente a 42,5  8 años), pero las diferencias no alcanzaron la significación estadística. Lo mismo ocurrió con el perímetro abdominal y la TAS, con una media superior en ambas variables para el grupo con AOS (perímetro abdominal: 128  13 cm frente a 118  15 cm; TAS: 135  13 mmHg frente a 129  10 mmHg), pero sin alcanzar la significación estadística. J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 84 | P á g i n a Tabla 6. Variables de la visita basal del total de la muestra (n = 70) y de los que completaron el estudio (n = 24) VARIABLES TOTAL EN LA PRIMERA VISITA COMPLETAN EL ESTUDIO Sin AOS Con AOS Sin AOS Con AOS n 34 36 9 15 Sexo [femenino; n (%)] 29 (85,3) 17 (47,2) *** 8 (88,9) 6 (40) * Edad (años) 40,5 ± 7,9 47,9 ± 8,2 *** 42,4 ± 7,9 49,6 ± 9 Peso (kg) 113,4 ± 13,8 121,1 ± 16,4 * 116,3 ± 13,2 117 ± 13,1 * IMC (kg/m 2 ) 41,6 ± 3,8 43 ± 4,8 42 ± 1,5 42 ± 3,1 Perímetro del cuello (cm) 40,2 ± 3,1 43,9 ± 3,7 *** 40,4 ± 4,2 44,6 ± 4,1 ** Perímetro abdominal (cm) 119,1 ± 10,6 129,3 ± 13,3 *** 118,4 ± 14,7 127,8 ± 12,8 * Perímetro de la cadera (cm) 134,1 ± 9,1 134,4 ± 14,1 136,1 ± 10,9 129,9 ± 10 Indice cintura-cadera 0,89 ± 0,09 0,96 ± 0,11 ** 0,87 ± 0,14 0,99 ± 0,12 * Epworth 7,2 ± 3,5 7,9 ± 4,4 8,8 ± 4 9,2 ± 4,8 IAH (eventos/hora) 3,8 ± 2,3 32,9 ± 23,6 *** 4,5 ± 3 35,5 ± 21,7 *** CT 90 (%) 4 ± 7,5 33,2 ± 27,9 *** 1,7 ± 1,7 30,4 ± 23,9 *** SatO 2 (%) 93,8 ± 1,2 91 ± 2,6 *** 94,3 ± 1,1 91,2 ± 2,1 *** Fumador activo 5 (14,7) 10 (27,8) 4 (16) 7 (33,3) Exfumador 11(32,4) 19 (52,8) 8 (32) 9 (42,9) Nunca fumador 18 (52,9) 7 (19,4) * 13 (52) 5 (23,8) Hipertensión arterial 14 (41,2) 23 (63,9) * 6 (66,7) 10 (66,7) Dislipemia 6 (17,6) 20(55,6) *** 1 (11,1) 10 (66,7) ** Diabetes mellitus 9 (26,5) 20 (55,6) ** 1 (11,1) 9 (60) ** Evento cardiovascular 3 (8,8) 4 (11,1) 1 (11,1) 2 (13,3) Asma 2 (5,8) 3 (8,3) 0 1 (6,7) Consumo de fármacos sedantes 8 (23,5) 7 (19,4) 1 (11,1) 2 (13,3) FEV 1 (l) 3,19 ± 0,84 2,99 ± 0,9 3,36 ± 0,98 2,86 ± 0,75 FEV 1 (%) 100,9 ± 13,8 93,8 ± 17,4 * 103,2 ± 5,4 88,5 ± 15,3 ** TAS (mmHg) 129,5 ± 13,7 140,6 ± 16,2 ** 129,4 ± 10 135,5 ± 13,6 TAD (mmHg) 85,4 ± 8,4 87,9 ± 11,4 84,4 ± 8,7 90 ± 12,2 CT 90 : porcentaje de tiempo con saturación de oxígeno por debajo del 90 %; FEV 1 : volumen espiratorio máximo en el primer segundo; IAH: índice de apneas e hipopneas; IMC: índice de masa corporal; SatO 2 : saturación de oxígeno; TAD: tensión arterial diastólica; TAS: tensión arterial sistólica. Variables Cualitativas: Frecuencia (%). Variables Cuantitativas: media (Desviación Estándar). Con AOS frente sin AOS, U de Mann Whitney; variables cualitativas, χ 2 ; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. ––––––––––––––––– 5. R ESULTADOS P á g i n a | 85 Como se ha descrito previamente, se utilizaron los datos de pacientes del estudio EPIOSA, que incluye pacientes sin OM (IMC < 35 kg/m 2 ) y sin comorbilidades. Las diferencias se muestran en la Tabla 7. Tabla 7. Descripción de las muestras de EPIOSA y EPIMOOSA VARIABLES EPIOSA EPIMOOSA Sin AOS (n = 16) Con AOS (n = 65) OM sin AOS (n = 9) OM con AOS (n = 15) Edad (años) 47,8 ± 6,3 45,1 ± 9,3 42,4 ± 7,9 49,6 ± 9 Sexo [femenino; n (%)] 3 (18,7) 6 (18,1) 8 (88,9) 6 (40) IMC (kg/m 2 ) 28,9 ± 3,6 30,3 ± 3,7 42 ± 1,5 42 ± 3,1 TAS (mmHg) 119,7 ± 11,3 127,2 ± 13,6 129,5 ± 15 144,2 ± 17,2 * TAD (mmHg) 72,7 ± 7,8 82,1 ± 12,2 * 84,4 ± 8,7 90 ± 12,2 * Epworth 10,6 ± 3,8 11,2 ± 5 6,67 ± 3,3 7 ± 3,9 IAH (eventos/hora) 2 ± 2 38,2 ± 20,5 * 4,5 ± 3 35,5 ± 21,7 * SatO 2 media (%) 94,5 ± 1,2 92,8 ± 2,2 * 94,3 ± 1,1 91,2 ± 2,1 * CT 90 (%) 2,9 ± 6,5 17,6 ± 17 * 1,7 ± 1,7 30,4 ± 23,9 * Glucosa (mg/dl) 91,5 ± 11,2 92,8 ± 11,9 100,1 ± 8,4 113 ± 14,6 * Hemoglobina glicosilada (%) - - 5,7 ± 0,4 5,9 ± 0,4 Colesterol total (mg/dl) 205,6 ± 37,5 207,4 ± 38,9 180,8 ± 26,2 186 ± 29,3 HDL (mg/dl) 53,8 ± 15,4 49 ± 11,9 53 ± 8,6 45,2 ± 14,8 LDL (mg/dl) 129 ± 27,7 126,3 ± 33,2 106,2 ± 27,8 111 ± 31,7 Ácido úrico (mg/dl) 5,39 ± 0,9 6,3 ± 1,3 * 5,9 ± 2 6,8 ± 1,6 * Triglicéridos (mg/dl) 114,2 ± 41,3 150,1 ± 74,9 107,5 ± 38,9 138,8 ± 59,4 Creatinina (mg/dl) 0,84 ± 0,15 0,86 ± 0,16 0,74 ± 0,15 0,88 ± 0,18 Urea (mg/dl) 32,7 ± 7,3 32,6 ± 7,5 36,8 ± 13,1 34,1 ± 8,1 Apolipoproteína A (mg/dl) 149,8 ± 24,8 147,5 ± 27,7 143,4 ± 18 137,2 ± 26,2 Apolipoproteína B (mg/dl) 103,7 ± 23,4 108,6 ± 30,3 92,7 ± 20,5 104,2 ± 25,4 PCR (mg/dl) 0,24 ± 0,19 0,43 ± 0,41 0,86 ± 0,61 0,71 ± 0,45 CT 90 : porcentaje de tiempo con saturación de oxígeno por debajo del 90 %; HDL: lipoproteína de alta densidad; IAH: índice de apneas e hipopneas; IMC: índice de masa corporal; LDL: lipoproteína de baja densidad; PCR: proteína C-reactiva; SatO 2 : saturación de oxígeno; TAD: tensión arterial diastólica; TAS: tensión arterial sistólica. Variables cualitativas: frecuencia (%). Variables Cuantitativas: media y desviación estándar. Con AOS frente sin AOS, U de Mann Whitney; variables cualitativas, χ 2 ; * p < 0,05 ; ** p < 0,01; *** p < 0,001. J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 92 | P á g i n a Figura 29. Relación del miR146 con los parámetros antropométricos en pacientes con obesidad mórbida (OM) sin y con apnea obstructiva del sueño (AOS) A: OM sin AOS. B: OM con AOS. El análisis de regresión, utilizando como variables independientes la glucosa y la hemoglobina glicosilada, no demostró ningún tipo de relación en el conjunto de los pacientes con OM. Al dividir la muestra, encontramos que en los pacientes con OM y AOS la expresión de miR34 disminuía a medida que aumentaba la concentración tanto de glucosa (r 2 = 0,850; p = 0,0001) como de hemoglobina glicosilada (r 2 = 0,427; p = 0,041). En los pacientes con OM sin AOS ––––––––––––––––– 5. R ESULTADOS P á g i n a | 93 no se encontraron relaciones significativas entre los parámetros glucémicos y los miRNA en estudio. Sin embargo, es interesante mencionar la relación demostrada por el miR320, aunque no alcance la significación estadística. Todos estos resultados se muestran en la Figura 30. Figura 30. Relación del perfil glucémico con los micro-RNA exosomales en pacientes con obesidad mórbida (OM) con apnea obstructiva del sueño (AOS) y sin AOS A: OM con AOS. B: OM sin AOS. A continuación, se buscaron las relaciones existentes entre los parámetros del perfil lipídico y los miRNA en cada una de las visitas. En la primera visita, tanto en el conjunto de la J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 94 | P á g i n a muestra como en la comparación entre pacientes con OM y AOS, se establecieron relaciones significativas. Gran parte de esas relaciones fueron producto de la presencia de valores extremos y desaparecieron al excluirlos. Las relaciones significativas encontradas se muestran en la Figura 31. Los niveles de HDL y apolipoproteína B no mostraron ninguna relación con la expresión de los miRNA en el conjunto de la muestra. El miR145 experimentó un descenso en su expresión, tanto con el colesterol total (r 2 = 0,265; p = 0,016) como con las LDL (r 2 = 0,217; p = 0,033). De igual modo, la expresión de miR146 se vio influida por los niveles de apolipoproteína A (ApoA) (r 2 = 0,189; p = 0,037). Los niveles de triglicéridos también influyeron de manera proporcional sobre la expresión de miR34 (r 2 = 0,271; p = 0,038). En el análisis comparado de la muestra en la primera visita pudimos comprobar cómo los pacientes con OM y AOS manifestaron estrechas relaciones de los parámetros estudiados con la expresión de dos de los miRNA (Figura 31). Una de ellas fue la relación, directamente proporcional, entre la concentración de ApoA y la expresión de miR126 (r 2 = 0,394; p = 0,021). La otra relación se estableció entre el colesterol total y la expresión de miR145. En este caso, el sentido de esta correlación fue inversamente proporcional, es decir, a medida que aumentaba la concentración de colesterol total disminuía la expresión de miR145 (r 2 = 0,423; p = 0,016). El grupo de pacientes con OM y sin AOS no mostró diferencias en relación con ninguno de los parámetros, y la más próxima fue la hallada entre las HDL y el miR146 (r 2 = 0,395; p = 0,07). ––––––––––––––––– 5. R ESULTADOS P á g i n a | 95 Figura 31. Relación de los parámetros lipídicos en el conjunto de la muestra de pacientes con obesidad mórbida (OM) y en los pacientes con OM y apnea obstructiva del sueño (AOS) durante la primera visita A: Conjunto de pacientes con OM. B: OM con AOS. J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 96 | P á g i n a 5.2. V ISITA A LOS 6 MESES PRECIRUGÍA : EFECTO DEL TRATAMIENTO CON PRESIÓN POSITIVA CONTINUA EN LA VÍA AÉREA 5.2.1. Descripción de la muestra en la segunda visita Al igual que ocurrió en la primera visita, se establecieron diferencias significativas en los pacientes con y sin AOS en los parámetros antropométricos y la glucosa (Tabla 8). A diferencia de la primera visita, aparecieron diferencias a favor de los pacientes con OM y sin AOS en los valores de HDL y ApoA. Tabla 8. Descripción de la muestra en la segunda visita Sin AOS Con AOS n 9 15 IMC (kg/m 2 ) 43 ± 1,8 42,5 ± 3 Perímetro cervical (cm) 41,6 ± 3,4 45,2 ± 4,1* Perímetro abdominal (cm) 127,4 ± 10,5 131,1 ± 9,1* Índice cintura-cadera 0,93 ± 0,11 0,99 ± 0,10* Glucosa (mg/dl) 103,1 ± 21,9 122,1 ± 34,1* Hemoglobina glicosilada (%) 5,7 ± 0,4 6,2 ± 0,7 Colesterol total (mg/dl) 185,1 ± 25,7 184,4 ± 32,7 HDL (mg/dl) 55,8 ± 8,6 44,3 ± 9,2 ** LDL (mg/dl) 104,3 ± 27 113,1 ± 35,4 Triglicéridos (mg/dl) 124 ± 28,8 135 ± 39,3 ApoA (mg/dl) 167,8 ± 24,4 132,4 ± 22,6 ** ApoB (mg/dl) 99,6 ± 20,1 110,2 PCR (mg/dl) 0,62 ± 0,32 0,80 ± 0,78 ApoA: apolipoproteína A; ApoB: apolipoproteína B; HDL: lipoproteína de alta densidad; IMC: índice de masa corporal; LDL: lipoproteína de baja densidad; PCR: proteína C-reactiva. Valores expresados como media y desviación estándar. U de Mann Whitney; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. Como podemos ver en la Tabla 9, el tratamiento con CPAP no produjo ningún cambio en los parámetros antropométricos ni bioquímicos. Por el contrario, en el grupo de pacientes ––––––––––––––––– 5. R ESULTADOS P á g i n a | 97 con OM y sin AOS se produjo un incremento significativo de los parámetros antropométricos, a excepción del IMC. También aumentaron los niveles de ApoA. Tabla 9. Impacto tras 6 meses de tratamiento con presión positiva continua en la vía aérea sobre los parámetros antropométricos y bioquímicos Con AOS (n = 9) Sin AOS (n = 15) VISITA BASAL VISITA A LOS 6 MESES PRECIRUGÍA VISITA BASAL VISITA A LOS 6 MESES PRECIRUGÍA IMC (kg/m 2 ) 42 ± 1,5 43,1 ± 1,8 42 ± 3,1 42,5 ± 3 Perímetro cervical (cm) 40,4 ± 4,2 41,6 ± 3,4 * 44,6 ± 4,1 45,2 ± 4,1 Perímetro abdominal (cm) 118,4 ± 14,7 127,4 ± 10,5 * 127,8 ± 12,8 131,1 ± 9,1 Índice cintura-cadera 0,87 ± 0,14 0,93 ± 0,11 * 0,99 ± ,0,12 0,99 ± 0,10 Glucosa (mg/dl) 100,1 ± 8,4 103,1 ± 21,9 113 ± 14,6 122,1 ± 34,1 Hemoglobina glicosilada (%) 5,7 ± 0,4 5,7 ± 0,4 5,9 ± 0,4 6,2 ± 0,7 Colesterol total (mg/dl) 180,8 ±26,2 185,1 ± 25,7 186 ± 29,3 184,4 ± 32,7 HDL (mg/dl) 53 ± 8,6 55,8 ± 8,6 46,9 ± 11,6 44,3 ± 9,2 LDL (mg/dl) 106,2 ± 27,8 104,3 ± 27 111 ± 31,7 113,1 ± 35,4 Triglicéridos (mg/dl) 107,5 ± 38,9 124 ± 28,8 138,8 ± 59,4 135 ± 39,3 ApoA (mg/dl) 143,4 ± 18 167,8 ± 24,4 * 137,2 ± 26,2 132,4 ± 22,6 ApoB (mg/dl) 92,7 ± 20,5 99,6 ± 20,1 104,2 ± 25,4 110,2 ± 28,3 PCR (mg/dl) 0,86 ± 0,61 0,62 ± 0,32 0,71 ± 0,45 0,80 ± 0,78 HDL: lipoproteína de alta densidad; LDL: lipoproteína de baja densidad; PCR: proteína C-reactiva; IMC índice de masa corporal. Valores expresados como media y desviación estándar. Wilcoxon; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. 5.2.2. Evolución en la expresión de micro-RNA exosomales en la segunda visita A la hora de comparar los resultados entre los pacientes procedentes de EPIOSA y EPIMOOSA, hay una limitación fundamental que se debe tener en cuenta, que es el desigual periodo de seguimiento del tratamiento con CPAP (un año en el grupo EPIOSA y 6 meses en el grupo EPIMOOSA). Por ese motivo no se realiza la comparación entre pacientes con OM y pacientes sin OM. J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 98 | P á g i n a Tras el tratamiento con CPAP observamos cómo el miR16, el miR21, el miR126 y el miR320 vieron disminuida su expresión de manera significativa en los pacientes con AOS (Figura 32). El miR223, que en la primera visita demostró tener una menor expresión en los pacientes con OM y AOS, no vio modificada su expresión en la segunda visita por efecto de la CPAP. Del mismo modo, los pacientes con OM y sin AOS no mostraron diferencias significativas en la segunda visita. ––––––––––––––––– 5. R ESULTADOS P á g i n a | 99 Figura 32. Variación de la expresión de miRNA exosomal entre primera y segunda J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 100 | P á g i n a En la segunda visita desaparecen las diferencias en la expresión del miR16, el miR21 y el miR320 entre los pacientes con AOS y los pacientes sin AOS; se incrementa la diferencia en la expresión de miR223 y aparece una diferencia en miR146. Como observamos en la Figura 33 la expresión de miR146 en los pacientes con AOS se reduce significativamente en la mayoría de los pacientes. Este miRNA, en esa segunda visita, disminuye su expresión (FC = 0,52; p = 0,004) en los pacientes con OM y AOS frente a los que no lo padecían. En el caso del miR223, persiste la menor expresión en los pacientes con OM y AOS, pero no se aprecian variaciones significativas entre la segunda y la primera visita, tanto en los pacientes con AOS como en los pacientes sin ella. ––––––––––––––––– 5. R ESULTADOS P á g i n a | 101 Figura 34. Variación de la expresión de micro-RNA exosomal entre la primera y la segunda visita en los pacientes con obesidad mórbida (OM) sin apnea obstructiva del sueño (AOS) y con AOS en tratamiento con presión positiva continua en la vía aérea (CPAP) A: Diferencia de la expresión de miRNA en pacientes con AOS y sin AOS. B. Evolución de la expresión de miRNA en pacientes con OM sin AOS. C. Evolución de la expresión de miRNA en pacientes con OM y AOS. U de Mann Whitney (A) y Wilcoxon (B y C); * p < 0,05; ** p < 0,01. En este punto pudimos comparar el efecto que el tratamiento con CPAP tuvo en los pacientes con OM frente a los pacientes no obesos del estudio EPIOSA. No se pudieron comparar todos los miRNA (sólo miR21, miR126, miR145, miR223 y miR320). Las diferencias observadas en el grupo de pacientes con AOS no se alcanzaron en el grupo de pacientes con AOS no obesos. Sin embargo, este grupo presentó un descenso significativo en el miR145 (Figura 35). J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 108 | P á g i n a 5.3. V ISITA A LOS 12 MESES POSTCIRUGÍA : EFECTO DE LA CIRUGÍA BARIÁTRICA 5.3.1. Descripción de la muestra en la tercera visita El principal cambio en esta última visita respecto a la primera fue la pérdida de peso, que fue de 30,5 kg ± 10,2 o 10,9 kg/m 2 ± 3,8 y que representa un 25,7 % ± 8,4 del exceso de peso. Los pacientes con AOS experimentaron una mayor pérdida de peso, con una diferencia de 11,4 kg/m 2 ± 4,5, lo que corresponde a una pérdida del 27,4 % ± 9,4 del exceso de peso. Los pacientes sin AOS perdieron 9,9 kg/m 2 ± 2,01, lo que supone un 23,8 % ± 4,8 del exceso de peso. Las diferencias entre ambos grupos no alcanzaron la significación estadística. En la última visita se repitieron el estudio del sueño y la gasometría arterial, así como el estudio del resto de las variables que se habían analizado en las distintas visitas. Los resultados del estudio del sueño demostraron el efecto que la pérdida de peso tuvo sobre el diagnóstico de AOS. La prevalencia de AOS en la muestra se redujo a tan solo 3 individuos (12,5 %). Como podemos ver en la Tabla 10, no aparecieron diferencias entre ambos grupos, aunque en el grupo de pacientes con AOS tan solo quedaban 3 pacientes con este diagnóstico ––––––––––––––––– 5. R ESULTADOS P á g i n a | 109 Tabla 10. Descripción de la muestra en la última visita Con AOS Sin AOS n 9 15 IMC (kg/m 2 ) 32,1 ± 2,5 30,5 ± 3,9 Perímetro cervical (cm) 37,1 ± 3,4 38,9 ± 4,6 Perímetro abdominal (cm) 103,4 ± 7,9 102,9 ± 11,2 Índice cintura-cadera 0,88 ± 0,09 0,94 ± 0,08 IAH (eventos/h) 2,2 ± 1,7 9,5 ± 14,5 CT 90 (%) 1,3 ± 3,6 15,7 ± 23,3 SatO 2 media (%) 94,7 ± 1 93 ± 2,2 pH 7,40 ± 0,02 7,40 ± 0,03 P a O 2 (mmHg) 74,2 ± 27,7 72,3 ± 26,9 P a CO 2 (mmHg) 43 ± 2,8 43,2 ± 4,7 HCO 3 (mEq/l) 27,2 ± 2,8 26,9 ± 1,6 Glucosa (mg/dl) 83,5 ± 6,6 87,3 ± 8,8 Hemoglobina glicosilada (%) 5,4 ± 0,1 5,2 ± 0,3 Colesterol Total(mg/dl) 188,2 ± 31,3 174 ± 46,4 HDL (mg/dl) 62,6 ± 13,4 53,9 ± 14,5 LDL (mg/dl) 106 ± 29,1 103 ± 39,2 Triglicéridos (mg/dl) 97,6 ± 30,7 84,4 ± 30,1 ApoA (mg/dl) 171,6 ± 29,3 155,4 ± 38,3 ApoB (mg/dl) 90,2 ± 28,1 89,6 ± 29,8 PCR (mg/dl) 0,20 ± 0,15 0,45 ± 0,78 ApoA: apolipoproteína A; ApoB: apolipoproteína B; CT 90 : porcentaje de tiempo de tiempo con saturación de oxígeno por debajo del 90 %; HCO 3 : bicarbonato; IAH: índice de apneas e hipopneas; IMC: índice de masa corporal; P a CO 2 : presión parcial arterial de dióxido de carbono; P a O 2 : presión parcial arterial de oxígeno; PCR: proteína C-reactiva; SatO 2 : saturación de oxígeno. Valores expresados como media y desviación estándar. U de Mann Whitney; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 110 | P á g i n a La pérdida de peso modificó tanto los parámetros antropométricos como los gasométricos y bioquímicos en ambos grupos respecto a la primera visita. Aunque en ambos grupos las diferencias fueron estadísticamente significativas, fueron mucho mayores en el grupo de pacientes con AOS (Tabla 11). En el anexo 8 se muestran las diferencias evolutivas con respecto a la visita a los 6 meses precirugía. Tabla 11. Impacto de la cirugía bariátrica en la última visita respecto a la primera visita Sin AOS (n = 9) Con AOS (n = 15) VISITA BASAL VISITA A LOS 12 MESES POSTCIRUGÍA VISITA BASAL VISITA A LOS 12 MESES POSTCIRUGÍA IMC (kg/m 2 ) 42 ± 1,5 32, 1 ± 2,5 *** 42 ± 3,1 30,5 ± 3,9 *** Perímetro cervical (cm) 40,4 ± 3,4 37,1 ± 3,4 *** 44,6 ± 4,1 38,9 ± 4,6 *** Perímetro abdominal (cm) 118,4 ± 14,7 103,4 ± 7,9 *** 127,8 ± 12,8 102,9 ± 11,2 *** Índice cintura-cadera 0,87 ± 0,14 0,88 ± 0,09 0,99 ± 0,12 0,94 ± 0,08 * IAH (eventos/h) 4,5 ± 3 2,2 ± 1,7 35,5 ± 21,7 9,5 ± 14,5 *** CT 90 (%) 1,7 ± 1,7 1,3 ± 3,6 30,4 ± 23,9 15,7 ± 23,3 * SatO 2 media (%) 94,3 ± 1,1 94,7 ± 1 91,2 ± 2,1 93 ± 2,2 * Glucosa (mg/dl) 100,1 ± 8,4 83,5 ± 6,6 ** 113 ± 14,6 87,3 ± 8,8 *** Hemoglobina glicosilada (%) 5,7 ± 0,4 5,4 ± 0,1 * 5,9 ± 0,4 5,2 ± 0,3 *** Colesterol Total(mg/dl) 180,8 ± 26,2 188,2 ± 31,3 186 ± 29,3 174 ± 46,4 HDL (mg/dl) 53 ± 8,6 62,6 ± 13,4 * 46,9 ±11,6 53,9 ± 14,5 * LDL (mg/dl) 106,2 ± 27,8 106 ± 29,1 111 ± 31,7 103 ± 39,2 Triglicéridos (mg/dl) 107,5 ± 38,9 97,6 ± 30,7 * 138,8 ± 59,4 84,4 ± 30,1 *** ApoA (mg/dl) 143,4 ± 18 171,6 ± 29,3* 137,2 ± 26,2 155,4 ± 38,3 * ApoB (mg/dl) 92,7 ± 20,5 90,2 ± 28,1 104,2 ± 25,4 89,6 ±29,8 * PCR (mg/dl) 0,86 ± 0,61 0,20 ± 0,15 ** 0,71 ± 0,45 0,45 ± 0,78 * ApoA: apolipoproteína A; ApoB: apolipoproteína B; CT 90 : porcentaje de tiempo de tiempo con saturación de oxígeno por debajo del 90 %; HCO 3 : bicarbonato; HDL: lipoproteína de alta densidad; IAH: índice de apneas e hipopneas; IMC: índice de masa corporal; LDL: lipoproteína de baja densidad; P a CO 2 : presión parcial arterial de dióxido de carbono; P a O 2 : presión parcial arterial de oxígeno; PCR: proteína C-reactiva; SatO 2 : saturación de oxígeno. Valores expresados como media y desviación estándar. Wilcoxon; * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. ––––––––––––––––– 5. R ESULTADOS P á g i n a | 111 5.3.2. Evolución de la expresión de micro-RNA en la última visita En la última visita desaparecen las diferencias entre el grupo de pacientes con AOS y el grupo de pacientes sin AOS. A diferencia de lo ocurrido entre la primera y la segunda visita, entre la segunda y la última visita tan solo aparece el incremento significativo en la expresión de miR146 (Figura 40). Este miRNA recupera su expresión de la primera visita. Las diferencias tan solo acontecen en el grupo de pacientes con AOS. La variación de la SatO 2 media, dentro los parámetros del sueño, fue el único que demostró una relación significativa con la diferencia en la expresión de miR145 y miR16 (FC de la primera visita y FC de la última visita). En el caso del miR145, el incremento relativo de SatO 2 media se tradujo en un mayor descenso de este miRNA. El miR16 experimentó una relación similar, aunque de sentido contrario, es decir, el incremento de SatO 2 media aumentó el miRNA. La variación de los parámetros antropométricos, en concreto del perímetro abdominal, fue lo que más influyó en la variación tanto del miR21 como del miR223 y el miR320 (Figura 41). La expresión de miR223 también se ve influida por la pérdida de peso (IMC). J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 112 | P á g i n a Figura 40. Evolución de la expresión de micro-RNA en las distintas visitas en los pacientes con obesidad mórbida sin apnea obstructiva del sueño (AOS) y con AOS. Efecto del tratamiento con presión positiva continua en la vía aérea y cirugía bariátrica A: OM sin AOS. B: OM con AOS. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001. ––––––––––––––––– 5. R ESULTADOS P á g i n a | 113 Figura 41. Relación entre la pérdida de peso relativo tras la cirugía bariátrica y los cambios en la expresión de microRNA SatO 2 : saturación de oxígeno. En el grupo de pacientes sin AOS, la reducción en el IAH implicó un aumento tanto del miR16 como del miR320. Dentro del grupo de pacientes con AOS, el aumento de la SatO 2 media fue la variable que mejor predijo el incremento de miR145 y miR223. En este grupo de pacientes, cuanto mayor fue la pérdida de perímetro abdominal mayor fue el incremento de miR21 y miR320 (Figura 42). J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 114 | P á g i n a Figura 42. Relación de la variación relativa de los parámetros del sueño tras la cirugía bariátrica y los cambios en la expresión de micro-RNA en pacientes con obesidad mórbida (OM) sin apnea obstructiva del sueño (AOS) y con AOS IAH: índice de apneas e hipopneas; SatO 2 : saturación de oxígeno. A: OM sin AOS. B: OM con AOS. ––––––––––––––––– 5. R ESULTADOS P á g i n a | 115 5.3.3. Relación de los micro-RNA exosomales con los parámetros antropométricos y bioquímicos En la última visita, un año después de la CB y con la pérdida de peso conseguida, observamos algunas relaciones no expresadas en la primera visita. Esas relaciones aparecen únicamente con el miR223 (Figura 43). Vemos cómo el aumento en el IAH se traduce en una menor expresión de miR223, mientras que el aumento de la SatO 2 aumenta la expresión de este miRNA. El resto de los miRNA no mostraron relación en esta última visita con ninguno de los parámetros de la poligrafía nocturna. Figura 43. Relación de la expresión del miR223 exosomal con los parámetros del sueño en la última visita IAH: índice de apneas e hipopneas; SatO 2 : saturación de oxígeno. Tras la pérdida de peso inducida por la CB, a diferencia de lo ocurrido en las visitas previas, el IMC mostró relaciones significativas con el miR16, el miR21 y el miR223 (Figura 44). En la última visita, la pérdida de peso redujo el IAH y tan solo 3 pacientes mantuvieron un IAH por encima de 10, motivo por el cual se decidió no realizar un análisis de regresión con los grupos con AOS y sin AOS. En esta última visita no se establecen conexiones entre los parámetros de la gasometría arterial y los miRNA analizados. J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 116 | P á g i n a Figura 44. Relación de la expresión de micro-RNA exosomales con los parámetros antropométricos en la última visita IMC: índice de masa corporal. Tras la pérdida de peso 12 meses después de la CB, se establecieron llamativas relaciones en el conjunto de la muestra. En esta visita la glucosa no mostró relaciones con ninguno de los miRNA en estudio. El incremento de la hemoglobina glicosilada tras la pérdida de peso se relacionó con un descenso de distintos miRNA: miR133 (r 2 = 0,352; p = 0,025), miR145 (r 2 = 0,199; p = 0,042) y miR146 (r 2 = 0,208; p = 0,028) (Figura 45). En esta tercera visita, cabe mencionar la relación de la hemoglobina glicosilada con el miR223, que no alcanzó la significación estadística al retirar los outliers (r 2 = 0,127; p = 0,069). Dado que al finalizar la prueba solo hubo 3 pacientes con AOS, no se buscaron las relaciones en este grupo. ––––––––––––––––– 5. R ESULTADOS P á g i n a | 117 Figura 45. Relación de los parámetros del perfil glucémico con micro-RNA exosomales en la última visita En la última visita pudimos observar cómo los niveles de colesterol se relacionaron significativamente con la expresión de miR145 (r 2 = 0,228; p = 0,028), con un sentido inversamente proporcional, es decir, a medida que aumentaba la concentración de colesterol total, disminuía la expresión de miR145. Con este miRNA observamos una relación similar, en el límite de la significación estadística, con la concentración de ApoA (r 2 = 0,179; p = 0,050). El incremento de los triglicéridos disminuyó la expresión de miR320 (r 2 = 0,242; p = 0,017). Todas las relaciones se muestran en la Figura 46. La ApoA, que en otras visitas demostró correlaciones con algunos miRNA, en esta ocasión no lo hizo; aunque destacamos las observadas con el miR21 (r 2 = 0,158; p = 0,055) y el miR146 (r 2 = 0,151; p = 0,06) (resultados no representados en las gráficas). Al igual que ha ocurrido con el resto de los parámetros, no se pudo realizar el análisis comparativo entre los pacientes con AOS y sin AOS. J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 124 | P á g i n a miR320 y el miR126 los que arrojan las mayores diferencias (anexo 10). Aunque los miRNA que se han estudiado son los mismos en ambos grupos, los experimentos para su análisis, aunque han seguido la misma metodología, son distintos. Este hecho podría justificar las diferencias tan elevadas observadas en las tasas de cambio. Para dilucidar definitivamente si la obesidad tiene un papel fundamental en la expresión de estos y otros miRNA exosomales, se hace necesario analizarlos con la misma metodología. 6.3. I NFLUENCIA DE LA APNEA OBSTRUCTIVA DEL SUEÑO SOBRE LA RELACIÓN DE LOS PARÁMETROS ANTROPOMÉTRICOS Y BIOQUÍMICOS CON LA EXPRESIÓN DE MICRO -RNA EXOSOMAL CIRCULANTE El análisis de los parámetros antropométricos demostró que los que más relación guardan con la obesidad (perímetro abdominal e índice cintura-cadera) establecieron las mejores relaciones con la expresión del miR146, independiente de la coexistencia de AOS. Los parámetros antropométricos influyeron de manera determinante en la expresión de un miRNA en concreto, el miR146. En el estudio de regresión lineal vimos cómo a mayor perímetro cervical, índice cintura-cadera y, en especial, perímetro abdominal, la expresión de miR146 disminuía. Este efecto se mantuvo tanto en el grupo de pacientes con AOS como en el de los pacientes sin AOS, por lo que su presencia no afecta a la expresión de dicho miRNA. El miR146 se ha relacionado con la obesidad, así como con procesos antiinflamatorios y aterogénicos (222, 223). Pero esta relación ha arrojado resultados contradictorios. El trabajo llevado a cabo por Hijmans et al. (224) sobre 45 pacientes sanos (15 no obesos, 15 con sobrepeso y 15 obesos) demostró que los pacientes con obesidad y sobrepeso presentaban una menor expresión de RNA total en suero. Establecen además una relación negativa con el IMC, pero no encuentran relación ni diferencias en su expresión en función del perímetro abdominal. Otro estudio (225), sobre niños y adultos asiáticos obesos, para buscar miRNA de riesgo de padecer DM en al edad adulta, demostró una relación positiva entre el IMC y la expresión de miR146a y miR146b, con una sobreexpresión de estos en los niños obesos en comparación con los controles no obesos, así como en los adultos no obesos con DM. Los resultados de nuestro estudio siguen la línea del trabajo de Hijmans, si bien en nuestro caso no se logra alcanzar la significación estadística entre el IMC y la expresión de miR146, pero sí con el resto de parámetros antropométricos. En síntesis, en pacientes con OM existe una relación significativa entre el perímetro abdominal y la expresión de miR146. Esta relación es independiente de la existencia de AOS. ––––––––––––––––– 6. D ISCUSIÓN P á g i n a | 125 En nuestro estudio no hemos encontrado ninguna relación entre el perímetro cervical y la expresión de miRNA exosomal. Proseguimos el análisis con los parámetros gasométricos. Vimos cómo los valores relacionados con la hipoventilación (P a CO 2 y bicarbonato) estaban vinculados con el miR16 y el miR21 en el conjunto de la muestra. Tan solo los pacientes con OM y AOS mantuvieron esas relaciones y, además, añadieron la influencia de la concentración de bicarbonato sobre el miR320 (con la P a CO 2 no se alcanzó la significación estadística). Esos miRNA ven aumentada su expresión a medida que se incrementa la P a CO 2 y el bicarbonato. El siguiente punto del análisis lo constituyen las relaciones observadas de la expresión de miRNA con los parámetros del perfil glucémico. El 60 % de los pacientes con AOS presentaban DM, mientras que tan solo un paciente (11,1 %) del grupo sin AOS era diabético. Los parámetros utilizados para analizar la DM fueron la glucosa y la hemoglobina glicosilada. De nuestro análisis se desprende que, en aquellos individuos en los que coexisten OM y AOS, el incremento en la concentración de glucosa y hemoglobina glicosilada aumenta la expresión de miR34. Los pacientes con OM pero sin AOS no mostraron esta relación, y el conjunto de pacientes con OM tampoco. Otros investigadores han analizado el papel de los miRNA circulantes o extracelulares en la obesidad, los estados prediabéticos y la DM insulinodependiente y no insulinodependiente. Dentro de la batería de miRNA, la sobreexpresión de miR34 se ha observado en pacientes obesos o en situaciones de DM (226). En la primera visita pudimos comprobar cómo los niveles de glucosa y hemoglobina glicosilada se relacionaron con el miR21, el miR146 y el miR320. El incremento tanto de la glucosa en ayunas como de la hemoglobina glicosilada dio lugar a un descenso en la expresión de miR21 en el grupo de pacientes sin AOS, si bien las diferencias no alcanzaron la significación estadística. El miR21 se ha relacionado con los estados prediabéticos y con la DM tipo 2; sin embargo, su relación con los parámetros del perfil glucémico no se ha podido determinar en un sentido o en otro (226). De igual forma, tanto el miR146 como el miR320 vieron reducida su expresión a medida que aumentaban los valores de hemoglobina glicosilada sin alcanzar la significación estadística. Al igual que el miR21, la relación de ambos con la DM (prediabetes y DM tipo 2) también se ha documentado, aunque tampoco se ha aclarado la dirección de esta relación (226). Para terminar el análisis del perfil glucémico, queremos incidir en las limitaciones que presenta nuestro estudio debido al escaso número de pacientes incluidos, en especial en el J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 126 | P á g i n a grupo de pacientes con OM y AOS y sin DM. No obstante, podemos concluir que la coexistencia de OM y AOS influye en los parámetros del perfil glucémico y su relación con el miR34. Dentro del marco del análisis de las relaciones entre el miRNA exosomal y los parámetros bioquímicos, continuamos con el análisis del perfil lipídico. Los pacientes con AOS no presentaron diferencias significativas en los parámetros analizados del perfil lipídico ni en el grupo de quienes acudieron a la primera visita ni entre quienes completaron todo el estudio. No obstante, las diferencias no fueron homogéneas en todos los parámetros. En el caso de la ApoA, vimos que los pacientes con AOS que completan el estudio tenían menor cantidad de esta proteína que los pacientes sin AOS; por el contrario, en el grupo de pacientes que no completan el estudio esta relación se invierte. Esta diferencia resulta difícilmente explicable, ya que lo esperable (tanto por los datos encontrados en la bibliografía como por la relación entre la AOS y la aterosclerosis) es que los niveles de ApoA sean superiores en los pacientes sin AOS (227, 228). Nuestro análisis demuestra que el incremento en la concentración de colesterol total y LDL se traduce en un descenso en la expresión de miR145. Un experimento analizó el efecto de las fuerzas de cizallamiento, factor proaterogénico, sobre la expresión de miR143/145 en cultivos de células endoteliales humanas y de músculo liso. En él se observó que dicho estímulo induce, por un lado, una mayor expresión del complejo miR143/145 y, por otro, mayor empaquetamiento exosomal de ese complejo de miR143/145, cuyo destino son las células de la musculatura lisa vascular de proximidad. Una vez en su interior, inducen cambios fenotípicos en la célula de músculo liso y la protegen de la formación de placas de ateroma (229). Nuestros resultados señalarían la dirección marcada en este último trabajo, ya que el aumento de colesterol total y LDL, ambos factores proaterogénicos, se traduce en una menor expresión de miR145 exosomal circulante. En ese sentido, vimos cómo esta relación, esta vez tan solo entre el colesterol total y el miR145, tan solo se observó en el grupo de pacientes con AOS. Para terminar el análisis del perfil lipídico en la primera visita, estudiamos el papel de la ApoA. Esta lipoproteína es el principal componente de la HDL, lo que hace que el aumento en su concentración se considere un efecto positivo y ateroprotector. En nuestras observaciones comprobamos cómo el aumento en la concentración de ApoA se tradujo en una ampliación en la expresión del miR146 en el conjunto de la muestra; y, en el grupo de pacientes con AOS, del miR126. ––––––––––––––––– 6. D ISCUSIÓN P á g i n a | 127 El miR146 tiene una actividad antiinflamatoria (171, 179). Los estudios de Cheng et al. (101, 171) señalan la acción inhibidora sobre el NF-κB, entre otras, como responsable de este efecto antiinflamatorio. Esos estudios afirman que la sobreexpresión de miR146 aparece como respuesta al incremento de citocinas proinflamatorias, actúa, como dicen Cheng et al. (101), como un «freno». La expresión de miR146 está aumentada en las células endoteliales del fenómeno aterogénico (230). Dicho incremento se entiende como un mecanismo de respuesta para controlar la inflamación que lleva a la formación de la placa de ateroma. El otro miRNA que mostró una relación significativa con la ApoA fue el miR126, que aumenta con el incremento de los niveles de ApoA en el grupo de pacientes con OM y AOS. La expresión de miR126 desempeña un papel antiinflamatorio y ateroprotector (231). La relación de este miRNA con las lipoproteínas se ha estudiado en el contexto del papel que esas moléculas, en concreto las HDL, adquieren como transportadores de miRNA (118, 232, 233). De las evidencias mostradas por los miRNA exosomales y los parámetros del perfil lipídico, podemos concluir que la coexistencia de OM y AOS induce un vínculo entre ambos, que no se da en pacientes sin AOS. 6.4. E FECTO DEL TRATAMIENTO CON PRESIÓN POSITIVA CONTINUA EN LA VÍA AÉREA SOBRE LA CARGA DE MICRO -RNA EXOSOMAL En nuestro estudio, como vimos en la Figura 32, los pacientes con AOS que han estado en tratamiento con CPAP experimentaron un descenso significativo de los miRNA exosomales: el miR16, el miR21, el miR126 y el miR320. Este hecho no se puso de manifiesto en el grupo de pacientes sin AOS. Dicha variación en la expresión de los miRNA, inducida por el tratamiento con la CPAP, hizo que, en esta segunda visita, desapareciesen las diferencias observadas en la primera visita entre los pacientes con AOS y sin AOS. El efecto que el tratamiento con CPAP tiene sobre los exosomas y la expresión de miRNA circulante ya se ha estudiado (187, 234-237). Los trabajos procedentes del estudio HIPARCO (187, 236) demostraron que con 3 y 6 meses de tratamiento con CPAP ya se producían variaciones significativas en ellos. Aunque los resultados señalan en la misma dirección hay que tener en cuenta que el estudio HIPARCO analiza miRNA libre circulante mientras que el nuestro lo hace con miRNA contenido en los exosomas. Como se acaba de comentar, el efecto positivo del CPAP sobre la expresión de miRNA circulante ya se ha descrito. No obstante, tan solo en dos de esos trabajos se analiza el efecto que la CPAP tiene en pacientes con OM (235, 237). Ambos estudios tienen como objetivo J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 128 | P á g i n a principal analizar el comportamiento de los exosomas circulantes en sujetos con síndrome de hipoventilación y obesidad y, aunque evidencian diferencias en ellos, tan solo el trabajo de Bhattacharjee et al. (237) aporta información sobre el contenido que transportan. Este trabajo, llevado a cabo sobre 12 pacientes, en su mayoría afroamericanos, indica que el tratamiento con un dispositivo de CPAP o de bipresión positiva en las vías respiratorias (bilevel positive airway pressure, BiPAP) modificó la expresión de los miRNA exosomales, entre los que se encontraba el miR16. Estos hallazgos, junto con los trabajos citados en el párrafo anterior, validan nuestros resultados. Pudimos comparar el efecto de la CPAP en pacientes con y sin OM gracias a los pacientes del estudio EPIOSA. Vemos cómo el tratamiento con CPAP en pacientes con OM modifica un mayor número de miRNA exosomales (miR21, miR126 y miR320), mientras que en el grupo de pacientes de EPIOSA el tratamiento con la CPAP tan solo modifica la expresión del miR145. Este punto merece un comentario aparte, ya que, en el estudio original, los pacientes del grupo con AOS se subdividen en cuatro grupos: AOS con aterosclerosis subclínica y sin ella y con tratamiento con CPAP y sin él. En los pacientes con AOS sin aterosclerosis tratados con CPAP se modifica la expresión de miR320 (206). Estas diferencias vienen determinadas por las características basales de ambos grupos y el efecto de la obesidad sobre la expresión de miRNA exosomales. También fue objeto de análisis la modificación en los parámetros antropométricos y bioquímicos a los 6 meses, tanto en pacientes con AOS como en pacientes sin AOS. En la visita de los 6 meses observamos cómo el grupo de pacientes que estaba en tratamiento con CPAP mantuvieron sus parámetros antropométricos. Este hecho no ocurrió con los pacientes que no padecían AOS, quienes experimentaron un incremento significativo en todas las medidas, a excepción del IMC. El IMC en este grupo de pacientes aumento 1,1 kg/m 2 sin alcanzar la significación estadística. El efecto que el tratamiento de la AOS con CPAP tiene sobre el IMC ya se ha estudiado. En este sentido, el trabajo de Myllylä et al. (238) demuestra que la adherencia al tratamiento con CPAP no evita la ganancia ponderal en pacientes con OM, pero sí que consigue atenuarla. Otros estudios han demostrado que el uso de CPAP no es capaz de reducir el IMC y que incluso lo puede aumentar con respecto al placebo (sham CPAP) (239, 240). El objetivo principal de nuestro estudio no fue analizar el efecto concreto de la CPAP sobre los parámetros antropométricos, pero en los que la utilizaron no se produjo esa ganancia ponderal. Al igual que en la primera visita, comenzamos el análisis de los parámetros bioquímicos con el perfil glucémico. La glucosa se mantuvo constante en ambos grupos en la segunda visita. Por el contrario, la hemoglobina glicosilada aumentó en los pacientes con AOS sometidos a ––––––––––––––––– 6. D ISCUSIÓN P á g i n a | 129 tratamiento con CPAP. Pese a la evidente relación existente entre AOS y DM, el tratamiento del primero no parece alterar ni el nivel de glucemia en ayunas ni la hemoglobina glicosilada, aunque sí que parece reducir la resistencia a la insulina (241, 242). Tres de los miRNA (miR16, miR21 y miR320) que experimentaron un descenso significativo por la acción de la CPAP mostraron novedosas relaciones con los niveles de glucosa en el conjunto de la muestra. El incremento en la concentración de glucosa disminuyó la expresión de estos miRNA. El grupo de pacientes con OM sin AOS, a diferencia de lo observado en la primera visita, dio cuenta de novedosas relaciones. En este grupo el miR16 y el miR320 disminuyeron su expresión a medida que aumentaba la concentración tanto de glucosa como de hemoglobina glicosilada. En el grupo de pacientes con OM y AOS desaparece la relación observada en la primera visita entre el miR34 y los parámetros del perfil glucémico. Además, este grupo de pacientes experimentó un incremento de la expresión de miR145 a medida que aumentaron los niveles de hemoglobina glicosilada. Este miRNA ha sido relacionado con el diagnóstico de disfunción de células  pancreáticas en pacientes no diabéticos que acabaron desarrollando una situación de pre-DM tipo 2 a los 3 años (243). De esta forma, el miR145, junto con otros miRNA (como el miR21 o el miR223, entre otros), actuarían como predictores, muy precoces, del riesgo de padecer DM. En resumen, vemos cómo el tratamiento con CPAP actúa de manera determinante sobre la relación de los miRNA exosomales y su relación con los parámetros del perfil glucémico estudiados. Los parámetros del perfil lipídico también mostraron diferencias llamativas que pasamos a discutir a continuación. Los individuos con OM y sin AOS experimentaron un aumento significativo en la concentración de ApoA respecto a la primera visita. Achacamos este hecho al tratamiento con hipolipemiantes, ya que en la primera visita tan solo un paciente del grupo sin AOS usaba estos fármacos y, en esta segunda visita lo hacen 4 pacientes más. Uno de los efectos del tratamiento con estatinas es el aumento en la concentración de ApoA (244-246). En esta segunda visita se actualizan las relaciones entre los parámetros del perfil lipídico. El miR223 presenta una relación significativa con los niveles de ApoA en la segunda visita, tan solo en el conjunto de la muestra. Gracias a los trabajos de Vickers et al., conocemos el papel que este miRNA juega en la homeostasis del colesterol, así como su unión con las moléculas HDL para su transporte (119, 247). En sus experimentos sobre cultivos de hepatocitos humanos, describe cómo la sobreexpresión de miR223 inhibe la biosíntesis de colesterol, así J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 130 | P á g i n a como su captación, y favorece la salida a través del ATP binding casette transport A1 (ABCTA1). Esta vía de salida hace que el colesterol se una a la ApoA1, favoreciendo, por tanto, la formación de HDL, tanto en los hepatocitos como en los macrófagos cargados de lípidos del tejido periférico (248). También vimos cómo el miR146 aumentaba su expresión con el incremento de ApoA en los pacientes con OM y sin AOS. En los experimentos con ratones que no expresaban miR146, más allá de las diferencias en la formación de placa frente a aquellos que sí lo expresaron, encontraron que aumentaban los niveles de citocinas proinflamatorias circulantes, como TNF-α o IL-6; se alteraba la producción, en la médula ósea, de células aterogénicas (descenso de monocitos Ly6 hi , neutrófilos y células T con efecto proaterogénico; incremento de monocitos Ly6 lo con efecto protector); y disminuían los niveles de todo el perfil lipídico, en especial de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y LDL (101). La relación del miR34 con los triglicéridos se invirtió respecto a la primera visita. Antes de iniciar el tratamiento con CPAP, la relación positiva se dio en el conjunto de la muestra. Sin embargo, en esta segunda visita, el aumento en la concentración de triglicéridos disminuyó la expresión de miR34. En esta ocasión, esta relación se vio tanto en el conjunto de la muestra como en el grupo de pacientes sin AOS; ahora bien, el grupo de pacientes con AOS y en tratamiento con CPAP exhibe una relación en el mismo sentido que los pacientes sin AOS, pero sin alcanzar la significación estadística. El único cambio con respecto a la primera visita es el aumento de la concentración de ApoA, que achacamos al aumento en el uso de hipolipemiantes, y el uso de la CPAP en el grupo de AOS. Los niveles de miR34 no experimentaron una variación significativa en esta segunda visita, por lo que la AOS no parece jugar un papel fundamental en esta relación. Otro de los miRNA que establecieron novedosas relaciones fue el miR133. Este miRNA mostró conexiones con la concentración de ApoA en el conjunto de la muestra y con los triglicéridos en el grupo de pacientes con OM sin AOS. Estos hallazgos no se encontraron en la primera visita. El miR133 se considera un miRNA con efecto protector frente al desarrollo de aterosclerosis (169). En la revisión realizada, los estudios encontrados muestran una relación entre la concentración de LDL y miR133. El primer estudio demuestra cómo la acción del miR133 en los macrófagos CD36 impide, a través de la vía del testicular orphan nuclear receptor 4 (TR4), la entrada de oxi-LDL, evitando de esta forma la transformación del macrófago en célula espumosa y su posterior depósito en la placa de ateroma (249). Otro estudio llevado a cabo en pacientes con DM tipo 2 con y sin enfermedad coronaria demostró que aquellos que padecían la enfermedad coronaria presentaban una relación directamente proporcional entre los niveles de LDL y la expresión de miR133 circulante (250). Estos ––––––––––––––––– 6. D ISCUSIÓN P á g i n a | 131 hallazgos sugieren que el incremento de miR133 actuaría como factor protector frente al desarrollo de aterosclerosis. Nuestros resultados sugieren que el incremento de miR133 podría estar causado por el incremento de ApoA, e indirectamente por las HDL, con una función claramente preventiva frente a la aterosclerosis. El grupo de pacientes sin AOS, en la segunda visita, fue el que más relaciones demostró: el miR126 con el colesterol total, las LDL y la ApoA, y el miR145 con los triglicéridos y la ApoA. En la primera visita, el miR126 resultó estar conectado con el incremento de ApoA únicamente en el grupo de pacientes con AOS. Por el contrario, en la segunda visita, tras la acción de la CPAP, esos hallazgos en el grupo con AOS desaparecieron. Sin embargo, se mantuvieron en el grupo de pacientes sin AOS. Como hemos comentado previamente, el papel del miR145 en el metabolismo lipídico y su relación con la aterosclerosis no están claros. En esta segunda visita, desaparece la concordancia observada en el grupo de pacientes con AOS y, por extensión, en el conjunto de la muestra. Nuevamente, atribuimos al tratamiento con hipolipemiantes los hallazgos en el grupo de pacientes sin AOS en esta segunda visita. Concluimos, por tanto, que el tratamiento con la CPAP hizo desaparecer la concordancia entre el miR145 y el colesterol total; y, probablemente, la relación entre este y las LDL. En definitiva, podemos concluir que el tratamiento con CPAP modifica las conexiones establecidas en la primera visita entre distintos miRNA exosomales y determinados parámetros del perfil lipídico. 6.5. E FECTO DE LA CIRUGÍA BARIÁTRICA SOBRE LA CARGA DE MICRO -RNA EXOSOMAL Con la CB se produjo la mayor pérdida de peso, con una caída de 11 kg/m 2 en el conjunto de la muestra, lo que supone una pérdida del 25 % del exceso de peso en el conjunto de la muestra. Los pacientes con AOS experimentaron una caída mayor que los pacientes sin AOS, si bien estas diferencias no fueron significativas. La caída del resto de los parámetros antropométricos fue similar en ambos grupos, a excepción de la reducción del perímetro cervical, que fue significativamente mayor en el grupo de pacientes con AOS. La pérdida de peso en nuestro trabajo es similar a lo descrito en la revisión bibliográfica. La mayor pérdida de peso se alcanza en el primer año y, aunque puede proseguir en el segundo, ya se mantiene a lo largo de los años (87, 251). J AVIER L ÁZARO S IERRA ––––––––––––––––– 132 | P á g i n a En la última visita, con respecto a la primera, hubo diferencias significativas en el miR16, el miR21, el miR126 y el miR320. Sin embargo, no podemos achacar a la pérdida de peso esas diferencias, ya que el tratamiento con CPAP fue el responsable de ellas. Tan solo se produjo una variación significativa respecto a la segunda visita, en relación con el miR146. Ese miRNA había experimentado en los pacientes con OM y AOS un descenso significativo respecto a la primera visita, mientras que con la pérdida de peso recuperó la expresión de esa primera visita. Estos resultados, desde nuestro punto de vista, y tras la revisión de la literatura, no se han descrito previamente. Hasta la fecha tan solo hemos encontrado dos trabajos que analicen los miRNA exosomales en pacientes con OM antes y después de CB (252, 253). El trabajo de Hubal et al. (252) fue llevado a cabo en 6 mujeres afroamericanas en las que se analizaron los miRNA exosomales derivados de los adipocitos y su influencia sobre la resistencia a la insulina. A diferencia de nuestro estudio, realizan un microarray, en el que seleccionan miRNA que actúan sobre mRNA que participan en la resistencia a la insulina. De entre todos los miRNA que mostraron cambios significativos tras la CB, destacan el miR16 y el miR125. Ambos actúan selectivamente sobre 37 mRNA relacionados con la señalización de la insulina, pero solo se establece una correlación significativa entre la variación del miR16 y la mejoría de la resistencia a la insulina un año después de la CB. En el otro estudio, llevado a cabo por Bae et al. (253), se analizó el comportamiento de 12 pacientes con OM no diabéticos ni hipertensos, antes de la CB y 6 meses después. Utilizan como controles a un grupo de voluntarios sanos. En su análisis, demuestran que la pérdida de peso inducida por la CB modifica la expresión de miRNA exosomales. Ambos estudios no analizan la influencia de la AOS en sus resultados. En nuestro grupo de pacientes también observamos estas variaciones entre la visita inicial y la de un año después de la CB. Sin embargo, esas diferencias no se reproducen en el grupo de pacientes sin AOS, pero sí en aquellos que sufren apneas. Como conclusión, pensamos que dichos miRNA vienen determinados por la existencia de AOS y no por la obesidad. Otro estudio analizó la evolución temporal de los miRNA circulantes en los 12 primeros meses después de la CB (142). Entre los miRNA que modificaron su expresión se encontraron el miR16, que se modificó a los 9 meses, y el miR21 y el miR320, que lo hicieron en la última visita, coincidiendo con la mayor pérdida de peso. Una vez más, no se tuvo en cuenta la existencia de AOS. En nuestra revisión han sido múltiples los miRNA circulantes que se ven alterados por la pérdida de peso inducida por la CB, pero el miR320 es el que con más frecuencia aparece como alterado (142, 144, 254). ––––––––––––––––– 6. D ISCUSIÓN P á g i n a | 133 Respecto a las diferencias en esta última visita entre pacientes con AOS y sin AOS en cuanto a la expresión de miRNA, no se establecieron. Entendemos que la ausencia de diferencias en este sentido puede deberse al descenso del IAH inducido por la propia pérdida de peso. Ello hace, como se muestra en los resultados del grupo de pacientes con AOS, que tan solo queden 3 pacientes con un IAH superior a 10. Dado que 3 individuos es un número muy escaso para elaborar análisis estadístico, no se llevó a cabo. Sin embargo, si revisamos los resultados del estudio EPIOSA, se establecen diferencias significativas en el miR21, el miR126, el miR223 y el miR320 (206). En esta última visita se estableció una relación positiva entre la SatO 2 media y el miR223. Este hallazgo iría en línea con los hallazgos de la primera visita, en la que la expresión de miR223 fue menor en pacientes con AOS, algo que ha sido descrito en modelos in vitro e in vivo (190). La variación relativa de la SatO 2 media fue el único parámetro del sueño que demostró influir de manera determinante en la variación de los miRNA respecto a la primera visita. En este caso, fueron el miR16 y el miR145 los que demostraron estar influidos por la variación de la SatO 2 media. En el grupo de pacientes con OM y sin AOS, el incremento relativo del IAH determinó el descenso en la expresión de miR16 y miR320 respecto a la primera visita. Este resultado, aunque significativo, tiene escasa explicación técnica, ya que la variación del IAH, en pacientes con OM y sin AOS, no presenta diferencias significativas respecto a la primera visita. Por el contrario, en el grupo de pacientes con AOS, el incremento en la SatO 2 media aumentó la expresión del miR145 y el miR223. Con la pérdida de peso experimentada después de la CB, el IMC alcanzó un protagonismo que no obtuvo en la primera visita. El miR146, que había establecido significativas relaciones con el resto de los parámetros antropométricos, en esta ocasión no manifestó ninguna. El IMC en esta visita presentó una correlación negativa con la expresión de miR16, miR223 y miR21; este último, además también mostró una correlación igualmente negativa con el perímetro abdominal. La variación en los parámetros antropométricos, en especial del perímetro abdominal, influyó en el descenso en la expresión de miR21, miR320 y miR223; sobre este último, también influyó la pérdida relativa de IMC. Estos hallazgos solo se describieron en los pacientes que inicialmente se incluyeron en el grupo de AOS. La relación entre el miR223 y el IMC se ha descrito en un grupo de niños obesos (255). Al finalizar el estudio se establecieron relaciones significativas entre algunos miRNA y la hemoglobina glicosilada. El incremento de los niveles de hemoglobina glicosilada disminuyó significativamente la expresión de miR133. Este miRNA participa en la homeostasis de la P á g i n a | 141 B IBLIOGRAFÍA P á g i n a | 143 BIBLIOGRAFÍA 1. 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