Partikel und Kapseln auf Basis des rekombinanten Spinnenseidenproteins eADF4(C16)

 PartikelundKapselnaufBasisdes rekombinantenSpinnenseidenproteins eADF4(C16)   Dissertation  zurErlangungdesakademischenGradeseines DoktorsderNaturwissenschaften (Dr.rer.nat.) anderBayreutherGraduiertenschulefürMathematik undNaturwissenschaftenderUniversitätBayreuth   vorgelegtvon  Diplom‐Biologin ClaudiaBlüm  Bayreuth2013   DievorliegendeArbeitwurdeinderZeitvonJuni2008bisJuni2013amLehrstuhl BiomaterialienderUniversitätBayreuthunterderAnleitungvonProf.Dr.ThomasScheibel angefertigt. VollständigerAbdruckdervonderBayreutherGraduiertenschulefürMathematikund Naturwissenschaften(BayNAT)derUniversitätBayreuthzurErlangungdesakademischen GradeseinesDoktorsderNaturwissenschaften(Dr.rer.nat.)genehmigtenDissertation.     Dissertationeingereicht:04.06.2013 ZulassungdurchdiePrüfungskommission:10.06.2013 WissenschaftlichesKolloquium:14.11.2013  AmtierenderDirektor:Prof.Dr.FranzXaverSchmid   Prüfungsausschuss: Prof.Dr.ThomasScheibel(Erstgutachter) Prof.Dr.AndreasFery(Zweitgutachter) PDDr.StefanGeimer(Vorsitz) Prof.Dr.ClemensSteegborn    Inhaltsverzeichnis i  Inhaltsverzeichnis 1Summary...................................................................................................................................1 2Zusammenfassung....................................................................................................................3 3Einleitung..................................................................................................................................7 3.1NatürlicheSpinnenseide...................................................................................................7 3.1.1AufbauundStrukturdesAbseilfadensvonRadnetzspinnen...................................9 3.1.2AssemblierungdesnatürlichenAbseilfadens.........................................................11 3.1.3MechanischeEigenschaftennatürlicherSpinnenseide..........................................14 3.1.4NatürlicheSeidenproteinealsBiomaterial............................................................17 3.2RekombinanteSpinnenseide..........................................................................................18 3.2.1AufbauundStrukturvoneADF4.............................................................................19 3.2.2AssemblierungsformenvoneADF4........................................................................20 3.2.2.1Partikel................................................................................................................20 3.2.2.2Kapseln...............................................................................................................22 3.3WirkstofftransportundkontrollierteWirkstofffreisetzung...........................................25 3.3.1PolymerealsmobileWirkstofftransport‐undDepotsysteme...............................29 3.4Sterilisationsmethoden..................................................................................................37 3.5Zielsetzung......................................................................................................................40 4MaterialundMethoden.........................................................................................................43 4.1Material..........................................................................................................................43 4.1.1Chemikalien............................................................................................................43 4.1.2Materialien.............................................................................................................44 4.1.3GrößenstandardsundKits......................................................................................44 4.1.4ProteineundAntikörper.........................................................................................45 4.1.5PufferundLösungen..............................................................................................45 4.1.6Geräte.....................................................................................................................47 4.1.7Computerprogramme.............................................................................................49 4.2ReinigungderrekombinantenSpinnenseidenproteine.................................................49 4.3ProteinanalytischeMethoden........................................................................................50 4.3.1SDS‐Polyacrylamid‐Gelelektrophorese(SDS‐PAGE)...............................................50 4.3.2Silberfärbung..........................................................................................................51 4.3.3WesternBlot...........................................................................................................52 4.4SpektroskopischeMethoden..........................................................................................53 Inhaltsverzeichnis ii  4.4.1UV/Vis‐Spektroskopie.............................................................................................53 4.4.2Fluoreszenzspektroskopie......................................................................................54 4.4.3FouriertransformierteInfrarot(FTIR‐)Spektroskopie............................................54 4.4.4Massenspektrometrie(MALDI‐TOF).......................................................................55 4.5ProteinpräparativeMethoden.......................................................................................56 4.5.1Dialyse....................................................................................................................56 4.5.2ChemischeKopplungvon5(6)‐CarboxyfluoresceinN‐hydroxysuccinimid‐Ester (NHS‐Fluoreszein)aneADF4(C16)..........................................................................56 4.6ProteinverarbeitendeMethoden‐Partikel....................................................................57 4.6.1HerstellungvonMikropartikeln.............................................................................57 4.6.2ChemischeVernetzungdereADF4Partikel............................................................58 4.6.3AnalysedesEinflussesderVernetzungaufdiechemischenStabilitätvon eADF4(C16)Partikeln..............................................................................................59 4.6.4BeladungvoneADF4(C16)Partikeln.......................................................................60 4.6.5WirkstofffreisetzungauseADF4(C16)Partikeln.....................................................61 4.7ProteinverarbeitendeMethoden‐Kapseln...................................................................61 4.7.1Kapselherstellung...................................................................................................61 4.7.2HerstellungvonKapselnmitMikrofluidik..............................................................62 4.7.2.1HerstellungeinerPhotomaskeundPlatine........................................................63 4.7.2.2GießeneinesMikrofluidik‐ChipsausPDMS.......................................................64 4.7.2.3Zu‐undAbläufe..................................................................................................64 4.7.2.4WeitereVersuchsdurchführungen.....................................................................65 4.7.3MolekulareGrößenausschlussbestimmungvoneADF4(C16)Kapseln...................65 4.7.4VerkapselungvonEnzymen....................................................................................66 4.8Enzymkinetikmit‐Galaktosidase.................................................................................66 4.8.1ProteolytischerVerdauvon‐Galaktosidase.........................................................68 4.9MikroskopischeMethoden.............................................................................................69 4.9.1Lichtmikroskopie....................................................................................................69 4.9.2Fluoreszenzmikroskopie.........................................................................................69 4.9.3Rasterelektronenmikroskopie(REM).....................................................................69 4.9.4KonfokaleLaser‐Scanning‐Mikroskopie(CLSM).....................................................70 4.9.5Rasterkraftmikroskopie(AFM)...............................................................................70 4.9.5.1BildgebungmitdemAFM...................................................................................70 4.9.5.2MikromechanischeCharakterisierungmittelsderColloidalProbeTechnique..71 Inhaltsverzeichnis iii  4.9.5.3DirekteKraft‐MessungenmittelsderColloidalProbeTechnique......................73 4.10Materialanalysen............................................................................................................76 4.10.1DynamischeDifferenzkalorimetrie(DSC)...............................................................76 4.10.2ThermogravimetrischeAnalyse(TGA)....................................................................76 4.10.3Wasseraufnahmeund–abgabedereADF4(C16)Partikel......................................77 4.10.4ZetapotentialundElektrophoretischeMobilität....................................................77 4.11Sterilisationsmethoden..................................................................................................78 4.11.1Gammastrahlen‐undEthylenoxid‐Behandlung.....................................................78 5Ergebnisse...............................................................................................................................81 5.1HerstellungundchemischeVernetzungvoneADF4Partikeln.......................................81 5.2CharakterisierungdereADF4Partikel............................................................................82 5.2.1MorphologischeEigenschaftendereADF4(C16)Partikel......................................82 5.2.2QuellverhaltenvoneADF4(C16)Partikeln..............................................................83 5.2.3EinflussderchemischenVernetzungaufdieSekundärstrukturder eADF4(C16)Partikel................................................................................................85 5.2.4OberflächenpotentialdereADF4(C16)Partikel......................................................86 5.2.5ChemischeStabilitätdereADF4(C16)Partikel.......................................................90 5.2.6ThermischeStabilitätvoneADF4Partikel..............................................................93 5.2.7MechanischeStabilitätvoneADF4Partikeln.........................................................95 5.3BeladungundFreisetzungvonRhodaminBauseADF4(C16)Partikeln.........................97 5.4SterilisationvoneADF4(C16)Partikeln........................................................................103 5.4.1SDS‐PAGEmitSilberfärbungundWesternBlot...................................................103 5.4.2Massenspektrometrie..........................................................................................104 5.4.3UV/Vis‐undFluoreszenzspektroskopie................................................................105 5.4.4FTIR‐Spektroskopie...............................................................................................106 5.5HerstellungundCharakterisierungvoneADF4(C16)Kapseln......................................107 5.5.1ModifizierteHerstellungvoneADF4(C16)Kapseln..............................................107 5.5.2MikroskopischeCharakterisierungderKapseln...................................................109 5.5.3Membranpermeabilität........................................................................................110 5.6HerstellungvonKapselnmittelsMikrofluidik..............................................................112 5.7KapselnalsReaktionscontaineramBeispiel‐Galaktosidase......................................115 6Diskussion.............................................................................................................................121 6.1eADF4PartikelalsWirkstofftransportsystem..............................................................121 6.1.1EinflussderVernetzungaufeADF4(C16)Partikel................................................122 Inhaltsverzeichnis iv  6.1.2WirkstofftransportundWirkstofffreisetzung.......................................................129 6.2SterilisationvoneADF4(C16)Partikeln........................................................................132 6.3eADF4(C16)KapselnalsReaktionscontainer................................................................134 6.4RekombinanteSpinnenseidenproteinealsWirkstofftransportsystemimVergleichzu anderenPolymeren.........................................................................................................137 7Literatur................................................................................................................................141 8Abkürzungen.........................................................................................................................155 9Publikationen........................................................................................................................159 10Anhang..................................................................................................................................161  Summary 1  1 Summary Naturalspidersilkhasbeenusedasabiomaterialforcenturiesduetoitsunique mechanicalpropertiesanditsbiocompatibility.Thedraglinesilkproteinsofthe EuropeangardencrossspiderA.diadematusareofspecialinterest.Araneusdiadematus fibroin4(ADF4)isoneofthisdraglinesilk´sproteincomponentsandithasbeenusedas atemplatefortheengineeredAraneusdiadematusfibroin4(eADF4).ADF4iscomposed ofupto100repetitionsoftherepetitivecoresequencewhichisflankedbynon‐ repetitiveterminalregions.eADF4consistsofseveralrepetitionsofamimicofthecore sequence(knownastheC‐module),whichhasbeenoptimizedforproductioninEcoli. TheoreticallytheC‐modulecanberepeatedmanytimes,thenumberofrepetitions definingthesizeoftheresultingprotein,howeverE.colicannottranslatelargeproteins faultlessly,whichlimitsthesizeoftheproteinsthatcanbeproduced.Inthiswork,the mainfocuswaseADF4(C16)whichconsistsof16repetitionsoftheC‐moduleresultingin amolecularweightofaround47kDa. Controlleddrugdeliveryaswellascontrolledenzymetransportisonefocusofmedical andpharmaceuticalresearch.Byusingcontrolleddrugdelivery,manyproblemsof traditionallydrugdeliverycanbeovercome.Sideeffectsduetolocaldrug concentrationsbeingtoxicafterinjectionsordissolutionoftabletsareproblemswhich havetobesolved.Therefore,depotsystemswithacontrolledreleaseofdrugsovera longerperiodoftimeareofinterest.Mobilesystemslikeparticlesorcapsulearealso suitable. eADF4(C16)particlesareproducedbyaprecipitationstepandtheyaresuitableforthe transportofwater‐insolubledrugs,whichhasbeenshownforrhodamineB,amodel drug.Drugloadingofparticlescanbeperformedeitherbyco‐precipitationofthedrug moleculestogetherwiththeproteinorbydiffusion,withtheco‐precipitationstep resultinginthehighestloading.Theinfluenceofcrosslinkingondrugreleasewas investigated;however,weobservednosignificantincreaseinthedurationofrelease. Nevertheless,anincreaseinchemicalstabilityduetothechemicalcrosslinkingwas achieved.Chemicalaswellasphysicalcrosslinkinginfluencedthemechanicalbehavior andtheswellingratiooftheparticleswhichalsoinfluencesthestoragestability.The Einleitung 8  GartenkreuzspinneAraneusdiadematus(A.diadematus)oderdieGoldeneSeidenspinne Nevilaclavipes(N.Clevipes),könnenbiszusiebenverschiedeneSeidenarten produzieren(Abb.3.1),22jedeeinzelneineinereigensdafürangelegtenDrüse.Die einzelnenSeidenartensindmeistnachdenDrüsenbenannt,indenensiegebildet werdenundunterscheidensichinihremAufbauundihrenmechanischenEigenschaften stark.23  Abb.3.1:SchematischeDarstellungderverschiedenenSeidenarten,sowiederKlebesubstanzvon RadnetzspinnenamBeispielA.diadematus.DieDragline‐SeidedientderSpinnealsAbseilfadensowieals SpeichendesNetzes(A).DieFangspiraledesRadnetzesbestehtausFlagelliform‐Seide(B).Fangspiraleund SpeichendesSpinnennetzeswerdendurchdiePiriform‐Seidezusammengehalten(C).DieseSeideistauch fürdieVerankerungdesNetzesanOberflächenzuständig.DieMinorampullate‐Seide(D)wirdals HilfsspiralebeimNetzbaubenötigtundhatimfertigenNetzeinenetzverstärkendeFunktion.Zweiweitere SeidenartenwerdenzumSchutzderNachkommenverwendet,eshandeltsichdabeiumdieTubiliform‐ Seide(E)diedieäußereHülledesEiersacks(Kokonhülle)darstelltundumAciniform‐Seide(F),diedie innereKokonhüllebildet.DieKlebesubstanzwirdabschließendaufdasNetzaufgebrachtunddientdem FesthaltenderBeute. DiesogenannteDragline‐SeidewirdindergroßenAmpullendrüse(Majorampullate) gebildetundbestehthauptsächlichausdenProteinkomponentenMaSp1undMaSp2 (MajorampullateSpidroin).24Dragline‐SeidewirdalsSicherungs‐ undAbseilfadender Spinne,sowiefürdenRahmenunddieSpeichendesNetzesverwendet(Abb.3.1A).25Sie istdieambestencharakterisierteSeideundvereinigteinzigartigemechanische Eigenschaften(Tab.3.1).26,27DiezweitebeimNetzbauverwendeteSeideistdie Flagelliform‐Seide(B),welchedieFangspiraledesNetzesbildet.Siebestehtnuraus einerProteinkomponenteundbesitztviskoelastischeEigenschaftenmiteiner einzigartigenDehnbarkeit(270%).26,27DieenormeDehnbarkeitistwichtig,umden Einleitung 9  AufprallvonInsektenimNetzabzufangen.ZuBeginndesNetzbauswirdnocheine zusätzlicheSeidenartbenötigt,diesogenannteMinorampullate‐Seide(MiSp)(D).Diese wirdinderkleinenAmpullendrüsegebildet,dientalsHilfsspiralebeimNetzbauund wirktnetzverstärkendimfertigausgebildetenNetz.MitHilfederPiriform‐Seide (seidenähnlicheKlebesubstanz)(C)wirddasfertigeNetzanverschiedenenOberflächen befestigt.EinezusätzlicheFunktiondieserSeideistdasVerbindenvonDragline‐Seide undFlagelliform‐Seide.WeiblicheRadnetzspinnenproduzierennochzweiweitere Seidenarten,diedemSchutzderNachkommendienen,dieTubuliform‐Seide(E),welche dieäußereKokonhüllebildetunddieAciniform‐Seide(F),welchedieinnereKokonhülle darstellt,aberhauptsächlichzumEinwickelnvonBeuteverwendetwird.Die Klebesubstanz(G),welcheaufdieNetzoberflächeaufgebrachtwirdunddie auftreffendenInsektenfesthält,istimeigentlichenSinnkeineSeide.Siebesteht hauptsächlichausorganischenMolekülen,Salzen,FettsäurenundGlykoproteinen, welcheinderAggregatdrüsegebildetwerden. 3.1.1 AufbauundStrukturdesAbseilfadensvonRadnetzspinnen DerAbseilfadenvonRadnetzspinnenisteinerderstabilstenbekanntennatürlichen FasernundsetztsichimKernauszweiProteinkomponenten,densogenannten Spidroinen,zusammen.DiesewerdenindergroßenAmpullendrüsegebildet,woraus sichihreNomenklatur,MaSp1undMaSp2,ergibt.17AbhängigvonderSpinnenart variierensowohldieAminosäurezusammensetzungalsauchdiedarausresultierenden mechanischenEigenschaften(Kapitel3.1.3);derprinzipiellehierarchischeAufbaudes Abseilfadensbleibtjedochgleich(Abb.3.2). Einleitung 10   Abb.3.2:A)SchematischerAufbauderSpidroinedesAbseilfadensvonRadnetzspinnen.Repetitive Kernsequenzenwerdenvonnicht‐repetitiventerminalenDomänen(NR‐Domänen)flankiert. B)HierarchischerAufbaueinesAbseilfadensamBeispielN.clavipes.DerAbseilfadenbestehtauseinem fibrillärenKern,welchervonmehrerenHüllschichtenumgebenist.HierzuzählensowohlLipideund GlykoproteinealsauchMiSp1ähnlicheProteine.DerfibrilläreKernbereichdesAbseilfadensbestehtaus kristallinenundamorphenBereichen.DiekristallinenBereichesorgenfürdieenormeStabilitätdesFadens unddieamorphenBereichesindfürseineElastizitätverantwortlich.Sowohlkristallinealsauchamorphe BereichesinddurchdieAminosäuresequenzfestgelegt,glycinreicheModulederKernsequenzenbildendie amorphenBereiche,alaninreicheSequenzendiekristallinen‐Faltblattstrukturen. DerAbseilfadenbestehtauseinemfibrillärenKern,welcherausdenbeidenProteinen MaSp1undMaSp2besteht.DieSpidroineMaSp1undMaSp2setzensichausrepetitiven Kernsequenzenzusammen,welchevonnicht‐repetitivenTerminiflankiertwerden.Die repetitivenKernsequenzenvonMaSp1bestehenhauptsächlichauspoly‐Alaninen(A) oderglycinreichenWiederholungseinheiten(GGX),wobeiXentwederfürAlanin, Tyrosin,LeucinoderGlutaminsteht.DieKernsequenzenvonMaSp2hingegenbestehen zueinemGroßteilauspoly‐Alanin‐AbfolgenundprolinreichenSequenzenin unterschiedlichenAbfolgen(meistGPGQQoderGPGGY)(Abb.3.2A).11,28,29Durchdie poly‐Alanin‐AbfolgenentstehtinnerhalbdesFadenseinhydrophobererTeil,zusammen mitdenglycinreichenBereichenergibtsichdahereineZusammensetzung,diestarkan Einleitung 11  Block‐Copolymereerinnert.30‐34DieSekundärstruktureninnerhalbdesFadens,welche sichfürdieeinzigartigenmechanischenEigenschaftenverantwortlichzeigen,sinddurch dieAminosäurezusammensetzungderrepetitivenModulefestgelegt.MittelsFourier transformierterInfrarotspektroskopie(FTIR‐Spektroskopie), Kernspinresonanzspektroskopie(NMR)undRöntgenbeugungsanalysenkonntenden poly‐Alanin‐Sequenzengrößtenteils‐faltblattreicheStrukturenzugeordnetwerden, welchefürdieenormeStabilitätdesFadensverantwortlichsind.30‐34Dieamorphen Bereichebestehenhauptsächlichaus‐Spiralen,ungeordnetenStrukturenund31‐ Helices,welchesichfürdieenormeElastizitätdesAbseilfadensverantwortlich zeigen.33,35,36DiejeweiligenWiederholungseinheitenwerdenvonnicht‐repetitiven Terminiflankiert(NR‐Regionen).DieseRegionenbestehenausca.100Aminosäuren, welcheeinewichtigeRollesowohlbeiderFadenassemblierungalsauchbeider LagerungderhochkonzentriertenwässrigenSpinnlösungeninnerhalbderDrüsen spielen.AufgrundvonVeränderungenderUmgebungsbedingungen(SalzgehaltoderpH‐ Wert)werdendurchdieterminalenDomäneninnerhalbdesSpinnkanalswichtige SchrittebeiderFadenassemblierungeingeleitet.37‐40ZumSchutzvorAustrocknungoder anderenUmwelteinflüssenistdiefibrilläreKernregionsowohlvonGlykoproteinenund Lipiden,alsauchvoneinemMiSp1ähnlichenProteinumgeben(Abb.3.2B). DerAbseilfadenderGartenkreuzspinneA.diadematusistdemvonN.clavipesinseinem Aufbauähnlich,dieNomenklaturunterscheidetsichjedoch.AnstellevonMaSp1und MaSp2sinddieSpidroinederGartenkreuzspinnenachihremArtnamenundder ReihenfolgeihrerIdentifizierungbenannt,AraneusdiadematusFibroin(ADF)3und4. BeiADF3undADF4handeltessichaufgrundihreshohenProlingehaltesumMaSp2‐ Analoga.23 3.1.2 AssemblierungdesnatürlichenAbseilfadens DieAssemblierungdesAbseilfadensauseinerhochviskosenLösungzueinemfesten, mechanischstabilenFaden,findetbeiRadnetzspinnenimSpinnkanal,derausder großenAmpullendrüseaustritt,statt.DieDrüseunterteiltsichinzweiBereiche,die SpinndrüsemitdersekretorischenZoneundderLagerungszone.Andieseschließtsich derS‐förmigeSpinnkanalan,welcherindieSpinnwarzemündet(Abb.3.3). Einleitung 12   Abb.3.3:SchematischeDarstellungdesnatürlichenSpinnprozessesamBeispielderDragline‐Seide.Der SpinnapparatunterteiltsichinzweiHauptbereiche,dieSpinndrüseunddenSpinnkanal.DieSpinndrüse dientsowohlderSekretionalsauchderLagerungderSpinnenseidenproteine,derSpinnkanaldientder KonzentrierungundUmstrukturierungderProteine.DurchIonenaustauschundWasserentzugentsteht einehochviskoseSpinnlösung.DieProteinerichtensichaus,wodurchder‐Faltblattanteilder Proteinlösungstarkerhöhtwird.AnderSpinnwarzewirdderFadendurchmechanischenZugausdem SpinnkanalherausgezogenunderhältdurchdiezusätzlicheStreckbewegungseinebesonderen mechanischenEigenschaften. DersekretorischeTeilderSpinndrüsebefindetsichimoberstenAbschnitt,einem länglichen,breiterwerdendenFortsatz(Abb.3.3).DieserAbschnittbestehtaus säulenartigenEndothelzellen,inwelchendieSpinnenseidenproteinetranslatiert werden,undaussekretorischenGranula.16,30DieausdenGranulasekretierten SpinnenseidenproteinedesAbseilfadenswerdeninhoherKonzentration(ca.50%(w/v)) inderLagerungszonedergroßenAmpullendrüseingelösterFormgespeichert.41Die hoheLöslichkeitderProteinlösunggehtunteranderemaufdieSekundärstrukturder MaSp‐Proteinezurück.DieseentsprichtderSekundärstruktureinesnativentfalteten Proteinsundbestehtgrößtenteilsausrandom‐coilundpoly‐Prolin‐IIStrukturensowie‐ Helices.42Insbesonderediepoly‐Prolin‐II‐Helix‐ähnlichenBereichehabenhierbeieine besondereBedeutung,dadiesehauptsächlichausSequenzenderrepetitivenBereiche gebildetwerden,die‐HeliceswerdenmeistvondenterminalenDomänengebildet. IndemsiedieAusbildungvonWasserstoffbrückenbindungenzwischenden ProteinseitenkettenunddemLösungsmittelbegünstigen,verhinderndiepoly‐Prolin‐II‐ HelicesdasAusbildenintramolekularerWasserstoffbrücken,wodurchdiestabile LagerungderProteinlösunginderSpinndrüseerklärtwerdenkann.43Zusätzlichlassen sichdieHelicesaufgrundihrerTorsionswinkelleichtin‐Faltblattstrukturenumwandeln, Einleitung 13  welchedengrößtenSekundärstrukturanteilimfinalenFadendarstellen.44Umausder SpinnlösungeinenFadenzuassemblieren,sindsowohlbiochemischealsauch physikalischeVeränderungennotwendig.45DiephysikalischenEinflüssesindsowohl Elongations‐alsauchScherkräfte,welcheaufdemWegdurchdensichverjüngendenS‐ förmigenSpinnkanalaufdieLösungeinwirken.AbgesehenvondiesenKräften,welche sichaufdieOrientierungderSeidenproteineauswirken,spielenchemische VeränderungenwährenddesTransportsderSeidenproteinedurchdenSpinnkanaleine entscheidendeRolle.30ZudenEinflüssengehörtu.a.dieÄnderungendespH‐Werts(von pH7,4(Spinndrüse)auf6,3(Spinnkanal))37,45‐48welcherdurcheineProtonenpumpe geregeltwird.AuchwerdenNatrium‐ undChloridionendurchkosmotropeIonen (Kalium‐undPhosphationen)ersetzt,waszueinerFlüssig‐flüssig‐Phasentrennungführt. DieKonzentrierungderSpinnlösungerfolgtdurchMikrovilliderEpithelzellenundeine besonderekutikuläreSchichtimletztenAbschnittdesSpinnkanals.Beidevergrößerndie OberflächedesKanals,wodurcheineWasserabscheidungbegünstigtwird.30,49Zuletzt erfolgteinFlüssig‐fest‐PhasenüberganganderSpinnwarze.AmEndedieses PhasenübergangsstehteinnochunfertigerFaden,derdurcheinenendgültigen StreckungsprozessanderLuftfinalisiertwird.41 DiebesondereBedeutungdernicht‐repetitiventerminalenDomänederProteine, sowohlbeiderLagerungderhochkonzentriertenProteinlösunginderDrüsealsauchbei derFadenassemblierungkonntebereitsfürverschiedeneSeidenproteinegezeigt werden.37,38DesWeiterenkonntegezeigtwerden,dassnichtnurdieFunktiondernicht‐ repetitiventerminalenDomänensondernauchihreStrukturzwischenverschiedenen Spinnenartenhoch‐konserviertsind.50Beidenicht‐repetitivenTerminifungierenals molekulareSchalter,welcheabhängigvondenUmgebungsbedingungenderProteine ihreKonformationändern.DerAmino‐terminaleBereichliegtunter SpeicherbedingungeninderSpinndrüsealsMonomervor,durchpH‐Änderungenzum SaurendimerisiertdieserjedochinantiparallelerWeise.50DerCarboxy‐terminale,nicht‐ repetitiveBereich,hingegenliegtimmeralsparallelesDimervor.IndieserFormfördert derTerminusdieLöslichkeitderSpidroineundunterstützt,beiderAssemblierung,die geordneteAusbildungderFasern.37,38,51  Einleitung 14  3.1.3 MechanischeEigenschaftennatürlicherSpinnenseide NatürlicheSpinnenseidensindfürihreaußerordentlichenmechanischenEigenschaften bekannt.InTab.3.1sindvierMaterialeigenschaftenverschiedenernatürlicherund synthetischerMaterialienaufgelistet.BeiderSteifigkeithandeltessichumeineGröße, diedenWiederstandeinesKörpersgegenseineVerformungbeschreibt.DieFestigkeit einesMaterialskannalsdieKraftproFlächebeschriebenwerden,dieaufgebracht werdenmuss,umeinenGegenstandmechanischzuverformenbzw.zuzerreißen.Ein weitererwichtigerParameteristdieDehnbarkeit.Dieseistdefiniertalsdiemaximale AusdehnungeinesKörpers,bevorerreißt.AlsvierteMaterialeigenschaftwirddie ZähigkeitverschiedenerMaterialienverglichen.EshandeltsichhierbeiumdieEnergie, dieeinKörperproVolumenaufnehmenkann,bevorerreißt. Tab.3.1:MechanischeEigenschafteneinigernatürlicherundsynthetischerMaterialienimVergleich (modifiziertnach26,27). MaterialSteifigkeit(E‐Modul) [GPa] Festigkeit [GPa] Dehnbarkeit [%] Zähigkeit [MJm‐3] Dragline‐Seide (A.diadematus) 101,127160 Flagelliform‐Seide (A.diadematus) 0,0030,5270150 Kokon‐Seide(B.mori)70,61870 Elastin0,00110,0021502 Resilin0,0020,0041904 Collagen1,20,121306 DistalerMuschelbyssus0,870,07510945 ProximalerMuschelbyssus0,0160,03520035 Knochen200,1634 Wolle(100%Luftfeuchtigkeit)0,50,25060 Kevlar491303,62,750 Nylon50,951880 Karbonfaser30041,325 HochfesterStahl2001,50,86  Einleitung 15  InsbesonderederAbseilfadenvonSpinnenistaufgrundseinerKombinationaus Steifigkeit,FestigkeitundhoherDehnbarkeitundderdarausresultierendenenormen ZähigkeitfürdieForschungvonbesonderemInteresse(Tab.3.1).DerAbseilfadender GartenkreuzspinneA.diadematusbesitztmit10GPaeinedoppeltsohoheSteifigkeit undmit160MJm‐3einedoppeltsohoheZähigkeitwieNylon.Keinesderanderen aufgelistetenMaterialienverkörpertdieseKombinationanEigenschaften.Sowohl hochfesterStahlalsauchKarbonfasernundKevlar49‐Fasernbesitzendeutlichhöhere Steifigkeiten,sieerreichenjedochgeringereWertebeidenanderendargestellten Parametern.DieFlagelliform‐SeidevonA.diadematusweistebenfallssehr beeindruckendemechanischeEigenschaftenauf,siebesitzteineDehnbarkeitvonca. 270%.DiesemechanischenEigenschaftendernatürlichenSpinnenseidezeigenihre optimaleAnpassunganihremechanischenAnforderungeninderNatur.27,52,53Der AbseilfadenvonRadnetzspinnenmussinseinernatürlichenUmgebungzumeinendas AbseilenderSpinneausgroßenHöhenermöglichenundwirdzumanderenfürRahmen undSpeichenbeimNetzbaueingesetzt.DerDragline‐Seidekommtsomithauptsächlich einestabilisierendeFunktionzu.DieFlagelliform‐SeidehingegenstelltdieFangspiraleim fertigenNetzdarundmusssomitdenAufprallauftreffenderInsektenabfangen,damit dieBeutenichtwiederausdemNetzgeschleudertwird.53Hierfürbenötigtsie EigenschaftenwiebeispielsweiseeinehoheDehnbarkeitkombiniertmiteinerhohen Zähigkeit. DiemechanischenEigenschaftendernatürlichenSpinnenseidegeheninsbesondereauch aufihrenmolekularenAufbauzurück.ImFadensinddiekristallinenBereicheineiner MatrixausunstrukturiertenRegioneneingebettet(Abb.3.2).DieElastizitätdes SeidenfadensgehtaufdieunstrukturierteMatrixdesFadenszurück.Diesesemi‐ amorphenRegionenbestehenhauptsächlichaus‐SpiralenundhelikalenStrukturen,54 welcheaufdieGPGXX‐Motivezurückgehen.DieFlagelliform‐Seidebesteht hauptsächlichausdiesenMotiven,wodurchsichihreenormeElastizitäterklärenlässt. DieStabilitätdesSeidenfadensgehthingegen,wiebeianderen‐faltblattreichen Proteinenauch,aufdie‐Faltblattstrukturenzurück,welchealsphysikalisch quervernetzteNanokristalleindiesemi‐amorpheMatrixeingebettetsind.54‐57Die Motive,diediesenStrukturenzugrundeliegen,bestehenhauptsächlichauspoly‐Alanin‐ Einleitung 16  Sequenzenund,beiB.mori,auspoly‐(Glycin‐Alanin)‐Abfolgen.DieGrößedieser NanokristallehatdabeieinenentscheidendenEinflussaufdieFestigkeitunddie ZähigkeitderFasern.57,58DieVerringerungderLängederpoly‐Alaninehataucheinen EinflussaufdiekorrekteAusbildungder‐Faltblatt‐Nanokristalle.59ZusätzlichzurLänge derpoly‐Alanin‐SequenzenhatdieAusrichtungderKristalle(antiparalleloderparallel) eineenormeBedeutunginBezugaufdiemechanischenEigenschaften(z.B.Steifigkeit) vonSpinnenseide.60,61WirdderFadeneinerZugkraftausgesetzt,verstärkendie NanokristalledieteilweiseunstrukturiertenBereichedurchAusbildungvon Verzahnungen.DurchdiesewirddieaufdenFadeneinwirkendeKraftgleichmäßig verteiltunddiesemi‐amorphenRegionenwerdendarangehindert,sichzustark auszudehnen.32,43,57,60 DiemechanischenEigenschaftenderverschiedenen,voneinerSpinnegebildetenFäden, unterscheidensichjedochsehrstark,jenachdeminwelcherSpinndrüsedieProteine gebildetwurden(Tab.3.1).DesWeiterenvariiertauchdieMechanikvonSeidenfäden desgleichenTypsunterschiedlicherSpinnenartenebensowiezwischenIndividuender gleichenSpinnenart.DieseVarianzhatvieleUrsachenundgehtunteranderemaufdie jeweiligenMessbedingungenzurück.1InsbesondereUmwelteinflüssespielenbeider BestimmungdermechanischenEigenschafteneinesSeidenfadenseinewichtigeRolle, bereitsgeringeVeränderungeninderLuftfeuchtigkeitoderTemperaturwährendeiner MessungkönneneinenenormenEinflussaufdiegewonnenenmechanischenDaten aufweisen.EinGrundhierfüristdersemi‐kristallineZustanddesSeidenfadens.Flexible BereicheundkristallineBereicheliegennebeneinanderimFadenvorundwerdendurch Wasserstoffbrückenbindungenmiteinanderverbunden.WasserundTemperaturkönnen dieBindungsenergiedieserBindungenherabsetzenundsomitalsWeichmacher fungieren.62ZusätzlichlässtsichdiemechanischeVarianzauchaufverschiedene Umwelteinflüsse(Temperatur,Luftfeuchtigkeit)sowiedieSpinngeschwindigkeit währenddesSpinnprozesseszurückführen.1DieSpinngeschwindigkeitderSpinne beeinflusstsowohldieDickedesFadensalsauchdieAusbildungvon‐ FaltblattStrukturen.58BiszueinerSpinngeschwindigkeitvon20mms‐1,nimmtder FadendurchmesservonN.edulismitzunehmenderGeschwindigkeitab,oberhalbdieser GeschwindigkeitbleibtderDurchmesserdesSeidenfadenskonstant,beiextremen Einleitung 17  Zuggeschwindigkeiten(ca.800mms‐1)kannjedochkeinstabilerFadengewonnen werden.DiehoheZuggeschwindigkeitbeeinflusstdieProteinfaltungwährenddes SpinnprozessesebensowiediedamiteinhergehendenVernetzungsprozesseinnerhalb desFadens.1,16,63‐65 3.1.4 NatürlicheSeidenproteinealsBiomaterial BiomaterialiensindausvielenBereichendermedizinischenForschungnicht wegzudenken.SeitvielenJahrenfindensieAnwendungalsImplantatmaterialimDental‐ Bereich,alsProthesenmaterial,z.B.fürkünstlicheHerzen,alsKnochentransplantatoder auchalsneuronaleProthesen.66InsbesondereimBereichderImplantate,alsoder Endoprothesen,spielenBiokompatibilitätundzumTeilauchBioabbaubarkeiteine wichtigeRolle.DieOberflächenbeschaffenheitundsomitauchdieBiokompatibilität einesImplantats,ebensowiedieGrenzflächezwischenImplantatunddemihn umgebendenGewebesindwichtigeAspekte,diebeiderWahldesImplantatmaterials berücksichtigtwerdenmüssen.DurchdieoptimaleAnpassungdesMaterialskanndie IntegrationdesBiomaterialsimjeweiligenOrganismusbegünstigt,mögliche AbstoßungsreaktionenvermiedenundeinemöglichstlangeVerweildauerdesImplantats imKörpererzieltwerden.AufgrundderbesonderenEigenschaftennatürlicherSeide, insbesondereimBereichderBiokompatibilitätundBioabbaubarkeit,rücktdiesesowohl alsImplantatmaterialalsauchalsmöglichesBeschichtungsmaterialfürImplantate immermehrindenFokusderWissenschaft.67WeitereEigenschaftennatürlicher Spinnenseide,wieihrestarkemechanischeBelastbarkeitundihreElastizität, unterstützendieseRolleweiter.InsbesonderedieKombinationdergenannten EigenschaftenzusammenmitihrerbiostatischenWirkung(VerhindertdasWachstum vonMikroorganismen),68hebtnatürlicheSpinnenseidevonanderenSeidenarten,z.B. derSeidedesSeidenspinners,aberauchvonvielenanderennatürlichenund synthetischenMaterialien,ab(Tab.3.1).InverschiedenenAnsätzenwurdedie BiokompatibilitätvonnatürlichenSeidenanalysiert.VorallemdieKokon‐Seidevon B.moristandlangeZeitinderKritik,hypersensitiveReaktionenbeiPatienten hervorzurufen.MittlerweilekonntejedochdieUrsachefürdieseReaktionenanalysiert werden,eshandeltsichwahrscheinlichumdasdenSeidenfadenumgebendeSericin.69 HeutzutageistdasReinigungsprotokollderSeidedesSeidenspinnersoptimiert,undes Einleitung 24  beschreibtStrömungenvonFluidenaufkleinstemRaum,zwischen1µmund1mm, wobeisichFluideindiesemFallinsbesondereaufFlüssigkeitenbezieht.Esgibtdrei wichtigeParameter,welcheFlüssigkeitencharakterisieren,dieDichte,dieViskositätund derDruck.DasFließverhaltenderFlüssigkeiteninnerhalbderMikrofluidikfolgteinem laminarenStrömungsprofil.DieseswirddurchdieReynolds‐Zahlbeschrieben,eine dimensionsloseKennzahl,diedasVerhältnisvonTrägheits‐zuZähigkeitskräftenangibt. JegrößerdieReynolds‐Zahlist,destoturbulenteristeineStrömung.Dadiesedirekt proportionalzumKanaldurchmesserist,erhältmaninderMikrofluidiklediglichsehr kleineWertefürdieReynolds‐Zahl,wodurchsichdaslaminareStrömungsprofil ergibt.107,108DurchdiesesStrömungsprofilistesmöglich,dieStrömungeninnerhalbder Mikrofluidikkanälezuberechnen.EinweiteresPhänomeninnerhalbdieserkleinen Dimensionenist,dassaufgrunddesgroßenOberflächen‐ zuVolumenverhältnis, OberflächeneigenschaftenwiebeispielsweisedieOberflächenspannungderLösungen oderkapillareEffekteanBedeutunggewinnen. Mikrofluidik‐ChipsstelleneineMöglichkeitdar,verschiedeneProzesseaufkleinem Raumzusammenzufassen.HierbeireichtdasSpektrumvoneinfachenKanalsystemen, welchedurchgeschickteVerbindungendereinzelnenKanäle,Lösungengezieltmischen, bishinzudreidimensionalenFokussierungenvonStrömungen.Dadurchistesu.a. möglich,Emulsionenherzustellen,ihreTropfengrößeeinzustellenundKoaleszenzzu verhindern.DiesbeschränktsichjedochnichtalleinaufmonodisperseEmulsionen,auch polydisperseEmulsionensindproblemlosherstellbar.109,110Mikrofluidikbietetaufgrund ihreskleinenMaßstabsvieleVorteileimVergleichzuVersuchsaufbautenim Labormaßstab.InsbesonderediekleinenProbenvolumina,welchefürKanäleim Mikrometermaßstabbenötigtwerden,spielenhierbeieinewichtigeRolle,dadadurch verschiedeneKanalstrukturenoderLayoutskostengünstigundschnellgetestetwerden können. ChipsfürdieMikrofluidikbasierenaufunterschiedlichenMaterialien,u.a.aufGlas, MetallenoderPolymeren.Letzteresindhierbeiaufgrundihrereinfachenund kostengünstigenHandhabungvonbesonderemInteresse.Polydimethylsiloxan(PDMS) bietetvieleVorteilegegenüberanderenMaterialien,daesleichtzuverarbeitenundim auspolymerisiertenZustandklarundchemischinertist.DieFertigungderMikrofluidik‐ Einleitung 25  ChipserfolgthierbeiinvierSchritten,derErstellungeinerFotomaskeunddes Formwerkzeugs,demGießendesChipsundderabschließendenBearbeitung. ImBereichderBiomaterialienwerdenMikrofluidik‐ChipsbereitszurHerstellung unterschiedlicherMorphologieneingesetzt.Soistesgelungen,einenFadenausB.mori FibroindurchgezieltesFokussierenimMikrofluidik‐Kanalherzustellenundzusätzlich seineEigenschaftendurchVariationderParametereinzustellen.111AuchdieHerstellung vonFibroinpartikelnimMikrometerbereichkonntebereitsrealisiertwerden.112 3.3 WirkstofftransportundkontrollierteWirkstofffreisetzung DerkontrollierteWirkstofftransportaneinenZielortinnerhalbdesOrganismus,ebenso wiediekontrollierteWirkstofffreisetzungamWirkort(controlleddrugdelivery/release) hatvieleVorteileimVergleichzuherkömmlicherMedikation(Abb.3.8).113Viele WirkstoffewirkennurinnerhalbeinestherapeutischenFensters,unterhalbdieser KonzentrationsindvieleMedikamentewirkungslos,oberhalbkönnentoxische Nebenreaktionenauftreten.BeiderherkömmlichenVerabreichungvonMedikamenten tretennachInjektionbzw.nachEinnahmedesMedikamentsmeistsehrhohelokale Wirkstoffkonzentrationenauf,welcheaberübereinenrechtkurzenZeitraumhinweg schnellwiederabflachen.DieseSchwankungenkönnenunerwünschteNebenreaktionen bedingenundsollendeshalbdurchdiekontrollierteWirkstofffreisetzungverringert werden.  Abb.3.8:SchematischeDarstellungdererwartetenWirkstoffkonzentrationenimPlasmadurch kontrollierteWirkstofffreisetzungundherkömmlicheMedikation(modifiziertnach113).Durcheine Einleitung 26  kontrollierteFreisetzungsollentoxischeNebenwirkungenebensowieunwirksame KonzentrationsbereichederMedikamentevermiedenwerden. SowohlmobilealsauchstationäreSystemesindfürdiekontrollierte Wirkstofffreisetzungdenkbar.Mobilebzw.injizierbareSystemesindu.a.mit WirkstoffenbeladenePartikeloderKapseln,welcheimBlutkreislaufzirkulierenoderoral aufgenommenwerden.Abb.3.9zeigtverschiedenemobileWirkstofftransportsysteme amBeispielvonPolyethylenglykol(PEG),demamhäufigstenverwendetensynthetischen PolymerimBereichdesPolymer‐basiertenWirkstofftransportes.114  Abb.3.9:ÜbersichtderverschiedenenPolymer‐basierten,mobilenWirkstofftransportsystemeamBeispiel PEG(modifiziertnach114). Hierbeiwirddeutlich,dassesverschiedeneMöglichkeitengibt,Wirkstoffezuverpacken bzw.zutransportieren.Zumeinenkönnendiesevollständigdurchkapsuläre,partikuläre odermizellareSystemeeingeschlossenwerden,zumanderenkönnendieWirkstoffean einTrägermolekülgekoppeltwerden,welchesdieVerweildauerimBlutkreislauferhöht oderdiespezifischeZellaufnahmefördert.DieWahleinesgeeignetenSystemsisthierbei Einleitung 27  sowohlvondenEigenschaftendesWirkstoffesalsauchvomZielortundderArtder Therapieabhängig. ImGegensatzzumobilenSystemensindstationäreSystemeentwederimplantierbare Wirkstoffträger,z.B.Partikel,HydrogeleoderFilme(Implantatbeschichtungen),115oder WundabdeckungenundNahtmaterial,welchedieWirkstoffelangsamandieWunde abgeben.FürWundabdeckungeneignensichbeispielsweiseFilme,Vliese116oder Hydrogele,117alsNahtmateriallediglichFasern. DieFreisetzungderWirkstoffekannsowohlbeimobilenalsauchbeistationären SystemenaufzweiverschiedeneArtenerfolgen.DieWirkstoffmolekülekönnenzum einenausdemTransportsystemherausdiffundieren.DieFreisetzungerfolgthierbei aufgrundvonÄnderungendespH‐WertesimumgebendenPlasma,des WirkstoffkonzentrationsgefällesimPlasmaoderanderenFaktoren.DasTransportsystem bleibthierbeiwährenddesDiffusionsprozesseserhaltenundwirdanschließend entwederausgeschieden(mobileSysteme),durchProteasenverdaut,im VerdauungstraktdurchSäurenetc.nachträglichzersetztoder,z.B.beiWundauflagen, vonderWundeabgelöst.AlternativkönnendieWirkstoffträgernachFreigabedes Wirkstoffesauchwiederexplantiertwerden.Zumanderenkönnendie WirkstoffmoleküleauchdurchdieDegradationdesTrägermaterialsfreigesetzt werden.118JenachMaterialkanndaseinerseitsdurchSäurenimVerdauungstrakt geschehen,andererseitsauchdurchProteasendirektamWirkort.DieFreisetzungder WirkstoffeundsomitdieWahldesSystemsistvonverschiedenenParameternabhängig. HierzuzählendasMolekulargewicht,dieKristallinitätundPorosität,sowiederAufbau unddieGrößedesTrägermaterials(Polymer),ebensowiedasWirkstoffmolekülansich (Größe,Ladung)unddieUmgebungsbedingungenindiedieWirkstoffmoleküle freigesetztwerdensollen.118,119 AnstellederVerpackungvonWirkstoffen,könnenauchZellenoderEnzymeverpackt werden.HierbeiwirdnichtderWirkstoff,sonderndieimOrganismusfehlendenZellen oderEnzymetransportiert.EinBeispielhierfüristdieVerpackungvonLangerhansInseln. DieseverpacktenZellenkönnenDiabetikernaneinegutzugänglicheundgut durchbluteteStelleimplantiertwerden,z.B.indenOberarmmuskel.JenachderHöhe Einleitung 28  desBlutzuckerspiegelskönnendieZellendortInsulinproduzieren,ohnedassdieses injiziertwerdenmuss.DieÜberlebensratederverpacktenZellenistvonmehreren Faktorenabhängig,zumeinenvomumgebendenMaterial,zumanderenauchvonder Implantationsstelle.DurchdieVerpackunginMaterialienwiebeispielsweiseAlginatsind dieZellenvomImmunsystemgeschützt,dasumgebendeNetzwerkistjedochsemi‐ permeabel,sodassNährstoffeundSauerstoffzudenZellenhineindiffundierenkönnen undAbfallproduktesowieWirkstoffe,z.B.dasproduzierteInsulin,nachdraußen gelangenkönnen.120‐122 Dieverschiedenen,bereitsbeschriebenen,AnforderungenanPolymere,welchefürden Wirkstofftransporteingesetztwerden,sindinTab.3.2zusammengefasst.DerFokus dieserAuflistungliegtindenBereichenWirkstoffverarbeitung,Pharmakokinetikund klinischeVerabreichung.123 Tab.3.2:AnforderungenaneinWirkstofftransportsystemaufBasisvonPolymerenhinsichtlichder Wirkstoffverarbeitung,PharmakokinetikundklinischenVerabreichung(modifiziertnach123). WirkstofftransportBlutZielgewebeAusscheidungKlinik keinegiftigen Monomereund Zusatzstoffe Hämo‐ kompatibilität Gewebe‐oder Zellspezifische Markierungen niedriges Molekulargewicht sichereund einfache Applikation Stabilisierungund Solubilisierungdes Wirkstoffes verlängerte Zirkulationsdauer durchdringt biologische Barrieren ungiftige Abbauprodukte gutesKosten‐ /Risiko‐/Nutzen‐ Verhältnis Schutzder Wirkstoffe kontrollierte Wirkstofffrei‐ setzung Aufnahmein Zellen/Organe keine Akkumulationenin Organen hochskalierbar physikalische, chemischeund mikrobielle Stabilität Schutzvor Agglomeration undAggregation Maßgeschneider‐ tesFreisetzungs‐ verhalten Ausscheidungüber LeberoderNieren einfacheLagerung hohe Biokompatibilität keineAufnahme durchdasRES (Retikuloendothe‐ lialesSystem) Bioabbaubarkeit einfache Sterilisierbarkeit keineReinigung durchdieLunge Biokompatibilität angemessene Gebinde verursachtkeine Embolien nichtzytotoxisch, genotoxischoder immunogen   Einleitung 29  3.3.1 PolymerealsmobileWirkstofftransport‐undDepotsysteme VieleverschiedeneBiomaterialienwurdenbereitsfürihrenEinsatzals Wirkstofftransport‐ undDepotsystem,aberauchalsVerpackungsmaterialfürZellen oderEnzymegetestet.HierzuzählenMaterialienwiez.B.Alginat,124Chitosan,125‐127 Gelatine,128Fibroin,74,76,79,112,129‐131Zein,132undSpinnenseiden,99,100,102,103,133aberauch KompositmaterialienausmehrerendieserBiomaterialien.73EinVorteildieser natürlichenPolymeregegenübersynthetischenwiePEG,114PLA,119PGAoder PLG113,134,135liegtinderVerarbeitungundVerträglichkeitderMoleküle.Viele synthetischePolymerebenötigenstarkeorganischeLösungsmittelodersehrhohe TemperaturenfürihreVerarbeitung,imGegensatzzunatürlichenPolymeren,diemeist untermildenBedingungeninwässrigenLösungenverarbeitetwerdenkönnen.Des WeiterenweisenvieledernatürlichenPolymereneinehoheBiokompatibilitätund teilweiseaucheineguteBioabbaubarkeitauf,wodurchsiesichfüreinemedizinische Anwendungeignen.SynthetischePolymeresindindiesemPunktmeistimNachteil. InsbesonderePEGstehtimVerdacht,unterStressverstärktAbbaureaktionenhinzu toxischenAbbauproduktenzuzeigen.DieseundweitereallgemeineUnterschiede zwischensynthetischenundnatürlichenPolymerensindinTab.3.3zusammengefasst. Tab.3.3:AllgemeineEigenschaftennatürlicherundsynthetischerWirkstoffträgerinBezugauf pharmazeutischeAnwendungen.123,136 EigenschaftennatürlichePolymeresynthetischePolymere Bioabbaubar/metabolisierbarjateilweise HerstellungsmethodeProduktioninBioorganismenchemischsynthetisiert Reinigungsschrittemeistaufwändig meistnichtaufwendig GleichbleibendeChargenqualitätneinja möglichemolekulareVeränderungengenetisch/chemischchemisch AuslösenvonEntzündungsreaktionenkaumja Immunogenkaum ja EntfernungderTrägermaterialsausdem Organismus bioabbaubaroperativ VerschiedeneBeladungsmechanismen (elektrostatischeoderhydrophobe Wechselwirkungen,kovalenteBindungen) jateilweise Oberflächenmodifikationenvielekaum  Einleitung 30  SowohlbeinatürlichenalsauchbeisynthetischenPolymerenhandeltessichum allgemeineBegriffe,welchesehrgroßeundinhomogeneGruppenumschreiben.Aus diesemGrundsindinTab.3.4undTab.3.5einigeMitgliederdieserGruppengenauer beschriebenundcharakterisiert.Eshandeltsichhierbeiumeinevergleichende AuflistungverschiedenernatürlicherundsynthetischerPolymere,welcheimBereichdes gezieltenWirkstofftransportesgenutztwerden,sowieeinigeihrerVor‐undNachteilein BezugaufmedizinischeAnwendungen.   Einleitung31  Tab.3.4:VergleichendeAuflistungeinigersynthetischerPolymere,welchealsmobileWirkstofftransportsystemeVerwendungfinden.123 StoffklasseMaterialMorphologieVorteile Nachteile PolyesterPolyglykolsäure(PGA)‐Implantate ‐Beschichtungen ‐Partikel ‐Gerüstsysteme ‐FDA‐Zulassung ‐bioabbaubar/metabolisierbar ‐kontrollierbareDegradationsrate ‐hydrophob ‐biokompatibel ‐wasserunlöslich ‐nichtautoklavierbar ‐immunogenesPotentialistvorhanden ‐geringeToxizität ‐schlechteInteraktionmithydrophilenWirkstoffmolekülen Polylactide(PLA) Polylactid‐co‐Glycolid (PLG)137,138 Acrylbasierte Polymere Polyacrylamid(PAA)  oderanderePolymereauf Acrylamid‐Basis139‐143  ‐Beschichtungen ‐Partikel ‐Hydrogel ‐Hydrogelpartikel ‐verlängerteVerweildauervonWirkstoffenimBlutsystem ‐Proteinresistent ‐keinezytotoxischenNebenreaktionen ‐biokompatibel ‐ImplantationvonHydrogelenkannzuEntzündungsreaktionen führen ‐kannzuAcrylamidabgebautwerden(durchTemperaturoder photolytischeEffekte)–lösenneurotoxischeReaktionenaus ‐nicht‐abbaubaresKarbon‐Rückgrat ‐teilweiseAkkumulationderPartikelinderLeber Silikon144Polydimethylsiloxan (PDMS)  ‐Hydrogel ‐Flüssigkeit ‐Kapseln ‐Membran ‐physiologischinert ‐thermischstabil ‐oxidativstabil ‐FDA‐Zulassung ‐geringeToxizität Poly(Amino‐ säuren) 114,145,146 Polyglutaminsäure(PGS)‐Beschichtungen ‐Liposomen ‐Mizellen ‐Konjugate ‐bioabbaubarinnicht‐toxischeAminosäuren ‐verlängertdieVerweildauervonWirkstoffenimBlut ‐erhöhteLöslichkeitinWasserdurchKonjugate ‐verbesserteZellaufnahme ‐hydrophil ‐biokompatibel ‐OrganischeLösungsmittelbeiderVerarbeitung ‐könnenimOrganismuseineImmunantwortauslösen Polyhydroxyethyl‐L‐ asparagin(PHEA) Polyhydroxyethyl‐L‐ Glutamin(PHEG) SonstigePolyethylenglykol (PEG)114,147‐153 ‐Partikel ‐Kapsel ‐Liposomen/ Polymersomen ‐Mizellen ‐Konjugate ‐verlangsamteDegradationszeitdesWirkstoffes ‐verlängerteZirkulationszeitdesWirkstoffesimBlut ‐günstiginderProduktion ‐verbessertePermeabilitätundAufnahmeinZellen ‐vielePEG‐stabilisierteWirkstoffesindbereitsinUSAund Europazugelassen ‐Hypersensitivität ‐toxischeNebenproduktebeiderProduktion ‐verstärkteDegradationunterStresseinflussmöglich ‐nichtbioabbaubar ‐möglicheBeeinflussungderPharmakokinetikbeimehrfacher Verabreichung(acceleratedbloodclearence–beschleunigte Einleitung32  ‐Beschichtung ‐biokompatibel ‐vermindertdieInteraktionmitKomponentendesBlutes ‐reduziertdiePartikelaggregation ‐dieenormeGrößenvarianzderPEG‐Moleküle(400Dabis 50kDafürmedizinischeAnwendungen)machtsiefürdie KopplungverschiedenerMoleküleinteressant(z.B. Proteine,Polypeptide,DNS,RNS…) Blutreinigung) ‐durchOxidationentstehentoxischeMetabolite,insbesonderebei PEGmitkleinemMolekulargewicht Polyethylenimin(PEI)154,155‐nichtviraleVektorSysteme ‐verzweigteoderlineare Molekülemit unterschiedlichen Molekulargewichten ‐Partikel ‐verhältsichwieeinProtonenschwamm ‐besondersgeeignetfürdenGen‐Transport ‐durchdievielenAmino‐Gruppeneröffnensichviele Anwendungsgebiete(chemischeModifikationen) ‐kationisch ‐starkzytotoxisch ‐schlechteBlutverträglichkeit ‐bisherkonntekeinkontrollierterWirkstofftransportzumZielort erreichtwerden  Einleitung33  Tab.3.5:VergleichendeAuflistungverschiedenernatürlicherPolymere,welchealsmobileWirkstofftransportsystemeVerwendungfinden.123 StoffklasseMaterialMorphologieVorteile Nachteile Polysaccharide mikrobiellen Ursprungs Chitosan undseineDerivate126,136,156‐163  Polyamino‐saccharid,ausN‐ Acetylglucosamin‐resten  ‐Partikel ‐Beschichtungen ‐Granulat ‐Hydrogel ‐Fasern ‐Filme ‐Molekulargewicht:5‐540kDa ‐einfacheVerarbeitunguntermildenBedingungen ‐biokompatibel ‐bioabbaubar ‐bioadhäsiv/mukoadhäsiv ‐pHsensitiv ‐kationisch ‐kannvernetztwerden ‐fürdenTransportvonProteinengeeignet ‐wasserlöslich ‐blutstillend ‐wundheilungsfördernd  ‐saurerpH‐WertlöstdasNetzwerkauf ‐QuellverhaltenistvompH‐Wertabhängig ‐untermildenBedingungenhergestelltePartikel sindmeistsehrgroß(1‐2mm) ‐VernetzungsreaktionenmitGlutaraldehydsind biomedizinischproblematisch Dextran oderseineDerivate136,164  PolysaccharideausderKlasseder  ‐D‐ Glucane ‐Hydrogele ‐Kapseln  ‐Molekulargewicht:10‐150kDa ‐gleichmäßigeWirkstofffreisetzung ‐bioabbaubar ‐biokompatibel ‐chemischeModifikationensindmöglich ‐autoklavierbar ‐wasserlöslich ‐chemischesundphysikalischesVernetzenistmöglich ‐löstsichunvernetztinwässrigerUmgebungauf Polysaccharide menschlichen odertierischen Ursprungs Heparin undseineDerivate136,165  Polysaccharid,ausD‐Glucosaminund Uronsäuren ‐Kapseln ‐elektrostatische Komplexe ‐Gele ‐anionisch ‐3‐50kDa ‐antithrombotisch ‐gerinnungshemmend ‐bioabbaubar ‐löstsichunvernetztinwässrigerUmgebungauf Einleitung 40  3.5 Zielsetzung NatürlicheSpinnenseideistfürihreguteBiokompatibilität,Bioabbaubarkeitundihre außerordentlichenmechanischenEigenschaftenbekannt.Bereitsseithundertenvon JahrenfindetSieinverschiedenenBereichenAnwendung,unterandereminderMedizin zurWundversorgungundalsNahtmaterial. DurchdierekombinanteHerstellungvonSpinnenseidenproteinenistesnunmöglich, dieseingroßemMaßstabherzustellenundinverschiedeneMorphologienzu überführen,welcheinunterschiedlichenmedizinischenundtechnischenBereichen Anwendungfindenkönnen. SeidenpartikelwurdenbereitsalsmöglicheWirkstofftransportsystemecharakterisiert unddasBe‐ undEntladeverhaltenanalysiert.Letztereswarbeigutwasserlöslichen Wirkstoffenzuschnell,umdieSeidenpartikelalsWirkstofftransportereinsetzenzu können.HiersolltedurchzusätzlicheVernetzungsprozesseundneue BelademechanismeneinebessereBeladungundeineverlängerte Wirkstofffreisetzungsdauererzieltwerden.HierfürwurdeRhodaminBals Modellwirkstoffverwendet.DapartikuläreSystemesowohlalsTransportsystemeim medizinischenBereichalsauchalsmöglicheFüllstoffeinKompositmaterialieneiner starkenmechanischenBeanspruchungausgesetztsind,isteswichtig,dasmechanische VerhaltenderPartikelzubestimmen.UnterVerwendungderColloidalProbeTechnique wurdensowohldiemechanischenEigenschaftenalsauchdieOberflächeneigenschaften derPartikelanalysiert.MitHilfederdarausgewonnenDatenkönnenmögliche Anwendungsbereichebesserausgewähltundcharakterisiertwerden. DieOptimierungderHerstellungvonKapselnausdemrekombinanten SpinnenseidenproteineADF4(C16)stellteeinenweiterenSchwerpunktdieserArbeitdar. DieHerstellungvonKapselnistbereitsseitmehrerenJahrenbekanntundpubliziert, allerdingskonntebislangkeinebiomedizinischrelevanteAnwendungderKapseln gezeigtwerden.DerherkömmlicheHerstellungsprozessbasiertjedochaufder VerwendungdesalsgesundheitsgefährdendeingestuftenToluols.Ineinemneuen ProzesssollteToluoldurchdasunbedenklicheSilikonölersetztwerden,ummittels dieserneuenHerstellungsvarianteeingeeignetesVerpackungssystemfüraktive Einleitung 41  WirkstoffeundEnzymezugenerieren.DieswurdeamBeispiel‐Galaktosidasegezeigt. DesWeiterensolltegezeigtwerden,dassdasEnzymauchnachdemHerstellungsprozess nochaktivistunddurchdieProteinhüllevorProteasengeschütztwird.Zusätzlichsollte einenachträglicheAktivierungverkapselterEnzymeerprobtwerden,wodurchsichneue AnwendungsgebieteinMedizinundBiotechnologieaufzeigenwürden.Ummöglichst homogeneKapselnherzustellen,solltezudemdieMikrofluidikalsHerstellungsmethode getestetwerden. UmrekombinantinBakterienhergestellteProteineimmedizinischenBereichanwenden zukönnen,mussdieSterilitätderProteinebzw.desfertigenProduktsgewährleistet sein.AusdiesemGrundwurdenverschiedenebekannteSterilisationsverfahrenim HinblickaufihreAuswirkungenaufeADF4(C16)hingetestetundanalysiert.  MaterialundMethoden 43  4 MaterialundMethoden 4.1 Material 4.1.1 Chemikalien Sofernnichtandersangegeben,wurdenalleweiterenverwendetenChemikalienvon denFirmenCarlRothGmbH&Co.KG,Karlsruhe,DeutschlandoderMerckKGaA, Darmstadt,Deutschland,mitdemReinheitsgradp.a.bezogen.ZurHerstellungvon LösungenundPuffernwurdeultrareinesWasserauseinerMilli‐Q‐Anlage(Millipore, Billerica,MA,USA)verwendet. ChemikalienFirma (2,2´‐bipyridyl)dichlororuthenium(II)Sigma‐AldrichChemieGmbH,Steinheim, Deutschland 3‐AminopropyldiisopropylethoxysilanSigma‐AldrichChemieGmbH,Steinheim, Deutschland Ameisensäure,p.a.Sigma‐AldrichChemieGmbH,Steinheim, Deutschland Ethanol,p.a.VWRInternationalGmbH,Darmstadt,Deutschland Fluoreszeinisothiocyanat‐Dextran (Molekulargewichte:3‐5kDa,20kDa,40kDa) Sigma‐AldrichChemieGmbH,Steinheim, Deutschland Fluoreszein‐NHSThermoScientificInc.,Waltham,MA,USA GlyzerinSigma‐AldrichChemieGmbH,Steinheim, Deutschland Hellmanex®IIIHellmaGmbH&Co.KG,Mühlheim,Deutschland Klebstoff,2‐Komponenten(UHUEndfest300) UHUGmbH&Co.KG,Bühl,Deutschland Klebstoff,UV‐härtend(NorlandOpticalAdhesives Nr.63) NorlandProducts,Cranbury,NJ,USA MethanolSigma‐AldrichChemieGmbH,Steinheim, Deutschland o‐Nitrophenyl‐‐D‐galactopyranosidSigma‐AldrichChemieGmbH,Steinheim, Deutschland PolydimethylsiloxanSylgard184 DowCorningGmbH,Wiesbaden,Deutschland Sigmacote®Sigma‐AldrichChemieGmbH,Steinheim, Deutschland  MaterialundMethoden 44  4.1.2 Materialien AlleweiterenVerbrauchsmaterialienwurdenvonderFirmaVWRInternationalGmbH, Darmstadt,Deutschland,bezogen. MaterialFirma Aluminiumoxid‐TiegelfürTGAMettler‐ToledoGmbH,Gießen,Deutschland Aluminium‐TiegelfürDSCMettler‐ToledoGmbH,Gießen,Deutschland Dialysemembran(6‐8kDa)Spektra/Por,RanchoDominuez,CA,USA Feindosierungsspritze1ml(Injekt®FSolo)B.BraunMelsungenAG,Melsungen,Deutschland Einmalspritzen4ml(Omnifix®Solo) B.BraunMelsungenAG,Melsungen,Deutschland EppendorfReaktionsgefäß(Safe‐Lock)1,5ml,2mlEppendorfAG,Hamburg,Deutschland Mikrotiterplatte96‐well,schwarzNalgeNuncInternational,Rochester,NY,USA Mikrotiterplatte24‐well,klarNalgeNuncInternational,Rochester,NY,USA Platine(unbearbeitet)BungardElektronikGmbH&Co.KG,Windeck, Deutschland Polystyrol‐Röhrchen(15ml,45ml)GreinerBio‐OneGmbH,Frickenhausen, Deutschland PVDF‐MembranGEHealthcareGmbH,München,Deutschland OriginalPerfusor®‐Leitung,PEB.BraunMelsungenAG,Melsungen,Deutschland QuarzglasSuprasilKüvettenHellmaGmbH&Co.KG,Mühlheim,Deutschland REM‐ProbenhalterAgarScientificLtd.,Essex,UK Silikat‐Kugeln(20‐50µm)(Mikromechanik)PolysciencesEuropeGmbH,Eppelheim, Deutschland Silikat‐Kugeln(direkteKraftmessungen),LudoxAM 30 Sigma‐AldrichChemieGmbH,Steinheim, Deutschland Thermanox™plasticcoverslipsNalgeNuncInternational,Rochester,NY,USA Whatman®Chromatographiepapier3MMCHRCarlRothGmbH&Co.KG,KarlsruheDeutschland  4.1.3 GrößenstandardsundKits Molekulargewichtsstandard: ColorPlusPrestainedProteinMarker7‐175kDa (NewEnglandBiolabs,Frankfurta.M.,Deutschland) ECLwesternblotdetectionkit:AmershamBiosciences,Piscataway,NJ,USA MaterialundMethoden 45  4.1.4 ProteineundAntikörper Antikörper:T7‐TagHRPconjugate(Novagen,Madison,WI,USA) ausderMaus,Verdünnung:1:10000inPBSmit1% (w/v)Milchpulver EndoproteinaseAspNSequencinggrade,ausPseudomonasfragimutant, RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,Deutschland ‐Galactosidase:GradeVI,Sigma‐AldrichChemieGmbH,Steinheim, Deutschland ‐GalactosidaseFragmente:ED28(Peptid)undEA22(Akzeptor)    beide‐Komplementations‐Untereinheitenwurden vonDr.AlfonsNichtl(RocheDiagnosticsGmbH, Penzberg,Deutschland)synthetisiert. RekombinanteSpinnenseidenproteine,basierendaufADF4(A.diadematus): RekombinantesSpinnenseidenproteinMolekulargewicht Quelle eADF4(C8)24,6kDaDanielHümmerich eADF4(C16)47,7kDaDanielHümmerich eADF4(C32)93,8kDaDanielHümmerich  4.1.5 PufferundLösungen SDS‐PAGE Trenngelpuffer(4x):  1,5MTris/HCl(pH8,8),0,8%(w/v)SDS Sammelgelpuffer(2x): 250mMTris/HCl(pH6,8),0,4%(w/v)SDS Auftragspuffer(5x)(Lämmli):10%(w/v)SDS,50%(v/v)Glyzerin,300mM Tris/HCl(pH6,8),0,05%(w/v)Bromphenolblau, 25%(v/v)2‐Mercaptoethanol Laufpuffer(10x):250mMTris/HCl(pH8,8),2MGlyzin(v/v), 1%(w/v)SDS MaterialundMethoden 46  ZusammensetzungderSDS‐Gele 5%Sammelgel:Sammelgelpuffer(1x),5%Acrylamid‐Bisacrylamid‐ Stammlösung,0,2%(w/v)SDS,0,13%(w/v)APS,  0,066%(v/v)TEMED 12%Trenngel:Trenngelpuffer(1x),12%Acrylamid‐Bisacrylamid‐ Stammlösung,0,1%(w/v)SDS,0,065%(w/v)APS,  0,033%(v/v)TEMED Silberfärbung FixierlösungI(FixI): 30%(v/v)Ethanol,10%(v/v)Essigsäure FixierlösungII(FixII):0,4MNatriumacetat(pH6,0),0,5%(v/v)Eisessig, 30%(v/v)Ethanol,0,1%(w/v)Na2S2O3 Silberfärbelösung: 6mMAgNO3,0,025%(v/v)Formaldehyd Entwicklerlösung: 0,35MNa2CO3,0,04%(v/v)Formaldehyd Stopplösung:  50mMEDTA,pH7,5 WesternBlot Transferpuffer:48mMTris,39mMGlyzin,1,3mMSDS, 20%(v/v)Methanol PBS:4mMKH2PO4,16mMNa2HPO4*2H2O,115mMNaCl (pH7,4) Blocking‐Reagenz: PBS‐Puffermit5%(w/v)Milchpulver SonstigeLösungen PufferZ:100mMNa3PO4(pH7),10mMKCl,1mMMgSO4,50mM 2‐Mercaptoethanol Matrix‐Lösung:20mg/mlSinapinsäurein50%Acetonitril, 0,1%TrifluoressigsäureinH2O MaterialundMethoden 47  Ätzlösung(Platine):  20%H2O,20%HClkonzund10%H2O2  4.1.6 Geräte GerätModellFirma Blot‐ApparaturFastblotB44Biometra,Göttingen, Deutschland Cantileverhart:NSC14 weich:NSC36/CSC17 NSC12(silikon) SNL‐10(Silikon‐Nitrit) MikroMasch,Tallinn,Estland   BrukerCorporation,Bremen, Deutschland ExsikkatorNovusmitTubusdeckelVWRInternationalGmbH, Darmstadt,Deutschland FeuchtigkeitsanalysegerätIGASorpHidenAnalytical,KochelamSee, Deutschland FluoreszenzimagerEttanDIGEGEHealthcare,München, Deutschland FluoreszenzmikroskopLeicaDMI3000BLeicaMicrosystemsGmbH, Wetzlar,Germany FluoreszenzspektrometerFP‐6500JascoGmbH,Essex,UK FTIR‐SpektrometerTensor27IR‐Spektrometer Detektor:MCT Messeinheit:MIRacle GermaniumATRKristall BrukerCorporation,Bremen, Deutschland GelelektrophoreseapparaturMightySmallIISE250basicHoeferInc.,Holliston,Ma,USA HochdruckhomogenisatorPanda2KGEANiroSoavi,Lübeck, Deutschland KonfokalesLaser‐Scanning‐ Mikroskop DMI6000CS Scankopf:TCSSP5 LeicaMicrosystemsGmbH, Mannheim,Deutschland LichtmikroskopmitSchwarz‐ Weiß‐Kamera LeicaDMI3000B(Mikroskop) LeicaDFC340FX(Kamera) LeicaMicrosystemsGmbH, Wetzlar,Deutschland LyophilleAlpha1‐2LDplusMartinChrist Gefriertrocknungsanlagen GmbH,OsterodeamHarz, Deutschland KalorimeterDSC/SDTA821eMettlerToledo,Gießen, Deutschland MassenspektrometerBrukerReflexIIIBrukerCorporation,Bremen, Deutschland MaterialundMethoden 48  OfenHeraeusFunctionLineThermoScientificInc.,Waltham, MA,USA pH‐MeterLab850SIAnalyticsGmbH,Mainz, Deutschland PipettenEppendorfResearchEppendorfAG,Hamburg, Deutschland PlatereaderMithrasLB940BertholdTechnologies, Sprendlingen,Deutschland Rasterelektronenmikroskop1540ESBCrossBeamCarlZeiss,Oberkochen, Deutschland LEO1530VP‐FESEMCarlZeiss,Oberkochen, Deutschland Rasterkraftmikroskopmit inversemoptischenMikroskop NanoWizard®I(AFM) Axiovert200(Mikroskop) JPKInstruments,Berlin, Deutschland CarlZeissMicroImaging,Jena, Deutschland RasterkraftmikroskopMFP‐3DAsylumResearch,CA,USA RollenschüttlerStuartSRT1BibbyScientificLimited,Stone, Staffordshire,UK SpektrophotometerNanoDropND‐1000ThermoScientificInc.,Waltham, MA,USA SpritzenpumpenHarvard33HarvardApparatus,Holliston, MA,USA Thermogravimeter SDTA861eMettler‐ToledoGmbH,Gießen, Deutschland ThermomixerThermoCompact/ComfortEppendorfAG,Hamburg, Deutschland ÜberkopfschüttlerIntelliMixerneoLabMiggeLaborbedarf VertriebsGmbH,Heidelberg, Deutschland UltrazentrifugeOptimaMAX‐XPBeckmanCoulterInc,Brea,CA, USA UV/Vis‐SpektrometerCary50BioVarian,Darmstadt,Deutschland VortexSchüttlerVV3VWRInternationalGmbH, Darmstadt,Deutschland WaagenCPA225DSartoriusAG,Göttingen, Deutschland OhausPioneer  VWRInternationalGmbH, Darmstadt,Deutschland ZentrifugenHeraeusBiofugeprimoR HeraeusFresco17 HeraeusPico17 ThermoScientificInc.,Waltham, MA,USA MaterialundMethoden 49  HeraeusMultifuge3SR+ SorvallRC6plus Zetaview ZetaviewPMX100ParticleMetrixGmbH, Meerbusch,Deutschland  4.1.7 Computerprogramme AdobeIllustratorCS5:AdobeSystems,SanJose,CA,USA AdobePhotoshopCS5:AdobeSystems,SanJose,CA,USA AdobeReader9.0:  AdobeSystems,SanJose,CA,USA ImageJ1.45s:WayneRasband,NationalInstituteofHealth,Bethesda, MD,USA LeicaApplicationSuite:LeicaMicrosystemsGmbH,Wetzlar,Deutschland MicrosoftOffice2007:MicrosoftCorporation,Redmond,WA,USA OriginPro8.1G: OriginLabCorporation,Northampton,MA,USA OPUSsoftware: BrukerAXSInc.,Madison,WI,USA StareSoftware: MettlerToledo,Gießen,Deutschland ExPASy‐SIBBioinformaticsResourcePortal: https://expasy.org  4.2 ReinigungderrekombinantenSpinnenseidenproteine BeidenindieserArbeitverwendetenProteinenhandeltessichumamLehrstuhl BiomaterialienetablierteKonstrukte.DieFermentationundErntedertransformierten E.coliBakterienim30LMaßstabwurdevonAndreasSchmidtundJohannesDiehl durchgeführt.DiegeerntetenBakteriensuspensionenwurdenanschließendim schockgefrorenenZustandbereitgestellt. DieReinigungallerverwendetenrekombinantenSpinnenseidenproteinewurdeanalog desfüreADF4(C16)etabliertenProtokollsdurchgeführt.98IneinemerstenSchritt wurdendieZellpelletsaufgetaut.AlleweiterenSchrittewurden,biszurFällungdes MaterialundMethoden 56  denAnalysatoreingespeistunddetektiert.BeidemhierverwendetenDetektorhandelt essichumeinenFlugzeitanalysator.DurchAnlegeneinerBeschleunigungsspannung wanderndieProteinionenimelektrischenFeld,wobeidieFlugzeitinAbhängigkeitdes Masse‐zu‐Ladungsverhältnissesdargestelltwird.201,208 IndieserArbeitwurdeMALDI‐TOFeingesetzt,umdenEinflussverschiedener SterilisationsmethodenaufeADF4(C16)Proteinenachzuweisen.Fürdie ProbenvorbereitungwurdenProteineinwässrigerLösungmitderMatrix‐Lösungauf eineKonzentrationvon20µMin5mMTris/HCl(pH8)verdünnt.Die massenspektrometrischeUntersuchungmittelsMALDI‐TOFwurdeaneinemGerätder FirmaBrukeramLehrstuhlMakromolekulareChemieIIderUniversitätBayreuth durchgeführt.DiesesGerätistausgestattetmiteinem337nmN2‐Laserimlinearen ModusundeinerBeschleunigungsspannungvon20kV. 4.5 ProteinpräparativeMethoden 4.5.1 Dialyse FürvielederbiochemischenAnalysen,aberauchfürproteinpräparativeMethoden, werdendiesterilisierteneADF4ProteineindenaturierterForminwässrigerLösung verwendet.UmdialysiertesProteinineinewässrigeLösungzuüberführen,wurdedieses in6MGdmSCNca.30mindenaturiertundanschließendinDialyseschläuchemiteiner molekularenAusschlussgrößevon6.000–8.000Daüberführt.DieDialyseerfolgteüber Nachtgegeneinenmindestens1.000‐fachenVolumenüberschuss10mMTris/HCl(pH8) oder10mMHEPES(pH8)(jenachspätererVerwendung)beiRaumtemperatur.Der verwendetePufferwurdewährenddessenmindestensvierMalgewechselt.Nach beendenderDialysewurdedieProteinlösungabzentrifugiert(60min,186.000xg, 15°C),ummöglicheAggregatezusedimentieren.Diedialysierten,wässrigen ProteinlösungenwurdenbiszuihrerweiterenVerwendungbei4°Cgelagert. 4.5.2 ChemischeKopplungvon5(6)‐CarboxyfluoresceinN‐hydroxysuccinimid‐Ester (NHS‐Fluoreszein)aneADF4(C16) NHS‐EsterkönnenunterAbspaltungvonN‐HydroxysuccinimidanprimäreAminebinden. eADF4ProteineverfügenübereineN‐terminaleAmin‐Gruppe,welchesichfür KopplungsreaktionenmitNHS‐Estereignen.DurchdenEinsatzvonfluoreszierenden MaterialundMethoden 57  NHS‐Derivatenistessomitmöglich,unterschiedlicheFluoreszenzfarbstoffeN‐Terminal aneADF4(C16)zukoppeln.IndervorliegendenArbeitwurdeNHS‐Fluoreszein verwendet.FürdieKopplungsreaktionwurdeein20‐fachermolarerÜberschussdes NHS‐Fluoreszein(20mMinDMF)mitderwässrigeneADF4(C16)Lösungin10mM HEPES‐Na(pH8)für2StundenunterLichtausschlussinkubiert.Anschließendwurdedas Proteinmit1MKaliumphosphat(pH8)gefällt,dasnicht‐gekoppelteNHS‐Fluoreszein bliebhierbeiinLösung.DurchZentrifugationwurdedaspräzipitierteProtein anschließendsedimentiertunddreiMalmitH2OMQgewaschen.ImAnschlussdaran wurdedasProteingefriergetrocknet.DieweitereVerwendungdesProteins (Denaturierung,Dialyse)erfolgteanalogzudennicht‐fluoreszierendeneADF4Proteinen (Kapitel4.5.1). 4.6 ProteinverarbeitendeMethoden‐Partikel 4.6.1 HerstellungvonMikropartikeln DieHerstellungvonMikropartikelnausdenrekombinantenSpinnenseidenproteinen eADF4(C8),eADF4(C16)undeADF4(C32)beruhtaufdergezieltenPräzipitationder ProteinemitkosmotropenSalzen.DerpostulierteMechanismusder PartikelassemblierungistinKapitel3.2.2.1,Abb.3.6zusammengefasst.DieGrößeder präzipitiertenPartikelistabhängigvonderProteinkonzentrationinderwässrigen LösungundderMixintensitätwährenddesPräzipitationsschrittes.103,104Fürdie HerstellungvonPartikelnmiteinemDurchmesserzwischen400und600nm,wurdeeine 50µMProteinlösung(in10mMTris/HCl,pH8)nachderDialysedurchResuspendieren (Pipette)mit2MKaliumphosphat(pH8)imVerhältnis1:1innerhalbwenigerMinuten ausgefällt.UmPartikelmiteinemDurchmessergrößerals1µmherzustellen,erfolgte derPräzipitationsschrittlangsamer.HierfürwurdediewässrigeProteinlösung45min gegendas100‐facheVolumen1Mbzw.2MKaliumphosphat(pH8)bei Raumtemperaturdialysiert.DiepräzipitiertenPartikelwurdennachderHerstellung abzentrifugiert(10min,17.000xg,20°C)undjenachAnwendungdreiMalmitH2OMQ bzw.mit10mMTris/HCl(pH8)gewaschen. MaterialundMethoden 58  4.6.2 ChemischeVernetzungdereADF4Partikel DiechemischeVernetzungdereADF4PartikelerfolgtemitdemvonFancyundKodadek beschriebenenProzess(Abb.4.1).209BeidieserVernetzungsstrategiewerdendurch Rubpy((2,2´‐bipyridyl)dichlororuthenium(II))undAPS(Ammoniumpersulfat)Proteine überaromatischeSeitenkettenvernetzt.RubpyundAPSwirkenhierbeialsInitiatoreiner radikalischenReaktion(Abb.4.1).DiesgeschiehtüberdiePhotolysevonRubpyin AnwesenheitvonAPSmitLichtimsichtbarenBereich(452nm).DadurchentstehtRu(III), einsehrwirkungsvollesEin‐Elektronen‐OxidantundeinSulfat‐Radikal.Ru(III)kannleicht aromatischeProteinseitenkettenoxidieren,wodurcheinRadikalentsteht,welches gegebenenfallsmehrere,inräumlicherNähebefindlichearomatischeGruppenangreifen kannunddadurchzustabilenC‐C‐BindungenundKopplungvonArenenführt.209Diese VernetzungsstrategieeignetsichgutfürdieeADF4‐Moleküle,dajedesC‐Modulzwei Tyrosinebesitzt,welcheaufdieseWeisedurchdieBildungvondi‐Tyrosineninter‐und intramolekularvernetztwerden.  Abb.4.1:PostulierteVernetzungsstrategievonaromatischenAminosäurendurchAPSundRubpy.209Durch LichtwirdRubpyinderAnwesenheitvonAPSoxidiert,dadurchkönnendieAromatenebenfallsoxidiert MaterialundMethoden 59  werdenundeineradikalischeReaktionstarten.ImFallvoneADF4kommtesdadurchzurAusbildungvon di‐Tyrosinen. Eswurdebereitsgezeigt,dassRubpyundAPSunterschiedlicheAssemblierungsformen voneADF4(C16)chemischvernetzenkönnen,dazuzählenHydrogele210,211und Kapseln.100SowohlbeiHydrogelenalsauchbeiKapselnisteineverbessertechemische undenzymatischeStabilitätbeobachtetworden,beidenHydrogelenkonntenzusätzlich VeränderungenimrheologischenVerhaltenerzieltwerden,diezuvornichtgegeben waren.100,210 IndervorliegendenArbeitwurdeeinzweifachermolarerÜberschussRubpyundein200‐ facherÜberschussAPSentwederdirektmitderwässrigenProteinlösungvermischtund zusammenausgefällt(co‐Präzipitation)odermitbereitsgebildetenPartikelnüberNacht imDunkelninkubiert,sodassdieVernetzermoleküleindiePartikelhineindiffundieren konnten.DerVernetzungsprozessbeiderRoutenwurdedurchLichtimsichtbaren Bereichinitiiert.HierfürwurdendiePartikel2minmiteinerhandelsübliche Wolframlampebestrahlt.AnschließendwurdendiechemischvernetztenPartikel abzentrifugiert(10min,17.000xg,20°C)unddreiMal,jenachspätererAnwendung, entwedermitH2OMQ,mit10mMTris/HCl(pH8)odermit10mMTris/HCl(pH8)+ 50µMRhodaminB(Kapitel4.6.4)gewaschen.DieLagerungdervernetzenPartikel erfolgteimDunkelnbei4°C. 4.6.3 AnalysedesEinflussesderVernetzungaufdiechemischenStabilitätvon eADF4(C16)Partikeln IndiesemVersuchsolltenuneinmöglicherEinflussderVernetzungmitRubpyundAPS aufdiechemischeBeständigkeitvoneADF4(C16)Partikelngegenüber6MGdmSCN, Ameisensäure,HFIP,8MGdmClund10mMTris/HCl(pH8)analysiertwerden.Hierfür wurdenPartikelmiteinemDurchmesserzwischen400und600nmaus10nmol eADF4(C16)Lösungpräzipitiertundanschließendbei37°Cindenjeweiligen Lösungsmitteln(400µl)inkubiert.Jeweilsnach6hundnach25hwurdendieProben abzentrifugiert(10min,17.000xg,20°C)unddieGrößedersedimentierten Proteinpartikelpelletsoptischbestimmt.DieresultierendenPartikelwurdenzusätzlich elektronenmikroskopischanalysiert(Kapitel4.9.3). MaterialundMethoden 60  4.6.4 BeladungvoneADF4(C16)Partikeln AlsModell‐WirkstoffmolekülfürdieVersuchezurBeladungvoneADF4(C16)Partikeln wurdeRhodaminBverwendet(Abb.4.2).Eshandeltsichhierbeiumeinengut wasserlöslichen,fluoreszierendenXanthen‐FarbstoffmiteinemMolekulargewichtvon 479Da,welcherinsbesondereimBereichderkontrolliertenWirkstofffreisetzungund WirkstoffverpackunghäufigalsModellsystemverwendetwird.74,212,213  Abb.4.2:StrukturformelvonRhodaminB. DieBeladungderPartikelmitRhodaminBerfolgteaufzweiArten.Entwederwurden 50µMRhodaminB‐Lösung(in10mMTris/HClpH8)mitbereitspräzipitiertenPartikeln überNachtimDunkelninkubiert,sodassdieFarbstoffmoleküleindiePartikelhinein diffundierenkonnten,oderdiegleicheMengeRhodaminBwurdezusammenmitdem gelöstenProteinauseinerwässrigenLösungco‐präzipitiert.FürbeideMethoden wurdenPartikelaus10nmoleADF4(C16)ausgefällt.Diezweiverschiedenen BeladungsartenwurdenmitvernetztenundmitunvernetztenPartikelndurchgeführt. BeidenvernetztenPartikelnwurdezusätzlichunterschieden,obdiePartikelzum ZeitpunktdesBeladensbereitsvernetztwarenodernicht,bzw.obdie Vernetzermolekülemitco‐präzipitiertwurdenodernicht(Abb.5.1).FürdieBestimmung deraufgenommenenRhodaminBMengenwurdendiebeladenenPartikeldurch Zentrifugation(5min,17.000xg,15°C)sedimentiertundderÜberstandabgenommen. 100µldesÜberstandswurdenanschließendineineschwarze96‐wellMikrotiterplatte überführtundphotometrischamPlatereaderanalysiert(Emission, Anregungswellenlänge:530nm,Emissionswellenlänge:600nm).Dieverwendete50µM RhodaminB‐Lösungwurdehierbeials100%Beladungangenommen.Umausden darausresultierendenWertendieMengeanaufgenommenemRhodaminBzu bestimmen,wurdeeineEichgeradeerstellt.Beidenmittelsco‐Präzipitationbeladenen MaterialundMethoden 61  PartikelnwurdederVerdünnungsfaktordurchdieKaliumphosphat‐Lösung berücksichtigtundebenfallseineentsprechendeEichgeradeerstellt. 4.6.5 WirkstofffreisetzungauseADF4(C16)Partikeln UmdieMengeanRhodaminBbestimmenzukönnen,dieausdeneADF4(C16)Partikeln freigesetztwurde,wurdendiebeladenenPartikelin200µl10mMTris/HCl(pH8) (Puffer)überführtundresuspendiert.HierfürwurdenPartikelverwendet,dieaufzwei verschiedeneArtenbeladenwurden,durchDiffusionunddurchco‐Präzipitation. ZusätzlichwurdendieVersuchemitvernetztenPartikelndurchgeführt.Nachjeweils 30minInkubationszeitimPufferwurdendiePartikelabzentrifugiert(5min,17.000xg, 15°C)undderÜberstandabgenommen.DiesedimentiertenPartikelwurden anschließendsofortinfrischemPufferresuspendiertunddieRhodaminB‐Freisetzung weiterverfolgt.100µldesabgenommenenÜberstandswurden,ebensowiebeider BeladungderPartikel,photometrischamPlatereaderinschwarzen96‐ wellMikrotiterplattenanalysiert(vgl.Kapitel4.6.4).DieBestimmungderMengean freigesetztemRhodaminBerfolgtealle30minübereinenZeitraumvon240minund wurdeunterZuhilfenahmeeinerEichgeradenanalysiert.FürdieBestimmungder FreisetzungskinetikwurdendieRhodaminBMengennachderFreisetzungaddiert,so dassnach240mindeutlichwurde,wievielRhodaminBsichnochindenPartikeln befand. 4.7 ProteinverarbeitendeMethoden‐Kapseln 4.7.1 Kapselherstellung GrundlagefürdieKapselbildunganeinerÖl‐Wasser‐Grenzflächeistderamphiphile CharaktervoneADF4(C16).DadurchlagertsichdasProteinbevorzugtanderÖl‐Wasser‐ Grenzschichtan,wodurchdieFilmbildunganderGrenzflächebegünstigtwird.Die HerstellungvonKapselnauseADF4(C16)basiertaufeinemProtokollvon Hermansonetal(Abb.3.7).100DiesesbeschreibtdieKapselherstellungdurch GrenzflächenpolymerisationdesProteinsaneinerToluol‐Wasser‐Grenzfläche. IndieserArbeitwurdedasProtokollfürdieVerwendungvonSilikonölmodifiziert.Bei Silikonölenhandeltessichumklare,farbloseundchemischinertehydrophobe Flüssigkeiten.SilikonölesindpolymerisierteMethylsiloxane,dieimGegensatzzuToluol MaterialundMethoden 62  nichtgesundheitsgefährdendsindunddahergefahrlosfürmedizinische, pharmazeutischeoderkosmetischeAnwendungenverwendetwerdenkönnen.Ein weitererVorteilliegtinderVielseitigkeitdesÖls.Silikonölewerdeninverschiedenen Vikositätenangeboten,sodassderEinflussderViskositätaufdiejeweiligeAnwendung erprobtwerdenkann,ohnegleichzeitigweiterechemischeParameterzuverändern. FürdieHerstellungvoneADF4(C16)KapselnwurdendieSilikonöleM5(5mm2s‐1, niedrigviskos),M100(100mm2s‐1,mittelviskos)undM500(500mm2s‐1,mittelviskos) erprobt. DiemodifizierteMethodebasiertaufderHerstellungeinerEmulsionausrekombinanten SpinnenseidenproteineninwässrigerLösungundSilikonöl.DurchVermischenvon500µl Silikonölmit5µlwässrigerProteinlösungmiteinerKonzentrationvon3‐7mg/mlfür 45sekmiteinemVortexerbildetesicheineEmulsion.Diegebildetenkapselartigen StrukturensankenimEppendorfReaktionsgefäßaufdenBodenab,sodassderSilikonöl‐ Überstandabgenommenwerdenkonnte.DurchResupendierenderrestlichenEmulsion in200µl50%Ethanolp.a.fandeineStrukturänderungderProteineinderKapselhülle hinzueinemhöheren‐Faltblattanteilstatt.DadurchwurdedieKapselhüllestabilisiert unddieKapselnkonnteninH2OMQüberführtundgewaschenwerden.Dieserfolgtein 24‐wellMikrotiterplatten,wobeijederAnsatzauseinem1,5mlEppendorf Reaktionsgefäßineineinzelneswellüberführtwurde. DieLagerungderKapselnerfolgteinWasserin24‐wellMikrotiterplattenbei4°C.Der ErfolgderKapselherstellungwurdelichtmikroskopischüberprüft. UmKapselnfluoreszenzmikroskopischundmittelsCLSManalysierenzukönnen,wurde derwässrigeneADF4(C16)LösungvorderKapselherstellungFluoreszein‐markiertes eADF4(C16)imVerhältniseADF4(C16)zueADF4(C16)‐Fluoreszein20:1zugesetzt (Kapitel4.5.2).DiefluoreszierendenKapselnwurdenunterLichtausschlussgelagert. 4.7.2 HerstellungvonKapselnmitMikrofluidik DieKapselherstellungmittelsMikrofluidikwurdezueinemgroßenTeilvonBernhard KaufmannwährendseinerStudienarbeitamLehrstuhlBiomaterialienuntermeiner Anleitungdurchgeführt.DaunszudiesemZeitpunktkeinReinraumzurVerfügungstand, MaterialundMethoden 63  wurdendiePDMS‐ChipsamLehrstuhlBiomaterialiengegossen,diePlatinenhierfür wurdenamLehrstuhlfürMess‐undRegeltechnik(UniversitätBayreuth)unterAnleitung vonAnnetteHackerbelichtetundgeätzt.DieHerstellungdermitGlasverschlossenen PDMS‐ChipsundderentsprechendenPlatinenwurdevonMartinTrebbin(Lehrstuhl PhysikalischeChemieI,UniversitätBayreuth)übernommen. 4.7.2.1 HerstellungeinerPhotomaskeundPlatine FürdieHerstellungderPhotomaskewurdedasgewünschteLayoutmittelseines LaserdruckersinmehrerenSchichtenaufeinedurchsichtigeFoliegedruckt(5x).214 MehrereSchichtensindnotwendig,umeineguteDeckkraftdesDruckertonerszu gewährleistenundsomitdieLichtdurchlässigkeitandenbedrucktenStellenzu verringern.UmeineoptimaleAuflösungderStrukturenzuerhalten,wurdedas gewünschteLayoutineinemVektorgrafikformatgespeichert,diein(Abb.5.28) abgebildeteStrukturwurdemitdemTextsatzsystemLATEXerstellt.DerQuellcode hierzukanninderStudienarbeitvonBernhardKaufmannoderimAnhangnachgelesen werden. FürdieHerstellungderPlatinemiterhabenenKanalstrukturen,wurdeeine unbearbeitetePlatineverwendet,welcheauseinermitKupfer(70µm)beschichteten Epoxydharzplattebesteht.DieDickederKupferschichtstelltspäterdiemaximale KanalhöheimfertigenPDMS‐Chipdar.AufdieKupferschichtisteinepositive Photolackschichtaufgebracht.UmdiedesignteKanalstrukturaufdiePlatinezu übertragen,wurdediePhotomaskeaufdiePlatinegelegtund2minmitUV‐Licht belichtet.NachdiesemBelichtungsvorgangfolgtedasEntwickelnderPlatine.Hierfür wurdedieseinschwacherNatronlaugegeschwenkt,sodasssichderbelichtete Photolacklangsamablöst,anschließendfolgteeinWaschschrittinWasser.Umdienun freigelegtenKupferflächenzuentfernen,folgtedasÄtzenderPlatinemitderÄtzlösung. NachwenigenMinutenSchwenkenderPlatineinderÄtzlösungerhieltmandie erhabenenLayout‐StrukturenausKupferwelchealsVorlagefürdasPDMSdienten.Der verbliebenePhotolackkonntemiteinerBürstevorsichtigabgelöstwerden. MaterialundMethoden 64  4.7.2.2 GießeneinesMikrofluidik‐ChipsausPDMS BeidemverwendetenPDMShandelteessichumeinPräpolymermitHärter.Diese wurdenimVerhältnis10:1eingewogen(ca.30gPräpolymer/Chip),vorsichtigvermischt undanschließendineinemExsikkatorentgast.DieMassewurdeüberdiehergestellte Platinegegossenundanschließenderneutentgast,ummöglicheLufteinschlüssezu vermeiden.HierfürwurdediePlatineineineSchaleausAluminiumfoliegelegt,dienach demAushärtenwiederabgezogenwerdenkonnte.JenachAbdichtungdesChips(Platte ausPDMSoderausGlas)wurdeunterschiedlichweiterverfahren. UmdenMikrofluidik‐ChipmiteinerPlatteausPDMSzuverschließen,wurdepartielles HärtenalsVerfahrenangewandt.HierfürwurdeparallelzumChipeinePlatteausPDMS gegossen,welcheanschließendalsDeckelfürdenChipdiente.UmdiePlattezugießen wurdeeinGlas‐ObjektträgerebenfallsineineFormausAluminiumfoliegelegtundmit einerdünnenSchichtPDMSbedeckt.DerAuspolymerisierungsprozessbeiderPDMS‐ TeilewurdedurchErhitzenderMassenauf60°Cbeschleunigt.JenachDickederPDMS‐ SchichtdauertedieserVorgangzwischen35und40min.AnschließendwurdederPDMS‐ ChipvorsichtigvonderPlatineabgelöst,aufdievorbereiteteDeckelplattegelegtundfür 90minbei100°Cfinalausgehärtet.215 WenneineGlasplattealsDeckelfürdenPDMS‐Chipverwendetwurde,wurdederChip sofortauf100°Cerhitzt,bisdasMaterialvollständigauspolymerisiertwar.Nachdem AbziehendesPDMS‐ChipsvonderPlatinemusstesowohldieGlasplattealsauchder PDMS‐ChipmitSauerstoffplasmabehandeltundanschließendaufeinandergelegt werden.DurchdasSauerstoffplasmawurdendieOberflächenhydrophil,undaufgrund vonAdhäsionskräftenkameszueinerirreversiblenBindungzwischenPDMSund Glasplatte.215 4.7.2.3 Zu‐undAbläufe UmdieZu‐ undAbläufesicherindasPDMSeinbringenzukönnenwurdenzwei verschiedeneAnsätzeverfolgt.ZumeinenwurdenkurzeStückeeinerMetallkanüle währenddesVorgangsdespartiellenHärtens,nachdemAbziehendesChipsvonder Platine,indiePDMS‐Struktureingebrachtundanschließendmitausgehärtet.Über möglichstkurzeSchlauchstückemitLuer/Lock‐PrinzipwurdendieKanülenmitden MaterialundMethoden 65  Spritzenpumpenverbunden.AlternativwurdennachdemAushärtenderChips,bevor diesemitdenGlasplattenverschlossenwurden,LöcherandiemarkiertenStellen gestanzt.IndieseLöcherwurdeeindünnesSchlauchstückeingeführt,welchesübereine Perfusor‐LeitungmitdenSpritzenpumpenverbundenwurde. 4.7.2.4 WeitereVersuchsdurchführungen FürdieVersuchezurKapselherstellungwurdeeADF4(C16)inwässrigerLösungmiteiner Konzentrationvon4–6mg/ml(Kapitel4.5.1)ineine1mlFeindosierungsspritze überführt.AlsÖlphasewurdeentwederdasmittelviskoseSilikonölM100bzw.dasetwas viskosereSilikonölM500verwendet,welchesin5mlEinmalspritzengefülltwurde. AlternativwurdedasSilikonölM500mitToluolimVerhältnis1:1gemischt.DieSpritzen wurdeninSpritzenpumpendesTypsHarvard33eingebautunddiejeweiligen Schubgeschwindigkeitenmanuelleingestellt.ZuBeginnderVersuchewurde,umdas LayoutzuüberprüfenunddieFließgeschwindigkeitenderbeidenLösungeneinzustellen, anstattmitProtein‐mitPufferlösung(10mMTris/HCl,pH8)gearbeitet. FürdieBeschichtungderKanälewurdendiesemit500µlSigmacote®gespült, anschließendentleertundschließlichgetrocknet. 4.7.3 MolekulareGrößenausschlussbestimmungvoneADF4(C16)Kapseln UmZellenoderEnzymeerfolgreichinKapselnverpackenzukönnen,isteswichtigdie molekulareAusschlussgrößederKapselmembranzukennen.DieKapselhüllestellt hierbeieinesemi‐permeableMembrandar,durchdiedieverpacktenStoffevor AngriffendesImmunsystemsaberauchvorProteasensichergeschütztsind.Gleichzeitig könnendieverkapseltenStoffenichtausderKapselhinausdiffundieren,esseidenndie Hüllewirdgezieltbeschädigtoderabgebaut. FürdieBestimmungdesmolekularenGrößenausschlussesvoneADF4(C16)Kapseln wurdenFITC‐markierteDextraneverwendet.FürdiehierbeschriebenenVersuche wurdendreiverschiedeneDextraneverwendet,mitMolekulargewichtenvon3‐5kDa, 20kDaund40kDa.ProAnsatzwurde1µlderentsprechendenFITC‐Dextran‐ Stocklösung(40µg/µlinH2OMQ)zurwässrigenProteinlösunggegebenundanschließend durchHerstellungeinerEmulsionmitSilikonölindieKapselneingeschlossen(vgl. Kapitel4.7.1).DieKapselnwurdensowohlvoralsauchnachihrerÜberführungindie MaterialundMethoden 72   Abb.4.5:SchematischeDarstellungdesColloidalProbeSetups. (ModifiziertnachNeubaueretal,BiomaterSci2013(1),mitGenehmigungderRoyalSocietyofChemistry) FürdiemikromechanischeCharakterisierungvoneADF4Partikelnwurdedie ColloidalProbeTechniqueverwendet.HierfürwurdenandieCantilever(NSC12)Glas‐ KugelnmiteinemDurchmesservon20‐50µmmiteinemZwei‐KomponentenKlebstoff befestigt.VordemStartderMessungenwurdenalleverwendetenCantileverunter VerwendungvonGlassubstratenkalibriert.DieFederkonstantewurdehierbeinachdem hookeschenGesetzberechnet.223DieKraftspektrenwurdenanschließendnachder TheorievonHertz224ausgewertetunddiejeweiligenElastizitätsmodulnderPartikel berechnet.DieTheorievonHertzbasierthierbeiaufderAnnahme,dassessichbeiden gemessenenPartikelnumlinearelastischeKörperhandeltunddasssowohl ReibungskräftealsauchAdhäsionskräftezwischenderimmobilisiertenGlas‐Kugelund demzumessendenPartikelvernachlässigtwerdenkönnen. DasVerhältniszwischenderDeformationdesPartikels(d)undderaufgewendetenKraft (F)isthierbeiinGleichung2füreineKugel‐Kugel‐Geometriedargestellt.   d √ Gleichung2 IndieserGleichungstehtEfürdenrelativenE‐ModulundRfürdenrelativenRadius, welchenachGleichung3und4berechnetwurden,wobeiνdiePoissonzahlist.Für eADF4PartikelwirdhiereinWertvon0,5angenommen.DieIndizesstehenhier stellvertretendfürdieGlas‐KugelamCantileverunddiezumessendenPartikel.        Gleichung3         Gleichung4 MaterialundMethoden 73  DieBestimmungderPartikeldurchmessererfolgtebeidiesenMessungenmikroskopisch. FürdieVersuchsdurchführungenwurden5µleADF4Partikel(5mg/ml)inmit Polyethylenimin(PEI)beschichteteGlaspetrischalen(Durchmesser2cm,Höhe0,5cm) pipettiertundmehrmalsvorsichtigmitH2OMQgewaschen.DieBeschichtungmitPEI dienthierbeiderverbessertenAdhäsiondernegativgeladeneneADF4Partikelander Glasoberfläche.FürdieMessungenimhydratisiertenZustandwurdendiePartikelinder Petrischalemit1,5mlH2OMQüberschichtet.FürdieMessungenunterdehydratisierten BedingungenwurdendiePartikelüberNachtindertrockenenPetrischalegelagertund amnächstenTagdaringemessen. 4.9.5.3 DirekteKraft‐MessungenmittelsderColloidalProbeTechnique DurchdirekteKraft‐MessungeninKugel‐Kugel‐Geometrie(Abb.4.5),können InformationenzumAdsorptionsverhaltenvonPartikelngewonnenwerden(kolloidale Eigenschaften).222Diesgeschieht,ebensowiebereitsfürdiemechanischenMessungen beschrieben,indemdieaufdenCantilevereinwirkendenKräftegemessenwerden. HierfürwirdderCantileverindirektenKontaktzurProbegebrachtundanschließend wiederentfernt.DurchAuftragendergemessenenAuslenkunggegendieHöhe,erhält maneinetypischeKraft‐Abstandskurve(Abb.4.6)eineridealelastischenProbe,welche inmehrerePositionenunterteiltwerdenkann:225  Abb.4.6:Ideale,mittelsAFMaufgenommeneKraft‐Abstandskurve.DieroteLiniesymbolisiertdie AnnäherungdesCantileversandieProbe,diegraueKurvedieRückstellungdesCantileversvonderProbe. 1)DerCantileverinteragiertaufgrundderEntfernungnichtmitderProbe.2)Aufgrundvonattraktiven WechselwirkungennähertsichderCantileverandieProbean,bis3)derSchwellenwerterreichtwird. 4)VerweildauerdesCantilever.5)DieattraktivenWechselwirkungendesCantileversmitderOberfläche werdenüberwunden.6)DerCantileveristsoweitvonderProbeentfernt,dassdieGrundliniewieder erreichtwird. MaterialundMethoden 74  BefindetsichderCantileverweitentferntvonderProbe,kanndiesernichtmitderProbe interagierenundsomitistkeineAuslenkungmessbar(1).VerringertmandenAbstand zurProbe,kommtmanzueinemPunkt,andemsichderCantileveraufgrundvon attraktivenWechselwirkungenzurProbehinbiegtundinKontaktmitderOberflächetritt (2).DerCantileverwirddaraufhinweiterandieProbeangenähert(3),bisder sogenannteSchwellenwert(triggerpoint)erreichtwird(4).Hierkanneszueiner möglichenVerweildauer(dwelltime)desCantileverkommen,umdasAusbildenvon BindungenoderUmstrukturierungenzuermöglichen.Dieswarfürdiehier durchgeführtenMessungenallerdingsnichtnotwendig.Anschließendwirdder CantileverwiedervonderProbeentferntbiseinPunkterreichtist,andemdie RückstellkräftedesCantileversdieattraktivenWechselwirkungenmitderOberfläche überwinden(5).AndiesemPunktunterscheidensichdieAnnäherungs‐ unddie Rückstellkurve,wodurchInformationenzudenAdhäsionskräftenderOberfläche gewonnenwerdenkönnen.EntferntmandenCantilevernochweitervonderProbe, wirddieAusgangsgrundliniewiedererreicht(6).226,227 MitHilfedieserMethodekönnenunterschiedlicheBereichederPartikeldefiniert werden,wodurchsichmöglicheAnwendungsgebiete(Wirkstofftransport,‐Lagerung,‐ Schutz,partikelverstärkteKompositmaterialien)fürdieanalysiertenPartikelergeben. FürdieDurchführungderdirektenKraftmessungenwurdeebenfallsdie ColloidalProbeTechniqueverwendet.HierfürwurdenspezielleCantilever(NSC12)ohne Spitzeverwendet,welcheeineFederkonstantevon0,3N/mbesaßen.Fürdie ColloidalProbeTechniquewurdensiegesäubertundmitSauerstoffplasmabehandelt, anschließendwurdendieSilikat‐PartikelandenCantilevergeklebt.Hierfürwurdeein spezieller,unterUV‐LichtaushärtenderKlebstoffverwendet.DerCantilevermitdem immobilisiertenPartikelwurdealsfinalerSchrittfürzweiStundengesintert.228Diezu analysierendeneADF4(C16)bzw.Silikat‐PartikelwurdenfürdieseMessungenaufeiner Glasplatteimmobilisiert.HierfürwurdedieGlasplattedurchUltraschallbehandlungin einer2%igenHellmanex‐Lösungbei40°Cundeineranschließenden UltraschallbehandlungineinemIsopropanol/Wasser‐Gemisch(v/v=3:1)bei RaumtemperaturgereinigtundanschließendmiteinerMischungausH2OMQ, HydrogenperoxidundAmmoniak(v/v/v=5:1:1)bei80°Cfür20mininkubiert.Die MaterialundMethoden 75  SilanisierungderGlasplatteerfolgteüberNachtmit3‐ Aminopropyldiisopropylethoxysilan(ABCR)imAnschlussaneineO2‐PlasmaBehandlung. UmdieSilanisierungzuvervollständigenundunreagiertesSilanzuentfernen,wurden diebehandeltenGlasplattenmitEthanolgespültundanschließendfürzweiStundenauf 80°Cerhitzt.FürdieMessungenwurdeeinGemischausder eADF4(C16)PartikelsuspensionundderSilikat‐Partikelsuspension(Standard)aufden silanisiertenGlasträgergetropftundgetrocknet.VorjederMessungwurdendiePartikel fürzweiStundeninderjeweiligenElektrolytlösungequilibriert.DieKugel‐Kugel‐ MorphologiebefandsichwährendderMessungenineinerhalbgeschlossenen Flüssigkeitszelle.ProeADF4(C16)Partikelwurden50Kraft‐Abstandskurvenmiteiner Geschwindigkeitvon800nm/sundeinerKraftvon15‐20nNaufgenommen.Hierfür wurdedieFederkonstantedesCantileversaufGrundlagedesthermischenRauschens bestimmt.223DieerhaltenenDatenwurdenanschließendaufdeneffektivenRadiusReff normiert,welchersichausdenRadienderSilikat‐PartikelunddereADF4Partikel zusammensetzt(Gleichung5).      Gleichung5 R1beziehtsichaufdenRadiusdesamCantileverimmobilisiertenPartikelsundwurde durchLichtmikroskopiebestimmt.R2istderRadiusdesaufdemGlassubstrat immobilisiertenPartikelsundwurdesowohlkraftmikroskopischaussogenannten ForceMapsüberdieBestimmungderPartikelhöhe,alsauchlichtmikroskopisch bestimmt.DieBerechnungdesPotentialsderdiffusenSchichterfolgtedurchFittenauf BasisderPoisson‐BoltzmannGleichung.229DieSteifigkeitdereADF4(C16)Partikelwurde unterVerwendungderGleichung6berechnet.BeiceADF4undcSiOxhandeltessichumdie KraftantwortendesCantilevers,wennerinKontaktzudenimmobilisiertenPartikeln kommt,230kcistdieFederkonstantedesCantilevers.      Gleichung6 DieOberflächentopographiederPartikelkannimhydratisiertenZustanddurchAFM bestimmtwerden.HierfürwurdedasAFMMFP‐3D,miteinemSilikon‐NitritCantilever MaterialundMethoden 76  (Federkonstante0,24N/m)undeinerResonanzfrequenzvon56kHz,imTappingMode verwendet. 4.10 Materialanalysen DieDSC‐ undTGA‐MessungenwurdenamLehrstuhlfürPolymereWerkstoffeder UniversitätBayreuthvonUteKuhndurchgeführt.DieMessungenzurWasseraufnahme und‐AbgabevoneADF4(C16)PartikelnerfolgtendurchElisaAgostiniamLehrstuhlfür PharmazeutischeTechnologieundBiopharmazie(LMUMünchen). 4.10.1 DynamischeDifferenzkalorimetrie(DSC) DieDynamischeDifferenzkalorimetriedientderBestimmungvontemperaturabhängigen VeränderungenimMaterial.IndieserArbeitsolltederEinflussvonphysikalischerund chemischerVernetzungaufdieMaterialeigenschaftendereADF4Partikelanalysiert werdenunddiethermaleZersetzungstemperaturTmbestimmtwerden.Hierfürwurden 5‐7mgeADF4PartikelinAluminiumtiegelunterStickstoffatmosphäremiteinerHeizrate von5°C/minineinemSDTA821eDifferentialScanningCalorimeterauf400°Cerhitzt. DiesesGerätistmiteinemKeramik‐Sensormiteinem56‐fachenAu‐Au‐Pd‐ Thermoelementausgestattet.VordemStartderMessungwurdendieProbenzuerstauf 110°Cerhitzt,umWasserrestezuentfernen.NachEinstellungeinesGleichgewichts (10min)wurdendieProbenauf‐40°Cabgekühlt,darananschließenderfolgtedie eigentlicheMessung. 4.10.2 ThermogravimetrischeAnalyse(TGA) DurchdiethermogravimetrischeAnalysevonPartikelnistesmöglich,die MassenänderungderProbeinAbhängigkeitvonderTemperaturundderZeitzu bestimmen.Hierfürwurdenca.10mgPartikelaufBasisdesrekombinanten SpinnenseidenproteinseADF4inAluminiumoxid‐TiegelüberführtundmiteinerHeizrate von10°C/minunterStickstoffatmosphäre(50ml/min)von25°Cauf800°Cerhitzt.Die GenauigkeitderMikrowaagebetrug1µg.FürdieAuswertungwirddasGewichtder ProbeaufdenAnfangswertnormiertundsomitnurdieÄnderungderMasse(%) angegeben. MaterialundMethoden 77  4.10.3 Wasseraufnahmeund–abgabedereADF4(C16)Partikel FürvieleAnwendungsgebietedereADF4(C16)PartikelistihrQuellverhaltenvon Interesse.Umsicherzustellen,dassdasQuellverhaltenderPartikelvollständigreversibel ist,wurdedieWasseraufnahmeund–abgabein10Zyklenanalysiert.Hierfürwurdeein Feuchtigkeitsanalysegerät(IGASorp)verwendet,welchesübereineMikrowaagen‐ Auflösungvon0,1µgverfügtundeineminimaleFeuchtigkeitsänderungvon0,2% durchführenkann.20mgdehydratisierteeADF4(C16)Partikelwurdenbeieiner konstantenTemperaturvon25°CundunterkonstanterStickstoffatmosphäreinkubiert, wobeigleichzeitigdierelativeLuftfeuchtigkeitvon0auf90%erhöht(Wasseradsorption derPartikel)undanschließendwiedergesenktwurde(WasserdesorptionderPartikel). zehnAdsorptions‐undDesorptionszyklenwurdenfürjedeProbedurchgeführt. 4.10.4 ZetapotentialundElektrophoretischeMobilität DieAbhängigkeitendesZetapotentialsvonderIonenstärkeundvompH‐Wertwurden vonNicolasHelfricht(LehrstuhlPhysikalischeChemieII,UniversitätBayreuth)gemessen. EinewichtigeMethodezurOberflächencharakterisierungvonPartikelnistdie BestimmungderelektrophoretischenMobilitätinAbhängigkeitvonderIonenstärkeund despH‐WertesmittelsMikroelektrophorese.HierbeiwanderndiePartikelineiner flüssigenPhasenachAnlegeneineselektrischenFeldes.AusderGeschwindigkeitdieser BewegungkanndieMobilitätbestimmtwerden;hierfürmussaufdasangelegte elektrischeFeldnormiertwerden.UmdieLadungderPartikelausihrerMobilität berechnenzukönnen,werdenjenachGrößeundEigenschaftenderPartikel verschiedeneModelleverwendet.MitihrerHilfelässtsichdasZetapotential,alsodas PotentialanderScherebene,berechnen,welchesimGegensatzzum OberflächenpotentialderPartikelvomelektrischenFeldabhängigist.231,232 DasZetapotentialunddieelektrophoretischeMobilitätvoneADF4(C16)Partikeln wurdenaneinemZetaviewPMX100(LehrstuhlPhysikalischeChemieII,Universität Bayreuth)bestimmt.DiesesGerätistmiteinemLaser‐StreulichtVideo‐Mikroskop ausgestattet,wodurchdiesichinderMesszellebewegendenPartikelinEchtzeit beobachtetwerdenkönnen.UmdenEinflussderchemischenVernetzungundder BeladungderPartikelaufdasZetapotentialzubestimmen,wurdensowohlbeladeneals MaterialundMethoden 78  auchunbeladenePartikelineinerKonzentrationvon5µMinH2OMQresuspendiert.2ml derPartikelsuspensionwurdenproMessungindieMesszelleinjiziert,wobeijedeProbe dreiMalgemessenwurde.AusdenWertenderelektrophoretischenMobilitätwurde mittelsderTheorievonSmoluchowski231dasZetapotentialderPartikelberechnet. UmdieAbhängigkeitderelektrophoretischenMobilitätvompH‐Wertundder Ionenstärkezubestimmen,wurdendiesemitKCl,HClundNaOHeingestellt.DiepH‐ abhängigeelektrophoretischeMobilitätwurdefürpH‐WertezwischenpH2undpH12 fürzweiverschiedeneKonzentrationen(1mMund10mM)bestimmt.DieAbhängigkeit derelektrophoretischenMobilitätvonderIonenstärkewurdebeipH5,5undpH10 gemessen.FürdieAuswertungderdarausgewonnenenDatenwurdedieTheorienach O´BrienundWhite,welcheaufeinemAlgorithmusvonHunterbasiert,verwendet.231,232 4.11 Sterilisationsmethoden 4.11.1 Gammastrahlen‐undEthylenoxid‐Behandlung DieBehandlungdereADF4(C16)PartikelmitGammastrahlenundEthylenoxid,ebenso wiedieBestimmungderVorverkeimung,wurdevonderFirmaLohmann&Rauscher GmbH&Co.KG(Neuwied,Deutschland)durchgeführt. HierfürwurdendieeADF4(C16)PartikeldurchPräzipitationmitKaliumphosphataus wässrigerLösunghergestellt,dreimalmitdestilliertemWassergewaschenund anschließendgefriergetrocknet.DielyophilisiertenPartikelwurdenvonderFirma Lohmann&RauscheraufihreVorverkeimunghinuntersuchtundanschließendmit unterschiedlichenGamma‐Strahlungsintensitäten(0‐50kGy)bzw.Ethylenoxid behandelt.FürdieGammastrahlen‐BehandlungwurdedasProteinin1,5mlEppendorf ReaktionsgefäßengelagertundmitCo‐60alsStrahlungsquellebestrahlt.Beiden angegebenenStrahlungsintensitätenhandeltessichumdieMinimalwerte,dieerreicht werdensollten.FürdieBehandlungmitEthylenoxidwurdedasProteininspezielle Plastikfolienüberführt,eingeschweißtundanschließendbegast. DieBestimmungderVorverkeimungerfolgtegemäßdervom„EuropäischenArzneibuch zurPrüfungvonProduktenaufAnwesenheitvonBakterien“empfohlenen Membranfilter‐Methode.HierfürwurdendiePartikelin0,9%NaClund0,02%Tween80 MaterialundMethoden 79  resuspendiertundanschließenddurcheinenMembranfiltermiteinerPorengrößevon 0,45µmfiltriert.DieserFilterwurdeaufeinenCASOAgargelegtundfürvierTagebei 32,5°Cinkubiert.DieAuswertungderkeimbildendenEinheiten,welcheaufdemAgarzu findenwaren,erfolgtelichtmikroskopisch. Ergebnisse 81  5 Ergebnisse 5.1 HerstellungundchemischeVernetzungvoneADF4Partikeln DieHerstellungvoneADF4PartikelnerfolgtdurcheinenAussalzungsprozessaus wässrigerProteinlösung.HierbeikannderDurchmesserderPartikeldurchdie ProteinkonzentrationsowiedurchdieMixintensitätwährenddesFällungsprozesses eingestelltwerden.DurchResuspendierendereADF4(C16)Lösungmitkosmotropen Salzen,z.B.Kaliumphosphat,werdenProteinpartikelerzeugt,derenDurchmesser kleinerals1µmsind.GrößerePartikelmiteinemDurchmesservonüber1µmwerden durchDialysederwässrigenProteinlösunggegen1‐2MKaliumphosphat hergestellt.103,104 FürdieBestimmungdermechanischenEigenschaftenderPartikel,ebensowiefürdie CharakterisierungihrerOberflächenladung,wurdenPartikelmiteinermittlerenGröße von1bis3µmverwendet,fürdieBeladungs‐ undFreisetzungskinetiken,Partikelmit einemmittlerenDurchmesservon400‐600nm. Esistbereitsbekannt,dasseADF4(C16)PartikelmitverschiedenenMolekülenbeladen unddieseMoleküleanschließendwiederfreigesetztwerdenkönnen.102,133Umdie zugrundeliegendenProzessebesserverstehenundbeeinflussenundzudemdie EigenschaftenderPartikelkontrollierenzukönnen,wurdeneADF4(C16)Partikel chemischvernetzt.AufgrundderAminosäuresequenzvoneADF4(C16)eignetsich hierfüreinbereitsetabliertes,aufRubpyundAPSbasierendes,System (Kapitel4.6.2).209,233BeidieserlichtinduziertenVernetzungsstrategiewirkenRubpyund APSalsInitiatoreneinerradikalischenReaktion,wodurcharomatischeAminosäuren vernetztwerden.RubpywirdbeidieserVernetzungsstrategieinAnwesenheitvonAPS photolysiert,wodurchRu(III)entsteht,einein‐Elektronen‐Oxidant.Diesesoxidiert Aminosäurereste,beieADF4(C16)z.B.Tyrosine,wodurchTyrosin‐Radikaleals ZwischenprodukteeinerradikalischenReaktionentstehen(vgl.Abb.4.1).Fürdas EinbringenderStartermoleküleRubpyundAPSindiePartikeleignensichzwei verschiedeneRouten(Abb.5.1).ZumeinenkönnenRubpyundAPSzusammenmitdem ProteinausderwässrigenLösungco‐präzipitiertwerden(CL_Fällung,Abb.5.1A),zum anderenkönnendieMoleküleindiefertigausgebildetenPartikeleindiffundieren Ergebnisse 88   Abb.5.7:ElektrophoretischeMobilitätvoneADF4(C16)PartikelninAbhängigkeitvondempH‐Wert(A) undderIonenstärke(B).DiepH‐abhängigeelektrophoretischeMobilitätwurdebeizweiIonenstärken bestimmtunddieAbhängigkeitderelektrophoretischenMobilitätvonderIonenstärkebeizwei verschiedenenpH‐Werten(NicolasHelfricht,PhysikalischeChemieII,UniversitätBayreuth). (ModifiziertnachHelfrichtetal,BiomaterSci2013(1),mitGenehmigungderRoyalSocietyofChemistry) AnstattaufdieTheorievonSmoluchowskizurückzugreifen,wurdediesenMessungen dieTheorievonO`BrienundWhitezugrundegelegt.232CharakteristischfürdieseTheorie istdasgemesseneMinimumderelektrophoretischenMobilitätalsFunktionvonder Ionenstärke(Abb.5.7B).DieTheorievonO´BrienundWhitehatzusätzlichdenVorteil, dassdieRelaxationseffektederumgebendenIonenwolkemitberücksichtigtwerden.Des WeiterenwurdebeidendurchgeführtenMessungenberücksichtigt,dasseszueiner VarianzinderOberflächenzusammensetzungdereADF4(C16)Partikelkommenkann. DieseVarianzistinAbb.5.7durchdiefarbigenFlächendargestelltundstellteine Variabilitätvon30%(ΓmobMinimumundMaximum)dar.DiefarbigenLinien repräsentierendieausdenWertenfürΓmobberechnetenWertefürdie elektrophoretischeMobilität,ebenfallsnachderTheorievonO`BrienundWhite,wobei beiallenBerechnungenimmereinkonstanterPartikeldurchmesservon2,8µm angenommenwurde. DieelektrophoretischeMobilitätdereADF4(C16)PartikelinAbhängigkeitvonder Ionenstärke(Abb.5.7B)entsprichtdentheoretischenWertennachO`BrienundWhite, sodassderenTheorieaufdieeADF4(C16)Partikelanwendbarist.Dieexperimentellen WertesindinBezugaufdieelektrophoretischeMobilitätgeringeralsdietheoretischen. DieseAbweichungengehenaufeinediePartikelumgebendediffuseSchichtzurück,die bereitsfürandereMaterialienbeschriebenwurde.236,237 Ergebnisse 89  InsbesondereimsaurenpH‐BereichstimmendieberechnetenWertefürdie elektrophoretischeMobilitätinAbhängigkeitvompH‐Wertgutmitdenexperimentell ermitteltenüberein(Abb.5.7A).DienegativenWertederelektrophoretischenMobilität nehmenmitsteigendempH‐Wertweiterzu,wobeiabneutralempH‐WerteinPlateauzu beobachtenist.DiesestheoretischePlateauimneutralenpH‐Bereichkonntejedochbei demverwendetenVersuchsaufbauexperimentellnichtnachgewiesenwerden.Aufgrund dessehrbasischenpKaderTyrosinekonntejedochdasPlateauimBasischenbestimmt werden. ProteinpartikelweisenamäußerenRandalszusätzlichesterischeKomponenteeine diffuseSchichtauf.236,237Umdiese,diePartikelumgebende,diffuseSchichtauch experimentellnachzuweisen,wurdedieColloidalProbeTechniqueverwendet (Kapitel4.9.5).MitHilfeeinesimmobilisiertenSilikat‐Partikels(Abb.5.8A,orange)am CantileverwerdendieGrenzflächeneigenschaftendereADF4(C16)Partikel(grün)undals VergleichsgrößedieEigenschaftenvonSilikat‐Partikelnbestimmt(Abb.5.8A).  Abb.5.8:A)REM‐AufnahmederimmobilisiertenSilikat‐(orange)undeADF4(C16)Partikel(grün)unddes ColloidalProbeAufbausB)RepräsentativeKraftprofilefürdieInteraktionzwischenSilikat‐Silikat‐Partikeln undzwischenSilikat‐eADF4(C16)PartikelnbeipH5,5undeinerIonenstärkevon1mM.Dieverwendeten FitsgehenaufdiePoisson‐BoltzmannGleichungzurück,welchedreiverschiedene Grenzflächenbedingungenberücksichtigt:konstanteLadung(CC),konstantesPotential(CP)unddie RegelungderLadung(CR)(NicolasHelfricht,PhysikalischeChemieII,UniversitätBayreuth). (ModifiziertnachHelfrichtetal,BiomaterSci2013(1),mitGenehmigungderRoyalSocietyofChemistry) InAbb.5.8Bwirddeutlich,dassdieInteraktionsprofilezwischendenSilikat‐ undden eADF4(C16)PartikelnimVergleichzureinenSilikat‐SilikatInteraktionsprofilen Ergebnisse 90  komplexersind.BeireinenSilikat‐SilikatInteraktionsprofilenspieltlediglichdie ElektrostatikeineRolle,wasdurchdenlinearenKurvenverlaufindersemi‐ logarithmischenDarstellungverdeutlichtwird.DieabgebildetenWechselwirkungsprofile sindaufdeneffektivenRadiusderPartikelnormiert(Abb.5.8B). DaskomplexeWechselwirkungsprofilzwischeneADF4(C16)PartikelnundSilikat‐ PartikelngehtaufunterschiedlicheInteraktionenzwischendenPartikelnzurück. AufgrunddersphärischenFormderPartikellassensichdurchdie ColloidalProbeTechniqueverschiedeneBereichedereADF4(C16)Partikelverdeutlichen. NähertmandenCantileverlangsamandenPartikelan,sokannabeinemAbstandvon ca.50nmeineerstekraftspektroskopischeReaktiondesCantileversdetektiertwerden, eshandeltsichhierbeiumdenBereichderdiffuseSchicht(I).UmdasPotentialdieser diffusenSchichtberechnenzukönnen,wurdendieWechselwirkungskräftezwischen Silikat‐Partikelnbestimmt(symmetrischerFall).ÜberdieseWertekanndaraufhindas PotentialdereADF4(C16)Partikelbestimmtwerden,welchesüberdie WechselwirkungskräftezwischenSilikat‐PartikelundeADF4(C16)Partikelanalysiertwird (asymmetrischerFall).DurchweiteresAnnäherndesCantileversandiePartikel,kommt eszusterischenInteraktionen(II).DerBeginndiesesBereicheswirddurchdie gestricheltevertikaleLinieinAbb.5.8Bsymbolisiert.NähertmandenCantileverdem Partikelweiteran,sokommteszueinermechanischenDeformationdesPartikels(III), welchebereitsdurchdiemikromechanischenCharakterisierungendereADF4Partikel beschriebenwurde(Kapitel4.9.5.2). 5.2.5 ChemischeStabilitätdereADF4(C16)Partikel EskonntebereitsanhandanderereADF4(C16)Morphologien(HydrogelenundKapseln) gezeigtwerden,dassdiechemischeVernetzungderProteineEinflussaufihre BeständigkeitgegenüberLösungsmittelhat.100,210,211EinpotentiellerEinflussder chemischenVernetzungaufeADF4(C16)Partikelwurdehingegenbishernichtanalysiert. AusdiesemGrundwurdensowohlvernetztealsauchunvernetzteeADF4(C16)Partikelin verschiedenenLösungsmittelnbiszu25hinkubiert(Tab.5.2)(Kapitel4.6.3).Eskann keinUnterschiedzwischenvernetztenPartikelderzweiverschiedenenRouten Ergebnisse 91  beobachtetwerden,weshalbdieErgebnissederzweiVernetzungsrouteninTab.5.2 unter„vernetztePartikel“zusammengefasstdargestelltsind. Tab.5.2:ChemischeStabilitätvernetzterundunvernetztereADF4(C16)Partikel.„‐“bedeutetdiePartikel wurdeninnerhalbderangegebenenZeitvollständigaufgelöst,eskonntenkeinePartikelmehr sedimentiertwerden.„+“kennzeichnetPartikel,dienachderangegebenenZeitnochstabilvorlagenund sedimentiertwurden. (ModifiziertnachBlüm&Scheibel,BioNanoSci2012(2),mitGenehmigungderSpringerScience+BusinessMedia) LösungsmittelvernetztePartikel 6h25h unvernetztePartikel 6h25h 6MGdmSCN ++‐‐ 100%Ameisensäure++‐‐ 100%HFIP++‐‐ 8MGdmCl++++ 10mMTris‐Puffer (pH8) ++++  VernetzteeADF4(C16)PartikelsindinallenverwendetenLösungsmittelnstabil (Tab.5.2).DieunvernetztenPartikelwurdenvon6MGdmSCN,AmeisensäureundHFIP innerhalbkurzerZeitvollständigaufgelöst,sodasskeinePartikelmehrsedimentiert werdenkonnten.Sowohl8MGdmClalsauch10mMTris‐Pufferzeigenkeine AuswirkungenaufdiePartikelstabilität. UmeinenEindruckvondenPartikeloberflächennach25StundenInkubationderPartikel indenverschiedenenLösungsmittelnzuerhalten,wurdendiesesedimentiert, getrocknetundelektronenmikroskopischanalysiert(Abb.5.9).Diedehydratisierten PartikelwurdenhierfürmitPlatinbesputtert. Ergebnisse 92   Abb.5.9:ElektronenmikroskopischeAnalysederaufihrechemischeStabilitäthinuntersuchten, vernetztenundunvernetzteneADF4(C16)Partikel,nach25StundenInkubationinverschiedenen Lösungsmitteln.PartikelbeiderVernetzungsroutenwurdenanalysiert(vgl.Abb.5.1).DieMaßbalken entsprechen300nm. NachInkubationderPartikelindenverschiedenenLösungsmittelnkann elektronenmikroskopischkeineVeränderunganderOberflächenbeschaffenheitder nicht‐denaturiertenPartikeldetektiertwerden.DieOberflächederPartikelistglattund diePartikelzeigeneinerundeForm,unabhängigvomverwendeten Denaturierungsmittel.Diein10mMTris‐PufferinkubiertenPartikeldienenhierbeials Kontrolle.DurchdiechemischeVernetzungkannsomit,unabhängigvonder verwendetenVernetzungsroute,eineverbessertechemischeStabilitätderPartikel erreichtwerden. Ergebnisse 93  5.2.6 ThermischeStabilitätvoneADF4Partikel DieEigenschaftenvoneADF4PartikelnkönnensowohldurchdieBildungvondi‐ Tyrosinen,aufgrundderchemischenVernetzung,alsauchdurchdieKettenlängender Proteine(physikalischeVernetzung)beeinflusstwerden.ObdieseVernetzungsarten einenEinflussaufdiethermischeStabilitätderPartikelhaben,wurdeimFolgenden mittelsDSC(Kapitel4.10.1)undTGA(Kapitel4.10.2)analysiert(Abb.5.10).Unter VerwendungderdynamischenDifferenzkalorimetrieistesmöglich,dieabgegebeneund aufgenommeneWärmeenergiewährenddesAufheizensderPartikelnzudetektieren (Abb.5.10A,C,E). FüreADF4(C16)PartikelkanneinendothermesMaximumimWärmeflussbeica.310°C gemessenwerden,diesesMaximumistunabhängigvonderchemischen VernetzungsroutederPartikelerkennbar.AlleinAbb.5.10AdargestelltenKurvenweisen zusätzlicheinweiteresendothermesSignalbeica.100°Cauf.Diesesgehtauf verdampfendesWasserzurück,undwurdezusätzlichdurchTGA‐Messungenbestätigt (Abb.5.10B).DiesethermogravimetrischenAnalysenzeigtenebenfallskeinenEinfluss derchemischenVernetzungderProteineaufdiethermischeStabilitätder eADF4(C16)Partikel.DietemperaturabhängigenMasseänderungenvisualisiereneinen Masseverlustvonca.10%beimAufheizenderPartikelauf100°C,erstabeiner Temperaturvonca.280°CwirdeindeutlicherMasseverlustsichtbar.Zwischen280°C und350°CgehtderMasseanteildereADF4(C16)Partikelaufca.30%der Ausgangsmassezurück.DieserAbbauistaufdiethermischeZersetzungdes ProteinmaterialszurückzuführenundunabhängigvomchemischenVernetzungsgrad. Ergebnisse 94   Abb.5.10:ThermischeStabilitätvernetzterundunvernetztereADF4Partikel,analysiertmittelsDSC(A,C, E)undTGA(B,D,F).DieVersuchewurdenmiteADF4(C16)Partikeln(AundB),eADF4(C8)Partikeln(Cund D)undeADF4(C32)Partikeln(EundF)durchgeführt,umzusätzlichzumEinflussderchemischen VernetzungaucheinenmöglichenEinflussderMolekülkettenlängenundsomitderphysikalischen VernetzungaufdiethermischeStabilitätzudetektieren. (ModifiziertnachNeubaueretal,BiomaterSci2013(1),mitGenehmigungderRoyalSocietyofChemistry) UmdenEinflussderMolekülkettenlängederProteineaufdasthermischeVerhaltender Partikelzubestimmen,wurdefüreADF4(C8)bzw.eADF4(C32)ebenfallssowohlder Wärmefluss(Abb.5.10CundE)alsauchdieMassenabnahme(Abb.5.10DundF) analysiert.ImVergleichzueADF4(C16)warendieKurvenverläufeunverändert.Diedurch DSCaufgezeichnetenMaximaimWärmeflussvoneADF4(C16)Partikelnbeica.100°C und310°CsindauchbeieADF4(C8)undeADF4(C32)Partikelndetektierbar.DieTGA‐ Ergebnisse 95  MessungenergebenebenfallseineAbnahmederMasseum10%beica.100°Cdurch verdampfendesWasserunddiethermischeZersetzungzwischen280°Cund350°C. SomitwurdekeinEinflussderanalysiertenVernetzungsartensowieder MolekülkettenlängenderProteineaufdiethermischenEigenschaftendereADF4Partikel beobachtet. 5.2.7 MechanischeStabilitätvoneADF4Partikeln DiemechanischenEigenschaftenvonPartikelnsindfürvieleAnwendungenvon Bedeutung.AusdiesemGrundwirdmittelsderColloidalProbeTechnique (Kapitel4.9.5.2)dasDeformationsverhaltendereADF4(C16)Partikelbestimmt.Fürdie AuswertungderdadurchgeneriertenDatendientHertzalstheoretischesModell.224 AufgrunddesQuellverhaltensdereADF4(C16)PartikelinGegenwartvonWassersind UnterschiedeindenausdenKraft‐Abstands‐KurvenresultierendenElastizitätsmoduln derPartikelerkennbar.Dehydratisierte,unvernetzteeADF4(C16)Partikelweiseneinen mittlerenElastizitätsmodulimGiga‐Pascal‐Bereich(0,8GPa±0,5GPa)auf,hydratisierte, unvernetzteeADF4(C16)PartikelzeigeneinE‐ModulimMega‐Pascal‐Bereich (2,99MPa±0,04MPa). ZusätzlichwurdenErmüdungstestsmit51bzw.61Wiederholungensowohlan dehydratisierten(Abb.5.11A)alsauchanhydratisierteneADF4(C16)Partikeln (Abb.5.11B)durchgeführt.DiedehydratisierteneADF4(C16)Partikel(Abb.5.11A)zeigen hierbeieineVerschiebungdesKontaktpunktesderKraft‐Abstands‐Kurvenmit zunehmenderDeformationszahl.ZusätzlichnimmtdieSteigungderKraft‐Abstands‐ KurvenmitZunahmederDeformationenzu.DieseErgebnissedeutenaufeinnicht‐ elastischesVerhaltenderdehydratisierteneADF4(C16)Partikelhin.Diehydratisierten eADF4(C16)Partikel(Abb.5.11B)hingegenweisenbeiderAufnahmederKraft‐ Abstands‐KurveneinidealelastischesVerhaltenauf.AuchdieWiederholungder DeformationsexperimentezeigtkeineVeränderungenderKurven,sowohlder KontaktpunktalsauchdieSteigungderKurvenbleibennach61Wiederholungengleich. Ergebnisse 96   Abb.5.11:ErmüdungstestsaneADF4(C16)Partikelnimdehydratisierten(A)undhydratisierten Zustand(B)(MartinNeubauer,PhysikalischeChemieII,UniversitätBayreuth). (ModifiziertnachNeubaueretal,BiomaterSci2013(1),mitGenehmigungderRoyalSocietyofChemistry) VergleichtmandieausdenKraft‐Abstands‐Kurvenermitteltenmittleren ElastizitätsmodulnderhydratisiertenunddehydratisiertenPartikelwirdeinUnterschied deutlich(Abb.5.12).DermittlereE‐ModulderhydratisiertenPartikelbleibtnachüber 60WiederholungenkonstantaufdemAnfangswert,dermittlereElastizitätsmodulder dehydratisiertenPartikelsteigthingegenan.  Abb.5.12:ErmüdungstestsaneADF4(C16)Partikeln.VergleichendeDarstellungdermittleren Elastizitätsmodulnvonhydratisierten(n=17)unddehydratisierten(n=11)Partikeln(MartinNeubauer, PhysikalischeChemieII,UniversitätBayreuth). (ModifiziertnachNeubaueretal,BiomaterSci2013(1),mitGenehmigungderRoyalSocietyofChemistry) AlsnächsteswurdederEinflussderchemischenundderphysikalischenVernetzungauf dasmechanischeVerhaltenderPartikelimhydratisiertenZustand(Abb.5.13)ermittelt. DiedenElastizitätsmodulnentsprechendenGauß‐Fitssindinschwarzdargestellt.Der EinflusseinerchemischenVernetzungaufdieE‐Modulnhydratisierter eADF4(C16)PartikelistinAbb.5.13Azusammengefasst.DerMittelwertderE‐Moduln unvernetzterPartikelliegtbeica.3MPa.Dieserverschiebtsichnachchemischer VernetzungmitRubpyundAPSabhängigvondergewähltenVernetzungsroute.Werden Ergebnisse 97  dieVernetzermoleküledurchco‐PräzipitationindiePartikeleingeschlossen(CL_Fällung), verschiebtsichdermittlereE‐Modulhinzuca.5,5MPa,diffundierenRubpyundAPSin diebereitspräzipitiertenPartikel(CL_Diffusion),erhöhtsichderdurchschnittlicheE‐ Modulaufca.8,5MPa.ImdehydratisiertenZustandkonntekeinEinflussder chemischenundphysikalischenVernetzungaufdieElastizitätsmodulnderPartikel gemessenwerden.  Abb.5.13:ElastizitätsmodulndereADF4PartikelimhydratisiertenZustandmitzugehörigemGauß‐Fitin AbhängigkeitvonderchemischenVernetzung(A)undderMolekülkettenlänge(B)(physikalische Vernetzung)(MartinNeubauer,PhysikalischeChemieII,UniversitätBayreuth). (ModifiziertnachNeubaueretal,BiomaterSci2013(1),mitGenehmigungderRoyalSocietyofChemistry) NebendemEinflussderchemischenVernetzungaufdieE‐ModulndereADF4(C16) PartikelgibtesaucheinenEinfluss,deraufphysikalischeVernetzungzurückgeführt werdenkann(Abb.5.13B).DurchVerkürzenderKettenlängevon16Wiederholungen desC‐ModulsaufachtWiederholungen,verringertsichdermittlereE‐Modulder zugehörigenPartikelvonca.3MPafüreADF4(C16)Partikelaufca.2,5MPafür eADF4(C8)Partikel.EineVerdopplungderKettenlängevon16WiederholungendesC‐ Modulsauf32WiederholungenführtzueinerErhöhungdesmittlerenElastizitätsmoduls auf5,5MPafüreADF4(C32). SomitkannderEinflusseinerchemischenundeinerphysikalischenVernetzungaufdas mikromechanischeVerhaltenvonhydratisierteneADF4(C16)Partikelnbeobachtet werden. 5.3 BeladungundFreisetzungvonRhodaminBauseADF4(C16)Partikeln EinemöglicheAnwendungdereADF4(C16)PartikelliegtimBereichdes WirkstofftransportsundderkontrolliertenWirkstofffreisetzung.Ummodellhaftdie BeladungundFreisetzungvonWirkstoffenzutesten,wurdeneADF4(C16)Partikelmit Ergebnisse 104  DieErgebnissederSilberfärbungwurdenzusätzlichdurchWesternBlotbestätigt (Abb.5.18B)(Kapitel4.3.3).DadieNachweisgrenzebeieinemImmunoblotdeutlich unterhalbderSensitivitätderSilberfärbungliegt,könnenselbstgeringeProteinmengen nach35kGyGammabestrahlungnochsichtbargemachtwerden.DieEthylenoxid‐ BehandlungderPartikelführtzukeinergelelektrophoretischnachweisbaren DegradationderProteine.DieChemilumineszenzzurDetektiondesImmunoblotswird durchdieEO‐BehandlungimVergleichzumunbehandeltenProteinnochverstärkt. 5.4.2 Massenspektrometrie DieProteindegradationdurchGammastrahlenundderEinflussdesEthylenoxidswurden zusätzlichmassenspektrometrischanalysiert(Abb.5.19)(Kapitel4.4.4).Diedadurch erhaltenenSpektrengebenAufschlussüberdieArtdesProteinabbaus.  Abb.5.19:MALDI‐TOFSpektrenausgewähltersterilisiertereADF4(C16)Proteine.DasnachExPASy berechneteMolekulargewichtvoneADF4(C16)liegtbei47,7kDa. Ergebnisse 105  DiemassenspektrometrischenAnalysenmachendeutlich,dassdieGammastrahlendie Proteinedegradieren.InsbesonderederEinflussvonhohenStrahlungsdosen(50kGy) führtezueinemsehrstarkenAbbaudesProteins,sodasskeinMaximaimMasse‐ zu Ladungsverhältnis(m/z‐Verhältnis)mehrdetektiertwerdenkonnte.Ethylenoxidscheint aufdasm/z‐VerhältnisvoneADF4(C16)keinenEinflusszuhaben,dasMaximumistexakt bei47,7kDa,undsomitidentischzudemunbehandeltenProtein. 5.4.3 UV/Vis‐undFluoreszenzspektroskopie DieKonzentrationderProteinprobeninwässrigerLösungwurdeUV/Vis‐spektroskopisch bestimmt(Kapitel4.4.1)undanschließendalleLösungenaufdiegleiche Proteinkonzentrationeingestellt(1mg/ml).MitdiesenverdünntenProteinlösungen wurdendiefluoreszenzspektroskopischenAnalyseninwässrigerLösungdurchgeführt (Kapitel4.4.2). DieinAbb.5.20AgezeigtenUV/Vis‐SpektrendersterilisierteneADF4(C16)Partikel zeigeneinenfürProteinetypischenVerlaufmiteinemMaximumbei278nm.Die unterschiedlichenBestrahlungsintensitätenmitGammastrahlenebensowiedie BehandlungmitEthylenoxidführenzukeinerVeränderungimUV/Vis‐ Absorptionsspektrum.  Abb.5.20.SpektroskopischeAnalysendersterilisierteneADF4(C16)Partikel.A)UV/Vis‐SpektrenundB) FluoreszenzspektrenderAminosäureTyrosin. AuchdieFluoreszenzspektrenzeigeneinenfüreADF4(C16)ProteinetypischenVerlauf (Abb.5.20B).eADF4(C16)besitztproC‐ModulzweiTyrosine.FallseszueinemAbbau derProteinedurchdieSterilisationsvorgängekommt,kanndieserwedermitUV/Vis‐ SpektroskopienochmitFluoreszenzspektroskopienachgewiesenwerden.Die Ergebnisse 106  Aminosäuren,aufdiediespektroskopischenAnalysenzurückgehen,werdendurchdie SterilisationsversuchemitGammastrahlenundEthylenoxidnichtfürdieseMethoden nachweisbarverändert. 5.4.4 FTIR‐Spektroskopie DerEinflussderGammastrahlenaufeADF4(C16)PartikelwurdeimFolgendenFTIR‐ spektroskopischanalysiert(Abb.5.21A)(Kapitel4.4.3).ZusätzlichwurdederEinflussvon EthylenoxidaufdieSekundärstrukturderProteineuntersucht. BeiderATR‐MethodekanndiegenaueProteinmengeaufdemKristallnichtbestimmt werden,zudemkommteszuStreuungseffektenaufdenPartikeloberflächen.Umdiese EinflüssezuminimierenundvergleichbareSpektrenzuerhalten,wurdeeine GrundlinienkorrekturundNormierungderSpektrendurchgeführt. DieAufnahmevonFTIR‐Spektrendermitunterschiedlichen GammastrahlungsintensitätenundEthylenoxidbehandeltenPartikelineinem Wellenzahl‐Bereichvon1900‐800cm‐1ergabidentische,fürProteinemiteinemhohen ‐FaltblattanteiltypischeSpektren(Abb.5.21A).EswurdekeinUnterschiedzuden unbehandelteneADF4(C16)Partikeln(0kGy)beobachtet.Selbsteine Gammastrahlenintensitätvon50kGyzeigtekeinenEinflussaufdie SekundärstrukturanteilederrekombinantenSpinnenseidenproteine. AbhängigvonderVorverkeimungdereingesetztenProben,ergibtsichdiefürdieProben erforderlicheGammastrahlenintensität,umeinevollständigeSterilitätderProbenzu gewährleisten.FürdieSterilisationvonMedizinproduktenwirdmit Strahlungsintensitätenzwischen30und35kGygearbeitet.Diegetesteten50kGyliegen somitweitüberderüblicherweiseeingesetztenDosis. InAbb.5.21BbisDsinddiefürProteinewichtigenBereiche,derAmidI(Abb.5.21B)und derAmidIIBereich(Abb.5.21C),vergrößertdargestellt.Ebensowirdeinweiterer,für eADF4ProteinewichtigerBereichgezeigt,dieAbsorptionsbandederpoly‐Alanine, welcheeinemMaximumbei964cm‐1zugeordnetwird(Abb.5.21D).238Diese AbsorptionsbandensetzensichausüberlagertenBandendesPeptid‐Rückgratesundder AminosäureseitenkettenderProteinezusammenundkönnenSekundärstrukturen Ergebnisse 107  zugeordnetwerden.238DieAbsorptionsbandenderdreiBereicheweisenauchnachder BehandlungderPartikelmitGammastrahlenundEthylenoxididentische,füreinen hohen‐FaltblattanteiltypischeMaximabeidenWellenzahlen1631cm‐1und1628cm‐1 imAmidIBereichund1528cm‐1und1520cm‐1imAmidIIBereichauf(vgl.Tab.4.3).  Abb.5.21:A)ÜbersichtsdarstellungderFTIR‐SpektrendersterilisierteneADF4(C16)Partikel. B)VergrößerteDarstellungdesAmidIBereichs,C)desAmidIIBereichsundD)desAbsorptionsbereichs derpoly‐Alanine.  5.5 HerstellungundCharakterisierungvoneADF4(C16)Kapseln 5.5.1 ModifizierteHerstellungvoneADF4(C16)Kapseln DieHerstellungvonKapselnausdemrekombinantenSpinnenseidenproteineADF4(C16) basiertaufeinembereitsfürToluolalsÖlphaseetabliertenProtokoll.100Inder vorliegendenArbeitwurdedasbestehendeProtokollfürdieVerwendungdes SilikonölsM100alsÖlphasemodifiziert(Abb.5.22)(Kapitel4.7.1).Beidem SilikonölM100handeltessichumeinmittelviskosesÖl,miteinerViskositätvonca. 130mPa.ImGegensatzdazuweistToluoleinesehrgeringeViskositätvonca.3mPaauf. Ergebnisse 108   Abb.5.22:SchematischeDarstellungdesmodifiziertenKapselherstellungsprozesses. DasmodifizierteKapselherstellungsprotokollbasiertaufderHerstellungeinerEmulsion ausderwässrigenProteinlösungundeinerÖlphase.DasProteindiffundiertandie GrenzflächezwischendemSilikonölunddemwässrigenTropfenundassembliertdort. DurcheinenzusätzlichenResuspensionsschrittmit50%Ethanolistesmöglich,stabile KapselnzugenerierenunddieseinWasserzuüberführen.ZweiweitereÖlewurdenfür dieHerstellungvonKapselnerprobt,dasniedrigviskoseSilikonölM5unddasebenfalls mittelviskoseSilikonölM500.SilikonölM5besitzteineähnlicheViskositätwieToluol, dennochkonntenkeinestabilenKapselnhergestelltwerden.AuchdasSilikonölM500 eignetsichnurbedingtfürdieKapselherstellung,dadurchdiehoheViskositätdesÖls (ca.500mPa)dieHerstellungeinerEmulsionerschwertwird.AusdiesemGrundwirdin dieserArbeitlediglichdieHerstellungvonKapselnmitdemSilikonölM100behandelt. DerEinschlussvonWirkstoffenstellteinebesondereHerausforderungbeider Kapselherstellungdar,denndieKapselnkönnennurdannalsSchutzhüllefungieren, wenndieeingeschlossenenSubstanzendieKapselhüllenichtpassierenkönnen.In Abb.5.22(rot)istdieVerpackungvonMolekülenschematischdargestellt.UmMoleküle sicherineADF4(C16)Kapselneinschließenzukönnen,werdenmögliche VerkapselungsproduktebereitszurwässrigenProteinlösung(Abb.5.22)hinzugegeben, sodassdiesewährenddesAssemblierungsvorgangesderProteineanderGrenzflächein derwässrigenPhasesindunddadurchindieneugebildeteKapseleingeschlossen werden. Ergebnisse 109  5.5.2 MikroskopischeCharakterisierungderKapseln NachderHerstellungderEmulsionkönnendieKapselnlichtmikroskopischinder Ölphasedetektiertwerden(Abb.5.23).  Abb.5.23:eADF4(C16)KapselninSilikonölM100nacheinemTag. KapselnauseADF4(C16)bestehenauseinemwässrigenKern,welchervoneinem dünnenProteinfilmumgebenist.InSilikonölunterscheidensiesichlichtmikroskopisch nichtvondeninWasserüberführtenKapseln(Abb.5.24).DieinAbb.5.24dargestellten KapselnwurdendurchdeninAbb.5.22beschriebenenVorgangausdemSilikonölin Wasserüberführt.  Abb.5.24:eADF4(C16)KapselninH2OMQ,direktnachdemTransferinWasser. OhnedenzusätzlichenResuspensionsschrittmit50%EthanolkonntenkeineinWasser stabilenKapselngeneriertwerden,sondernlediglichkleineProtein‐Filmstückeinder wässrigenPhasebeobachtetwerden.DieÜberführungsversucheohneEthanolerfolgten durchResuspensionderEmulsionmitWasser,durchkurzeZentrifugationsschritte (1min,100xg)inWasseroderdurchZugabevonEmulgatoren(u.a.Tween20)und anschließendemResuspendierenbzw.ZentrifugierenindiewässrigePhase. FluoreszenzmikroskopischeAufnahmenvonKapseln(Kapitel4.9.2),hergestelltaus eADF4(C16)undNHS‐Fluoreszein‐markiertemeADF4(C16)(Kapitel4.5.2)inWasser zeigen,dasssichdasProteinanderÖl‐Wasser‐Grenzflächeangelagerthatundzueinem Ergebnisse 110  Filmassembliertist(Abb.5.25A‐C).DurchCLSM(Kapitel4.9.4)konntebestätigtwerden, dasssichdasProteinanderKapselgrenzflächeangelagertunddorteinenFilmgebildet hat.Abb.5.25DzeigtdenQuerschnittdurchdieMitteeinereinzelnenKapsel.Hierbei wirddeutlich,dassdasfluoreszierendeProteinnuramAußenrandderKapselist,der wässrigeKernderKapselfluoresziertnicht.  Abb.5.25:MikroskopischeAufnahmenvonKapselnauseADF4(C16)undNHS‐Fluoreszein‐markiertem eADF4(C16)inWasser.A)LichtmikroskopischeAufnahme,B)FluoreszenzmikroskopischeAufnahmeund C)ÜberlagerungderbeidenAufnahmen.DerMaßbalkenindiesendreiAbbildungenentspricht50µm. D)CLSM‐AufnahmeeinereinzelnenKapsel.DerMaßbalkenentspricht10µm.  5.5.3 Membranpermeabilität DieBestimmungderPermeabilitätdereADF4(C16)Kapselnistbesondersfürdie VerpackungvonWirkstoffenoderEnzymenwichtig.AktiveStoffekönnendurchden EinschlussinKapselnnurdannerfolgreichvorderUmgebunggeschütztwerden,wenn sienichtdurchdiePorenderKapselhüllediffundierenkönnenbzw.wennProteasen oderähnlicheunerwünschteMolekülenichtindieKapselnhineingelangenkönnen.Für aufBasisvonToluolhergestellteeADF4(C16)KapselnwurdedieDurchlässigkeitder Kapselmembranbereitsdetailliertanalysiert.99,100DiemittlereAusschlussgrößeder Ergebnisse 111  Kapselmembranliegtbei27kDa(Kapitel4.7.3).UmmöglicheÄnderungenbedingtdurch dieUmstellungdesHerstellungsprozesseszuanalysieren,wurdendie eADF4(C16)KapselnbeiderHerstellungmitFITC‐Dextranunterschiedlichen Molekulargewichts(3‐5kDa,20kDaund40kDa)beladen.VorderÜberführungder KapselnausSilikonölinWasseristdeutlicherkennbar,dassalleKapselnbzw.wässrigen Tropfengrünfluoreszieren(Abb.5.26).DasumgebendeSilikonölverhindertdie DiffusionderfluoreszenzmarkiertenDextraneausdenKapseln.  Abb.5.26:eADF4(C16)KapselnmiteingeschlossenemFITC‐DextranverschiedenerGrößenin SilikonölM100undWasser.Maßbalken:50µm. NachdemTransferderKapselninWasserwurdenerneutmikroskopischeFluoreszenz‐ undHellfeld‐AufnahmenderKapselnerstellt(Abb.5.26).Hierbeiwurdedeutlich,dass lediglichdieKapselnFluoreszenzaufwiesen,welcheDextranemiteinem Molekulargewichtvonmindestens40kDaenthielten.DieFITC‐Dextrane,welcheein geringeresMolekulargewichtbesitzen,warenbereitsausdenKapselnhinausdiffundiert, sodassdieKapseln,diemit3‐5kDaFITC‐Dextranenund20kDaFITC‐Dextranenbeladen waren,keineFluoreszenzaufwiesen.    Ergebnisse 112  5.6 HerstellungvonKapselnmittelsMikrofluidik IndenbisherigenVersuchenzurKapselherstellungwurdeeinemanuelle EmulsionsherstellungmittelsPipetteverfolgt(Kapitel4.7.1).EinNachteildieser MethodeistdieinhomogeneGrößenverteilungderKapseln,diedurchdie ungleichmäßigeGrößenverteilungderEmulsionstropfengegebenist.AusdiesemGrund, undummöglichstkleineKapselnherzustellen,wurdeimFolgendeneinAnsatzzur HerstellungvoneADF4(C16)KapselnmittelsMikrofluidikverfolgt(Kapitel4.7.2).Neben denkleinenDimensionenderKapselnliegteinweitererVorteildieserMethodeinihrer KontinuitätundAutomatisierbarkeit,welchefürvieleAnwendungenwichtigist. ErsteVersuchezurHerstellungvonKapselnauseADF4(C16)undToluolunter VerwendungvonMikrofluidik‐KanalstrukturenwurdenvonMarkusHarasimwährend seinerDiplomarbeit(Prof.Bausch,LehrstuhlfürZellbiophysik,TUMünchen)verfolgt.239 HierbeikamesjedochzuProblemen,sodassdieKapselherstellungimMikrofluidik‐ MaßstabinderDiplomarbeitvonMarkusHarasimnichtabgeschlossenwurde. HiersolltedasSystemvonToluolaufSilikonölumgestelltundzusätzlicheinebestehende ProblematikdesAuslaufsausdenChipsgelöstwerden.EineNeuerungstelltdasLayout derKanalstrukturendar,beidemdieEmulsionstropfendurchAbreißenaneiner rechtwinkligenKantegebildetwerden.BeidiesemVerfahrenwirddieProteinlösung durcheinenimVergleichzumÖl‐ZuflussrelativkleinenKanalineinerT‐Kreuzungindas Öleingeleitet(Abb.5.27undAbb.5.28).DieProteinlösungbildetinderkontinuierlichen ÖlphasekleineTropfen,sobalddieentstehendeScherspannungdie OberflächenspannungderGrenzschichtübersteigt(Abb.5.27).DieGrößeder EmulsionstropfenwirdhierbeivondenFließgeschwindigkeitendesÖlsundder Proteinlösungbestimmt. Ergebnisse 113   Abb.5.27:Tropfenbildung(Puffer)anderT‐KreuzunginnerhalbderKanalstruktur.Maßstab:100µm. ImAnschlussandieT‐Kreuzung,sobaldsichdieTropfengebildethaben,wirdderKanal ingewundenerFormweitergeleitet(Abb.5.28).  Abb.5.28:EinfacheMikrofluidik‐KanalstrukturfürdieHerstellungvonKapselnauseADF4(C16). UnterVerwendungdieserStrukturistesgelungen,homogeneEmulsionstropfen (Puffer),miteinemDurchmesservonca.100µmherzustellen,welcheproblemlosdurch dieKanalstrukturfließen.UmkleinereTropfenherzustellen,müssenlediglichdie KanaldurchmesserverringertoderdieFlussratenerhöhtwerden.BeiVersuchenmit eADF4(C16)kamesimVergleichzudenVersuchenmitPufferteilweisezuAblagerungen desProteinsandenKanalwänden,wodurchdieserblockiertwurde.Dieskonntemit einerBeschichtungderKanalinnenseitendurchSigmacote®behobenwerden.Bei Sigmacote®handeltessichumeinchloriertesOrganosiloxan,welchesinHeptengelöst ist.EsreagiertmitdenSilanol‐GruppenderPDMS‐Oberflächenundbildeteinen Diskussion 121  6 Diskussion SpinnenseideverfügtüberaußerordentlicheEigenschaften,sowohlhinsichtlichihrer Mechanik26,27,41,240alsauchhinsichtlichihrernatürlichenBiokompatibilitätund Bioabbaubarkeit.240,241EinigedieserEigenschaftenfindensichauchinden verschiedenen,aufdemrekombinantenSpinnenseidenproteineADF4(C16)basierenden, Morphologienwieder. 6.1 eADF4PartikelalsWirkstofftransportsystem PartikelaufBasisvoneADF4(C16)eignensichu.a.alsWirkstofftransportsystemfür niedermolekularewasserlöslicheundwasserunlöslicheStoffe.101,102Durchdie kontrollierteWirkstofffreisetzungsollentoxischeNebenreaktionen,aufgrundvon kurzzeitigensehrhohenlokalenDosierungen,vermiedenwerden.117Eskonntebereits gezeigtwerden,dasseADF4(C16)Partikelerfolgreichmitunterschiedlichen Modellwirkstoffenbeladen,unddiese,jenachWirkstoffmolekülund Umgebungsbedingungen,wiederfreigesetztwerdenkönnen.102,105,133Sowohlder HerstellungsprozessderPartikel,alsauchihreBeladungs‐ undFreisetzungsvorgänge könnenausschließlichaufwässrigerBasisablaufen,undeskannauforganische LösungsmittelundhoheTemperaturen,wieesoftmalsbeiderVerarbeitungvon synthetischenPolymerenderFallist,242verzichtetwerden.98,102‐104Derbishererprobte BeladungsmechanismusdereADF4(C16)PartikelfürhydrophileWirkstoffeberuhtauf Diffusionsvorgängen,wodurchdiemaximaleBeladungdurchdas DiffusionsgleichgewichtzwischenPartikelundumgebendemMediumbestimmtwird.102 NebenderBeladungderPartikelistauchdieWirkstofffreisetzungdiffusionsgetrieben,102 siekannallerdingszusätzlichdurchproteolytischenVerdaudereADF4(C16)Proteine beschleunigtwerden.101DieBeladungderPartikelmithydrophobenWirkstoffenberuht aufco‐Präzipitation,ihreFreisetzungerfolgtausschließlichüberchemischeoder enzymatischeDegradationderPartikel.101 IndieserArbeitwurdeeineweitereBeladungsmethodeunterVerwendungderco‐ PräzipitationderPartikelmithydrophilenWirkstoffenerprobtundzudemderEinfluss einerchemischenundphysikalischenVernetzungderProteineaufdiePartikelundihre Diskussion 122  biochemischenEigenschaften,ebensowieaufderenWirkstoffbeladungs‐ und Wirkstofffreisetzungsverhaltenanalysiert. 6.1.1 EinflussderVernetzungaufeADF4(C16)Partikel ChemischeVernetzungsreaktionensindbeiPolymerenundBiopolymerenweit verbreitetumNetzwerkezuverfestigen,Porengrößenzubeeinflussenoderdie chemischeundenzymatischeStabilitätzuverändern.Benzochinonebeispielsweise, könnendurchAktivierungmitUV‐LichtNetzwerkeausbildenundsomitHydrogele bilden.243,244EinweiteresBeispielistdiephotoinitiiertePolymerisationvon Polyethylenglykolzumakroporösen,vernetztenHydrogelen.245Aberauchbei BiopolymerenistdiechemischeVernetzungeinweitverbreitetesWerkzeug.Durchdie VernetzungvonChitosanmitGlutaraldehydkönnensicheinigeEigenschaftenwie beispielsweisedieWasserabsorption,Hydrophobizität,Ionenpermeabilität,sowie chemischeundmechanischeEigenschaftendesMaterialsändern.246 FürdiechemischeVernetzungdesrekombinantenSpinnenseidenproteinseADF4(C16) eignetsicheinaufRubpyundAPSbasierendesSystem.HierbeiwirkenRubpyundAPS alsInitiatoreneinerradikalischenReaktion,welchezurVernetzungvonaromatischen Aminosäuren,beieADF4(C16)zurVernetzungvonTyrosinen,führt(Kapitel5.1und 4.6.2,Abb.4.1).209Eswurdebereitsgezeigt,dassdieseMoleküleunterschiedliche AssemblierungsformendesrekombinantenSpinnenseidenproteinsvernetzenkönnen, z.B.HydrogeleundKapseln,100,210,211unddadurchdiechemischeundenzymatische StabilitätdieserMorphologienverbessern.DesWeiterenkonnteanhandvon ZellkulturversuchenmitFibrinogengezeigtwerden,dassdasVernetzenvonHydrogelen mitRubpykeinenegativenAuswirkungenaufneonatalehumaneHautfibroblasten hat.247 NebenderchemischenVernetzungderProteinekannaucheinephysikalische VernetzungdieEigenschaftenderPartikelbeeinflussen.Unterschiedliche MolekülkettenlängenvoneADF4(C8),eADF4(C16)undeADF4(C32)könnenzu veränderteninter‐ undintramolekularenWechselwirkungenderProteineführen (Kapitel5.2.5,5.2.6und5.2.7). Diskussion 123  DasEinbringenderchemischenVernetzermoleküleRubpyundAPSindiePartikelmatrix wurdeanhandzweiverschiedenerRoutengetestet,co‐Präzipitationder VernetzermolekülemitdemProtein(CL_Fällung,Abb.5.1A)undEindiffundierenvon RubpyundAPSindiefertigausgebildetenPartikel(CL_Diffusion,Abb.5.1B)(Kapitel5.1). BeibeidenRoutenwareswichtig,dieVernetzungerstnachderPartikelassemblierung durchLichtzuinitiieren,wobeieinevorherigeAktivierungderVernetzungsreaktion lediglichzuamorpherAggregationführte.eADF4(C16)ProteineliegeningelösterForm unstrukturiert(randomcoil)vor,42,104wobeidieAusbildungderdi‐Tyrosinezueiner StrukturierungderProteinkettenführenkann,waswiederumdieLöslichkeitdes Proteinsherabsetzt. DiezweiunterschiedlichenVernetzungsroutenführtenzuPartikelnmitverschiedenen VernetzungsmusternunddarausresultierendenEigenschaften.Diechemische VernetzungbeeinflusstjedochnichtallePartikeleigenschaften.Hierkonntegezeigt werden,dassdieVernetzungderPartikelmitRubpyundAPSkeinenEinflussaufihre MorphologieoderSekundärstrukturhat(Kapitel5.2.1und5.2.3),dader VernetzungsprozesserstnachderPartikelassemblierunginitiiertwird.Diezusätzliche Ausbildungderdi‐Tyrosine,ebensowiedieverändertenMolekülkettenlängenunddie damiteinhergehendephysikalischeVernetzungderPartikel,hatzudemkeinen detektierbarenEinflussaufdiethermischeStabilitätderPartikel(Kapitel5.2.6). DurchdieVernetzungmitRubpyundAPSnimmtaberdiechemischeStabilitätder Partikeldeutlichzu(Tab.5.2).DurchdieBildungderdi‐Tyrosinekommteszur AusbildungvonzusätzlichenkovalentenBindungen,welchediePartikelstruktur stabilisieren.DieverwendeteVernetzungsroutehataufdieseBeobachtungenjedoch keinenEinfluss,eskönnenkeineUnterschiedezwischendenzweianalysiertenRouten detektiertwerden.DashatvieleVorteileinBezugaufmöglichetechnische Anwendungen.ChemischvernetzteeADF4(C16)Partikelsindnichtnurgegenüber wässrigenLösungenstabilsondernauchgegenübervielenorganischenLösungsmitteln (Tab.5.2).DadurchkönnendiePartikelauchinpartikelverstärktenKompositmaterialien zusammenmitsynthetischenPolymerenverwendetwerden. Diskussion 124  ZusätzlichzurchemischenStabilitätistfürvieleAnwendungenauchdiekolloidale StabilitätderPartikelinLösungvonBedeutung.BeiKolloidenhandeltessichum heterogeneSysteme,dieausmikroskopischkleinen,geladenenPartikelnbestehen, welchegleichmäßigverteiltineinemMediumvorliegen.VielewichtigeEigenschaften eineskolloidalenSystemshängendirektoderindirektmitderelektrischenLadungbzw. demelektrischenPotentialderPartikelzusammen.231DasPotentialbestimmthierbeidie InteraktionsenergiezwischendenPartikeln.MeististdieseInteraktionsenergiedirektfür daskolloidaleVerhaltenderPartikelverantwortlich(Stabilitätgegenüber Koagulation).231DreiverschiedeneabstoßendeMechanismenderPartikelsindfürihre gleichmäßigeVerteilungimMediumundihreStabilitätgegenüberKoagulation entscheidend,elektrostatische,sterischeundelastischeAbstoßung.234DergrößteAnteil derAbstoßungsmechanismengehtaufdiesterischeundelektrostatischeAbstoßung zurück.BeidehinderndiePartikeldaran,sichzunahezukommenundsomitVan‐der‐ Waals‐Bindungenauszubilden.DiesekönntenmöglicherweisezuKoaleszenzführen. FürdieGrenzflächenladungderPartikelsindverschiedeneelektronegative SeitengruppenderProteineverantwortlich,welcheaufderPartikeloberfläche zugänglichsind.AbhängigvonderIonenstärkeunddempH‐Wertdesumgebenden MediumsergebensichOberflächenladungsverhältnissederPartikel,auswelchendurch ElektrophoresedasZetapotentialabgeleitetwerdenkann.Durchdiechemische VernetzungkommteszurAusbildungvondi‐Tyrosinen,welchesichvondenTyrosinen impKaihrerSeitenkettenunterscheidenkönnen.DadurchkannauchdasZetapotential dereADF4(C16)Partikelbeeinflusstwerden.PrinzipiellgilthierbeidieFaustformel,je höherdasZetapotential,destostärkeristdieelektrostatischeAbstoßungderPartikel unddestobessersinddiePartikelinderDispersionstabilisiert.234DieÄnderungdes PotentialsdereADF4(C16)PartikelaufgrundderchemischenVernetzungderProteine hatallerdingsnureinengeringenEinflussaufdaskolloidaleVerhaltenderPartikel.Das liegtzumeinendaran,dassdieVeränderungendesZetapotentialsnurgeringwaren (±8mV)(Tab.5.1,Kapitel5.2.4),zumanderendaran,dasssichderEinflussder sterischenAbstoßungdurchdiechemischeVernetzungnurgeringfügigveränderthaben sollte.Tab.6.1zeigteineallgemeineEinschätzungderphysikalischenStabilitätvon DispersionenanhanddesZetapotentials.234BerechnetmandasZetapotentialder Diskussion 125  eADF4(C16)PartikelnachderTheorievonSmoluchowski,soerhältmanfürunvernetzte PartikelinH2OMQeinenWertvonca.‐36mV,dasZetapotentialdervernetztenPartikel liegtbeica.‐44mV.SomitweisendieunvernetzteneADF4(C16)PartikelinH2OMQnach derUnterteilungvonRiddick234inDispersionenkeineAgglomerationauf,diechemisch vernetztenPartikelzeigeninDispersionensogareineguteStabilität. Tab.6.1:UnterteilungderStabilitätenvonDispersionenanhanddesZetapotentialsnachRiddick.234 KennzeichenderStabilitätZetapotential(mV) MaximaleAgglomerationundSedimentation +3bis0 AusgeprägteAgglomerationundSedimentation ‐1bis‐4 leichteAgglomerationundSedimentation ‐5bis‐10 SchwellezurAgglomeration‐11bis‐20 GeringeAgglomeration‐21bis‐30 KeineAgglomeration ‐31bis‐40 GuteStabilität‐41bis‐50 SehrguteStabilität‐51bis‐60 AusgezeichneteStabilität‐61bis‐80 MaximaleStabilität‐81bis‐100  DieelektrophoretischeMobilitätist,wiebereitserwähnt,nichtnurvonder AminosäurezusammensetzungunddemVernetzungsgradderPartikel,sondernauchvon denUmgebungsbedingungenabhängig.UnterVerwendungderTheorievonO´Brienund White232istesgelungen,dieelektrophoretischeMobilitätvoneADF4(C16)Partikelnin AbhängigkeitvonderIonenstärkeunddempH‐WertmiteinerVarianzvon30%zu berechnen(Abb.5.7,Kapitel5.2.4).DieVarianzgehthierbeiaufdieVariabilitätder Oberflächenladungsverteilungzurück,welcheu.a.durchdieVerteilungder AminosäurenimInnerenderPartikelundaufderOberflächebestimmtist.Lediglichbei derAbhängigkeitderelektrophoretischenMobilitätvonderIonenstärke,weichendie theoretischenunddiegemessenenWertestärkervoneinanderab.DieseAbweichungen gehenaufdieSteifigkeitderPartikelunddiesterischenWechselwirkungenzwischenden ProteinenundderumgebendenLösungzurück.DieverwendeteTheorievonO´Brien undWhitebeziehtsicheigentlichaufhartePartikel,beihydratisierten eADF4(C16)PartikelnhandeltessichjedochumeinimVergleichweichesMaterial, Diskussion 126  wodurcheszuleichtenAbweichungenbeiderBestimmungderelektrophoretischen Mobilitätkommenkann.  Abb.6.1:BereichedereADF4(C16)Partikel,welchedurchdieelektrophoretischeMobilitätunddie kraftspektroskopischenAnalysenderPartikelbestimmtwerdenkonnten(NicolasHelfricht,Physikalische ChemieII,UniversitätBayreuth). (ModifiziertnachHelfrichtetal,2013,eingereichtbeiBiomaterSci,mitGenehmigungderRoyalSocietyofChemistry) KombiniertmandieErgebnissederelektrophoretischenMobilitätsmessungenmitden GrenzflächeneigenschaftenderPartikel,sowirddeutlich,dassessichbeiden InteraktionsprofilenzwischendenimmobilisiertenSilikat‐Probenkörpernundden eADF4(C16)PartikelnumsehrkomplexeProfilehandelt(Abb.5.8,Kapitel5.2.4).Das liegtdaran,dassbeiderColloidalProbeTechniquebeiunterschiedlichenAbständender Partikel,verschiedeneInteraktionenzwischendiesenauftreten.Ausdendaraus gewonnenenProfilenkanndurchFittenaufBasisderPoisson‐BoltzmannGleichungein speziellerBereichderPartikeldefiniertwerden,diediffuseSchicht(Abb.6.1).229Es handeltsichbeidieseräußersten,diePartikelumgebendenSchichtumelektrostatische Wechselwirkungen,welcheaufLadungenaufderPartikeloberflächeundden entsprechendenGegenioneninderumgebendenLösungzurückgehen(I).Dieser BereichgehtineinenzweitenBereichüber,inwelchemdiesterischenInteraktionen zwischenPartikelundCantileverimVordergrundstehen(II).DerdritteBereichwird durchdiemechanischeDeformationdeseADF4(C16)Partikelsbestimmt(III),welche durchdiemechanischenAnalysencharakterisiertwurde. SowohldasQuellverhaltenderPartikel(Abb.5.4,Kapitel5.2.2)alsauchihre mechanischeStabilität(Kapitel5.2.7)sind,imGegensatzzuverschiedenenanderen Eigenschaften,vonderVernetzungsrouteabhängig.DasQuellverhaltenspieltbei Partikeln,welcheinmedizinischenundpharmazeutischenBereichenAnwendungfinden sollen,einewichtigeRolle.VielePartikelwerdenmeistimdehydratisiertenZustand Diskussion 127  analysiert(REM)aberimhydratisiertenZustandverabreicht.Beivernetzten eADF4(C16)PartikelnwerdendieunstrukturiertenRegionendesProteinsdurchdie Bildungderdi‐Tyrosinezusätzlichstabilisiert,sodassdieseunterWassereinflussweniger starkquellen(Kapitel5.2.2).Durchco‐PräzipitationhergestelltePartikelweisenhierbei eineVerteilungderdurchdiedi‐Tyrosineentstandenenzusätzlichenkovalenten BindungenüberdenganzenPartikelauf,diePartikelsinddadurchinsichbesser stabilisiert(Quellfaktor1,4)(Kapitel5.2.2).DurchDiffusionmitRubpyundAPSbeladene PartikelweisenlediglicheinezusätzlicheStabilisierungindenäußerenBereichender Partikelauf,sodassdiesestärkerquellen,alsdiesfürPartikelderanderen Vernetzungsroutebeobachtetwerdenkonnte(Quellfaktor1,76)(Kapitel5.2.2). DesWeiterenkonntegezeigtwerden,dassdieWasseraufnahmeund‐abgabeder vernetztenundunvernetzteneADF4(C16)PartikelauchnachzehnWiederholungen vollständigreversibelsind(Kapitel5.2.2,Abb.5.5).Abb.6.2fasstdenEinflussder chemischenVernetzungaufeADF4(C16)PartikelineinemModellnochmalszusammen.  Abb.6.2:ModellzumEinflussderchemischenVernetzungaufdiemechanischenEigenschaftenunddas QuellverhaltenvoneADF4(C16)Partikeln.UnterschiedeimQuellverhaltenwerdendurchdie Partikelgrößensymbolisiert.ImdehydratisiertenZustandhatdiechemischeVernetzungkeinenEinfluss aufdiemechanischenEigenschaftenderPartikel.DermittlereE‐ModulderdehydratisiertenPartikelist deutlichgrößeralsderE‐ModulderhydratisiertenPartikel.Dieunterschiedlichenmechanischen EigenschaftenwerdendurchdieunterschiedlichenLiniendickenvereinfachtdargestellt. (ModifiziertnachNeubaueretal,2013,eingereichtbeiBiomaterSci,mitGenehmigungderRoyalSocietyofChemistry) Diskussion 128  DiemechanischeStabilitätvonPartikelnspieltinvielenAnwendungsbereicheneine wichtigeRolle.248Daheristeswichtig,dieMaterialienvoreinemmöglichenEinsatzauf ihremechanischeWiderstandfähigkeithinzuuntersuchen. IndervorliegendenArbeitwurdendiemechanischenEigenschaftenvonhydratisierten unddehydratisiertenPartikelnanalysiert(Kapitel5.2.7).Hydratisierte eADF4(C16)PartikelweisenhierbeieinelastischesVerhaltenauf,dehydratisierte Partikelhingegensindmechanischwesentlichstabiler,wodurchsiesichfüreine möglicheAnwendungimBereichderpartikelverstärktenKompositmaterialieneignen. HydratisierteeADF4(C16)PartikelweiseneinenmittlerenE‐ModulimMega‐Pascal‐ Bereichauf(ca.3MPa),dehydratisierteeADF4(C16)PartikelimGiga‐Pascal‐Bereich(ca. 1GPa).MöglicheEinflüsseeinerchemischenoderphysikalischenVernetzungkonnten lediglichfürhydratisiertePartikelbeobachtetwerden.SowohldieMolekülkettenlängen derProteinealsauchdieBildungderdi‐Tyrosinewirkensichdeutlichaufdaselastische VerhaltenderPartikelaus(Abb.5.13).Di‐TyrosinesorgenfüreineStabilisierungder unstrukturiertenPartikelbereiche,wodurchdievernetztenPartikelimhydratisierten ZustandeinenhöherenE‐Modulalsdieunvernetztenaufweisen.DieVernetzungsroute hatebenfallseinenEinflussaufdiemechanischenEigenschaftenderPartikel (Abb.5.13A).DasgleichmäßigeEinbringenderVernetzermoleküleindiePartikel (CL_Fällung)führtzueinerhomogenenVernetzung.Durchdiezusätzlichenkovalenten Bindungenentstehteinstabiles,abertrotzdemelastischesNetzwerk.DermittlereE‐ Modulhydratisierter,vernetztePartikelliegtbeica.5,5MPa,derderunvernetztenbei ca.3MPa.DieDiffusionderVernetzermoleküleindiePartikelführthingegenzueiner ungleichmäßigenVerteilungvonRubpyundAPSüberdiePartikel,insbesondereinden RandbereichenkommteszueinerstarkenVernetzung.Daswirktsichauchaufdas mechanischeVerhaltenaus,hydratisiertePartikeldieserRouteweisenimVergleichzu denunvernetztenundüberdiezweiteRoutevernetztenPartikelndenhöchstenE‐Modul (ca.8,5MPa)auf.DiephysikalischeVernetzungderProteinehateinenähnlichenEinfluss aufdieMechanikderPartikel.JekürzerdieMolekülkettenlängederProteine,desto geringeristdermittlereE‐ModulderhydratisiertenPartikel(Abb.5.13B).Hydratisierte eADF4(C8)PartikelbesitzeneinenmittlerenE‐Modulvonca.2,5MPa, eADF4(C16)Partikelvonca.3MPaundeADF4(C32)Partikelvonca.5,5MPa.Dashängt Diskussion 129  mitdeninter‐undintramolekularenWechselwirkungenderMolekülkettenzusammen. Insbesonderedie‐FaltblättersorgendurchhydrophobeWechselwirkungenzwischen deneinzelnenpoly‐Alanin‐BereichenfürdieStabilitätderPartikel.Jemehrpoly‐Alanin‐ BereicheineinemMolekülvorkommen,destostärkerkönnendiedarausgebildeten‐ FaltblättermiteinanderwechselwirkenundsorgendadurchfürdiezusätzlicheStabilität derPartikel.EineähnlicheStabilitätdurch‐Faltblätterkannauchimnatürlichen Spinnenfadenbeobachtetwerden,daimSeidenfadendieStabilitätdesFadensaufdie‐ faltblattreichenBereichezurückgeführtwird.32‐34 AuchbeianderenPolymerenkanneinEinflussderKettenlängebzw.des MolekulargewichtsaufdiemechanischenEigenschaftenoderaufdas WirkstofffreisetzungsverhaltenderPartikelbeobachtetwerden.AnhandvonChitosan konntegezeigtwerden,dassdasMolekulargewichtdesverwendetenChitosanseinen entscheidendenEinflussaufdieFestigkeitundFlexibilitätderresultierendenPartikel hat.249‐251DesWeiterenhängtbeispielsweisedasMolekulargewichtvonKollagenen direktmitdendarausresultierendenPartikelgrößenzusammen.252Einähnliches VerhaltenkannfürsynthetischePolymerebeobachtetwerden.Sokonntegezeigt werden,dassdieBeladungseffizienzvonPartikelnaufBasisvonPEGu.a.vom Molekulargewichtabhängigist.253,254AuchaufdiePartikelgrößehatdieKettenlängedes PEGeinenEinfluss,mitzunehmenderKettenlängenimmtdiePartikelgrößezu.253 ZusätzlichkonnteeinEinflussderPEG‐KettenlängeaufdieHydrophilieundFlexibilität derco‐Polymerebeobachtetwerden.255AlsweiteresBeispielfürsynthetischePolymere wirdauchbeiPolyethylenterephthalat(PET)eineAnhängigkeitdermechanischen EigenschaftenvondemMolekulargewichtbeschrieben.256 6.1.2 WirkstofftransportundWirkstofffreisetzung DasWirkstoffaufnahme–undFreisetzungsverhaltenvoneADF4(C16)Partikelnwurde anhandvonRhodaminBalsModellwirkstoffanalysiert.EshandeltsichbeiRhodaminB umeinenhydrophoben,wasserlöslichenFluoreszenzfarbstoff,welcherbeineutralem pH‐Wertzwitterionischvorliegt.257MitHilfediesesModellwirkstoffeswaresmöglich, zweiverschiedeneBeladungsstrategienzuverfolgen,co‐PräzipitationundDiffusion (Kapitel5.3).Eskonntehierbeibeobachtetwerden,dassco‐Präzipitationdes Diskussion 136   Abb.6.3:SchematischeDarstellungderSchutzfunktiondereADF4(C16)Kapsel. DieVersuchezurEnzymaktivitätvon‐Galaktosidaseundseiner‐komplementierten Formzeigten,dassdiealleinigeAnwesenheitvongelöstemeADF4(C16)dieAktivitätdes ‐komplementiertenEnzymserhöht(Abb.5.32,Tab.5.3).DieseEigenschaftgehtauf bereitsbeobachteteStabilisierungseffektederSeidenproteineaufEnzymezurück.265,266 Kontrollenhabenallerdingsgezeigt,dassdieAnwesenheitvongelöstemeADF4(C16) odervonleerenKapselnauseADF4(C16)nichtalsSchutzsystemfürdieEnzyme gegenüberProteasenausreicht(Abb.5.34),dieVerpackungineinerKapselistalsSchutz notwendig. DieGrößederhergestelltenKapselnlässtsichbisherlediglichüberdieEmulsion einstellen.MikrofluidikisteineeleganteLösung,homogeneKapselndefinierterGröße herzustellen.DieserAnsatzkonnteindervorliegendenArbeitjedochnichtabschließend bearbeitetwerden.DurchdiemodifizierteKapselherstellungmitSilikonölkommteszu keinerdirekten‐Faltblattbildung,welchefürdieHerstellungvonstabilen, wasserunlöslichenKapselnnotwendigist. DasDeformations‐ undFließverhaltenvonPartikelninMikrofluidik‐Kanälenlässtsich relativgenausimulieren.267DadurchkanndasStrömungsverhalteninnerhalbeiner Kapsel,währendsiedurchdieKanälefließt,vorhergesagt,unddiefürdieKapselbildung wichtigenDiffusionsvorgängedesProteinsandieÖl‐Wasser‐Grenzschichtoptimiert werden.UmdieAusbildungeinermechanischstabilenKapselhülleimMikrofluidik‐Kanal zugewährleisten,isteineNachbehandlungderProteinemitEthanolnotwendig.Hierfür mussdemLayouteinzusätzlicherKanalhinzugefügtwerden.DiegeschwungenenKanäle solltenjedocherhaltenbleiben,dadurchdieFormunddiedadurchgegebenen FließeigenschaftenderTropfen,dieDurchmischunginnerhalbderEmulsionstropfen Diskussion 137  verbessertwird239unddadurchfüreinebeschleunigteDiffusiondesProteinsandieÖl‐ Wasser‐Grenzfläche,woeszueinemdünnenFilmassembliert,sorgen.Dabeiistjedoch zuberücksichtigen,dassdasStrömungsverhaltenderPartikeldurchdenneuenZufluss nichtnegativbeeinflusstwird.TurbulenteStrömungenkönnendiegebildeten EmulsionstropfenvorderStabilisierungdurchEthanolzerstören.DerEinflusssolcher StrömungenkannjedochebenfallsdurchSimulationsversuchevorabanalysiertwerden, sodassdasLayoutoptimalangepasstwerdenkann.MöglicheAnwendungsgebietevon artifiziellenKapselnsindu.a.imBereichdeskontrolliertenWirkstofftransportsoder auchalsMikroreaktoren.267 6.4 RekombinanteSpinnenseidenproteinealsWirkstofftransportsystemim VergleichzuanderenPolymeren DieAnforderungenanPolymereimBereichderkontrolliertenWirkstofffreisetzungsind großundwurdenbereitsinderEinleitungausführlichbeschrieben.Hierzuzähltu.a. eineguteKontrolleüberdieStrukturundFunktiondesMaterials,einegutemechanische StabilitätundeineeinfacheVerarbeitungderMaterialieninunterschiedliche Morphologien.HinzukommenzusätzlicheAnforderungen,welchesichaufdie VerträglichkeitdereingesetztenPolymerebeziehen,z.B.Bioabbaubarkeitinungiftige ProdukteundBiokompatibilität.130EswerdenbereitseineVielzahlunterschiedliche natürlicheundsynthetischePolymerefürdenEinsatzalsWirkstofftransportsystem erfolgreichgetestet,dazuzählennebenvielenanderen,Alginat,Kollagen,Fibroinund SpinnenseidealsVertreterdernatürlichenPolymere(Tab.3.5)undPLGoderPEGals BeispielefürsynthetischePolymere(Tab.3.4).74,79,102,113,123,130,268Sovielfältigwiedie verwendetenMaterialiensindauchihreMorphologienund Verarbeitungsmethoden.104,262,269 eADF4(C16)vereintvieledergenanntenAnforderungenfüreinenEinsatzimBereichdes kontrolliertenWirkstofftransports,imVergleichzuetabliertensynthetischenPolymeren. EskannbeispielsweisedurchProteaseninPeptidemetabolisiertwerden,wodurches einermöglichenAkkumulationimOrganismusentgegenwirkt.SynthetischePolymere hingegenakkumulierenoftmalsimKörperoderwerdenintoxische Degradationsprodukteabgebaut.UmdieseMaterialientrotzdemimKörperanwenden zukönnen,müssendiePartikelundKapselnentwedernachderWirkstofffreisetzung Diskussion 138  explantiertwerdenodereineandereMöglichkeitgefundenwerden,umdietoxischen Abbauproduktezuvermeiden.270VorteiledesrekombinantenProteinsgegenüber synthetischenMaterialiensinddieguteBiokompatibilität,Bioabbaubarkeitundgeringe Immunogenität. InsbesonderedieVerpackungvonaktivenWirkstoffenaufProteinbasisstellteine Herausforderungdar.VieleproteinbasierteWirkstoffeweiseninLösungeinesehr geringeHalbwertszeitauf,durchdieImmobilisierungdieserWirkstoffeinKapselnoder PartikelnkanndieHalbwertszeitdeutlichverlängertwerden.DieVerpackunghatsomit zusätzlichzuihrerSchutzfunktionaucheinenstabilisierendenEinflussaufdieverpackten ProteineoderEnzyme.130NichtnureADF4(C16),auchanderenatürlicheBiomaterialien habeninsbesondereindiesemBereicheinenentscheidendenVorteilgegenüber synthetischenPolymeren.DurchdieVerarbeitungnatürlicherPolymereunterwässrigen BedingungenwirddieAktivitätderverpacktenProteineundEnzymenichtnegativ beeinflusst,ganzimGegenteilzurNutzungsynthetischerPolymere.Synthetische PolymerebenötigenmeisthoheTemperaturen,organischeLösungsmitteloder Ultraschallbehandlung,umindiegewünschtenMorphologienüberführtzuwerden.242 DieseBehandlungenkönnensichnegativaufdieAktivitätderzuverpackenden Materialienauswirken. EineEigenschaft,welcheProteinealsWirkstofftransportsystemweiterhervorhebtistdie VielzahlanBeladungsmöglichkeitenundBindekapazitätenfürWirkstoffe.Hierzuzählen sowohldieInteraktionenderWirkstoffmolekülemitdenProteinenüberelektrostatische undhydrophobeWechselwirkungenoderkovalenteBindungen,alsauchmögliche OberflächenmodifikationenüberfunktionelleGruppen,dieeinengezieltenTransport derWirkstoffeandenZielortermöglichen.136VielediesergenanntenEigenschaften findensichauchbeiPolysaccharidenwieder.ProteineundsomitaucheADF4(C16) weisenjedochaufgrundihrerVielfaltanMorphologienundihrerFähigkeitzu Emulgieren,Wasserzubindenundselbstzuassemblieren,136,270eingrößeresPotential fürmedizinische,pharmazeutischeundtechnischeAnwendungenauf. EinNachteilvonnatürlichenProteinentierischenUrsprungsistihrstarkesQuellenin Wasser,wodurchWirkstoffmoleküleleichterausdenPartikelnfreigesetztwerden Diskussion 139  können.EinekontrollierteWirkstofffreisetzungübereinenlangenZeitraumistdadurch nichtmöglich.270EineMöglichkeitdaszuverhindernistbeispielsweiseeinezusätzliche chemischeVernetzungderProteine,welcheeinerseitsEinflussaufdieHydrophobizität derPartikelnehmenundandererseitsdiePorengrößenderPartikelbeeinflussen.Diese ProblematiktrittbeisynthetischenPolymerenwenigerausgeprägtauf.EinWeiteres, insbesonderebeiMaterialientierischenUrsprungsauftretendesProblemsindmögliche viraleKontaminationen.271EinigeVirenkönnenbeimMenschengefährlicheKrankheiten auslösen,hierzuzählenz.B.HepatitisB‐Viren,HepatitisC‐VirenoderderHumane Immunodefizienz‐Virus(HIV).AuchKontaminationendurchPrionen,welcheebenfallszu schwerenErkrankungenbeimMenschenführenkönnen,sindmöglich.Einbekanntes BeispielfüreineaufPrionenzurückgehendeErkrankungbeimMenschenistdie Creutzfeld‐Jakob‐Krankheit.271EswerdenbereitsverschiedeneAnsätzeverfolgt,die KontaminationenvonbiopharmazeutischenProduktenmitViren,BakterienundPrionen zureduzieren.SogibtesbeispielsweisespezielleNanofilter,272welcheVirenaus Lösungenherausfilternsollen,teilweisekombiniertmitSäulenchromatrographie272,273 oderdieBehandlungderProbenmitUV‐StrahlenodermitOzon.198 NichtnureADF4(C16),auchandereProteineeignensichfürmedizinischeund pharmazeutischeAnwendungen.eADF4(C16)hatjedochdenVorteil,dassesdurchdie rekombinanteHerstellungunabhängigvonUmwelteinflüssen,natürlichen KontaminationenundKrankheitserregernmiteinergleichbleibendhohenQualität hergestelltwerdenkannundtrotzdemvielederEigenschaftendernatürlichenSeide aufweist.HierzuzählendieguteBiokompatibilität,274‐276dieBioabbaubarkeitunddie gutenmechanischenEigenschaftenderPartikel,dieindervorliegendenArbeit aufgezeigtwurden.DurchdiebiotechnologischeHerstellungsweiseisteszudem möglich,dieProteineandiegewünschtenAnforderungenanzupassen,beispielsweise durchEinfügenspeziellerPeptideumdieendozytotischeAufnahmeinZellenzu begünstigenoderspezielleSequenzen,wodurchdieZelladhäsionverbessert,die OberflächeneigenschaftenverändertoderzusätzlicheenzymatischeSchnittstellen eingefügtwerden.216,274  Literatur 141  7 Literatur 1Vollrath,F.,Madsen,B.&Shao,Z.Z.Theeffectofspinningconditionsonthemechanics ofaspider'sdraglinesilk.PRoySocLondBBio268,2339‐2346(2001). 2Sutherland,T.D.etal.Singlehoneybeesilkproteinmimicspropertiesofmulti‐protein silk.PLoSOne6,e16489(2011). 3Hepburn,H.R.&Kurstjens,S.P.TheCombsofHoneybeesasComposite‐Materials. Apidologie19,25‐36(1988). 4Weisman,S.etal.Honeybeesilk:Recombinantproteinproduction,assemblyandfiber spinning.Biomaterials31,2695–2700(2009). 5Bauer,F.&Scheibel,T.Artificialeggstalksmadeofarecombinantlyproducedlacewing silkprotein.AngewChemIntEdEngl51,6521‐6524(2012). 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