Identificación de biomarcadores pronósticos en pacientes con Linfoma Difuso de Células Grandes Bmediante Next Generation Sequencing en ADN extracelular circulante

Identificación de biomarcadores pronósticos en pacientes con Linfoma Difuso de Células Grandes B mediante Next Generation Sequencing en ADN extracelular circulante Javier Arzuaga Méndez 2025 REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 Facultad de Medicina y Enfermería Departamento de Genética, Antropología Física y Fisiología Animal TESIS DOCTORAL Identificación de biomarcadores pronósticos en pacientes con Linfoma Difuso de Células Grandes B mediante Next Generation Sequencing en ADN extracelular circulante Doctorando: Javier Arzuaga Méndez Directoras/es: Juan Carlos García Ruiz Idoia Martín Guerrero REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 (cc) 2025 Javier Arzuaga Méndez (cc by-nc-sa 4.0) REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 Agradecimientos Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que han hecho posible que este proyecto se convierta en una realidad. En especial, a mis directores, Juan Carlos García e Idoia Martín, cuya orientación y experiencia han sido fundamentales a lo largo de este proceso. Gracias por su dedicación y por guiarme en cada paso de este camino. A mis compañeros del Servicio de Hematología del Hospital Universitario Cruces, quienes me han brindado no solo su apoyo, sino también sus conocimientos y compañerismo. Agradezco también al personal de enfermería de la planta y del Hospital de Día, y al personal del Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Cruces y del Biobanco Vasco, cuyo compromiso y ayuda en la recogida de muestras han sido fundamentales para llevar a cabo esta investigación. Al equipo investigador de la UPV/EHU por su profesionalidad y apoyo constante. Quiero hacer una mención especial a los pacientes que participaron en esta investigación. Su generosidad y confianza han sido el pilar sobre el cual se sostiene este proyecto. Finalmente, a mi familia, cuyo apoyo incondicional y paciencia me han acompañado en cada momento. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 Abreviaturas ADN: Ácido desoxirribonucleico ADNct: ADN circulante tumoral ADNec: ADN extracelular circulante AID: Deaminasa de citidina inducida por activación AP: Anatomía patológica ARN: Ácido ribonucleico ARNm: ARN mensajero Axi-cel: Axicabtagene ciloleucel BCR: Receptor del linfocito B BTK: Tirosina Kinasa de Bruton CAR: Receptor antigénico quimérico CBA: Célula B activada CG: Centro germinal CMH: Células Madre Hematopoyéticas ECOG: Eastern Cooperative Oncology Group EMR: Enfermedad medible residual FFPE: Tejido fijado en formalina y embebido en parafina FISH: Hibridación in situ fluorescente HMS: Hipermutación somática HUC: Hospital Universitario Cruces HR: Harzard Ratio ICC: Clasificación Internacional de Consenso IPI: Índice pronóstico internacional KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes LDCGB: Linfoma difuso de células grandes B LF: Linfoma folicular Liso-cel: Lisocabtagene maraleucel LBAG: Linfoma B de alto grado LNH: Linfoma No Hodgkin LZM: Linfoma de la zona marginal REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 MHC: Complejo mayor de histocompatibilidad MO: Médula ósea NCG: No centro germinal NGS: Next Generation Sequencing NOS: Not otherwise specified (no especificado de otra manera) OMS: Organización Mundial de la Salud PCR: Reacción en cadena de la polimerasa PET: Tomografía por emisión de positrones R/R: En recaída o refractario R-IPI: Índice pronóstico internacional revisado RM: Respuesta molecular RMM: Respuesta molecular mayor RMP: Respuesta molecular precoz SG: Supervivencia global SLP: Supervivencia libre de progresión SNC: Sistema nervioso central SNC-IPI: Índice pronóstico internacional para predecir el riesgo de recaída en el sistema nervioso central SP: Sangre periférica TAPH: Trasplante autólogo de progenitores hematopoyéticos TC: Tomografía computarizada TCR: Receptor de la célula T TdT: Terminal deoxynucleotidyl transferase Tisa-cel: Tisagenlecleucel TIT: Terapia intratecal UPV/EHU: Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea VAF: Variant alelle frecuency (Fracción alélica de la variante) REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 6 REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 7 Introducción Los linfomas difusos de células grandes B (LDCGB) son neoplasias linfoides B maduras que se caracterizan por la proliferación no regulada de linfocitos de tamaño mediano o grande, de forma difusa, destruyendo la arquitectura normal de los ganglios linfáticos. El LDCGB es la histología de linfoma no Hodgkin (LNH) más frecuente y supone un 30-40% de todos los nuevos diagnósticos de LNH B y más del 60% de los LNH B de comportamiento agresivo (1,2). Como otras neoplasias hematológicas, estos linfomas presentan una enorme heterogeneidad biológica, manifestada en términos morfológicos, genéticos y de comportamiento clínico. Epidemiología En Europa y Estados Unidos la incidencia de LDCGB es de aproximadamente 5-7 casos por cada 100 000 personas al año (2– 4). Esta incidencia varía por etnia, es más frecuente en poblaciones del norte de Europa y menos frecuente en África y Asia (5). La incidencia de LDCGB en España se sitúa en 6-7 casos por cada 100 000 personas al año. En la comunidad autónoma del País Vasco la incidencia bruta de este tipo de linfoma es de 6,28 casos por cada 100 000 personas año (6). El Hospital Universitario Cruces (HUC) atendió entre 2020 y 2024 a 179 pacientes con LDCGB de nuevo diagnóstico. Hay una ligera predisposición por sexo, puesto que un 55% de los casos ocurren en hombres, y la incidencia aumenta con la edad, con una mediana de presentación a los 64 años. Hay cierta tendencia a REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 8 la agregación familiar, con un incremento de hasta 3,5 veces de la incidencia de LDCGB en familiares de primer grado (7,8). Por último, cabe destacar también, que se está observando un aumento progresivo en la incidencia de los LNH, incluido el LDCGB, en los países desarrollados, con una tendencia de un incremento del 0,7% anual desde 2007 (9). Presentación clínica El LDCGB se presenta habitualmente como masas adenopáticas de crecimiento rápido localizadas frecuentemente en ganglios cervicales, axilares o abdominales. No obstante, puede aparecer en cualquier parte del cuerpo. La presencia de enfermedad extraganglionar es frecuente y hasta un 26% de los pacientes presentan un LDCGB primariamente extraganglionar (10). Un tercio de ellos presentan en el momento del diagnóstico sudoración nocturna profusa, pérdida de peso o fiebre. Estos síntomas, indicativos de actividad tumoral, se conocen como “síntomas B”, por la relevancia que tuvieron en el estadiaje de Ann Arbor (la presencia de alguno de estos síntomas modificaba el estadio de A a B) (11). Aproximadamente el 60% de los pacientes se diagnostican en estadio avanzado (III o IV). La médula ósea está infiltrada por linfoma hasta en el 30% de los pacientes con LDCGB (Fig. 1), pero esta infiltración puede mostrar un tipo histológico diferente, como el linfoma folicular, hasta en la mitad de ellos, sobre todo LDCGB transformados de un bajo grado histológico (12). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 9 Fig. 1: Biopsia de médula ósea mostrando infiltración por LDCGB (Hematoxilina Eosina, 400x). Se observa una infiltración masiva por células de tamaño grande con núcleos redondeados de cromatina laxa y escaso citoplasma, que sustituyen la celularidad normal y la grasa de la médula ósea. Fotografía cortesía del Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Cruces (HUC). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 10 Fisiopatología, patogenia y genética del LDCGB EL LDCGB es una neoplasia originada en los linfocitos B maduros pre o post centro germinal, que obtienen un fenotipo neoplásico a través de la adquisición progresiva de diferentes alteraciones genéticas. El LDCGB puede ocurrir de novo, sin antecedentes previos de una neoplasia linfoide, pero también como una transformación de LNH de bajo grado de malignidad o “indolentes”, como la leucemia linfática crónica (LLC), linfoma folicular (LF) o linfoma de la zona marginal (LZM). La patogenia molecular del LDCGB es compleja y muy heterogénea, ya que existen muchas vías diferentes implicadas en la adquisición del fenotipo neoplásico por la célula B madura. Además, las alteraciones moleculares que llevan a esta transformación son diferentes en los diferentes subtipos de LDCGB (13). Es necesario comprender la complejidad biológica del LDCGB para poder identificar a los pacientes que no vayan a responder adecuadamente a la terapia convencional y ser subsidiarios de estrategias que mejoren los resultados, ya sea mediante intensificación del tratamiento o con terapias dirigidas a las vías metabólicas implicadas en su desarrollo. Esta identificación, teóricamente, también podría evitar la utilización de tratamientos innecesarios y potencialmente tóxicos en determinados perfiles de pacientes. En este sentido, uno de los primeros avances en esta área se obtuvo con la identificación de dos subtipos biológicamente diferentes de LDCGB basados en si su perfil de expresión génica es similar a las células B activadas (CBA) o a las células del centro germinal (CG) (14). Posteriormente, se identificaron algunas alteraciones REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 11 citogenéticas con valor pronóstico y predictivo de respuesta al tratamiento estándar, especialmente la coexistencia de translocaciones que afectan al gen MYC con translocaciones afectando a los genes BCL2 o BCL6. Estos pacientes presentan una respuesta deficiente al esquema de inmunoquimioterapia estándar (tipo R-CHOP y esquemas similares), y actualmente se tratan con esquemas más intensivos o incluso esquemas tipo linfoma de Burkitt (15,16). La implicación de la biología del LDCGB en el tratamiento del mismo se describe en la sección “Tratamiento” (Pág. 37). En los últimos años, los estudios de secuenciación masiva mediante next generation sequencing (NGS) han permitido identificar el espectro de mutaciones y vías de señalización implicadas en la patogenia del LDCGB, especialmente en tres grandes estudios que están buscando su validación clínica (17–19). Biología del linfocito B normal Los linfocitos B se desarrollan desde las células madre hematopoyéticas (CMH) de la médula ósea (MO). Primero, las CMH se diferencian en progenitores linfoides comunes que, tras diferentes estados de maduración, dan lugar a los linfocitos B vírgenes, células B que aún no han tenido contacto con su antígeno. Durante este proceso de diferenciación en la MO, se da el proceso de recombinación V(D)J para formar el receptor del linfocito B (BCR), que está formado por inmunoglobulinas de superficie asociadas a un complejo señalizador transmembrana y tiene la función de reconocer a los antígenos para iniciar la respuesta inmune adaptativa del linfocito B. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 12 Los genes encargados de la síntesis de las inmunoglobulinas son el gen IGH (cadena pesada) e IGK o IGL (cadenas ligeras kappa y lambda). A diferencia de otros genes, la secuencia de estos genes no puede transcribirse directamente en un ARN mensajero (ARNm) y deben primero ser procesados por los linfocitos B. Estos genes tienen varias regiones V y J (y en el caso de IGH también varias regiones D) que el linfocito B debe reordenar, dejando exclusivamente una de cada para formar un gen funcional. Este reordenamiento aleatorio permite generar alrededor de 3x1011 combinaciones distintas de inmunoglobulinas, capaces de reconocer un inmenso repertorio de antígenos. A nivel molecular, el proceso consiste en cortar el ADN eliminando varias regiones D y J para posteriormente ensamblarlo, uniendo una D con una J. Posteriormente el proceso se repite con las regiones V y D. Las principales enzimas que participan en este proceso son RAG1/2 que forman un complejo encargado de cortar el ADN por regiones específicas entre las regiones V, D y J, TdT que añade nucleótidos aleatorios en los puntos de corte para aumentar la diversidad y, por último, el sistema de reparación del ADN por recombinación no homóloga ensambla los extremos libres. Una vez han completado este proceso, los linfocitos B sufren un proceso de selección positiva y negativa. Durante la selección positiva, los linfocitos B que han reordenado un BCR funcional reciben señales de supervivencia y diferenciación del estroma medular. Los linfocitos cuyo reordenamiento fue no productivo, realizan un segundo reordenamiento utilizando el otro alelo de IGH o entran en apoptosis. En la selección negativa, los linfocitos B que han producido BCR que reaccionan fuertemente contra antígenos propios, son eliminados, de forma que se limita el riesgo de REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 13 autoinmunidad. La selección negativa que sufren los linfocitos B en la MO no es tan estricta como la que sufren los linfocitos T en el timo, y pueden, por lo tanto, existir clones de linfocitos B autorreactivos. Sin embargo, dado que la activación de los linfocitos B requiere la colaboración con linfocitos T previamente activados, el riesgo de autoinmunidad por la presencia de estas clonas es bajo. Una vez han completado el proceso de diferenciación en la MO, los linfocitos B vírgenes (sin contacto previo por el antígeno) circulan por la sangre periférica y se establecen en los órganos linfoides secundarios (principalmente ganglios linfáticos) donde forman folículos linfoides. En éstos, se originan los centros germinales, estructuras temporales que surgen en respuesta al contacto con un antígeno timo-dependiente y cuya función es madurar la afinidad de los linfocitos B que reconocen a dicho antígeno y diferenciarlos hacia células plasmáticas o linfocitos B de memoria. La función de las células plasmáticas es producir anticuerpos contra el antígeno de forma muy eficiente, mientras que los linfocitos B de memoria persisten durante largos periodos en el organismo para poder iniciar una respuesta inmune de forma más rápida ante posteriores contactos con el antígeno, sin necesidad de realizar el proceso de maduración de la afinidad antigénica de nuevo (20). Alteraciones genéticas en el LDCGB Las alteraciones genéticas que participan en la patogenia del LDCGB son muy diversas. Como en el caso de otros tumores, la linfomagénesis se basa en la progresiva activación de protooncogenes y desactivación de genes supresores de tumores. Estas mutaciones pueden originarse tanto por procesos comunes REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 14 con otras neoplasias, por ejemplo, la deaminación espontánea asociada a la edad, como por mecanismos específicos relacionados con el proceso de diferenciación y maduración de los linfocitos B (13). Durante su maduración, los linfocitos B realizan los procesos de reordenamiento de las cadenas de inmunoglobulinas, cambio de clase e hipermutación somática. Estos procesos, necesarios para crear las inmunoglobulinas específicas con las que los linfocitos B realizan su función inmune, se basan en activar de forma controlada los genes RAG1 y RAG2, que participan en el reordenamiento de IGH. En este proceso se pueden causar roturas en IGH que lleven a translocaciones con otros genes (21). Además, la deaminasa de citidina inducida por activación (AID) media el cambio de clase y la hipermutación somática de las inmunoglobulinas. Durante el cambio de clase se pueden inducir roturas off-target en genes que estén transcripcionalmente activos como MYC o BCL6, dando lugar a los reordenamientos MYC::IGH e IGH::BCL6, respectivamente (22). Respecto a la hipermutación somática, la acción off-target de la AID durante este proceso parece ser también una fuente importante de mutaciones oncogénicas en el LDCGB ya que alrededor de la mitad de los LDCGB presentan un patrón de mutaciones similar a la hipermutación somática en genes distintos a los de las inmunoglobulinas. De hecho, las mutaciones en algunos genes implicados en la patogenia del LDCGB como BCL2, SGK1 y PIM1 parecen mediadas principalmente por AID (17). Las vías implicadas en la patogenia del LDCGB son muy diversas, y aunque se observan ciertos patrones en las alteraciones genéticas según la célula de origen, los LDCGB CBA y CG no son entidades biológicamente homogéneas y hay gran variabilidad de las vías REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 15 implicadas en la patogenia dentro de cada grupo. Las vías metabólicas y de señalización más frecuentemente alteradas en los LDCGB se exponen a continuación. Diferenciación del linfocito B Se han descrito varias alteraciones genéticas que interrumpen la diferenciación de los linfocitos B en pacientes con LDCGB. El gen BCL6 es reconocido como el regulador maestro de la transición por el centro germinal, y el gen PRDM1 es el regulador clave responsable de la diferenciación de células plasmáticas. BCL6: BCL6 regula la transición por el centro germinal y diferenciación a célula plasmática. Entre el 25-50% de los LDCGB CBA y el 10-30% de los CG tienen translocaciones de este gen que provocan la sobreexpresión de la proteína. También se han observado mutaciones en el promotor de BCL6 que impiden la autorregulación negativa y favorecen su sobreexpresión. Además, las mutaciones activadoras en MED2B o inactivadoras en EP300 y CREBPP, también favorecen la sobreexpresión de BCL6. La sobreexpresión de BCL6 en LDCGB promueve la proliferación celular, impide la maduración a célula plasmática y limita la respuesta al daño en el ADN (23–26). PDRM1: Este gen suprime la vía de señalización del BCR y la proliferación celular en los linfocitos B activados para promover su diferenciación terminal a célula plasmática (27). Se observan mutaciones de PDRM1 en un 20-25% de LDCGB CBA. La pérdida de función de PMDR1 activa NF-κB y bloquea la diferenciación a célula plasmática (28). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 22 se dan en un 20% de los LDCGB, sobre todo CBA, y protegen frente a la acción citotóxica antitumoral de los linfocitos T CD8+ y NK (54). PDL1 y PDL2: Se han observado ganancias de número de copias, amplificaciones y translocaciones de PDL1 y PDL2 sobre todo en LDCGB CBA, que producen sobreexpresión de estos genes, lo que facilita la anergia de los linfocitos T en el microambiente tumoral (56). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 23 Clasificaciones de los LDCGB Clasificación histológica Los LDCGB son considerados un grupo heterogéneo de entidades desde el punto de vista histológico. Aunque presentan algunas características morfológicas e inmunohistoquímicas comunes, también presentan múltiples características específicas que han permitido clasificarlos en diversas entidades. A partir de la clasificación de Neoplasias Linfoides de la Organización Mundial de la Salud 4ª edición, publicada en 2016 (OMS 2016) se han incluido varias entidades diagnósticas dentro del LDCGB intentando reflejar estas diferencias clínicas y biológicas (1). Estas entidades han sido revisadas en las recientes clasificación de la OMS (5ª edición) (57) y la clasificación internacional de consenso de neoplasias linfoides maduras (ICC) (58). Teniendo en cuenta las clasificaciones anteriores, en los LDCGB se incluyen las siguientes entidades: • LDCGB rico en células T e histiocitos: En este subtipo de LDCGB en el que las células tumorales suponen <10% de la celularidad total y predomina un infiltrado policlonal de linfocitos T e histiocitos. Este tipo infrecuente de LDCGB tiene tendencia a infiltrar la médula ósea y bazo (59). • LDCGB primario mediastínico (tímico): Supone el 7% de los LDCGB y se diagnostica frecuentemente en edades más tempranas que el resto de LDCGB (30-40 años), con un predominio en mujeres con una relación 3 a 2 (60). Se origina en los linfocitos B de la médula del timo y tiene tendencia a comprimir estructuras locales, causando con REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 24 frecuencia síndrome de vena cava superior, trombosis de grandes vasos y taponamiento cardiaco. • Linfoma intravascular de células B grandes: Define una variante muy infrecuente de LDCGB en la que se da una proliferación neoplásica intravascular de linfocitos B grandes afectando sobre todo a los vasos de pequeño tamaño en el sistema nervioso central (SNC), riñones, pulmones y piel, sin que haya una obvia expresión leucémica. Es una variante de comportamiento clínico muy agresivo (61,62). • LDCGB primario de localizaciones inmunoprivilegiadas: La 5ª edición de la clasificación de la OMS reconoce una entidad específica para los LDCGB de localización primaria en el SNC, humor vítreo, retina o testículos. Estos LDCGB suelen presentar un perfil de expresión génica de célula B activada y mutaciones en MYD88 y CD79B (57). • LDCGB cutáneo primario, tipo pierna “leg type”: Se trata de un LDCGB de localización cutánea primaria que frecuentemente afecta a la piel de las piernas de forma bilateral. Es un subtipo muy infrecuente de LDCGB (1). • LDCGB asociado a inflamación crónica: LDCGB que se desarrolla sobre áreas de inflamación crónica previa (generalmente piotórax crónicos) y se asocia con infección por virus de Epstein Barr. Afecta principalmente a ancianos, aunque es muy infrecuente (57). • LDCGB/Linfoma B de alto grado con translocación de BCL2 y MYC: Puede presentar histología del LDCGB o linfoma de alto grado más indiferenciado o anaplásico. Se caracteriza por la translocación de MYC y BCL2 con un gen cuyo promotor se encuentra activo en los linfocitos B REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 25 (generalmente IGH, IGK o IGL). Estos linfomas suelen presentar un perfil de expresión génica de centro germinal y comparten características clínicas y biológicas con el linfoma de Burkitt. Este subtipo es clínicamente muy agresivo y requiere un tratamiento más intensivo que el resto de LDCGB (40,63). • LDCGB, no especificado de otra manera (LDCGB, NOS): Esta entidad agrupa todos los casos que no pueden clasificarse en ninguna de las entidades anteriores, y muestra una gran heterogeneidad clínica y biológica. Se trata, con diferencia, de la entidad más frecuente dentro del global de LDCGB, ya que más de la mitad de los diagnósticos de éste se incluyen en ella. Histológicamente, esta variante se caracteriza por una infiltración homogénea por linfocitos B grandes que borra por completo la estructura ganglionar (Fig. 2). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 26 Fig. 2: Imagen histológica de un LDCGB, NOS. A: Hematoxilina eosina 500x mostrando una infiltración difusa homogénea, principalmente por células grandes con núcleos de cromatina laxa. B: Tinción inmunohistoquímica para CD20, mostrando una fuerte positividad en la membrana de las células, lo que las identifica como clinfocitos B. Fotografía Cortesía del Servicio de Anatomía Patológica del HUC. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 27 Clasificación por célula de origen En el año 2000, Alizadeh et al. desarrollaron una clasificación del LDCGB basada en el patrón de expresión génica medida mediante microarrays de expresión génica (14). Con esta clasificación identificaron 2 subgrupos de LDCGB, centro germinal (CG) y célula B activada (CBA), además de un pequeño porcentaje de LDCGB inclasificables. Los LDCGB con perfil tipo CG presentan una expresión génica similar a la de los linfocitos normales que proliferan en el centro germinal, mientras que los del tipo CBA muestran un perfil similar al que presentan los linfocitos B post-centro germinal cuando se activan por entrar en contacto con su antígeno. En ambos casos, estos perfiles de expresión que en los linfocitos B normales ocurren únicamente durante la proliferación y activación, se mantienen indefinidamente en los linfocitos neoplásicos del LDCGB (Fig. 3) (64–66). Esta clasificación tiene relevancia clínica, ya que el pronóstico de los LDCGB CBA es peor que el de los CG, ya que muestran una supervivencia global a los 5 años de un 25% a un 40% inferior. Sin embargo, esta clasificación presenta varias limitaciones importantes que han impedido su aplicación en el desarrollo de estrategias personalizadas de tratamiento a nivel clínico. Primero, existe mucha heterogeneidad biológica y clínica dentro de cada grupo (CBA y CG). Esto es debido a que existen múltiples mecanismos por los cuales los linfocitos pueden adquirir el fenotipo neoplásico y desembocar en cualquiera de los dos perfiles de expresión génica (diferentes alteraciones genéticas pueden desembocar en la misma célula de origen). Adicionalmente, existen REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 28 patrones mutacionales capaces de producir indistintamente linfomas tanto con perfil de expresión CBA como CG (alteraciones genéticas similares pueden desembocar en célula de origen diferente), como se expone en el apartado siguiente. Segundo, la utilización de los arrays de expresión génica es compleja, lo que ha supuesto que no se puedan aplicar de forma generalizada en los laboratorios clínicos-asistenciales. De hecho, la forma más habitual en la actualidad de clasificar por célula de origen es mediante la aplicación de algoritmos basados en la presencia o ausencia de expresión de ciertos marcadores inmunohistoquímicos, como el algoritmo de Hans (Fig. 4) o el de Choi. Estos algoritmos tienen una concordancia con la expresión génica de entre el 85-90% (67,68). Cuando los LDCGB se clasifican mediante algoritmos inmunohistoquímicos se suelen clasificar en los en los subgrupos CG y No CG (NCG), en lugar de CG y CBA. El grupo NCG incluiría todos los LDCGB que no son CG, es decir, a los CBA propiamente dichos y los LDCGB que habrían sido inclasificables por arrays de expresión génica. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 29 Fig. 3: Maduración de los linfocitos B en el ganglio y célula de origen de los dos tipos LDCGB y otras neoplasias B maduras relacionadas. LLC: Leucemia Linfática Crónica, HMS: Hipermutación somática. LCM: linfoma de Células del Manto. Elaboración propia basada en referencias 64–66. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 30 Fig. 4: Algoritmo de Hans. A: Algoritmo inmunohistoquímico (CG: Centro germinal). B-E: Aplicación del algoritmo de Hans para clasificación por célula de origen de un caso de LDCGB. B: Hematoxilina Eosina. C: CD10 de membrana, negativo. D: BCL6 nuclear, positivo. E: MUM1 nuclear, positivo. Según el algoritmo de Hans, este caso quedaría clasificado como “No Centro Germinal”. Cortesía del Servicio de Anatomía Patológica del HUC. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 31 Clasificación molecular En 2018 Chapuy et al. llevaron a cabo un análisis mediante secuenciación del exoma y transcriptoma completos de 304 LDCGB para identificar mutaciones puntuales, indels, alteraciones somáticas del número de copias y variantes estructurales. Integrando esos datos lograron identificar cinco subtipos de LDCGB con características genéticas y clínicas diferenciadas, que denominaron “Clústeres” (17). Poco después, Schmidt et al. desarrollaron otra clasificación basándose en los resultados de NGS con un panel de 327 genes y análisis de número de copias en 574 LDCGB (18). Con los resultados obtenidos encontraron cuatro subtipos diferentes de LDCGB que se caracterizaban por presentar alteraciones genéticas características y tener un comportamiento clínico diferenciado. Además, también crearon un sistema de clasificación en base a un panel más compacto de 50 genes y las translocaciones de BCL2 y BCL6 para facilitar su aplicación clínica. Este panel clasificador tenía una alta concordancia (>94%) con la clasificación basada en el panel completo de 327 genes y análisis del número de copias. Un 54% de los linfomas CBA y un 51% de los linfomas CG no pudieron ser clasificados en ninguno de los cuatro subtipos propuestos por Schmidt et al. Por esta razón, ese mismo grupo presentó una actualización de su clasificación en 2020 añadiendo dos subtipos moleculares adicionales (19). Ambas clasificaciones son superponibles, aunque con ciertas diferencias, y parecen tener valor pronóstico, diferenciando pacientes de alto y bajo riesgo de recaer o ser refractarios. Sin embargo, en ambos casos el estudio pronóstico se ha realizado de REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 38 Una posible explicación a estos pobres resultados podría residir en la heterogeneidad biológica del LDCGB. La mayoría de estos estudios utilizaron herramientas clínicas (scores pronósticos tipo Índice Pronóstico Internacional, IPI) o clasificaciones atendiendo a la célula de origen para estratificar a los pacientes, herramientas que presentan limitaciones. De esta forma, los pacientes incluidos en los estudios fueron heterogéneos y aunque un subgrupo de los mismos respondiera mejor al tratamiento intensificado, eso no compensó la toxicidad a la que fueron expuestos el resto de pacientes por el sobretratamiento que recibieron (75). Un hecho que apoya esta hipótesis es que la intensificación del tratamiento ha tenido un mayor impacto en el subgrupo de LDCGB y Linfomas B de alto grado (LBAG) con reordenamiento de MYC y BCL2, donde la administración de un régimen intensificado y ajustado a la máxima tolerancia hematológica de cada paciente (Rituximab, etopósido, prednisona, vincristina, ciclofosfamida, doxorrubicina; R-daEPOCH) ha demostrado mejorar las tasas de respuesta y la supervivencia libre de eventos en comparación con R‑CHOP (15). Esta entidad, como ya se ha comentado con anterioridad, se distingue por su pronóstico adverso y biomarcadores diagnósticos distintivos y relativamente sencillos de analizar, lo que facilita su identificación precisa y el desarrollo de terapias con intensificación de dosis. En este sentido, tras describirse la clasificación molecular del LDCGB, los investigadores del estudio PHOENIX (76) que comparaba R‑CHOP vs. R‑CHOP + ibrutinib en LDCGB no CG, clasificaron molecularmente de forma retrospectiva a los pacientes que participaron en el estudio para determinar si la respuesta fue diferente entre los diferentes grupos moleculares. A pesar de que REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 39 en el estudio principal no observaron diferencias significativas entre R‑CHOP e ibrutinib + R‑CHOP en la población completa, el análisis de subgrupos mostró resultados significativamente mejores con ibrutinib + R-CHOP en comparación con R‑CHOP en pacientes <60 años con grupos moleculares MCD y N1 (SLE 100% vs. 47% y 50% respectivamente), mientras que no hubo diferencias en los grupos BN2 e inclasificables (77). Actualmente, está en curso el ensayo GIDANCE-01 (NCT04025593), un estudio en fase II que compara R‑CHOP contra R‑CHOP-plusX, consistente en R‑CHOP estándar más un fármaco adicional (ibrutinib, decitabina, tucidinostat o lenalidomida) escogido según la clasificación molecular del LDCGB y otros biomarcadores genéticos. En un análisis intermedio de 107 pacientes se observó que los resultados eran significativamente mejores en la rama RCHOP-plusX, tanto en tasa de RC (87% vs. 66%) como en SLP a 1 año (96% vs. 79%) (78). Todos estos hallazgos sugieren que es necesario el diseño de sistemas de estratificación de riesgo más precisos para los pacientes con LDCGB. Estos sistemas podrían permitir dirigir estrategias de intensificación desde la primera línea en los pacientes de alto riesgo, así como atenuar el tratamiento, disminuyendo toxicidad innecesaria, en los pacientes con mejor pronóstico. Tratamiento de segunda línea y posteriores El tratamiento estándar del LDCGB en recaída o refractario (R/R) es la quimioterapia intensiva basada en platino seguida de intensificación con quimioterapia a altas dosis y trasplante autólogo de progenitores hematopoyéticos (TAPH). Este tratamiento puede REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 40 ser curativo en alrededor de la mitad casos, pero presenta limitaciones notables. Por una parte, es un tratamiento muy intensivo y no exento de efectos adversos que requiere que el paciente presente una buena reserva funcional. Otra de sus limitaciones es la edad, ya que los TAPH no están indicados habitualmente en pacientes mayores de 75 años, edad en la que los LDCGB son más prevalentes. De esta forma, en torno a la mitad los pacientes con LDCGB R/R no son candidatos a recibir TAPH. También hay que tener en cuenta que la eficacia de este tratamiento es mucho menor en los pacientes que presentan enfermedad quimio-refractaria o recaídas precoces (< 1 año). Además, las recaídas tras esta segunda línea de tratamiento tienen muy pocas probabilidades de responder a quimioterapia tradicional y su pronóstico es infausto. Por todo ello, se han intentado desarrollar nuevas estrategias de rescate basadas en inmuno y quimioterapia (Tabla 2), de las cuales la más prometedora disponible es la terapia celular con linfocitos T con receptor antigénico quimérico (CAR-T) anti CD19. Los CAR-T son linfocitos T citotóxicos autólogos modificados genéticamente mediante la introducción de un vector retroviral que contiene la secuencia de un receptor quimérico anti-CD19. Este receptor combina la región variable de una inmunoglobulina antiCD19 con la región intracelular del receptor de la célula T (TCR), de forma que estos linfocitos CD8+ pueden activarse y destruir las células neoplásicas que expresan CD19 de forma muy eficiente y sin necesidad de activarse por los linfocitos T CD4+. Actualmente existen 3 productos CAR-T comerciales aprobados para el tratamiento del LDCGB: Axicabtagene ciloleucel (Axi-cel), REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 41 Tisagenlecleucel (Tisa-cel) y Lisocabtagene maraleucel (Liso-cel), caracterizados por una eficacia similar, pero con algunas diferencias estructurales derivadas principalmente de un dominio coestimulador diferente (CD28 para Axi-cel, 4-1BB para Tisa-cel y Liso-cel) y una relación CD4+/CD8 + equilibrada única para Liso-cel. Los tres productos demostraron una alta eficacia en el LDCGB R/R tras al menos 2 líneas previas, con tasas de respuesta globales del 52 al 83% con un 40% a 58% de RC y una mediana de duración de la respuesta de 11 a 23 meses entre diferentes ensayos (79–81). Estos buenos resultados de los CAR-T como tercera línea impulsaron a probarlos como tratamiento de segunda línea en LDCGB R/R. Se han llevado a cabo tres grandes ensayos aleatorizados de fase III en los que se compararon los tres productos CAR-T y el tratamiento estándar (Quimioterapia de rescate y TAPH), en pacientes con LDCGB refractario o en recaída precoz (82–84). En el ensayo BELINDA, el tisa-cel no mostró superioridad respecto al tratamiento estándar de rescate, probablemente debido a un largo tiempo desde la recaída hasta la administración del CAR-T (mediana de 59 días) (84). En cambio, los ensayos ZUMA-7 (Axi-cel) y TRANSFORM (Liso-cel) demostraron la superioridad de los dos productos CAR-T respecto al tratamiento estándar, tanto en términos de respuestas al tratamiento (RC 65% frente a 32%, y 66% frente a 39%, respectivamente) como de supervivencia (mediana de SLE 8,2 frente a 2 meses y 10,2 frente a 3,1 meses, respectivamente). A pesar de estos resultados prometedores, los CAR-T tienen ciertas limitaciones que pueden dificultar su implantación como tratamiento de segunda línea. Son productos económicamente muy costosos, su manufactura es compleja y puede demorarse REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 42 varias semanas, lo que puede dificultar su uso en pacientes con enfermedades rápidamente progresivas (de hecho, este pudo ser una de las principales causas de los resultados negativos del estudio BELINDA) y, además, al dirigirse contra una única diana (el CD19) pueden fomentar la evolución clonal y aparición de mecanismos de escape en las células neoplásicas. La implantación de nuevos biomarcadores que permitan una estratificación del riesgo más precisa y la identificación precoz de la recaída en un momento en el que haya una baja carga tumoral podrían mitigar estos problemas, al permitir la utilización de los CAR-T de forma más eficiente, centrándose en los pacientes que más se van a beneficiar de ellos. Evaluación de la respuesta y monitorización La mayoría de las recaídas del LDCGB ocurren durante los primeros dos años de seguimiento. Actualmente la evaluación de la respuesta se realiza mediante PET-TC al finalizar el tratamiento y, posteriormente, únicamente mediante herramientas clínicas (anamnesis, exploración), reservando las pruebas de imagen para los momentos en los que se sospeche una recaída. Se han estudiado varias estrategias de monitorización con pruebas de imagen (PET o TC) seriadas para intentar detectar de forma precoz la recaída, pero estas estrategias no han prosperado, principalmente por su baja sensibilidad y por riesgos asociados a la irradiación repetida (85,86). De esta forma, actualmente no se cuenta con ninguna herramienta que permita detectar precozmente las recaídas antes de que sean sintomáticas. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 43 Tabla 1. Estrategias de mejora de la primera línea de tratamiento del LDCGB Esquema Fase N CdO Caract. Ptes. Resultados R-CHOP14 (87) III 540 Todas SLP a 2 años 75,4% vs. 74,8% (NS) SG a 2 años 82,7% vs 80,8% (HR 0.9, NS) R-ACVBP (88) III 194 Todas IPI 1 (bajo riesgo). Edad <60 años. SLE a 3 años 81% vs 67% (HR 0,56, p=0,0035) EAs grado 3-4 42% vs 15% R-da-EPOCH (89) III 266 Todas SLP a 2 años 78.9 vs 75,5, SG 86,5 vs 85,7 (NS) R-CHOP + TAPH (90) III 199 Todas SG a 5 años 78% vs 77% (NS) G-CHOP (91) III 706 Todas SLP a 3 años 70% vs 67% (NS). EAs más frecuentes con G-CHOP R2-CHOP (E1412) (92) II 145 Todas ECOG <2 SLP a 3 años del 73% frente al 61%, (HR 0,66) SG a 3 años 83% vs 75% (HR 0,67) R2-CHOP (ROBUST) (93) III 285 No CG SLP a 2 años 72%, SG a 2 años 79%. No diferencias significativas con R-CHOP, HR 0,85 (95% CI, 0,63 A 1,14). VR-CHOP (PYRAMID) (94) II 103 No CG No diferencias en SLP ni SG REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 44 Esquema Fase N CdO Caract. Ptes. Resultados VR-CHOP (REMODLB) (95) III 459 Todas SLP a 30 meses 70,1% vs 74,3% (NS) Ibrutinib + RCHOP (76) III 419 No CG No diferencia en SLP en la cohorte completa. En menores de 60 años PFS superior con Ibrutinib + RCHOP (HR 0,57) Pola-R-CHP (POLARIX) (74) III 440 Todas Edad <80 años. RC 78% vs 74% (NS). SLP a 2 años 76,7% vs. 70,2%. No diferencias es SG. No diferencia en EAs graves. Venetoclax + RCHOP (96) II 206 Todas ECOG <2 RG 83%, RC 69%. SLP a 2 años 80% (HR vs. Controles históricos R-CHOP 0,61%) EAs grado 3-4: 86% Abreviaturas: Caract. Ptes.: Características de los pacientes N: Número de pacientes incluidos en la rama experimental. CdO: Célula de origen. IPI: índice pronóstico internacional. SLP: Supervivencia libre de progresión. RG: Respuestas globales. RC: Respuestas completas. SLE: Supervivencia libre de eventos. SG: Supervivencia global. HR: Hazard Ratio. No CG: No centro germinal. EAs: Eventos Adversos. NS: No significativo. ECOG: Eastern Cooperative Oncology Group (Perfeormance Scale). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 45 Tabla 2. Nuevos fármacos para el tratamiento del LDCGB en recaída o refractario. Esquema Descripción Fase N Población Resultados Tafasitamab + Lenalidomida (97) Anti-CD19 con lenalidomida II 81 LDCGB R/R no elegibles para TAPH RG 60%, RC 43%, SLP a 1 año 50% Mosunetuzumab (98) Anticuerpo biespecífico AntiCD20 x Anti-CD3 I 129 LNH-B R/R (Incluye LDCGB y otros) RG 39%, RC 19%, Mediana SLP 1,4 meses Glofitamab (99) Anticuerpo biespecífico AntiCD20 x Anti-CD3 I 127 LNH-B R/R (Incluye LDCGB y otros) RG 41%, RC 29%, Mediana SLP 2,4 meses Epcoritamab (100) Anticuerpo biespecífico AntiCD20 x Anti-CD3 I/II 46 LNH-B R/R (Incluye LDCGB y otros) RG 68%, RC 45% Odronextamab (101) Anticuerpo biespecífico AntiCD20 x Anti-CD3 I 71 LNH-B R/R (Incluye LDCGB y otros) RG 60%, RC 60% en pacientes previamente no tratados con CAR-T. RG 33%, RC 24% en pacientes previamente tratados con CAR-T REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 46 Esquema Descripción Fase N Población Resultados Plamotamab (102) Anticuerpo biespecífico AntiCD20 x Anti-CD3 I 36 LNH-B R/R (Incluye LDCGB y otros) RG 33% Polatuzumab-RBenda (103) Anti-CD79 con rituximab y bendamustina II 192 LDCGB R/R no elegibles para TAPH RG 41.5%, RC 38.7%. Mediana SLP 9.2 meses. Mediana SG 12.4 meses. Loncastuximab teresine (104) Anticuerpo conjugado contra CD19 II 145 LDCGB R/R RG 42%, RC 24%. Mediana SLP 4.9 meses. Mediana SG 9.9 meses. Abreviaturas: N: Número de pacientes incluidos en la rama experimental (solo incluye los LDCGB en caso de que el estudio incluyese otros LNH). CdO: Célula de origen. IPI: índice pronóstico internacional. SLP: Supervivencia libre de progresión. RG: Respuestas globales. RC: Respuestas completas. SLE: Supervivencia libre de eventos. SG: Supervivencia global. HR: Hazard Ratio. No CG: No centro germinal. EAs: Eventos Adversos. NS: No significativo. LNH: Linfoma no Hodgkin. R/R: en recaída o refractario. TAPH: Trasplante autólogo de progenitores hematopoyéticos. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 47 Necesidades no cubiertas en los LDCGB Teniendo en cuenta lo previamente expuesto, se podría considerar que existen una serie de necesidades no cubiertas en el LDCGB: • Dificultad para diseñar estrategias de mejora de la primera línea basadas en intensificación o terapias dirigidas, debido al riesgo de sobre o infra tratamiento, porque los biomarcadores actualmente en uso, no permiten identificar claramente a los pacientes de alto riesgo. • La sensibilidad de las técnicas de evaluación de la respuesta es limitada, lo que impide diseñar estrategias de consolidación en primera línea basadas en la presencia o no de enfermedad residual. • No existen técnicas de monitorización de la enfermedad que permitan detectar precozmente la recaída, de forma que ésta suele presentarse de forma sintomática, con enfermedad extensa, lo que puede limitar la aplicabilidad de tratamientos que requieren tiempo de manufactura o en los que la cantidad de masa tumoral se ha relacionado con su eficacia (como la terapia CAR-T). Actualmente se están investigando nuevos biomarcadores en el LDCGB que puedan ayudar a suplir estas necesidades. Entre ellos, destaca el ADN extracelular circulante (ADNec), cuyo estudio se conoce como “biopsia líquida” y presenta un papel cada vez más relevante como biomarcador en oncología. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 54 residual (EMR), sino para detectar la aparición de nuevas mutaciones que puedan indicar la formación de clones resistentes al tratamiento. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 55 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 56 REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 57 Hipótesis y Objetivos Como se ha indicado anteriormente, el LDCGB muestra una marcada heterogeneidad biológica y clínica que supone que el pronóstico de los pacientes no pueda ser predicho con exactitud con las herramientas de estratificación pronóstica actualmente disponibles en la práctica clínica. Este hecho ha dificultado mucho el diseño de estrategias de tratamiento dirigidas contra esta enfermedad. En la última década, el estudio mediante NGS del ADN circulante tumoral de forma no invasiva (conocido como “biopsia líquida”) ha tomado relevancia en múltiples cánceres. Aunque la investigación sobre estas técnicas en LDCGB aún es relativamente escasa, varios estudios han mostrado que podría aportar información pronóstica en estos pacientes. Teniendo todo lo anterior en cuenta, proponemos la siguiente hipótesis y objetivos. Hipótesis El estudio molecular del ADN extracelular circulante en plasma mediante Next Generation Sequencing en pacientes con Linfoma Difuso de Células Grandes B permite mejorar la estratificación pronóstica proporcionada por las herramientas clínicas actualmente en uso e identificar a pacientes de muy alto riesgo de refractariedad o recaída. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 58 Objetivos El objetivo de este estudio es identificar biomarcadores moleculares de forma mínimamente invasiva que permitan detectar a los pacientes con LDCGB de alto riesgo de no responder a la quimioterapia de primera línea o de recaer, mejorando así la estratificación pronóstica de estos linfomas. Para ello, se han propuesto los siguientes objetivos específicos: 1. Evaluar la sensibilidad de la tecnología NGS para identificar mutaciones somáticas en ADN extracelular circulante obtenido a partir de plasma (biopsia líquida), en una serie de pacientes con LDCGB, mediante el estudio de: 1.1 La concordancia en la detección de variantes somáticas, identificadas mediante un panel preseleccionado de genes relacionados con la biología de los LNH, en muestras pareadas de ADN extraído tejido tumoral fijado en formalina y embebido en parafina y en ADN extracelular circulante obtenido de plasma. 1.2 La concordancia entre la asignación de subtipos moleculares de LDCGB según las variantes identificadas en ADN extraído de tumor y plasma, con el panel anteriormente mencionado. 2. Establecer el perfil mutacional del LDCGB en biopsia líquida en una serie ampliada de pacientes, mediante: 2.1 La identificación de los genes más frecuentemente mutados en LDCGB a partir de un panel preseleccionado de genes relacionados con la biología de los LNH. 2.2 La identificación de variantes recurrentes y regiones frecuentemente mutadas en LDCGB (hotspots). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 59 3. Identificar biomarcadores no invasivos en pacientes con LDCGB que permitan: 3.1 Estratificar el pronóstico de los pacientes de nuevo diagnóstico. 3.2 Evaluar precozmente la respuesta al tratamiento de primera línea con esquemas basados en R-CHOP. 4. Evaluar la utilidad de los biomarcadores previamente identificados en una pequeña cohorte de pacientes con LDCGB recaído o refractario tratados con esquemas de rescate con intención curativa. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 60 REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 61 MATERIALES Y MÉTODOS REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 62 REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 63 Métodos Población de estudio y muestras biológicas Criterios de inclusión y exclusión Se incluyeron pacientes con LDCGB, de novo o transformado de linfomas de bajo grado diagnosticados en los Servicios de Hematología y Hemoterapia del Hospital Universitario Cruces y Hospital Universitario Araba entre los años 2018-2022, que cumplieron los siguientes criterios de inclusión y no presentaron ninguno de los siguientes criterios de exclusión. Criterios de inclusión: 1. Diagnóstico de LDCGB confirmado mediante estudio anatomopatológico con alguna de las siguientes histologías: • LDCGB, no especificado de otra manera (LDCGB, NOS) • LDCGB rico en células T e histiocitos • LDCGB de localizaciones inmunoprivilegiadas • LDCGB primario mediastínico (tímico) • Linfoma de alto grado doble/triple hit según la clasificación OMS 2016 de neoplasias linfoides (139), con morfología de LDCGB en la anatomía patológica, que corresponde a LDCGB con translocación de MYC y BCL2 en la más reciente clasificación OMS2022 (57). 2. Tratamiento con intención curativa: • Pacientes incluidos en primera línea: Tratamientos basados en Rituximab y antraciclinas “R-CHOP like”, incluyendo R-CHOP, R-daEPOCH, R-miniCHOP y R-CHOP con antraciclinas liposomales, seguidos o no de consolidación con auto-TPH. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 70 Secuenciación del ADN Panel NGS Se utilizó un panel basado en sondas de captura previamente publicado para su uso en muestras de ADNec en LDCGB (142). Este panel contiene 112 genes frecuentemente mutados en linfomas no Hodgkin B: • Región codificante completa: ACTB, ARID1A, ARID1B, ARID5B, ATM, B2M, BCL10, BCL2, BCL6, BCOR, BTG1, BTG2, BTK, CARD11, CCND3, CD274, CD36, CD58, CD70, CD79A, CD79B, CD83, CDKN2A, CDKN2B, CIITA, CREBBP, CXCR4, DDX3X, DTX1, EP300, ETS1, ETV6, FBXW7, FOXO1, GNA13, GNAI2, HIST1H1B, HIST1H1C, HIST1H1D, HIST1H1E, ID3, IRF2BP2, IRF4, IRF8, ITPKB, KLHL14, KLHL6, KMT2D, KRAS, MALT1, MAML1, MAP2K1, MAPK1, MCL1, MEF2B, MFHAS1, MYC, MYD88, NFKBIA, NFKBIE, NFKBIZ, NOTCH2, OSBPL10, PARP2, PAX5, PIK3CA, PIM1, POU2F2, PRDM1, PRKCB, REL, RHOA, RRAGC, S1PR1, S1PR2, SETD1B, SETD2, SGK1, SMARCA4, SOCS1, SPEN, SPIB, STAT3, STAT6, TBL1XR1, TCF3, TMEM30A, TMSB4X, TNFAIP3, TNFRSF14, TNIP1, TOX, TP53, XBP1 y ZEB2. • Exones seleccionados: BRAF, DIS3, EBF1, EZH2, FAS, HVCN1, NOTCH1, NRAS, P2RY8, PCBP1, PIK3CD, PIK3R1, PTEN, PTPRD, SF3B1, TET2 y XPO1. El ADN proveniente de FFPE se fragmentó con COVARIS®, mientras que el ADNec se procesó sin fragmentar, ya que por su naturaleza se encuentra ya fragmentado en cadenas de unas 150 pb. Se realizaron librerías con 10-200 ng de ADNec y 150 ng de ADN proveniente de muestras FFPE utilizando adaptadores con barcode molecular (ThruPLEX Taq-seq Kit, Takara) y enriquecimiento por captura (SureSelect XT Target Enrichment System). La calidad de las REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 71 librerías se determinó utilizando Bioanalyzer (High Sensitivity DNA kit) y, posteriormente, las librerías se secuenciaron en el instrumento NovaSeq 6000 de Illumina (2x150 bp) en los Servicios Generales de Investigación de la UPV/EHU (SGIker). Flujo de trabajo y análisis bioinformático Los datos crudos resultantes de la secuenciación se analizaron para identificar las variantes utilizando el paquete bioinformático “Sarek”(143–145) (Fig. 7). Se trata de un proceso bioinformático validado para la detección de variantes somáticas en muestra tumorales, que se compone de los siguientes pasos: 1. Estudio de calidad de los archivos fasq mediante FastQC. 2. Eliminación de adaptadores mediante FastP. 3. Alineamiento contra la versión GRCh38 (Hg38) del genoma humano mediante BWA con al algoritmo mem. 4. Identificación y marcado de las lecturas duplicadas. 5. Recalibración de la calidad de las bases siguiendo las buenas prácticas de GATK (GATK BaseRecalibrator y ApplyBQSR). Este paso utiliza un algoritmo que ajusta la calidad de las bases reportada por el secuenciador para aumentar la especificidad de la posterior identificación de variantes. En general reduce el riesgo de aceptar artefactos de secuenciación como variantes cuando se trabaja con bajas fracciones alélicas (VAF). 6. Identificación de variantes con mutect2 en modo “somático, solo tumor”. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 72 7. Anotación de las variantes mediante SnpEff y Variant Effect Predictor (VEP) para para clasificar las variantes y predecir sus efectos. Adicionalmente, se realizó en paralelo la identificación de variantes partiendo de los archivos BAM recalibrados usando las herramientas Freebayes (ajustando la sensibilidad a VAF 1%) y Pisces, con la configuración recomendada para variantes somáticas de baja VAF. Sólo las variantes identificadas como “PASS” en al menos 2 de los 3 algoritmos utilizados se consideraron para el análisis posterior. También se descartaron las variantes con una cobertura menor de 200 o menos de 10 lecturas de la variante. Identificación de mutaciones somáticas y filtrado de polimorfismos El filtrado de polimorfismos se basó en un análisis funcional in silico de las variantes, ya que no se contaba con muestras con ADN germinal para hacer un estudio comparativo de detección de variantes somáticas. En un primer paso, se consideraron probables polimorfismos y se eliminaron del análisis aquellas variantes que cumplieran alguno de los siguientes criterios: • Frecuencia en la población >1% en 1000 genomes o GenomeAD. • Reportadas como benignas en Clinvar. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 73 Posteriormente, se consideraron variantes de interés, probablemente somáticas y relacionadas con el tumor, aquellas que cumplieran alguno de estos criterios: • Cualquier variante reportada como patogénica o probablemente patogénica en ClinVar o asociada a cáncer en la base de datos COSMIC (146). • La variante produce una proteína truncada o cambio del marco de lectura. • La variante afecta a un donante o aceptor de splicing, evaluado mediante las herramientas SpliceAI (147) y Pangolin (148). • Variantes que producen un cambio de aminoácido probablemente patogénico por algoritmos in silico (CADDphred score > 10, PolyPhen score > 0.9, SIFT < 0.1 o MutationAssessor score > 2). Las variantes de interés se revisaron manualmente utilizando las plataformas VarSome (149) y GeneBe (150) para confirmar su patogenicidad. Estas plataformas agregan información sobre la patogenicidad de variantes de múltiples bases de datos y algoritmos in silico. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 74 Fig. 7: Pipeline bioinformática de análisis de variantes REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 75 Cálculo de la concentración de ADNct Los niveles de ADNct se calcularon teniendo en cuenta la concentración de ADNec total (medida por Qubit tras la extracción) y la mediana de la frecuencia alélica de las mutaciones patogénicas observadas en el estudio de secuenciación de dicho ADN, siguiendo un método previamente publicado (121,122). Los niveles de ADNct se expresaron en equivalentes de genoma haploide (hGE). La fórmula empleada para el cálculo de los niveles de ADNct fue la siguiente: [𝐴𝐷𝑁𝑒𝑐]𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 (𝑛𝑔 𝑚𝑙 ⁄)= 𝐴𝐷𝑁 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑑𝑜 (𝑛𝑔) 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑑𝑎 (𝑚𝑙) [𝐴𝐷𝑁𝑐𝑡] (𝑛𝑔 𝑚𝑙 ⁄)=[𝐴𝐷𝑁𝑒𝑐]𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 (𝑛𝑔 𝑚𝑙 ⁄)∗𝐹𝐴 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎𝑛𝑎 [𝐴𝐷𝑁𝑐𝑡] (ℎ𝐺𝐸 𝑚𝑙 ⁄)= [𝐴𝐷𝑁𝑐𝑡] (𝑛𝑔 𝑚𝑙 ⁄) ∗ 1000 𝑝𝑔 1 𝑛𝑔 ∗ 1 ℎ𝑔𝐸 3.3 𝑝𝑔 Donde: 𝐴𝐷𝑁 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑖𝑑𝑜 (𝑛𝑔): es la cantidad total de ADN extraído del plasma, calculado como la concentración de ADN en el eluido final multiplicado por el volumen de dicho eluido. 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑟𝑡𝑖𝑑𝑎 (𝑚𝑙): es el volumen de plasma procesado para la extracción de ADNec. [𝐴𝐷𝑁𝑒𝑐]𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 : es la concentración de ADNec total en plasma (liberado por el tumor y el resto de células del organismo). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 76 𝐹𝐴 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎𝑛𝑎: es la mediana de la frecuencia alélica de las variantes patogénicas identificadas en el estudio de NGS en ADNec en plasma. [𝐴𝐷𝑁𝑐𝑡] (𝑛𝑔 𝑚𝑙 ⁄ ): es la concentración de ADNct estimada, expresada en ng/uL. [𝐴𝐷𝑁𝑐𝑡] (ℎ𝐺𝐸 𝑚𝑙 ⁄ ): es la concentración de ADNct estimada, expresada en equivalentes de genoma haploide por ml de plasma. Se calcula como la concentración de ADNct en ng/ml por la masa de un genoma humano haploide (3,3 pg). Concordancia de hallazgos genéticos detectados en muestras de ADNec y ADN extraído de FFPE Para determinar la precisión de la NGS en biopsia líquida para hallazgo de mutaciones somáticas en LDCGB, se compararon los resultados obtenidos en ADNec y ADN extraído de FFPE, analizando tres parámetros: • Proporción de pacientes con al menos una mutación somática detectable en ADNec. • Sensibilidad de la secuenciación de ADNec, calculada como la probabilidad de encontrar en ADNec una mutación presente en la muestra tumoral. • Concordancia entre la clasificación en subgrupos genéticos según las mutaciones halladas en FFPE y ADNec (ver más adelante). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 77 Clasificación de los LDCGB en subtipos genéticos Las muestras fueron clasificadas en subtipos moleculares utilizando el algoritmo LymphGen v2.0, Lymphplex 1.0 y two-step (19,151,152), utilizando los variantes halladas en la NGS de la muestra tumoral o ADNec, y la presencia o ausencia de translocación de MYC, BCL2 y BCL6 en FISH realizado en las muestras de biopsia tumoral en el estudio diagnóstico del paciente. Se seleccionaron los subtipos moleculares EZB, BN2, MCD, N1 y ST2. Adicionalmente, las muestras incluidas en el grupo genético EZB, se clasificaron como MYC+ si presentaron mutaciones en DDX3X, FOXO1, GNA13, MYC o TP53 (19). Las discordancias entre algoritmos se resolvieron por consenso (asignando a la muestra el subgrupo indicado por dos de tres algoritmos o asignando el grupo “Otro” en caso de discordancia entre los tres algoritmos). No se pudo incluir el subtipo A53 porque se define principalmente en base a variaciones del número de copia (VNC) que no son estudiadas en profundidad por el panel utilizado. Como aproximación a dicho grupo, se clasificaron como “sospecha A53” las muestras que hubieran sido clasificadas en el subtipo “Otro” y que presentasen mutaciones con pérdida de función en TP53 y truncantes (parada o pérdida del marco de lectura) en B2M, ya que estas dos son las únicas alteraciones características del subtipo A53 que no se basan en VNC (19). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 78 Identificación de biomarcadores no invasivos Identificación de nuevos biomarcadores pronósticos Además de las variables clínicas con valor pronóstico ya conocidas (edad, LDH, estadio, afectación extraganglionar, estado general) se estudió el efecto en la supervivencia global (SG) y libre de progresión (SLP) de las siguientes variables: • La concentración de ADNec total en plasma • Variantes somáticas identificadas en ADNec • El subtipo molecular de LDCGB calculado en base a las variantes identificadas en ADNec • Los niveles de ADNct (ADNec derivado del linfoma) Evaluación precoz de la respuesta al tratamiento según los niveles de ADNct Determinamos los niveles de ADNct en los pacientes de los que se disponía de muestra para determinar la respuesta molecular según las definiciones de Kurtz et al (121), tras haber recibido 1 o 2 ciclos de tratamiento quimioterápico: • Respuesta molecular precoz (RMP): reducción de los niveles de ADNct de más de 2 logaritmos (o ADNct indetectable) tras un ciclo de tratamiento quimioterápico. • Respuesta molecular mayor (RMM): reducción de los niveles de ADNct de más de 2,5 logaritmos (o ADNct indetectable) tras dos ciclos de tratamiento quimioterápico. • Respuesta molecular (RM): haber alcanzado RMP o RMM. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 79 Comparamos la SG y SLP de los pacientes según si alcanzaron RM o no para determinar si ésta se puede utilizar como biomarcador para predecir precozmente la refractariedad o recaída. Los pacientes en primera línea y los pacientes en recaída fueron analizados por separado. Análisis estadístico El estudio estadístico se realizó utilizando el software R versión 4.2.1. Los estudios de supervivencia se realizaron mediante el estimador de Kaplan-Meyer y las supervivencias entre grupos se compararon mediante la prueba Log Rank. Las diferencias de supervivencia entre grupos se expresaron como hazard ratio (HR). Los puntos de corte de las variables continuas para la separación de grupos pronósticos (concentración de ADNec, niveles de ADNct) se calcularon utilizando la función rhier del paquete rolr de R. Esta función utiliza la prueba Log Rank móvil para identificar puntos de corte óptimos en una variable continua para producir grupos con mayores diferencias de supervivencia. La correlación entre variables cuantitativas continuas se midió mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Utilizamos la prueba t de Student para comparar medias y prueba de chi cuadrado (χ²) para analizar proporciones. Se realizó un modelo de riesgos proporcionales multivariante de Cox para determinar las variables independientes con mayor impacto pronóstico. Esas variables se utilizaron para hacer un score pronóstico con objetivo de mejorar el poder discriminativo del REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 86 Sensibilidad de la NGS en ADNec El estudio de la sensibilidad de la NGS para identificar mutaciones somáticas en ADNec se llevó a cabo en 46 pacientes de los que se disponía de muestras pareadas de ADN extraído de muestra de tejido FFPE y de plasma, en ambos casos antes de iniciar el tratamiento. Los parámetros utilizados para valorar la viabilidad de la NGS en ADNec fueron los siguientes: • Proporción de pacientes con al menos una mutación somática detectable en ADNec. • La sensibilidad de la NGS sobre ADNec para detectar variantes presentes en ADN tumoral extraído de muestra FFPE. • La concordancia en el subtipo molecular calculado utilizando las variantes halladas en ADNec frente a las variantes halladas en ADN tumoral extraído de muestra FFPE Detección de variantes somáticas Tras el filtrado de variantes siguiendo el pipeline diseñado, identificamos 513 variantes patogénicas, probablemente patogénicas o de significado incierto en las 46 muestras de ADN extraído de FFPE y 807 en las 78 muestras de ADNec. La profundidad de lectura de las variantes fue similar en FFPE y ADNec, 2444,4 y 2256,7 lecturas, respectivamente (Tabla 4). La fracción alélica (VAF) media de las variantes halladas en ADN REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 87 extraído de FFPE fue del 39,3% (rango 0,6% - 95,3%), y en ADNec, del 23,1% (rango 0,8% a 96,3%). Tabla 4: Profundidad de lectura de las variantes en tejido tumoral y plasma. Profundidad media Variantes >2000x (%) Variantes >1000x (%) Variantes >500x (%) FFPE 2444,4x 54,5% 87,6% 95,8% ADNec 2256,7x 48,1% 80,2% 96,0% FFPE: ADN extraído de tejido tumoral fijado en formalina y embebido en parafina, ADNec: ADN extracelular circulante (en plasma). Los resultados de la secuenciación mostraron al menos una mutación en todas las muestras de ADN extraído a partir de la muestra tumoral, con una media de 11 mutaciones por paciente (rango 1-32). En ADNec, encontramos al menos una mutación en 38 de los 46 pacientes (82,6%). Teniendo en cuenta estos datos, la sensibilidad global de la NGS en ADNec para detectar mutaciones presentes en el tejido tumoral fue del 66,6%. Esta sensibilidad depende de la VAF de la variante en el tejido tumoral, siendo mayor la sensibilidad para las variantes con VAF más alta en tumor (Tabla 5 y Fig. 9 A). Si añadimos el dato de la concentración de ADNec, observamos que en los pacientes con concentraciones de ADNec < 50 ng/ml, se detectaron el 46% de las variantes, de 50 a 200 ng/ml el 76% y >200 ng/ml el 90%. La concentración de ADNec fue significativamente mayor en los pacientes con al menos una variante detectada en el ADNec en comparación con aquellos sin variantes detectables (Fig. 9, C). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 88 Tabla 5: Sensibilidad de la NGS en ADNec (biopsia líquida) para detectar variantes presentes en ADN de tejido tumoral (muestra de biopsia de LDCGB) FA en FFPE <5% 5-15% 15-25% 25-40% >40% Global Variantes en ADN de FFPE 42 41 131 148 150 513 Variantes en ADNec 5 21 78 108 130 342 Sensibilidad 11,9% 51,2% 59,5% 72,9% 86,6% 66,6% FA: Fracción alélica. Sensibilidad: % de variantes detectables en tejido tumoral que se detectaron en la muestra pareada de ADNec. Los ocho pacientes en los que no se observaron mutaciones en el ADNec presentaban todos ellos estadio I, sin infiltración orgánica, baja carga tumoral y baja concentración de ADNec. Incluyendo esta información en el cálculo de la sensibilidad, por un lado, una VAF >5% en la muestra tumoral (para eliminar variantes subclonales poco representativas), y una alta carga tumoral (pacientes con estadio II o mayor), la sensibilidad de la técnica aumentó al 81,3%. Por último, identificamos 61 mutaciones únicamente presentes en ADNec que no estaban presentes en las correspondientes muestras pareadas de tejido tumoral (Fig. 9, B). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 89 Fig. 9: Sensibilidad de la NGS en biopsia líquida (ADNec en plasma) para detectar variantes somáticas en LDCGB, estudio sobre 46 pacientes con muestras pareadas de tumor y plasma. A: Sensibilidad de la NGS en ADN extracelular circulante para detectar variantes presentes en el tejido tumoral según la frecuencia alélica de la variante en tumoral parafinado (FFPE) y el estadio del paciente. B: Concordancia global entre las variantes halladas en ADNec en plasma y ADN extraído de tejido tumoral FFPE C: Concentración de ADNec en pacientes sin y con variantes en dicho ADN. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 90 Clasificación molecular según ADNec Para determinar la viabilidad del ADNec para clasificar el LDCGB en subtipos moleculares (SM), comparamos la clasificación obtenida utilizando las variantes halladas en ADN tejido tumoral y plasma en las 46 muestras pareadas. La clasificación en subtipos moleculares se realizó mediante los algoritmos LymphGen, LymphPlex y Two Step, teniendo en cuenta las variantes identificadas en ADNec o extraído de tejido tumoral, y la presencia o ausencia de reordenamientos de MYC, BCL2 y BCL6 si se había realizado estudio de FISH sobre la biopsia del diagnóstico, según la práctica clínica habitual (ver métodos, pág. 77). La concordancia global entre el SM asignado según las variantes identificadas en tejido tumoral y ADNec fue del 65%. Las discrepancias se debieron principalmente a las ocho muestras en las que no se identificaron variantes en ADNec en plasma. Tres de ellas habían sido clasificadas mediante el tejido tumoral como EZB y 5 como “Otros”. Adicionalmente, 2 pacientes clasificados como ST2 y uno clasificado como “Otros” mediante tejido tumoral fueron clasificados mediante ADNec en plasma como “Otros” y EZB, respectivamente (Fig. 10). Teniendo en cuenta únicamente las muestras con variantes identificadas en ADNec, la concordancia de SM fue del 92%. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 91 Fig. 10 Gráfico de Shankey que muestra la distribución de los subtipos moleculares en nuestra serie de 46 pacientes con muestras pareadas, desde la clasificación por célula de origen (izquierda) a la clasificación molecular según ADN de tejido tumoral (centro) y según ADNec (derecha). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 92 Perfil mutacional del LDCGB en biopsia líquida Genes frecuentemente mutados en LDCGB En nuestra cohorte de 78 pacientes con muestra de plasma extraída en el momento del diagnóstico, los 20 genes más frecuentemente mutados fueron KMT2D (n=37 pacientes), TP53 (n=29), CREBBP (n=28), TNFRSF14 (n=21), B2M (n=19), GNA13 (n=18), PIM1 (n=18), TBL1XR1 (n=18), ARID1B (n=17), MYD88 (n=17), BTG2 (n=15), DTX1 (n=15), FOXO1 (n=15), TMSB4X (n=15), EZH2 (n=14), ITPKB (n=14), CARD11 (n=13), CCND3 (n=13), EP300 (n=13) y TET2 (n=13). La Fig. 11 muestra una matriz indicando los genes mutados en biopsia líquida y tipo de variante por paciente. Muchos de los genes presentaron varias mutaciones en el mismo paciente (multi-hit), destacando BCL2 (con una media de 4,3 variantes por paciente), PIM1 (3,73), MYC (2,88), DTX1 (2,86), MFHAS1 (2,78), PRDM1 (2,75), P2RY8 (2,71), BTG2 (2,68), SOCS1 (2,55), ACTB (2,37), RHOA (2,33) y KMT2D (2,26). En relación a los genes con mayor número de mutaciones identificadas, estos fueron KMT2D, PIM1, CREBBP, TP53, DTX1, TNFRSF14, BTG2, B2M, GNA13, BCL2, SOCS1, TMSB4X, TBL1XR1 y TET2, en los que se encontraron 59, 41, 36, 35, 29, 26, 25, 24, 23, 22, 22, 22, 21 y 20 variantes, respectivamente. La Fig. 12 muestra el número de variantes identificadas en cada gen incluido en el panel, estratificando por célula de origen en la cohorte completa de 90 pacientes. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 93 *Continua en página siguiente 029 062 087 111 F002 089 010 020 027 049 073 082 092 104 F018 T-001 107 015 019 047 063 034 008 003 005 051 075 108 T-003 115 012 098 038 048 050 077 090 100 103 004 078 113 070 001 013 030 052 058 066 072 102 109 110 F017 T-006 046 006 065 067 074 081 083 101 105 T-002 T-004 T-010 CO CG CG CG CG CG NCG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG NCG CG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG CG CG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG CG NCG NCG NCG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG SM EZB EZB EZB EZB EZB EZB EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM ST2 ST2 ST2 ST2 ST2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 MCD MCD MCD MCD MCD MCD MCD MCD MCD A53 A53 A53 N1 Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other BCL2 tr. 0100020121 1 1 1 1 02 2 2 2 0002 2 2 2 2 02 2 0 0 22202 2 2 2 2 2 02020 0 0 0 20 0 0 2222200020 0 2 BCL6 tr. 00000200002 2 2 2 02 2 020002 2 010 0 120 0 2020002 2 2 02 2 02020 0 20 0 0 0 0 0 2200020 0 2 MYC tr. 020000012220210212 2 0 0 202 2 1202 2 0002 2 02 2 02220101020120 0 2 2 2 120001 1 0 0 2 KMT2D 2255545 5 252144 42421525 5 5 137% CREBBP 4247451 1 1 64575121227% TNFRSF14 1654541 1 51 1 1 41 21% EZH2 5 5 1 1 1 1 1 1 1 1 15% TP53 1 1 1 1 1 51 1 1 5 5 5 1 1 1 1 261 1 1 1 21 1 539% GNA13 2141545251 1 242722% DDX3X 1 1 1 1 1 1 61513% FOXO1 151 1 31 1 1 1 13% CARD11 515 5 1 1 1 1 1 1 1 16% TNFAIP3 21452 2 2 10% NOTCH2 4 4 4 4 4 7% TET2 1525241542516% SGK1 41 1 6159% MYD88 1 1 7111111151 1 1 1 1 1 25% PIM1 151115 5 45115% CD79B 1 1 1 61 1 2612% BTG1 5 5 5 6175 5 12% ETV6 156 6 6% B2M 2326 6 35654515321% NOTCH1 213% TBL1XR1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 18% DTX1 451 1 1 5 5 1 1 5116% BTG2 16151 1 515615% IRF8 41 1 1 841 1 1 815% ARID1B 74 4 1717512% ATM 51 1 21651 1 13% CCND3 1 1 21 1 41 1 413% TMSB4X 6163516 6 513% BCL2 5151 1 1 1 10% EP300 1 1 36 6 1 1 1 12% ITPKB 41 1 1 751212% SPEN 2 2 5121510% TMEM30A 46451 1 4 4 12% MEF2B 1 1 6141610% MYC 51515 5 610% ACTB 5 5 1 1 1 1 9% BCL10 25454 4 9% EBF1 6 6 1517% GNAI2 7571 1 7% H1-4 1 1 216% IRF4 6514% NFKBIE 12 2 2 57% OSBPL10 1 1 1 617% POU2F2 1 1 1 4219% SOCS1 5 5 5 327% TOX 1452149% ARID1A 2 2 566% CD58 5 5 246% REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 94 *Continua en página siguiente 029 062 087 111 F002 089 010 020 027 049 073 082 092 104 F018 T-001 107 015 019 047 063 034 008 003 005 051 075 108 T-003 115 012 098 038 048 050 077 090 100 103 004 078 113 070 001 013 030 052 058 066 072 102 109 110 F017 T-006 046 006 065 067 074 081 083 101 105 T-002 T-004 T-010 CO CG CG CG CG CG NCG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG NCG CG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG CG CG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG CG NCG NCG NCG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG CG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG NCG SM EZB EZB EZB EZB EZB EZB EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM EZBM ST2 ST2 ST2 ST2 ST2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 BN2 MCD MCD MCD MCD MCD MCD MCD MCD MCD A53 A53 A53 N1 Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other Other BCL2 tr. 0100020121 1 1 1 1 02 2 2 2 0002 2 2 2 2 02 2 0 0 22202 2 2 2 2 2 02020 0 0 0 20 0 0 2222200020 0 2 BCL6 tr. 00000200002 2 2 2 02 2 020002 2 010 0 120 0 2020002 2 2 02 2 02020 0 20 0 0 0 0 0 2200020 0 2 MYC tr. 020000012220210212 2 0 0 202 2 1202 2 0002 2 02 2 02220101020120 0 2 2 2 120001 1 0 0 2 CDKN2A 641 1 6% H1-5 121717% KLHL6 414517% PRKCB 1 1 1 1 6% PTPRD 6 6 1 1 1 7% CD70 645 5 6% CD83 12316% FAS 1644% H1-2 1 1 516% HVCN1 7254% IRF2BP2 5214% RHOA 1 1 1 46% SETD1B 42516% STAT6 1 1 1 4% BCL6 1414% BCOR 1214% BRAF 1 1 1 4% BTK 1 1 1 4% CIITA 6714% H1-3 1 1 74% MAP2K1 1 1 1 4% MCL1 1 1 34% MFHAS1 5 5 14% PRDM1 1514% STAT3 5724% ZEB2 2 2 64% ETS1 21% KLHL14 5 5 3% MAML1 11% NFKBIZ 613% NRAS 1 1 3% P2RY8 1 1 3% PAX5 1 1 3% RRAGC 1 1 3% SPIB 213% PCBP1 51% ARID5B 61% CD36 41% CD79A 11% MALT1 61% NFKBIA 41% PTEN 11% S1PR2 11% SMARCA4 5 1% TCF3 11% TNIP1 21% XPO1 11% REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 95 Leyenda: Célula de origen Centro germinal No centro germinal Translocaciones Presente Ausente No testada Fig. 11: Variantes halladas en ADN extraído de plasma (biopsia líquida) en las 67 muestras de plasma de los pacientes incluidos en primera línea en las que se detectó al menos una variante. Las muestras están agrupadas por célula de origen y subtipo molecular. “Multi-hit”: presencia de dos variantes patogénicas o probablemente patogénicas diferentes en el mismo gen. BCL2/BCL6/MYC tr.: Translocación de BCL2/MYC/BCL6 Subtipo molecular EZB MYCMCD EZB MYC+ A53 (sospecha) ST2 N1 BN2 Otro/Inclasificable Tipo de variante 1 Cambio de Aminoácido 7 Inserción o deleción en marco 2 Cambio marco de lectura 3 Pérdida de inicio 4 Codón de parada 8 Pérdida de parada 6 Lugar de splicing 9 Otras 5 "Multi Hit" REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 102 Fig. 15: Localización de las variantes identificadas en CD79B. En rojo se indica la localización del hotspot Tyr196, en el dominio ITAM de CD79B. EN amarillo variantes de splicing en la unión entre el exón 4 y 5. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 103 Fig. 16: Localización de las variantes identificadas en B2M. En rojo se indica la localización de la variante recurrente p.Met1? (pérdida del codón de inicio). En amarillo variantes en la región de splicing entre los exones 1 y 2. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 104 Fig. 17: Localización de las variantes identificadas en BTG2. En rojo se indica la localización del hotspot p.Gly28. Adicionalmente en amarillo se muestra la región de splicing al inicio del intrón 1-2 también alterada. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 105 Fig. 18: Localización de las variantes identificadas en FOXO1. En rojo se indica la localización del hotspot que abarca de p.Arg21 a p.Thr24. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 106 Fig. 19: Localización de las variantes identificadas en NFKBIE. En rojo se indica la localización de la variante recurrente NFKBIE: c.759_762delTTAC (p.Tyr254fs). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 107 Fig. 20: Localización de las variantes identificadas en PIM1. En rojo se indica la localización del hotspot situado en el codón 135. A diferencia de otros genes con variantes recurrentes, en PIM1 se identificaron múltiples variantes repartidas por toda la secuencia codificante. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 108 Identificación de biomarcadores pronósticos no invasivos El estudio de biomarcadores con utilidad pronóstica se realizó analizando el ADNec obtenido en el momento del diagnóstico del LDCGB en los 78 pacientes tratados en primera línea con R-CHOP o esquemas similares. Los biomarcadores estudiados fueron: • La concentración de ADNec total en plasma • Variantes somáticas identificadas en ADNec • El subtipo molecular de LDCGB calculado en base a las variantes identificadas en ADNec • Los niveles de ADNct (ADNec derivado del linfoma) Concentración de ADN extracelular circulante total La concentración de ADNec total en las muestras extraídas al diagnóstico fue muy variable, con una media de 150,28 ng/ml (rango 4,86 – 1563,75 ng/ml). Cuando se compararon los niveles de ADNec con el resto de variables clínicas con valor pronóstico, se observó una mayor concentración de ADNec en los pacientes con estadios avanzados (III-IV), síntomas B, afectación extraganglionar y LDH elevada (aunque mostrando marcado solapamiento entre grupos) (Fig. 21, A-D). En relación con los análisis de supervivencia, observamos que los pacientes con mayor concentración de ADNec al diagnóstico mostraban una SLP y SG menor. Para este estudio, dividimos a los pacientes en 3 grupos, según los niveles de ADNec: bajo (<10 ng/ml), intermedio (10-100 ng/ml) y alto (>100 ng/ml). Estos pacientes presentaron una SLP a 2 años de 91,7%, 69,7% y 54,0%, y una SG a 2 años de 91,7%, 80,5% y 58,5%, respectivamente, tal y como se muestra en la Fig. 21, E-F. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 109 Fig. 21: Concentración de ADNec en plasma al diagnóstico según diferentes características clínicas (A-D). Estudio de supervivencia según la concentración de ADNec en plasma en el momento del diagnóstico (E-F): Supervivencia libre de progresión (SLP) y global (SG). ** = p<0,01; *** p<0,001; **** = p<0,0001. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 110 Variantes somáticas identificadas en ADNec Para determinar el valor pronóstico de las mutaciones, analizamos la SLP según la presencia o ausencia de variantes patogénicas (o probablemente patogénicas) en cada uno de los genes incluidos en el panel de forma individual. Excluimos del análisis los genes mutados en menos de tres pacientes diferentes, dado que no es un tamaño muestral suficiente para identificar diferencias significativas en supervivencia. Tras la corrección por comparaciones múltiples siguiendo el método de Benjamini-Hochberg, identificamos dos genes significativos ARID1B e IRF8 (p ajustada <0,05). Adicionalmente, identificamos cuatro genes cercanos a la significación estadística: IRF4, MYC, B2M y TP53 multi-hit (p ajustada <0,1 pero >0,05 con p bruta <0,01). El efecto en la SLP de las mutaciones en estos genes se muestra en la Tabla 6 y Fig. 22. Tabla 6: Genes con valor pronóstico Gen N HR p P ajust. ARID1B 7 (8,9%) 5,27 (2,02-13,76) <0,001 <0,001 IRF8 10 (12,8%) 3,96 (1,62-9,65) 0,0011 0,028 B2M 14 (17,9%) 2,99 (1,27-7,03) 0,0083 0,081 (NS) IRF4 3 (3,8%) 5,43 (1,57-18,78) 0,0026 0,056 (NS) MYC 7 (8,9%) 3,93 (1,46-10,58) 0,0035 0,064 (NS) TP53 MH 7 (8,9%) 3,74 (1,39-10,4) 0,0049 0,070 (NS) N: Número de pacientes con variantes patogénicas en el gen (% del total), HR: Hazard ratio (intervalo de confianza del 95%), MH: Multihit, definida según los criterios de la ICC (>1 variante con fracción alélica (FA) >10% o una variante con FA >50%), NS: No significativo. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 111 Fig. 22: Curvas de Kaplan-Meyer mostrando la supervivencia libre de progresión (SLP) según la presencia de mutaciones patogénicas o probablemente patogénicas en ADNec en plasma en los genes ARID1B, IRF4, IRF8, MYC, B2M y TP53 multihit. No hubo diferencias significativas en la SLP según las mutaciones en el resto de genes incluidos en el panel. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 118 Tabla 9: Distribución por célula de origen en los diferentes subtipos moleculares Subtipo Total CG (N, %) NCG (N, %) p EZB 17 16 (94,1%) 1 (5,9%) <0,001 MCD 8 1 (12,5%) 7 (87,5%) 0,02 BN2 8 2 (25,0%) 6 (75,0%) 0,14 (NS) ST2 6 4 (66,7%) 2 (33,3%) 0,37 (NS) A53 (sospecha) 3 1 (33,3%) 2 (66,7%) 0,57 (NS) N1 1 0 (0%) 1 (100%) N/A Otro 24 12 (50%) 12 (50%) 0,93 (NS) Sin variantes 11 3 (27,3%) 8 (72,7%) 0,11 (NS) CG: centro germinal, NCG: no centro germinal. La significación estadística se ha calculado mediante chi-cuadrado, comparando la distribución por célula de origen de cada subtipo respecto al resto. N/A: No aplica (no calculable p para un único evento). NS: No significativo. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 119 Fig. 24: Supervivencia libre de progresión en los diferentes subtipos moleculares (curvas coloreadas). La curva gris en cada gráfico muestra la SLP del resto de pacientes como comparación. p <0.01 P = 0.024 P = 0.05 p=0.47 p=0.73 p=0.19 p=0.46 p=0.2 + REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 120 Niveles de ADN circulante tumoral (ADNct) Los niveles de ADNct se calcularon en base a la concentración de ADNec en plasma total y la mediana de la fracción alélica de las variantes identificadas mediante NGS (ver métodos pág. 75). Los niveles de ADNct al diagnóstico mostraron una alta variabilidad (rango: indetectable a 5,3 log10 hGE/ml) La comparación de los niveles de ADNct con el resto de variables clínicas mostró que estos niveles fueron mayores en los pacientes con estadios avanzados, síntomas B, mayor LDH sérica y afectación extranodal (Fig. 25). Fig. 25: Niveles de ADNct según diferentes variables clínicas y analíticas. Valores de p: *< 0,05; **<0,01; ***<0,001; **** <0,0001. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 121 En los pacientes con ADNct detectable (es decir, presencia de alguna variante en ADNec) hubo una fuerte correlación entre los niveles de ADNct y la concentración de ADNec (R2 = 0,89, p <0,01); sin embargo, hubo 12 pacientes con concentraciones de ADNec entre 0,4 log10 ng/ml y 2,1 log10 ng/ml en los que no se hallaron variantes, con lo que la correlación global fue menor (R2 = 0,75, p <0,01) (Fig. 26). Fig. 26: Correlación entre los niveles de ADNec y los niveles de ADNct. A: pacientes con ADNct detectable. B: todos los pacientes. Además, los niveles de ADNct mostraron impacto pronóstico, dado que mediante estos niveles se pudieron estratificar a los pacientes en 3 grupos pronósticos: ADNct bajo (<2 log10 hGE/ml), intermedio (2-4,5 log10 hGE/ml) y alto (>4,5 log10 hGE/ml), con una SLP a 2 años del 93,3%, 67,7% y 37,5%, respectivamente (p<0,01) (Fig. 27). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 122 Fig. 27: Curvas de Kaplan-Meyer que muestran la supervivencia libre de progresión (SLP) y global (SG) de los pacientes con LDCGB según los niveles de ADNct al diagnóstico (expresados en log10 hGE/ml). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 123 Combinación de variables clínicas y niveles de ADNct En nuestra cohorte, la aplicación del Índice Pronóstico Internacional Revisado (R-IPI) (Tabla 10) permitió dividir a los pacientes en tres grupos de riesgo con diferente SLP: Muy Bueno (SLP a 2 años 100%), Bueno (SLP a 2 años 86,5%) y Malo (SLP a 2 años 53,7%) (Fig. 28, A). Tabla 10: Variables incluidas en el Índice Pronóstico Internacional Revisado (R-IPI). Variables del R-IPI Variable Punt. Edad >60 años 1 2 o más LE 1 LDH elevada 1 Estadio III o IV 1 ECOG > 1 1 Grupos de riesgo según R-IPI Punt. G. Riesgo SLP 2a (IC 95%) 0 Muy Bueno 100% (100-100 %) 1-2 Bueno 86,5% (73,4-100 %) 3-5 Malo 53,7% (40,1-70,9 %) Punt.: Puntuación. LE: Localizaciones extraganglionares, LDH: Lactato deshidrogenasa, ECOG: Eastern Oncology Cooperative Group (Performance Scale). G. Riesgo: Grupo de riesgo. SLP 2a: Supervivencia libre de progresión a 2 años. IC: intervalo de confianza. Para determinar si los niveles de ADNct podían mejorar la discriminación entre los grupos del R-IPI, configuramos un nuevo score pronóstico consistente en la puntuación IPI más uno o dos puntos adiciones si los niveles de ADNct eran superiores a 2 o 4 log10 hGE/ml (Tabla 11). Este score separó a los pacientes en 4 grupos, 3 con una SLP similar a los grupos muy bueno, bueno y malo del R-IPI (SLP a 2 años 100%), y un grupo adicional de muy alto riesgo con SLP a 2 años inferior al 20% (Fig. 28, B). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 124 Tabla 11: Modificación del R-IPI para incluir los niveles de ADNct Variables R-IPI+ADNct Variables Punt. Edad >60 años 1 2 o más LE 1 LDH elevada 1 Estadio III o IV 1 ECOG > 1 1 ADNct 2-4 1 ADNct >4 2 Grupos de riesgo según R-IPI+ADNct Punt. G. Riesgo SLP 2a (IC 95%) 0 Muy Bueno 100% (100-100 %) 1-3 Bueno 92,1% (82,2-100 %) 4-6 Malo 58,7% (44,6-77,2 %) >6 Muy Malo 14,29% (2,3-39,6 %) Punt.: Puntuación. LE: Localizaciones extraganglionares, LDH: Lactato deshidrogenasa, ECOG: Eastern Oncology Cooperative Group (Performance Scale). ADNct: niveles de ADN circulante tumoral en log10 hGE/ml, G. Riesgo: Grupo de riesgo, SLP 2a: Supervivencia libre de progresión a 2 años. IC: intervalo de confianza. Fig. 28: Supervivencia libre de progresión de los pacientes con LDCGB tratados con R-CHOP según R-IPI (A) y R-IPI+ADNct (B). MB: Muy bueno, B: Bueno, M: Malo, MM: Muy Malo (únicamente en R-IPI+ADNct). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 125 Identificación de biomarcadores de respuesta a tratamiento Los niveles de ADNct para evaluación precoz de la respuesta Para determinar el valor del ADNct como biomarcador de respuesta al tratamiento, analizamos muestras de plasma de 33 pacientes tratados con R-CHOP, extraídos tras uno (N=16) o dos (N=17) ciclos de dicho esquema. En estas muestras, en primer lugar, definimos la respuesta molecular precoz (RMP) y respuesta molecular mayor (RMM) de acuerdo con los criterios definidos por Kurtz et al. (ver Métodos, pág. 78), con la salvedad de que, en nuestro caso, dada la menor sensibilidad de nuestra técnica, la disminución de 2 y 2,5 log propuesta por Kurtz et al. fue equivalente a que los niveles de ADNct fuesen indetectables (no hallar variantes somáticas en el ADNec). En base a esto, los análisis de supervivencia mostraron que aquellos pacientes que no alcanzaron la RMP o la RMM (es decir, pacientes con niveles de ADNct detectables tras 1 o 2 ciclos de R-CHOP) tenían valores de SLP y SG significativamente más bajos, con una SLP a 2 años de 28,6% vs. 95,4% (HR 2,7; p<0,0001) y SG a 2 años de 28,6% vs. 100% (HR 3,32; p<0,0001) (Fig. 29). Estas diferencias se debieron principalmente a refractariedad y recaídas precoces en el grupo de pacientes que no alcanzó ningún tipo de respuesta molecular (n=7). De estos, cinco recayeron antes de los 6 meses del inicio del tratamiento con R-CHOP. De estos 5 pacientes, 2 fallecieron antes de poder iniciar el tratamiento de rescate y 3 fueron refractarios a dicho tratamiento. En dos de los pacientes que no alcanzaron respuesta molecular y recayeron, la progresión se identificó mediante el TC interim realizado de rutina tras 2 ciclos de R-CHOP, muy cercano en el tiempo a la extracción de la biopsia líquida, mientras que en los REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 126 otros tres, el estudio mediante biopsia líquida detectó la persistencia de enfermedad una media de 3,4 (1,6-6,2) meses antes de que se evidenciase la progresión clínica o por técnica de imagen. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 127 Fig. 29: Curvas de Kaplan-Meyer que muestran la supervivencia libre de progresión (SLP) y global (SG) según los niveles de ADNct tras 1 o 2 ciclos de R-CHOP en pacientes tratados en primera línea. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 134 • La concentración de ADNec (ADN extracelular circulante en plasma total) • La presencia de mutaciones en varios genes de forma individual o agrupados según las vías metabólicas en las que participan. • El subtipo molecular de LDCGB • Los niveles de ADNct (cantidad del ADNec total que proviene de las células tumorales) Adicionalmente, estudiamos el impacto pronóstico de la evolución de los niveles de ADNct en 33 pacientes con muestras de plasma extraídas tras 1 o 2 ciclos de quimioterapia, para determinar su utilidad para la evaluación precoz de la respuesta o detección precoz del fallo terapéutico. Por último, de forma exploratoria, estudiamos los biomarcadores pronósticos previamente identificados en 12 pacientes con LDCGB recaído o refractario incluidos en segunda línea. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 135 Identificación de mutaciones somáticas en ADNct Viabilidad de la NGS en ADNec La NGS realizada sobre muestra de ADNec permite la detección de mutaciones somáticas del LDCGB de forma no invasiva con una sensibilidad variable. En nuestra serie, con la metodología utilizada, identificamos en el plasma el 66,6% de todas las variantes identificadas en tumor. Esta sensibilidad aumentó al 81,3% para los pacientes en estadio II de Lugano o superior y para las variantes con fracción alélica superior al 5% en tejido tumoral, de forma similar a la observada en estudios previos (123,128,129,131,142). La capacidad de la NGS para detectar las variantes somáticas del tumor en ADNec depende tanto de los niveles de ADNct como la carga alélica de la variante en el tumor. Este hecho implica que las variantes principales presentes en toda la masa tumoral serán más fácilmente detectadas en biopsia líquida que las variantes subclonales. En nuestra cohorte, además, identificamos algunas variantes en plasma que no se encontraron en la muestra pareada de tejido tumoral. Este hecho ha sido previamente descrito en otros estudios similares, y se postula que no se trata de falsos positivos, sino de variantes clonales que se encuentran en una zona del tumor diferente a la biopsiada. Esto significa que no se detectan en los estudios de NGS realizados en ADN extraído del tejido tumoral, pero al poder liberarse al plasma, pueden ser detectadas en el ADNec (129,130). De esta forma, la NGS sobre ADNec podría capturar la heterogeneidad genética del LDCGB mejor que la NGS sobre una muestra tumoral obtenida por biopsia de una región aleatoria del REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 136 linfoma. Este hallazgo es compatible con la experiencia clínica previa con otras técnicas diagnósticas, por ejemplo, la PET, que en algunos pacientes muestra diferentes niveles de captación en diferentes áreas que, al ser biopsiadas, pueden mostrar diferencias histológicas. Por otro lado, la no identificación de variantes en algunos pacientes no ha significado un fracaso de la técnica, ya que este resultado también otorga una información clínica relevante. De hecho, la ausencia de variantes en ADNec (o lo que es lo mismo, tener niveles de ADNct indetectables) asoció muy buen pronóstico en nuestra serie. Por último, respecto a la capacidad de la NGS sobre ADNec para realizar la clasificación molecular del LDCGB, en los 46 pacientes con muestras pareadas, la concordancia de la clasificación molecular entre el ADN extraído de FFPE y ADNec fue del 65%. Esta baja concordancia se explica principalmente por las muestras sin variantes identificadas en ADNec, que no se pudieron clasificar, y tratamos como un subgrupo aparte (“sin variantes”). En el caso de los 67 pacientes con al menos una variante detectada en plasma, la concordancia aumentó al 92%. Además, para los pacientes con subtipos descritos en la literatura como desfavorables (MCD en NCG y EZB MYC+ en CG) la concordancia fue del 100% (todos ellos tenían variantes detectables en ADNec). Cabe destacar que todos los pacientes con translocación de MYC detectada por FISH presentaron en ADNec alguna mutación característica del subtipo EZB MYC+, que podría haberlos clasificado en este subtipo incluso en ausencia del resultado del FISH de MYC. Este hecho tiene gran relevancia clínica, ya que en ocasiones la REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 137 calidad y cantidad de muestra obtenida en las biopsias diagnósticas no permite realizar técnicas citogenéticas. Globalmente, podemos concluir que la secuenciación con tecnología NGS sobre ADNec tiene una sensibilidad aceptable para detectar mutaciones somáticas del LDCGB y permite realizar la clasificación molecular con fiabilidad siempre y cuando los niveles de ADNct sean suficientes para poder detectar variantes en plasma. Perfil molecular del LDCGB en biopsia líquida La frecuencia alélica de las variantes y el número de variantes identificadas por muestra fueron similares a otros estudios previos (17–19). En general, el perfil de mutaciones entre diferentes pacientes fue muy heterogéneo. Sin embargo, hubo varios genes frecuentemente mutados en los LDCGB CG, como KMT2D, CREBBP, TNSFR14 o EZH2; en los LDCGB NCG, como B2M, PIM1 o MYD88; y en LDCGB con ambas células de origen, como TP53. Todos estos genes tienen funciones conocidas en la patogenia del LDCGB (ver: Alteraciones genéticas en el LDCGB, pág. 13). Identificación de hotspots con potencial relevancia clínica Aunque la mayoría de las variantes identificadas se localizaron por toda la región codificante de los genes analizados, identificamos varios hotspot en nuestra serie, regiones pequeñas de genes que se encontraron frecuentemente mutados en varias muestras. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 138 El más frecuente fue la mutación del codón Tyr646 del gen EZH2, que se dio en un 16,6% de los pacientes al diagnóstico, todos ellos de célula de origen CG, la mayoría (90%) pertenecientes al subtipo molecular EZB (tanto MYC+ como MYC-). El LDCGB transformado de linfoma folicular (LF) suele pertenecer al subtipo EZB (19), y este hotspot también se encuentra frecuentemente mutado en LF, aumentando de frecuencia cuanto mayor sea su grado histológico, lo que sugiere que podría tener relación con el fenómeno de la transformación a alto grado (146). En nuestra serie no identificamos que las variantes en este hotspot tuvieran valor pronóstico. También fueron interesantes el hotspot en CD79B p.Tyr196 y la variante MYD88 p.Leu260Pro (conocida también como L265P). Este conjunto de variantes son muy específicas del subtipo MCD y muy frecuentes en dicho grupo, estando alguna de las dos presentes en al menos dos tercios de los LDCGB MCD (19). Este subtipo molecular es especialmente relevante dado su comportamiento clínico característico, con mayor riesgo de infiltración extraganglionar y neuromeníngea. De hecho, la última edición de la guía de profilaxis neuromeníngea en LDCGB publicada por GELTAMO (Grupo Español de Linfomas y Trasplante Autólogo de Médula Ósea), sugiere que el subtipo MCD podría consolidarse como una indicación de profilaxis neuromeníngea en el futuro (154). Cabe destacar que, como este subtipo se define principalmente por la presencia de mutaciones en los hotsposts de MYD88 y CD79B, su identificación en la práctica clínica podría ser relativamente sencilla, tanto usando técnicas moleculares clásicas sobre muestra de ADN tumoral (PCR alelo específica, secuenciación Sanger, etc.), REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 139 como mediante estudios dirigidos en biopsia líquida (por ejemplo, mediante PCR digital). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 140 Biomarcadores pronósticos en ADNec Concentración de ADNec La concentración de ADNec total (de origen tumoral y no tumoral) mostró impacto negativo en la SLP y SG en nuestra cohorte. Este hecho probablemente se deba a que los niveles de ADNec se correlacionaron con los de ADNct, mostrando un impacto pronóstico muy fuerte en nuestra serie. Sin embargo, la correlación no es completa y hubo varios pacientes con ADNec elevado que no presentaron niveles elevados de ADNct. La razón probablemente sea que el ADNec se puede elevar en múltiples situaciones clínicas, algunas de ellas frecuentemente concomitantes al debut de un LDCGB, como las infecciones o la inflamación sistémica (109,124). Por esto, la concentración elevada de ADNec no siempre indica niveles elevados de ADNct, por lo que no parece ser tan útil para identificar pacientes de alto riesgo. Por el contrario, todos los pacientes con baja concentración de ADNec presentaron niveles de ADNct bajos o indetectables y un pronóstico favorable, de forma que podría ser una herramienta relativamente sencilla para identificar pacientes de buen pronóstico. Otra limitación del ADNec para su aplicación como biomarcador pronóstico es que es muy sensible a las variantes preanalíticas, especialmente al tiempo desde la toma de la muestra de sangre hasta su procesamiento, así como a las condiciones de almacenamiento de la misma. Esto es debido a que, en caso de coagulación de la muestra de sangre antes de la separación del plasma, se produce una liberación in vitro de ADN de los neutrófilos que incrementa falsamente el ADN total en el plasma (y reduce el porcentaje de ADNct). REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 141 En conclusión, el valor como biomarcador pronóstico del ADNec es limitado, pero, dada la relativa facilidad y el bajo coste de su medición, podría ser un biomarcador útil en la práctica clínica, especialmente para identificar pacientes de buen pronóstico si su concentración es baja. Variantes genéticas con valor pronóstico Para identificar genes con valor pronóstico, realizamos un estudio de supervivencia valorando la SLP de los 78 pacientes tratados con esquemas similares a R-CHOP, agrupados según si tenían o no variantes patogénicas o probablemente patogénicas en cada uno de los genes incluidos en el panel. Dado que el estudio estadístico incluyó múltiples análisis de supervivencia realizados sobre la misma población, corregimos el indicador p de cada análisis de supervivencia mediante la técnica de Benjamini-Hochberg (BH), para reducir el riesgo de error por comparaciones múltiples. Con este método identificamos únicamente 2 genes asociados a pronóstico adverso en nuestra cohorte: ARID1B e IRF8. Adicionalmente, identificamos otros 4 genes con tendencia a un pronóstico adverso pero que no alcanzaron la significación estadística tras la corrección BH: BM2, IRF4, MYC y TP53 con variantes multi-hit. ARID1B es un gen que participa en la remodelación de la cromatina e IRF8, IRF4 y B2M se han asociado a evasión inmune en neoplasias linfoides. Estos genes pertenecen a las vías metabólicas con impacto pronóstico que hemos identificado en este estudio, y serán discutidos en detalle más adelante. REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 142 Respecto al gen MYC, su alteración más frecuente y característica en LDCGB es su translocación con IGH, pero las mutaciones puntuales en MYC también se han descrito en un 5-15% de los pacientes (39,155). Aunque el reordenamiento de MYC, especialmente cuando se encuentra asociado al reordenamiento de BCL2, es un factor de mal pronóstico reconocido en el LDCGB, el impacto pronóstico de las mutaciones puntuales de MYC no está claro. TP53 es un gen supresor de tumores cuya pérdida de función se asocia a resistencia a la quimioterapia y pronóstico adverso en múltiples neoplasias. Las mutaciones con pérdida de función de TP53 ya han sido previamente asociadas en la literatura a pronóstico adverso en LDCGB (44,156). En nuestra cohorte las mutaciones patogénicas en TP53 por sí mismas no asociaron pronóstico adverso, sin embargo, en los casos con TP53 multi-hit (presencia de 2 variantes en TP53 o una variante con VAF >50%), sí que identificamos una tendencia hacia una menor SLP, aunque no fue significativa tras la corrección estadística por comparaciones múltiples. No obstante, hay que tener en cuenta que nuestro análisis tiene varias limitaciones. Por una parte, como limitación técnica por las características del panel, en este estudio únicamente incluimos las mutaciones puntuales e indels pequeñas, y podría haber otras alteraciones, como variaciones en el número de copias o reordenamientos que no han sido detectadas y podrían ser importantes, sobre todo en genes como TP53 o MYC. Por otra parte, muchos de los genes incluidos en el panel estaban mutados sólo en una pequeña proporción de las muestras. De esta forma, nuestra cohorte de 78 pacientes podría ser demasiado pequeña REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617 143 para detectar diferencias en supervivencia según las variantes en genes infrecuentemente mutados, especialmente tras la corrección por comparaciones múltiples. Por este motivo, para aumentar nuestra potencia estadística, decidimos agrupar los genes según las diversas vías metabólicas en las que participan y estudiar el pronóstico de la alteración de dichas vías de forma integral. Mutaciones en vías metabólicas con valor pronóstico En nuestra cohorte identificamos tres rutas metabólicas que cuando presentaron mutaciones en alguno de los genes que participan en ellas, se asociaron a un pronóstico adverso: Remodelación de la cromatina dependiente de ATP Esta ruta metabólica se encarga de regular la compactación de la cromatina y es uno de los mecanismos fundamentales de regulación de la expresión génica (157). Los genes de esta vía que hemos estudiado han sido ARID1A, ARID1B, ARID5B, SMARCA4 y ACTB. Los cuatro primeros son miembros de la familia de proteínas SWI/SNF que forman diferentes subunidades de los complejos de remodelación de cromatina dependiente de ATP. ACTB, en cambio, es el gen que codifica la beta-actina, una proteína del citoesqueleto que, en este contexto, regula la interacción de los complejos de remodelación de la cromatina con el ADN (158,159). La alteración de la remodelación de la cromatina se ha descrito como un mecanismo importante en la patogenia de los linfomas, aunque su valor pronóstico aún no está claro (160). Las mutaciones en estos genes estuvieron presentes tanto en LDCGB CG como NCG REGISTRO TELEMÁTICO Sarreren Erregistro Orokorra / Registro General de Entradas 29/05/2025 18:26 EHU2025E022617