Fitodermologia i cariologia d'Onobrychis viciifolia Scop., O. Supina (Chaix) DC. i O. saxatilis Lam. de Catalunya

Orsis, 3: 55-65 (1988) Fitodermologia i cariologia d'onobrychis viciifolia Scop., O. Supina (Chaix) DC. i 0. saxatilis Lam. de Catalunya Teresa Garnatje i Angels Cardona Laboratori de Botinica. Facultat de Citncies. Universitat Autbnoma de Barcelona. 08193 Bellaterra (Barcelona). Key words: chromosome numbers, idiograms, index of asymmetry, stomatal index, stomatal size, s'tomatal type. Abstract.Phytodermo1ogy and karyology of Onobrychis viciifolia Scop., O. supina (Chaix) DC. and 0. saxatilis Lam. of Catalonia (NE Spain). Epidermal fragments from 47 populations of Onobrychis viciifolia, 0. supina and 0. saxatilis are studied. The stomatal size, orientation, type and stomatal index are calculated for taxonomical application. The form of the epidermal cells is the most important characteristic for this application. The basic number of genus Onobrychis x=7, the chromosome number of 0. supina, 2n=14, and 0. viciifolia, 2n=28, are confirmed. The chromosome number 2n=14 is new for 0. saxatilis. The karyotypes, the chromosome formula and asymmetry index are calculated. Resum. S'han estudiat fragments epidtrmics provinents de 47 poblacions d'onobrychis viciifolia Scop., O. supina (Chaix) DC. i 0. saxatilis Lam. i s'ha calculat les dimensions, 110rientaci6 i la tipologia dels estomes i I'index estomitic. Aquests parimetres s'han utilitzat des del punt de vista taxonbmic i s'ha posat de manifest I'interts de la forma de les ctl~lules epidtrmiques com a caracter discriminant en alguns casos de determinació dubtosa o dificultosa. S'ha efectuat l'estudi cariolbgic dels tres thxons, s'han elaborat els corresponents idiogrames i fórmules cromosbmiques i s'ha calculat I'index d'asimetria. Es confirma el nombre de base del gtnere Onobrychis x=7 i els nombres cromosbmics d'O. supina (2n=14) i $0. viciifolia (2n=28) i s'estableix el d'O. saxatilis, 2n=14, nou per a la citncia. Introducció Aquest treball forma part d'un estudi biosistemitic més ampli, emprk per tal &aclarir la posició taxonbmica dels taxons del gbnere Onobrychis presents a Catalunya. El fet que siguin bons farratges naturals, 0. viciifolia es cultiva amplament com a planta farratgera, incrementa l'interbs d'aquest estudi. L'estudi fitodermolbgic ens ha portat a trobar alguns carhcters diagnbstics que, afegits als utilitzats de manera tradicional, permeten diferenciar les següents espbcies: 0. saxatilis Lam., O. supina (Chaix) DC. i O. viciifolia 56 T. GARNATJE & A. CARDONA Scop., les dues darreres espbcies són particularment difícils de distingir en les zones de contacte i10 convivbncia. L'estudi cariolbgic ens ha permbs de provar, basant-nos en la bibliografia i en les nostres prbpies observacions, l'existbncia de dos nivells de ploidia al si d'O. saxatilis, el diploide (2n=14), nou per a la cibncia i el tetraploide (2n=28), i de confirmar que 0. supina és diploide i O. viciifolia tetraploide. A més de l'index d'asimetria proposat per Stebbins (1971), s'ha utilitzat el nou mbtode d'estimació de I'asimetria del cariotip proposat per RomeroZarco (1986) per tal de comparar ambdós índexs. Material i metodes Fitodermologia L'estudi de l'epidermis inferior ens ha revelat la consthncia d'alguns dels seus parametres i la seva possible aplicació taxonbmica. Hem treballat amb carhcters quantitatius: mida dels estomes i índex estomhtic, i amb carhcters qualitatius: orientació i forma dels estomes. D'altres carhcters, com és la densitat d'estomes per unitat de superfície, han estat rebutjats perqub la bibliografia consultada ens els ha revelat com a molt variables i, per tant, poc vhlids des del punt de vista taxonbmic. L'index estomhtic, definit per Salisbury (1927) és: on S és el nombre d'estomes i E el nombre de cbl~lules epidbrmiques en una superfície determinada. Les poblacions estudiades són les següents: Onobrychis supina (Chaix) DC. Albarca (CF27) 18-1-86, Alt de Coubet (DG 57) 24-VI-86, Alt de Viu (CG 28) 22-V-86, Bagh (DG 08) 23-VI-86, Berga (CG 96) 20-VII-85, Boi* (CH 21) 22-VI-86, Bruguera* (DG 38) 24-VI-86, Caldes de Boi* (CH 21) 22-VI-86, Colldejou* (CF 25) 2-V-86, Durro* (CH 20) 22-VI-86, Forcat* (CH 10) 22-VI-86, Gombrbn (DG 17) 23-VI-86, Gósol (CG 78) 23-VI-86, Hortoneda (CG 53) 11-XI-85, La Pobla de Lillet (DG 17) 23-VI-86, Llesp (CH 10) 22-VI-86, Llinars* (CG 66) 20-VII-85, Malphs (CG 19) 22-VI-86, Saldes (CG 97) 23-VI-86, Sarroca de Bellera* (CG 29) 22-VI-86. Onobrychis viciifolia Scop. Alins (CH 61) 21-VI-86, Baró* (CG 49) 21-VI-86, Bellaterra* (CF 29) 4-VI-85, Bellver* (CG 9% 21-VII-85, Bor (DG 08) 21-VII-85, Cambrils (CG 66) 21-VI-85, Castellar del Vallbs (DG 20) 27-V-85, Cornudella (CF 27) 3-V-86, Cruilla d'Espot (CH 41) 21-VI-86, Dosrius* (CG 50) 17-IV-86, El Casot (DG 38) 24-VI-86, El Pali de Torroe- FITODERMOLOGIA I CARIOLOGIA D'ONOBRYCHIS 57 lla (CG 93) 20-VI-86, Escaló (CH 41) 21-VI-86, Estamariu (CG 79) 21-VII-85, Farena* (CF 47) 3-V-86, Font de St. Joan (CG 66) 21-VII-85, Juneda* (CG 10) 19-VI-86, Navata* (DG 87) 16-VIII-85, Noves de Segre (CG 79) 21-VII-85, Rialb (DG 38) 24-VI-86, Ripoll (DG 37) 16-VI-85, Santigosa (DG 47) 24-VI-86, Sort* (CG 49) 21-VI-86, Tau11 (CH 20) 22-VI-86, Tredós (CH 23) 22-VI-86, Vilaverd (CF 47) 3-V-86. Onobrychis saxatilis Lam. Bellaterra* (DF 29) 1-VII-86, Castellar del Vallbs* (DG 20) 27-V-85, Ponts* (CG 75) ll-XI-85. Per a cadascuna de les poblacions hem observat de 4 a 6 individus i tres mostres de cada un d'ells, les quals corresponen a tres folíols diferents. Vista la impossibilitat d'obtenir un nombre suficient de mostres d'epidermis a partir de material fresc, hem treballat sempre sobre plantes prkviament premsades i assecades. Per aquesta raó hem hagut de rehidratar les fulles amb una solució d'etanol, glicerol i aigua (1:l:l) durant 12 a 48 hores, segons l'estat de deshidratació de la fulla i, també, del taxon en qüestió. Després les fulles eren submergides en una solució saturada d'hidrat de cloral durant uns dos minuts. Seguidament, sota la lupa binocular, es treia l'epidermis amb l'ajut d'unes pinces i es tenyia amb roig de ruteni durant dos minuts. Aquesta tinció permet una millor observació del material que si aquest s'estudia sense tenyir. L'observació s'ha efectuat amb un Visopan Reichert de 400 augments. La zona de la preparació escollida, (0.10904 mm2) s'ha calcat sobre paper vegetal per tal d'efectuar els calculs corresponents i de disposar sempre d'un testimoni ja que les preparacions no són permanents. Cariologia Els estudis cariolbgics s'han efectuat en poncelles joves, fixades directament al camp en alcohol etílic absolut i Bcid acktic ferro-carminat (4:l). S'han fixat un mínim de 15 plantes per població. Les poblacions estudiades des del punt de vista cariolbgic estan marcades amb un asterisc en la relació de poblacions estudiades fitodermologicament. En total són 19; encara que n'estudihrem moltes més, la informació obtinguda no ens sembla suficient per a prendre-les en consideració. La tinció s'ha realitzat bullint les poncelles durant dos minuts en 10 ml. de carmí acktic addicionat amb 2 o 3 gotes d'acetat fkrric i deixant reposar el material en el colorant durant 24 hores aproximadament; pensem que aquest és el temps bptim perqub els cromosomes d'onobrychis quedin ben tenyits amb el colorant esmentat. Els aixafaments s'han fet amb una gota d'icid acktic al 45 % i glicerol (1:l) entre porta i cobre i les preparacions s'han observat amb un fotomicroscopi Leitz Orthoplan provei't de dispositiu de dibuix (cambra clara de tub amb un ocular de 20 x). Hem obtingut, mitjangant projecció, els dibuixos de metafases mitbtiques així com les mides proporcionals dels cromosomes. 58 T. GARNATJE & A. CARDONA Hem completat la morfologia d'aquests, observant-10s detingudament al microscopi a 1500 augments. S'han establert els nombres cromosbmics sobre un mínim de 10 metafases ovhriques i els idiogrames corresponents, expressats com fórmula cromosbmica i idiograma haploide, basant-nos almenys en cinc metafases projectades i dibuixades. S'ha seguit la terminologia de Levan et al. (1964). També s'ha calculat l'índex d'asimetria segons Stebbins (1971) i segons RomeroZarco (1986). Per donar la fórmula cromosbmica, hem establert 4 categories de cromosomes segons la seva longitud aparent total: ML (molt llarg) > 2 pm; L (llarg) 1.5-2 pm; M (mitja) 1-1.5 pm i C (curt) <1 pm. Resultats i discussi6 Fitodermologia En les espbcies estudiades d'onobrychis hem trobat tres tipus d'estomes que s'ajusten als models descrits per Metcalfe & Chalk (1979): a) Anomocitic o amb cbl.lules irregulars. Les cbl-lules que envolten l'estoma s6n en nombre indefinit i no difereixen de les altres cbl-lules epidbrmiques. Onobrychis saxatilis presenta una proporció xnés gran d'estomes anomocitics (Fig. I), encara que també s'hi donen els anisocitics i paracítics. b) Anisocitic o amb c&l.lules desiguals. Generalment l'estoma és envoltat per tres cbl-lules auxiliars, una de les quals és considerablement més gran o més petita que les altres dues. c) Paracític o amb tres cblu-les paraleleles. Hi trobem una o, més freqüentment, dues cbl-lules auxiliars d'eixos llargs i paralelels a les cbl-lules oclusives. Aquets dos Últims tipus d'estoma es troben preferentment a O. viciifolia i a 0. supina, i és més freqüent el paracitic a mesura que els estomes s'apropen al nervi principal de la fulla. En resum, hem trobat els tres tipus d'estomes a les tres espbcies i, per tant, no podem considerar aquest caracter com a discriminant. L'orientació dels estomes respecte del nervi principal no varia massa en els thxons estudiats. L'eix longitudinal de l'estoma tendeix a mantenir-se paralalel al feix principal, perd aquesta orientació es va perdent a mesura que els estomes se n'allunyen. Onobrychis saxatilis presenta un index estomatic inferior al de les altres dues espbcies (Taula 1). Una analisi de la variancia ens corrobora que hi ha diferbncies significatives (P < 0.55) en l'index estomatic entre espbcies. Aquest index és un parametre relativament constant dintre de cada espbcie, independentment de quina sigui la població estudiada (Taula I), la qual cosa reafirma el seu valor com a caricter taxonbmic. No obstant aixb, cal tenir present que l'índex estomatic es pot veure afectat per la humitat (Cutter 1978). Onobrychis viciifolia i O. supina no difereixen significativament pel seu index estomatic (t de Student, P < 0.10). FITODERMOLOGIA I CARIOLOGIA D'ONOBRYCHZS 59 ,-- Figura 1. Fragments epidtrmics d'onobrychis: (A) 0. saxatilis (B) 0. supina. (C) 0. viciifolia. L'orientaci6 del nervi principal coincideix amb I'horitzontal de la pigina. 60 T. GARNATJE & A. CARDONA Taula 1. Caracteristiaues estomatiaues d'Onobrvchis. Índex estomatic Mida dels estomes (pm) - Espbcie x + S% n X + S% n O. supina 9.57 f 0.28 42 25.50 + 0.38 42 O. viciifolia 9.96 + 0.33 37 26.28 + 0.39 37 O. saxatilis 6.09 + 0.22 4 21.89 + 0.69 4 Pel que fa a les dimensions dels estomes, hem obtingut uns resultats semblants per a cada espbcie (Taula 1). Aixb permet de creure que aquest carhcter no té relació amb els factors ecolbgics, donat que varia poc en les diferents poblacions estudiades de cada espkcie. Novament, I'anhlisi de la varihncia revela diferkncies significatives entre espbcies en la mida dels estomes. Aixb és degut que 0. saxatilis té estomes més petits que les altres dues espbcies (Taula I), les quals tampoc difereixen significativament entre si en aquest carhcter. L'afirmació de Cutter (1978) que les dimensions dels estomes depenen del nivell de plo'idia només es compleix per 0. viciifolia i 0. saxatilis. Per altra banda, la mida dels estomes i l'index estomhtic no estan gens correlacionats (r=0.000) en les poblacions que hem estudiat, la qual cosa evidencia que es tracta de carhcters independents. Altres carhcters de valor sistemhtic a considerar són les característiques de les cbl.lules epidkrmiques. 0. saxatilis presenta unes cbl.lules epidkrmiques molt petites i subpoligonals, mai sinuades, mentre que a 0. supina i O. viciifolia són molt més grans, generalment sinuades i de vegades subpoligonals. Proposem una clau per a diferenciar O. saxatilis de les altres dues espkcies: - IE < 7. Estomes <23 pm. Ck1.lules epidbrmiques molt petites, subpoligonals, no sinuades.. . O. saxatilis - IE> 7. Estomes >23 pm. Cbl.lules epidkrmiques molt més grans, sovint sinuades.. . O. supina O, viciifolia Per diferenciar O. supina d'O. viciifolia hem de recórrer als carhcters tradicionals ja que, com hem comentat, els carhcters fitodermolbgics que hem emprat no discriminen entre aquestes dues espkcies. Cariologia Les metafases i els idiogrames es troben a les Figures 2 i 3. Confirmem el nombre cromosbmic d'O viciifolia, 2n=28 (Favarger 1954, Fernandes & Queirós 1978, Kozuharov et al. 1973, Larsen 1955, Sacristan 1966, Uhikova & Schwarzova 1976), comptat en les poblacions estudiades. FITODERMOLOGIA I CARIOLOGIA D'ONOBRYCHIS 61 Figura 2. (A) Metafase mitbtica d' O. saxatilis , de Ponts. Fórmula cromosbmica: 6M(st + msat + smsat + sm + m + msat) + lC(m). (B) Metafase mitbtica d'O. supina, de Durro. Fórmula cromosbmica: 2ML (m + msat) + 5M ( 2m + smSdt + 2msat). (C) Metafase mitotica d'O. supina de Caldes de Boi. Fórmula cromosomica: 3ML (smsat + mSat + m) + 4M (msat + 3m). (D), (E), (F) Idiogrames corresponents. 62 T. GARNATJE & A. CARDONA Els idiogrames presenten diferbncies considerables. Cal tenir present que la poblaci6 de Bellver de Cerdanya (Fig. 3c), provinent d'un camp de conreu, podria perthnyer a una de les moltes varietats de trepadella importades i que han estat objecte de millora genética. Per contra, la població de Farena (Fig. 3d) es pot considerar subesponthnia donat que és ben allunyada dels Figura 3. (A) Metafase mitbtica $0. viciifolia, de Farena. F6rmula cromosbmica: lML(sm) + 5L (msat + 2m + st + m) + 8M (2sm + msat + 5m). (B) Metafase mitbtica d'O. viciifolia, de Bellver de Cerdanya. F6rmula cromosbmica.: 2ML (MSat + st) + 3L (stsat + 2msat) + 8M (4sm + 2msa' + 2m) + 1C (MSat). (C) , (D) Idiogrames corresponents. FITODERMOLOGIA I CARIOLOGIA D'ONOBRYCHZS 63 camps de conreu. La diferbncia més important observada entre ambdues poblacions és la presbncia de quatre macrosatbl-lits a la població de Bellver i de dos a la de Farena. També són diferents les fórmules cromosi,miques, encara que els cromosomes presenten una longitud mitjana aparent semblant en ambdós casos. Per contra, no hi ha variació en el tipus d'asimetria del cariotip. També confirmem el nostre cromosbmic d'O. supina, 2n=14 (Guinochet & Logeois 1962, Larsen 1960, Natarajan 1978, Sacristán 1966). Les longituds mitjanes aparents dels cromosomes de les dues poblacions estudiades són prou diferents i els idiogrames també, donat que la població de Caldes de Boi (Fig. 2f) presenta quatre macrosatbl-lits i la de Durro (Fig. 2e) només dos, i que la primera posseeix un cromosoma més de la classe ML que no la segona. Aquest fet fa creure en l'existbncia de races cromosbmiques d'O. supina difícilment detectables morfolbgicament. Per contra, l'index d'asimetria coincideix en ambdues poblacions i representa un menor grau d'evolució respecte d'O. viciifolia. Creiem que el nombre cromosbmic que hem establert per 0. saxatilis, 2n=14, és nou per a la cibncia ja que l'únic recompte del qual tenim constancia és 2n=28, efectuat per Sacristán (1966); encara que sense indicació de localitat ni presentació de dibuix ni fotografia, no dubtem de la seva validesa. La longitud mitjana aparent dels cromosomes d'O. saxatilis és de 1.04 pm, és a dir, molt més petits que els de les dues espbcies anteriors, cosa que es reflecteix en l'idiograma i en la fórmula cromosbmica on no hi ha cap cromosoma de les classes ML i L. índex d'asimetria és 2A, igual que en 0. viciifolia, perd que indica un grau d'evolució més elevat que en O. supina, com veurem tot seguit. Creiem que el mbtode d'estimació de la asimetria del cariotip de RomeroZarco (1986) s'acosta més a la realitat que el proposat per Stebbins (1971), i és de 0.39 a O. viccifolia i a 0. saxatilis i de 0.27 i 0.33 a les dues poblacions &O. supina. L'anhlisi i la comparació dels idiogrames dels tres timons ens permet de dir que posseeixen un cariotip caracteritzat per la presbncia de diversos cromosomes amb constriccions secundhries, d'alguns amb macrosatbl.lits i d'altres amb microsatbl-lits, i que els cromosomes són dels més petits dins de les fanerbgrames, amb una longitud mitjana aparent que oscil-la entre 1.04 i 1.74 pm. D'altra banda, hi ha una predominan~a dels cromosomes metacbntrics i snbmetacbntrics enfront dels acrocbntrics, la qual cosa dóna lloc a cariotips forqa homogenis i amb un índex d'asimetria més aviat baix: lA, 2A segons l'index de Stebbins (1971) i de 0.27-0.39 segons Romero-Zarco (1986), possiblement, degut a la formació de cromosomes metacbntrics i submetacbntrics per fragmentació i fusió d'altres d'acrocbntrics, la qual cosa representa un increment secundari de la simetria en el procés evolutiu. És a dir, les tres espbcies estudiades posseeixen un cariotip més evolucionat del que sembla amb l'aplicació dels índexs esmentats.