Efecto de la raza sobre la acumulación de cobre en terneros de cebo

UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTADE DE VETERINARIA DE LUGO DEPARTAMENTO DE PATOLOXÍA ANIMAL EFECTO DE LA RAZA SOBRE LA ACUMULACIÓN DE COBRE EN TERNEROS DE CEBO Memoria presentada por la licenciada Dña. Betiana A. Gutiérrez Álvarez para optar al grado de Doctora en Veterinaria Lugo, noviembre de 2007 D. JOSE LUIS BENEDITO CASTELLOTE, Profesor Titular del Departamento de Patología Animal, Dña. M. MARTA LÓPEZ ALONSO, Profesora Titular del Departamento de Patología Animal y Dña. MARTA I. MIRANDA CASTAÑÓN, Profesora Titular del Departamento de Ciencias Clínicas Veterinarias de la Universidade de Santiago de Compostela INFORMAN Que la Tesis Doctoral titulada “Efecto de la raza sobre la acumulación de cobre en terneros de cebo”, de la que es autora la Licenciada en Veterinaria Dña. BETIANA A. GUTIÉRREZ ÁLVAREZ, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Patología Animal de la Universidade de Santiago de Compostela y, en opinión de los abajo firmantes, este trabajo reúne las condiciones legales para optar al Título de Doctor en Veterinaria. Y para que conste a los efectos oportunos firmamos el presente informe en Lugo a trece de noviembre de 2007. Fdo. José Luis Benedito Castellote Fdo. M. Marta López Alonso Fdo. Marta I. Miranda Castañón A mi Familia A mis Amigos Deseo expresar mi más sincero agradecimiento a las siguientes personas: Profesor Dr. D. José Luis Benedito Castellote, Director de la presente Tesis Doctoral, por brindarme esta gran oportunidad y abrirme las puertas de España y de la Facultad de Veterinaria de Lugo, así como su apoyo y ayuda inestimables. Las Profesoras Doctoras Dña. Marta López Alonso y Dña. Marta Miranda Castañón, codirectoras de la presente Tesis, por su ayuda, guía y paciencia para la realización de este trabajo. Los Profesores Doctores D. Joaquín Hernández Bermúdez y Dña. Cristina Castillo Rodríguez por su constante apoyo y cariño durante todo este tiempo. Mis compañeros del Departamento de Patología General, Patricia, Victor, Marco, Mayte e Isabel por su constante colaboración, su compañía y por soportarme en el día a día. Dr. D. Jesús Velasco Pastor por convertir nuestros muestreos en una cita tan deseada, por su disposición, por las risas, los momentos musicales y su amistad sincera. D. Delfín Olmos Luciañez, propietario del Establecimiento Nadela, por su colaboración y predisposición para la realización de las tareas de campo. Al Dipartimento Clínico Veterinario de la Universidad de Bologna (Italia), especialmente al Prof. Paolo Famigli Bergamini y al. Prof Arcángelo Gentile por coordinar mi estancia y abrirme las puertas del Hospital Clínico permitiéndome enriquecer este trabajo con una magnífica experiencia clínica. A los compagni del establecimiento Stalla dell’ Oppio (Módena), Vet. Andrea, Franca y Saverio por permitirnos alborotar su rutina, por su colaboración y paciencia. Pero muy especialmente al Dr Giovanni Bernardini por demostrarme que la generosidad, el cariño y la amistad no conocen de idiomas. A toda la gente de Italia que se cruzó en mi camino e hizo de mi estancia una experiencia inolvidable, Giussepe, Nicoletta, Emanuella, Silvio, Miguele, Andrea, Moira y en especial a Luca…a tutti voi grazie mille. A mis Jefes y Amigos del Área Clínica Médica y Quirúrgica de Rumiantes de la Universidad de Buenos Aires por acompañarme en esta aventura y brindarme sus constantes consejos, apoyo y cariño. Especialmente a los Doctores Roberto Perna, Eloy Fernández, Mariano Nahum, Diego Stewart, Marcelo Tropeano , Marcelo Zurita y a Lía Bouzo. A mis amigos del alma y compañeros de la vida, Vera, Soledad, Guadalupe, Gabriel, Mauricio, Natalia, Soledad, Lorena, Mariana, Andrea, Roxana, Florencia, Ventu y Gilda, por acompañarme a cada paso y estar siempre a mi lado sin importar las distancias. A mis amigos, Patri, Victor, Marco, Mayte, Eva, Marcos e Isa, por brindarme su cariño incondicional, estar siempre presentes y hacerme sentir como en casa en todos estos años. A mis tíos Óscar y Julita por su entrañable presencia, dedicación, apoyo y cariño constantes . A mi Familia por entero, desde mis abuelos, tíos, primos y primas políticas, sobrinos, ahijados, a todos ellos por brindarme el orgullo de pertenecer y la pertenencia del amor. A mi prima Analía por la inestimable ayuda con el inglés pero principalmente por estar siempre a mi lado, a pesar de los kilómetros que nos separan. A mis hermanos, Adolfo y Adrián, por cuidarme, quererme y acompañarme durante toda mi vida. A Adolfo y Analía por su compañía, apoyo, paciencia y amor durante estos tres años. A Francisco, Sofía, Santiago y Máximo, por ser los soles que iluminan mis días. Por último, aunque ellos saben que son los primeros, a Mis Padres, por su amor y apoyo incondicionales, por creer siempre en mi y sencillamente porque todo se lo debo a ellos… A toda la gente que no nombro en esta Tesis pero que me ayudan cada día a ser un poco mejor… a todos ustedes ... MUCHAS GRACIAS. Esta Tesis Doctoral ha sido realizada gracias a una Beca Predoctoral para estudiantes iberoamericanos otorgada por la Universidade de Santiago de Compostela en cofinanciación con el Departamento de Patología Animad de la Facultad de Veterinaria de Lugo y enmarcada dentro del Proyecto de Investigación titulado: “Estudio sobre el efecto de la suplementación de distintos niveles de cobre en cebo intensivo de terneros” (PGIDIT04RAG261005PR), financiado por la Xunta de Galicia y desarrollado en el Departamento de Patología Animal de la Facultad de Veterinaria de Lugo, Universidade de Santiago de Compostela. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 4 altamente tolerante a niveles elevados de cobre en la dieta, hecho que se manifiesta en su suplementación (junto con zinc) como promotor de crecimiento a altas concentraciones (250 mg Cu/kg materia seca) en los sistemas de producción intensiva (Poulsen, 1998). Adentrándonos en la familia de rumiantes, se descubrió, que el ganado ovino era particularmente susceptible a la intoxicación por cobre, probablemente por su incapacidad de incrementar la excreción biliar de cobre en respuesta a niveles altos en su dieta ; y sin embargo, durante muchos años se consideró al ganado vacuno como una especie resistente ya que los episodios de toxicidad eran poco frecuentes. Es por esto que no se incluía a la intoxicación por cobre dentro de los paneles de diagnóstico diferencial de otras enfermedades en esta especie. No obstante, esta realidad cambió y en los últimos años el número de casos de intoxicación por cobre en ganado vacuno se incrementó de forma drástica (Bradley, 1993; Engle y Spears, 2000a), incluso con niveles de acumulación hepática claramente inferiores a los considerados como tóxicos de forma clásica (Perrin et al., 1990; Gummow, 1996). Esta alarma dió origen a nuevas investigaciones que no han llegado a demostrar que la causa principal sea una concentración excesiva de cobre en la dieta y tampoco se ha llegado a identificar un alimento o grupo de ellos como causa fundamental en este tipo de intoxicaciones. Se piensa, sin embargo, que muchos casos podrían estar asociados a un cambio en el tipo y disponibilidad de los suplementos de cobre empleados (Galey et al., 1991; Steffen et al., 1997). Así, se observó, que determinados suplementos, donde el mecanismo de acción de los aminoácidos es quelar minerales, aumentan la disponibilidad de los mismos en un 300-500% en comparación con las tradicionales sales de sulfato de cobre, generando en muchos de los casos, episodios de toxicidad relacionados directamente a estos cambios en los suplementos dietéticos empleados (Galey et al., 1991; Steffen et al., 1997). Estudios recientes en animales suplementados con cobre, dentro de los límites permitidos, ponen de manifiesto que se alcanzan niveles de residuo en hígado de alrededor de 125 mg Cu/kg, los que se encuentran claramente por encima de los valores de normalidad (25-100 mg/kg; Puls, 1994) y que en algunos casos los animales mostraban un menor consumo de alimento y ganancia de peso en comparación con los animales control (Engle and Spears, 2000a). Estos niveles de cobre que parecen estar asociados a toxicidad subclínica en terneros han sido descritos a gran escala en numerosos países, estando asociados en la mayor parte de los casos al uso de suplementos minerales por encima de las necesidades animales (Hadrich, 1996; Jilg et al., 1997) o a la contaminación de pastos o forrajes por emisiones industriales, mineras o lodos, especialmente purines de cerdo ricos en cobre (Tokarnia et al., 2000; López-Alonso et al., 2001). INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 5 A la hora de estudiar el metabolismo y acumulación de cobre en animales, y especialmente en rumiantes, es importante señalar que el desarrollo de problemas de deficiencia y toxicidad no va a depender solo de la concentración de cobre en la dieta, sino que va a verse afectado por numerosos factores que condicionan tanto la absorción/excreción como la biodisponibilidad del mismo (Gooneratne et al., 1989a). Entre estos factores, el estatus de otros elementos en la dieta, principalmente el molibdeno y el azufre, aunque también el zinc y hierro, van a ser fundamentales para estimar los requerimientos nutricionales de cobre. Así, a modo de ejemplo, podemos señalar que pequeños cambios en la concentración de molibdeno y azufre en el pasto o en la ración pueden ser capaces de producir cambios mayores en la absorción, distribución o excreción de cobre en los rumiantes, dando como resultado síndromes clínicos tanto de deficiencia como de toxicidad (Suttle, 1991; Smith y White, 1997). Además de los factores propios de la dieta, la susceptibilidad a padecer desordenes en el metabolismo del cobre va a depender enormemente de factores propios del animal. En este sentido, uno de los factores que emergen cuando se aborda el tema del metabolismo y la suplementación de cobre en animales de granja es que pueden existir diferencias raciales importantes, tanto en las necesidades nutricionales como en la susceptibilidad a padecer procesos de deficiencia y/o intoxicación, hecho que debería conocerse en detalle para evitar problemas tanto de carencias como de excesos. La importancia del componente racial en el metabolismo del cobre está bien estudiada en ganado ovino, donde existen marcadas diferencias genéticas en cuanto a la eficacia de absorción gastrointestinal del cobre dietético y a la excreción biliar. Esto ha permitido clasificar a las razas ovinas en susceptibles o resistentes a la intoxicación por cobre, y de esta forma, no solo ajustar los suplementos a los requerimientos reales de los animales sino la posibilidad de realizar una selección racial específica según las características de cada región geográfica (Underwood y Suttle, 2002). De esta manera se logró, en zonas con conocida carencia de cobre, utilizar aquellas razas con mayor capacidad de retención de cobre (como la raza Texel), disminuyendo así la incidencia de patologías deficitarias; de forma paralela en zonas con riesgo de toxicidad se utilizaron razas consideras resistentes al presentar una menor acumulación de cobre hepático o una temprana saturación de la absorción de cobre como la raza Blackface, permitiendo disminuir los riesgos. La existencia de determinados genes que controlan las concentraciones plasmáticas de cobre ha quedado demostrada al seleccionar líneas genéticas con altos y bajos niveles de cobre (incluso en una misma raza). Según Radostits et al. (2002), la herencia genética podría explicar un 0,3% de la variación normal de este parámetro. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 6 En ganado vacuno, sin embargo, la importancia del componente racial en el metabolismo del cobre apenas se ha estudiado. Aunque se sabe que razas como la Simmental o la Charolesa presentan mayores necesidades que otras como la Angus (Radostits et al., 2002), poco se conoce sobre la posible susceptibilidad a la intoxicación por cobre en estas y otras razas de ganado vacuno. Se ha propuesto, al igual que en el ovino, que las diferencias raciales en el metabolismo del cobre y por lo tanto en los requerimientos de los animales, podrían deberse principalmente a diferencias en la absorción del mineral a nivel intestinal, así como a la excreción biliar del mismo. Esto fue avalado por estudios que demostraron, por ejemplo, que la excreción biliar en la raza Simmental fue el doble que en la raza Aberdeen Angus para cualquier tipo de dieta, lo que predispone a la raza Simmental a sufrir procesos de deficiencia si las condiciones ambientales no son las óptimas (Gooneratne et al. 1994). También se hallaron diferencias genéticas en las concentraciones de cobre hepático dentro del ganado lechero, donde la raza Jersey mostró mayor susceptibilidad a la intoxicación por cobre al acumular mayor cantidad del mismo en hígado comparado con la raza Holstein frente a igual contenido de cobre en la dieta (Dú et al. 1996). Esto mismo fue observado para el ganado Limousin por Grings et al. (1999), llevando a considerar a esta raza como eficazmente adaptable a ambientes donde el cobre sea limitante. Todos estos hallazgos, si bien permiten realizar un manejo más eficaz de los animales según sus características raciales empós de evitar alteraciones metabólicas, no lograron identificar los verdaderos puntos críticos dentro del metabolismo de cobre entre las distintas razas. Tan solo podemos considerar que las diferencias genéticas entre las razas bovinas se centrarían en la variabilidad en la absorción de cobre de la dieta, la excreción de cobre endógeno, la cantidad de alimento consumido y su capacidad de excretar los excesos de cobre (vía biliar). En Galicia, en un estudio previo llevado a cabo por nuestro grupo de investigación en terneros en régimen de explotación tradicional en la Comarca del Deza, en el que los animales estaban expuestos de forma natural a niveles relativamente altos de cobre en los pastos abonados con purines de cerdo ricos en cobre, se constató que existen diferencias raciales en la acumulación de cobre a nivel hepático, donde los animales de raza Frisona acumulan niveles de cobre un 50% superiores a los de raza Rubia Gallega. El hecho de que los cruces industriales entre ambas razas suelen mantener un estatus de cobre intermedio entre las mismas, apunta a la posibilidad de que este acúmulo tenga un componente genético-racial importante y pone de manifiesto la mayor susceptibilidad del ganado de raza Frisona a sufrir procesos crónicos de acumulación de cobre a nivel hepático (Cruz, 2005; Miranda et al., 2006). Este hecho podría tener relevancia, además de en aquellos animales expuestos de forma natural a contaminantes en el medio ambiente (como es la Comarca del Deza), en sistemas INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 7 de explotación intensivos donde las dietas de vacuno se suplementan de forma rutinaria con niveles relativamente altos de cobre. No debemos dejar de tener en cuenta, sin embargo, que muchas veces la suplementación puede ser la adecuada para los animales, pero ante situaciones estresantes o de interacciones con otros oligoelementos en la dieta, se genera una situación de desequilibrio que dispara los signos de deficiencia o intoxicación, y en estos casos serán mas susceptibles aquellas razas que acumulan mayor cantidad de cobre hepático en condiciones normales (Galey et al. 1991; Tremblay y Baird, 1991; Bradley, 1993.) El objetivo general que nos planteamos en esta Tesis Doctoral es evaluar de forma experimental la influencia de la raza (Frisona, Rubia Gallega y cruces industriales de ambas razas) sobre el metabolismo y la acumulación intrahepática de cobre en terneros mantenidos en régimen intensivo y con el nivel de suplementación permitido por la Unión Europea (35 mg/kg materia seca; Reglamento CE Nº 1334/2003 da Comisión de 25 de julio de 2003). Para ello nos planteamos los siguientes objetivos concretos: 1. Evaluar el efecto de la raza sobre diversos parámetros sanguíneos de cobre durante todo el ciclo productivo en terneros 2. Estudiar si existen diferencias raciales en la distribución y acumulación orgánica (hígado, riñón, músculo, corazón, bazo y cerebro) de cobre en el momento del sacrificio. 3. Determinar si existen diferencias raciales sobre la distribución del cobre en distintas regiones anatómicas del hígado, así como la validez de la biopsia hepática in vivo para determinar la acumulación intrahepática de cobre. 4. Valorar la influencia de la raza en la distribución subcelular de cobre en hígado (fraccionamiento subcelular y concentración de metalotioneínas) que puedan condicionar la susceptibilidad de los animales a sufrir procesos de acumulación crónica. 5. Evaluar las repercusiones orgánicas de la acumulación de cobre, a través de parámetros hematológicos y bioquímicos, en las distintas razas. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 11 I. Necesidades y fuentes de cobre en rumiantes Para poder establecer las necesidades dietéticas de cobre, al igual que otros nutrientes o minerales, es necesario previamente tener conocimiento de cuáles son las principales fuentes del nutriente, y conocer los niveles en suelos y plantas, así como los factores que pueden influenciar la disponibilidad de los mismos. I.1. Fuentes de cobre I.1.1. Cobre en suelos Los niveles de cobre en suelos varían de 6 a 60 mg/kg (Kabata-Pendias, 2001). La concentración inicial de cobre en los suelos depende fundamentalmente de dos factores, la roca madre y los procesos de formación del mismo; así, por ejemplo, el contenido de cobre suele ser más alto en suelos ricos en hierro y más bajo en suelos arenosos y orgánicos. El cobre es el mineral más abundante en las rocas mafic e intermedias de la corteza terrestre, mientras que en las rocas eruptivas, como los granitos, se encuentra en concentraciones muy bajas. Se suele presentar bajo formas simples y complejos sulfito; estos minerales se solubilizan fácilmente en procesos intemporales y liberan los iones de cobre sobre todo en ambientes ácidos. El cobre es un catión versátil que en los suelos o en la materia reposicionada cuenta con una gran capacidad para interaccionar químicamente con otros minerales y compuestos orgánicos. Aunque es soluble, y por tanto móvil y disponible, la forma química en la que se presenta en el suelo es de gran importancia para las prácticas agrícolas, mientras que el contenido total de cobre ofrece únicamente información básica para los estudios geoquímicos. La característica más común en la distribución del cobre en cuanto al perfil del suelo es su acumulación en el horizonte (capas superficiales). Esto hace que la determinación de la concentración del cobre en la superficie de los suelos refleje la bioacumulación del metal y las deposiciones recientes provocadas por el manejo del hombre. La variación del pH afecta a la asimilación del cobre, aunque se mantiene al mismo nivel cuando el pH baja de 5. Si se eleva el pH se reduce el cobre asimilado, lo que REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 12 hace que las carencias de cobre se observen con más frecuencia en los suelos calizos (Kabata-Pendias, 2001). I.1.1.1. Reacciones con los componentes del suelo Los procesos que implican la fijación del cobre por el suelo se relacionan con los siguientes fenómenos: • Adsorción. Todos los suelos son capaces de absorber iones de cobre de la fase en la que están disueltos y sus propiedades dependen de la carga superficial de los adsorbentes. La carga superficial está controlada por el pH, por tanto la adsorción de las especies iónicas se puede presentar como una función del mismo. La adsorción del cobre en general es muy elevada, lo que limita su movilidad y hace que sea uno de los 6 microelementos que es adsorbido con mayor fuerza por la superficie de cambio de suelo, explicando así la tendencia a formar enlaces muy enérgicos. Muchos autores constataron que el cobre puede ser absorbido dentro de un rango de 1.90-63.5 mg/g; de esa cantidad absorbida el cobre ha sido siempre encontrado con óxido de hierro y manganeso, hierro amorfo (formas cristalinas), hidróxido de aluminio y arcilla. Harter (1979) demostró que las cifras más significativas en la superficie del suelo se obtuvieron entre absorción de cobre y el total de bases, mientras que en profundidad la absorción de cobre está altamente relacionada con el contenido de vermiculita. • Oclusión, coprecipitación y sustitución. Son fenómenos involucrados en la adsorción inespecífica de cobre. Aquellas fracciones del cobre en el suelo que no se difunden son las que están formando parte de ciertas estructuras minerales que tienen una enorme afinidad por ellas, constituyendo la porción más estable del metal en el suelo. • Quelación orgánica y formación de complejos. La capacidad de los constituyentes orgánicos del suelo para unirse al cobre está reconocida, siendo estas reacciones la llave que gobierna el comportamiento del cobre en la mayoría de los suelos. • Fijación microbiana. Juega un rol muy importante en la unión al cobre en determinadas superficies del suelo. La cantidad de cobre fijada por la biomasa microbiana varía ampliamente y se ve afectada por varios factores como la concentración del metal, las propiedades del suelo y el crecimiento estacional, siendo sin duda un importante paso en el ciclo ecológico de este metal. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 13 I.1.1.2. Contaminación del suelo La contaminación del suelo agrícola por cobre se debe fundamentalmente a la utilización de purines de cerdo (y en menor medida de gallinaza) como fertilizantes, así como al empleo de fitosanitarios, aerosoles y otros productos con un contenido elevado de este metal (García Fernández et al., 1999). En zonas industriales, las emisiones procedentes de actividades antropogénicas pueden contribuir además de forma significativa al enriquecimiento de cobre de los suelos (Grobler, 1999; Grobler y Swan, 1999 a, b; Underwood y Suttle, 2002). Los purines de cerdo contienen elevadas concentraciones de cobre y zinc. Esto se deb a la adición de cobre en las dietas para cerdos como promotor de crecimiento así como para el control de la disentería; simultáneamente se añade zinc para prevenir cuadros de intoxicación por cobre y problemas de paraqueratosis y/o deficiencia de zinc (Christie y Beattie, 1989). El problema deriva en que no se ajustan las cantidades de estos oligoelementos en la dieta a los requerimientos del animal en función de su estado productivo. Si las concentraciones de estos minerales son superiores a los niveles de absorción, que es lo habitual, la parte no absorbida pasa a los purines o estiércol aumentando su poder contaminante (Coppenet et al., 1993; Vilafranca, 1997; Poulsen, 1998). El purín de cerdo está considerado como uno de los problemas medioambientales más importantes en los países con elevada densidad de porcino en intensivo, como Francia (Arzul y Maguer, 1990; Copenet et al., 1993; L’Herroux et al., 1997), Dinamarca (Bak et al., 1997), Holanda (Binnerts, 1986; Esselink et al., 1995) e incluso Reino Unido (Parkinson y Yells, 1985; Christie y Beattie, 1989; Poole et al., 1990; Nicholson et al., 1999), donde se ha demostrado que el uso de estos purines como fertilizante en los campos provoca un incremento anual importante de cobre en los suelos, llegando incluso a alcanzar niveles de toxicidad si el uso de estos purines es elevado (Carballás Fernández et al., 1990). El abonado continuo de los campos con purines de cerdo produce acúmulos considerables de cobre y zinc, que pueden llegar a producir efectos detectables en la biomasa microbiana del suelo e incluso pueden ser tóxicos para los animales, sobre todo la oveja (Christie y Beattie, 1989). Coppenet et al. (1993) observaron como con los años el acúmulo tanto de cobre como de zinc en los suelos aumenta de manera preocupante. Arzul y Maguer (1990) observaron una correlación positiva entre el número de cerdos por hectárea y el nivel de cobre en los estuarios, señalando además que los niveles de cobre en suelos crecían proporcionalmente con la carga porcina. Posteriormente, L’Herroux et al. (1997) en esta misma zona, estudiaron los metales pesados presentes en los purines de cerdo y observaron que al inicio del experimento el cobre en el suelo estaba de forma inerte (fracción residual) y en formas químicas poco asimilables por las plantas. Tras aplicaciones intensivas de REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 14 purines este elemento estaba presente en concentraciones mucho mayores y en formas disponibles, debido a que la reincidencia de abonado produjo cambios de las condiciones ambientales con alteraciones del potencial redox, bajada del pH y condiciones de anoxia o anaerobiosis. Existe por tanto la necesidad de evaluar las condiciones locales y el tipo de suelo en particular antes de proceder a la aplicación de los purines en los campos. Además, debe tenerse en cuenta las características y los niveles de cobre en la hierba y los excesos de este mineral disponibles para el ganado (Parkinson y Yells, 1985). Numerosos autores han descrito en ganado ovino niveles elevados de cobre en hígado en animales que se alimentan de forraje sobre el que se aplican estos purines, siendo frecuentes los casos de intoxicación (Parkinson y Yells, 1985; Christie y Beattie, 1989; Poole et al., 1990; Kerr y McGavin, 1991). Aunque con menor frecuencia, también se han descrito casos de toxicidad en ganado vacuno (Batey et al., 1972; Braude, 1973), atribuidos al consumo de pastos a los que se había aplicado purines de cerdo. La gestión y tratamiento del estiércol y de los purines en las explotaciones de porcino es un aspecto que cada vez adquiere mayor importancia debido a la sensibilidad social y al problema de acúmulo de determinados elementos tóxicos en suelo-planta-animales por el abuso de abonado (De la Torre et al., 2000). Además, la legislación será más restrictiva en el futuro debido a que las dimensiones de las explotaciones han aumentado considerablemente, produciéndose una concentración de la cabaña porcina en determinadas áreas, lo que origina un aumento final de la carga animal y lleva por tanto a problemas para la reutilización del estiércol y purines de la propia explotación, con el peligro de originar situaciones de riesgo para la salud humana y animal (Vilafranca, 1997). Aunque en menor medida, debemos señalar el potencial contaminante del empleo de gallinaza como fertilizante agrícola. A los pollos de crecimiento acelerado se le aportan, al igual que a los cerdos, excesos de minerales como promotores de crecimiento así como para evitar ciertas enfermedades. Por ello, los excrementos de pollo son también una importante fuente de contaminación por acúmulo excesivo de determinados minerales (cobre, zinc y manganeso principalmente) en el suelo y plantas, por lo que debe controlarse el uso continuo de los mismos en los campos para evitar problemas en los pastos y en los animales que se alimentan de ellos (Van der Watt et al., 1994). De forma más puntual, o incluso accidental, la contaminación de cobre en el suelo podría presentarse por la corrosión de materiales de construcción con aleación de cobre como son los alambres eléctricos o las cañerías, entre otros (Kabata-Pendias, 2001). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 15 I.1.2. Cobre en plantas I.1.2.1. Absorción y transporte Los mecanismos de absorción del cobre por las plantas no se conocen en detalle, aunque hay evidencias de que se trata de un proceso de absorción activa; no obstante, cuando se alcanzan niveles de toxicidad de cobre en los suelos pueden ocurrir fenómenos de absorción pasiva. A pesar de la complejidad de los mecanismos de absorción, se observa una correlación entre la concentración del metal en las soluciones nutrientes o en el suelo y la concentración en las plantas, siendo dicha asociación especialmente evidente en el rango de toxicidad (Cook et al., 1997; Kabata-Pendias, 2001). Además, debemos señalar que el contenido de cobre de las plantas que crecen en zonas irrigadas se va a ver condicionado no sólo por factores dependientes del suelo sino también por los niveles de cobre en el agua y demás propiedades de la misma. La distribución del cobre dentro de la planta es altamente variable siendo la tendencia general a acumularse en los órganos reproductivos de la planta; así, la mayor concentración de cobre ha sido encontrada en el embrión de los granos de cereales (con un rango de 8 a 18 mg/kg materia seca) y en la cubierta de la semilla (de 8 a 23 mg/kg), mientras que considerando el total de la misma el valor mayor registrado fue 4 mg/kg (Loneragan, 1981). El movimiento del cobre en la planta determina su utilización por la misma. Así, los tejidos que se encuentran en las raíces poseen la enorme capacidad de unirse al cobre a contragradiente de su transporte hacia los brotes, tanto bajo condiciones de deficiencia como de exceso de cobre. Aunque este proceso todavía no se conoce de forma completa, Loneragan (1981) concluyó con sus estudios que la excreción del cobre desde la raíz hacia el xilema y el floema donde se encuentran las formas móviles del cobre, constituye la base de la nutrición referida al cobre en las plantas. La extracción de cobre por los cultivos es despreciable en comparación con el contenido en el suelo (Cabral et al., 1998; Kabata-Pendias, 2001). A pesar de la tolerancia general de las plantas (especies y genotipos) este metal se considera altamente tóxico (Oskarsson y Norrgren, 1998). Los síntomas generales más característicos de la intoxicación por cobre son clorosis y malformación en las raíces; además, el crecimiento se reduce, sobre todo el de las raíces que son espesas, poco ramificadas y con raicillas de color oscuro (Loué, 1988). Estudios en trigo en crecimiento en suelos enriquecidos en cobre mostraron que las plantas reducían su crecimiento, sufrían clorosis y cambios ultraestructurales en los cloroplastos y manifestaban una eficiencia reducida de la fotoquímica del fotosistema II (PSII) (Eleftheriou y Karataglis, 1989). De todas formas, la toxicidad del cobre no es frecuente debido a la gran capacidad de fijación de este elemento en el suelo, y REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 22 raramente los niveles de la cosecha no fibrosa y en el caso del silo hacen que las mejoras sean consistentes (Suttle, 1986). Diversos componentes de la dieta, como el fitato, el ácido ascórbico, los tiomolibdatos, la fructosa o la fibra presentan la capacidad de acomplejarse con el cobre y por tanto limitar su absorción (Underwood y Suttle, 2002). La intoxicación por cobre es esencialmente un problema en ganado en sistemas de explotación intensiva, pero no por el hecho en sí, si no porque su alimentación implica que la disponibilidad del cobre va a ser mayor. Siguiendo este razonamiento lógico, la deficiencia de cobre es un problema del ganado en pasto por la pobre disponibilidad del cobre en la hierba (Suttle, 1986). I.2.2. Efectos del molibdeno y azufre en la disponibilidad del cobre La capacidad del molibdeno y azufre para inducir deficiencia de cobre en rumiantes es un hecho perfectamente constatado (Whitelaw et al.,1984; Ladefoged y Stürup, 1995; Smart et al., 1992; MacPherson et al., 1997). Se ha acumulado suficiente información sobre las interacciones entre estos metales como para establecer ecuaciones que cuantifican un 78% de variación en la disponibilidad del cobre en ovejas en un determinado lugar (Suttle, 1983 a). Las interacciones con hierro, molibdeno y azufre van a condicionar las necesidades de cobre, y esto debe tenerse en cuenta antes de valorar la capacidad de los alimentos para proporcionar el cobre disponible necesario (Suttle, 1986). I.2.3. La importancia de la constitución genética La constitución genética cobra una gran importancia al conocerse que los desórdenes metabólicos del cobre podrían ser controlados por manipulación genética (Underwood y Suttle, 2002). Como se tratará de forma más específica en otros apartados de esta revisión bibliográfica, la influencia genética en la susceptibilidad a padecer procesos de deficiencia o toxicidad de cobre ha sido ampliamente estudiada en ganado ovino, lo que ha permitido adaptar las razas (susceptibles o tolerantes al cobre) a las características de los pastos (Suttle et al., 2002). En ganado vacuno el efecto de la genética sobre las necesidades de cobre ha sido mucho menos estudiado, limitándose a un número reducido de razas, si bien hay evidencias de que existen diferencias genéticas en cuanto a sus necesidades de cobre (Littledike et al., 1995; Mullis et al., 2003). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 23 II. Metabolismo y funciones del cobre II.1. Metabolismo II.1.1. Absorción Aunque el mecanismo de absorción de cobre en el animal adulto no se conoce con precisión, se sabe que se lleva a cabo en varios tramos del tracto digestivo, desde el estómago al intestino grueso. En el caso de los rumiantes se limita principalmente a duodeno y yeyuno (Underwood y Suttle, 2002). La capacidad máxima de absorción intestinal está dentro del rango del 30-60%. No obstante, de este cobre absorbido una gran parte se secreta, haciendo que al final las cifras que se manejen sean del 5-10% (Quiroz-Rocha y Bouza, 2001). La absorción intestinal cuenta con dos componentes: por un lado el transporte activo que es saturable y mediado por metalotioneínas (se relaciona con concentraciones bajas de cobre) y la difusión simple, que es un mecanismo pasivo e insaturable (relacionado con concentraciones altas de mineral). Además, la absorción de los compuestos de cobre podría agruparse en dos categorías: aquellos que son absorbidos fácilmente como es el caso de hidróxidos, yoduros, glutamatos, citratos y pirofosfatos frente a los que tienen dificultada la absorción que son los sulfatos, óxidos, el cobre metálico y los compuestos de cobre no hidrosolubles (Quiroz-Rocha y Bouda, 2001). La valencia del ion de cobre influye en la disponibilidad del metal en el intestino (Nederbragt, 1984). En animales monogástricos el cobre se presenta normalmente como cobre divalente, mientras que en rumiantes se presenta predominantemente como cobre monovalente cuya absorción es más difícil que en su forma divalente. Es importante señalar que además de las variaciones específicas en la absorción intestinal de cobre ya nombradas hay otras que son propias de las circunstancias del individuo como la edad, raza o propiamente idiosincrásicas. Así por ejemplo, el recién nacido tiene asegurado el aporte necesario de cobre mediante la absorción por picnocitosis de las macromoléculas intactas y el alto contenido de cobre en el calostro, además tiene una mayor capacidad de absorción y sus reservas son mayores (Quiroz-Rocha y Bouda, 2001). Los animales monogástricos y los terneros absorben del 45-55 % del cobre dietético, lo que puede ser debido a los bajos niveles de hierro en su comida a la formación de sulfito de cobre por la reducción de sulfato a sulfito. Bajo condiciones normales los animales monogástricos utilizan de un 30 a 50% del cobre dietético, mientras que los porcentajes disminuyen si se incluyen mayores REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 24 cantidades de cobre en la dieta. En rumiantes el sistema microbiótico en el rumen es un factor importante que determina la disponibilidad del cobre, lo que se denota claramente por la influencia de la producción de sulfito en el rumen; se piensa que está unido el cobre a S-2 formando Cu2S una forma más insoluble incluso que el CuS (Nederbragt, 1984). En el ambiente ruminal con un pH reducido, el cobre se puede presentar de forma monovalente, y de hecho se puede demostrar que muestras de rumen reducen fácilmente grandes cantidades de cobre iónico (Nederbragt, 1984).La razón de la vulnerabilidad del rumiante al déficit del cobre tiene su explicación en los procesos digestivos que tienen lugar en el rumen, donde se degradan las fuentes orgánicas e inorgánicas de azufre a sulfuro. Los protozoos del rumen juegan un papel muy importante en la generación de sulfuro; así se ha visto que en animales libres de patógenos que son extraídos mediante cesárea (Ivan, 1988) o mediante la administración de ionóforos antiprotozoarios (Van Ryssen y Barrowman, 1987), la absorción de cobre está aumentada. Durante la digestión ruminal la mayor parte del cobre liberado va a precipitar en forma de sulfuro de cobre y permanece sin absorberse, mientras que el liberado durante la digestión postruminal se une parcialmente a componentes no digeridos. En ovejas se han propuesto una serie de teorías para explicar la acumulación de cobre por el desequilibrio de la actividad o composición de la microflora del rumen, pero no hay evidencias que constaten estas teorías (Nederbragt, 1984). Tanto en humanos como en animales se ha demostrado que la absorción intestinal de cobre se regula por las formas químicas en las que se presenta en el alimento, el estatus nutricional del individuo y numerosas interacciones con otros factores dietéticos que afectan a la biodisponibilidad. El transporte de cobre en el intestino delgado podría estar condicionado por una gran variedad de componentes dietéticos, incluyendo la fibra, fitatos, ácido ascórbico, tiomolibdatos y aminoácidos (Cousins, 1985). Aunque no se conocen en detalle los mecanismos bioquímicos involucrados, hay evidencias de que la absorción intestinal de cobre se regula en gran medida por las necesidades del organismo, donde las metalotioneínas juegan un papel destacado en el mantenimiento de un estatus nutricional adecuado (Bremner, 1998). La razón por la que estas proteínas varían tanto en animales de genética y estados fisiológicos distintos no se conoce, algunas posibilidades podrían ser cambios en el flujo de cobre o ratio de síntesis/degradación de la proteína (Cousins, 1985). A modo de ejemplo, el cordero que es alimentado con leche puede llegar a absorber un 70-85 % del cobre ingerido, mientras que el destetado absorbe menos del 10%. Durante la gestación, el aumento en la retención de cobre en las ratas es en parte una consecuencia de la disminución de la excreción biliar del metal (Terao y Owen, 1977). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 25 Cuando se enriquece la ración con molibdeno y azufre se forman tiomolibdatos que llevan a la formación de compuestos de cobre que son más complejos y además el cobre tiende a unirse más fuertemente al material particulado (Allen y Gawthorne, 1987 a,b), se reduce entonces la disponibilidad del cobre llevándolo a una absorción menor al 1% (Price y Chesters, 1985). La absorción del cobre se va a ver mermada por la acción de antagonistas, y así cabe citar como los más importantes: • Elementos de transición. Existen elementos químicos que son similares al cobre y que van a competir con él por los sitios de unión en los sistemas metabólicos específicos, incluyendo la absorción intestinal. Evans et al. (1970a) aislaron y purificaron unas proteínas metalafines en el duodeno de ganado vacuno y demostraron que el cadmio y el zinc desplazan al cobre de los puntos de unión sulfhídricos. • Ácido ascórbico. El ácido ascórbico es reconocido como un antagonista del cobre en numerosas especies animales (Johnson y Murphy, 1988) probablemente debido a la capacidad de reducción de su forma divalente a la monovalente. Hunt et al. (1970) observaron una reducción significativa del cobre hepático en pollos con una dieta suplementada con ácido ascórbico, concluyendo que afectaba la absorción de cobre, o su utilidad y/o ambos. Evans et al. (1970b) demostraron una disminución en la unión de cobre a las metalotioneínas en intestino e hígado después de la adición de ácido ascórbico; el análisis espectral de las proteínas indica que la vitamina interactúa con las metalotioneínas y por eso inhibe la formación de mercáptidos. En experimentos llevados a cabo en animales de laboratorio alimentados con dietas deficientes de cobre y suplementados con 1-5% de ácido ascórbico se observaron mayores índices de mortalidad, pérdidas de peso y bajo valor de hematocrito y hemoglobina que en los animales control; así se sugería que el ácido ascórbico daña el estatus de cobre a través de una disminución en la absorción o un aumento en la movilización del mismo (Johnson y Murphy, 1988). • Complejos dietéticos cúpricos. La disponibilidad del cobre se ve condicionada por la naturaleza de los componentes de la dieta. Existen investigaciones que demuestran que la proteína ingerida tiene un papel protector frente a la acumulación de cobre (McKee y Frieden, 1971) y que consiste en la formación de complejos macromoleculares que los invalidan para su absorción. • Aniones. La forma más conocida como inhibidora sobre la absorción del cobre es el sulfito, hecho comprobado en numerosas especies animales como ratas, cerdos o el hombre (Underwood y Suttle, 2002). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 26 II.1.2. Transporte y almacenamiento El cobre a nivel intestinal se enlaza a una metalotioneína de la mucosa lo que limita su traslocación posterior (Cousins, 1985) y permite la adaptación a ingestiones excesivas (Woolliams et al., 1983). Después de la absorción intestinal el cobre es transportado a través de la sangre por la albúmina. Para ser captado por el hígado se une a glutatión primero y después a metalotioneínas y otras proteínas citoplasmáticas, donde es utilizado para el metabolismo hepático, almacenado en forma de Cu-metalotioneínas o, si el aporte es excesivo, eliminado a través de la bilis. El cobre necesario para el metabolismo extrahepático abandona el hígado en forma de ceruloplasmina, cuya síntesis está condicionada por fenómenos como la inflamación, ciertas hormonas y niveles de cobre (Cousins, 1985). En el caso de un déficit de cobre, se produce un aumento en la actividad hepática de los enzimas encargados de la síntesis de glutation (Chen et al., 1995) que estimulan la eficacia en la captación de cobre por el hígado; lo mismo sucede en la exposición a un exceso de selenio (Hartman y van Ryssen, 1997). La captación de cobre en el resto del organismo ocurre sobre todo debido a receptores de ceruloplasmina en la membrana celular (McArdle, 1992; Saenko et al., 1994), aunque también se observó in vitro que la albúmina y algunos aminoácidos como la histidina facilitan su captación. La ceruloplasmina constituye la fracción de cobre plasmático más elevada en animales, a excepción de las aves donde la actividad de esta proteína en el torrente sanguíneo es muy escasa. En los animales no rumiantes constituye el 95% del cobre plasmático frente al 80% de los rumiantes. En vacuno los niveles de ceruloplasmina disminuyen drásticamente durante una deficiencia de cobre y pueden alcanzar niveles no detectables en ganado aparentemente sano (Humphries et al., 1983). En la sangre, el cobre se encuentra principalmente en los eritrocitos, donde el 60% del total está asociado al enzima superóxido dismutasa (SOD) mientras que el 40% restante se encuentra libre. Este último está contenido en un compartimento dializable que Bush et al. (1956) designaron como pool lábil en el que está unido a aminoácidos y que probablemente es necesario para asegurar un adecuado suplemento para mantener la actividad enzimática superóxido dismutasa. El cobre total contenido en los eritrocitos permanece constante a pesar del estatus de cobre del animal y esto ocurre en la mayoría de las especies animales tanto en casos deficiencia como en ingestiones excesivas. Ante situaciones de deficiencia de cobre se produce un estímulo del reciclaje al optimizar la eficacia de absorción, si bien los mecanismos involucrados en este proceso homeostático no se conocen en detalle. Tampoco se sabe hasta qué punto el REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 27 cobre es vulnerable a los tiomolibdatos capaces de estimular las pérdidas de cobre. Smith et al. (1968) obtuvieron un aumento de 2.5 veces en las pérdidas fecales endógenas de cobre en ovejas que recibían grandes suplementos de molibdeno (25 mg/kg) y azufre (4.5 mg/kg). Woollians et al. (1983), al igual que Freudenberger et al. (1987), observaron incrementos notables en la velocidad de depleción hepática del cobre al tiempo que veían un efecto de la estimulación del molibdeno de la ración sobre las pérdidas endógenas de cobre. Por último comentar que la captación del cobre no va a condicionar la excreción del mismo por vía urinaria. Como el cobre circula en la sangre unido a la ceruloplasmina o se encuentra confinado dentro de los eritrocitos, es muy poco el cobre permeable en los capilares glomerulares, lo que hace que la excreción urinaria de cobre sea insignificante en todas las especies animales, aunque se sabe que en las ovejas aumenta ante la exposición a molibdeno (Smith et al., 1968; Marcilese et al., 1969). II.1.3. Metabolismo hepático El éxito en la adaptación a las variaciones en el aporte de cobre en la dieta se consigue gracias al almacenamiento hepático y la excreción biliar, si bien la proporción de cobre almacenado así como la capacidad de eliminación biliar varía ampliamente según la especie animal. Los rumiantes, especies más vulnerables a la deficiencia e intoxicación de cobre, almacenan los excesos de este micronutriente, mientras que los no rumiantes, que no cuentan con ningún riesgo, excretan por vía biliar el exceso de cobre y mantienen bajos los niveles hepáticos de este metal. Deben tenerse en cuenta también las diferencias entre especies en cuanto a la restricción de la acumulación hepática mediante excreción biliar; de hecho la incapacidad del ovino para la eliminación biliar de cobre explica su mayor vulnerabilidad a padecer procesos de intoxicación crónica frente a otras especies como el porcino donde esta capacidad no es limitada (Bremner, 1998). En rumiantes cuando ocurre una depleción de cobre (por ejemplo ante una falta de ingestión en la dieta) el ritmo al que desciende el cobre hepático se correlaciona de manera positiva con las concentraciones previas a la depleción en este órgano (Woollians et al., 1983; Freudenberger et al., 1987). En los tejidos extrahepáticos el metabolismo del cobre se limita sobre todo a la síntesis y degradación de enzimas cobre-dependientes, mientras que el hígado está implicado además en el mantenimiento de la homeostasis del cobre. II.1.3.1. Distribución subcelular de cobre y almacenamiento hepático Dentro del hígado, el cobre se encuentra asociado a distintas fracciones celulares en las que desempeña un papel específico, tanto formando parte de enzimas cobre dependientes como ligado a proteínas de almacenamiento. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 28 Estudios de fraccionamiento subcelular, llevados a cabo principalmente por técnicas de centrifugación diferencial (Corbett et al., 1978; Gooneratne et al., 1979; Saylor y Leach, 1980; Jenkins, 1989; Kumaratilake y Howell, 1989), consideran que en las células hepáticas el cobre está contenido en cuatro grandes fracciones, desempeñando unas funciones específicas en cada una de ellas: • Fracción microsomal. Contiene al menos un 10% del cobre total en la célula hepática y representa las fracciones del retículo endoplasmático rugoso, retículo endoplasmático liso, aparato de Golgi y ribosomas. Está involucrada en la nueva síntesis de proteínas que contienen cobre que están siendo transportadas con el fin de su uso o secreción. • Fracción nuclear. Contiene aproximadamente el 20 % del cobre total hepático en la mayoría de los mamíferos, si bien su contenido exacto es difícil de evaluar puesto que en esta fracción queda además englobado el cobre unido a restos de tejidos y células intactas. Se considera una organela que puede funcionar como un almacén temporal. Está constituido por ácido nucleico y proteínas básicas a las cuales se une el cobre. • Fracción granular. En la mayor parte de los animales con un estatus adecuado representa el 20% del cobre total. Está compuesta por mitocondrias y lisosomas, éstos últimos con un papel vital para mantener la homeostasis del cobre. El material que no puede ser digerido o preparado para su excreción por el parénquima es almacenado dentro de los lisosomas, organelas que secuestran el exceso de cobre previa excreción biliar. • Citosol. El sobrenadante final o citosol contiene la mayoría del cobre hepático en los mamíferos adultos. Está asociado en su mayor parte a proteínas específicas metal-afines como las metalotioneínas (principales puntos de almacenamiento temporal de cobre en la célula) aunque en menor medida también a enzimas cobre-dependientes como la superóxido dismutasa. Es necesario señalar que la proporción de cobre en las distintas fracciones subcelulares mencionadas varía de forma muy destacable en función de diversos factores como la especie animal, edad y estatus de cobre. VARIACIONES EN LA DISTRIBUCIÓN SUBCELULAR DE COBRE DEPENDIENTES DE LA ESPECIE ANIMAL En la mayoría de las especies de mamíferos con un estatus normal de cobre la mayor proporción de este metal (por encima del 50%) está localizada en el citosol, como almacenamiento temporal en forma de metalotioneínas. La capacidad de esta fracción para almacenar cobre va a depender de forma muy importante de la especie animal, siendo muy alta en aquellas, como el perro y el cerdo, que tienen una enorme capacidad de síntesis de metalotioneínas, en comparación con otras, REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 29 como los rumiantes, donde esta capacidad es muy limitada. A su vez, la escasa capacidad de los rumiantes y especialmente el ovino, para la síntesis de metalotioneínas hace que la excreción biliar de cobre vía lisosomal sea muy limitada, lo que conduce a su almacenamiento en concentraciones elevadas en la fracción granular. LA EDAD COMO AGENTE MODIFICADOR DE LA DISTRIBUCIÓN SUBCELULAR DE COBRE EN EL HÍGADO La concentración hepática de cobre en la mayoría de las especies de mamíferos va aumentando de forma constante durante el periodo intrauterino, alcanza un máximo antes o en el momento del nacimiento y después disminuye hasta alcanzar los niveles encontrados en adultos (Underwood y Suttle, 2002). Evans et al. (1970c) demostraron con sus experimentos que los aumentos en las concentraciones hepáticas de cobre en animales inmaduros resultan de su limitada capacidad de eliminación biliar. Al igual que la concentración total de cobre hepático, el contenido de cobre en las distintas organelas varía de forma destacable con la edad. Así, los estudios realizados con centrifugación diferencial en hígado humano (Porter, 1964), bovino (Porter et al., 1961) y de rata (Gregoriadis y Sourkes, 1967; Evans et al., 1970c) demostraron que las fracciones granular y nuclear contienen el más alto nivel de cobre durante el desarrollo neonatal (con un total de casi un 80% del cobre total neonatal del hígado inmaduro) mientras que el citosol contiene únicamente un 15%. Durante el desarrollo, una vez que maduran los mecanismos homeostáticos de eliminación biliar, el contenido de cobre disminuye drásticamente en la fracción granular y nuclear y ligeramente en el citosol, mientras que el resto es distribuido en las organelas subcelulares en la proporción previamente descrita. Las alteraciones de la distribución subcelular hepática que dependen de la edad señalan la existencia de un mecanismo homeostático de protección en las células hepáticas. Como la eliminación de cobre es limitada en el hígado inmaduro y esto causa un aumento de la concentración del mismo, los sitios de unión en el citosol llegan a saturarse y el exceso de cobre pasa a estar unido a los lisosomas o es incorporado a las proteínas de las mitocondrias y del núcleo. Cuando el animal madura y la capacidad de eliminación biliar del cobre mejora, la acumulación de este metal dentro de la célula disminuye y así también disminuye la necesidad de unión del cobre a organelas celulares. Cuando el movimiento del cobre hepático alcanza su máxima capacidad, la mayor proporción de cobre hepático está unido a metalotioneínas dentro del citosol en la mayoría de las especies, a excepción de los rumiantes que presentan una capacidad de síntesis de metalotioneínas muy limitada (Evans, 1973; Cousins, 1985). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 30 EFECTO DEL ESTATUS DEL COBRE EN SU DISTRIBUCIÓN SUBCELULAR Ante el acúmulo de cobre en el hígado la distribución subcelular se asemeja a la de los neonatos (Gregoriadis y Sourkes, 1967; Evans et al., 1970c), en ambos casos el contenido de cobre en las organelas subcelulares y la concentración hepática siguen una función lineal. La capacidad de unión es alta en la fracción granular y nuclear, mientras que en el citosol es limitada; el retículo endoplasmático liso y las proteínas del núcleo son los encargados de mantener la homeostasis del cobre hepático. La distribución subcelular de cobre, zinc, hierro y molibdeno fue investigada en el hígado de terneros pre-rumiantes alimentados con lactorreemplazantes, comparando los efectos de una dieta control de 10 mg Cu /kg (dosis control) y 1000 mg Cu /kg (dosis alta), o con la dosis alta de cobre de 1000 mg/kg junto con zinc. En los animales del grupo control el cobre se localizaba principalmente en el núcleo y la fracción lisosomal, el zinc principalmente en el citosol, el hierro en el citosol y la fracción nuclear, mientras que el molibdeno se presentaba en todos los compartimentos con un mínimo en los microsomas. Los terneros que recibían dosis altas de cobre presentaban marcados aumentos de cobre en el núcleo y la fracción del citosol, el zinc aparecía reducido en el citosol, el hierro aumentado en el núcleo y el molibdeno disminuido en todas las fracciones (Jenkins y Hidiroglou, 1989). II.1.3.2. Influencia materna en el metabolismo fetal del cobre Salvo la especie ovina la mayoría de los animales neonatos presentan una mayor concentración de cobre en el hígado que los adultos (Underwood y Suttle, 2002). Gracias al almacén mineral en el hígado fetal, el recién nacido obtiene el cobre necesario para los primeros estadios de vida. Las reservas neonatales se reducen si se produce una restricción del aporte materno, con esto se acelera su depleción posterior (Wiener et al., 1984 a, b). El feto tiene una máxima prioridad frente a la madre a la hora del reparto del cobre dietético. Se ha observado que vacas con concentraciones de cobre hepáticas bajas (<24.8 mg/kg peso seco) pueden criar terneros que contienen en sus hígados 330 mg/kg materia seca de cobre (Gooneratne y Christensen, 1985); sin embargo con valores maternos por debajo de 16,5 mg/kg peso seco, los valores fetales descienden en más de un 50%. En cuanto a la concentración de cobre en la leche materna se ha observado que la secreción de este oligoelemento se reduce cuando el aporte dietético es inadecuado, si bien no se incrementa al suplementar cobre en la ración (Whitelaw et al., 1983). También es destacable la existencia de diferencias en los niveles de cobre en leche entre especies, mientras que en vaca y cabra son bajos (0,15 mg/l Cu) la cerda REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 31 secreta niveles altos (0,75 mg/l Cu) durante un periodo breve, posiblemente debido a que se trata de una lactación de una camada grande y de rápido crecimiento (Underwood y Suttle, 2002). De lo dicho anteriormente se desprende que el almacenamiento de cobre en el hígado fetal a expensas de la madre, seguido de la excreción de cobre sufrida durante la lactación, hacen mermar de forma considerable las reservas hepáticas de la hembra. En casos de deficiencia de cobre, las escasas reservas de la madre pueden no ser suficientes para cubrir las necesidades, lo que hace que la descendencia nazca con reservas hepáticas de cobre disminuidas y que consuman leche donde el contenido de cobre está muy por debajo de lo normal (Suttle et al., 1970). II.1.4. Proteínas implicadas en el metabolismo del cobre II.1.4.1. Ceruloplasmina Como hemos indicado, la ceruloplasmina es la principal proteína exportadora de cobre hepático hacia los tejidos. Presenta un peso molecular de 132000 daltons y contiene 6 átomos de cobre por molécula (Frieden, 1980) y liga del 90 al 95% del cobre en el torrente sanguíneo (Cousins, 1985). Después de un tiempo la ceruloplasmina vuelve al hígado donde se degrada en los lisosomas. La ceruloplasmina ejerce un papel fundamental en el mantenimiento del equilibrio entre el cobre hepático y extrahepático. Por una parte, el aumento de la concentración hepática de cobre induce la síntesis de ceruloplasmina, lo que permite una mayor redistribución del metal hacia los tejidos periféricos, así como el mantenimiento de los niveles de cobre hepáticos dentro de los límites fisiológicos, si bien es cierto, que por encima de una determinada concentración de cobre en el hígado los niveles de ceruloplasmina alcanzan una fase de meseta (Eckert et al., 1999). Por otra parte, tal y como han demostrado Campbell et al. (1981) la absorción de cobre hacia los tejidos está estrictamente relacionada con la liberación de ceruloplasmina por parte del hígado. Evans et al. (1970c) comprobaron en ratas que la disminución de la concentración hepática de cobre durante el desarrollo neonatal coincide con un aumento de la ceruloplasmina en plasma. La ceruloplasmina se considera como una proteína de fase aguda, con marcadas propiedades antiinflamatorias (Denko, 1979), así como de protección frente a fenómenos de peroxidación lipídica (Dormandy, 1980). Como ejemplos del aumento de ceruloplasmina asociada a procesos inflamatorios podemos citar enfermedades crónicas comunes como la artritis (Sorenson, 1978) y la enfermedad periodontal (Freeland et al., 1976). El mecanismo fisiopatológico que explica este aumento de REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 38 La velocidad de excreción biliar es muy variable dependiendo de la especie animal. De forma experimental se ha demostrado que terneros a los que se les administra cobre excretan menos de un 4 % del total infundido en los tres días siguientes a la administración, mientras que en cerdos se alcanzan cifras del 80-90% (Charmley y Symonds, 1985). Estas diferencias en la excreción biliar explican la enorme susceptibilidad de los rumiantes a padecer procesos de intoxicación crónica de cobre en comparación con los cerdos. En este mismo experimento se demostró que el ganado vacuno puede trasladar por vía intravenosa el cobre infundido de la circulación sistémica al hígado más rápidamente que los cerdos, pero no es capaz de excretarlo vía biliar; en contraste, los cerdos trasladan el cobre infundido más lentamente del plasma, pero son capaces de excretar casi todo el cobre infundido a bilis en un periodo de 3 días (Charmley y Symonds, 1985). Similares resultados han sido descritos en otros experimentos. Lynne et al. (1982) mostraron con sus observaciones en vacas que aproximadamente el 95% del cobre infundido es aclarado rápidamente del plasma, sin embargo, detectaron pequeñas cantidades del cobre excretado en orina y bilis durante los 10 días después de la infusión. Según Phillipo y Graca (1983), la pérdida total de cobre en bilis parecería estar determinada por las concentraciones hepáticas de cobre, aunque no estaba afectada de forma significativa por las distintas concentraciones de cobre en la dieta en un estudio realizado en vacuno. II.2. Funciones del cobre Hace casi un siglo que se conoce la necesidad de que el cobre se encuentre en la dieta de los mamíferos, así como la existencia de patologías asociadas tanto a su deficiencia - entre las que podemos destacar por su importancia la anemia, depresión del crecimiento, diarrea severa, cambios en la coloración del pelo o de la lana (acromotriquia), ataxia neonatal, alteraciones en el crecimiento con presencia de huesos largos, débiles y frágiles, infertilidad temporal e insuficiencia cardiaca (Miller et al., 1993; Benedito et al., 1998; Radostits et al., 2002; Underwood y Suttle, 2002), y que afectan fundamentalmente a los rumiantes en pasto - como a su toxicidad por una exposición excesiva. No obstante, es destacable lo poco que se conocen las causas exactas de por qué la deficiencia de cobre en la dieta provoca enfermedad clínica. Esto se debe, desde el punto de vista práctico, a que la deficiencia de cobre está confinada en su mayor parte a los rumiantes en pasto, y en seguida se trata con la administración de cobre por distintas vías. Sin embargo, se le ha prestado poca atención a las variaciones en la respuesta a la deficiencia de cobre que se han registrado tanto intra como entre especies. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 39 Aunque se sabe que el cobre es un elemento multifuncional, básico para al menos diez metaloenzimas, donde cada una de ellas cuenta con un papel importante en el organismo, todavía no se conocen en detalle los mecanismos fisiopatológicos de las distintas alteraciones orgánicas que aparecen ante una deficiencia de cobre, lo que hace difícil indicar porque aparece una sintomatología específica ante una deficiencia de cobre. En su mayor parte la función del cobre en las metaloenzimas involucra una transferencia de electrones y la unión enzimática a oxígeno molecular. La presencia de un fallo localizado en la actividad de una cuproenzima no evidencia de forma substancial una lesión aunque muchas veces se interpreta de esta forma. A continuación citamos las principales enzimas dependientes de cobre presentes en los tejidos de mamíferos (Tomado de Frieden, 1986). • Citocromo-c-oxidasa (CCO): localizada en la membrana mitocondrial interna. Participa en el transporte electrónico. La falta de esta enzima desencadena una deficiente producción energética, conducción nerviosa y fallo respiratorio. • Superoxido dismutasa (SOD): localizada en citoplasma de cerebro, hígado, corazón y eritrocitos. Actúa en la dismutación de radicales superóxido, y su déficit desencadena degeneración del SNC y convulsiones. • Tirosinasa: localizada en los melanocitos del ojo y de la piel, participa en la producción de melanina y su déficit desencadena despigmentación cutánea. • Dopamina-β-hidroxilasa: está prresenta en el plasma y médula adrenal y participa en la producción de catecolaminas. La falta de esta enzima desencadena desequilibrio en el centro hipotalámico, hipotermia, anorexia, fallo respiratorio, somnolencia, deshidratación y ataxia. • Amino-oxidasa: está presente en plasma, cerebro, pulmón, riñón, intestino, placenta, y participa en la oxidación de mono-, diy poliaminas. El déficit produce aumento de los niveles de histamina y consecuentemente urticaria. • Lisil-oxidasa: Presente en el cartílago, hueso y sangre, participa en la formación de colágeno y elastina. El déficit de esta enzima provoca alteraciones en el tejido conectivo, ruptura vascular, anormalidades óseas, etc. • Ceruloplasmina: está presente en el plasma. Participa en el transporte de cobre y movilización de hierro y antioxidantes. Los bajos niveles de esta enzima provocan anemia. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 40 Experimentos nutricionales han demostrado que el cobre es necesario para una gran variedad de funciones entre las que cabe citar la formación ósea, función cardiaca, desarrollo de tejido conectivo, la mielinización del cordón espinal, queratinización y pigmentación de tejidos (Radostits et al., 2002; Underwood y Suttle, 2002). II.2.1. Eritropoyesis En 1928 Hart et al. establecieron la necesidad del cobre y del hierro para prevenir la anemia en ratas que eran alimentadas con leche, demostrando así la esencialidad del cobre como constituyente de la dieta (Adham y Song, 1980). La sangre es uno de los tejidos diana del cobre ya que este metal está fuertemente involucrado en los procesos de síntesis de la médula ósea (Barceloux, 1999a). La anemia se desarrolla cuando la deficiencia de cobre es intensa o prolongada; cuando los niveles de cobre se reducen a 0,095-0,190 mg/dl no es posible mantener la hematopoyesis normal. Aunque no está totalmente esclarecido el papel del cobre en la hematopoyesis, y por tanto la patogenia de la deficiencia del mismo, todo parece indicar que en vacuno y ovino se trata de una anemia hipocrómica y macrocítica, que en perros es normocrómica y normocítica, mientras que en otras especies como cerdos, conejos y ratas la anemia es hipocrómica y microcítica, como la anemia por deficiencia de hierro. Aunque en un principio se sostuvo la idea de que el metabolismo del hierro agrava la deficiencia de cobre en los animales, hay evidencias de que en algunas especies el efecto eritropoyético no se relaciona con su papel en la síntesis de hemoglobina. Prueba de ello fueron los experimentos realizados en conejos y ratas con suplementos de cobre, en los que el efecto eritropoyético no iba acompañado de un aumento en la cantidad de hemoglobina. Lahey et al. (1952) comprobaron que ante deficiencias de cobre en cerdos a los que se le suplementaba este mineral la microcitosis desaparecía antes de que la concentración corpuscular de hemoglobina volviera a la normalidad, lo que puede ser debido a que el ratio de células en maduración esté retrasado; así bajo este punto de vista, estudios morfológicos en perros con anemia por deficiencia de cobre demostraron que la médula ósea era más hiperplásica que en perros con anemia por deficiencia de hierro y que contaba con un mayor número de células inmaduras. Se han propuesto numerosos mecanismos de participación del cobre en la hematopoyesis: • En animales con un estatus normal de cobre, la alta actividad de la enzima citocromo-c-oxidasa en la médula ósea está totalmente asociada a la hematopoyesis, mientras que en animales cobre-deficientes esta enzima está seriamente disminuida hasta un nivel que afecta la hematopoyesis; en los REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 41 eritroblastos de los animales cobre deficientes las mitocondrias están ampliadas pudiendo presentar una estructura espiral o apilada. • La ceruloplasmina es esencial para la promoción de saturación de hierro de la transferrina y en su utilización en la médula ósea. En animales cobre deficientes la actividad plasmática de ceruloplasmina está disminuida de forma marcada, mientras que en animales con un estatus de cobre dentro de la normalidad su actividad es mayor a la mínima requerida para la máxima movilización de hierro. Parece ser que los defectos de movilización de hierro tan sólo se detectan en procesos de deficiencia de cobre largos y severos, cuando la ceruloplasmina disminuye intensamente, de ahí que la anemia pueda ser un signo tardío de deficiencia de cobre. • Junto con los efectos en la síntesis de hemoglobina, la disminución severa de la actividad de la citocromo-c-oxidasa en animales deficientes afecta a la síntesis de fosfolípidos y retrasa la maduración de los glóbulos rojos. • En cerdos con deficiencia de cobre el tiempo de supervivencia en la circulación de los glóbulos rojos es bastante más corto de lo normal y se atribuye al daño provocado por la peroxidación en las membranas de los glóbulos rojos por el anión superóxido, además de la disminución del enzima superóxido-dismutasa. Finalmente, señalar que se han observado cuerpos de Heinz dentro de los eritrocitos en corderos deficientes de cobre. II.2.2. Protección frente a oxidantes El cobre puede tener un papel protector frente a la oxidación con dos vías de actuación, la primera relacionada con el equilibrio del metabolismo del hierro y la segunda a través de la enzima cobre-zinc superóxido dismutasa (CuZnSOD). Así, el descenso de CuZnSOD se correlaciona con una disminución del cobre hepático y, a su vez, en esta situación se encuentran reducida la capacidad defensiva del hígado de otros radicales libres como son los superóxidos (Taylor et al., 1988). La ceruloplasmina ayuda a defender al organismo como agente antioxidante al capturar el hierro libre y los radicales libres (Saenko et al. 1994), y proporciona además interacciones con otros nutrientes que tienen propiedades antioxidantes como manganeso, selenio y vitamina E. II.2.3. Desarrollo cardíaco Se han registrado casos de cardiomegalia en ganado vacuno tras sufrir episodios de deficiencia de cobre. Gross y Prohaska en 1990 demostraron en ratones que la actividad del enzima dopamina-ß-monooxigenasa (DBM) se encuentra disminuida en situaciones de deficiencia de cobre, mientras que el metabolismo de las REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 42 catecolaminas puede verse seriamente afectado tanto en el corazón como en el cerebro. Se han observado también defectos en la síntesis de proteínas miofibrilares en animales deficientes de cobre asociadas a una baja actividad del enzima citocromo-c-oxidasa (Chao y Allen, 1992). En ratas (Abraham y Evans, 1972) se ha demostrado que la disminución de la actividad de la citocromo-c-oxidasa en el miocardio que se produce en la depleción de cobre se acompaña de cambios morfológicos con un agrandamiento del corazón. Resultados similares han sido también descritos en ganado vacuno (Mills et al., 1976). En muchas especies animales se ha descrito que ante deficiencias severas o prolongadas de cobre, si el corazón está involucrado, puede aparecer una muerte repentina atribuida a una ruptura del miocardio con hemopericardio y hemotórax, mientras que en la depleción crónica se presenta paro cardíaco local con un reemplazo fibroso en el miocardio. Estudios morfológicos, tanto en ganado vacuno como en animales de laboratorio deficientes de cobre, ponen de manifiesto un agrandamiento en la fracción mitocondrial de las fibras del miocardio que contribuyen a la aparición de cardiomegalia; el área ocupada por las mitocondrias agrandadas excedía la de las miofibrillas que aparecían desplazadas y deformadas. No obstante, estas mitocondrias cardíacas, aisladas in vitro, tenían una función normal con respecto a la respiración y fosforilación (Goodman y Dallman, 1970). Los estudios histoquímicos llevados a cabo para evaluar la posibilidad de una adaptación de las mitocondrias ante situaciones de déficit de cobre, mostraron que mientras se producía la disminución de la actividad citocromo-c-oxidasa aumentaban otras enzimas oxidativas mitocondriales. Por ello, se sugirió que el agradamiento del miocardio junto con el incremento en la actividad enzimática se podría explicar por el aumento de las mitocondrias; de forma alternativa, los mecanismos oxidativos para la producción energética podrían también estar aumentados por el uso de vías glucolíticas que son menos eficientes. A nivel histológico, se ha observado que en ganado vacuno con deficiencia crónica de cobre, el corazón aparece más firme (hecho asociado al cambio fibrótico) a pesar de que el miocardio es suave, grueso y pálido. La mayor anormalidad era un espesamiento de la red de fibras miocárdicas, si bien de forma local las fibras miocárdicas atróficas aparecían reemplazadas por tejido fibrótico. La cronicidad con la que aparecen las lesiones en ganado vacuno contrasta con el carácter severo y agudo de las deficiencias de cobre experimentales en cerdos, donde el corazón presenta un aspecto pálido y friable. Así, en cerdos que morían por rotura cardíaca no se hallaron lesiones específicas en las fibras de miocardio; en REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 43 estos animales el principal mecanismo de los daños patológicos eran posiblemente los cambios encontrados en las arterias coronarias (Underwood y Suttle., 2002). II.2.4. Desarrollo de los vasos sanguíneos El cobre ejerce un papel esencial en la formación de los vasos sanguíneos a través de la metaloenzima lisil-oxidasa. De hecho, una de las lesiones registradas con más frecuencia y de mayor importancia en la deficiencia de cobre es la formación defectuosa de los tejidos elásticos que se debe a la falta de dicha enzima. Como consecuencia de esta falta de actividad de la lisil-oxidasa, los enlaces de los residuos de lisina resultan dañados y el tejido elástico sufre fallos estructurales por la supresión de la síntesis de elastina (Rucker y Tinker, 1977), de hecho los test mecánicos realizados en segmentos aislados de aorta muestran que las fuerzas tensionales están disminuidas. La apariencia anormal de la elastina defectuosa en ratas con déficit severo de cobre se reconoce fácilmente en microscopio óptico y electrónico (Kitano, 1980; Prohaska y Heller, 1982). La debilidad progresiva de las paredes arteriales conlleva la aparición de aneurismas y muerte repentina por la rotura de las arterias principales en numerosas especies animales como pollos, pavos, cerdos, conejos y cobayas (Underwood y Suttle, 2002). Sin embargo, ni la fragmentación del tejido elástico ni la ruptura de la aorta han sido observados en ganado vacuno con deficiencia de cobre (Mills et al., 1976) ni en ovino (Cleary y Fanning, 1975), si bien en vacuno se han constatado cambios en el tejido elástico del ligamento nucal (Mills et al., 1976). A nivel de la circulación periférica también se ha observado una fragmentación del tejido elástico de los vasos, lo cual se traduce como hemorragias internas que podrían ser fatales, y en algunos animales hemorragias subcutáneas generales. Así, se ha visto que las deficiencias severas de cobre provocaron lesiones hemorrágicas en embriones de pollo, hemorragias subcutáneas generales en pollos y petequiales en orejas de conejos. También se han observado casos de hidropericardio, hidrotórax, efusión pleural y ascitis, si bien estos efectos son difíciles de aislar de la anemia y los desordenes cardiacos con los que se relaciona. Gallagher (1979) sugirió que probablemente los factores que contribuyen al desarrollo del edema sean los fallos miocárdicos, hepáticos y endoteliales que siguen a la severa depresión de la respiración celular. También se podrían desarrollar pequeñas hemorragias si las células del músculo liso, que son muy sensibles a los efectos de la noradrenalina, presentaran espasmos intermitentes. Lo que parece claro, sin embargo, es que los defectos hemorrágicos son mucho más probables en fetos y recién nacidos, concretamente en las fases de crecimiento y REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 44 órganogénesis, y en relación a esto, cabe destacar el papel activo del cobre como componente de ciertas sustancias angiogénicas que promueven la migración de células endoteliales y el crecimiento de capilares (Mc Auslan et al., 1980). II.2.5. Desarrollo óseo El cobre ejerce una función importante en el desarrollo óseo a través de la enzima lisil-oxidasa, encargada del entrecruzamiento de las fibras de colágeno y elastina, puesto que la mineralización del colágeno es un importante paso en la fase temprana del desarrollo óseo, siendo para ello fundamental el correcto establecimiento de los enlaces de colágeno (Suttle, 1987). Las anomalías en el desarrollo óseo varían ampliamente entre especies y razas. Las alteraciones de la osificación endocondrial que provoca un crecimiento óseo anormal (osteocondrosis) solo pueden afectar a los animales en crecimiento, de forma que la morfología ósea depende del ritmo de crecimiento, la distribución del peso corporal, el movimiento, e incluso el ritmo de crecimiento de las pezuñas. El ensanchamiento de las epífisis en los huesos de las extremidades posteriores es una manifestación frecuente del ganado vacuno en crecimiento con deficiencia de cobre durante dicho periodo. En ganado ovino y vacuno se ha podido apreciar las costillas en apariciencia de “rosario” debido al sobrecrecimiento de las articulaciones costocondrales; los animales adultos pueden presentar osteoporosis sin alteraciones en el crecimiento de la epífisis pero con evidencias de un daño en la actividad osteoblástica y también es frecuente observar una mayor incidencia de fracturas óseas espontáneas. En corderos jóvenes estabulados nacidos de ovejas deficientes en cobre pueden aparecer osteoporosis y una reducción de la actividad osteoblástica pero sin cambios morfológicos de los huesos. En cerdos jóvenes sometidos a deficiencia de cobre muy intensa se observó una reducción de la actividad osteoblástica, el ensanchamiento de la zona epifisaria y el desarrollo de alteraciones óseas notables con fracturas y malformaciones graves, incluyendo marcadas curvaturas de las extremidades anteriores. II.2.6. Desarrollo del sistema nervioso central El papel del cobre en el desarrollo del sistema nervioso central se descubrió en corderos en condiciones de explotación (Brady y Helvig, 1984). Estudios experimentales enfocados hacia el estudio de la deficiencia de cobre en corderos se contraponen en la patogenia del estado atáxico conocido como “ataxia neonatal” o “ataxia enzoótica”, que es uno de los primeros trastornos reconocidos de la deficiencia de cobre. Por un lado se piensa que la lesión primaria se localiza en las neuronas con una degeneración secundaria de mielina y por el otro que la aplasia de REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 45 la mielina cobra una mayor importancia (Bremner y Davies; 1976; Bremner et al., 1978). En cuanto a la deficiencia de citocromo-c-oxidasa descrita en este tipo de procesos, hay autores que afirman que esta enzima es necesaria para mantener la integridad neuronal y axonal, mientras que otros defienden su papel en el mantenimiento de la síntesis de fosfolípidos; la dificultad desde el punto de vista temporal y anatómico para realizar estudios en los tractos nerviosos prolongan esta falta de acuerdo, es más, se ha visto que pueden ocurrir lesiones en la materia blanca y gris en animales normales bajo el punto de vista clínico (Bremner y Mehra, 1983). También se observaron descensos de otros enzimas dependientes de cobre, como el peptidil-α-amidamonooxigenasa (PAM) en el cerebro de ratas recién nacidas de madres deficientes en cobre (Prohaska y Bailey, 1995), ya que del cobre dependen numerosas moléculas biogénicas como las hormonas reguladoras del apetito gastrina y colecistoquinina. En la patogenia de la ataxia neonatal debemos situar la reducción de la actividad de la citocromo-c-oxidasa, enzima esencial para la síntesis de fosfolípidos, que como se sabe son esenciales para la formación apropiada de la mielina a nivel del sistema nervioso central. En este sentido se debe señalar que en animales sanos la actividad de la citocromo-c-oxidasa es muy elevada en el sistema nervioso, y que en las fases iniciales de la deficiencia de cobre en el cerebro ocurre una depleción menor de su actividad, en comparación con otros tejidos como el hígado, posiblemente para poder asegurar la integridad del sistema nervioso; no obstante, en deficiencias de cobre avanzadas hay una pérdida de hasta un 70% de su actividad enzimática (Abraham y Evans, 1972), lo que se traduce en el desarrollo de anomalías del sistema nervioso central. También se constató una reducción importante de la actividad citocromo-c-oxidasa en la región de núcleo rojo del cerebro, así como del contenido en cobre, en la ataxia neonatal tardía. Uno de los factores más crítico en la patogenia de la ataxia neonatal parece ser la concentración de cobre en el cerebro. El valor umbral entre clínica normal y enfermedad se estableció en 3 mg/kg peso húmedo en todo el cerebro; por debajo de este valor hay una asociación clara entre la concentración de cobre y la actividad de la enzima citocromo-c-oxidasa en el núcleo rojo. Smith (1980) encontró en fetos de bovinos deficientes en cobre, una disminución del 60% en la actividad de la citocromo-c-oxidasa en cerebro, si bien los efectos de esta falta de actividad enzimática no son importantes antes del periodo perinatal. El foco lesional en la materia gris del cerebro de corderos afectaba al nacimiento (ataxia neonatal congénita) y a la médula espinal en casos tardíos; este hecho refleja los picos de síntesis de desarrollo de mielina en esos lugares del día 90 de gestación al día 20 después del nacimiento (Lee et al., 1968). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 46 El desarrollo postnatal de la ataxia neonatal tardía ha sido confirmado a través de controles de suplementación de cobre después del nacimiento, pero el tiempo del tratamiento (31±10 días) sugirió que la mielina es vulnerable a la deficiencia de cobre por la razón que sea durante un periodo prolongado de tiempo. II.2.7. Cambios en el tejido elástico Cuando la enzima lisil-oxidasa se encuentra afectada se puede observar una rotura aórtica, desórdenes articulares y osteoporosis. La osteocondrosis observada en ciervos rojos con deficiencia de cobre se acompaña habitualmente de graves defectos de los cartílagos articulares (Thompson et al., 1994), lo que probablemente se deba a un desarrollo alterado del colágeno y de la elastina, que provoca hemorragias subperiostiales e inserciones tendinosas defectuosas. La marcha anormal observada en rumiantes deficientes en cobre que algunos describen como “en pie de paloma” no son simples alteraciones óseas sino una combinación de desordenes que afectan al tejido óseo y conectivo. Rucker et al. (1996) observaron como en ratas deficientes en cobre una disminución del 50-60% de la actividad de lisil-oxidasa en la piel no se acompañaba de modificaciones en la estructura del colágeno. Se cree que la formación defectuosa de la cáscara del huevo de la gallina se produce por anomalías bioquímicas similares (Baumgartner et al., 1978), al igual que la delgadez de la red de capilares alveolares del pulmón de las aves (Buckingham et al., 1981). Fahrenbach et al. (1966) describieron el proceso de elastogénesis del ligamento nucal en vacas y en sus observaciones enfatizaron el alto nivel de la actividad celular en animales cobre-deficientes. La alteración del ligamento nucal provoca una dislocación de la escápula que causa una “joroba” mientras baja la cabeza. II.2.8. Pigmentación Entre las fenoloxidasas que contienen cobre se encuentra el enzima tirosinasa, que está involucrada en la producción de melanina a partir de tirosina. Este proceso es extremadamente sensible a los cambios en el estatus de cobre, de hecho las pérdidas de pigmento en lana, pelo y plumas son un marcado índice de la deficiencia de este mineral (Underwood y Suttle, 2002). La despigmentación suele ser el síntoma clínico más precoz de la deficiencia de cobre en todas las especies animales de capa pigmentada. Así, la falta de pigmentación en la lana de ovejas negras y la formación de pelo gris en ganado vacuno, especialmente alrededor de los ojos, puede ya aparecer con niveles REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 47 marginales de cobre en la dieta, pero suficientes para evitar la aparición de otros síntomas de deficiencia. En las ovejas, el proceso de pigmentación es tan sensible a cambios en la ingestión de este oligoelemento que se pueden encontrar bandas de fibras de lana despigmentadas alternadas con pigmentadas, según se retire o añada cobre a la ración (Underwood y Suttle, 2002). La pigmentación del pelo es reducida, el rojo se transforma en amarillo, el negro en gris, sobre todo alrededor de los ojos, punta de las orejas y en los flancos (Herd, 1990). Para controlar rápidamente el problema, podrían incluirse en el rebaño varias ovejas de lana negra en las que la alteración de la pigmentación es fácilmente detectable. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la despigmentación es un síntoma común que aparece en otros procesos carenciales como deficiencias de vitaminas o cobalto (Underwood y Suttle, 2002). Por este motivo, desde el punto de vista bioquímico así como diagnóstico, la existencia de bajas concentraciones de cobre y acromotriquia en el mismo animal no se pueden interpretar simplemente como causa y efecto. Además de la despigmentación del pelo y de la lana, se registra alopecia y alteración en la estructura de las fibras de la lana que ocurren como resultado de una queratinización alterada. En ovejas con un estatus muy bajo de cobre una de las primeras alteraciones que aparece es el fallo de los folículos para comunicar estructura característica a las fibras de lana, lo que le da un aspecto de “lana de acero”; esto ocurre cuando los grupos sulfhidrilo de prequeratina se oxidan formando grupos disulfuro que producen enlaces de unión en la queratina, ya que para realizar esta transformación son necesarias enzimas Cu-dependientes. II.2.9. Inmunocompetencia El cobre juega un papel esencial en el funcionamiento normal del sistema inmune de los rumiantes. Hay evidencias de un aumento del número de leucocitos en vacas jóvenes deficientes en cobre (Arthington et al., 1996; Gengelbach et al., 1997). El cobre juega un papel muy importante en la función efectiva de los linfocitos B, T y los neutrófilos, macrófagos y función del complemento (Jones y Suttle, 1981; Arthur y Boyne, 1985; Gengelback y Spears, 1998). En animales de laboratorio la deficiencia de cobre puede afectar al número de células que intervienen en la inmunidad, aumentando los mastocitos (células inespecíficas del sistema inmune) y disminuyendo las subpoblaciones de células T (células específicas del sistema inmune) (Mulhen y Koller, 1988). En cuanto a la susceptibilidad a las infecciones, en estudios realizados en ganado ovino en las colinas escocesas para valorar las causas de la mortalidad en un rebaño, entre ellas las genéticas, se observó que las infecciones microbianas eran la causa más importante y que había una correlación significativa entre la susceptibilidad a la REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 54 neonatos debido a la administración de bolos de óxido de cobre descrita por Hamar et al. (1997). El episodio sucedió en Nebraska (USA) en una zona con deficiencia de cobre en la que debido a la falta de eficacia de otros suplementos se recomendó el empleo de bolos de óxido de cobre. En el conjunto de los 8 rebaños afectados, el 7,1% de los animales suplementados murieron mostrando un cuadro de intoxicación por cobre entre las 6 y 8 semanas de edad. Los estudios histológicos confirmaron el diagnóstico, donde las concentraciones de cobre en hígado y riñón superaron en la mayoría de los casos los 1000 y 250 mg/kg peso fresco respectivamente. Sullivan et al. (1991) describen un caso de intoxicación en terneros de entre 2 y 4 meses de edad en cinco granjas debido a la suplementación de la dieta con antihelmínticos que contenían cobre; siete animales murieron y en el estudio postmorten, además de las lesiones típicas de intoxicación por cobre, se observaron concentraciones de cobre en hígado entre 277 y 684 mg/kg y niveles de cobre en riñón entre 1,1 y 82 mg/kg. En otras ocasiones los altos niveles de cobre proceden del propio alimento. Así, citar el episodio de intoxicación por cobre descrito en un rebaño de vacuno en Brasil alimentado con gallinaza en la que murieron 146 de las 1000 cabezas de ganado con síntomas de intoxicación crónica por cobre (Tokarnia et al., 2000). Los niveles de residuo en hígado, que se situaron por encima de 1000 mg/kg peso fresco, confirmaron la intoxicación y el análisis de dos muestras de la gallinaza empleada, con un contenido en cobre de 362 y 323 mg cobre/kg (más de un orden de magnitud superior a las necesidades fisiológicas de esta especie animal) permitió establecer la causa de dicha intoxicación. En otras ocasiones, sin embargo, la suplementación de cobre puede ser adecuada (o al menos estar dentro de los límites que marca la legislación para suplementos animales) y la susceptibilidad a la intoxicación podría estar ligada a ciertos factores estresantes o a la deficiencia de otros oligoelementos en la dieta. Así por ejemplo citar el incidente descrito por Galey et al. (1991) en una zona deficiente de cobre en California en dos rebaños de terneros de aptitud cárnica donde tras la administración de una solución de edetato de cobre disódico por vía parenteral (120 mg de cobre en animales con un peso superior a 150 Kg), 16 animales murieron con signos de intoxicación por cobre. Al tratarse de un nivel de suplementación adecuado, los autores incidan que la susceptibilidad de estos animales al cobre podría situarse en una deficiencia de selenio, puesto que en ambos casos las granjas estaban localizadas en un área deficiente en este segundo oligoelemento. De hecho, está bien establecido que el selenio es un antioxidante esencial en los animales, que aumenta la tasa de supervivencia y minimiza la oxidación celular en ratas a las que se les administran dosis elevadas de cobre (Dougherty y Hoekstra, 1982). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 55 En la misma línea podríamos citar el episodio de toxicidad descrito por Tremblay y Baird (1991) en dos vacas adultas de raza Holstein, pertenecientes a granjas diferentes, con un cuadro de anemia hemolítica y donde el estudio tisular postmorten reveló niveles de cobre compatibles con intoxicación por este metal. En ambos casos tanto los niveles de cobre en la dieta como en los suplementos minerales utilizados era adecuado, lo que lleva a los autores a concluir que podría tratarse de una interacción con niveles bajos de molibdeno o incluso a la presencia de algún factor estresante que precipitase la crisis hemolítica en estos animales que por motivos desconocidos presentaban un nivel de acumulación de cobre en hígado elevado. De forma similar, Bradley (1993) describe también un episodio de intoxicación por cobre en vacuno lechero de raza Holstein con el resultado de 9 muertes de 63 animales (14%) tras la suplementación con 37 mg/kg de cobre en el alimento durante un período de 2 años. Aunque se trata en principio de un nivel de cobre tolerado por esta especie animal, junto con el hecho de que no se identificaron otras causas que predispongan a la intoxicación de cobre (como un contenido bajo de molibdeno en la dieta) lleva a sugerir, al igual que en el caso anterior, la posibilidad de que se trate de una predisposición genética de esta raza a la acumulación de cobre en el hígado. De hecho, en un estudio previo llevado a cabo en terneros en Galicia por nuestro grupo de investigación se pone de manifiesto que los animales de raza Holstein acumulan niveles de cobre en hígado un 60% superiores a los de raza Rubia Gallega (Cruz, 2005, Miranda et al., 2006). La intoxicación crónica en vacuno se puede producir además por la contaminación de los pastos por residuos de minería o emisiones industriales y basura, o por el empleo de purines de cerdo ricos en cobre en los pastos destinados al ganado vacuno (Grobler y Swan, 1999 a, b; Tokarnia et al., 2000). Sargison y Scout (1996) describen un caso de intoxicación en teneros lactantes de una edad comprendida entre 4 y 12 semanas, y cuyas madres se habían alimentado con productos procedentes de la propia explotación, en la que se había empleado una elevada cantidad de purines de cerdo ricos en cobre como fertilizante durante los últimos 20 años. Los animales mostraron los signos típicos de una intoxicación crónica por cobre, destacando que los principales afectados eran de raza Aberdeen Angus, que mostraron una prevalencia seis veces superior (32,3%) a los de la raza Charolesa (5,5%). La patogenia de la acumulación de cobre ha sido estudiada en profundidad en ganado ovino (Corbett et al., 1978; Gooneratne et al., 1979; Kumaratilake y Howell, 1987, 1989; Haywood et al., 2001). Aunque todavía no se conocen en detalle los mecanismos patogénicos implicados en la acumulación crónica de cobre en el hígado a nivel molecular se considera que la susceptibilidad de esta especie se asocia con la incapacidad de acumular el exceso de cobre en las metalotioneínas en el hígado, lo REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 56 que a su vez limita su capacidad de excreción biliar, fundamentalmente a través de los lisosomas hepáticos. Cuando se supera la capacidad de almacenamiento de cobre en el hígado se produce la lisis de los hepatocitos cargados de cobre con la consiguiente salida del metal libre al torrente circulatorio, lo que a su vez origina una importante crisis hemolítica que termina en muchos casos con la muerte del animal. Los estudios de distribución subcelular en ganado ovino del cobre en el hígado (Corbett et al., 1978; Gooneratne et al., 1979; Kumaratilake y Howell, 1989) han contribuido de forma muy importante al esclarecimiento de los mecanismos implicados en la acumulación crónica de cobre en esta víscera. Durante las fases tempranas de acumulación de cobre en el hígado en ovino, al igual que en la mayoría de mamíferos, el cobre se acumula principalmente en el citosol unido a las metalotioneínas; sin embargo, a diferencia de otras especies, la oveja tiene una capacidad limitada para acumular grandes cantidades de cobre-metalotioneína en el hígado y la saturación ocurre muy pronto. Una vez que los sitios de unión para el cobre están saturados se inicia la absorción del cobre por los lisosomas (en la fracción granular). La acumulación en los lisosomas está probablemente relacionada con la autofagia del cobre y está bien asumido que tiene un papel importante en el proceso de detoxificación del cobre para su posterior excreción biliar, si bien hay otras vías para la excreción del cobre aparte de la lisosomal (Bremner, 1998). El secuestro del exceso de cobre por los lisosomas en proliferación podría ser responsable del mantenimiento de una concentración constante de cobre en el citosol de las células hepáticas (Kumaratilake y Howell, 1989). Al inicio del almacenamiento de cobre en los lisosomas éstos van a aumentar predominantemente en número (de hecho, durante la fase de almacenamiento de cobre en el hígado previa a la hemólisis el número de lisosomas en los hepatocitos está correlacionado positivamente con la concentración de cobre en el hígado). Sin embargo, a medida que la acumulación progresa, el incremento en el número de lisosomas se reduce significativamente (llegando incluso cesar con niveles críticos de cobre) y el exceso de metal es acumulado en los lisosomas ya presentes, dando lugar al aumento de su volumen (Howell y Gooneratne, 1987). Los lisosomas ya existentes podrían llegar a saturarse con lo que el citosol, e incluso el núcleo, no pueden mantener las concentraciones de cobre y comienzan a acumularlo a una velocidad mayor de lo normal, alcanzando valores de toxicidad. Los lisosomas son por tanto organelas de almacenamiento esenciales que se encargan de proteger la célula hepática de los efectos tóxicos del metal. Mientras los lisosomas son capaces de secuestrar cobre, éste se almacena en el hígado durante un periodo de semanas o meses sin manifestación clínica de daño hepático (Howell y Gooneratne, 1987). Sin embargo, una vez que se saturan los lisosomas, el cobre REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 57 comienza a acumularse en concentraciones elevadas en el núcleo y otras organelas, o incluso puede permanecer libre en el citosol, causando en ambos casos importantes lesiones celulares. El papel de los lisosomas en la capacidad de acumulación de cobre en el hígado, y por tanto, en las diferencias entre las distintas especies animales en cuanto a su susceptibilidad a sufrir procesos de intoxicación crónica, parece estar relacionado con la cantidad de cobre que son capaces de acumular. Los estudios de distribución subhepática de cobre en oveja indican que la fracción granular (que contiene los lisosomas) comienza a alcanzar una fase de meseta a una concentración de cobre en el hígado entre 160 y 180 mg/kg peso fresco, menos de 2 veces por encima de los niveles de cobre adecuados para esta especie (Corbett et al., 1978; Gooneratne et al., 1979; Saylor and Leach, 1980), mientras que en otras especies menos susceptibles a la intoxicación por cobre, como las ratas, la capacidad de la fracción granular para acumular cobre comienza a saturarse a niveles de cobre entre 210 y 300 mg/kg peso fresco, casi 100 veces por encima de las concentraciones de cobre normales para esta especie animal (Corbett et al., 1978). Aunque no se conoce en detalle el mecanismo de necrosis hepática en animales que presentan una acumulación de cobre en el hígado, se ha sugerido que el exceso de acumulación de cobre conlleva la ruptura de la membranas lisosomales, dando lugar a una filtración de hidrolasas ácidas en el citoplasma y la destrucción de las células hepáticas (Gooneratne et al., 1980). Lindquist (1968) sugiere que la ruptura lisosómica ocurriría por oxidación catalítica de la membrana lipídica, que se podría iniciar por la acción directa del cobre con oxígeno formándose radicales libres, aunque es también posible que la acumulación de cobre en la fracción nuclear desestabilice el ADN e inhiba la actividad de la RNA polimerasa, dando lugar a una desorganización y la consecuente muerte de la célula (Bremner, 1998). El aumento de iones de cobre libres en el citosol podría afectar a la actividad enzimática de los microsomas, causando la peroxidación lipídica de las membranas y la degeneración y necrosis de las células (Kumaratilake y Howell, 1989). III.2. Cuadro clínico Las manifestaciones clínicas en la intoxicación crónica por cobre están bien documentadas y se agrupan en tres fases distintas: prehemolítica, hemolítica y posthemolítica (Howell y Gooneratne, 1987). Durante la fase prehemolítica el cobre se acumula en el organismo, particularmente en el hígado, como hemos indicado. Esta fase puede durar de semanas a meses, tiempo en el que el animal se encuentra clínicamente normal. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 58 La fase hemolítica es la fase clínica. Una vez que se ha superado la capacidad de almacenamiento de cobre en el hígado se produce un intenso daño hepático con la consiguiente salida del metal almacenado en los hepatocitos a la circulación sanguínea, lo que origina el repentino desarrollo de una hemólisis. Lo característico de esta fase es la hemólisis, por lo que normalmente se hace referencia a ella como “crisis hemolítica”. La gravedad de la hemólisis va a condicionar el pronóstico del animal, así, aquellos casos con hemólisis ligeras suelen superar la enfermedad, mientras que los que presenten una hemólisis severa mueren a las pocas horas. Los síntomas clínicos en los animales van a ser los característicos de una anemia hemolítica incluyendo letargia, polidipsia y pérdida de apetito; las mucosas aparecen ictéricas, los ojos hundidos y los vasos de la esclerótica color marrón chocolate por la metahemoglobina. La orina es de color oscuro. Los animales que sobreviven pasan a la fase posthemolítica. Durante este periodo pueden aparecer nuevas crisis hemolíticas, incluso después de que la fuente de cobre haya sido eliminada. El animal recobra la normalidad, si bien la recuperación es tanto más lenta cuanto más intensa haya sido la fase hemolítica. III.2.1. Cambios en hígado En la intoxicación crónica por cobre los hepatocitos muestran un gran número de lisosomas cargados de cobre y se presume que la carga excesiva precede a la muerte individual de los mismos (Howell y Kumaratilake, 1985). Durante el periodo prehemolítico se ha demostrado mediante estudios morfométricos un gran aumento en el número de lisosomas que acumulan más cobre, aumentan en tamaño y presumiblemente en peso. A nivel ultraestructural, muchos hepatocitos muestran un aumento marcado en número, tamaño y densidad de los lisosomas que eran normales en otras situaciones. Algunos de estos lisosomas mostraron interrupciones focales de sus membranas, lo que se asocia a liberación de material granular (Gooneratne et al., 1980). Estudios morfométricos ponen de manifiesto que la acumulación de cobre en los lisosomas comienza el la zona periportal, aunque en alguna raza como la Merina, el cobre comienza a acumularse en la zona de las venas centrales y a medida que progresa la acumulación se extiende a las zonas medias y periféricas de los lóbulos (zona periportal). La distribución de las células hepáticas que sufren necrosis no sigue este patrón y dichas células se distribuyen de forma aleatoria a lo largo de los lóbulos hepáticos cargados de cobre. El examen de secciones de hígados de animales que se encuentran en la fase prehemolítica pone de manifiesto la existencia de células vacuolizadas y numerosas células de Kupffer con una elevada actividad fostatasa ácida (Howell y Gooneratne, 1987). El hígado de los animales que mueren o son sacrificados durante la fase hemolítica contienen también un número elevado de células parenquimatosas necróticas, las REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 59 cuales se sitúan sobre todo alrededor de las venas centrales, además de focos de neutrófilos, depósitos de bilis, y un número elevado de células de Kupffer, Se observan además densos depósitos granulares de cobre tanto en las células parenquimatosas como en las células de Kupffer, así como un gran número de estas últimas alrededor de las zonas centrolobulillares (Howell y Gooneratne, 1985). III.2.2. Cambios en sangre El aumento de la concentración de cobre en sangre se debe a la ruptura de los lisosomas hepáticos y liberación enzimática desde el hígado. El cobre procedente de la lisis de los hepatocitos cargados de cobre pasa a la sangre dando lugar a una crisis hemolítica. El mecanismo que desencadena la absorción del cobre por los eritrocitos 24 horas antes de la hemólisis no está claro, pero podría ser debido a una deformación de sus membranas por efectos indirectos o directos del cobre, dando lugar a cuerpos de Heinz y/o sobre componentes como la enzima glucosa-6-P-deshidrogenasa, glutation y adenosina-trifosfato. Durante la acumulación de cobre hay un aumento de la actividad simultánea de fosfatasa ácida y sorbitol deshidrogenasa a parte del cobre en sangre. Kumaratilake et al. (1981) encontraron mínimas fluctuaciones de cobre en sangre, plasma y glóbulos rojos hasta un poco antes de la hemólisis, momento en el que los valores eran de 4 a 10 veces superiores a lo normal. Tras muestreos diarios de sangre en ovejas en fase de acumulación de cobre (prehemolítica) se observó que los niveles de cobre, tanto en sangre entera como en plasma, eran elevados en periodos cortos de tiempo durante las 14 semanas previas a la hemólisis, aunque los aumentos eran de mayor intensidad 1 o 2 días o incluso el primer día de la hemólisis. En base a esto, concluyeron que las estimaciones de los niveles de cobre en sangre tienen una validez limitada para el diagnóstico de la acumulación o intoxicación con cobre. Otros cambios bioquímicos en sangre están asociados al daño hepático, uno de los más tempranos en la fase prehemolítica es el aumento de la actividad de enzimas hepáticas que son específicas como sorbitol-deshidrogenasa, arginasa o glutamatodeshidrogenasa, ésta última es considerada por algunos autores como el mejor indicador para el diagnóstico de la intoxicación crónica de cobre por sus aumentos significativos (Humann-Ziehank et al., 2001). La mayor parte de estos aumentos se correlacionan con la actividad de la fosfatasa ácida y con los máximos niveles de cobre plasmático indicando así la liberación del contenido de los lisosomas hepáticos (organelas que acumulan cobre) en el transcurso de la enfermedad. En otros estudios la actividad de fosfatasa ácida en suero permaneció aumentada durante la fase prehemolítica en todas las ovejas (Spengler, 1989). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 60 III.2.3. Cambios en el riñón Durante la fase pre-hemolítica de la intoxicación crónica por cobre, el metal se acumula sin que el riñón pierda su función y presente únicamente mínimos daños estructurales (Howell y Gooneratne, 1987; Ledoux et al., 1996). Durante la hemólisis la asociación de cobre y hierro contenidos en el riñón es bastante marcada generando una incapacidad glomerular y tubular. En cuanto a la patogenia no está claro el mecanismo responsable de los cambios degenerativos y necróticos: la ruptura de los lisosomas que liberan cobre, el cobre unido a metalotioneínas, o simplemente las metalotioneínas, todos ellos tienen un carácter citotóxico pudiendo dar lugar a una desorganización de la célula. Los mecanismos fisiopatológicos son posiblemente similares a los que afectan al parénquima hepático. En el transcurso de la fase posthemolítica tanto la actividad enzimática como las células sanguíneas antes mencionadas regresan a la normalidad, sin embargo existen evidencias de fallo renal representado por los niveles de urea elevados. III.3. Acumulación subclínica de cobre en el hígado Como ya se ha indicado, en la intoxicación crónica por cobre previa a la crisis hemolítica hay una fase, más o menos prolongada de tiempo, en la que se produce la acumulación de cobre en el hígado (Weaver et al., 1999); solamente cuando se sobrepasa esta capacidad de almacenamiento es cuando ocurre la rotura de los hepatocitos cargados de cobre que da lugar a la hemólisis masiva. Teniendo en cuenta la patogenia de la toxicidad crónica de cobre es fácil entender que durante la fase silente de almacenamiento (fase prehemolítica) ocurran pequeños daños hepáticos, medibles a nivel laboratorial (utilizando marcadores enzimáticos de daño hepático), pero que pasan desapercibidos desde un punto de vista clínico. Estas lesiones pueden ser responsables de un menor rendimiento de los animales, o lo que es lo mismo, de toxicidad subclínica. La acumulación de cobre en hígado en ganado vacuno, junto con la toxicidad subclínica derivada de la misma, es un tema de gran actualidad. Estudios de monitorización del estatus de cobre llevados a cabo en diversos países en los últimos años (Hadrich, 1996; Jilg et al., 1997; López Alonso et al., 2000b) ponen de manifiesto que un porcentaje relativamente alto de animales presenta niveles de cobre por encima de los límites fisiológicos, lo que indica un riesgo potencial de toxicidad. Al igual que en los casos de toxicidad clínica, la causa de esta acumulación subclínica se sitúa en el empleo de suplementos de cobre, especialmente en alimentos compuestos, por encima de las necesidades fisiológicas (Engle y Spears, 2000a). También se ha descrito un aumento significativo de los niveles de cobre en REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 61 animales procedentes de regiones agrícolas donde la densidad de ganado porcino es elevada, y si bien los autores señalan que no suceden episodios de toxicidad clínica, podrían ser responsables de una merma en las producciones. A modo de ejemplo podemos señalar varios estudios experimentales donde, a pesar de no inducir toxicidad clínica, el almacenamiento crónico de cobre a nivel hepático en ganado vacuno es responsable de una merma de las producciones. Gummow (1996) de forma experimental indujo una intoxicación por cobre en ganado vacuno adulto administrando suplementos de cobre durante largos periodos de tiempo. Los resultados de su estudio permitieron establecer que en las condiciones de sus experimentos aparecen daños subclínicos tras la administración oral de dosis iguales o superiores a 12 mg/kg de peso de cobre al día, una concentración comúnmente empleada en programas de suplementación de cobre en ganado vacuno. Durante el curso de la prueba se monitorizaron las concentraciones de gammaglutamiltransferasa (GGT) y aspartato aminotransferasa (ASAT), BUN (nitrógeno ureico), cobre plasmático, concentraciones de zinc y hierro. Los resultados de ASAT muestran que los animales que reciben 10 mg de cobre al día presentaban un daño hepático que llegó a ser detectado sobre el día 40 y persistió durante la prueba, el patrón del daño hepático cobra interés por los picos que aparecen cada 80 días, a los que se interponen periodos de actividad enzimática normal. Se postuló que este patrón puede reflejar episodios de daño celular severo, en el que los hepatocitos de forma individual son destruidos y sustituidos por tejido fibroso no activo. El resultado es una decadencia de la masa funcional y la aparente normalización de la actividad enzimática. Los resultados de ASAT podrían reflejar también que no todos los hepatocitos acumulan cobre al mismo tiempo y la misma cantidad, causando el daño antes en unas células que en otras. Cuando se examinó la concentración del cobre plasmático se observó que en los grupos que recibían 10 y 20 mg/kg de cobre al día los valores encontrados eran significativamente altos en comparación con los controles; estos resultados indican que cuando ocurre la lisis celular el cobre se libera desde las células dañadas, dando lugar a un aumento significativo de los niveles de cobre en sangre en los animales clínicamente normales. Jenkins y Hidiroglou (1989) realizaron un experimento en terneros lactantes a los que se les suplementó cobre en distintas concentraciones (entre 10 y 500 mg/kg) con el fin de estimar la concentración de metal que podría afectar al rendimiento de los animales. Tras el tratamiento observaron que tanto el peso del ganado como la eficiencia de la dieta fueron similares en los grupos que recibían 10 y 50 mg/kg, pero la ganancia de peso mermaba significativamente en los grupos que recibieron entre 200 y 500 mg/kg. El suplemento adicional de 1000 mg/kg de zinc previene las muertes para 1000 mg/kg de cobre pero el rendimiento de los terneros es pobre. Encontraron que con 50 mg/kg de cobre se conseguía una ingesta segura con REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 62 lactorreemplazante que contenía 48 mg/kg de zinc y 1,1 mg/kg de molibdeno, sin embargo, en ingestas inferiores de estos elementos o durante periodos superiores a 6 semanas, los terneros podrían ser más susceptibles a la intoxicación por cobre. Los niveles plasmáticos de aspartato aminotransferasa, indicativos de necrosis hepática, fueron similares y se mantuvieron dentro de los valores de referencia para los animales de los lotes que recibían 10, 50 y 200 mg/kg de cobre, aunque fueron elevados para 500 mg/kg de cobre y para los lotes de 1000 mg/kg de cobre más 1000 mg/kg de zinc. Durante el examen postmortem ninguno de los terneros que recibían 10, 50, o 200 mg/kg de cobre mostraron grandes anormalidades. En definitiva, los terneros alimentados con lactoreemplazantes toleraron hasta 50 mg/kg de cobre, mientras que niveles de 200 y 500 mg/kg fueron tóxicos y causaron menor rendimiento y eficiencia del alimento; con un nivel de suplementación de 1000 mg/kg 3 de 7 terneros murieron, si bien con la adición de zinc a este suplemento se previnieron las muertes aunque disminuyó su rendimiento. Engle y Spears (2000b) realizaron un estudio sobre el efecto del cobre dietético sobre el metabolismo lipídico, fermentación ruminal y rendimiento de los animales. Para ello se contó con un grupo control, y con 2 grupos a los que se le suplementó 10 y 20 mg de cobre (como CuSO4)/kg peso seco. Se observó una correlación positiva entre el nivel de suplementación y los niveles de cobre en el hígado, mientras la concentración de colesterol total en suero se redujo. Durante la fase de acabado, la suplementación de cobre reduce la ganancia de peso, la ingesta de alimento, y el índice de conversión (consumo alimento/ganancia peso), sin tener en cuenta la concentración ni fuente de cobre. La disminución del rendimiento puede ser debido a un alto nivel de cobre en la dieta que es capaz de alterar la fermentación ruminal (Engle y Spears., 2000a). La toxicidad subclínica de cobre es un tema de gran actualidad, puesto que estudios de monitorización del estatus de cobre llevados a cabo en diversos países (Hadrich, 1996; Jilg et al., 1997) ponen de manifiesto que un porcentaje relativamente alto de animales presenta niveles de cobre por encima de los límites fisiológicos, lo que indica un riesgo potencial de toxicidad. Al igual que en los casos de toxicidad clínica, la causa de esta acumulación subclínica se sitúa en el empleo de suplementos de cobre, especialmente en alimentos compuestos, por encima de las necesidades fisiológicas (Engle y Spears, 2000a). También se ha descrito un aumento significativo de los niveles de cobre en animales procedentes de regiones agrícolas donde la densidad de ganado porcino es elevada, y si bien los autores señalan que no suceden episodios de toxicidad clínica, podrían ser responsables de una merma en las producciones. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 63 IV. Parámetros para valorar el estatus de cobre El estatus mineral en los animales depende del mantenimiento de una relación sueloplanta-animal (Quiroz-Rocha y Bouda, 2001) y si alguno de estos tres niveles se encuentra afectado, la salud, y en consecuencia el rendimiento de los animales, se verán alterados de manera equivalente. En general, debemos tener en cuenta que en los desordenes minerales los resultados de los test de diagnóstico ofertan suficiente información para guiar la clínica de forma correcta, aunque en muchos casos los protocolos requieren múltiples pruebas incluyendo la dosis del elemento en varios compartimentos y la valoración de otros parámetros bioquímicos. El examen del estatus de un mineral debe orientarse hacia la prevención, debe incluir una anamnesis con datos de presumible importancia como son la producción y la reproducción, un examen físico que valore los distintos estados fisiológicos en los que se pueden encontrar los animales, una analítica de muestras de fluidos y tejidos, así como un examen patológico de muestras en caso de que se lleven a cabo necropsias (Quiroz-Rocha y Bouda, 2001). Debemos tener en cuenta en primer lugar si existen síntomas clínicos o subclínicos de pérdida de producción, si desde el punto de vista bioquímico observamos concentraciones anormales del mineral en tejidos y en sangre y si existen diferencias entre los animales en relación a un tratamiento con o sin cobre. Dentro del programa de diagnóstico de deficiencia de cobre deberá conocerse el nivel del mineral de los suelos, hacer una revisión de la dieta (sin olvidarse de las premezclas minerales) para así conocer el aporte de cada elemento, y por supuesto, si queremos conocer el estatus de cada elemento en el organismo, habrá que realizar los análisis oportunos (Quiroz-Rocha y Bouda, 2001). En lo que se refiere a la dieta, deberemos ir más allá, profundizando en el estudio de posibles interferencias con otros de sus componentes, requerimientos mayores que puede tener el animal por encontrarse en alguna fase de variación fisiológica o por excesos de eliminación. Desde un punto de vista profiláctico resulta de gran utilidad realizar un estudio con carácter anual del estatus mineral a nivel del conjunto de la explotación. Si nos encontramos con problemas clínicos es necesario repetir el estudio del ciclo sueloplanta-animal (Quiroz-Rocha y Bouda, 2001); debe tenerse en cuenta además otros factores de variación como pueden ser los cambios estacionales, ya que van a influir en la disponibilidad de los elementos. A la hora de realizar el diagnóstico de la intoxicación por cobre debemos de tener en cuenta además de las características clínicas del animal, la historia de exposición al metal, la predisposición genética, los cambios morfológicos y bioquímicos y el análisis del contenido de cobre en la dieta, tejidos y sangre. El no considerar en REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 70 Sin embargo, en el resto de los casos, las ventajas que aporta la determinación de la actividad de la ceruloplasmina en comparación con el cobre sanguíneo en rumiantes son pocas, ya que las correlaciones de estos dos parámetros suelen ser muy altas puesto que el 80-90% del cobre se encuentra en forma de ceruloplasmina. Los rangos de referencia para la ceruloplasmina en plasma se sitúan entre 10 y 20 mg/dl para animales con un estatus de cobre adecuado, entre 5 y 10 mg/dl como indicativos de deficiencia y < 5 mg/dl en casos de deficiencia severa (Gay et al., 1988). IV.7. Cu-Zn-Superóxido dismutasa (SOD) La actividad de la Cu-Zn superóxido dismutasa en los eritrocitos, una de las principales cuproenzimas, constituye un método indirecto para valorar el estatus de cobre en animales. Comparando la actividad SOD con la concentración hepática de cobre se llegó a la conclusión de que sirve para predecir los niveles de cobre en hígado en ovejas cuando la ingesta es de baja a moderada (Underwood y Suttle, 2002). La actividad de SOD en los eritrocitos va a ayudar al diagnóstico de forma distinta que los niveles de cobre plasmático o sérico, ya que ante una deficiencia de cobre la actividad enzimática va a descender a un ritmo lineal y lento (Suttle y McMurray, 1983). Así, frente al descenso de manera exponencial del cobre plasmático o sérico los valores bajos de SOD nos señalan una deficiencia prolongada de cobre y los valores altos una sobrecarga del mismo que se relacionan más con la tasa de crecimiento que con el contenido de ceruloplasmina. Debe tenerse en cuenta que las unidades convencionales de medida no son cuantitativas, utilizando como unidad la actividad necesaria para alterar en un 50% la tasa de “superoxidación”. Como las tasas de superperoxidación varían según el método, la equivalencia molecular de SOD de una unidad también varía. Además, los glóbulos rojos deben lavarse para eliminar los inhibidores plasmáticos y diluirse para minimizar la interferencia de los constituyentes de los hematíes, incluyendo probablemente la hemoglobina. Se han propuesto intervalos específicos para ensayos particulares (Herbert et al., 1991). Gracias a que la actividad de SOD está correlacionada de forma importante con el cobre eritrocitario, la medición del cobre en los glóbulos rojos sería más útil y menos problemática (Arthington et al., 1996). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 71 IV.8. Biomarcadores de acumulación hepática de cobre En la actualidad, los medios diagnósticos disponibles para la identificación de los animales que sufren una intoxicación por cobre son únicamente válidos para la fase clínica de la enfermedad, en la que ha ocurrido un importante daño orgánico. Hay por tanto una clara necesidad de identificar nuevos marcadores sensibles a cambios tempranos, con la capacidad de predecir riesgo de acumulación de cobre a nivel hepático, antes de que aparezcan las alteraciones funcionales características de la intoxicación crónica de cobre. En un intento por encontrar marcadores potenciales de la exposición a niveles elevados de cobre, y teniendo en cuenta que la ceruloplasmina, principal componente del cobre en la sangre, puede verse afectada por multitud de factores a parte de la exposición a cobre, la fracción no-ceruloplasmina (como un valor calculado) se ha usado de forma reciente como marcador de exposición a cobre en la especie humana (Eife et al., 1999; Araya et al., 2003; López-Alonso et al., 2006). Así, se ha demostrado que la fracción no-ceruloplasmina de cobre en el suero está positivamente correlacionada con los niveles de cobre en el suero tanto en pacientes que reciben niveles altos de cobre en la dieta como en aquellos que presentan alteraciones en el metabolismo del cobre que dan lugar a altos depósitos de cobre en el hígado (como por ejemplo en la enfermedad de Wilson o en otras formas de cirrosis en niños). El ratio actividad ceruloplasmina frente al cobre sérico también se ha empleado como herramienta en el diagnóstico de deficiencia de cobre en rumiantes (Mackencie et al., 1997; Arnhold et al., 1998a), permitiendo incluso valorar la interferencia de niveles elevados de molibdeno sobre el estatus de cobre. No obstante se desconoce la utilidad de este parámetro como posible indicador de la acumulación de cobre en rumiantes. Finalmente, señalar que nuevos estudios realizados en medicina humana apuntan la posibilidad del empleo de ciertas proteínas eritrocitarias como marcadores de exposición a niveles elevados de cobre (Speisky et al., 2003), basándose en el hecho de que el cobre es capaz de fijarse con una gran afinidad a ciertas proteínas presentes en los eritrocitos. IV.9. Enzimas marcadoras de daño hepático La determinación de ciertas enzimas marcadoras de daño hepático permite evaluar el grado de necrosis celular una vez que los hepatocitos saturados de cobre sufren la lisis celular. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 72 Se han realizado numerosas investigaciones con el fin de identificar cuáles son los indicadores bioquímicos más adecuados para el diagnóstico de intoxicación por cobre en rumiantes. Entre ellas las más empleadas han sido la aspartato-aminotransferasa que se libera normalmente en respuesta a cambios en la permeabilidad hepatocelular, daño subletal y necrosis (Bakley et al., 1982) y la gamma-glutamiltransferasa que está asociada con membranas microsomales y se suele liberar durante la necrosis letal celular (van der Schee et al., 1983; Humphries, 1989; Lewis et al., 1997). También se han empleado otras enzimas específicas hepáticas como la arginasa, sorbitol deshidrogenasa y la glutamato deshidrogenasa además de enzimas lisosomales como la fostatasa ácida (Zervas et al., 1990; Sutherland et al., 1992). Los resultados de estos estudios son bastante inconsistentes, tanto en lo relacionado a la sensibilidad de los parámetros como en la correlación existente entre el daño hepático y la magnitud en la elevación de sus niveles plasmáticos. Algunos estudios muestran que las actividades de las enzimas tan sólo se elevan al comienzo de la crisis hemolítica, por lo tanto no son realmente técnicas diagnósticas válidas (Humann-Ziehank et al., 2001). Duncan y Prasse (1986) documentaron además que la correlación entre la actividad sérica de la enzima aspartato-aminotransferasa y la manifestación clínica de la insuficiencia hepática es pobre. IV.10. Hematología Durante la fase clínica de intoxicación por cobre el estudio hematológico pone de manifiesto un marcado descenso del número de glóbulos rojos, del valor hematócrito y de la hemoglobina asociado a la hemólisis masiva que puede afectar hasta al 75% de los eritrocitos. El examen del frotis sanguíneo en la fase hemolítica revela la existencia de numerosos fragmentos celulares, anisocitosis, poiquilocitosis, policromasia y presencia de cuerpos de Heinz en más del 15% de los eritrocitos. Los glóbulos blancos estarán muy aumentados (2-3 órdenes de magnitud) con un incremento muy marcado del número de neutrófilos (Underwood y Suttle, 2002). IV.11. Cobre en pelo y lana Las concentraciones de cobre en pelo y lana, tanto en ovejas como en ganado vacuno, tienen un valor relativo como ayuda diagnóstica. Pueden reflejar una ingestión de cobre subóptima, lo que se vería con el deterioro de la capa del animal (Suttle y Angus, 1978; Suttle y McMurray, 1983). A la hora de la interpretación diagnóstica no se debe olvidar que otras deficiencias nutritivas también pueden influir en el crecimiento del pelo y de la lana. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 73 IV.12. Hallazgos de necropsia En los animales que mueren durante la fase hemolítica se constata la presencia de una ictericia generalizada y líquido seroso en las cavidades; el hígado presenta un aspecto friable y un color anaranjado o amarillento; los riñones muestran un color marrón-oscuro, están edematizados y de consistencia disminuida; la orina es de color café o rojo oscuro (Howell y Gooneratne, 1987; Underwood y Suttle, 2002). Los exámenes histológicos del hígado muestran la presencia de necrosis en gran número de hepatocitos, especialmente alrededor de la vena central. Los hepatocitos además muestran vacuolización, a veces con pigmento de aspecto granular de color amarillo-claro; las células de Kupffer están repletas de pigmentos de color marrónacaramelado; se observa además una gran retención de bilis en los canalículos biliares. A nivel renal destaca la presencia de un gran número de cilindros granulares rojos o hialinos, vacuolización de las células epiteliales, a veces con pigmentos amarillo-claro en las mismas, dilatación de los túbulos y necrosis de las células de los túbulos contorneados proximales (Maiorka et al., 1998). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 74 V. Factores de variación en la acumulación orgánica de cobre Como hemos comentado anteriormente, la acumulación orgánica de cualquier metal, tanto tóxicos como esenciales, va a verse condicionada por diferentes factores y hay que tener en cuenta que es difícil poder establecer una relación directa entre los niveles de exposición y las concentraciones tisulares encontradas. Esto es debido a que existen numerosos factores de variación que influyen sobre la absorción y deposición de estos elementos en el organismo (Ma, 1996; Gochfeld, 1997). Estos factores pueden ser propios del animal, así puede haber variaciones en la acumulación dependiendo de la especie animal, raza, sexo, edad; o bien depender de otros factores como puede ser factores dietéticos, interacciones con otros elementos, factores orgánicos, etc. (Goyer, 1995). De entre las causas propias del animal es importante distinguir factores genéticos heredables de factores ambientales. Estos factores que modifican la susceptibilidad podrían actuar en el lugar de exposición (aumentando o disminuyendo la ingesta), podrían afectar a la toxicodinámica del metal (con frecuencia formándose complejos o uniones covalentes) o podrían modificar el transporte al órgano diana o la inmunología, bioquímica o citología del órgano diana (Underwood y Suttle, 2002). V.1. Influencia de la especie sobre la acumulación orgánica de cobre La susceptibilidad al padecimiento de desordenes en el metabolismo mineral, tanto en casos de deficiencia como de toxicidad, puede verse condicionada por numerosos factores, dependientes no solo de la dieta, sino también del propio animal. Se considera que existen especies de animales con una marcada diferencia en su tolerancia al cobre dietético. Hay especie altamente tolerantes al cobre como los caballos y los cerdos, y por el contrario los rumiantes son altamente susceptibles, ya que acumulan grandes cantidades de cobre a nivel hepático. Dentro de los caballos, los ponyes son extremadamente resistentes a la intoxicación y pueden tolerar concentraciones tan altas como 791 mg/kg en materia seca sin sufrir ningún tipo de alteración (Smith et al., 1975). El cerdo también se caracteriza por su resistencia, y como ya se ha comentado el cobre se emplea en esta especie en elevadas concentraciones (incluso de 250 mg/kg materia seca) como promotor del crecimiento sin causar ningún tipo de alteración al animal. En el extremo opuesto se sitúa el ganado ovino, especie altamente susceptible al padecimiento de intoxicación crónica por cobre, debido a que presenta una escasa capacidad de eliminar el exceso de cobre en la dieta vía biliar, como consecuencia de su baja capacidad para inducir la síntesis de REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 75 metalotioneínas. Aunque de forma tradicional el ganado vacuno se ha considerado relativamente tolerante a la intoxicación por cobre, en los últimos años han aumentado de forma alarmante los casos de intoxicación, debido sobre todo al uso excesivo de suplementos en la ración. A su vez, existen importantes diferencias interespecíficas en cuanto a su susceptibilidad a padecer desordenes en el metabolismo del cobre, que trataremos en el siguiente apartado. V.2. Influencia de la raza sobre la acumulación orgánica de cobre V.2.1. Ganado ovino La influencia de la raza sobre la susceptibilidad a padecer procesos de deficiencia o toxicidad de cobre ha sido ampliamente estudiada en ganado ovino (Radostits et al., 2002; Underwood y Suttle, 2002), llevando a clasificar a los animales como tolerantes y/o resistentes,e incluso, hacer una selección racial específica que se adapte a las necesidades de cada región geográfica en concreto, permitiendo en muchos casos disminuir la incidencia de patologías asociadas tanto a la deficiencia de cobre (como la ataxia enzoótica o los problemas reproductivos), como al exceso o acumulación hepática de cobre. Entre las diferentes razas de ovejas existen variaciones muy destacables a nivel hepático cuando reciben excesos de este elemento (Woollians et al., 1982; van der Berg et al., 1983). Es el caso de la raza Texel que es de las más vulnerables a la toxicidad por cobre por su mayor retención (Littledike y Young, 1993; Suttle et al., 2002); por el contrario aquellas caracterizadas por una pobre retención desarrollan hipocuprosis cuando el aporte de cobre es insuficiente, pudiendo citar así a la raza escocesa Blackface (Woollians et al., 1986). Estas diferencias genéticas en el metabolismo de cobre en ganado ovino parecer estar asociadas en gran parte a diferencias en la absorción intestinal del cobre dietético (Wiener et al., 1978; Woollians et al., 1983), aunque también pueden producirse por diferencias debidas al metabolismo y distribución del cobre absorbido (Woollians et al., 1982, 1983). La existencia de determinados genes que controlan las concentraciones plasmáticas de cobre ha quedado demostrada con éxito en la selección de líneas genéticas con niveles de cobre altos y bajos (dentro, incluso, de una misma raza), donde la herencia genética puede explicar un 0,3% de la variación normal de este parámetro (Radostits et al., 2002). Así, Wooliams et al. (1982) demostró que el cruce entre ovejas Blackface y Texel Scottish retenían más del doble de cobre en hígado que los animales de raza pura Scottish Blackface (13,7% vs. 5,6% del cobre ingerido). Esto parece deberse a REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 76 diferencias en la eficacia de absorción por parte de ciertas razas en relación al cobre consumido. Wiener et al. (1978) reportaron que las ovejas Orkney, una raza que es altamente susceptible a la intoxicación por cobre, parecían absorber el cobre de la dieta más eficientemente que otras razas. La raza Blackface, una raza ovina que es resistente a la intoxicación por cobre, tenía una temprana saturación de la absorción de cobre comparada con la raza Welsh, una raza susceptible a dicha intoxicación. En otras palabras, el rango máximo de absorción de cobre de la raza Blackface fue bajo con respecto a la Welsh. Varias investigaciones sugirieron que la diferencia en la excreción endógena de cobre también contribuyó a las diferencias genéticas en la retención de cobre hepático. En un experimento realizado por Suttle et al. (2002) en el cual se utilizaron corderos de razas Suffolk, Texel y Charolais alimentados con una dieta que contenía una mezcla de minerales (entre ellos cobre) y sin adición de ningún antagonista de cobre, se observó lo siguiente: • El patrón de excreción de cobre de la raza Suffolk comenzó con valores bajos alcanzando una meseta a las 22 semanas de edad; para la raza Texel, en cambio, sus valores se incrementaron continuamente partiendo de un nivel inicial alto con un promedio de 53,7 mmol/kg materia seca de cobre al día. • La acumulación hepática de cobre varió significativamente con la raza, y la herencia genética puede explicar un 0,85% de la variación normal en la raza Suffolk. • La alta concentración de cobre en hígado en los corderos de raza Texel respecto a los corderos Suffolk confirma resultados previos obtenidos mediante cruzamientos de estas razas (Woolliams et al., 1982). En el pasado, se creía (Weiner et ál., 1978) o asumía (Woolliams et al., 1982 y 1985) que las variaciones raciales para el estatus de cobre eran debidas principalmente a la diferencia en la proporción de cobre consumido que era absorbido. No obstante, los diferentes patrones de excreción de cobre del hígado para los corderos Texel y Suffolk observados en este estudio parecen explicar mejor las diferencias en la acumulación hepática del cobre. Con respecto a la raza Charolais, no se pudo evaluar la excreción hepática de cobre por la limitación del número de animales en el estudio. Woolliams et al. (1982) compararon la raza Texel con otras cinco razas, entre ellas la Suffolk) cruzadas con Scottish Blackface, alimentadas con una dieta con 12 o 20 mg Cu/kg materia seca. La actividad de la enzima ASAT (aspartato-aminotransferasa) indicó que el daño hepático fue mayor en el cruce con Texel que en el cruce con Suffolk, debido a la mayor acumulación de cobre en hígado. Además, se obervó que REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 77 la acumulación de cobre en hígado provoca una disminución del peso y tamaño de la viscera (Wolliams et al., 1982). En otro estudio realizado por Simpson et al. (2004) se encontró que la raza North Ronaldsay es muy sensible al cobre ambiental sufriendo daños hepatocelulares con exuberante fibrosis e incipiente cirrosis. La raza Cambridge, por el contrario, demostró ser mucho más tolerante y acumular cobre más lentamente, sufriendo un cambio patológico en el hígado, pero sin demasiada fibrogénesis. Esta diferente respuesta patológica podría derivar de una diferente expresión de los componentes celulares constituyentes del hígado. V.2.2. Ganado vacuno A diferencia del ganado ovino, en ganado vacuno la información de la que se dispone es escasa y se refiere a un número muy limitado de razas. Así por ejemplo, se ha indicado que ciertas razas como la Simmental y la Charolesa podrían tener mayores requerimientos de cobre que otras como la Aberdeen Angus (Radostits et al., 2000; Underwood y Suttle, 2002). Smart y Christensen (1984) encontraron que las novillas Simmental tenían concentraciones de cobre plasmático más bajas que las razas Hereford y Aberdeen Angus. De forma similar Ward et al. (1995) observaron que en ausencia de suplementación con cobre, los animales de raza Aberdeen Angus tienen mayores concentraciones de cobre plasmático que el ganado Simmental o Charolais. Mullis et al. (2003) en vacuno adulto suplementado con cobre y zinc, observó que los animales de raza Simmental mostraban un menor estatus de cobre que los de raza Aberdeen Angus, lo que sugiere unos mayores requerimientos de este mineral. A la hora de explicar las diferencias raciales en el metabolismo de cobre en ganado vacuno, y por tanto en las necesidades de cobre en dichos animales, se ha propuesto que pueden deberse, al igual que el ganado ovino, tanto a diferencias en la absorción de cobre a nivel intestinal, como en la excreción biliar del mismo. Así, en un estudio realizado por Gooneratne et al. (1994) empleando distintos tipos de dietas (con niveles altos y bajos de cobre, con o sin suplementos de molibdeno y azufre) se puso de manifiesto que la excreción biliar de cobre en la raza Simmental fue al menos dos veces la de la Aberdeen Angus para cualquier tipo de dieta, lo que hace que esta raza esté especialmente predispuesta a sufrir procesos de deficiencia de este oligoelemento. Las diferencias observadas en los depósitos corporales de cobre entre razas también podrían estar asociadas a diferencias en la cantidad de alimento ingerido, siendo ésta muy variable y atendiendo a las necesidades fisiológicas de los animales. Du et al. (1996) observaron como al recibir la misma ración ad libitum rica en cobre, el ganado Jersey acumuló cobre en hígado un poco más rápido que el Holstein, aunque también es cierto que consumían más alimento por unidad de peso metabólico. Se REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 78 encontraron además diferencias en la actividad de la ceruloplasmina, lactato deshidrogenasa y aspartato aminotransferasa. Este estudio fue la primera demostración de las diferencias genéticas en la concentración del cobre hepático dentro del vacuno de leche. Incluso aunque las vacas Jersey parecen ser más susceptibles a la intoxicación por cobre y tenían mayor cantidad de cobre plasmático que las Holstein (Gibson et al., 1987), las diferencias genéticas fueron asociadas a la deficiencia en la absorción de cobre dietético, excreción de cobre endógeno y la cantidad de comida ingerida. Morales et al. (2000), en otro estudio realizado con las mismas razas, encontraron un consumo de alimento más alto al inicio del estudio para las vacas de raza Holstein, si bien se igualaba al expresarlo como porcentaje del peso corporal. La concentración de cobre plasmático se vio incrementada por el consumo de dietas bajas en cobre, y su efecto fue mayor en vacas Holstein, causando una interacción de cobre x raza. Contrariamente, la concentración de cobre en leche fue más alta en la raza Jersey, y las dietas bajas en cobre disminuyeron esta concentración principalmente en Jersey con respecto a las Holstein. La depleción de cobre disminuyó el cobre en leche y esto llevó a los autores a pensar que la concentración de cobre en leche puede ser un indicador más agudo del estatus de cobre de los animales que el cobre en plasma. Otras posibles explicaciones a la variación racial de los depósitos de cobre podrían situarse en las diferencias en el tamaño relativo del hígado y los estatus normales de otros oligoelementos, así por ejemplo, Littledike et al. (1995) han constatado que la raza Limousin acumula más cobre a nivel hepático tras largos periodos de suplementación, lo que podría explicarse teniendo en cuenta el tamaño pequeño del hígado así como unos mayores niveles de zinc hepático en comparación con otras razas de vacuno. En otro experimento, estos mismos autores evaluaron nuevamente la raza Limousin pero comparándola, en este caso, con la raza Piamontesa y Hereford, para observar el efecto de la raza sobre la concentración mineral en tejidos en ganado de carne. Nuevamente hallaron que la raza Limousin acumula más cobre en hígado que las otras razas (Piamontesa y Hereford). Los datos podrían implicar una mayor necesidad de minerales o una mayor eficiencia en el uso de los minerales de la dieta por parte de la raza Limousin. Estas investigaciones concluyeron que el ganado Limousin podía adaptarse mejor a un medioambiente donde el contenido de cobre sea limitante, como vimos anteriormente. Finalmente los niveles de cobre en plasma fueron influenciados por la raza, las novillas Hereford tuvieron concentraciones de cobre plasmático más bajas que la raza Piamontesa. En un estudio llevado a cabo en animales alimentados sobre pastos abonados reiteradamente con purines de cerdo ricos en cobre se observó que la acumulación hepática de cobre en terneros de raza Frisona (92,7±3,92 mg/kg) fue casi un 50% superiores a la raza Rubia Gallega (62,3±2,99 mg/kg) y un 20% a la de los cruces REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 79 industriales de ambas razas (76,3±2,88 mg/kg). Además, la raza Frisona presentó el mayor porcentaje de casos (42%) con niveles hepáticos de cobre por encima de los rangos de normalidad (>100 mg/kg peso fresco; Puls, 1994), frente al 27% en los cruces industriales y al 13% en los terneros de raza Rubia Gallega. A nivel sanguíneo, los niveles de cobre mostraron el mismo patrón de distribución por razas, siendo en este caso las concentraciones sanguíneas de cobre en terneros de raza Frisona (0,906±0,17 mg/l) un 18 y un 6% superiores a los de las razas Rubia Gallega (0,766±0,13 mg/l) y los cruces industriales de ambas (0,853±0,12 mg/l) respectivamente (Cruz, 2005, Miranda et al., 2006). No obstante, en este estudio a diferencia de los experimentos mencionados anteriormente, los animales no han estado sujetos a condiciones experimentales que permitiesen evaluar si las diferencias observadas se deben a un distinto nivel de absorción intestinal o excreción biliar o a diferencias en la cantidad de exposición a cobre en la dieta. En ganado vacuno son necesarios nuevos estudios metabólicos en condiciones experimentales que nos permitan establecer si las diferencias observadas entre el nivel de acumulación hepática de cobre en las distintas razas obedece a diferencias metabólicas (a nivel de la absorción intestinal, acumulación hepática o excreción biliar) o se debe a diferencias de grado de ingestión del alimento. Los resultados de estos estudios podrían tener una gran importancia de cara a la selección de animales más resistentes ante procesos de deficiencia como de intoxicación por cobre, tal y como se ha hecho en ganado ovino para adaptarlos a zonas donde existe un problema de deficiencia o excesos de exposición al mismo (Cruz, 2005). Conocer las necesidades de cobre en las distintas razas permitiría además adaptar las necesidades de este oligoelemento en las dietas y minimizar los riesgos de intoxicación crónica por cobre en ganado vacuno suplementado de forma rutinaria con niveles relativamente altos de cobre (Livesey, 2002). Existen otras investigaciones como las realizadas por Engle y Spears (2001) que intentaron determinar los efectos del cobre dietético sobre el rendimiento y el metabolismo lipídico en terneros Simmental. En dicho estudio, la suplementación de cobre a terneros Simmental tuvo mínimos efectos sobre el metabolismo de los lípidos. Esto contrasta con los efectos del cobre sobre el metabolismo lipídico observado en ganado de raza Aberdeen Angus y sus cruces con Hereford (Ward and Spears, 1994; Engle and Spears, 2000a, Engle et al., 2000a, b). Esta diferencia entre razas relacionada con los efectos del cobre sobre el metabolismo lipídico podría deberse a diferencias en el metabolismo de cobre entre las razas Simmental y Aberdeen Angus (Gooneratne et al., 1994; Wards et al., 1995), o bien a diferencias en el metabolismo lipídico entre razas. De hecho, estudios previos en las razas Aberdeen Angus y sus cruces con Hereford indican que la suplementación con cobre REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 86 retarda su transferencia al espacio extravascular y a los tejidos en general; la ceruloplasmina también desciende aunque en este caso no depende del cobre unido a la albúmina. Como consecuencia de estos mecanismos se produce una baja utilización del cobre hepático (que es el órgano de mayor importancia como lugar de depósito de este mineral). Al administrar tetratiomolibdatos (TTMs) se observa una fuerte eliminación de cobre y molibdeno vía biliar, ambos están unidos a macromoléculas siendo parte del cobre insoluble en ácido tricloroacético; en relación al cobre plasmático insoluble en ácido tricloroacético éste parece proceder del cobre corporal, posiblemente del hígado (Igarza y Auza, 1995). La incidencia de efectos sistémicos tales como niveles de cobre elevados en plasma y a nivel renal ha sido a menudo observada en ovejas con altos niveles de molibdeno en la dieta (Underwood y Suttle, 2002), estos aumentos fueron observados aunque los niveles de cobre fueran bajos. Gooneratne et al. (1989b), tras probar con distintos complejos que contenían molibdeno y azufre comprobaron que aumentaban la acumulación de cobre en el riñón. En conclusión, las distintas interacciones que tienen lugar en el aparato digestivo pueden reducir la disponibilidad del mineral procedente del alimento y las interacciones sistémicas pueden contribuir al desarrollo de estados metabólicos deficitarios de cobre, por depleción de las reservas tisulares (Igarza y Auza, 1995). Van Ryssen et al. (1987) realizaron una prueba para determinar los efectos del molibdeno y azufre dietético en el estatus de cobre de ovejas con hipocupremia después de la retirada de cobre de la dieta. En primer lugar, a las ovejas se les administraron 75 mg de cobre al día durante un periodo previo para establecer altos niveles de cobre en sus hígados. Después se alimentaron con molibdeno (0-140 mg/día) y azufre (0-4 g/día) sin añadir cobre en la dieta. Las ovejas con 70 mg de molibdeno al día mostraron un 40% de reducción de cobre en comparación con aquellos animales que no tuvieron suplementos de molibdeno, pero si tenían cobre extra en la ración no se observaba la reducción. Se encontraron, además, niveles altos de cobre en riñón y plasma en todos los grupos de animales que eran suplementados con molibdeno. En los tratamientos con cobre adicional los efectos sistémicos eran menos pronunciados que con un tratamiento de 70 mg de molibdeno sin cobre, lo que sugiere que la fuente de cobre medida en estos efectos sistémicos no tiene como origen la dieta. Van Ryssen et al. (1987) constataron con sus observaciones que el molibdeno dietético en presencia de azufre se une al cobre en el tracto digestivo y que enlaces residuales de tiomolibdato podrían ser absorbidos y reaccionar con cobre en el organismo. En un experimento realizado en vacunos de dos regiones con forraje pobre y rico en molibdeno (1,7 mg/kg y 72,1 mg/kg respectivamente), Hamaguchi (1999) puso de manifiesto que las dietas conocidas como ricas en molibdeno durante más de 125 días REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 87 no afectaban a la salud ni al rendimiento animal. Si la alimentación con el forraje rico en molibdeno se mantenía durante un periodo continuado, no conllevaba deficiencia de cobre o efectos adversos. Los niveles de molibdeno en leche, sangre e hígado se elevaron y los de cobre no se vieron afectados; después de separarlos de la fuente de molibdeno, sus niveles volvieron a ser normales. En otros estudios, como el realizado por El-Gallad et al. (1983), tras inyecciones intravenosas e intraduodenales de tetratiomolibdatos en ovejas, se observó un aumentó del cobre a nivel plasmático, acumulándose en la misma fracción cromatográfica que el molibdeno. Al administrar en ratas el mismo compuesto pero en la dieta, se observó una disminución de la absorción de cobre plasmático, la actividad de la ceruloplasmina así como la concentración hepática de cobre; además el cobre y el molibdeno se unieron a las mismas proteínas y formas ácido-insolubles en plasma y riñón (Mills et al., 1976). V.6.2.2. Zinc El antagonismo mutuo entre el cobre y el zinc se presentó como el primer ejemplo de interacción competitiva biológica entre metales con propiedades químicas y físicas similares. Si se suplementa con zinc disminuye la intoxicación por cobre, y también se produce la situación contraria, porque al aumentar el cobre puede afectar al metabolismo del zinc (Bremner y Beattie, 1995). El principal mecanismo de interacción entre el cobre y el zinc se sitúa en la competencia entre ambos metales por los puntos de unión a las metalotioneínas. La síntesis de metalotioneínas podría estar inducida por metales esenciales y cobre pero también por algunos metales tóxicos. Las metalotioneínas funcionan como un almacén intracelular para el zinc y el cobre (Bebe y Panemangalore, 1996). La anemia falciforme y la enfermedad de Wilson son dos alteraciones en las que se establece una relación entre el cobre y el zinc. Los pacientes con anemia falciforme se caracterizan por presentar hiperzincuria. La deficiencia de zinc parece producir una ligera acumulación de cobre y un aumento de los niveles de ceruloplasmina, al intensificarse la absorción de cobre. Debido a la deficiencia de zinc, se produce el cierre del mecanismo intestinal de las metalotioneínas y aumenta la absorción de zinc. También se produce un aumento en la absorción de cobre y de sus niveles en el organismo sobre todo a nivel hepático, respondiendo con un aumento en la síntesis de ceruloplasmina. El proceso se revierte con la administración de zinc. La deficiencia de cobre trae como consecuencia la inducción intestinal de metalotioneínas por el zinc (Brewer et al., 1985). En cuanto a la enfermedad de Wilson, se trata de un desorden del cromosoma-13 relacionado con la excreción hepatobiliar de cobre manifestándose como una progresiva intoxicación hepática y neurológica (Goyer, 1995). La penicilamina resulta REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 88 ser efectiva pero es necesario valorar otras posibilidades debido a su toxicidad; así, el zinc se presenta como un tratamiento alternativo a la penicilamina. Para comprobar que el único camino para controlar la acumulación de cobre en la enfermedad de Wilson era la penicilamina se retiró a los pacientes brevemente de la penicilamina y se hizo un estudio del estatus de cobre con la terapia de zinc. Debe prolongarse durante 2 o 3 meses debido a que durante la terapia con penicilamina los pacientes presentan deficiencia de zinc. Así que hasta que no tengan la cantidad suficiente con las dosis farmacológicas el zinc no induce la síntesis de metalotioneínas, de ese modo proporciona un bloqueo de la absorción de cobre (Brewer et al., 1985). V.6.2.3. Hierro El metabolismo del cobre y del hierro están íntimamente relacionados (Garrick et al., 2003b). Aunque se sabe que la deficiencia de cobre genera deficiencia celular de hierro no se conoce todavía cual es la base molecular de esta interacción. Hart et al. (1928) fueron quienes registraron una de las primeras interacciones entre elementos traza, así descubrieron que el requerimiento de cobre en la hematopoyesis que relaciona el cobre y el hierro puede describirse como una interacción no competitiva. Se han realizado estudios sobre esta interacción positiva que cobran importancia porque la proteína ferroxidasa-I que contiene cobre, cuya actividad está marcadamente disminuida por su deficiencia, es esencial para la movilización de hierro de los almacenes previos a su incorporación a la hemoglobina (Roeser et al., 1970). Askwith et al. (1994) comprobaron en levaduras que el cobre es un grupo prostético de la ferroxidasa involucrada en el transporte de alta afinidad de hierro. Tanto el cobre como el hierro son nutrientes esenciales para la mayoría de los organismos, y muchas de sus utilidades están basadas en su capacidad para asumir al menos dos oxidaciones en las reacciones de reducción. Tanto el hierro férrico como el cobre cúprico son esencialmente insolubles en soluciones acuosas a pH neutro y precipitarán bajo la mayoría de las condiciones fisiológicas, así que por su toxicidad potencial y la dificultad de mantenerlos solubles es por lo que se asocian a transportadores y chaperones en casi todas las fases de su metabolismo. Cuando la capacidad de los transportadores/chaperones/sistemas de almacenamiento esté saturada es cuando llegan a ser tóxicos. En lo que se refiere al hierro, el control de la absorción, transporte y almacén depende de los cambios y unión a transferrina, ferritina y posiblemente lactoferrina. La metalotioneína juega un papel principal en el secuestro de cobre, lo que lleva a cuestionar si esta capacidad de unirse al cobre implica que pueda realizar una función análoga a la de la ferritina (Cherian, 2003). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 89 Cada día se están descubriendo nuevos mecanismos relacionados con el transporte de metales. El transportador divalente de metal (DMT1) aparentemente transporta ambos metales iónicos (Gunshin et al., 1997), por lo que es otro cruce potencial en la homeostasis del cobre y del hierro. Linder et al. (2003) examinaron la interacción entre cobre y hierro en un mismo cultivo celular, encontrando que la disminución celular aumenta la absorción para ambos iones metálicos y que la disminución celular de hierro o cobre también intensifica el transporte epitelial de hierro desde la cámara apical a la basal. Algunos de estos resultados reflejan la conducta del transportador DMT1. La capacidad de DMT1 de transportar otros metales divalentes como manganeso, cadmio, níquel, cobalto, o plomo (Garrick et al., 2003a) podrían explicar que estos metales interaccionen con el hierro y el cobre. De la misma forma Roth et al. (2003) demostraron que el estatus de hierro afectaba a la toxicidad de manganeso probablemente en una vía en la que comparten un transportador como DMT1. La ceruloplasmina y la hepaestina son oxidasas de cobre que juegan un claro papel en el metabolismo del hierro, ambas están involucradas en la exportación de hierro de algunas células. Patel et al. (2000) consideraron el papel de la ceruloplasmina en lo referente a la interacción del hierro y cobre, e identificaron una isoforma de proteína (GPI) que se detectó particularmente en el cerebro, estos hallazgos ayudaron a corroborar la hipótesis del traspaso parcial de funciones entre la ceruloplasmina y la hepaestina porque no todas las formas de proteína se encuentran en el suero. Otro mecanismo de interacción entre ambos metales puede proceder de IRE/IRP (elementos sensibles al hierro/proteínas reguladoras de hierro). Este sistema sensible asegura que el ARN de los elementos sensibles al hierro se exprese de manera coordinada con la disponibilidad del hierro. Oshiro et al. (2002) concluyeron que algún otro metal podría afectar a este sistema sensible. Arredondo et al. (2003) mostraron que la respuesta de IRP1 (proteína sensible al hierro) con respecto al cobre era similar a la respuesta del hierro. A pesar del paralelismo también existen importantes diferencias entre hierro y cobre en cuanto a su homeostasis. Linder et al. (2003) revisaron la excreción del cobre que es una de las fases de mayor importancia en cuanto a su homeostasis, diferente al hierro que se pierde a través de procesos que son relativamente independientes de los niveles de hierro en el organismo, excepto ante mayores contenidos de cobre en células que llevan a una ligerísima mayor excreción. Se ha cuestionado por qué los niveles de DMT1 son altos en riñón, una localización que se relacionaría con el proceso de excreción, se cree que asegura la recuperación del hierro filtrado o guía la homeostasis de otro metal (Garrick et al., 2003a). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 90 En la intoxicación crónica por cobre se han descrito modificaciones importantes de los niveles de hierro, especialmente a nivel renal. Durante la fase pre-hemolítica el cobre acumulado en riñón mantiene su función y éste presenta mínimos daños estructurales (Gooneratne y Howell, 1983). Durante la hemólisis, la asociación de cobre y hierro contenidos en el riñón es bastante elevada y destaca su incapacidad funcional a nivel glomerular y tubular. En cuanto a la patogenia no está claro el mecanismo responsable de los cambios degenerativos y necróticos, la ruptura de los lisosomas que liberan cobre, cobre-metalotioneínas, todos pueden ser citotóxicos y dar lugar a una desorganización de la célula. Los mecanismos son quizás similares a los que afectan al parénquima hepático. La actividad redox del cobre también se asocia a una neurodegeneración (Opazo et al., 2003). Cuando es uno de los síndromes asociados a enfermedades relacionadas como de Wilson y Menkes (Mercer, 1997; Mercer et al., 2003) y aceruloplasminemia (Miyajima et al., 2003), se constata la hipótesis de que ambos metales, cobre y hierro, son críticos para el desarrollo mental propiamente dicho, así como la toxicidad de uno o los dos conlleva al desarrollo de muchas formas de neurodegeneración. V.6.2.4. Selenio El selenio es un elemento que presenta importantes interacciones tanto con elementos tóxicos como cadmio, plata y mercurio, como con otros esenciales como el cobre. Posiblemente la interacción mejor estudiada es la que ocurre con el mercurio; así, actúa frente a su intoxicación probablemente protegiendo del daño celular producido por los radicales libres, aumentando la síntesis de la enzima glutation-peroxidasa (que sería inhibida por el mercurio) y formando complejos inactivos de selenio-mercurio (Goyer, 1995). Uno de los mecanismos en los que se ve involucrado el selenio en la detoxificación de metales consiste en trasladar elementos tóxicos desde la circulación sistémica y concentrarlos en los lisosomas. El selenio intensifica los procesos de concentración y precipitación de ciertos elementos que tienen lugar dentro de los lisosomas, lo que resulta en muchos casos beneficioso. Berry et al. (1995) estudiaron la interacción del selenio con elementos del grupo 1b del sistema periódico y emplearon pruebas de microanálisis para detectar a los elementos en las organelas intracelulares; tras administrar cobre, plata y sales de oro observaron como se concentraban en los lisosomas de hígado o riñón en presencia de sulfuro. En el caso concreto del cobre, la incorporación del cobre hepático en las metalotioneínas del citosol y sobre todo en los lisosomas constituye un importante mecanismo para la detoxificación celular, ya que como sabemos el patrón de distribución del cobre hepático refleja la distinta susceptibilidad que sufren las REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 91 especies y la toxicidad hepática del cobre se reduce enormemente si éste está unido a metalotioneínas (Bremner, 1987). El papel del selenio al formar parte de la enzima glutation-peroxidasa es la catálisis de la reducción de peróxido de hidrógeno y otros hidroperóxidos (Counotte y Hartmans, 1989). Como la GSH-Px sanguínea se encuentra en los glóbulos rojos funcionando como parte del sistema antioxidativo, protege la célula de procesos oxidativos (Chowdhury y Chandra, 1987; Bires et al., 1991b). En la intoxicación por cobre el selenio neutraliza el efecto tóxico del cobre ya que produce un daño oxidativo en los glóbulos rojos y causa hemólisis (Soli, 1980; Hidiroglou et al., 1984) y peroxidación de lípidos especialmente en los hepatocitos (Nederbragt et al., 1984). Otros nutrientes, como la vitamina E, ácidos grasos poliinsaturados, metionina, azufre y cobre, interaccionan con el selenio y por tanto van a afectar a sus requerimientos. Bires et al. (1991a) realizaron un estudio tras una administración parenteral de selenio en ovejas para evaluar la influencia en el desarrollo de una intoxicación de cobre. Los resultados confirmaron que el selenio administrado 3 veces por semana no afectaba significativamente a la evolución de los animales intoxicados por cobre. Otro mecanismo de interacción entre el selenio y el cobre podría situarse en el tracto digestivo donde el selenio da lugar a complejos al asociarse al cobre, como la forma selenito de cobre que es altamente insoluble. Estos complejos tan sólo se solubilizan ligeramente en ácido (Weast 1978) si se forman dentro del rumen, pero no se solubilizan en el abomaso, por lo que pasaría a ser no disponible. En relación a la asociación casual descubierta entre la deficiencia de selenio y el desarrollo de cáncer en humanos, ésta permitió establecer que los compuestos de selenio dietéticos tienen un papel protector frente al cáncer. Los experimentos realizados en animales expuestos de forma crónica a selenito de sodio, cadmio, plomo y arsénico inorgánico demostraron que estos últimos contrarrestan el efecto anticarcinogénico de los compuestos de selenio administrados. De manera que si se consiguen aclarar estos mecanismos moleculares se descubrirían potencialmente los mecanismos involucrados en la intoxicación crónica de los metales pesados y metaloides (Gailer, 2002). V.7. Influencia hormonal en el metabolismo del cobre Es conocida la influencia hormonal de la secreción de las glándulas endocrinas en una amplia variedad de funciones metabólicas en el organismo de los mamíferos. Una de las primeras evidencias de la influencia hormonal en el metabolismo del cobre fue descrita por Krebs en 1928, quien observó que los niveles de cobre en suero de hembras preñadas eran casi el doble de la que presentaban los individuos control REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 92 (Evans, 1973). Desde entonces se ha descubierto la participación de numerosas hormonas en el metabolismo del cobre. V.7.1. Hormona del crecimiento La hormona del crecimiento o somatotropina provoca el crecimiento de los tejidos del cuerpo, además tiene muchos efectos metabólicos generales que incluyen un aumento de la síntesis de proteínas en todas las células del organismo, mejora el empleo de las grasas y conserva los carbohidratos. La hormona del crecimiento también influye en el metabolismo del cobre a través de sus efectos en el metabolismo proteico y, como ya sabemos, la síntesis de proteínas tiene un marcado efecto en la homeostasis cúprica (Evans, 1973). V.7.2. Hormonas adrenocorticotrópica y adrenales La hormona adrenocorticotrópica (ACTH) controla la secreción de cortisol. Evans y Wiederanders (1968) observaron que múltiples inyecciones de hormona adrenocorticotrópica disminuían los niveles de ceruloplasmina y cobre en plasma de ratas, tanto en animales neonatos como en adultos. Sin embargo, hay otros estudios que muestran resultados opuestos, en los que se constata que no hay un aumento de cobre plasmático tras la inyección de trementina que tiene entre otros un efecto estimulante. Ante cualquier tipo de estrés se produce un incremento inmediato y notable de la secreción de hormona adrenocorticotrópica en la hipófisis anterior, a lo que sigue en plazo de minutos un aumento de la secreción de cortisol. Ante el estrés la mayoría de los mamíferos presentan un aumento de los niveles de cobre y ceruloplasmina en plasma. Así, Evans et al. (1969) demostraron que tanto la concentración plasmática de cobre como la de ceruloplasmina se elevaban de forma significativa en ratas adultas después de permanecer siete minutos nadando. De forma similar, Haralambie y Kreul (1970) detectaron un aumento de cobre y ceruloplasmina en suero después de dos horas de ejercicio físico en humanos. Se ha demostrado una relación inversa entre los niveles plasmáticos de cobre y corticosteroides, lo que indica que las hormonas de la corteza adrenal no determinan un aumento de cobre plasmático durante el ejercicio físico; es más, la inyección de esteroides adrenales en ratas adultas no tuvo efectos en los niveles de cobre plasmáticos (Gregoriadis y Sourkes, 1970; Evans, 1973). De esa manera se reforzó como hipótesis provisional que la adrenalina era la responsable del aumento plasmático de cobre y ceruloplasmina asociado al ejercicio físico intenso (Evans, 1973; Gregoriadis y Sourkes, 1970). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 93 V.7.3. Hormonas sexuales El efecto de las hormonas sexuales femeninas se estudió al administrar estrógenos y se observaron aumentos de cobre sanguíneos en muchas especies de mamíferos (Evans et al., 1970a; Evans, 1973). Rusanov et al. (1981) demostraron que las hormonas sexuales, especialmente los estrógenos, inducían la síntesis de ceruloplasmina en ovejas, además de producir un aumento de la concentración de cobre en hígado. La gestación también parece tener un efecto significativo sobre la homeostasis de cobre. Butler (1963) demostró en ovejas que la preñez producía un descenso en los niveles de cobre y ceruloplasmina en sangre entera, mientras que en otras especies mamíferas se ha descrito un aumento de los niveles de cobre y ceruloplasmina en sangre al progresar la preñez (O´Leary y Spellacy, 1968). Esta influencia hormonal presenta importancia, puesto que puede condicionar la susceptibilidad de los animales a padecer procesos de intoxicación por cobre. A modo de ejemplo señalar que en una intoxicación accidental en ganado vacuno lechero al que se le añadió una cantidad excesiva de cobre a la ración comercial, se encontró que la mayoría de los animales afectados que sucumbieron a la intoxicación por cobre eran hembras que se encontraban al final de la preñez o habían parido pocos días antes de la crisis hemolítica (Perrin et al., 1990). Se documenta así que altos niveles de estrógenos aumentan la absorción de cobre en el intestino y pueden acelerar la síntesis de ceruloplasmina y otras proteínas ligantes de cobre. En cuanto a las hormonas sexuales masculinas, se ha observado que la administración de testosterona produce un aumento de cobre sanguíneo en humanos (Johnson et al., 1959). REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 94 VI. Tratamiento y control, suplementación de cobre VI.1. Tratamiento y control Una vez que se ha diagnosticado la intoxicación por cobre el tratamiento irá encaminado, además de tratar de estabilizar al animal en la fase de crisis hemolítica, a retirar la fuente de cobre y a reducir los depósitos corporales (especialmente hepáticos) de este mineral (Howell y Gooneratne, 1987; Auza et al., 1999; Underwood y Suttle, 2002) La primera medida a tomar es eliminar inmediatamente la fuente de cobre. Como en la mayor parte de los casos la intoxicación ocurre a través de la dieta, ésta debe remplazarse por una que contenga un nivel de cobre y de oligoelementos antagonistas adecuado. No obstante, hay que tener en cuenta que los signos de intoxicación pueden seguir apareciendo en el rebaño o incluso algún animal puede morir después de que se haya eliminado el exceso de cobre; esto puede ser debido a que el cobre continua disponible en el rumen o a que el nivel de almacenamiento hepático es muy elevado. Además, como la crisis hemolítica se desencadena generalmente en situaciones de estrés, un punto fundamental en el tratamiento es evitar todas aquellas situaciones estresantes como traslados, cambios bruscos de temperaturas (especialmente el frío), periodos de ayuno temporales y determinadas prácticas de manejo como la castración o el esquilado en ovejas que puedan suponer un estrés para los animales del rebaño, incluso para aquellos aparentemente sanos (Underwood y Suttle, 2002) Los primeros tratamientos que se registraron de la intoxicación de cobre fueron el azul de metileno y el ácido ascórbico con el objetivo de corregir la metahemoglobinemia, así como los daños peroxidativos. El azul de metileno, a una dosis de 5-10 mg/kg de peso inyectados en una solución intravenosa al 4%, reducía la metahemoglobinemia (fenómenos oxidativos en la hemoglobina) pero no prevenía las muertes. El ácido ascórbico también fallaba en lo que se refería a revertir los efectos de la intoxicación por cobre como son los daños por fenómenos de oxidación (Braude y Ryder, 1973). También se evaluó para el tratamiento de la intoxicación por cobre el uso de agentes quelantes que se unen al metal y previenen el daño tisular. En ovejas, 100 mg de 2,3dimercapto-1-propanol en aceite administrado por vía intramuscular, y di-sodiocalcio-edetato administrado intravenoso fallaron en el intento de aumentar la excreción urinaria de cobre y por tanto fueron inefectivos. La penicilamina, sin embargo, consiguió aumentar la excreción urinaria en más de 20 veces pero su REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 95 elevado precio hace que no sea factible su uso para el tratamiento rutinario en animales de granja. Otros compuestos como el dimetil-tiocarbamato tampoco se han mostrado efectivos en la excreción de los depósitos corporales de cobre (Gooneratne y Christensen, 1997). Los aumentos en las concentraciones de zinc en la dieta muestran un efecto beneficioso contra la intoxicación de cobre, tanto en ovejas como en cerdos, al disminuir la absorción intestinal de cobre. Sin embargo, el hecho de que las concentraciones dietéticas de zinc necesiten elevarse a valores de entre 220-420 mg/kg para que sean efectivas limita su aplicación práctica (Bremner y Davies, 1976). Pero por otro lado se constató que la suplementación con zinc (Van Ryssen y Barrowman, 1987) y D-penicilamina (Botha et al., 1993; Humann-Ziehank et al., 2001) son ineficaces en la eliminación de cobre en sus formas unidas en el hígado. Un aumento en la proteína del concentrado de la dieta, de 10 a 20% también parece proteger contra la intoxicación de cobre en ovino (McPherson y Hemingway, 1965). En la actualidad el método más efectivo para movilizar en cobre de los depósitos corporales es el empleo de soluciones orales de tetratiomolibdato de amonio (Gooneratne et al., 1989b). Se trata de un tratamiento muy práctico y específico que se basa en la interacción del cobre con molibdeno y azufre para producir compuestos de cobre unido a molibdatos que pueden ser excretados con facilidad. Tras la administración intravenosa de tetratiomolibdato de amonio a ovejas intoxicadas por cobre se observó una reducción importante en la concentración de cobre en las fracciones hepáticas, en el número y tamaño de los lisosomas electrodensos presentes en los hepatocitos y en el número de células necróticas en el hígado. El tetratiomolibdato es capaz de movilizar el cobre presente en los lisosomas y el citosol de las células cargadas de cobre. Tras la administración de tetratiomolibdato aumenta la concentración de molibdeno total en los hepatocitos así como en las distintas fracciones, lo que indica que el molibdeno procedente de los tetratiomolibdatos está entrando en las células hepáticas. La movilización hepática de cobre trae como consecuencia un descenso de los niveles del metal en el hígado, un aumento de la concentración de cobre en sangre así como de su excreción urinaria. De forma experimental también se ha demostrado la eficacia de los tetratiomolibdatos en la prevención parcial o total de la hemólisis y otros daños titulares (Howell y Gooneratne, 1987; Auza et al., 1999) En los estudios experimentales llevados a cabo por Gooneratne y colaboradores (1989b, 1997) en ovinos intoxicados por cobre se demostró que los tetratiomolibdatos producen una rápida movilización del cobre hepático para ser eliminado vía urinaria, aunque también se produce un aumento de su excreción vía biliar y se potencia su secreción endógena en el tracto gastro-intestinal. Los mayores efectos de los tetratiomolibdatos en la excreción biliar ocurrían a las 24 horas siguientes a su REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 102 que exceda, por encima de los requerimientos nutricionales, por la vía parenteral puede ser almacenada en el hígado y llegar a desencadenar una intoxicación. Hay distintos factores que determinan la duración del efecto, como la ingesta de cobre en la dieta, la cantidad almacenada en el organismo y los continuos requerimientos diarios. Por ejemplo, las terneras preñadas deben recibir suplementos de cobre adecuados antes del día 50, cuando comienza la primera fase de mielinización en el desarrollo fetal. En ganado ovino, si la deficiencia de cobre es severa durante la preñez, los corderos recién nacidos deberán ser suplementados con cobre vía parenteral. En vacuno de carne con rápido crecimiento que se encuentra pastando en áreas con severa deficiencia de cobre Gleed et al. (1983) demostraron que era necesario repetir la dosis parenteral. VI.2.5. Agujas de óxido de cobre Las agujas de óxido de cobre son partículas de elevado peso específico en forma de varilla, con una longitud de entre 1-10 mm, compuestas por óxido de cobre y alambres de cobre oxidado que pueden ser administradas fácilmente en gelatina o una cápsula similar. Una vez administradas las cápsulas se disuelven lo que permite que las partículas en ella englobadas se liberen durante un periodo de varias semanas, algunas de ellas en los preestómagos pero sobre todo en el abomaso, donde el óxido de cobre se disuelve de forma lenta a pH ácido (Cameron et al., 1989). El ritmo óptimo de dosificación es de 0,1 g/kg de peso vivo (Suttle, 1987). Deben controlarse las dosis elevadas en ovinos por la peligrosidad de causar una toxicidad, si éstas ya cuentan con buenos niveles de cobre (Allen et al., 1984). La principal ventaja que presentan frente a otros métodos de suplementación es que las reservas hepáticas de cobre pueden mantenerse durante meses después de una dosis única (McFarlane et al., 1991). En ovinos, este tipo de suplementación es uno de los mejores métodos para prevenir la deficiencia de cobre y sus implicaciones. Suttle (1981) demostró que 0,5 g de cobre (0,64 g de agujas) protegía de forma efectiva contra la hipocupremia, mientras que Cavanagh y Judson (1994) concluyeron que con dosis de 2,5 g de óxido de cobre se podría prevenir la deficiencia de cobre en breves periodos de tiempo en ovejas en pastoreo sin ningún riesgo de intoxicación por cobre. Judson et al. (1982) realizaron diversos experimentos en ovejas de la raza merina en Australia a las que se les prescribió dosis de 2 a 16 g de cobre. Concluyeron que con dosis de 2,0 g se incrementó la concentración de cobre en el hígado por lo menos durante 30 semanas. Whitelaw et al. (1983) administraron 3,2 g de cobre en terneros con deficiencia inducida y 1,6 g a corderos con edades comprendidas entre 3-5 semanas, pero no REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 103 consiguieron constatar cual era su efecto valorando las concentraciones de cobre en el hígado. Deland et al. (1979) administrando dosis de 50 g en terneros de 3 meses observaron que los animales estaban protegidos durante seis meses contra la deficiencia de cobre (hipocupremia, bajas concentraciones de cobre en hígado, reducciones en la producción). Al comparar sus efectos con la aplicación de una dosis única parenteral de 120 mg de cobre en forma de glicinato de cobre constataron que la protección alcanzada era mejor en el primer caso. McPherson (1983a) encontró que con una dosis de 3,2 g de cobre en terneros y de 8 a 16 g en novillas y vacas de carne adultas en pastoreo, los animales quedaban protegidos frente a las deficiencias estacionales producidas por el pasto. Whitelaw et al. (1983) administraron 16 g de cobre a terneros de 190 kg y observaron como su índice de crecimiento se vio aumentado de forma significativa al igual que los niveles de cobre en sangre durante varios meses. McPherson (1983b) administró 48 g de cobre en vacas de carne con el objetivo de conseguir una protección por largos periodos de tiempo y concluyó que estaba suficientemente justificada la dosis ya que se alargaba el periodo de protección a casi 8 semanas. El vacuno adulto se encuentra suficientemente protegido durante 6 meses con dosis de 16 g de cobre. En ovinos, el tratamiento temprano durante la preñez protege a sus crías gracias a la transferencia de cobre a través de la placenta (Gooneratne y Christensen, 1985). Tanto en ovino como en vacuno los niveles de cobre que son transferidos a través de la leche son pobres, es probable que los terneros se vean afectados y que se les deba administrar para la deficiencia de cobre dosis de hasta 20 g. Judson et al. (1984) estudiaron algunos factores que condicionan la disponibilidad del cobre en las agujas. Demostraron que en ovino, tanto en extensivo como en intensivo, el efecto del grado de llenado del rumen en el momento de la administración de la dosis era insignificante. Observaron además que las partículas de cobre eran más efectivas para alcanzar niveles de cobre hepáticos si presentaban un tamaño uniforme (de 3,0 a 4,0 mm de longitud, de 1 a 1,2 mm de diámetro, con un promedio de 140 partículas en 2,5 g) que si había tamaños distintos. Si se quiere conseguir la máxima eficacia de estas partículas se deben controlar las enfermedades parasitarias y otras causas de diarrea, ya que en estudios realizados en Nueva Zelanda por Bang et al. (1990) se sugirió que cuando los parásitos incrementaban el pH del abomaso la cantidad de cobre liberado de las partículas de óxido de cobre era menor. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 104 VI.2.6. Liberación controlada en cristales La utilización de cristales ha sido evaluada como un posible método de suplementación de cobre de larga duración por Allen et al. (1984), quienes han descrito como su solubilidad depende sobre todo de las concentraciones de los constituyentes principales (calcio, sodio e iones fosfato) variando así el cristal de insoluble a soluble, si bien en todos los casos las variaciones en la proporción de cobre tienen un mínimo efecto en su solubilidad. De forma adicional estos cristales también pueden contener selenio y cobalto. Estos mismos autores describieron el uso de cristales con un 18% del peso de cobre que tras el procesado bajo la forma de cápsulas cilíndricas contaban con un peso aproximado de 17 y 75 g para ovejas y vacuno de carne en crecimiento respectivamente; estos cristales se incrustan en la parte anterior del estómago de manera que el cobre se va liberando diariamente desde un mínimo de 2,1 mg en ovino a 11 mg en vacuno; incluso aunque este ratio de liberación se mantuviera tan sólo en un 50% en las ovejas y un 30% en los terneros de la recomendación diaria dietética, la concentración hepática de cobre se elevaría de forma muy importante. En un experimento realizado con ovejas se observó un aumento de la actividad de ceruloplasmina al menos durante un año desde su aplicación (Carlos et al., 1985). La mayor ventaja es que aprovisiona suplementos adicionales de cobre en una proporción uniforme durante muchos meses. Mientras que las agujas son efectivas 6 meses después de la dosis, esta forma cristalizada lo es más allá, es decir, sólo es necesaria una administración anual. Como un posible inconveniente, debemos señalar que en su primera comercialización en ovejas se sugirió que la cantidad de cobre que se liberaba no era suficiente para prevenir el desarrollo de ataxia neonatal en corderos de madres tratadas, si bien esta limitación se podría contrarrestar con un aumento en la solubilidad del producto. VI.2.7. Suplementos de cobre inorgánico vs. orgánico La baja disponibilidad del cobre en los alimentos para rumiantes ha hecho necesario potenciar el uso de agentes que protejan al cobre contra antagonistas que actúan en el rumen, pero desafortunadamente este objetivo no se ha logrado. Se han propuesto mezclas de hidroxilatos Cu-proteína (“metalosatos”) y de complejos aminoácidos específicos como Cu2:lisina. En varios estudios en ganado vacuno en los que se han probado metalosatos (Wittenberg et al., 1990) y Cu-aminoácido (Ward et al., 1993; Kegley y Spears, 1994; Du et al., 1996; Yost et al., 2002) y en un estudio en ovino con Cu2:lisina (Suttle y Bremner, 1996) no se ha demostrado que ninguna de estas fuentes tenga ventajas sobre el tradicional sulfato de cobre. En estudios con cerdos o aves REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 105 tampoco mostraron una disponibilidad superior sobre el sulfato de cobre, la metionina-Cu ni la lisina-Cu (Baker y Ammerman, 1995). VI.2.8. Selección genética Se pueden aprovechar las variaciones genéticas referidas al metabolismo del cobre para prevenir las deficiencias y disminuir la dependencia de una suplementación en el caso de problemas endémicos. Woollians et al. (1985, 1986) seleccionaron carneros jóvenes por sus concentraciones plasmáticas de cobre a lo largo de cuatro generaciones consiguiendo eliminar la hipocuprosis en un rebaño calificado como “vulnerable” sin la necesidad de recibir una alimentación específica. Otra opción es cruzar corderos de un rebaño calificado como “tolerante” como Texel con corderos escoceses Blackface para así reducir los problemas de hipocuprosis. VI.2.9. Minimización de los antagonismos Teniendo en cuenta la influencia de antagonistas como el hierro y especialmente el molibdeno sobre la incidencia de desordenes que responden al cobre, su prevención puede alcanzarse, en parte, reduciendo al máximo la exposición a dichos antagonistas. En cuanto a los problemas de deficiencia, debe evitarse el uso excesivo de cal y mejorar el drenaje del suelo cuando hablamos del molibdeno. En cuanto al hierro, se consigue disminuir a base de evitar el pastoreo excesivo. Además, tanto en rumiantes en pastoreo como adultos en estabulación nunca debe utilizarse hierro para formular suplementos minerales. MATERIAL Y MÉTODOS 109 I. Animales de estudio y diseño experimental I.1. Selección de los animales de estudio y condiciones de experimentación Para llevar a cabo los objetivos planteados en esta Tesis Doctoral se han empleado 30 terneros de las razas más significativas en terneros de carne en Galicia: raza Rubia gallega (11 animales), raza Frisona (9 animales) y cruces industriales de ambas razas (Rubia gallega x Frisona: 10 animales). Los animales se adquirieron antes del destete con una edad aproximada de 1 mes. Los datos relativos al animal, así como la comprobación de la línea genética materna (para asegurarnos de que no hubiese interferencias de otras razas) se comprobaron mediante el documento de identificación bovina (DIB) y a través de las bases de datos oficiales de los Servicios Veterinarios de la Xunta de Galicia. La línea paterna se comprobó por los registros de inseminación artificial. No se incluyó en el estudio ningún animal del que no tuviesemos información de la línea genética. Los animales se mantuvieron en condiciones de experimentación en unas instalaciones diseñadas y preparadas para llevar a cabo el experimento dentro de una explotación ganadera situada en Nadela (Lugo), a 10 kilómetros del laboratorio donde se llevaron a cabo todos los análisis. La estancia de los animales en el cebadero, así como todo el experimento que se detalla a continuación, fue realizado siguiendo las directrices relativas al alojamiento y cuidado de los animales para experimentación (Anexo II al artículo 5 de la Directiva del Consejo de 24 de noviembre de 1986 de la U.E.; R.D. 223/1998; D. 86/609/CEE; RD 1201/2005). Los terneros llegaron a la explotación aproximadamente al mes de vida, permaneciendo en ella hasta su traslado al matadero para el sacrificio. Una vez introducidos los animales en la explotación, se procedió al destete y aclimatación de los mismos y se comenzó a realizar un programa sanitario. En cuanto a las características del alojamiento, los cubículos estaban equipados con dispensadores automáticos de agua y el suelo era de rejillas con caída de las deyecciones al fondo. Los animales estaban separados en tres lotes según cada raza. En cuanto al programa sanitario, los animales fueron desparasitados con objeto de favorecer tanto su desarrollo productivo como su sistema defensivo. Para ello se MATERIAL Y MÉTODOS 110 emplearon ivermectina al 1% inyectable (1 mL/50 kg de peso vivo por vía subcutánea, Ivomec®, Laboratorios Merial) y albendazol en suspensión oral (1 ml/10 kg de peso vivo por vía oral, Albensol-10%®, Fort Dodge Veterinaria). Se llevó a cabo también un protocolo vacunal para IBR, PI3, síndrome respiratorio bovino y BVD (a dosis de 2 ml, Cattlemaster-4®, Laboratorios Pfizer); así como vacunación frente a enterotoxemia (4 ml, Toxipra S7®, Laboratorios Hipra). Como señalabamos anteriormente, una vez incorporados los animales a la explotación se procedió al destete y aclimatación de los mismos. Así, la incorporación de los terneros al consumo de la dieta utilizada en el experimento se realizó de forma paulatina, en primer lugar recibieron un pienso de arranque o starter, elaborado a base de lactorreemplazantes y cereales, y posteriormente se introdujo la dieta de crecimiento-cebo. Se realizó un ciclo de 7 meses, lo que se corresponde con las fases de crecimiento y acabado de los actuales sistemas de cebo de terneros (González y Llena, 1994). Los muestreos se realizaron entre los meses de abril y septiembre de 2005. I.2. Características de la dieta Una vez finalizada la fase de adaptación de los animales, éstos fueron alimentados con un pienso comercial específico para crecimiento y cebo de terneros, cuyos ingredientes y composición química se muestran en la Tabla 1. Los tres lotes de estudio fueron suplementados con 35 mg/kg de materia seca (MS) de sulfato de cobre (CuSO4), límite máximo permitido en dietas destinadas a terneros (Reglamento CE Nº 1334/2003 de la Comisión del 25 de julio de 2003). La dieta suministrada fue representativa de la que reciben los terneros en cebo intensivo (concentrado y forraje), estando adecuada a las necesidades nutricionales de los mismos (NRC, 2004). MATERIAL Y MÉTODOS 111 Tabla 1. Composición del pienso utilizado en la alimentación de los terneros (según etiqueta): Pienso complementario para vacuno en fase de crecimiento y cebo. TERNIgranNG (presentación en harina). Análisis de las dietas Una vez iniciado el experimento, se realizaron análisis mensuales de las dietas empleadas. De cada partida de pienso introducida se recogían tres muestras representativas, que fueron analizadas previo al consumo de pienso por parte de los animales para comprobar que la suplementación de cobre era correcta, así como valorar los niveles de otros minerales. Asimismo, sirvieron también para comprobar que tanto la composición de la dieta, como las características fisico-químicas de la misma eran adecuadas y coincidían con lo certificado por el fabricante. El análisis de las muestras se llevó a cabo en el laboratorio de Mouriscade, Finca Mouriscade, perteneciente al Servicio Agrario de la Diputación Provincial de Pontevedra; laboratorio certificado y de referencia de Galicia para análisis de alimentos animales. En la siguiente tabla (Tabla 2) presentamos los valores medios de los análisis realizados (n=9). En todo momento el análisis de la dieta coincidió con lo descrito por CONSTITUYENTES ANALÍTICOS Proteína bruta (%) 15,5% Materias grasas brutas (%) 5,25% Celulosa bruta (%) 4,27% Cenizas brutas (%) 5,76% ADITIVOS Vitamina A 10000 UI/kg Vitamina D3 2000 UI/kg Vitamina E (α-tocoferol de síntesis) 25 mg/kg Cobre (Sulfato cúprico pentahidrato) 35 mg/kg Sacaromyces cerevisiae-CNCM 7077 1,5 x 109UFC Butilhidroxitolueno E-321 MATERIAS PRIMAS PARA ALIMENTACIÓN ANIMAL Maíz 40% Cebada 22,1% Harina de extracción de soja modificada genéticamente 16,7% Salvado de trigo 8% Gluten feed de maíz modificado genéticamente 6% Carbonato cálcico 1,60% Aceite de soja modificada genéticamente 1,50% Sal cálcica de ácidos grasos de aceite de palma 1,10% Melaza de caña de azúcar 1% Fosfato monocálcico 0,70% Cloruro sódico 0,60% MATERIAL Y MÉTODOS 112 el fabricante. La suplementación de cobre fue correcta, los niveles variaron de un mínimo de 26 mg/kg a un máximo de 40 mg/kg. Tabla 2. Composición de la dieta de los análisis realizados (n=9) (media±ES y rango de valores). Parámetro analizado media ±ES Mín-Máx CONSTITUYENTES ANALÍTICOS Húmedad (%) 12,8±1,11 11,2-13,8 Proteína Bruta (%) 16,8±1,93 15,2-19,1 Fibra Bruta (%) 3,92±0,158 3,70-4,10 Cenizas (%) 5,08±0,657 4,30-5,90 Almidón (%) 39,1±2,96 35,2-41,8 Materia Grasa (%) 3,72±0,918 2,90-4,90 MINERALES Calcio (%) 0,618±0,140 0,50-0,78 Sodio (%) 0,264±0,147 0,10-0,41 Potasio (%) 0,820±0,045 0,80-0,90 Magnesio (%) 0,240±0,055 0,20-0,30 Fósforo (%) 0,450±0,051 0,39-0,50 Manganeso (mg/kg) 78,4±13,0 52,0-118 Hierro (mg/kg) 214±13,5 196-231 Zinc (mg/kg) 47,6±9,61 36,0-58,0 Cobre (mg/kg) 34,8±4,93 26,0-40,0 I.3. Parámetros productivos Durante el ciclo productivo de los animales se evaluó la ingesta media en las diferentes razas, y en cada muestreo se procedió a pesar a los animales y se calculó la ganancia media de peso. En la Tabla 3 aparecen reflejados los datos medios de consumo de pienso y los pesos medios de la canal y de las diferentes vísceras. Tabla 3. Consumo total de pienso (en kilogramos) y pesos (media±ES en kilogramos) de la canal y distintos órganos de los terneros de raza Rubia gallega, Frisona y cruces industriales de ambas razas en este estudio. raza Rubia gallega Frisona Cruces Consumo de pienso 1230 1444 1330 Peso canal 239±7 201±7 228±8 Peso hígado 4,70±0,18 5,98±0,32 5,19±0,12 Peso riñón 0,397±0,021 0,544±0,018 0,465±0,015 Peso corazón 1,44±0,05 1,69±0,08 1,49±0,04 Peso bazo 0,711±0,041 0,783±0,042 0,660±0,035 MATERIAL Y MÉTODOS 113 II. Toma de muestras II.1. Sangre Se tomaron muestras de sangre mensualmente durante todo el ciclo productivo, desde los 3 meses hasta el momento del sacrificio, aproximadamente a los 9-10 meses de edad. La recogida de las muestras tuvo lugar entre abril y septiembre de 2005. La toma de muestras se realizó siempre a la misma hora de la mañana. Los animales eran pasados por la manga, se pesaban y posteriormente se procedía a la extracción de 40 ml de sangre de cada animal mediante punción de la vena yugular. Se utilizaron agujas estériles (Microlance®, Braun, Barcelona, España) de 1,2 x 40 mm de diámetro y jeringas de 20 ml (Omnifix®, Braun, Barcelona, España). La sangre obtenida se distribuía en tres tipos de tubos Vacutainer®: un tubo con heparina (10 ml) para obtención de plasma y análisis de cobre en sangre entera, un tubo con EDTA (10 ml) para los análisis hematológicos y dos tubos sin aditivos para la obtención de suero (2x10 ml). Estas muestras fueron trasladadas al laboratorio en condiciones de refrigeración. De los tubos con EDTA se tomaba una pequeña alícuota para realizar el estudio hematológico en un analizador automático (MS9 Automatic Cell Counter, Melet Schloesing Laboratories), después esta muestra se ultracentrifugaba en capilares y se realizaba la lectura del microhematocrito y el valor de proteínas totales por refractometría. El resto de la muestra original se centrifugaba a 1200 rpm durante 10 minutos para obtener plasma (centrífuga Kubota 2700, Kubota Corporation, Tokio), luego se colocaba en tubos eppendorf con la correspondiente identificación y se almacenaban a -20ºC hasta su posterior análisis laboratorial. Los tubos con heparina se distribuían en dos tubos de sangre (2,5 ml) que se almacenaba a -20ºC hasta su procesado laboratorial para la determinación de cobre en sangre entera. El resto de la muestra se centrifugó a 1200 rpm durante 10 mínutos y el plasma obtenido se distribuyó en tubos eppendorf y se almacenó a -20º. Con respecto a los tubos sin aditivos se procedió a la centrifugación (1200 rpm, 10 mínutos), posteriormente el suero se distribuyó en tubos eppendorf y se congeló a - 20º C. De estas muestras se realizaron las determinaciones de bioquímica, actividad de ceruloplasmina y concentración de cobre en suero. MATERIAL Y MÉTODOS 120 III.2.2. Albúmina Para su determinación recurrimos al uso de un método colorimétrico suministrado por los Laboratorios HumanH (Alemania). Esta técnica se basa en la reacción del verde bromocresol con la albúmina en tampón citrato, en la cual se forma un complejo coloreado. A continuación se mide su absorbancia en el espectrofotómetro, sabiendo que la absorbancia a 546 nm es proporcional a la concentración de albúmina en la muestra ensayada. Cmuestra (g/L) = 40 x Δ Absmuestra / Δ Absstandard III.2.3. Proteínas totales Su determinación también se basa en un método colorimétrico de los laboratorios HumanH (Alemania), fundamentado en la reacción que sufren los iones de cobre con las proteínas en un medio alcalino que da lugar a un complejo de color violeta. La absorbancia de este complejo es proporcional a la concentración de proteína en la sangre. Se utilizó un espectrofotómetro para las mediciones de las absorbancias a una longitud de onda de 546 nm. Cmuestra (g/L) = 80 x Δ Absmuestra / Δ Absstandard III.2.4. Colesterol La concentración de colesterol en suero se realizó mediante un método enzimático colorimétrico perteneciente a los laboratorios Spinreact (Spinreact, S.A., Barcelona, España). El principio del método es que los ésteres del colesterol son hidrolizados por una colesterol esterasa y el colesterol producido en esta reacción, más el colesterol libre, es oxidado por acción de una colesterol oxidasa con formación de peróxido de hidrogeno. Este último, en presencia de peroxidasa, oxida el cromógeno 4Aminofenazona/fenol a un compuesto de color rojo. Se realiza la lectura de la absorbancia en un espectrofotómetro a 500 nm. Cmuestra (mg/dl) = 200 x Δ Absmuestra / Δ AbsStandard III.2.5. Triglicéridos La concentración de triglicéridos séricos se calculó mediante un método enzimático colorimétrico de los laboratorios Spinreact (Spinreact, S.A., Barcelona, España). Los fundamentos del método son que los triglicéridos se hidrolizan enzimáticamente en glicerol y ácidos grasos libres, por medio de una combinación especial de lipasas. El indicador es una quinona formada a partir de peróxido de hidrógeno + 4aminoantipirina y 4-clorofenol, con la acción catalítica de una peroxidasa. La MATERIAL Y MÉTODOS 121 cantidad de quinona formada es proporcional a la concentración de triglicéridos presentes en el suero. La absorbancia es leída en un espectrofotómetro a 505 nm. Cmuestra (mg/dl) = 200 x Δ Absmuestra / Δ AbsStandard III.2.6. Ácidos grasos no esterificados (NEFA) En su determinación utilizamos el método colorimétrico suministrado por los Laboratorios Randox® (United Kingdom), basado en las siguientes reacciones a 37 ºC: los ácidos grasos libres reaccionan con ATP y coenzima A en una reacción catalizada por la acilCoA sintetasa formando acilCoA, este compuesto es oxidado por la acilCoA-oxidasa formando peróxido de hidrógeno, éste último se valora al hacerlo reaccionar con N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-m-toluidina y 4-Aminoantipirina, en una reacción catalizada por la peroxidasa, formando un producto púrpura. Se realiza la lectura de la absorbancia en un espectrofotómetro de absorción ultravioleta visible a 550 nm. Cmuestra (mmol/l)= Δ Absmuestra / Δ Absstandard III.2.7. Creatinina Para determinar la concentración de creatinina en suero se utilizó un método colorimétrico proporcionado por los laboratorios Gernon (Gernon, RAL Técnica para el Laboratorio, Barcelona, España) en el cual la creatinina reacciona con el picrato alcalino, según la reacción de Jaffé, para dar un cromógeno rojizo. La cantidad de cromógeno que se forma bajo condiciones controladas, es directamente proporcional a la concentración de creatinina en la muestra y se mide fotométricamente a 500 nm en un espectrofotómetro a los 30 segundos y a los 150 segundos. Cmuestra (mg/dl) = Δ Absmuestra / Δ Absstandard x 2 III.2.8. Urea Para calcular la concentración de urea sérica se utilizó un método colorimétrico de los laboratorios Gernon (Gernon, RAL Técnica para el Laboratorio, Barcelona, España). El principio de la reacción es que la urea es desdoblada por la acción específica de la enzima ureasa en CO2 y NH3.En una segunda etapa el NH3 con el 2oxoglutarato y el NADH, pasan a dar en presencia de la enzima glutamato dehidrogenasa (GLDH), glutamato y NAD. El consumo de NADH es medido por la disminución de absorbancia a 340 nm y es proporcional a la concentración de urea en la muestra que es leída en un espectrofotómetro a los 60 segundos y a los 120 segundos. Cmuestra (mg/dl) = Δ Absmuestra x 50 / Δ Absstandard MATERIAL Y MÉTODOS 122 III.2.9. Aspartato amino transferasa (ASAT) Para la determinación de la actividad aspartato aminotransferasa en suero empleamos un test cinético de los Laboratorios Gernon (Gernon, RAL Técnica para el Laboratorio, Barcelona, España). El principio de la técnica se basa en que la enzima cataliza la reacción entre 2-oxoglutarato y L-aspartato, dando lugar a oxalacetato, el cual reacciona con NADH en presencia de malato deshidrogenasa, formándose malato y NAD+. Los incrementos de absorbancia que experimenta la muestra se miden en un espectrofotómetro de absorción ultravioleta visible, a una longitud de onda de 340 nm a intervalos de 1 minuto durante 3 minutos. Se calcula el incremento de absorbancia media por minuto y la actividad enzimática en la muestra se estima empleando la siguiente fórmula: Actividadmuestra (UI/L) = Δ Absmuestra/minuto X 952 III.2.10. Creatin kinasa (CK) Para la determinación de la actividad creatín quinasa en suero empleamos un test cinético de los Laboratorios Gernon (Gernon, RAL Técnica para el Laboratorio, Barcelona, España). El principio de la técnica se basa en que la enzima CK cataliza la fosforilación reversible de ADP, en la presencia de fosfato creatino, para formar ATP y creatina. A su vez, la Hexokinasa (HK) cataliza la fosforilación de glucosa por el ATP formado para producir ADP y glucosa-6-fosfato (G-6-P). El G-6-P es oxidado a 6fosfogluconato con producción derivada a NADH. La variación de la formación de NAHD, medida con un espectrofotómetro a 340 mm a intervalos de 1 minuto durante 4 minutos, es directamente proporcional a la actividad del suero CK. Actividadmuestra (UI/L) = Δ Absmuestra/minuto X 3375 III.2.11. Gamma glutamil transferasa (GGT) Para la determinación de la actividad gamma glutamil transferasa en suero empleamos un test cinético de los Laboratorios Spinreact (Spinreact, S.A., Barcelona, España). El principio de la técnica se basa en que la enzima cataliza la reacción entre el L-gamma-glutamil-3-carboxi-p-nitroanilinda y glicilglicina en la que se forma Lgamma-glutamilglicina y 5-amino-2-nitrobenzoato. Los incrementos de absorbancia que experimenta la muestra se miden en un espectrofotómetro de absorción ultravioleta visible, a una longitud de onda de 405 nm a intervalos de 1 minuto durante 4 minutos. Se calcula el incremento de absorbancia media por minuto y la actividad enzimática en la muestra se estima empleando la siguiente fórmula: Actividadmuestra (U/L) = Δ Absmuestra/minuto X 1190 MATERIAL Y MÉTODOS 123 III.2.12. Glutamato dehidrogenasa (GLDH) Para la determinación de la actividad glutamil dehidrogenasa en suero empleamos un test cinético de los Laboratorios Randox® (United Kingdom). La medición de esta enzima se basa en una reacción no específica por la cual el α-oxoglutarato + NADH + NH4 sufren una reacción de oxidación por la actividad de la GLDH dando como productos glutamato + NAD+ + H20. Este NADH oxidado produce una disminución en la absorvancia por minuto que es medida con un espectrofotómetro de absorción ultravioleta visible a 340 nm que es proporcional a la actividad de la enzima GLDH. Actividadmuestra (UI/L) = Δ Absmuestra X 197 Control de calidad analítica Durante todo el experimento se llevó a cabo un estricto programa de control de calidad analítica. En cada ciclo de análisis se introdujeron muestras patrón o de referencia (Gernon control para química clínica, suero bovino ensayado nivel 2 de Randox, Humantrol N: suero para control de calidad y calibración en química clínica, Spintrol “H” normal de Spinreact) para comprobar la precisión y exactitud del método. En la Tabla 4 aparecen los resultados del control de calidad, como puede observarse los resultados obtenidos coinciden con los niveles certificados. Tabla 4. Control de calidad de los parámetros bioquímicos (n=18). Parámetro Niveles analizados (media±ES) Niveles certificados (rango) Glucosa (mg/dl) 98,3±1,12 76,2-105 Albúmina (g/dl) 3,11±0,073 2,35-3,39 Proteínas totales (g/dl) 4,91±0,062 4,31-5,17 Colesterol (mg/dl) 148±5,11 121-175 Triglicéridos (mg/dl) 101±1,61 97-133 NEFA (mmol/l) 3,03±0,416 2,32-3,14 Urea (mg/dl) 36,1±0,923 30-46,8 Creatinina (mg/dl) 0,55±0,025 0,43-0,63 ASAT (UI/l) 35,7±1,56 30,6-49 CK (UI/l) 185±2,60 162-242 GGT (UI/l) 7,31±0,184 6,04-8,92 GLDH (UI/l) 11,5±0,248 9-14 MATERIAL Y MÉTODOS 124 III.3. Determinación de los niveles de ceruloplasmina Los estudios de la actividad ceruloplasmina se llevaron a cabo en un espectrofotómetro de luz ultravioleta visible Perkin Elmer modelo Lambda 2. La determinación de la actividad ceruloplasmina en suero se llevó a cabo empleando la técnica descrita por Suderman y Nomoto (1970). Principio A pH 5.4, la ceruloplasmina cataliza la oxidación de la p-fenilenediamina dando lugar a un color púrpura intenso. El grado de formación de este producto de oxidación con color es proporcional a la concentración de ceruloplasmina en suero y se realiza una corrección para la oxidación no-enzimática de la p-fenilenediamina. La inhibición de la oxidación no-enzimática de la p-fenilenediamina se consigue mediante el empleo de azida sódica. Reactivos • Solución de acetato sódico 0.2 M. • Solución de ácido acético 0.2 M. • Tampón acetato 0.1 M, pH 5.45 a 37ºC. Transferir a un frasco volumétrico 430 ml de la solución de acetato sódico 0.2 M, 70 ml de la solución de ácido acético 0.2 M y aproximadamente 400 ml de agua bidestilada. Calentar a 37 ºC en un baño de agua y ajustar el pH a 5.45 (5.40-5.50) añadiendo acetato sódico o ácido acético, y enrasar a un volumen final de 1 litro. • Solución de azida sódica 1.5 M. • Solución de p-fenilenediamina tamponada: Inmediatamente antes de usar, pesar 0.500 g de p-fenilenediamina dihidroclorito (C6H4(NH2)2 2HCl (características producto) y transferir a un frasco volumétrico de 100 ml, disolviéndolo en aproximadamente 75 ml de la solución de tampón acetato (pH 5.45) calentada a 37 ºC. El contenido del frasco se ajusta a un pH de 5.45 a 37ºC empleando una solución de hidróxido sódico 1M y a continuación se enrasa a 100 ml empleando tampón acetato. La solución es estable 3 horas. Procedimiento • Para cada muestra pipetear 2 ml de tampón acetato en dos tubos de ensayo rotulados como R (reacción) y B (blanco). • Añadir 0.1 ml de suero a cada tubo. MATERIAL Y MÉTODOS 125 • Colocar los tubos en un baño a 37ºC, junto con la solución de pfenilenediamina hasta que alcancen un equilibrio térmico. • Añadir 1 ml de la solución de p-fenilenediamina a cada tubo, mezclar bien y mantener sin tapar en el baño de agua durante 5 minutos. El baño debe estar tapado para evitar la exposición de los tubos a la luz. • Añadir 50 μl de la solución de azida sódica en el tubo B, mezclar bien y colocar de nuevo en el baño de agua. • Exactamente 30 minutos más tarde, añadir 50 μl de la solución de azida sódica en el tubo R y mezclar bien. • Las muestras R y B se transfieren a cubetas de espectrofotómetro y la absorbancia se mide a 530 nm en un espectrofotómetro de luz ultravioleta visible Perkin Elmer (modelo Lambda 2). El color de las muestras permanece estable durante 6 horas. Cálculo de la actividad ceruloplasmina Ceruloplasmina (g/l) = 0.752 (AR – AB) Donde AR = absorbancia de la muestra y AB = absorbancia del blanco Control de calidad analítica Durante todo el experimento se llevó a cabo un estricto programa de control de calidad analítica. La precisión del método, calculada como la desviación estándar relativa (% DSR) de la lectura de absorbancia de una muestra de referencia interna (suero bovino) fue 6,13. III.4. Determinación de los niveles de cobre y zinc por Espectroscopia de Emisión con Fuente de Plasma Acoplado (ICP-OES) Preparación de las muestras Todas las muestras de tejidos (hígado, riñón, cerebro, bazo, corazón y músculo) (2 gramos aproximadamente) y sangre (2 ml) se pesaron de forma precisa en los vasos de digestión utilizando una balanza electrónica SALTER-AND, modelo ER-60A. La digestión ácida de las muestras se realizó en un sistema de microondas marca Milestone Ethos Plus, equipado con vasos de alta presión. A cada muestra se le añadieron 5 ml de ácido nítrico concentrado (Suprapur grade, Merck), 2 ml de peróxido de hidrógeno 30 % p/v y 1 ml de agua ultrapura. A continuación se cerraron los vasos y se sometieron a un proceso de digestión cuyas características aparecen reflejadas en la Tabla 5. La solución resultante se diluyó con agua ultrapura hasta un MATERIAL Y MÉTODOS 126 volumen final de 25 ml y se almacenó en tubos de polipropileno hasta su posterior análisis químico. En el caso de las biopsias las muestras eran de menor tamaño (aproximadamente 50 mg), y por ello para mejorar el límite de cuantificación se realizó una digestión ácida en una bateria de digestión en vez de hacerlo en microondas. Las muestras de biopsia se pesaron (balanza electrónica SALTER-AND, modelo ER-60A) de forma precisa en tubos de digestión pirex (de 50 ml de capacidad) y se secaron en una estufa (Selecta, modelo 210) hasta que alcanzaron un peso constante (24 horas aproximadamente). A cada muestra se le añadieron 1 ml de ácido nítrico concentrado (Suprapur grade, Merck), permitiendo una digestión fría de las mismas durante 24 horas. Posteriormente las muestras se colocaron en un bloque termostático (Selecta Multiplaces) a 120±2ºC durante 60 minutos y se añadieron 1 ml de peróxido de hidrógeno 30 % p/v para completar la digestión de la materia orgánica durante otros 60 minutos. La solución resultante de diluyó con agua ultrapura hasta un volumen final de 5 ml. La preparación de las muestras de suero para la determinación de los niveles de cobre se llevó a cabo por dilución en la proporción 1:4. Todas las soluciones se prepararon con agua ultrapura con una resistividad específica de 18 MΩ.cm, obtenida a través de un sistema de purificación de agua Millipore (modelo Milli-Q Plus) inmediatamente antes de su uso. Tabla 5. Programa de digestión empleado para la digestión ácida de las muestras empleando un microondas marca Milestone (modelo Ethos Plus). Paso Tiempo Temperatura Potencia Vísceras 1 5 minutos 180º 1000 W 2 10 minutos 180º 1000 W Sangre 1 2 minutos 85º 1000 W 2 2.5 minutos 135º 1000 W 3 4.5 minutos 230º 1000 W 4 15 minutos 230º 1000 W Determinación de los niveles de cobre y zinc por ICP-OES La determinación de los niveles de cobre y zinc en las distintas muestras analizadas se llevó a cabo por Espectroscopia de Emisión con Fuente de Plasma Acoplado (ICPOES). Los análisis se realizaron en el Laboratorio FISQITECNAL perteneciente a los Servicios Centrales de la Universidad de Santiago de Compostela. Las condiciones MATERIAL Y MÉTODOS 127 analíticas aparecen reflejadas en la Tabla 6. Tabla 6. Condiciones instrumentales para el análisis por Espectroscopia de Emisión con Fuente de Plasma Acoplado (ICP-OES). Potencia 1 Kw Flujo de plasma 15 l/min Flujo gas auxiliar 1.5 l/min Presión nebulizador 150 Kilopascales Velocidad muestra 25 rpm Cálculo de las concentraciones de metales en las muestras Para calcular la concentración de los metales analizados en las muestras se empleó la siguiente formula: Donde K = concentración en la muestra (mg/kg o mg/l en sangre), a = concentración en la solución (μg/l o mg/l), b = concentración media del blanco (μg/l o mg/l), V = volumen final de la muestra (ml), m = peso de la muestra (g) o volumen para la sangre (ml). Control de calidad analítica Durante todo el estudio se llevó a cabo un estricto programa de control de calidad analítica. En cada lote de 10 muestras se incluía un blanco y una muestra de material de referencia certificado. El límite de detección en la digestión ácida se calculó como tres veces la desviación standard de los blancos (Tabla 7). Los límites de cuantificación, expresados como la concentración de cada analito en el tejido (peso fresco) se calcularon teniendo en cuenta el peso de la muestra y la disolución empleada. K = m Vba × − )( MATERIAL Y MÉTODOS 128 Tabla 7. Límites de detección (μg/l) y resultados del análisis del material certificado de referencia (Pig Kidney CRM 186) expresados en mg/kg. Elemento Límite de detección CRM (Pig Kidney CRM 186) * Niveles certificados (media±95%IC) Niveles analizados (media±95%IC) Porcentaje de Recuperación (%) Cu 1.4 31.9±0.4 28.6±2.1 90% Zn 6.0 128±3 111±6 87% Los estudios de recuperación analítica se llevaron a cabo empleando un material de referencia certificado (Pig Kidney CRM 186, BCR Reference Materials). Los resultados de estos estudios se muestran en la Tabla 7 y, en general, se observa que los valores determinados en este estudio son muy próximos a los valores certificados, lo que demuestra la exactitud del método y asegura que no se producen ni pérdidas ni contaminación de las muestras durante todo el proceso. En el caso de las muestras de sangre y suero los estudios de recuperación analítica se realizaron mediante el empleo de muestras añadidas de forma que se consiguiesen valores de absorbancia entre 2-10 veces por encima de los niveles de concentración esperados en dichas muestras; en todos los casos los valores de recuperación se situaron entre el 91 y 97%. III.5. Determinación de los niveles de metalotioneínas III.5.1. Determinación de los niveles de metalotioneínas en hígado, riñón y cerebro La concentración de metalotioneínas se determinó empleando una modificación del método de saturación de plata (Scheuhammer y Cherian, 1991). El método de saturación de plata para la determinación de metalotioneínas en tejidos se desarrolló como una modificación del método de saturación de cadmio (Scheuhammer y Cherian, 1986), con el objetivo de mejorar la precisión analítica cuando se determina la concentración de metalotioneínas en tejidos donde una elevada proporción de cobre (u otros metales de gran afinidad hacia estas metalotioneínas) pueden estar presentes en elevadas concentraciones. Principio La estimación de metalotioneínas por el método de saturación de plata se basa en la gran afinidad de los iones de plata (Ag+) para ligarse a estas metaloproteínas junto MATERIAL Y MÉTODOS 129 con la gran estabilidad térmica de estas proteínas en comparación con otros ligandos citosólicos. La adición de un exceso de Ag+ a la muestra da lugar a un desplazamiento de otros metales presentes en las metalotioneínas así como la saturación de las mismas por dicho metal. La adición de hemoglobina a la muestra elimina la Ag+ de otros ligandos distintos de las metalotioneínas. A continuación se realiza un tratamiento de calor donde se precipita la hemoglobina ligada a Ag+. La repetición de la adición de la hemoglobina completa el proceso de eliminación del exceso de Ag+ y otros ligandos de plata, y como consecuencia el sobrenadante resultante contiene exclusivamente Ag+ ligado a metalotioneínas. La concentración de metalotioneínas se calcula teniendo en cuenta la concentración de plata en el sobrenadante y el número de posiciones ocupadas por este metal en cada molécula de metalotioneínas. Reactivos e Instrumental analítico • Sacarosa (0.25 M). • Glicina (0.5 M): Ajustar a pH 8.5 con NaOH 4N. • AgNO3 (9.27 mM; 1000 µg Ag+/ml): Esta solución stock se debe almacenar en una botella oscura cubierta con papel de aluminio para protegerla de la luz debido a la fotosensibilidad del Ag+. Las soluciones de trabajo (20µg Ag+/ ml en Tampón glicina) se prepararán semanalmente y se guardarán en botellas oscuras. • Hemoglobina bovina (Sigma H-2625). Preparación de las muestras Para la determinación de la concentración de metalotioneínas se emplearon muestras de citosol (hígado, homogeneizado renal y cerebro). Para ello, aproximadamente 0.5 gramos de tejido eran homogeneizados en 4 volúmenes de sacarosa 0.25 M (pH 8.4, 4ºC) empleando un homogeneizador Potter-Elvehjem. Las muestras se centrifugaron a 18.000xg durante 20 minutos a 4ºC y el sobrenadante de ultracentrifugó a 105.000xg durante 1 hora para obtener el citosol (Scheuhammer y Cherian, 1991; Suzuki et al., 1994). Procedimiento • Alícuotas de entre 0.1 y 0.5 ml de cada citosol y se ajustaron a un volumen de 2.4 ml con Glicina 0.5 M (pH 8.5). La completa saturación de las muestras se aseguraba usando varias alícuotas de la misma muestra. • Añadir 1 ml de una solución de AgNO3 (20 μg/Ag/ml tampón de glicina) e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. • Añadir 0.2 ml de solución de hemoglobina al 2% en tampón y mezclar bien. • Calentar en un baño de agua (aproximadamente 100ºC durante 1 minuto). Capítulo I 140 El objetivo de este capítulo es evaluar la influencia de la raza sobre diversos parámetros sanguíneos indicadores del estatus de cobre en ganado vacuno a lo largo del ciclo productivo (crecimiento y cebo). Material y métodos Muestras Para este estudio se emplearon muestras de sangre recogidas a intervalos de tiempo mensuales durante todo el ciclo productivo, desde los 3 meses de vida hasta el momento de sacrificio a los 9-10 meses de edad aproximadamente. Los datos correspondientes a los distintos muestreos aparecen reflejados en el capítulo de material y métodos. Métodos La determinación de las concentraciones de cobre en sangre entera y en suero se realizó por Espectroscopia de Emisión con Fuente de Plasma Acoplado (ICP-OES). Las muestras de sangre entera se sometieron a una digestión ácida en microondas y las muestras de suero se diluyeron en una proporción 1:4 inmediatamente antes de su análisis. La determinación de la actividad ceruloplasmina en suero se llevó a cabo empleando la técnica descrita por Suderman y Nomoto (1970). Los detalles de los métodos analíticos empleados, así como el control de calidad analítica llevado a cabo durante el experimento, aparecen descritos en detalle en el apartado de material y métodos. Análisis estadísticos Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo en el programa SPSS para Windows (v.14.0). La distribución normal de los datos se chequeó empleando el test de Kolmogorov-Smirnov. La influencia de la raza sobre los parámetros analizados en este estudio a lo largo del periodo productivo considerado se evaluó mediante un Modelo General Lineal (MGL) de medidas repetidas, donde la variable raza fue considerada como efecto principal fijo (diseño intersujetos) y los distintos muestreos (diseño intrasujetos) como medidas repetidas. En todos los casos se estableció la existencia de diferencias estadísticamente significativas para un valor p < 0,05 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 141 Resultados Concentraciones de cobre en suero En la Tabla 1 aparecen reflejadas las concentraciones de cobre en suero en los terneros de raza Rubia gallega, Frisona y cruces industriales de los mismos a lo largo de todo el estudio. Las concentraciones medias de cobre en suero en los distintos grupos se situaron dentro de los niveles fisiológicos para esta especie animal (>0,475mg/l; Suttle, 1993). De forma individual debemos señalar que en un 20% de las muestras analizadas los animales presentaron niveles de cobre en suero por debajo del valor de normalidad considerado por Suttle (1993), siendo el valor mínimo descrito de 0,224 mg/l para un ternero de raza Frisona en el tercer muestreo correspondiente a los 5 meses de edad. Por el contrario, ningún animal en nuestro estudio presentó niveles de cobre en suero por encima de 3 mg/l, nivel considerado como indicativo de toxicidad en ganado vacuno (Bidewell et al., 2000), siendo la mayor concentración de cobre determinada en nuestro estudio de 1,39 mg/l en un ternero cruce a los 4 meses de vida. Al evaluar el efecto de la raza sobre los niveles de cobre en suero observamos que no fue un factor significativo en el análisis (F2,11=0,711; p=0,512). Las tres razas mostraron una distribución semejante para la concentración media de cobre en suero pero con variaciones de hasta un 21% entre razas para un mismo muestreo (Tabla 1). De las concentraciones de cobre en suero a lo largo de todo el estudio podemos señalar que los terneros de raza Frisona presentan en todos los muestreos los valores medios de cobre más bajos, mientras que las concentraciones medias de cobre en suero más elevadas aparecen en los terneros cruce durante los primeros muestreos y en los de Rubia gallega a partir de los 6 meses de edad (Tabla 1). Los terneros cruces son asimismo el grupo que presenta el mayor número de animales con niveles de cobre en suero por debajo de la normalidad, con un 42% en el total de los muestreos, seguidos por la raza Frisona con un 40% y por último la raza Rubia gallega que solo cuenta con un 18% de animales por debajo del valor mínimo de cobre en suero descrito por Suttle (1993). Al considerar la variación intrasujeto a lo largo del experimento observamos que no fue un factor significativo en el análisis para las concentraciones de cobre en suero (F4,5=3,908; p=0,061) aunque existe una cierta tendencia en cuanto a su evolución a lo largo del ciclo productivo de los animales para los tres grupos considerados (Tabla 1). De forma general podemos señalar que las tres razas presentan una distribución semejante con un descenso entre el primer y tercer muestreo, correspondiente a los tres y cinco meses de edad, desde una concentración media de cobre en suero de 0,769 a aproximadamente 0,600 mg/l en el conjunto de los animales, concentración Capítulo I 142 que se mantiene prácticamente constante hasta los 7 meses de edad, y tiende a incrementarse en los últimos meses de vida (Figura 1). Concentraciones de cobre en sangre entera En la Tabla 2 aparecen reflejadas las concentraciones de cobre en sangre entera en terneros de raza Rubia gallega, Frisona y cruces industriales de las mismas a lo largo de todo el estudio. Las concentraciones medias de cobre en sangre entera de las distintas razas consideradas en este estudio se situaron dentro de los niveles fisiológicos para los rumiantes (>0,667 mg/l; Suttle, 1993). Únicamente un 6,4% de los animales presentaron valores inferiores a dicho valor, y dentro de éstos los de raza Rubia gallega representan el 46%. Al evaluar el efecto de la raza sobre los niveles de cobre en sangre entera observamos que no fue un factor significativo en el análisis (F2,19=0,447; p=0,646). Las tres razas mostraron unos niveles de cobre similares, con unas diferencias en la concentración media de cobre en sangre que no superan el 15% de variación entre ellas (muestreo 2). A pesar de no existir diferencias significativas en los niveles de cobre en sangre entre razas, y al igual que sucede con los niveles de cobre en suero, los terneros de raza Frisona son en general los que presentan las menores concentraciones medias de cobre en sangre a lo largo del periodo de estudio. Asimismo, podríamos señalar que los cruces entre ambas razas muestran la mayor variación individual dentro del grupo, observándose un comportamiento opuesto en cuanto a su evolución a los de raza Frisona y Rubia gallega en varias de las tomas. Al considerar la variación intrasujeto a lo largo de nuestro estudio, observamos por el contrario que se produce una evolución estadísticamente significativa en las concentraciones de cobre en sangre (F4,5=9,751; p=0,000). De forma general podemos señalar que ocurre un descenso significativo en las concentraciones medias de cobre en sangre entera, desde un valor medio de cobre en el conjunto de los animales de 0,996 mg/l al inicio del experimento hasta 0,774 mg/l en la toma correspondiente a los 9 meses de vida de los terneros (Figura 1). La mayor variación se produce entre los 5 y 6 meses de vida donde ocurre un descenso significativo (p< 0,05) en los niveles de cobre en sangre. Este patrón de comportamiento es muy similar en todas las razas durante la etapa de crecimiento, a excepción de la toma 2 que corresponde a los 4 meses de edad de los animales, donde observamos que los niveles de cobre en sangre disminuyen para las razas Rubia gallega y Frisona contrariamente a lo que ocurre con los cruces (Tabla 2). A partir de este momento todas las razas continúan con un comportamiento homogéneo que tiende al descenso de los valores de cobre en sangre a medida que aumenta su edad. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 143 Concentración de ceruloplasmina en suero En la Tabla 3 aparecen reflejadas las actividades de ceruloplasmina en suero en terneros de razas Rubia gallega, Frisona y cruces industriales de las mismas a lo largo de todo el estudio. Las actividades medias de ceruloplasmina en suero en los distintos grupos se situaron dentro de los niveles considerados fisiológicos para esta especie animal (0,090-0,250 mg/l; Puls, 1994). Al considerar de forma individual las concentraciones de ceruloplasmina determinadas en nuestro estudio, debemos señalar que en ninguna muestra analizada los niveles se situaron por debajo de los valores de normalidad, si bien un 30% de los animales presentaron valores superiores a dicha referencia (>0,250 mg/l). La raza Rubia gallega representa el 36% de estos valores, seguidos por los cruces y Frisones con un 31% cada uno. Al evaluar el efecto de la raza sobre los niveles de ceruloplasmina en suero observamos que no existe una influencia significativa en este análisis (F2,12=0,076; p=0,927). Sin embargo, en general podríamos afirmar que los terneros de raza Frisona, al igual que sucedía con la concentración de cobre en suero y sangre, son los que presentan una menor actividad ceruloplasmina y los de Rubia gallega una mayor actividad, mostrando los cruces una posición intermedia entre ambas razas. Además, debemos señalar que los cruces se comportan de forma opuesta a los terneros de raza Rubia gallega y Frisona en la mayor parte de las tomas de nuestro experimento (Tabla 3). Al considerar la variación intrasujeto a lo largo de todo el estudio observamos que no hay diferencias estadísticamente significativas en las concentraciones de ceruloplasmina en suero a lo largo de la fase experimental (F4,5=0,864; p=0,563) mostrando valores muy similares durante todo el crecimiento, con una diferencia de un 12% entre el valor máximo y mínimo alcanzado y con una tendencia a disminuir con la edad (Figura 1). Discusión La influencia de la raza sobre la susceptibilidad a padecer procesos de deficiencia o toxicidad de cobre ha sido ampliamente estudiada en ganado ovino (Radostits et al., 2002; Underwood y Suttle, 2002), tal y como hemos comentado anteriormente. Esto ha llevado a clasificar a los animales como tolerantes y/o resistentes y a realizar una selección racial específica para adaptarse a las necesidades de cada región geográfica, permitiendo en muchos casos disminuir la incidencia de patologías asociadas tanto a la deficiencia de cobre (como la ataxia enzoótica o los problemas reproductivos), como al exceso de acumulación hepática de cobre. Estas diferencias genéticas en el metabolismo de cobre en ganado ovino parecen estar asociadas en Capítulo I 144 parte a diferencias en la absorción intestinal del cobre dietético (Wiener et al., 1978; Woollians et al., 1983) aunque también pueden producirse por diferencias debidas al metabolismo, fundamentalmente hepático, y distribución del cobre absorbido (Woollians et al., 1982, 1983). La existencia de determinados genes que controlan las concentraciones plasmáticas de cobre ha quedado demostrada con el éxito de la selección de líneas genéticas con niveles de cobre altos y bajos dentro incluso de una misma raza, donde la herencia genética puede explicar un 0,3 % de la variación normal de este parámetro (Radostits et al., 2002). En ganado vacuno, por el contrario, apenas se ha estudiado el efecto de la raza sobre el metabolismo de cobre a nivel sanguíneo. Si bien se ha constatado como al recibir la misma ración ad libitum rica en cobre el ganado Jersey presenta una mayor cantidad de cobre plasmático que el Holstein, además de una mayor actividad de la ceruloplasmina (Du et al.,1996), se desconoce lo que sucede en la mayor parte de las razas de vacuno. El contenido de cobre en sangre total se divide en dos grupos: el cobre presente en los glóbulos rojos (fundamentalmente formando parte de la enzima superóxido dismutasa) y el cobre presente en plasma. A su vez, en el suero o plasma el cobre está distribuido dentro de tres grandes compartimentos constituyendo dos pools entre los cuales no parece ocurrir intercambio: la ceruloplasmina (que supone el principal componente) que representa el cobre exportado del hígado hacia los tejidos, y el cobre unido a la albúmina y a ciertos aminoácidos que representa principalmente el cobre transportado desde el intestino hacia el hígado a través de la circulación portal (Cousins, 1985). Debido a que la síntesis de ceruloplasmina ocurre en el hígado, podría esperarse que los niveles de actividad de esta cuproenzima en el suero fuesen un indicador apropiado del grado de acumulación del metal en el hígado, sin embargo, resultados de investigaciones previas (Blackley y Hamilton, 1985; Stoszed et al., 1986; LópezAlonso et al., 2006) ponen de manifiesto que ambos parámetros no están correlacionados de forma significativa, tanto a niveles normales como elevados de acumulación de cobre en el hígado. Esto es debido a que, una vez que el animal alcanza un estatus adecuado de cobre en el hígado, la ceruloplasmina (al igual que otras cuproenzimas como la superóxido dismutasa de los eritrocitos) expresa una actividad máxima que no se incrementa a pesar de la acumulación de elevadas concentraciones de cobre en el hígado (Baker et al., 1999; Rock et al., 2000). En cuanto a la concentración de cobre en sangre entera, a pesar de no haber sido en los últimos años uno de los principales parámetros para evaluar el estatus de cobre en rumiantes (Suttle, 1993), podría ser un indicador de la acumulación de cobre en el hígado en estas especies animales. De hecho, en un estudio reciente en el que se investigaban nuevos marcadores de sobre-exposición a este metal en la especie RESULTADOS Y DISCUSIÓN 145 humana se ha demostrado que el cobre es capaz de fijarse con gran afinidad a ciertas proteínas presentes en la superficie de los eritrocitos (Speisky et al., 2003). No obstante, es todavía necesario estudiar en detalle y caracterizar estas proteínas eritrocitarias para poder validar su empleo como marcadores de exposición a elevados niveles de cobre. Los resultados de nuestro estudio indican que no hay diferencias estadísticamente significativas entre los grupos considerados, que nos permitan establecer un componente racial en los niveles de cobre en sangre en terneros. Sin embargo, y dentro de la variabilidad descrita, consideramos que merece especial mención el hecho de que los terneros de raza Frisona sean los que muestren en la mayor parte de los muestreos las menores concentraciones de cobre, tanto en sangre como en suero, como de actividad ceruloplasmina. Teniendo en cuenta la información que aporta cada uno de estos parámetros, como mencionamos anteriormente, los resultados de nuestro estudio podrían indicar que la mayor acumulación de cobre en hígado descrita en el ganado de raza Frisona no sería debida a una mayor absorción intestinal de cobre a través de la dieta, porque de ser así, tanto los niveles de cobre en suero como en sangre tendrían que ser más elevados al compararlos con el resto de los grupos. Por el contrario, los terneros de raza Rubia gallega son los que presentan en general las mayores concentraciones de cobre en suero y ceruloplasmina. Según la información que aportan estos parámetros podríamos pensar, entonces, que las diferencias observadas en nuestro estudio se podrían deber a una mayor movilización de cobre desde el hígado hacia los tejidos—aspecto que se evaluará en detalle en el Capítulo II de esta Tesis Doctoral—donde entraría en escena la ceruloplasmina que representa el cobre funcional que es exportado del hígado hacia los tejidos (80-90% del cobre en suero). Asimismo, la mayor parte del cobre en sangre entera se encuentra en suero (80-90%), y solamente cuando se alcanzan niveles tóxicos o muy elevados es cuando este metal se une a la superficie de los eritrocitos (Speisky et al., 2003) o queda libre en el torrente sanguíneo provocando una crisis hemolítica (Suttle, 2003). Otro punto que merece especial mención es que los terneros cruces de ambas razas presentan en general una evolución diferente a sus razas puras a lo largo del período experimental considerado. Para los niveles de cobre en suero, por ejemplo, ocupan una posición intermedia entre los de de raza Rubia gallega y los Frisones. Sin embargo, tanto para la concentración de cobre en sangre entera como para la concentración de ceruloplasmina en suero, muestran una evolución diferente a las otras dos razas, aumentando dichos parámetros cuando en las razas puras disminuyen y viceversa. Estos resultados son complejos de interpretar con la información de la que disponemos, si bien al ocupar estos animales una frecuente posición intermedia entre ambas razas, y al tratarse en general de un grupo más heterogéneo de Capítulo I 146 animales, podrían deberse a variaciones fisiológicas dentro de su crecimiento. No obstante, también es posible que estas diferencias sean simplemente debidas al azar. A pesar de las diferencias en el comportamiento de los parámetros sanguíneos de cobre encontradas entre las tres razas, observamos que en general todos los terneros tienden a disminuir la concentración de cobre en suero, sangre y ceruloplasmina a medida que aumenta su edad. Estos resultados coinciden con lo descrito por Underwood y Suttle (2002), que señalan un aumento en la concentración hepática de cobre en la mayoría de las especies de mamíferos durante el periodo intrauterino, llegando a un máximo antes o en el momento del nacimiento y después una disminución paulatina hasta alcanzar los niveles encontrados en adultos. Al estudiar la evolución a lo largo del ciclo productivo de los parámetros sanguíneos de cobre considerados observamos que su comportamiento es diferente. Así, mientras que los niveles de cobre en suero sufren un descenso acusado a los 3 meses de vida de los terneros, la concentración de cobre en sangre entera disminuye de forma significativa a los 5 meses de edad. Estos resultados pueden explicarse teniendo en cuenta que el cobre contenido en los eritrocitos lo está en su mayoría formando parte del enzima superoxido dismutasa, a la que se incorpora durante la eritropoyesis. En un estudio realizado por Suttle y McMurray (1983) se observó que en animales con depleción de cobre, la disminución en la actividad de esta enzima se evidenciaba con posterioridad a la disminución de cobre en plasma; dicha demora varió desde 0 a 80 días en terneros, siendo especialmente evidente en corderos jóvenes en crecimiento sujetos a una severa depleción de cobre. Se observó además que la concentración de cobre en plasma decreció de forma exponencial con el tiempo mientras que la actividad superóxido dismutasa lo hizo linealmente: 6 días después de comenzar la hipocrupremia, el cobre en plasma había caído un 67%, mientras que la actividad superóxido dismutasa lo había hecho en un 25%. Por otra parte, la repleción de la actividad súperoxido dismutasa no solo comenzó más tarde sino que continuó de forma más lenta en el tiempo, sobre todo en animales en crecimiento. Así, la concentración normal de cobre en plasma se alcanzó dentro de los 15 días, sin embargo, la actividad superóxido dismutasa fue de solo el 59% con respecto al valor inicial después de pasados 35 días y continuó incrementándose hasta el día 70 (Suttle and McMurray, 1983). Estos autores señalan que las diferencias en el lapso de tiempo entre los picos de cobre en suero y actividad superóxido dismutasa podría ser el resultado de diversos factores, entre los que destaca la larga vida media y el rango de crecimiento de la población de eritrocitos (aproximadamente 150 días) junto con la incorporación de cobre dentro de la superóxido dismutasa durante la eritropoyesis. Además, pueden observarse cambios en la actividad superóxido dismutasa, y por tanto del cobre contenido en los eritrocitos, independientemente del contenido de cobre en la dieta. Así, Paynter y RESULTADOS Y DISCUSIÓN 147 Caple (1984) describen incrementos en la actividad enzimática en relación con la edad en corderos, los cuales parecen estar relacionados a verdaderos efectos del desarrollo. Al igual que sucede con la superóxido dismutasa, la actividad ceruloplasmina en suero sufre variaciones a lo largo de la vida del animal, independientemente del estatus de cobre del mismo. Esto es debido, como comentamos anteriormente, a que una vez que el animal alcanza un estatus adecuado de cobre en el hígado, la ceruloplasmina expresa una actividad máxima, que no se incrementa a pesar de que el animal reciba suplementación mineral (Baker et al., 1999; Rocke et al., 2000). Por el contrario, la actividad sérica de la ceruloplasmina puede variar en relación a otros factores como el sexo o la edad de los animales (Fisher et al., 1990; Milne, 1994) y aumentar de forma importante en respuesta a otros factores distintos a los niveles de cobre en la dieta, como por ejemplo el ejercicio intenso, la inflamación o diversos procesos infecciosos (Harris, 1997; Beshetoor y Hambridge, 1998). Capítulo I 148 Tabla 1. Concentraciones de cobre en suero (mg/l) en terneros de raza Rubia gallega, Frisona y cruces industriales de las mismas a lo largo del ciclo productivo. Edad (meses) 3 4 5 6 7 8 9 Rubia gallega N 9 9 11 11 10 11 8 Media 0,751 0,691 0,598 0,595 0,616 0,723 0,748 ES 0,072 0,055 0,071 0,046 0,042 0,046 0,072 MG 0,725 0,674 0,555 0,577 0,604 0,711 0,724 Mínimo 0,501 0,492 0,263 0,348 0,468 0,553 0,508 Máximo 1,137 0,911 1,057 0,855 0,910 1,108 1,091 Frisona N 9 9 9 4 8 9 7 Media 0,716 0,572 0,561 0,528 0,584 0,650 0,588 ES 0,097 0,087 0,071 0,065 0,054 0,045 0,045 MG 0,655 0,524 0,518 0,516 0,568 0,637 0,578 Mínimo 0,236 0,238 0,224 0,393 0,445 0,445 0,455 Máximo 1,184 1,055 0,851 0,686 0,884 0,885 0,768 Cruces N 8 10 10 9 10 10 9 Media 0,849 0,632 0,621 0,592 0,587 0,659 0,616 ES 0,056 0,103 0,070 0,059 0,046 0,062 0,081 MG 0,835 0,569 0,589 0,568 0,571 0,636 0,577 Mínimo 0,663 0,246 0,363 0,336 0,420 0,409 0,303 Máximo 1,014 1,390 1,085 0,928 0,869 1,111 1,122 ES: error estándar; MG: media geométrica RESULTADOS Y DISCUSIÓN 149 Tabla 2. Concentraciones de cobre en sangre (mg/l) en terneros de raza Rubia gallega, Frisona y cruces industriales de las mismas a lo largo del ciclo productivo. Edad (meses) 3 4 5 6 7 8 9 Rubia gallega N 9 11 11 11 11 11 8 Media 0,990 0,916 0,969 0,845 0,842 0,772 0,777 ES 0,027 0,034 0,039 0,023 0,023 0,038 0,054 MG 0,987 0,909 0,962 0,842 0,839 0,763 0,764 Mínimo 0,860 0,706 0,830 0,711 0,767 0,609 0,613 Máximo 1,104 1,082 1,298 0,938 1,048 1,061 1,012 Frisona N 8 10 9 9 9 9 9 Media 0,986 0,878 0,945 0,783 0,833 0,800 0,729 ES 0,045 0,023 0,031 0,049 0,041 0,037 0,020 MG 0,979 0,875 0,941 0,773 0,825 0,794 0,727 Mínimo 0,821 0,775 0,845 0,631 0,698 0,680 0,627 Máximo 1,138 1,021 1,126 1,145 1,021 1,039 0,828 Cruces N 10 10 10 9 10 10 9 Media 1,011 1,023 0,903 0,837 0,735 0,819 0,816 ES 0,041 0,050 0,045 0,060 0,047 0,064 0,062 MG 1,004 1,012 0,893 0,824 0,723 0,799 0,800 Mínimo 0,865 0,784 0,749 0,688 0,569 0,587 0,619 Máximo 1,205 1,305 1,221 1,285 1,021 1,291 1,251 ES: error estándar; MG: media geométrica BIBLIOGRAFÍA 266 Van der Watt, H.v.H., Summer, M.E., Cabrera, M.L., 1994. 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