Caracterización de Neisseria gonorrhoeae mediante esquema NG-MAST y FTIR

MIKROBIOLOGIA ETA OSASUNA UNIBERTSITATE MASTERRA / MASTER UNIVERSITARIO EN MICROBIOLOGÍA Y SALUD Master Amaierako Lana / Trabajo Fin de Master Egilea/Autor/a: Lucía Valle Suárez Zuzendaria/Director/a: Miren Basaras Ibarzabal Mikel Urrutikoetxea Gutiérrez Data/Fecha Septiembre 2024 Caracterización de Neisseria gonorrhoeae mediante esquema NG-MAST y FTIR ABREVIATURAS ECDC European Center for Disease Prevention and Control FTIR Espectrometría infrarroja mediante transformada de Fourier HSH Hombres que tienen sexo con hombres ITS Infección de transmisión sexual IGD Infección gonocócica diseminada MLST Multilocus Sequence Typing NG-MAST Neisseria gonorrhoeae Multi-Antigen Sequence Typing OMS Organización Mundial de la Salud PCR Reacción en cadena de la polimerasa ST Secuenciotipo VIH Virus de la inmunodeficiencia humana ÍNDICE DE CONTENIDOS ANEXO 1 .................................................................................................................................. iv ABREVIATURAS ......................................................................................................................... v ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS.................................................................................................. vii RESUMEN .............................................................................................................................. viii 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 1 2. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 5 2.1. OBJETIVOS PRINCIPALES ........................................................................................... 5 2.2. OBJETIVOS SECUNDARIOS ........................................................................................ 5 3. MATERIAL Y MÉTODOS ...................................................................................................... 6 3.1. DISEÑO DEL ESTUDIO ............................................................................................... 6 3.1.1. Población a estudio .......................................................................................... 6 3.1.2. Criterios de inclusión........................................................................................ 7 3.1.3. Criterios de exclusión ....................................................................................... 7 3.2. SELECCIÓN DE LAS CEPAS ......................................................................................... 7 3.3. CARACTERIZACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS MEDIANTE NG-MAST ............................. 7 3.4. ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO ................................................................................... 10 3.5. CARACTERIZACIÓN MEDIANTE FTIR ........................................................................ 10 4. RESULTADOS ................................................................................................................... 11 4.1. RESULTADOS EPIDEMIOLÓGICOS............................................................................ 11 4.2. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LOS AISLADOS................................................. 13 4.3. COMPARATIVA FTIR Y NG-MAST ............................................................................. 17 5. DISCUSIÓN ...................................................................................................................... 21 5.1. SITUACIÓN EPIDEMIOLÓGICA DE LA INFECCIÓN POR N. gonorrhoeae..................... 21 5.2. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DE LOS PACIENTES CON INFECCIÓN GONOCÓCICA...... 22 5.3. CARACTERIZACIÓN DE LOS AISLADOS DE N. gonorrhoeae ....................................... 23 5.4. FTIR COMO MÉTODO DE TIPIFICACIÓN PARA N. gonorrhoeae ................................ 25 6. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 27 7. BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................................. 28 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Incidencia de infección gonocócica en España en el año 2022 1 Figura 2 Esquema representativo de la secuenciación Sanger 4 Figura 3 Perfil térmico de la reacción en cadena de la polimerasa utilizada 8 Figura 4 Esquema del proceso de caracterización de los aislados de N. gonorrhoeae 9 Figura 5 Tasas de incidencia de infección gonocócica por grupos de edad y sexo 11 Figura 6 Servicio de procedencia de los pacientes analizados en el trabajo 12 Figura 7 Dendrograma de los espectros de los 5 aislados analizados en el primer run con su correspondiente ST 18 Figura 8 Dendrograma de los espectros de los 5 aislados analizados en el segundo run con su correspondiente ST 18 Figura 9 Dendrograma de los espectros de los 18 aislados analizados en el tercer run con su correspondiente ST 19 Figura 10 Dendrograma de los espectros de los 9 aislados analizados en el cuarto run con su correspondiente ST 20 Figura 11 Matriz de distancias en la que se representa los secuenciotipos y los grupos generados por la espectroscopía FTIR 21 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1 Clasificación de los diagnósticos de infección gonocócica en función de la localización de la muestra y el sexo 12 Tabla 2 Secuenciotipos más frecuentes de N. gonorrhoeae durante el año 2023 13 Tabla 3 Secuenciotipos que no han sido previamente descritos de N. gonorrhoeae 14 Tabla 4 Secuenciotipos que no han sido previamente descritos, junto con sus ST más próximos 15 Tabla 5 Sensibilidad antimicrobiana a ciprofloxacino y a penicilina de los 10 ST más frecuentes 16 Tabla 6 Genogrupos de N. gonorrhoeae obtenidos en función de la semejanza de los alelos porB y tbpB 17 RESUMEN Las infecciones de transmisión sexual (ITS) representan un grave problema de salud pública emergente que afectan a la salud sexual y reproductiva en todo el mundo. La infección gonocócica, causada por Neisseria gonorrhoeae, es la segunda ITS bacteriana más común tras Chlamydia trachomatis. En los últimos años, su incidencia ha aumentado significativamente en nuestro país, siendo el País Vasco la segunda comunidad autónoma más afectada por detrás de Cataluña. Actualmente, la infección gonocócica se trata con antimicrobianos, sin embargo, la aparición de cepas resistentes a estos es cada vez más común. Por este motivo, es fundamental realizar una vigilancia epidemiológica molecular que nos proporcione información acerca de los clones que circulan en nuestro medio. Uno de los métodos de tipificación que se emplean con frecuencia es el esquema NG-MAST, debido a su poder discriminatorio y su alto grado de reproducibilidad y capacidad para relacionar cepas. A pesar de sus ventajas, se están introduciendo nuevas técnicas con el objetivo de agilizar este proceso. Recientemente, se ha comenzado a utilizar la espectrometría infrarroja mediante transformada de Fourier (FTIR) como tecnología alternativa de tipado. Este método ha resultado exitoso en diferentes especies bacterianas; sin embargo, son escasos los estudios realizados con N. gonorrhoeae. Nuestro trabajo tuvo como objetivo caracterizar las cepas aisladas de N. gonorrhoeae del año 2023 mediante el esquema NG-MAST y comprobar si la espectroscopía FTIR es viable con esta bacteria. Los resultados obtenidos muestran que el FTIR aún no es útil como método de tipificación para el gonococo, ya que no observamos ninguna correlación con el esquema NG-MAST. En vista de que N. gonorrhoeae presenta pleomorfismo, es necesario seguir investigando esta prometedora tecnología e incluir diferentes enfoques analíticos en un futuro. ABSTRACT Sexually transmitted infections (STIs) represent a serious emerging public health problem affecting sexual and reproductive health worldwide. Gonococcal infection, caused by Neisseria gonorrhoeae, is the second most common bacterial STI after Chlamydia trachomatis. In recent years, its incidence has increased significantly in our country, with the Basque Country being the second most affected autonomous community after Catalonia. Currently, gonococcal infection is treated with antimicrobials, however, the appearance of strains resistant to these is increasingly common. For this reason, it is essential to carry out molecular epidemiological surveillance to provide us with information about the clones circulating in our environment. One of the typing methods frequently used is the NG-MAST scheme, due to its discriminatory power and its high degree of reproducibility and ability to relate strains. Despite its advantages, new techniques are being introduced with the aim of speeding up this process. Recently, Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) has begun to be used as an alternative typing technology. This method has been successful in different bacterial species; however, few studies have been carried out with N. gonorrhoeae. Our work aimed to characterize N. gonorrhoeae isolates from the year 2023 using the NG-MAST scheme and to test whether FTIR spectroscopy is feasible with this bacterium. The results obtained show that FTIR is not yet useful as a typing method for gonococcus, as we did not observe any correlation with the NG-MAST scheme. Because N. gonorrhoeae shows pleomorphism, it is necessary to further investigate this promising technology and to include different analytical approaches in the future. 1 1. INTRODUCCIÓN Neisseria gonorrhoeae es una bacteria gramnegativa conocida por ser el agente etiológico de la gonorrea, una infección de transmisión sexual (ITS) que puede producir graves complicaciones (Quillin y Seifert, 2018). Las consecuencias físicas, psicológicas y sociales de las ITS, empeoran notablemente la calidad de vida de los pacientes afectados, provocando complicaciones tales como infertilidad, dificultades en el embarazo, así como importantes tasas de morbilidad y mortalidad (Raccagni et al., 2023). La infección gonocócica es la segunda ITS bacteriana más común en el mundo tras Chlamydia trachomatis (Lin et al., 2021) y según la Organización Mundial de la Salud (OMS) se estima que en 2020 se produjeron 82.400.000 casos de la enfermedad en todo el mundo (Miynarczyk-Bonikowska et al., 2022). El último informe anual del Centro Europeo para la Prevención y Control de Enfermedades (ECDC) reveló un total de 70.881 casos notificados de gonorrea en 28 países de la Unión Europea/Espacio Económico Europeo (UE/EEE) en el año 2022. Esta tasa de notificación de infección gonocócica es la más alta registrada desde que comenzó la vigilancia europea de ITS en 2009 (ECDC, 2024). Atendiendo a los últimos datos registrados en España (Figura 1) en el año 2022 se notificaron un total de 23.333 casos de gonorrea, siendo Cataluña, País Vasco, Madrid y Baleares las principales comunidades autónomas afectadas (ISCIII, 2024). Figura 1: Incidencia de infección gonocócica en España en el año 2022 por Comunidades Autónomas. Tomado de (ISCIII, 2024). 2 Por ello, el control y la prevención de las ITS, y en particular de N. gonorrhoeae se consideran una prioridad en la actualidad para la salud pública a nivel global (Raccagni et al., 2023). La gonorrea afecta a las localizaciones genitales, rectales y faríngeas tanto de hombres como de mujeres, y la infección puede cursar con o sin síntomas. En mujeres, aproximadamente el 80-90 % de los casos transcurren de manera asintomática, mientras que en hombres se presentan síntomas en el 45 % de los casos. La disuria y las secreciones purulentas son las principales manifestaciones de la infección en ambos sexos, y en caso de no ser tratada puede dar lugar a severas complicaciones entre las que destacan la epididimitis, la salpingitis y la enfermedad pélvica inflamatoria, que a su vez se asocian con mayor probabilidad de embarazo ectópico e infertilidad. De forma menos frecuente, N. gonorrhoeae puede llegar a diseminarse por todo el organismo y producir una infección gonocócica diseminada (IGD) que provoca artritis gonocócica, osteomielitis, endocarditis y meningitis entre otras (Lin et al., 2021; Raccagni et al., 2023). A pesar de que el principal mecanismo de transmisión es por contacto directo vía sexual, este patógeno también se puede transmitir de la madre al hijo durante el embarazo, causando en el feto infecciones oculares que pueden producir ceguera si no son tratadas adecuadamente. Asimismo, N. gonorrhoeae aumenta el riesgo de transmisión y adquisición del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) al igual que otras ITS (Lin et al., 2021). Con relación al tratamiento, las indicaciones terapéuticas para hacer frente a este patógeno han ido evolucionando a lo largo de los años. En 2016, la OMS recomendaba la terapia dual como régimen de tratamiento primario, basada en la combinación de ceftriaxona generalmente inyectable junto con azitromicina, o cefixima por vía oral en combinación con azitromicina. Sin embargo, en el año 2020 los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades actualizaron sus directrices acerca de las ITS debido al aumento de cepas resistentes a azitromicina y a los numerosos fracasos terapéuticos. Concretamente, suprimieron la azitromicina del tratamiento empírico y duplicaron la dosis de ceftriaxona de 250 a 500 mg, la cual se emplea actualmente (Raccagni et al., 2023). 3 En los últimos años, también se ha evaluado la eficacia de los carbapenemes como posible tratamiento frente a la infección gonocócica. Sin embargo, su aplicación ha sido descartada tanto de la práctica clínica habitual como opción de tratamiento de primera línea. El principal motivo se debe a la necesidad de preservar y reservar estos antimicrobianos para hacer frente a otro tipo de infecciones y evitar así la aparición de más cepas resistentes (Raccagni et al., 2023). Al igual que muchos otros microorganismos patógenos, N. gonorrhoeae ha logrado desarrollar mecanismos de resistencia a todas las clases de antimicrobianos disponibles, y en los últimos años se han identificado cepas circulantes resistentes tanto a ceftriaxona como a azitromicina (Lin et al., 2021). En vista de esta crítica situación, este patógeno fue incluido en el año 2017 en la lista desarrollada por la OMS de los doce agentes patógenos prioritarios que necesitan urgentemente el desarrollo de nuevos antimicrobianos debido a la amenaza que supone para la salud pública a nivel mundial (Miynarczyk-Bonikowska et al., 2022). Por todo ello, se ha producido un importante progreso en los programas de vigilancia epidemiológica tanto a nivel regional, nacional e incluso internacional con el objetivo de rastrear esos patrones de resistencia y llegar a conocer con precisión los clones circulantes en nuestro medio. Los esquemas de tipificación molecular son las principales herramientas para establecer correlaciones entre cepas, determinar su modo de propagación y sus mecanismos de resistencia (Ibargoyen et al., 2020). En el caso de N. gonorrhoeae, los esquemas de tipificación molecular que se emplean con mayor frecuencia son Multilocus Sequence Typing (MLST) y N. gonorrhoeae MultiAntigen Sequence Typing (NG-MAST) debido a su alto grado de resolución, reproducibilidad y capacidad para cuantificar relaciones entre cepas (Golparian et al., 2021). El esquema NG-MAST permite caracterizar las cepas atendiendo a cambios en las secuencias del gen porB que codifica para la proteína porina PorB, y del gen tbpB, que codifica para la subunidad B de la proteína de unión a la transferrina. Tanto la PorB como la TpbB son proteínas de membrana externa hipervariables, y por ello el esquema NGMAST tiene un poder discriminatorio significativamente mayor que el MLST, 10 3.4. ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO Una vez obtenidas las secuencias de cada cepa se utilizó el software ChromasPro 2 para realizar el análisis y la edición de las secuencias trazadas en ambas direcciones forward y reverse. La secuencia consenso de cada cepa se introdujo en la web de PubMLST para obtener los alelos porB y tbpB y finalmente el correspondiente secuenciotipo (ST). Para los alelos con una homología ≥ 99 % con un alelo descrito se calculó el alelo más próximo. Finalmente, los alelos de los diez ST más frecuentes se agruparon en genogrupos. De acuerdo con la definición previamente descrita por (Chisholm et al,. 2013), los aislados que comparten un alelo idéntico y cuyo otro alelo muestra una semejanza del ≥ 99 % (≤5 pares de bases de diferencia para porB y ≤4 pares de bases para tbpB) se agrupan en un genogrupo, el cual recibe el nombre del ST predominante dentro de cada grupo. 3.5. CARACTERIZACIÓN MEDIANTE FTIR Para llevar a cabo la espectroscopía FTIR, los aislamientos de Neisseria gonorrhoeae del cepario se sembraron por agotamiento en Agar Chocolate. Se incubaron durante 24 horas en una estufa a 37 °C y atmósfera de un 70 % de humedad, suplementados con 5 % de CO2. Tras el periodo de incubación, se realizó una resiembra y se incubaron nuevamente en la estufa durante 48 horas. Se realizó una suspensión con un inóculo de bacterias en viales diluidas en 50 µl de etanol 70 %. Estos viales contenían varillas metálicas para facilitar la homogeneización (Bruker Daltonics GmbH, Germany). Tras 5 minutos de agitación en vórtex, se añadió 50 µl de agua destilada. Se pipetearon 15 µl de la solución resultante en una placa de silicona (Bruker Daltonics GmbH, Germany) y se dejó secar a 37 °C durante 10 minutos. Se realizaron tres réplicas técnicas de cada uno de los aislados en varias ejecuciones independientes en días diferentes en el sistema IR Biotyper ®, en una ventana de adquisición espectral de 1300 a 800 cm-1, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Adicionalmente también se exploraron otras ventanas de adquisición, tanto preconfiguradas por el fabricante, así como otras desarrolladas específicamente para el trabajo. 11 4. RESULTADOS 4.1. RESULTADOS EPIDEMIOLÓGICOS En el estudio únicamente se ha incluido un aislamiento por paciente y por episodio, siendo el total 365 aislados. Sin embargo, 5 de esos aislados no crecieron en el medio de cultivo, por lo que fueron descartados para el trabajo. Por lo tanto, el análisis de los resultados se llevó a cabo únicamente con las 360 muestras con crecimiento positivo. Respecto al sexo, el 78,1 % (281) de las muestras estudiadas correspondían a hombres y el 21,9 % (79) a mujeres. La edad media de los pacientes fue de 30 años tanto en hombres como mujeres (DE= 9,89) (mediana 28 y rango de 14-74 años). Las tasas más elevadas de infección gonocócica se produjeron en el grupo de 25 a 34 años (40 %), seguidas del grupo de 20 a 24 años (25,6 %), 35 a 44 años (17,2 %), 15 a 19 años (7,8 %), 45 a 54 años (5,8 %), 55 años o más (2,8 %) y menores de 15 años (0,8 %) (Figura 5). Las tasas de infección en hombres fueron superiores a las de las mujeres en los grupos de 20 a 24 años, 25 a 34 años, 35 a 44 años y 45 a 54 años. Figura 5: Tasas de incidencia de infección gonocócica por grupos de edad y sexo. 12 Con relación a la localización, el 66,4 % de las muestras analizadas fueron obtenidas de localización genital, seguido de un 26,7 % de localización rectal, 5,5 % faríngea y 1,4 % con otra procedencia distinta (Tabla 1). En lo referente al servicio de procedencia de los pacientes, la mayor parte de los diagnósticos fueron realizados en la consulta de ITS (68,1 %), seguido de aquellos realizados en atención ambulatoria (18,3 %), en el Servicio de Urgencias (10,8 %) y en otros servicios del Hospital Universitario Basurto (2,8 %) (Figura 6). Tabla 1: Clasificación de los diagnósticos de infección gonocócica en función de la localización de la muestra y el sexo. Figura 6: Servicio de procedencia de los pacientes analizados en el trabajo. 13 4.2. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LOS AISLADOS La caracterización molecular mediante esquema NG-MAST se realizó a 360 aislamientos pertenecientes al año 2023. Se obtuvieron los ST de 318 pacientes mediante el uso de la base de datos online PubMLST, revelando un total de 76 ST diferentes. Del total, 38 ST se manifestaron en un único aislado, y otros 38 ST se manifestaron en dos o más aislados. Los 10 ST más frecuentes fueron el ST19838 (48 aislados, 13,3 %), ST20881 (29 aislados, 8,1 %), ST19792 (20 aislados, 5,6 %), ST19636 (19 aislados, 5,3 %), ST19762 (18 aislados, 5,0 %), ST3935 (14 aislados, 3,9 %), ST338 (10 aislados, 2,8 %), ST17972, ST20737 y ST21386 (8 aislados, 2,2 %) (Tabla 2). Los STs ST20881, ST3935 y ST21386 únicamente afectaron a hombres. Los secuenciotipos más frecuentes se distribuyeron de manera homogénea a lo largo del período de estudio. Sin embargo, algunos ST predominaron en épocas concretas del año 2023, como el ST19636 (7 aislados en enero), ST19792 (6 aislados en septiembre) o el ST21386 (4 aislados en abril). Tabla 2: Secuenciotipos más frecuentes de N. gonorrhoeae durante el año 2023. 14 Por otro lado, a un total de 40 pacientes no se les pudo determinar su ST debido a diferentes razones. En 23 de ellos, la base de datos online PubMLST no mostró coincidencias al introducir la combinación de alelos de ambos genes (Tabla 3), por lo que podrían presentar nuevos ST que aún no han sido descritos. En 13 pacientes, no se pudo determinar su ST exacto ya que presentaban mutaciones en el gen porB (12 pacientes) y en el gen tbpB (1 paciente). Sin embargo, al tratarse de un bajo número de mutaciones, se pudieron obtener sus ST más cercanos. Estos secuenciotipos son: ST19968, ST21783, ST20379, ST4186, ST20591, ST9702, ST22089, ST22693 y ST22896. Los 4 pacientes restantes presentaban más de cuatro mutaciones en el alelo porB, por lo que no fue posible determinar su ST exacto o cercano. A estos alelos se les asignó una nomenclatura diferente: nPor001, nPor002 y nPor003 (Tabla 4). Tabla 3: Secuenciotipos que no han sido previamente descritos de N. gonorrhoeae. 15 Al total de 32 ST no descritos previamente se les estableció la nomenclatura HUB (Hospital Universitario Basurto) seguido de un número y ordenados cronológicamente como se observa en las Tablas 3 y 4. Las secuencias de ambos genes no descritas previamente se enviaron a la base de datos PubMLST para que se les asigne un nuevo número alélico. Finalmente, no fue posible la secuenciación del fragmento del gen tbpB en 2 pacientes que compartían el mismo alelo del gen porB (alelo 30). En este caso, se realizó secuenciación masiva por nanoporos, y en ambos casos se confirmó la ausencia de amplificación en la PCR in silico mediante el uso de los cebadores del esquema NG-MAST para tbpB por una deleción en el gen. Los datos previamente obtenidos acerca de la sensibilidad antimicrobiana nos indicaron que la mayoría de los ST más frecuentes presentaban resistencia al ciprofloxacino (Tabla 5). Sin embargo, todos los aislados de los STs ST19636, ST3935 y ST21386 presentaron sensibilidad frente a este antimicrobiano. Respecto a la penicilina, la mayoría de los STs Tabla 4: Secuenciotipos que no han sido previamente descritos, junto con sus STs más próximos. 16 mostraron sensibilidad intermedia, exceptuando 8 aislados pertenecientes al ST338, y 1 aislado con secuenciotipo ST17972. Con relación a la tetraciclina, la mitad de los aislados (24) del ST19838 presentaron resistencia. Respecto al total de muestras del estudio, 163 aislados eran resistentes a este antimicrobiano (45,2 %). R: resistente, I: intermedio, S: sensible. Asimismo, todos los aislamientos pertenecientes a los ST ST22718, ST13892, ST8435, ST9208 y HUB08 también mostraron sensibilidad a ciprofloxacino. Respecto a la cefixima y ceftriaxona, las 360 cepas del estudio eran sensibles a ambas. Con respecto a los genogrupos, se designaron un total de 9 genogrupos que incluían a 189 aislados (52,5 %). El G19838 fue el genogrupo con mayor número de aislados. Los genogrupos G19838, G19792, G19762 y G3935 también englobaron ST diferentes (Tabla 6). Tabla 5: Sensibilidad antimicrobiana a ciprofloxacino y a penicilina de los 10 STs más frecuentes. 17 4.3. COMPARATIVA FTIR Y NG-MAST Se realizaron 4 análisis independientes para comprobar si la espectroscopía FTIR en el sistema IR Biosystem agrupaba los aislados de la misma manera que el NG-MAST. En todos los análisis se consiguió controlar el ruido y que todas las réplicas tuvieran suficiente absorbancia para superar el control de calidad. Los resultados se representaron en forma de dendrograma de espectros de los aislados y el punto de corte se fijó según las instrucciones del fabricante. El dendrograma se obtuvo en base a cálculos matemáticos según los valores de similitud espectral entre los aislados, y permite obtener una visión general en forma de árbol. El color verde muestra que las réplicas técnicas que pertenecen al mismo aislado se han agrupado satisfactoriamente. Por el contrario, el color amarillo indica que las réplicas técnicas del mismo aislado no consiguieron agruparse (Corwin et al., 2023). El color naranja indica que réplicas técnicas de diferentes secuenciotipos han agrupado dentro del mismo cluster. Tabla 6: Genogrupos de N. gonorrhoeae obtenidos en función de la semejanza de los alelos porB y tbpB. 18 En los dos primeros runs realizados, se investigaron 5 aislados con 3 réplicas técnicas (NG-003, NG-008, NG-009, NG-013, NG-017) pertenecientes a los secuenciotipos ST21359, ST5624, ST21645, ST19792 y ST17972, respectivamente (Figuras 7 y 8). Figura 7: Dendrograma de los espectros de los 5 aislados analizados en el primer run con su correspondiente ST. Figura 8: Dendrograma de los espectros de los 5 aislados analizados en el segundo run con su correspondiente ST. 19 En el tercer run, se analizaron 18 aislados con 3 réplicas técnicas (NG-012, NG-025, NG026, NG-027, NG-033, NG-035, NG-066, NG-077, NG-079, NG-097, NG-116, NG-123, NG157, NG-179, NG-202, NG-207, NG-289 y NG-352) todos ellos con secuenciotipo ST19636 (Figura 9). Figura 9: Dendrograma de los espectros de los 18 aislados analizados en el tercer run con su correspondiente ST. 26 En nuestro estudio, tampoco se observó concordancia con los resultados obtenidos por el esquema NG-MAST. La espectroscopía FTIR fue capaz de agrupar las réplicas técnicas de ciertos aislados, pero su correlación con el esquema NG-MAST fue escasa. Se plantean diferentes hipótesis acerca de por qué no se ha logrado establecer una correlación entre la espectroscopía FTIR y el NG-MAST. Uno de los motivos se cree que es debido a la variación antigénica y de fase de las estructuras superficiales de los carbohidratos de la pared celular del gonococo. Esta tecnología analiza y produce espectros de polisacáridos presentes en la pared celular de las bacterias, a diferencia de otros métodos de tipificación. Las moléculas de la superficie de la pared celular del gonococo suelen ser antigénicamente variables y los epítopos se modifican por variación antigénica o de fase. La pared celular de N. gonorrhoeae está compuesta por diversos factores de virulencia, peptidoglicano y glicoproteínas. Entre los factores de virulencia, destacan los lipooligosacáridos (LOS), ya que constituyen el 75 % de la membrana externa. Cuando N. gonorrhoeae crece en cultivo, la variación de fase de los lipooligosacáridos crea una superficie bacteria en constante cambio, lo que dificulta su uso como marcador de tipificación con esta tecnología. Además, N. gonorrhoeae carece de cápsula, y esto también pueden contribuir a que no sea posible su tipado por este método (Corwin et al., 2023). Asimismo, otro problema que plantea esta técnica es la elevada sensibilidad que posee, tanto a los medios de cultivo, como a la temperatura o al tiempo de inoculación, lo que puede conducir a resultados erróneos (Finlayson et al., 2019). En nuestro estudio, se analizaron además el rango espectral 1700-1600 cm-1 (región de humedad), 3000-2800 cm-1, 1500-1400 cm-1 (lípidos), 1800-1900 cm-1 (proteínas y carbohidratos) y aquellos diseñados específicamente para el proyecto, 995-975 cm-1, 1035-1025 cm-1, 1385-1370 cm-1. Sin embargo, con ningún rango se logró tipificar correctamente N. gonorrhoeae. En vista de la situación actual de infección gonocócica, es fundamental continuar realizando vigilancia epidemiológica que nos permita desarrollar nuevos enfoques en el tratamiento de esta enfermedad. La caracterización molecular ya sea por métodos convencionales o por nuevas tecnologías, es imprescindible para conocer con exactitud 27 las cepas resistentes que circulan en nuestro medio, pudiendo así anticiparnos a proporcionar un diagnóstico y un tratamiento más efectivo. En este este estudio se ha comprobado cómo la caracterización mediante el esquema NG-MAST aún sigue siendo la mejor opción para tipificar el gonococo. Sin embargo, la espectroscopía FTIR ha demostrado ser una alternativa en muchas especies bacterianas, debido a su bajo coste, facilidad y su tiempo reducido de análisis. Por todo ello, creemos necesario continuar investigando esta tecnología añadiendo diferentes enfoques analíticos que permitan tipificar con éxito N. gonorrhoeae en un futuro. 6. CONCLUSIONES Se exponen a continuación las conclusiones obtenidas tras la realización de este estudio: 1. La infección gonocócica en nuestro estudio afecta mayoritariamente a hombres, siendo el grupo de edad de 25 a 34 años el que presenta mayor prevalencia. 2. La caracterización molecular de los 360 aislados reveló un total de 76 ST diferentes en el área sanitaria de Bilbao durante el año 2023. Los 10 ST más frecuentes fueron ST19838, ST20881, ST19792, ST19636, ST19762, ST3935, ST338, ST17972, ST20737 y ST21386. Exceptuando el ST338 y el ST3935, el resto no han sido descritos en otros estudios previos, por lo que podemos encontrarnos ante cepas que están circulando principalmente en nuestra área. 3. Todos los aislados con ST19636, ST3935 y ST21386 presentaron sensibilidad frente al ciprofloxacino. 4. La caracterización molecular mediante el esquema NG-MAST posee un alto grado de resolución, reproducibilidad y una gran capacidad para relacionar cepas. Por ello, esta técnica continúa siendo la mejor opción de tipificación para N. gonorrhoeae. 5. De acuerdo con los resultados obtenidos, no se observó correlación entre el esquema NG-MAST y el FTIR. La principal hipótesis de este resultado se debe al pleomorfismo que presenta el gonococo. Por ello, es necesario continuar investigando este método y abordarlo desde diferentes perspectivas que permitan la caracterización de esta bacteria con éxito en un futuro. 28 7. BIBLIOGRAFÍA Allan-Blitz L. T., Adamson P. C., Klausner J. D. (2022). 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