Caracterización proteómica de venenos de serpientes de interés biomédico

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERIA AGRONÓMICA Y DEL MEDIO NATURAL Caracterización proteómica de venenos de serpientes de interés biomédico TRABAJO DE FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA CURSO 2015-2016 AUTOR: JOSE MUNUERA MORA DIRECTOR: JUAN JOSÉ CALVETE CHORNET TUTOR: MARÍA PILAR LÓPEZ GRESA VALENCIA, JULIO 2016 Datos del trabajo Título: Caracterización proteómica de venenos de serpientes de interés biomédico Autor: Jose Munuera Mora Localidad y fecha: Valencia, Julio de 2016 Director: Juan José Calvete Chornet Tutor: María Pilar López Gresa Tipo de licencia: Licencia Creative Commons. “Reconocimiento no Comercial Sin Obra Derivada”. Resumen Actualmente las serpientes venenosas están extendidas por prácticamente todo el mundo provocando que los problemas derivados por las mordeduras de estas serpientes sean de gran importancia. No obstante, este problema se acentúa mayoritariamente en países subdesarrollados y zonas rurales con pocos recursos económicos, con lo que se convierte en un problema infravalorado en las zonas más desarrolladas y con mayor capacidad de investigación en este ámbito. Por ello es importante seguir investigando en este campo para desarrollar los únicos tratamientos eficaces contra las mordeduras de serpientes venenosas, los antivenenos. En este trabajo se busca caracterizar venenos de serpientes del género Naja, la mayoría de ellas conocidas comúnmente como cobras, con el fin de conseguir una mayor información sobre las proteínas presentes y la abundancia relativa de estas, para permitir el desarrollo de antivenenos más específicos y, por tanto, más eficaces. Se analizan los venenos de serpientes de diferentes especies y de especies iguales pero encontradas en diversas zonas geográficas, con el objetivo de estudiar tanto la variación interespecífica, como la variación intraespecífica de carácter geográfico de los venenos, mediante la utilización de técnicas proteómicas. Palabras clave: veneno de serpiente, proteómica, venómica, antiveneno, variación interespecífica, variación intraespecífica. Abstract Currently venomous snakes are spread all over the world making the problems caused by snake bites a very important issue. However, that problem affects mainly underdeveloped countries and rural zones with few economic resources, and consequently it becomes an underestimated in developed countries with greater economic resources which are more capable to research in this area. Due to that, it is important to keep researching in this field to develop more specific and efficient antivenoms to treat snake envenoming. In this study the aim is to make a proteomic characterization of snakes’ venoms of the Naja genus, commonly known as cobras, to get more information about the proteins of these venoms and their relative abundance. Venoms of different snake species were analyzed and also, venoms of same species but located on different countries, to determine the interspecific and intraspecific geographic variation through the use of proteomic techniques. Key words: snake venom, proteimics, venomics, antivenom, interspecific variation, intraspecific variation. Índice 1. Introducción………………………………………………………………………………… 1 1.1. Las serpientes………………………………………………………………………………………………….. 1 1.2. Veneno………………………………………………………………………………………………………....... 4 1.3. Composición........................................................................................................ 6 1.4. Técnicas ómicas……………………………………………………………………………………………….. 9 2. Objetivos……………………………………………………………………………………. 12 3. Materiales y métodos………………………………………………………………… 13 3.1. Cromatografía………………………………………………………………………………………………... 14 3.2. Electroforesis……………………………………………………………………………………………....... 15 3.3. Digestión………………………………………………………………………………………………………… 16 3.4. Espectrometría de masas (MS)........................................................................ 16 3.5. Cálculo de la abundancia relativa de las toxinas…………………………………………… 18 4. Resultados y discusión………………………………………………………………. 19 4.1. Análisis de los venenos………………………………………………………………………………….. 19 4.2. Comparación de los venenos…………………………………………………………………………. 24 4.3. Variación interespecífica…………………………………………………………………………........ 26 4.4. Variación intraespecífica geográfica................................................................ 28 5. Conclusiones……………………………………………………………………………… 31 6. Referencias……………………………………………………………………………….. 32 7. Anexos………………………………………………………………………………………. 37 1 1. Introducción 1.1. Las Serpientes Las serpientes son animales que se encuentran dentro de la clase Reptila. A su vez, dentro de esta clase, pertenecen al orden de los Squamata y al suborden Serpentes. Existen alrededor de 3150 especies de serpientes de las cuales aproximadamente 600 son peligrosamente venenosas para los humanos (WHO, 2010). No obstante, existen algunas especies de las llamadas “non-front-fanged colubroid snkaes” (colúbridos sin colmillos frontales) que habitualmente no se clasifican como venenosas para los humanos, aunque se ha demostrado que producen veneno que en ocasiones presenta efectos clínicos significantes para nuestra especie (Weinstein, 2013). Dentro del suborden Serpentes, el clade Colubroidea incluye a la mayor parte de las serpientes que existen actualmente, de entre las cuales, las venenosas pertenecen mayoritariamente a las familias Viperidae y Elapidae (Calvete, 2014). Esta última (Elapidae) está compuesta a su vez por dos subfamilias Elapinae e Hydrophiinae. Figura 1. Resumen del árbol filogenético de las serpientes del clade Colubroidea. Imagen obtenida de (Pyron et al., 2011) 2 Las serpientes que pertenecen a la familia Elapidae son venenosas y se encuentran en regiones tropicales y subtropicales de Asia, Australia, América y África. Además también existen elápidos (especies de la familia Elapidae) acuáticos que habitan en los océanos Pacífico e Índico pertenecientes a la subfamilia Hydrophiinae. De entre los elápidos, se distinguen 361 especies agrupadas en 55 géneros, las cuales son muy diversas en cuanto a su tamaño, que va desde los 18 cm en algunas especies del género Drysdalia, hasta 5,6 metros que puede llegar a medir la cobra real (Ophiophagus hannah). Las serpientes venenosas se encuentran repartidas por casi todo el mundo exceptuando climas muy fríos, algunas islas y en algunas zonas con altitudes elevadas (Figura 2). Esta amplia distribución de serpientes venenosas provoca que el ataque por mordedura de serpiente sea un problema médico importante. Donde más se acentúa este problema es en zonas rurales de países en vías de desarrollo de África sub-Sahariana, Asia y América Latina, causando, en numerosas ocasiones, morbilidad y mortalidad en las víctimas (figura 3). Esto es debido principalmente a 2 causas:  Mayor convivencia con las serpientes peligrosas a causa de la ocupación de los ecosistemas habitados por éstas, bien por los trabajos humanos realizados en zonas rurales o bien por la degradación e invasión de dichos ecosistemas. Además, los desechos producidos en regiones pobladas atraen a las ratas, que a su vez atraen a las serpientes que se alimentan de éstas.  Menor acceso a servicios de sanidad, y los que tienen acceso, suelen ser de menor calidad y no lo suficientemente preparados para atender con eficacia episodios de envenenamiento. Otro problema añadido en estos centros médicos es la falta de antivenenos eficaces, los cuales son los únicos tratamientos específicos para tratar episodios de envenenamiento. Figura 2. Distribución de las zonas donde se han encontrado serpientes venenosas. Imagen obtenida de (Kasturiratne et al., 2008) 3 Figura 3. Figura explicativa de como afecta el problema de las mordeduras de serpientes alrededor del mundo. Figura obtenida de (Gutiérrez et al. 2010) Los primeros estudios para conocer la incidencia global del problema de las mordeduras de serpientes se basaron en los datos obtenidos de los centros sanitarios. A partir de estos datos obtuvieron que la incidencia global de este problema era de unos 2.5 millones de episodios de mordedura de serpiente anuales que derivaban en 250.000 víctimas con secuelas tras el envenenamiento y 85.000 muertes (Chippaux e. al., 1991). No obstante, la incidencia real de episodios de envenenamiento por mordedura de serpiente y su impacto en las diferentes regiones se desconoce, ya que en muchas zonas rurales, las víctimas no acuden a hospitales y mueren cerca del lugar de la mordida o en casa, sin que el accidente quede registrado en los datos sanitarios oficiales. Esta es la causa por la cual la estimación real se situaba muy por encima de estos resultados. Estudios más recientes han estimado que, anualmente, se producen entre 1.2 y 5.5 millones mordeduras de serpiente en todo el mundo y que terminan con la vida de entre 25.000 y 125.000 personas. Además, estos estudios estiman que alrededor de 400.000 víctimas más quedan con secuelas permanentes (Gutiérrez, 2015). En España, los accidentes de mordedura de serpiente no son muy comunes, situándose en aproximadamente 130 casos anuales. De todos los casos registrados entre 1997 y 2009, en todo el país, solamente un 1% de estos derivó en la muerte del paciente, aproximadamente 1 caso por año, aunque en diversos años no se registró ninguna víctima mortal (Saz-Parkinson et al., 2012). A pesar de la incidencia a nivel mundial, el problema de las mordeduras no recibe la suficiente atención por parte de las autoridades de la salud pública y la industria farmacéutica. De hecho, la OMS (Organización Mundial de la Salud) en Abril de 2009 incorporó los accidentes por mordedura de serpiente en la lista de condiciones descuidadas dentro del conjunto de enfermedades tropicales descuidadas (NTDs en inglés Neglected Tropical Diseases). 4 1.2. Veneno El veneno se define según la RAE como “sustancia que, incorporada a un ser vivo en pequeñas cantidades, es capaz de producir graves alteraciones funcionales, e incluso la muerte”. En términos más científicos, el veneno se puede definir como una secreción formada por compuestos bioactivos, producido en unas glándulas especializadas e inyectado mediante un aparato inoculador, que interfiere en procesos fisiológicos o bioquímicos normales de la presa. Dentro de este cóctel de compuestos que es el veneno, la mayor parte, alrededor de un 90%, está compuesto por unas pocas familias de proteínas y péptidos, mientras que el 10% restante se compone por diferentes compuestos tanto orgánicos como inorgánicos, como sal, azúcares, poliaminas y neurotransmisores. La capacidad de sintetizar veneno la aprovechan alrededor de 170.000 especies repartidas por casi todo el mundo. Tanto es así que a día de hoy es casi imposible encontrar un ecosistema donde no exista algún tipo de organismo venenoso (WHO, 2010, Fry, 1999, Utkin, 2015). Figura 4. Árbol esquemático de las especies venenosas a lo largo del reino animal. El árbol demuestra la relación entre la evolución de los diferentes linajes y la presencia de organismos venenosos. Los colores destacan los linajes en los cuales se han encontrado organismos con sistemas venenosos. El color rojo indica que la función principal del veneno es la predatoria, el color azul la función defensiva y el color verde la función de arma de competición intraespecífica. Imagen obtenida de (Casewell et al., 2013). 11 existentes en el gel de poliacrilamida que deben atravesar las proteínas, siendo más fácil para las proteínas de menor peso molecular (Sociedad Española de Proteómica, 2014). La combinación de estas dos técnicas permite una buena separación proteica, con la que posteriormente se pueden analizar los péptidos obtenidos mediante espectrometría de masas. En esta técnica se produce una fragmentación de las moléculas que conduce a la formación de iones, que se separarán en el espectrómetro de masas en función de su relación masa/carga. Gracias a esto, se pueden conocer las masas moleculares de los péptidos introducidos en el espectrómetro de masas. Acto seguido, se interpretan los espectros de masas, ya sea mediante búsquedas en bases de datos, en caso de que se encuentren fragmentos peptídicos similares a los obtenidos, o manualmente, mediante la técnica de secuenciación de novo. En esta técnica se interpreta el espectro de un determinado péptido, con el fin de secuenciarlo (identificar la secuencia de aminoácidos). 12 2. Objetivos El objetivo de este estudio fue conseguir una caracterización proteómica de los venenos de las serpientes Naja haje (de Mali y de Marruecos), Naja annulifera, Naja niglicollis nigricincta y Naja melanoleuca melanoleuca (de Uganda). Esta caracterización tenía como fin:  Conocer con la mayor exactitud posible la composición proteica de los venenos y la abundancia relativa de las toxinas presentes en estos, con el objetivo de aportar información para posteriores estudios y para el desarrollo de antivenenos más específicos y por tanto, más eficaces.  Estudiar las diferencias en la composición del veneno y en la abundancia relativa de sus toxinas a nivel: o Interespecífico, es decir, entre diferentes especies de serpientes del género Naja. o Intraespecífico geográfico, es decir, entre serpientes de la misma especie pero que habitan en diferentes zonas geográficas. Este es el motivo por el cual con la especie Naja haje se analizaron sus venenos en serpientes encontradas en países diferentes (Mali y Marruecos). 13 3. Materiales y métodos Gracias al avance de las técnicas proteómicas, el estudio de los venenos de serpiente ha evolucionado rápidamente, permitiendo una caracterización proteómica profunda de los venenos. Para la realización de este trabajo se siguieron los pasos explicados en el siguiente esquema (figura Figura 8. Esquema de los pasos seguidos para la caracterización proteómica de los venenos en este estudio. La extracción del veneno se lleva a cabo en centros especializados y el veneno llega al laboratorio en forma liofilizada. Una vez en el laboratorio, el veneno fue resuspendido con 200µl de PBS (Phosphate Buffer Solution) y centrifugado para descartar los precipitados. Para obtener suficiente cantidad de proteína para analizar, pero sin saturar la columna cromatográfica, se decidió cargar 2mg totales de veneno. Con el objetivo de conocer la concentración que se tenía en la muestra, se utilizó espectrofotometría a 280nm (longitud de onda a la que absorbe el enlace peptídico) y se utilizó la ley de Lambert y Beer. Esta ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que atraviesa la luz. La fórmula que representa esta ley es: 𝐴 = 𝜀 ∗ 𝑐 ∗ 𝑙 Ecuación 1. Ecuacnión de Lambert y Beer. Donde: A es la absorbancia, ε el coeficiente de extinción molar y l la longitud de la celda. 14 Una vez conocida la concentración de la muestra, se calculó el volumen necesario para obtener los 2mg de proteína que se utilizaron en la separación cromatográfica y se añadió el volumen restante hasta llegar a los 300µl, con la solución de inicio del programa de cromatografía (5% acetonitrilo + 0.1% de ácido trifluoroacético en agua MilliQ). 3.1. Cromatografía La cromatografía RP-HPLC se realizó utilizando una columna Teknokroma Europa Protein 300 con una matriz C18. Esta columna tiene unas dimensiones de 0.4cm de diámetro por 25cm de longitud, con un tamaño de partícula de 5µm y un tamaño de poro de 300Å. La cromatografía fue llevada a cabo con un gradiente linear de 0.1% TFA (ácido trifluoroacético) en agua MilliQ (solución A) y 0.1% de acetonitrilo también en agua MilliQ (solución B), aumentando progresivamente la solución B y disminuyendo la A de manera automatizada, siguiendo los siguientes pasos:  Del minuto 0 al 5: condiciones isocráticas con un 5% de la solución B.  Del minuto 5 al 15: aumento de la solución B desde el 5% hasta el 25%.  Del minuto 15 al 75: del 25% al 45% progresivamente de solución B.  Del minuto 75 al 85: del 45% hasta el 70% de B. Cada pico representa a un grupo de proteínas que, en función de su polaridad, fueron retenidas un tiempo determinado. Cada uno de estos picos, se recogió por separado para poder realizar posteriormente una separación más específica, utilizando electroforesis. El área bajo la curva de los picos depende de la cantidad de proteína detectada por el cromatógrafo. Figura 9. Cromatograma de Naja haje de Mali con el gradiente de la solución B. 15 Una vez terminada la cromatografía, las muestras recogidas se secaron utilizando una centrífuga de vacío (Savant), con el objetivo de eliminar el líquido presente en la muestra y así obtener solo las proteínas. Posteriormente, las muestras fueron resuspendidas con agua MilliQ para ser cargadas en el gel y que estuvieran todas igual de concentradas. 3.2. Electroforesis Como se ha dicho anteriormente, el tipo de electroforesis usado fue el llamado SDSPAGE donde se utilizaron geles de poliacrilamida con un porcentaje del 15%, realizados en el laboratorio manualmente, con los productos que se detallan en el anexo I. Se utilizó un gel con un porcentaje del 15% en acrilamida ya que se conocía que la mayoría de las proteínas presentes en los venenos eran pequeñas, y con un porcentaje alto se consigue una buena separación de las proteínas de menor tamaño. Los geles se diseñaron con una parte empaquetadora o stacking en la parte superior de éstos, realizando lo que se llama una electroforesis discontinua. En esta parte la resolución del gel es menor, ya que el porcentaje de acrilamida utilizado fue del 4% en este caso, lo que se traduce en un tamaño de poro mayor, que permite a las proteínas atravesarla más fácilmente. Con ello, se consigues un apilamiento justo al inicio de la parte separadora del gel, es decir, la de resolución mayor. El voltaje aplicado en la electroforesis fue de 80V en el gel empaquetador y de 120V en el separador. El voltaje usado en el empaquetador es menor para dar tiempo a que todas las proteínas se concentren en una banda discreta al inicio del gel separador, ya que al cargar, se usó un volumen alto y, sin gel stacking, se generarían bandas anchas. Además de preparar los geles, se prepararon las mezclas de carga formadas por 10µl de cada muestra proteica recogida en la cromatografía, a las cuales se le añadieron 2µl de los tampones de carga que se describen en el anexo II. Estas mezclas se calentaron a 99°C durante 5 minutos provocar la desnaturalización de las proteínas antes de someterlas a la electroforesis. Figura 10. Geles de SDS-PAGE de Naja haje de Mali después de cortar las bandas. 16 En este caso, la electroforesis se realizó por duplicado, pero añadiendo βmercaptoetanol en las mezclas de carga de uno de estos duplicados. Éste es un agente reductor que disocia los puentes disulfuro, rompiendo así enlaces disulfuro terciarios y cuaternarios y desplegando a las proteínas totalmente en su estructura primaria. La SDS-PAGE se dejó correr controlando visualmente, hasta que el frente del tampón de carga recorriera todo el gel, para evitar que las proteínas se salieran. Una vez terminada la electroforesis, se recortaron las bandas presentes en el gel, como se puede ver en la figura 10, para posteriormente ser digeridas y llevadas al espectrómetro de masas. 3.3. Digestión Una vez recortadas las bandas electroforéticas, se debe extraer la parte proteica presente en éstas. Para ello se realizó una in-gel digestion con el digestor automatizado ProGest Protein Digestion Workstation. Este digestor realiza primero una reducción de las proteínas con 10mM de ditiotreitol (DTT), seguida de una alquilación con 50mM de iodoacetamida y por último una digestión con tripsina durante toda la noche (25ng de tripsina por muestra). Al día siguiente, se recogieron los péptidos resultantes de la digestión y se llevaron a la centrífuga de vacío Savant (la misma que se utilizó después de la cromatografía), para secar las muestras. Una vez secas, antes de llevarlas al espectrómetro de masas, se resuspendieron con un volumen determinado de 0.1% de ácido fórmico en MilliQ, en función de la cantidad de proteína que se observó en cada banda del gel, para intentar tener todas las muestras en la misma concentración. 3.4. Espectrometría de masas (MS) Para el análisis de las masas totales y los digeridos trípticos, se utilizó un nano UPLCESI-QUAD-TOF (nano-Acquity Ultra Performance Liquid Cromatography acoplado a un espectrómetro de masas SYNAPT G2 High Definition Mass Spectrometry System de Waters Corporation). La columna utilizada en la cromatografía fue una BEH130 de 100µm x 100mm y presenta un tamaño de partícula de 1.7µm, y se trabajó a un flujo de 0.6ul/min. En primer lugar, se calcularon las masas totales de las proteínas a partir de las fracciones recogidas directamente del HPLC. Para ello se introdujeron dichas fracciones en el espectrómetro de masas, donde fueron ionizadas mediante electrospray (ESI) y posteriormente separadas en función de su relación masa-carga mediante la técnica quadrupolo (QUAD). Una vez separadas las proteínas se utilizó la siguiente fórmula para calcular sus masas: 𝑀1= 𝑀2 Ecuación 2. Donde M es igual a: 𝑀 = (𝑚𝑧 ⁄ ) ∗ 𝑧 − 𝑧 Ecuación 2.1. Donde: (m/z) es la relación masa-carga del péptido y z la carga de éste. 17 Para calcular las masas es necesario saber la carga que presenta cada péptido y para ello, se asignó la carga n a uno de los iones y en orden ascendiente hacia la derecha y descendente hacia la izquierda como se puede ver en la figura 11. Figura 11. Espectro de Naja haje de Mali, con las cargas asociadas a los iones en modo de incógnita en función de n. En este ejemplo el cálculo sería: 1116.93 ∗ 𝑛 − 𝑛 = 977.44 ∗(𝑛 + 1)− (𝑛 + 1) Ecuación 2.1. Desarrollada con los valores del ejemplo. Despejando el resultado es que n=7, quedando por tanto las cargas de la siguiente manera: Figura 11.1. Espectro de la Figura 11 pero con las cargas conocidas. Por último se calcula la masa de la proteína utilizando la ecuación con la ecuación 2, a partir de cualquiera de los péptidos, que en este caso sería: 𝑀 = 1116.93 ∗ 7 − 7 = 7811.51 𝐷𝑎 Ecuación 2. Desarrollada con los datos del ejemplo. El otro análisis que se llevó a cabo fue la identificación de los fragmentos peptídicos derivados de las proteínas iniciales. Para ello, se utilizaron las muestras que fueron sometidas a todo el protocolo (HPLC, SDS-PAGE e in-gel digestión). Al igual que en el análisis anterior, antes de analizarlas en el espectrómetro, se realizó una UPLC para separar las proteínas presentes en las muestras. En este caso, se utilizó la llamada espectrometría de masas en tándem o MS/MS, en la que después de la ionización por ESI los iones cargados con 2, 3 y 4 cargas positivas fueron seleccionados en el quadrupolo y pasaron a una celda de colisión inducida (CID), donde se fragmentaron en iones más pequeños. Una vez fragmentados se separaron mediante la técnica tiempo de vuelo (TOF), y se obtuvieron espectros que posteriormente sirvieron para la identificación proteica. 18 Estos espectros del MS/MS fueron interpretados usando el programa online MASCOT, para realizar la búsqueda en la base de datos del NCBI (http://www.matrixscience.com). En los casos en los que la búsqueda no dio resultados, se analizaron los espectros manualmente mediante secuenciación de novo, hallando la secuencia aminoacídica de los péptidos. En este segundo caso, las secuencias obtenidas fueron comparadas con las presentes en la base de datos del NCBI utilizando el programa BLAST. El objetivo de ambas búsquedas (con MASCOT y BLAST) fue identificar las famílias proteicas a las que pertenecen las proteínas analizadas en el espectrómetro de masas. 3.5. Cálculo de la abundancia relativa de las toxinas Una vez identificadas las familias proteicas de las toxinas, se estimaron sus abundancias relativas en cada veneno estudiado. Para ello se sumaron las áreas de los picos cromatográficos pertenecientes a la misma familia proteica para obtener el 100% y después se calculó el porcentaje que representaba cada pico. No obstante, debido a que la mayoría de picos estaban representados por más de una banda en la SDS-PAGE, se realizó una densitometría de los geles utilizando el programa Meta Imaging Series 7.1, con el que se asignó la proporción de cada banda respecto al porcentaje total del pico. En algunas de las bandas de la electroforesis, al realizar la búsqueda en bases de datos, se encontraron resultados de diferentes familias proteicas dentro de la misma banda. Para resolver este problema, la abundancia relativa de cada familia proteica presente en la banda fue estimada basándose en la intensidad relativa de los tres iones más abundantes en el análisis de espectrometría de MS/MS, es decir, se observaron estos tres iones, a que familia proteica pertenecían, se sumaron sus intensidades y se realizó el promedio de la intensidad de cada ion respecto a la intensidad total. En base a dicho promedio, se asignó la parte porcentual correspondiente a cada familia proteica presente en la banda de la SDS-PAGE. 19 4. Resultados y discusión Se realizó todo el proceso experimental detallado anteriormente para los venenos de las serpientes Naja haje (de Marruecos y de Mali), Naja annulifera, Naja nigricollis nigricincta y Naja melanoleuca melanoleuca (de Uganda) y se obtuvieron las caracterizaciones proteómicas de éstos venenos. En dichas caracterizaciones proteicas, no sólo se identificaron las proteínas, sino que además se determinaron las masas moleculares de las proteínas identificadas y se realizaron tablas informativas (anexo III) donde se describen el pico donde se ha encontrado la proteína, el porcentaje del total de proteínas del veneno que representa, la masa molecular además de la relación masa carga de la proteína con la que identificó, su carga, la secuencia con lo que se encontró similitud, el score y la especie en la que se encontró. Con estas tablas se pretendió dar el máximo de información tanto para este estudio como para la realización de posteriores estudios. Para la nomenclatura de las diferentes familias proteicas en la construcción de los gráficos se utilizaron las abreviaturas que se detallan en el anexo IV. 4.1. Análisis de los venenos Naja haje (Marruecos) En los cormatogramas de los venenos se pueden diferenciar principalmente 2 grupos: proteínas más polares y más apolares. El primer grupo está compuesto en este caso principalmente por las 3FTx, Kunitz, vNGF y PLA2, y ocuparan desde el pico 1 al 17 en este caso, mientras que el segundo destacan las SVMP y las CRISP (más apolares) y serían el resto de picos. Visualmente se puede observar como predominan las proteínas del primer grupo, de hecho, el porcentaje de las áreas de los picos 1-17 es del 86.23%. De este porcentaje el 68.08% corresponde a 3FTx y es que del pico 1 al 9, la totalidad de las proteínas identificadas pertenecen a esta familia y además, son las más destacadas en los picos 14 y 15 (los que más área representan). Por otro lado, los picos 18,19 y 20 representan la totalidad de las CRISP, además de cierto porcentaje de las metaloproteinasas (PIII-SVMP) encontradas, mientras que los últimos tres picos son identifican prácticamente en su totalidad con el resto de las metaloproteinasas y el 0.6% correspondiente a las LAAO. 20 Naja haje (Mali) En este veneno, los 7 primeros picos, excepto el 5 fueron recogidos pero no se realizó el resto del proceso experimental por problemas técnicos. No obstante, a la vista de los resultados obtenidos a partir de los otros venenos y del pico 5 de este veneno, se espera que el porcentaje correspondiente a dichos picos (el 12.10% asignado a proteínas no identificadas), esté compuesto por toxinas de la familia 3FTx, ya que son las más polares y por tanto, con un tiempo de retención menor. No obstante, para la continuación de este estudio se correrá de nuevo el veneno y se identificarán las proteínas presentes en estos picos. En cuanto a las proteínas sí identificadas, se puede ver la división de los dos grupos de familias proteicas, mencionados en el anterior veneno, a los 50 minutos aproximadamente (entre el pico 19 y 20). En el primer grupo son muy predominantes las toxinas de la familia three finger toxins, ya que los porcentajes de las otras familias mayoritarias de este grupo, como son vNGF, PLA2 y Kunitz, fueron inferiores al 2% e incluso no se llegó a identificar ninguna Kunitz. Figura 12. Cromatograma del veneno de Naja haje de Marruecos con los picos numerados. Además, se muestra el gráfico de las familias proteicas identificadas y el porcentaje respecto al total de proteínas que representa cada familia. 27 Como se ha mencionado, otra de las diferencias significativas entre los venenos es la gran diferencia porcentual de las proteínas de la familia PLA2 en los venenos de Naja n. nigricinta y N. m. melanoleuca respecto a las otras dos especies, siendo incluso inferior al 1%, el valor de su abundancia relativa en la N. annulifera. Por otro lado, otro resultado significativo es la presencia de metaloproteinasas (SVMP) en los venenos estudiados. Las SVMP son características de los vipéridos debido a su importante efecto hemorrágico y por ello se encuentran en un mayor porcentaje. No obstante, como se puede ver en la figura 17, son familias de toxinas relativamente abundantes en las Najas estudiadas. De hecho, en los venenos de la N. annulifera y la N. haje llega a ser el segundo grupo más abundante después de las 3FTx representando alrededor del 12% y el 8% del total de las proteínas. Estos resultados demuestran que a pesar del carácter neurotóxico del veneno de las cobras, también existe un importante efecto hemorrágico que aumenta los problemas derivados de los envenenamientos. En el caso de las CRISP, resulta interesante el hecho de que mantienen un valor de abundancia relativa relativamente similar en todas las especies estudiadas menos en la N. n. nigricincta, donde es prácticamente inexistente. Con las Kunitz ocurre un algo similiar, aunque en este caso llega incluso a no ser indentificada en esta especie. Cabe destacar que, aunque aparece también en el veneno la N. annulifera compone solo el 0.4% del total de proteínas en de éste, muy lejos del 4% en el veneno de la N. m. melanoleuca. Además, con la interpretación de los cromatogramas realizada con anterioridad, se pueden identificar las diferencias de abundancias relativas entre venenos en los cromatogramas. En primer lugar se deben identificar los dos grandes grupos de familias proteicas mencionados durante este apartado, que se sitúan entre el minuto 10 y el 50-55 aproximadamente, el primer grupo y del 50-55 hasta el final el segundo. En este segundo grupo, el de las proteínas más apolares, se puede además hacer una subdivisión en dos grupos más, ya que alrededor del minuto 60 se observa siempre una zona con unos 3 o 4 picos y a partir de los 70-75 minutos se observa otra zona de picos. En el grupo de proteínas retenidas 60 minutos las dos familias más abundantes son las PIII-SVMP y las CRISP, aunque normalmente predominan las CRISP ya que son más polares que las metaloproteinasas. Se puede observar como la intensidad de los picos en esa zona está relacionada con la cantidad de toxinas de la familia CRISP presentes en los venenos. De hecho en la N. n. nigricincta los picos son muy pequeños y el porcentaje de CRISP es de tan solo 0.04% de las proteínas totales, mientras que en el resto de venenos estudiados, la intensidad de los picos en esa zona es mayor, y se traduce en un mayor porcentaje de toxinas de esta familia. Por otro lado, en el grupo de las proteínas más polares y que, por tanto, son detectadas más pronto (en los 25 primeros minutos aproximadamente), siempre pertenecen a la familia de las 3FTx. No obstante, hasta el minuto 50-55 no dejan de identificarse estas toxinas, aunque a partir de esos 25 minutos se combinan con otras, principalmente PLA2 y algunas vNGF y Kunitz. De estas otras tres familias, la PLA2 representa una parte importante del veneno en las N. n. nigricincta y N. m. melanoleuca. En el cromatograma, estas proteínas se asocian prácticamente en su totalidad con los picos de alta intensidad que se detectaron alrededor de los 35 minutos, como son el pico 14 en la N. n. nigricincta y el 12 en la N. m. melanoleuca. No obstante, observando los cromatogramas, en los otros dos venenos también se observan picos intensos en esa zona que después no se traducen en un alto porcentaje de PLA2. Esto se debe a que estas toxinas se encuentran normalmente en esos picos, pero no 28 implica que sean las únicas, ya que en esa zona también se detectan muchas toxinas de la familia 3FTx. 4.4. Variación intraespecífica geográfica En este estudio, se analizaron los venenos de dos Naja haje de países diferentes con el objetivo de estudiar posibles diferencias en la composición proteica de estos venenos asociadas a sus localizaciones geográficas. La Naja haje o cobra egipcia fue muy importante en la mitología egipcia, siendo el símbolo de soberanía para los faraones, quien las incorporaban en sus diademas. Por lo que respecta a su hábitat, se pueden encontrar tanto en estepas como en sabanas o regiones semidesérticas con algo de agua y vegetación y además, son terrestres y nocturnas. Habitan en numerosos lugares del norte de África y África occidental principalmente, aunque también se encuentran en Sudán y Sudán del sur y algunos puntos del África Oriental (figura 19). En este trabajo los venenos estudiados fueron de Najas haje de Marruecos y de Mali. Después de realizar la caracterización de ambos venenos se pueden observar algunas diferencias. No obstante, estas diferencias son obviamente menores que las diferencias encontradas al comparar venenos de diferentes especies (figura 20). Figura 18. Cromatogramas numerados de los venenos de las especies a comparar 29 El valor de las 3FTx en el veneno de la serpiente de Mali es menor que en la de Marruecos, aunque como se ha mencionado con anterioridad, en los primeros picos de este veneno no se pudieron identificar sus proteínas, con lo que se espera que el valor porcentual de ambos venenos para la familia de las 3FTx sea más similar. Otro dato interesante, es la mayor abundancia de las proteínas más polares en el veneno de la serpiente de Marruecos, mientras que en Mali, abundan más las proteínas con carácter más apolar. En el primer caso se observa que, aunque no de manera significativa, el valor de PLA2 en el veneno de la N. haje de Marruecos es mayor que en el de la de Mali, y sucede lo mismo con las proteínas de la familia vNGF. El dato que sí presenta mayor importancia, es la ausencia de proteínas de la familia Kunitz en el veneno de Mali, mientras que en el de Marruecos representa casi el 3% del total de proteínas. Figura 20. Gráficos de las abundancias relativas de las proteínas de los venenos de las dos Naja haje estudiadas. Figura 19. Identificación de las zonas del continente africano donde se han encontrado serpientes de la familia Naja haje. Se resaltan los dos países de los cuales provienen las dos serpientes es esta especie estudiadas en este trabajo. 30 En cuanto al grupo de proteínas más apolares, las tres mayoritarias (PIII-SVMP, CRISP y LAAO) son más abundantes en el veneno estudiado de la cobra de Mali. Esto se traduciría en más efectos de carácter hemorrágico en la víctima con el envenenamiento de ésta Naja haje. Estas diferencias de composición del veneno se deben principalmente a las diferencias en las condiciones geográficas entre ambos países. Mientras que en Mali predominan las zonas desérticas y de sabana y con poca vegetación, en Marruecos existen cuatro cordilleras montañosas. Por otro lado, también existen diferencias climáticas, ya que Marruecos presenta un clima Mediterráneo mientras que en Mali el clima es subtropical, con muy pocas precipitaciones y frecuentes periodos de sequía. Además, a causa de estas diferencias los ecosistemas no son los mismos, y las especies que los habitan tampoco, con lo que las presas que sirven de alimento para estas cobras podrían variar en mayor o menor medida. No obstante, se debe seguir investigando en esta línea para identificar patrones geográficos que puedan influir en la composición final del veneno de las Naja haje y de hecho, actualmente este estudio se está ampliando. 31 5. Conclusiones  Se ha comprobado que los venenos de las Najas estudiadas presentan un predominante carácter neurotóxico, aunque también están compuestos por proteínas que producen efectos hemorrágicos.  Las proteínas más abundantes en todos los venenos estudiados son de la familia 3FTx, destacando así su importancia en los venenos de las cobras.  Existen numerosas diferencias interespecíficas en las abundancias relativas de las familias proteicas en los venenos de las especies Naja haje, Naja annulifera, Naja melanoleuca melanoleuca y Naja nigricollis nigricincta.  Se encontraron diferencias intraespecíficas de carácter geográfico entre los venenos de las Naja haje de Marruecos y de Mali. 32 6. Referencias Angeletti, R. H. (1970). Nerve growth factor from cobra venom. Proceedings of the National Academy of Sciences, 65(3), 668-674. Argentina, P. D. L. A. T. (2006). Acta Toxicológica Argentina. Buenos Aires.15(09), 2013. Arlinghaus, F. T., Eble, J. A. (2012). C-type lectin-like proteins from snake venoms. Toxicon, 60(4), 512-519. Brown, N. I. (2012). Consequences of neglect: analysis of the sub-Saharan African snake antivenom market and the global context. PLoS Negl Trop Dis,6(6), e1670. Calvete J. (2014). Next-generation snake venomics: protein-locus resolution through venom proteome decomplexation. Expert Reviews, Proteomics 11(3): 315-329. Calvete, J. J. (2010). Antivenomics and venom phenotyping: a marriage of convenience to address the performance and range of clinical use of antivenoms. Toxicon, 56(7), 1284-1291. Calvete, J. J. (2014). Next-generation snake venomics: protein-locus resolution through venom proteome decomplexation. Expert review of proteomics, 11(3), 315-329. Calvete, J. J. (2013). Snake venomics: from the inventory of toxins to biology.Toxicon, 75, 4462. Calvete, J. J., Juárez, P., Sanz, L. (2007). Snake venomics. Strategy and applications. Journal of Mass Spectrometry, 42(11), 1405-1414. Calvete, J. J., Escolano, J., Sanz, L. (2007). Snake venomics of Bitis species reveals large intragenus venom toxin composition variation: application to taxonomy of congeneric taxa. Journal of proteome research, 6(7), 2732-2745. Calvete, J. J., Marcinkiewicz, C., Monleón, D., Esteve, V., Celda, B., Juárez, P., Sanz, L. (2005). Snake venom disintegrins: evolution of structure and function. Toxicon, 45(8), 1063-1074. Calvete, J. J., Sanz, L., Pla, D., Lomonte, B., Gutiérrez, J. M. (2014). Omics meets biology: application to the design and preclinical assessment of antivenoms. Toxins, 6(12), 3388-3405. Calvete, J. J., Sanz, L., Angulo, Y., Lomonte, B., Gutiérrez, J. M. (2009). Venoms, venomics, antivenomics. FEBS letters, 583(11), 1736-1743. Casewell, N. R., Wüster, W., Vonk, F. J., Harrison, R. A., Fry, B. G. (2013). Complex cocktails: the evolutionary novelty of venoms. Trends in ecology & evolution, 28(4), 219-229. Chippaux, J. P. (2011). Estimate of the burden of snakebites in sub-Saharan Africa: a metaanalytic approach. Toxicon, 57(4), 586-599. Chippaux, J. P. (1998). Snake-bites: appraisal of the global situation. Bulletin of the World Health organization, 76(5), 515. 33 Chippaux, J. P., Williams, V., White, J. (1991). Snake venom variability: methods of study, results and interpretation. Toxicon, 29(11), 1279-1303. Clemetson, K. J., Lu, Q., Clemetson, J. M. (2006). Snake C-type lectin-like proteins and platelet receptors. Pathophysiology of haemostasis and thrombosis, 34(4-5), 150-155. Clemetson, K. J. (2010). Snaclecs (snake C-type lectins) that inhibit or activate platelets by binding to receptors. Toxicon, 56(7), 1236-1246. Cohen, S., Levi-Montalcini, R. (1956). A nerve growth-stimulating factor isolated from snake venom. Proceedings of the National Academy of Sciences, 42(9), 571-574. Du, X. Y., Clemetson, K. J. (2002). Snake venom L-amino acid oxidases.Toxicon, 40(6), 659-665. Durban i Sanchez, J. (2015). Aplicacions de Next Generation Sequencing en organismes no model: caracterització dels transcriptomes de verins de serps. Eichberg, S., Sanz, L., Calvete, J. J., Pla, D. (2015). Constructing comprehensive venom proteome reference maps for integrative venomics.Expert Review of Proteomics, 12(5), 557573. Escalante, T., Rucavado, A., Fox, J. W., Gutiérrez, J. M. (2011). Key events in microvascular damage induced by snake venom hemorrhagic metalloproteinases. Journal of proteomics, 74(9), 1781-1794. Escoubas, P., Quinton, L., Nicholson, G. M. (2008). Venomics: unravelling the complexity of animal venoms with mass spectrometry. Journal of mass spectrometry, 43(3), 279-295. Fry, B. G. (1999). Structure–function properties of venom components from Australian elapids. Toxicon, 37(1), 11-32. Fry, B. G., Casewell, N. R., Wüster, W., Vidal, N., Young, B., Jackson, T. N. (2012). The structural and functional diversification of the Toxicofera reptile venom system. Toxicon, 60(4), 434-448. Fry, B. G., Roelants, K., Champagne, D. E., Scheib, H., Tyndall, J. D., King, G. F., Nevalainen, T. J., Norman, J. A., Lewis, R. J., Norton, R. S., Renjifo, C., Rodríguez de la Vega, R. C. (2009). The toxicogenomic multiverse: convergent recruitment of proteins into animal venoms. Annual review of genomics and human genetics, 10, 483-511. Fry, B. G., Scheib, H., van der Weerd, L., Young, B., McNaughtan, J., Ramjan, S. R., Vidal, N., Poelmann, R. E., Norman, J. A. (2008). Evolution of an arsenal structural and functional diversification of the venom system in the advanced snakes (Caenophidia). Molecular & Cellular Proteomics, 7(2), 215-246. Fry, B. G., Vidal, N., Norman, J. A., Vonk, F. J., Scheib, H., Ramjan, S. R., Kuruppu, S., Fung, K., Blair Hedges, S., Richardson, M. K., Hodgson, W. C., Ignjatovic, V., Summerhayes, R., Kochva, E. (2006). Early evolution of the venom system in lizards and snakes. Nature, 439(7076), 584588. Fry, B. G., Wüster, W., Kini, R. M., Brusic, V., Khan, A., Venkataraman, D., Rooney, A. P. (2003). Molecular evolution and phylogeny of elapid snake venom three-finger toxins. Journal of molecular evolution, 57(1), 110-129. 34 Gutiérrez, J. M., Burnouf, T., Harrison, R. A., Calvete, J. J., Brown, N., Jensen, S. D., Warrell, D. A., Williams, D. J. Global Snakebite Initiative. (2015). A Call for Incorporating Social Research in the Global Struggle against Snakebite. PLOS Neglected Tropical Diseases,9(9), e0003960. Gutiérrez, J. M., León, G. (2009). Snake antivenoms. Technological, clinical and public health issues. Animal Toxins: State of the Art. Perspectives in Health and Biotechnology, 393-421. Gutiérrez, J. M., León, G., Burnouf, T. (2011). Antivenoms for the treatment of snakebite envenomings: the road ahead. Biologicals, 39(3), 129-142. Guo, C., Liu, S., Yao, Y., Zhang, Q., Sun, M. Z. (2012). Past decade study of snake venom Lamino acid oxidase. Toxicon, 60(3), 302-311. Gutiérrez, J. M., Williams, D., Fan, H. W., Warrell, D. A. (2010). Snakebite envenoming from a global perspective: Towards an integrated approach.Toxicon, 56(7), 1223-1235. Gutiérrez, J. M., Williams, D., Fan, H. W., Warrell, D. A. (2010). Snakebite envenoming from a global perspective: Towards an integrated approach.Toxicon, 56(7), 1223-1235. Harrison, R. A., Hargreaves, A., Wagstaff, S. C., Faragher, B., Lalloo, D. G. (2009). Snake envenoming: a disease of poverty. PLoS Negl Trop Dis, 3(12), e569. Hsiang, A. Y., Field, D. J., Webster, T. H., Behlke, A. D., Davis, M. B., Racicot, R. A., Gauthier, J. A. (2015). The origin of snakes: revealing the ecology, behavior, and evolutionary history of early snakes using genomics, phenomics, and the fossil record. BMC evolutionary biology, 15(1), 1. Isabel, T. F., Costa, G. N. M., Pacheco, I. B., Barbosa, L. G., Santos-Junior, C. D., Fonseca, F. P., França, J. B., Henrique-Silva, F., Yoneyama, K. A., Rodrigres, R. S., de Melo Rodrigues, V. (2016). Expression and partial biochemical characterization of a recombinant serine protease from Bothrops pauloensis snake venom. Toxicon, 115, 49-54. Jackson, K. (2007). The evolution of venom-conducting fangs: insights from developmental biology. Toxicon, 49(7), 975-981. Juárez, P., Comas, I., González-Candelas, F., Calvete, J. J. (2008). Evolution of snake venom disintegrins by positive Darwinian selection.Molecular biology and evolution, 25(11), 23912407. Kasturiratne A., Wickremasinghe A. R., de Silva N., Gunawardena N. K., Pathmeswaran A., Premaratna R., Savioli L., Lalloo D. G., and de Silva H. J. (2008). PLos Medicine, Volume 5, Issue 11, e 218. Kierszenbaum, A. L., Lea, O., Petrusz, P., French, F. S., Tres, L. L. (1981). Isolation, culture, and immunocytochemical characterization of epididymal epithelial cells from pubertal and adult rats. Proceedings of the National Academy of Sciences, 78(3), 1675-1679. Kini, R. M. (2002). Molecular moulds with multiple missions: Functional sites in three‐finger toxins. Clinical and experimental pharmacology and physiology,29(9), 815-822. Kini, R. M., Doley, R. (2010). Structure, function and evolution of three-finger toxins: mini proteins with multiple targets. Toxicon, 56(6), 855-867. 35 Kostiza, T., Meier, J. (1996). Nerve growth factors from snake venoms: chemical properties, mode of action and biological significance. Toxicon, 34(7), 787-806. Lynch, V. J. (2007). Inventing an arsenal: adaptive evolution and neofunctionalization of snake venom phospholipase A 2 genes. BMC evolutionary biology, 7(1), 1. Markland, F. S. (1998). Snake venoms and the hemostatic system. Toxicon,36(12), 1749-1800. Markland, F. S., Swenson, S. (2013). Snake venom metalloproteinases.Toxicon, 62, 3-18. Mukherjee, A. K., Mackessy, S. P., Dutta, S. (2014). Characterization of a Kunitz-type protease inhibitor peptide (Rusvikunin) purified from Daboia russelii russelii venom. International journal of biological macromolecules, 67, 154-162. Nei, M., Rooney, A. P. (2005). Concerted and birth-and-death evolution of multigene families. Annual review of genetics, 39, 121. Pahari, S., Mackessy, S. P., Kini, R. M. (2007). The venom gland transcriptome of the Desert Massasauga Rattlesnake (Sistrurus catenatus edwardsii): towards an understanding of venom composition among advanced snakes (Superfamily Colubroidea). BMC molecular biology, 8(1), 1. Pla, D., Gutiérrez, J. M., Calvete, J. J. (2012). Second generation snake antivenomics: comparing immunoaffinity and immunodepletion protocols.Toxicon, 60(4), 688-699. Pyron R. A., Burbrink F. T., Colli G. R., Montes de Oca A. N., Vitt L. J., Kuczynski C. A., Wiens J. J. (2011). The phylogeny of advanced snakes (Colubroidea), with discovery of a new subfamily and comparison of support methods for likelihood trees. Molecular Phylogenetics and Evolution 58: 329-342. Saz-Parkinson, Z., del Pino Luengo, M., López-Cuadrado, T., Andújar, D., Carmona-Alférez, R., Flores, R. M., Amate, J. M. (2012). Approach to the epidemiology of venomous bites in Spain. Toxicon, 60(4), 706-711. Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. (2006). In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.Nature protocols, 1(6), 2856-2860. Shikamoto, Y., Suto, K., Yamazaki, Y., Morita, T., Mizuno, H. (2005). Crystal structure of a CRISP family Ca 2+-channel blocker derived from snake venom. Journal of molecular biology, 350(4), 735-743. Six, D. A., Dennis, E. A. (2000). The expanding superfamily of phospholipase A 2 enzymes: classification and characterization. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 1488(1), 1-19. Sociedad Española de Proteómica. (2014). Manual de Proteómica. Stock, R. P., Massougbodji, A., Alagón, A., Chippaux, J. P. (2007). Bringing antivenoms to subSaharan Africa. Nature biotechnology, 25(2), 173-177. Sunagar, K., Fry, B. G., Jackson, T. N., Casewell, N. R., Undheim, E. A., Vidal, N., Ali, S. A., King, G. F., Vasudevan, K., Vascondelos, V. Antunes, A. (2013). Molecular Evolution of 36 Vertebrate Neurotrophins: Co-Option of the Highly Conserved Nerve Growth Factor Gene into the Advanced Snake Venom Arsenalf. PloS one, 8(12), 10-1371. Takeda, S., Takeya, H., Iwanaga, S. (2012). Snake venom metalloproteinases: structure, function and relevance to the mammalian ADAM/ADAMTS family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 1824(1), 164-176. Utkin, Y. N. (2015). Animal venom studies: Current benefits and future developments. World journal of biological chemistry, 6(2), 28. Utkin, Y. N. (2013). Three-finger toxins, a deadly weapon of elapid venom–Milestones of discovery. Toxicon, 62, 50-55. Vonk, F. J., Admiraal, J. F., Jackson, K., Reshef, R., de Bakker, M. A., Vanderschoot, K., van den Berge, I., van Atten, M., Burgerhout, E., Beck, A., Mirtschin, P. J., Kochva, E., Witte, F., Fry, B. G., Woods, A. E., Richardson, M. K. (2008). Evolutionary origin and development of snake fangs. Nature, 454(7204), 630-633. Vonk, F. J., Casewell, N. R., Henkel, C. V., Heimberg, A. M., Jansen, H. J., McCleary, R. J., Kerkkamp, H. M., Vos, R. A., Guerreiro, I., Calvete, J. J., Wüster, W., Woods, A. E., Logan, J. M., Harrison, R. A., Castoe, T. A., Jason de Koning, A. P., Pollock, D. D., Yandell, M., Calderon, D., Renjifo, C., Currier, R. B., Salgado, D., Pla, D., Sanz, L., Hyder, A. S., Ribeiro, J., M., Arntzen, J. W., van den Thillart, G. E., Boetzer, M., Pirovano, W., Dirks, R.P., Spaink, H. P., Duboule, D., McGlinn, E., Kini, R. M., Richardson, K. (2013). The king cobra genome reveals dynamic gene evolution and adaptation in the snake venom system.Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(51), 20651-20656. Warrell, D. A. (2010). Snake bite. The Lancet, 375(9708), 77-88. Weinstein, S. A., Keyler, D. E., White, J. (2012). Replies to Fry et al.(Toxicon 2012, 60/4, 434– 448). Part A. Analyses of squamate reptile oral glands and their products: A call for caution in formal assignment of terminology designating biological function. Toxicon, 60(5), 954-963. Weinstein S. A. , White J., Keyler D. E., Warrell D. A. (2013). Non-front-faged colubroid snakes: A current evidence-based analysis of medical significance. Toxicon, 69: 103-113. World Health Organization. (2007). Rabies and envenomings: a neglected public health issue. World Health Organization. World Health Organization. WHO Guidelines for the Prevention and Clinical Management of Snakebite in Africa [http://www.afro.who.int/en/clusters-a-programmes/hss/essentialmedicines/edm-publications/2731-guidelines-for-the-prevention-and-clinical-management-ofsnakebite-in-africa.html] Yamazaki, Y., Morita, T. (2004). Structure and function of snake venom cysteine-rich secretory proteins. Toxicon, 44(3), 227-231. Página web especializada Reptile Database. [http://www.reptile-database.org/]