Señalización Molecular en las Fases Tempranas de la Conidiación en el Hongo Modelo Aspergillus nidulans

(cc) 2021 Mikel Iradi Serrano (cc by-nc-nd 4.0) Biokimika II Kimika Aplikatua Kimika Fakultatea Donostia Señalización Molecular en las Fases Tempranas de la Conidiacin en el Hongo Modelo Aspergillus nidulans Memoria presentada para optar al grado de Doctor en Química Aplicada y Materiales Poliméricos por, Mikel Iradi Serrano 2021 Director de Tesis Doctoral: Unai Ona Ugalde Profesor Titular Facultad de Ciencias Químicas EHU/UPV Esta Tesis Doctoral ha sido realizada en la Facultad de Ciencias Químicas de Donostia (EHU/UPV) bajo la dirección del Dr. Unai Ona Ugalde Martínez, Profesor Titular de la UPV/EHU. El trabajo recogido en esta memoria ha sido financiado por el Gobierno Vasco a través del proyecto IT599-13, y por una beca del Programa para Formación de Personal Investigador de la UPV/EHU al doctorando Mikel Iradi Serrano. “A menudo la última llave que te queda por probar abre el candado” Anónimo Aita, Ama, Amona, Imanol eta Mariari ESKERRAK / AGRADECIMIENTOS: Gezurra dirudien arren, hauek izan dira tesi honetan idaztea gehien kostatu zaizkidan hitzak, jakin badakidalako asko izan zaretela urte hauetan zehar, hainbeste joan etorriren ondoren, nire ondoan egon zaretenak. Lehenik eta behin, ez nuke zientziaren munduan murgiltzeko aukerarik izango, aukera eman ez bazenit. Unai, orain dela sei urte eskua luzatu zenidanetik, zuri esker hainbat erronkei aurre egiteko gai izan naiz. Ezin izango dizut nahikoa eskertu une oro nirekin izan duzun pazientzia, denbora eta hitz egiteko eskaini didazun denbora guztia. Momentu guzti hauetatik, zatitxo asko daramatzat nire baitan. Bihotzez, mila esker! Laborategian asko izan zarete urte hauetan zehar aurrera egiten lagundu didazuenak. Oier, liburu ireki bat naiz zuretzako, beti egon zara prest izan ditudan zalantzak argitu eta momentu zailetan aurrera jarraitzeko behar nuen bultzada emateko. Marc, eskerrak ematen dizkizut niretzako ezezaguna zen mundu bat erakutsi eta tesi honetan ezinbesteko garrantzia izan duen zutabe izan zarelako. Aunque parezca mentira, éstas han sido las palabras que más me ha costado escribir en la tesis, porque sé que habéis sido muchos los que habéis estado a mi lado durante estos años, después de tantas idas y venidas. En primer lugar, no tendría la oportunidad de sumergirme en el mundo de la ciencia, si no me hubieras dado la oportunidad. Unai, desde que me tendiste la mano hace seis años, gracias a ti he sido capaz de afrontar varios retos. No podré agradecerte lo suficiente toda la paciencia, ayuda y el tiempo que has dedicado a estar conmigo. De todos estos momentos, me llevo muchos trocitos dentro de mí. ¡Muchas gracias, de todo corazón! En el laboratorio habéis sido muchos los que me habéis ayudado a avanzar a lo largo de estos años. Oier, soy un libro abierto para ti, siempre has estado dispuesto a resolver las dudas que he tenido y a darme el impulso que necesitaba para seguir adelante en los momentos más difíciles. Marc, te doy las gracias por haberme mostrado un mundo desconocido para mí y haber sido un pilar fundamental en esta tesis. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL ........................................ 5 1. Características generales de Aspergillus nidulans ................................................... 7 2. Ciclo de vida ................................................................................................................ 7 2.1. Crecimiento vegetativo .................................................................................. 9 2.2. Desarrollo asexual ....................................................................................... 10 3. La transición desde la hifa al conidióforo en Aspergillus nidulans ...................... 11 4. El Factor FluG y sus funciones en la formación del conidióforo ......................... 15 OBJETIVOS .............................................................................................. 17 CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS ..................................... 21 1. Cepas de Aspergillus nidulans .................................................................................. 23 2. Oligonucleótidos ....................................................................................................... 25 3. Plásmidos ................................................................................................................... 29 3.1. Plásmidos utilizados en A. nidulans ............................................................ 29 3.2. Plásmidos utilizados para expresión en E. coli ............................................ 30 4. Medios y condiciones de cultivo de Aspergillus nidulans ...................................... 31 5. Recuento de conidias y cleistotecios y pesaje de colonias ..................................... 33 5.1. Recuento de conidias ................................................................................... 33 5.2. Recuento de cleistotecios ............................................................................. 33 5.3. Pesaje de colonias ........................................................................................ 34 6. Experimentos de contacto entre colonias ............................................................... 34 7. Transformación de Aspergillus nidulans ................................................................ 34 7.1. Obtención de protoplastos ........................................................................... 35 7.2. Transformación de protoplastos .................................................................. 36 8. Aislamiento y manipulación de ácidos nucleicos ................................................... 37 8.1. Generación de mutantes nulos y etiquetado de genes con o sin promotor inducible ............................................................................................................. 37 8.2. Extracción de ADN genómico ..................................................................... 40 8.3. Southern Blot ............................................................................................... 41 8.4. Mutagénesis dirigida .................................................................................... 44 8.5. Inducción de la expresión ............................................................................ 45 8.6. Sustitución de las regiones de fluG por homólogos bacterianos y de planta 45 9. Técnicas de análisis de expresión génica ................................................................ 47 9.1. Extracción y cuantificación del ARN total .................................................. 47 9.2. Síntesis de cDNA ......................................................................................... 47 9.3. Real-Time PCR (PCR a tiempo real) ........................................................... 47 10. Técnicas de biología molecular para Escherichia coli ......................................... 48 10.1. Medios de cultivo y condiciones para E. coli ............................................ 48 10.2. Transformación de E. coli .......................................................................... 48 10.3. Extracción de ADN plasmídico ................................................................. 49 10.4. Digestión y ligación de plásmidos y fragmentos de ADN ........................ 50 11. Técnicas de biología molecular para Lactobacillus paracasei y Pseudomonas aeruginosa ...................................................................................................................... 51 11.1. Medios de cultivo y condiciones para L. paracasei y P. aeruginosa ........ 51 11.2. Extracción de ADN genómico en bacteria ................................................ 52 12. Aislamiento y manipulación de proteínas en Aspergillus nidulans .................... 53 12.1. Extracción de proteínas .............................................................................. 53 12.2. Western blot ............................................................................................... 54 13. Herramientas de análisis bioinformático ............................................................. 55 13.1. Construcción y secuenciación .................................................................... 55 13.2. Análisis in silico de FluG .......................................................................... 55 13.3. Búsqueda de homólogos de FluG en bacterias y plantas ........................... 55 13.4. Búsqueda de estructuras de cristal mediante SWISS-MODEL ................. 56 13.5. Modelado de FluG mediante MAESTRO ................................................. 56 14. Microscopía de fluorescencia ................................................................................. 57 CAPÍTULO III: PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE FLUG .......................................................................................................... 59 1. Introducción .............................................................................................................. 61 2. Resultados ................................................................................................................. 63 2.1. La producción de conidias no se ve afectada en una cepa mutante  ausA . 63 2.2. Una cepa  ausA revierte el fenotipo aconidial de un mutante cfwA2 y  fluG ............................................................................................................................ 63 2.3. La deleción del gen fluG afecta tanto al desarrollo asexual, como al sexual en Aspergillus nidulans ....................................................................................... 65 2.4. FluG presenta una distribución homogénea en el citoplasma...................... 66 3. Discusión .................................................................................................................... 70 CAPÍTULO IV: ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG .......................................................................... 73 1. Introducción .............................................................................................................. 75 2. Resultados ................................................................................................................. 78 2.1. Primera Etapa. FluG contiene dos regiones afines a sendos dominios enzimáticos ......................................................................................................... 78 2.2. Estudio bioinformático de la región N-terminal .......................................... 79 2.3. Estudio bioinformático de la región C-terminal .......................................... 88 2.4. Estudio comparativo de FluG con las -glutamil poliamina ligasas de Pseudomonas aeruginosa ................................................................................... 95 2.5. Los genes homólogos a las dos regiones de FluG están presentes en bacterias, hongos y plantas ................................................................................. 97 2.6. Las dos regiones de FluG están presentes en operones de bacterias ......... 100 3. Discusión .................................................................................................................. 101 CAPÍTULO V: CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG ... 107 1. Introducción ............................................................................................................ 109 2. Resultados .................................................................................................... 110 2.1. Las regiones Ny C-terminal de FluG cumplen distintas funciones ......... 110 2.2. La expresión por separado de las regiones Ny C-terminal de FluG afecta al desarrollo sexual ............................................................................................... 112 2.3. La sustitución de los residuos conservados afecta a la función de FluG ... 113 2.4. Niveles de expresión del gen fluG en distintos mutantes .......................... 114 2.5. La sustitución heteróloga de ambas regiones de FluG por sus homólogos bacterianos complementan su función .............................................................. 115 2.6. La sustitución heteróloga de FluG por su homólogo de planta, NodGS, no complementa su función ................................................................................... 117 2.7. Precisiones sobre la actividad enzimática de la región C-terminal ........... 118 3. Discusión .................................................................................................................. 126 CAPÍTULO VI: DISCUSIÓN GENERAL ........................................... 131 Una enzima bifuncional ............................................................................................. 133 La función de FluG en el contexto del micelio ......................................................... 137 El papel de FluG más allá de su relación como UDA .............................................. 141 CONCLUSIONES ................................................................................... 143 BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................... 147 ANEXOS .................................................................................................. 169 Anexo 1 ........................................................................................................................ 171 Anexo 2 ........................................................................................................................ 172 Anexo 3 ........................................................................................................................ 173 Anexo 4 ........................................................................................................................ 175 Anexo 5 ........................................................................................................................ 176 Anexo 6 ........................................................................................................................ 177 Anexo 7 ........................................................................................................................ 180 Anexo 8 ........................................................................................................................ 181 Anexo 9 ........................................................................................................................ 183 Anexo 10 ...................................................................................................................... 184 Anexo 11 ...................................................................................................................... 185 Anexo 12 ...................................................................................................................... 186 Anexo 13 ...................................................................................................................... 187 Anexo 14 ...................................................................................................................... 188 Anexo 15 ...................................................................................................................... 191 Anexo 16 ...................................................................................................................... 192 Anexo 17 ...................................................................................................................... 193 Anexo 18 ...................................................................................................................... 194 Anexo 19 ...................................................................................................................... 195 Anexo 20 ...................................................................................................................... 196 Anexo 21: Artículo científico ..................................................................................... 197 CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL INTRODUCCIÓN GENERAL 7 1. Características generales de Aspergillus nidulans El género Aspergillus (Geiser et al., 2007) comprende unas 300 especies, entre las que se incluyen algunas de interés alimentario (A. niger y A. oryzae) y clínico (A. fumigatus, A. flavus o A. parasiticus) (Taylor et al., 1993). Aspergillus nidulans es un organismo modelo empleado en estudios de biología fundamental (Pontecorvo et al., 1953; Martinelli, 1994). Sus características para el cultivo (37 oC), carácter saprófito, la facilidad para realizar experimentos en genética clásica, el carácter haplo-diplonte del ciclo de vida y el carácter no patógeno de esta especie facilitan su uso (Taylor et al., 1993). El genoma de A. nidulans, de 30,52 millones de pares de bases, está distribuido en 8 cromosomas. Contiene alrededor de 11.000 genes (Galagan, 2005), de los cuales, solo el 20% han sido caracterizados (Andersen, 2014). Los datos actualizados del genoma pueden consultarse en Aspergillus Genome Database (www.aspg.com) (Cerqueira et al., 2014), sin embargo, la información más completa est siendo integrada en la base de datos FungiDB (www.fungidb.org/fungidb/) (Basenko et al., 2018). 2. Ciclo de vida El ciclo de vida de Aspergillus nidulans incluye fases haplontes y diplontes, detallados en la Figura 1 (Casselton y Zolan, 2002). La primera etapa (haploide) comienza con la germinación de una espora y continúa con la formación de un tubo germinativo. El crecimiento vegetativo, está basado en hifas, que conforman una colonia intercomunicada denominada micelio. Dependiendo de los estímulos del entorno, el hongo puede llevar a cabo el desarrollo asexual para formar conidias (mitosporas), o sexual, dando lugar a ascosporas (meiosporas). En ciertos casos, un individuo puede llevar a cabo la fusión de hifas con otro, con fusión de núcleos, dando lugar a un diploide (ciclo parasexual). Teniendo en cuenta que esta tesis se ha centrado principalmente en las etapas comprendidas entre el crecimiento vegetativo y el desarrollo asexual, a continuación, se explicarán detalle estas dos fases del ciclo de vida. INTRODUCCIÓN GENERAL 8  Ciclo vegetativo  Ciclo asexual  Ciclo sexual  Ciclo parasexual CICLO PARASEXUAL Fusión entre hifas Diploide (2n) Heterocarión (n + n) CICLO ASEXUAL Célula pie y tallo Métulas Fiálidas Conidióforo Vesícula Desarrollo de asca Formación de ascosporas Cleistotecio Asca que contiene 8 ascosporas CICLO SEXUAL Ascospora Formación del dicarionte CICLO VEGETATIVO Germinación Espora Ramificación Figura 1. Ciclo de vida de Aspergillus nidulans. Modificado a partir de (Casselton y Zolan, 2002) INTRODUCCIÓN GENERAL 9 2.1. Crecimiento vegetativo La formación del micelio se inicia con la germinación una espora asexual o sexual. Estímulos externos (principalmente, presencia de agua y azúcares) propician una primera fase de crecimiento isotrópico (Momany, 2002). A continuación, se establece un punto de crecimiento polarizado dando lugar al tubo germinativo. Este tubo se extiende de manera polarizada hasta dar lugar a la formación de una hifa. Las hifas son células cilíndricas multinucleadas que mantienen un crecimiento polar (Riquelme et al., 2003) y están separadas por septos, a través de cuyos poros se regula el flujo de material celular (Harris, 2001). La hifa principal da lugar a ramificaciones, las cuales se van extendiendo sin alterar al crecimiento de la hifa principal (Trinci, 1970). A medida que transcurre este patrón de crecimiento, las ramificaciones distales acaban fusionándose entre sí mediante un proceso denominado anastomosis, el cual ha sido observado detalladamente en el ascomiceto Neurospora crassa que ofrece ventajas para la observación microscópica, por su tamaño (Roper et al., 2015; Fischer y Glass, 2019) (Figura 2). La cinética del crecimiento de un micelio ha sido estudiada en detalle en Aspergillus nidulans (Trinci, 1969; 1970). Zona interior de la colonia Zona periférica de la colonia Figura 2. Morfología de una colonia de Neurospora crassa durante el ciclo vegetativo: En la zona interior de la colonia, las hifas están interconectadas tras fenómenos de anastomosis (arriba a la derecha), mientras que, en la zona periférica, se repelen la una a la otra (abajo a la derecha). Modificado a partir de (Hickey et al., 2002) y (Buller, 1933) INTRODUCCIÓN GENERAL 16 identificado pudo causar la esporulación de un mutante nulo (  fluG) en la zona de contacto entre ambas colonias, incluso cuando estaban separadas por una membrana de tamaño de poro de 6-8 kDa (Lee y Adams, 1994). Otros estudios reportaron que un mutante nulo de FluG no producía un aducto de dos metabolitos secundarios llamados dehidroaustinol y diorcinol, que, era capaz de inducir la esporulación de un mutante nulo en fluG (Rodriguez-Urra et al., 2012). Se ha puesto en duda que el citado aducto fuese el factor de FluG, puesto que una cepa que no produce dehidroaustinol, es capaz de esporular (Nielsen et al., 2011). Otros estudios han verificado que mutantes de los genes UDA que están rio debajo de FluG (FlbB y FlbE) pueden causar la esporulación en la zona de contacto con el mutante nulo de fluG. Sin embargo, estos mutantes también esporulan en contacto con una cepa silvestre. Ello indica que hay al menos dos metabolitos relacionados con la esporulación (Etxebeste et al., 2008; Garzia et al., 2009). Si bien se puede intuir que existe una relación entre los factores FlbB y FlbE con FluG, se desconoce la identidad de los metabolitos y su papel en el proceso. Algunos trabajos han propuesto que la función de FluG podría estar modulada por la luz. Una mutación en el gen (FluG701) afectó a la sensibilidad a la luz roja (Yager et al., 1998). Esta evidencia propició la conexión funcional entre FluG y el complejo velvet. En la misma línea, se observó que la expresión de FluG aumenta en presencia de la luz (Ruger-Herreros et al., 2011). Otro estudio en Aspergillus flavus, reportó mediante experimentos Yeast-Two-Hybrid la interacción molecular entre FluG y VeA (Chang et al., 2013). Esto entraría en contradicción con una distribución citoplásmica descrita anteriormente (Lee y Adams, 1994). Ante la diversidad de informaciones e interpretaciones sobre la función de este importante factor de desarrollo asexual, el objetivo de esta tesis ha sido el de arrojar luz sobre su función mediante el uso de técnicas actualizadas de estudio en biología molecular y bioinformática. OBJETIVOS OBJETIVOS 19 La línea principal de investigación de está tesis doctoral está dedicada a la caracterización y el análisis funcional del gen fluG en Aspergillus nidulans. Este gen ha sido analizado en estudios anteriores efectuados en otros géneros de Aspergillus, no obstante, su papel en la regulación del desarrollo de hongo sigue siendo desconocido. Debido a ello, los objetivos generales que se plantearon al inicio del trabajo de investigación fueron: 1. Determinación de la relevancia del gen ausA en la inducción del desarrollo asexual, en relación con el gen fluG. Localización de FluG in vivo y primera caracterización bioinformática del gen fluG. 2. Estudio bioinformático del gen fluG y modelado estructural de la proteína, con el objeto de elucidar su función 3. Comprobación experimental de las hipótesis resultantes del análisis bioinformático de la secuencia de fluG. CAPÍTULO II: MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 23 1. Cepas de Aspergillus nidulans Las cepas utilizadas en el trabajo realizado a lo largo de esta tesis, están reflejadas en la Tabla 1. Tabla 1. Cepas utilizadas en este estudio Cepa Genotipo Fuente TTA127.4 (BD80) yA2;  fluG::trpC+; pabaA1;trpC801; veA1 (Lee y Adams, 1994) TN02A3 (BD129) pyrG89; argB2; pyroA4; ΔnkuA::argB+; veA1 (Nayak et al., 2006) CRO1 (BD267) cfwA2; yA2; pabaA1; veA1 (MárquezFernández et al., 2007) BD688 pyrG89; argB2; pyroA4; ΔausA::pyrG+; ΔnkuA::argB+; veA1 Este estudio WIM 126 yA2; pabaA1; veA+ (Butnick et al., 1984) FGSC A#1155 pyrG89;  nkuA::bar; pyroA4; veA1 Fungal Genetics Stock Center; (McCluskey et al., 2010) BD824 pyrG89;  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio (cruce entre WIM126 x FGSC A#1155) BD969 pyrG89;  fluG::pyrG+;  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD970 pyrG89; fluG(1-406);  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD971 pyrG89; fluG(427-865);  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD972 pyrG89; fluG(H20A;H22A);  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD975 pyrG89; fluG::GFP::pyrG+;  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio MATERIALES Y MÉTODOS 24 BD977 pyrG89; GFP::fluG;  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD982 pyrG89; alcA(p)::fluG::GFP::pyrG+;  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD988 pyrG89; fluG::HA3x::pyrG+;  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1145 pyrG89;  fluG::LSEI_0440::fluG(407865);  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1194 pyrG89; fluG(1-406);  nkuA::bar; pyroA4; fluG(427-865)::pyroA+; veA+ Este estudio BD1195 pyrG89; fluG(D354A);  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1196 pyrG89; fluG(H20A;H22A;D354A);  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1197 pyrG89; fluG(E566A);  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1198 pyrG89; fluG(E626A);  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1199 pyrG89; fluG(H682A);  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1200 pyrG89; fluG(R720A);  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1201 pyrG89; fluG(R739A);  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1202 pyrG89; fluG(R744A);  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1203 pyrG89; fluG(E752A);  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1206 pyrG89; GFP::fluG;  nkuA::bar; pyroA4; hhoA::mRFP::pyrG+; veA+ Este estudio BD1207 pyrG89; alcA(p)::GFP::fluG::pyrG+;  nkuA::bar; pyroA4; hhoA::mCherry::pyroA+; veA+ Este estudio MATERIALES Y MÉTODOS 25 BD1208 pyrG89; HA3x::fluG;  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1229 pyrG89;  fluG::PA5508;  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1231 pyrG89;  fluG::fluG(1-426)::PA5508;  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1233 pyrG89;  fluG::LSEI_0440::fluG(407426)::PA5508;  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio BD1235 pyrG89;  fluG::NodGS;  nkuA::bar; pyroA4; veA+ Este estudio 2. Oligonucleótidos Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados en este trabajo, suministrados por IDT y Metabion, están reflejadas en la Tabla 2. Para el diseño de los oligonucleótidos se utilizó el paquete informático Vector NTI 10.1.1. Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados en este estudio Oligonucleótido Secuencia (5´→3´) Construcción ausA-PP1 GGG GAG TGC ATA GGG ATA CAG AGT ACT AAC C Amplificación de la región 5´-UTR de ausA ausA-PP2 CAT CTT TCG AAA TAA AGT GAT CTT GAC TAA AAG G Amplificación de la región 5´-UTR de ausA ausA-SMP1 CCT TTT AGT CAA GAT CAC TTT ATT TCG AAA GAT GAC CGG TCG CCT CAA ACA ATG CTC T Generación del mutante nulo  ausA ausA-GFP2 CCA TTA CCA CAA CGA GGA TAG GCA CTA AAT ACT AAT TAG TCT GAG AGG AGG CAC TGA TGC G Generación del mutante nulo  ausA ausA-GSP3 TAA TTA GTA TTT AGT GCC TAT CCT CGT TGT GGT AAT GG Amplificación de la región 3´-UTR de ausA ausA-GSP4 GCC CGT CTT CCA AAT CTT CGC Amplificación de la región 3´-UTR de ausA MATERIALES Y MÉTODOS 32 Esterilizar en autoclave Medio completo Aspergillus (MCA) líquido Solución de sales y elementos traza 20 mL Extracto de levadura 5 g Ajustar el pH a 6,8 (con NaOH) Esterilizar en autoclave Medio de regeneración (MMR) Solución de sales y elementos traza 20 mL D(+)-Sacarosa (1 M) 342 g Agar (medio sólido) 15 g Ajustar el pH a 6,8 (con NaOH) Esterilizar en autoclave Medio de regeneración-TOP (MMRTOP) Solución de sales y elementos traza 20 mL D(+)-Sacarosa (1 M) 342 g Agar (medio sólido) 6 g Ajustar el pH a 6,8 (con NaOH) Esterilizar en autoclave Medio mnimo “Watch” (WMM) Elementos traza 1 mL KCl (17 mM) 0,5 g MgSO4·7H2O (5 mM) 0,5 g Ajustar el pH a 6,8 (con NaOH) Esterilizar en autoclave Solución NaH2PO4 5 M (25 mM) 5 mL Solución de D(+)-glucosa (0,1 % (p/v)) 5 mL Solución de tartrato amónico (5 mM) 10 mL Tabla 4. Soluciones utilizadas para los medios Soluciones Cantidades por litro Elemenos traza (103x) ZnSO4·7H2O 22 g H3BO3 11 g MnCl2·4H2O 5 g FeSO4·2H2O 5 g CoCl2·6H2O 1,6 g CuSO4·5H2O 1,6 g (NH4)6Mo7O24·4H2O 1,1 g Na2EDTA 50 g Ajustar el pH a 6,8 (con NaOH) Cubrir la botella con papel de aluminio Esterilizar en autoclave Sales + Elementos traza (50x) KCl 26 g MgSO4·7H2O 26 g KH2PO4 72 g 50 mL de elementos traza MATERIALES Y MÉTODOS 33 Cubrir la botella con papel de aluminio Esterilizar en autoclave D(+)-glucosa (10x) D(+)-glucosa 200 g Esterilizar en autoclave Tartrato amónico (100x) Tartrato amónico 92 g Esterilizar en autoclave NaH2PO4 5 M NaH2PO4 599,9 g Esterilizar en autoclave Tabla 5. Preparación de suplementos Suplementos Cantidades por litro Biotina (104x) Biotina 0,1 g Esterilizar por filtración (0,45m) Ácido p-aminobenzoico (Paba) (103x) Ácido p-aminobenzoico 2 g Esterilizar por autoclave Piridoxina (Pyro) (103x) Piridoxina 0,5 g Esterilizar por filtración (0,45m) Uridina 122 mg/100 mL de medio Uracilo 56 mg/100 mL de medio 5. Recuento de conidias y cleistotecios y pesaje de colonias 5.1. Recuento de conidias Se inocularon las cepas con en método de inoculación-puntual y se incubaron durante 72 horas. Finalizado el periodo de incubación, se recogieron las colonias cortando el agar por el perímetro de la colonia y se dispersaron las esporas vertiendo el trozo de agar en un tubo de 50 mL con una solución de Tween® 20 al 0,02 % (v/v) y se agitaron utilizando un vortex a velocidad máxima durante un minuto, dos veces. Se contaron las esporas utilizando un hematocitómetro (celda Thoma) en un microscopio (Optihot, Nikon). El área de la colonia se midió fotografiando las colonias, y tratando las imágenes utilizando el programa Digimizer 4.6.1 (MedCalc Software bvba). Los contajes se hicieron en tres tandas con al menos cuatro réplicas cada una y se utilizó el test de Grubbs para detectar ‘outliers’ (Grubbs, 1969). El número de esporas por cm2 se calculó a través de la división de la concentración de conidias por el diámetro de la colonia. 5.2. Recuento de cleistotecios Se sembraron placas Petri con 1x105 conidias en forma de césped, se sellaron las placas con Parafilm® M (Bemis) en el perímetro de las placas y se taparon con papel de MATERIALES Y MÉTODOS 34 aluminio. Se incubaron a 37 C durante 7 días. Finalizado el periodo de incubación, se recogieron 4 discos de 15 mm de diámetro paras cada cepa, se pulverizaron con una solución de etanol cosmético al 96 % para eliminar de la superficie las estructuras de esporulación asexuales y se fotografiaron los cleistotecios con una lupa binocular Nikon SMZ8000 a 20x aumentos para posteriormente ser contados utilizando el programa de tratamiento de imágenes Fiji (Schindelin et al., 2012). 5.3. Pesaje de colonias Para los experimentos de pesaje, se cortaron membranas de diálisis (Spectra/Por® 6) con un límite de peso molecular de 3,5 kDa y se esterilizaron en las mismas condiciones que los medios. Una vez estériles, se colocaron las membranas encima de los cultivos de crecimiento, se sembraron las cepas con en método de inoculación-puntual y se incubaron durante 72 horas. Finalizado el periodo de incubación, se recogieron las colonias separandolas de la membrana y se dejaron secar a 80 C toda la noche. En los casos en los que se cortó la colonia del agar, este último se eliminó derritiéndolo con agua caliente (80 C) y secando la colonia a 80 C toda la noche. El área de la colonia se midió fotografiando las placas sobre la membrana, y tratando las imágenes utilizando el programa Digimizer 4.6.1. Los pesajes se hicieron en tres tandas con al menos cuatro réplicas cada una y se utilizó el test de Grubbs para detectar ‘outliers’ (Grubbs, 1969). El número de miligramos por cm2 se calculó a través de la medida del diámetro de la colonia y los pesajes obtenidos. 6. Experimentos de contacto entre colonias Todos los experimentos de contacto se llevaron a cabo en placas de 90 mm de diámetro con MCA. Las cepas se inocularon puntualmente con un centímetro de separación y se incubaron hasta que entraban en contacto. A partir de ese momento, se siguieron cultivando durante 96 horas. Finalizado el periodo de incubación, se fotografiaron las zonas de contacto con una lupa binocular Nikon SMZ8000 a 20x aumentos. 7. Transformación de Aspergillus nidulans La obtención de los protoplastos de Aspergillus nidulans se realizó mediante el protocolo descrito por (Szewczyk et al., 2006), mientras que transformación de MATERIALES Y MÉTODOS 35 protoplastos se realizó utilizando el protocolo descritos por (Tilburn et al., 1983). Las soluciones necesarias para llevar a cabo ambos procesos están detalladas en la Tabla 6. Tabla 6. Soluciones utilizadas en la transformación de A. nidulans Soluciones Cantidades por 100 mL KCl 0,6 M KCl 4,47 g Esterilizar en autoclave KCl 0,6 M + CaCl2 50 mM KCl 4,47 g CaCl2·2H2O 0,74 g Esterilizar en autoclave KCl 1 M + Ácido cítrico 0,1 M KCl 8,20 g Ácido cítrico monohidratado 2,10 g Esterilizar en autoclave Guardar a 4 C D(+)-Sacarosa 1,2 M D(+)-Sacarosa 41,08 g Esterilizar en autoclave Solución 7 Sorbitol 18,22 g Tris-HCl (1 M, pH=7,5) 1 mL CaCl2 (1 M) 1 mL Esterilizar en autoclave Solución 8 Polietilenglicol (PEG6000) 60 g Tris-HCl (1 M, pH 7,5) 1 mL CaCl2 (1 M) 1 mL Añadir 10 mL de agua destilada, fundir en el microondas y enrasar a 100 mL Esterilizar en autoclave Solución de obtención de protoplastos (Prepararla 30 minutos antes de empezar el proceso de digestión) VinoTaste® Pro (Novozymes) 2,048 g KCl 1 M + Ácido cítrico 0,1 M 16 mL Centrifugar hasta que se disuelva el VinoTaste® y reposar en hielo. 7.1. Obtención de protoplastos Se obtuvieron esporas de la cepa a ser transformada en un tubo de 50 mL que contenía una solución de Tween® 20 al 0,02 % (v/v) y se agitó utilizando un vortex. La suspensión resultante de esporas se filtró a través de Miracloth (Calbiochem®, dp = 2225 μm) estéril y posteriormente se le eliminó la solución de Tween centrifugándo a 4000 rpm durante 5 minutos. Se añadió solución de Tween nuevamente y se contaron las esporas. Se inocularon 150 mL de MCA líquido y los suplementos necesarios con 2,5·106 conidias/mL en un matraz de 500 mL. El inóculo se incubó durante 14 horas a 28 °C con agitación (180 rpm). Una vez transcurrido el periodo de incubación, se filtró el MATERIALES Y MÉTODOS 36 micelio a través de Miracloth estéril sin prensar el micelio y se lavó con MCA líquido con el objeto de eliminar el Tween residual. Se pesaron entre 1 y 1,5 g de micelio y se depositaron en un tubo de 50 mL que contenía 16 mL de solución de obtención de protoplastos (Tabla 6) y 16 mL de MCA líquido con los suplementos requeridos. Se incubó la mezcla a 30 °C en agitación (100 rpm) durante 90-120 minutos. Durante el proceso de digestión, se agitó la suspensión a baja velocidad durante 5 segundos utilizando un vortex cada 15 minutos para favorecer la separación de los protoplastos y el micelio. Se observó la aparición de protoplastos aproximadamente a los 60 minutos de incubación. Una vez obtenidos los protoplastos, se dividió la mezcla en dos tubos de 50 mL que contenían 16 mL de la solución de D(+)-sacarosa 1,2 M; la mezcla se añadió lentamente utilizando una pistola auxiliar de pipeteado (Accu-Jet®, Brand). Una vez añadida la mezcla de protoplastos a la sacarosa, se procedió a centrifugar los tubos a 1800 g durante 10 minutos a 4 °C (SorvallTM Biofuge Primo R, Thermo Scientific). Tras haber finalizado la centrifugación, se recogió la banda de protoplastos de la interfase entre la sacarosa y la mezcla de protoplastos (sin micelio) y se depositó en un tubo de 50 mL previamente enfriado en hielo. Posteriormente, se añadió a los protoplastos recogidos de la interfase el doble del volumen de KCl 0,6 M frío y se mezcló suavemente por inversión. Se volvió a centrifugar la mezcla resultante a 1800 g durante 10 minutos a 4 °C, se retiró el sobrenadante y se procedió a resuspender el precipitado de protoplastos en 2 mL de KCl 0,6 M frío. La suspensión de protoplastos resultante se dividió en dos tubos de 2 mL y se centrifugó a 2400 g durante 3 minutos a temperatura ambiente (SorvallTM LegendTM Micro 21R, Thermo Scientific). Se retiró el sobrenadante y se resuspendieron ambos precipitados en un único tubo de 1 mL de KCl 0,6 M. Previa la transformación de los protoplastos, se centrifugó el tubo a 2400 g durante 3 minutos a temperatura ambiente, se retiró el sobrenadante y se resuspendió finalmente el precipitado en 1 mL de KCl 0,6 M y CaCl2 50 mM. 7.2. Transformación de protoplastos Una vez obtenidos los protoplastos y estando re-suspendidos en la solución KCl 0,6 M y CaCl2 50 mM se añadieron 100 μL de la suspensión de protoplastos y 10 μL de ADN en un tubo de 50 mL; a modo de control, se añadieron otros 100 μL de la suspensión de protoplastos a otro tubo de 50 mL, pero no se añadió ADN. Acto seguido, se mezcló el contenido mediante agitación por vortex entre 6 y 8 veces durante 2 segundos a velocidad máxima; este paso es crítico para asegurar una buena eficiencia en la MATERIALES Y MÉTODOS 37 transformación. A continuación, se 50 μL de solución 8 (a temperatura ambiente) añadieron a cada tubo y se mezclaron mediante agitación por vortex 4-6 veces durante 2 segundos a la misma velocidad que el anterior paso. Inmediatamente, se introdujeron los tubos en hielo y se incubaron durante 25 minutos. Una vez finalizada la incubación, se añadió 1 mL de solución 8 a ambos tubos y se homogenizaron las muestras por golpeteo con los dedos; se dejaron incubar los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos. Finalmente, se añadieron 5 mL de solución 7 a temperatura ambiente y luego MMR-TOP hasta los 20 mL, este último, previamente fundido y mantenido a 50 °C hasta el momento de la transformación. Las mezclas resultantes se vertieron en cinco placas, de las cuales, una contenía medio no selectivo, y cuatro contenían medio selectivo. En el caso del tubo que contenía el control sin ADN, se vertió la mezcla en dos placas, de las cuales una contenía MMR con medio no selectivo (en el cual deberían germinar y crecer los protoplastos) para confirmar la viabilidad de los protoplastos y una placa que contenía MMR con medio selectivo a modo de control negativo (en el que no debería de crecer nada) para verificar que no hubiera contaminantes. Por otro lado, el contenido del tubo con ADN se vertió en tres placas de MMR con medio selectivo para que solo crecieran aquellos protoplastos que habían sido transformados. Las placas se incubaron durante 35 días. Finalmente, las colonias transformates fueron aisladas y refrescadas en placas que contenían medio selectivo para confirmar que no era un contaminante. 8. Aislamiento y manipulación de ácidos nucleicos 8.1. Generación de mutantes nulos y etiquetado de genes con o sin promotor inducible Los casetes genómicos que se han utilizado en esta tesis para la deleción y el etiquetado de genes de A. nidulans fueron construidos utilizando los protocolos de PCR de fusión (Yang et al., 2004) y Touchdown PCR y (Korbie y Mattick, 2008). Los casetes que se diseñaron para la generación de mutantes nulos se construyeron amplificando mediante PCR por un lado los fragmentos correspondientes a la región 5´-UTR o promotor y la región 3´-UTR o terminador del gen candidato a ser delecionado. MATERIALES Y MÉTODOS 38 Figura 8. PCR de fusión y etiquetado de genes. Delecin de genes: Primero, se amplificaron el promotor (azul), el marcador de selección ( naranja) y el terminador (verde) utilizando los oligonucleótidos específicos (PP, Promoter Primer y GSP, Gene S pecific Primer) PP1/PP2, SMP1/GFP2 y GSP3/GSP4, respectivamente. Los oligonucleótidos SMP1 y GFP2, han sido diseñados con una región complementaria al final del promotor y principio del terminador, respectivamente. Acto seguido, los fragmentos se fusionaron mediante PCR utilizando los oligonucleótidos PP1 y GSP4. El gen a delecionar ( morado ) es reemplazado en la transformación mediante recombinación del producto de PCR, el cual contiene el marcador de selección. Etiquetado de genes en el extremo 3 : Primero, se amplificaron 1,5 kb del gen a etiquetar (sin codón stop; morado), el eptopo (amarillo ) junto al marcador de selección (naranja ) y el terminador (verde ) utilizaron los pares de oligonucleótidos GSP1/GSP2, GFP1/GFP2 y GSP3/GSP4, respectivamente. Los tres fragmentos se fusionaron utilizando los oligonucleótidos GSP1 y GSP4. El gen a etiquetar, es reemplazado por el producto de fusión con el epítopo deseado (TAG: GFP, mRFP o HA 3x). Figura 7. Construcción de los plásmidos bajo promotor inducible: Para llevas a cabo la digestión del fragmento de 1 kb del gen fluG (morado ) y el plásmido pNT5, el cual contiene el promotor inducible alcA (rosa) el epítopo de interés (amarillo ) y el marcador genético (naranja), se utilizaron las enzimas de restricción AscI y BamHI en los extremos 5´ y 3´, respectivamente. Una vez llevada a cabo la ligación, los plásmidos se secuenciaron para descartar la presencia de mutaciones no deseadas. Tras llevar a cabo la transformación y recombinación del plásmido en la región de 1 kb del gen fluG, la correcta integración se confirmó mediante Southern blot. MATERIALES Y MÉTODOS 39 Por otro lado, se amplificó el marcador de selección que se deseaba insertar en lugar del gen diana, empleando oligonucleótidos con colas complementarias al extremo 3´ del promotor y al extremo 5´ del terminador que fueron amplificados previamente. Una vez obtenidos los tres fragmentos, se fusionaron mediante PCR de fusión o Touchdown PCR, quedando el marcador de selección entre los fragmentos correspondientes al promotor y terminador (Figura 8). El etiquetado de proteínas se efectuó tanto en el extremo amino (5´ del gen) como el carboxilo terminal (3´ del gen) con los epítopos GFP, HA3x, mRFP o mCherry. El etiquetado del extremo amino terminal se efectuó amplificando mediante PCR por un lado los fragmentos correspondientes a la región 5´-UTR o promotor y un fragmento que contenía el gen candidato a ser etiquetado y la región 3´-UTR o terminador del mismo gen. Por otro lado, se amplificó el epítopo que se deseaba insertar en el extremo amino terminal del gen, empleando oligonucleótidos con colas complementarias al extremo 3´ del promotor y al extremo 5´ del gen que fueron amplificados previamente. Una vez obtenidos los tres fragmentos, se fusionaron mediante PCR de fusión o Touchdown PCR, quedando el epítopo entre los fragmentos correspondientes al promotor y el gen con el terminador (Figura 8). El etiquetado en el extremo carboxilo terminal se efectuó amplificando una región de 1,5 kb del extremo carboxilo terminal del gen candidato a ser etiquetado, y el terminador del mismo gen. De la misma forma, se amplificó un fragmento que contenía el epítopo que se deseaba insertar en el extremo carboxilo terminal junto con un marcador de selección adecuado, utilizando oligonucleótidos con colas complementarias al extremo 3´ del gen que se quería etiquetar y al extremo 5´ del terminador que fueron amplificados previamente (Figura 8). El etiquetado en el extremo amino terminal bajo el promotor inducible alcA(p) se llevo a cabo utilizando el plásmido pNT5 3.1. Plásmidos utilizados en A. nidulans). Para ello, se amplificaron aproximadamente 1 kb (sin el codón ATG) del gen fluG y se emplearon las técnicas de digestión y ligación detalladas en el apartado 10.4. Digestión y ligación de plásmidos y fragmentos de ADN para llevar a cabo la construcción del plásmido (Figura 7). MATERIALES Y MÉTODOS 40 8.2. Extracción de ADN genómico Esta técnica se utilizó siguiendo el protocolo de (Sambrook et al., 1989). Para extraer ADN genómico se inocularon 1x106 conidias/mL de cada cepa en un matraz de 100 mL con 25 mL de MMA líquido junto con los suplementos necesarios y se cultivó a 37 °C toda la noche en agitación (220 rpm). El micelio se filtró a través de Miracloth, se introdujo en tubos cónicos de 2 mL y se liofilizó (Cryodos, Telstar®) toda la noche. Una vez recogido el micelio liofilizado, se añadió una bola de acero inoxidable de 3,2 mm de diámetro (Next Advance) y se pulverizó el micelio liofilizado con el homogeneizador (Mini-Beadbeater, Biospec) en dos pulsos de 5 segundos con agitación mediana. Acto seguido, se retiró la bola y se añadió 1 mL de la solución TSE (Tabla 7), 100 μL de SDS al 10 % (p/v) y se resuspendió la muestra por pipeteo hasta que el micelio pulverizado quedase completamente húmedo. Tabla 7. Soluciones utilizadas en la extracción de ADN genómico de A. nidulans Soluciones Preparación para 100 mL Tris-HCl 1 M (pH 8,0) Trizma® 12,114 g Ajustar el pH a 8,0 (con HCl) D(+)-sacarosa 1 M D(+)-sacarosa 34,23 g EDTA 0,5 M EDTA 18,61 g Solución TSE (Tris-HCl 25 mM / D(+)-Sacarosa 250 mM / EDTA 20 mM) Tris-HCl 1 M (pH 8,0) 2,5 mL D(+)-sacarosa 25 mL EDTA 0,5 M 4 mL SDS 10 % SDS 10 g NaOAc 3 M (pH 6) NaOAc 24,609 g Ajustar el pH a 6,0 (con OAc) Fenol/Sevag (Sevag = Cloroformo:Alcohol isoamílico; 24:1) Fenol orgánico 25 mL Cloroformo 24 mL Alcohol isoamílico 1 mL Guardar a 4 C Se incubó la mezcla durante 15 minutos a 65 °C, mezclando el lisado por leve golpeteo manual durante la incubación. Acto seguido, se añadió 1 mL de Fenol/Sevag (Tabla 7), se agitó la mezcla vigorosamente en vortex y se continuó con una agitación por inversión regular durante 10 minutos. Se centrifugaron los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos a máxima velocidad y se separó la fase orgánica y la acuosa. Se recogió la fase superior (acuosa) en otro tubo de 2 mL y se repitió la fenolización. Una vez terminada la segunda fenolización, se añadió a la fase acuosa 0,1 y 0,6 volúmenes de NaOAc 3 M (Tabla 7) e isopropanol, respectivamente, respecto al volumen MATERIALES Y MÉTODOS 41 recogido previamente. La mezcla se mezcló por inversión y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente (en este punto un pellet blanco de ADN se hacía visible). Se centrifugó durante 5 minutos, se retiró el sobrenadante por aspiración y se le añadió 1 mL de EtOH al 80 % (v/v) para lavar el precipitado. Se volvió a centrifugar la muestra a máxima velocidad y se retiró el etanol mediante aspiración. El precipitado se resuspendió en 400 μL de agua Milli-Q® (MilliporeTM), se añadieron 4 μL de ARNasa (5 mg/mL) (Sigma-Aldrich) y se incubó a 37 °C durante 45 minutos para eliminar el ARN presente en la muestra. Se volvieron a añadir 0,1 y 0,6 volúmenes de OAcNa (3 M) e isopropanol, respectivamente y se mezcló por inversión. A continuación, utilizando una punta de pipeta, se recogió la madeja de ADN y se transfirió a un tubo de 2 mL con 500 μL de EtOH al 80 % (v/v). Seguidamente, se centrifugó la muestra a temperatura ambiente durante 5 minutos a máxima velocidad y se eliminó el etanol en vacío. Se dejó secar el ADN con el tubo abierto para eliminar los restos de etanol y se resuspendió en 200 μL de agua MilliQ®. Se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % (p/v) para comprobar el estado y el tamaño del ADN extraído. 8.3. Southern Blot Esta técnica diseñada por (Sambrook et al., 1989) se utilizó para comprobar que la recombinación de los distintos fragmentos de ADN en los transformantes de Aspergillus nidulans se había desarollado correctamente. Las soluciones utilizadas están detalladas en la Tabla 8. El etiquetado y detección de las sondas se realizó con el kit DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche). Una vez se comprobó el estado de las alícuotas de ADN obtenidas mediante el método de extracción de ADN descrito anteriormente, se procedió a digerirlas con una endonucleasa de restricción que permitiera distinguir la correcta recombinación del fragmento a insertar en el locus adecuado, respecto al ADN de la cepa parental. Se efectuó la digestión en función de las instrucciones del fabricante, y se dejó incubando a 37 °C durante toda la noche. Una vez finalizada la digestión, se procedió a separar los fragmentos por su peso molecular mediante una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % (p/v), durante 2-3 horas. Una vez finalizada la electroforesis, se expuso el gel a luz UV (320 nm, Vilber Lourmat) durante 5 minutos para que los fragmentos de ADN separados sufriesen una mayor degradación, con el objetivo de facilitar la transferencia de fragmentos de gran tamaño. Acto seguido, se depositó el gel en una fuente y se separaron MATERIALES Y MÉTODOS 48 10. Técnicas de biología molecular para Escherichia coli 10.1. Medios de cultivo y condiciones para E. coli El medio de cultivo utilizado para Escherichia coli fue LB (Bertani, 1951) modificado (Sambrook et al., 1989). La composición está descrita en la Tabla 9. Tabla 9. Composición de medios de cultivo de E.coli Medios de cultivo Cantidades por litro LB líquido Bactotriptona (1 %) 10 g Extracto de levadura (0,5 %) 5 g NaCl (1 %) 10 g Ajustar el pH a 7 (con NaOH) Esterilizar en autoclave LB sólido Bactotriptona (1 %) 10 g Extracto de levadura (0,5 %) 5 g NaCl (1 %) 10 g Agar (1,5 %) 15 g Ajustar el pH a 7 (con NaOH) Esterilizar en autoclave La selección de transformantes se hizo en un medio que contenía el antibiótico ampicilina (50 mg/mL en agua) con una concentración de 100 μg/mL. 10.2. Transformación de E. coli La transformación de E. coli se llevó a cabo mediante la técnica de choque térmico (Hanahan, 1983). Todo el proceso se llevó a cabo en un tubo de 1,5 mL, en el que se añadieron 100 μL de células competentes de las cepas DH1 o DH5α y 1-2 μL de ADN plasmídico. Se dejó reposar la mezcla en hielo durante 20 minutos, y acto seguido se indujo en choque térmico incubando la mezcla a 42 °C durante 2 minutos y se dejó otra vez en hielo durante 1 minuto. A continuación, se añadió 1 mL de medio LB líquido y se incubó a 37 °C durante 1 hora con agitación a 250 rpm. Finalizado el periodo de incubación, se inocularon entre 50 y 100 μL de la mezcla de transformación en placas de Petri de 90 mm que contenían medio LB sólido suplementado con ampicilina. En el caso de las ligaciones, se centrifugó la mezcla a 2500 rpm durante 3 minutos, se retiraron 900 μL de sobrenadante y se concentró la mezcla de transformación en los 200 μL de MATERIALES Y MÉTODOS 49 sobrenadante restantes para posteriormente inocularlo en placas suplementadas con ampicilina. 10.3. Extracción de ADN plasmídico 10.3.1. Extracción de ADN plasmídico a partir de colonias Este método de extracción se utilizó para confirmar si las colonias transformantes contenían el plásmido de interés. La composición de las soluciones utilizadas para extraer ADN plasmídico de medio sólido está detallada en la Tabla 10. Tabla 10. Soluciones utilizadas para la extracción de ADN plasmídico en medio sólido Soluciones Cantidades por 10 mL Solución de lisis Tris-HCl 1 M (pH 8) 100 μl EDTA 0,5 M (pH 8) 200 μl NaOH 10 M 100 μl SDS (10 %) 1000 μl GLB Glicerol 500 μl Xileno-cianol 2,5 μl Azul de bromofenol 2,5 μl HCl 1 N + GLB HCl 1 N 3,34 mL GLB 6,66 mL Para empezar, se añadieron 40 μl de solución de lisis en un tubo de 1,5 mL. Se tomó una muestra de la colonia transformante con un palillo estéril y se frotó repetidamente contra la pared del tubo hasta que se depositó visiblemente la biomasa. Acto seguido, se mojó el palillo en la solución de lisis removiendo la mezcla y se dejó incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Tras ello, se añadieron 8 μl de la solución HCl (1 N) + GLB y se observó un color verde oscuro en la disolución. Se añadió la cantidad necesaria de solución de lisis hasta que la mezcla adquirió un color azul y se congeló la mezcla a -80 °C durante 15 minutos. Finalizado este tiempo, se centrifugó a 13000 rpm a 4 °C durante 10 minutos y se utilizaron 20 μl de sobrenadante para hacer una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % (p/v). 10.3.2. Extracción de ADN plasmídico de cultivo líquido Este método de extracción se utilizó para purificar el plásmido de interés de las colonias transformantes que se habían confirmado con el método de extracción de ADN plasmídico de medio sólido. La extracción del ADN plasmídico se efectuó inoculando primero una alícuota de la colonia bacteriana a analizar en 25 mL de medio LB líquido MATERIALES Y MÉTODOS 50 suplementado con ampicilina. Se cultivó la mezcla a 37 °C durante toda la noche con una agitación de 200 rpm. La extracción se llevó a cabo siguiendo las indicaciones del kit GenEluteTM Plasmid MiniPrep Kit (Sigma-Aldrich). Finalizada la extracción, se verificó la correcta extracción del ADN plasmídico, realizando una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % (p/v). 10.4. Digestión y ligación de plásmidos y fragmentos de ADN Tanto el plásmido pNT5 como los distintos fragmentos se digirieron por separado con las enzimas AscI (New England BioLabs®) y BamHI (Takara Bio Inc.) utilizando el protocolo de digestión facilitado por el fabricante. La digestión con ambas enzimas se efectuó a 37 °C durante al menos 1 hora y 30 minutos, y se comprobó que la digestión se completó realizando una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % (p/v). Tras confirmar la correcta digestión, se inactivó la enzima a a 80 °C durante 20 minutos y se purificó utilizando el kit NucleoSpin® Gel and PCR Clean-Up (Macherey-Nagel GmbH & Co), para retirar cualquier reactivo que pudiera causar interferencias en la segunda digestión. Una vez finalizadas ambas digestiones, se procedió a medir la concentración en μg/μl del plásmido y el fragmento utilizando el espectrofotómetro NanoDropTM 2000c (Thermo Fisher Scientific), y se calculó la concentración de ambos en picomoles, valiéndonos de la herramienta digital DNA μg & pmol Converter (Gene Infinity LLC). La ecuación utilizada por la herramienta, es la siguiente: 𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝐷𝑁𝐴 · 𝑝𝑚𝑜𝑙 660𝑝𝑔 · 106𝑝𝑔 1𝜇𝑔 · 1 𝑛º𝑑𝑒 𝑛𝑢𝑐𝑙𝑒ó𝑡𝑖𝑑𝑜𝑠 =𝑝𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐷𝑁𝐴 Tras obtener las concentraciones, se procedió a preparar la ligación añadiendo tanto el plásmido como el fragmento en una relación 1:3, respectivamente. La ligación de llevó a cabo utilizando la enzima T4 DNA Ligase (Takara Bio Inc.) siguiendo el protocolo de ligación facilitado por el fabricante. La ligación se efectuó a temperatura ambiente durante al menos 4 horas, y se transformó todo el producto de ligación en E. coli utilizando el protocolo descrito anteriormente (7.2. Transformación de protoplastos). MATERIALES Y MÉTODOS 51 11. Técnicas de biología molecular para Lactobacillus paracasei y Pseudomonas aeruginosa 11.1. Medios de cultivo y condiciones para L. paracasei y P. aeruginosa La composición de los medios de cultivo utilizados tanto para Lactobacillus paracasei (De Man et al., 1960) y Pseudomonas aeruginosa (Lapage et al., 1970) están descritos en la Tabla 11 y Tabla 12, respectivamente. Tabla 11. Composición de los medios de cultivo utilizados en Lactobacillus paracasei Medios de cultivo Cantidades por litro MRS líquido D(+)-glucosa 20 g Peptona 10 g Extracto de carne 10 g Extracto de levadura 5 g NaOAc 5 g K2HPO4 2 g Tartrato amónico 2 g Tween 80 % 1 g MgSO4·7H2O 0,1 g MnSO4·H2O 0,05 g Ajustar el pH a 6,2 (con NaOH) Esterilizar en autoclave MRS sólido D(+)-glucosa 20 g Peptona 10 g Extracto de carne 10 g Extracto de levadura 5 g NaOAc 5 g K2HPO4 2 g Tartrato amónico 2 g Tween 80 % 1 g MgSO4·7H2O 0,1 g MnSO4·H2O 0,05 g Agar 15 g Ajustar el pH a 6,2 (con NaOH) Esterilizar en autoclave Tabla 12. Composición de los medios de cultivo utilizados en Pseudomonas aeruginosa Medios de cultivo Cantidades por litro Medio de nutrientes líquido Tris HCl 5 g Extracto de levadura 2 g Extracto de carne 1 g NaCl 5 g Ajustar el pH a 7,2 (con NaOH) Esterilizar en autoclave MATERIALES Y MÉTODOS 52 Medio de nutrientes sólido Peptona 5 g Extracto de levadura 2 g Extracto de carne 1 g NaCl 5 g Agar (1,5 %) 15 g Ajustar el pH a 7,2 (con NaOH) Esterilizar en autoclave 11.2. Extracción de ADN genómico en bacteria 11.2.1. Extracción de ADN genómico de Lactobacillus paracasei Este método de extracción se utilizó para purificar el material genético de L. paracasei (Klaenhammer, 1984), la preparación de las soluciones utilizadas está descrita en la Tabla 13. Tabla 13. Soluciones utilizadas para la extracción de ADN de Lactobacillus paracasei Preparación de soluciones Cantidades por litro Solución de lisis Tris-HCl 1 M (pH 8) 20 mL Tween 20 % 12 mL EDTA 0,5 M (pH 8) 4 mL 20 g de Lisozima (Sigma-Aldrich) Guardar a -20 °C La extracción se efectuó inoculando primero una alícuota de la colonia bacteriana en 25 mL de medio MRS líquido. Se cultivó la mezcla a 37 °C durante toda la noche con una agitación de 200 rpm. Tras ello, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 180 μL de solución de lisis y 20 μL de mutanolisina (1 mg/mL) (SigmaAldrich), dejando incubar la mezcla durante 1 hora con agitación a 200 rpm. Acto seguido, se llevó a cabo la extracción de ADN genómico siguiendo las indicaciones del kit NucleoSpin® Tissue (Macherey-Nagel GmbH & Co). Finalizada la extracción, se verificó el estado del ADN genómico realizando una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % (p/v). 11.2.2. Extracción de ADN genómico de Pseudomonas aeruginosa La extracción de ADN genómico de P. aeruginosa se efectuó utilizando un kit de extracción de ADN genómico de bacterias. Primero se inoculó una alícuota de la colonia bacteriana en 25 mL de medio de nutrientes líquido. Se cultivó la mezcla a 37 °C durante toda la noche con una agitación de 200 rpm. Tras ello, se eliminó el sobrenadante y se llevó a cabo la extracción de ADN genómico siguiendo las indicaciones del kit MATERIALES Y MÉTODOS 53 NucleoSpin® Tissue (Macherey-Nagel GmbH & Co). Finalizada la extracción, se verificó el estado del ADN genómico realizando una electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % (p/v). 12. Aislamiento y manipulación de proteínas en Aspergillus nidulans 12.1. Extracción de proteínas Tabla 14. Soluciones utilizadas para la extracción de proteínas de Aspergillus nidulans Soluciones Cantidades por 100 mL Solución de lisis NaOH 10 M 1 mL β-mercaptoetanol 100 μL Guardar a 0 °C TCA 100 % TCA 220,26 g Cubrir la botella con papel de aluminio Guardar a 4 °C Tris Base 1 M Trizma® 12,114 g Guardar a 4 °C Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) Trizma® 6,057 g Ajustar el pH a 6,8 (con HCl) SDS 10 % SDS 10 g Tampón de ruptura Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) 1,66 mL SDS 10 % 2 mL β-mercaptoetanol 500 μL Urea 3,6 g Guardar a -20 °C La extracción de proteínas se llevó a cabo mediante el método descrito por (HervásAguilar y Peñalva, 2010). Se inocularon 2·106 conidias/mL de cada cepa en un matraz de 250 mL con 50 mL de medio líquido junto con los suplementos necesarios y se cultivó el inóculo a 37 °C durante 18 horas en agitación (220 rpm). El micelio se filtró a través de Miracloth estéril, se introdujo en tubos cónicos de 2 mL y se liofilizó (Cryodos, Telstar®) toda la noche. Una vez recogido el micelio liofilizado, se añadió una bola de acero inoxidable y se pulverizó el micelio liofilizado con el homogeneizador (Mini-Beadbeater, Biospec) en dos pulsos de 5 segundos con agitación mediana. Acto seguido se recogieron 6-7 mg de micelio pulverizado en un nuevo tubo de 2 mL y se resuspendió en 1 mL de tampón de lisis Tabla 14. Se disolvió el micelio mezclando el tubo vigorosamente en el vortex, se añadió 75 μL de TCA 100 % (p/v) para precipitar las proteínas y se incubó la mezcla durante 10 minutos en hielo. Finalizada la incubación, se centrifugó a 14000 rpm durante 5 minutos a 4 °C y se eliminó el TCA mediante aspiración. Se repitió este paso MATERIALES Y MÉTODOS 54 para retirar el TCA residual. Seguidamente, se añadieron 100 μL de Tris Base (1 M) y 200 μL de tampón de ruptura, se mezcló mediante agitación por vortex y se guardó la muestra a -20 °C. Previamente a ser cargadas en un gel de SDS-poliacrilamida, se descongelaron las muestras en hielo y se agitaron en vortex durante 30 segundos. Acto seguido, se hirvieron a 95 °C durante 5 minutos y se centrifugaron durante 1 minuto a velocidad máxima. 12.2. Western blot Los extractos proteicos fueron cargados en un gel SDS-poliacrilamida para realizar la separación de los mismos (Sambrook et al., 1989). Una vez se desnaturalizaron las muestras con las condiciones descritas previamente, se cargaron en dos geles con una concentración de poliacrilamida del 10 % (Mini-PROTEAN® 3, Bio-Rad) (Laemmli, 1970). La integridad de los extractos proteicos se analizó tiñendo uno de los geles con Bio-SafeTM Coomassie. Una vez confirmado el correcto estado de los extractos proteicos, se procedió a la transferencia del segundo gel a una membrana de PVDF (Trans-blot® TurboTM Midi PVDF Transfer Pack, Bio-Rad). Para comprobar que la cantidad de proteína fuera la misma en todas las muestras, se empleó el método Ponceau Staining (Goldman et al., 2016). Una vez hecha la comprobación, los epítopos correspondientes se detectaron mediante la hibridación con anticuerpos primarios específicos, y estos anticuerpos primarios se hibridaron con anticuerpos secundarios adecuados con actividad peroxidasa (Tabla 15). Tabla 15. Anticuerpos utilizados en el Western blot Esta actividad se indujo mediante el kit de quimioluminiscencia ECL (ClarityTM Western ECL Blotting Substrate, Bio-Rad) y la membrana se reveló con el dispositivo ChemiDocTM XRS+ System (Bio-Rad). Las imágenes se analizaron mediante el software ImageLab (versión 5.2, Bio-Rad). Anticuerpos Dilución Origen Fabricante Primario -GFP 1/5000 Ratón Roche -HA 1/7500 Ratón Santa Cruz Secundario -ratón IgG 1/4000 Cabra Jackson InmunoResearch Laboratories INC MATERIALES Y MÉTODOS 55 13. Herramientas de análisis bioinformático El análisis bioinformático de la secuencia genómica y proteica de fluG se llevó a cabo empleando las herramientas citadas a continuación. 13.1. Construcción y secuenciación Las distintas secuencias analizadas en este trabajo se obtuvieron a partir de las bases de datos Aspergillus Genome Database (www.aspgd.org/) (Cerqueira et al., 2014) y Ensembl Genomes (www.ensemblgenomes.org/) (Kersey et al., 2018). Las construcciones genómicas y plasmídicas se diseñaron utilizando el programa Vector NTI® versión 10.1.1 (Invitrogen). Los resultados obtenidos de la secuenciación de distintos mutantes se compararon con la secuencia original del gen utilizando la herramienta Lalign (www.embnet.vital-it.ch/software/LALIGN_form.html), la cual implementa un algoritmo (Huang et al., 1990). 13.2. Análisis in silico de FluG La secuencia proteica de FluG se analizó utilizando una serie de predictores específicos para los dominios que se detallan a continuación: El péptido señal, el cual señala el destino, la ruta de transporte y la eficiencia de secreción de una proteína, se predijo mediante la herramienta SignalIP 4.1 (Nielsen, 2017). Las señales de localización y exportación nuclear, que habilitan el transporte por el poro nuclear, se predijeron mediante las herramientas NLStradamus (Nguyen Ba et al., 2009) y NetNES 1.1 (la Cour et al., 2004), respectivamente. La presencia de hélices transmembrana, las cuales pueden indicar, según su conformación que la proteína interactúa con la membrana celular, se predijeron utilizando la herramienta TMHMM server v2 (Sonnhammer et al., 1998). Finalmente, los motivos PEST, los cuales son candidatos a ser cortados mediante proteólisis, se predijeron utilizando la herramienta epestfind (Rechsteiner y Rogers, 1996). La identificación de los motivos funcionales se llevó a cabo utilizando la herramienta HMMER (www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmer). 13.3. Búsqueda de homólogos de FluG en bacterias y plantas Utilizando la secuencia proteica de FluG como referencia, se buscaron ortólogos en bacterias, hongos y plantas realizando un BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome) en el MATERIALES Y MÉTODOS 56 apartado Protein Blast (Boratyn et al., 2013). Se utilizó el algoritmo BLOSUM26 como matriz de referencia, fijando el límite de evaluación del alineamiento (E-valor) en 2e-100. Una vez obtenidos los ortólogos, se procedió a hacer un alineamiento múltiple de todas las secuencias utilizando la herramienta Clustal Omega (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) facilitado por EBI (European Bioinformatics Institute) (Li et al., 2015). Los alineamientos se visualizaron utilizando el programa Jalview versión 2.10.3b1 (Waterhouse et al., 2009), y la conservación de cada residuo de todos los homólogos obtenidos se obtuvo utilizando el algoritmo de divergencia JensenShannon (Capra y Singh, 2007). El valor de la identidad de todos los ortólogos de FluG se obtuvo como una media de las identidades de todas las identidades de los ortólogos de FluG en bacteria, hongo y planta, en comparación con el FluG de Aspergillus nidulans. La construcción del árbol filogenético se llevó a cabo utilizando el software MEGA7 (Kumar et al., 2016) y aplicando el método basado en la mínima evolución (NeighborJoining Method) (Saitou y Nei, 1987). Los resultados fueron posteriormente editados utilizando la herramienta iTOL (Interactive Tree Of Life) (Letunic y Bork, 2019). La búsqueda de operones predichos en bacteria que codificaran ambas regiones de FluG se llevó a cabo mediante los predictores OperonDB (Pertea et al., 2009) y ProOpDB (Taboada et al., 2012). 13.4. Búsqueda de estructuras de cristal mediante SWISS-MODEL Utilizando la secuencia proteica de FluG como referencia, se utilizó la herramienta SWISS-MODEL (www.swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014) para identificar estructuras de cristal homólogas a ambas regiones de FluG. Tras haber obtenido varias estructuras candidatas a servir como modelos de FluG, previamente a ser utilizadas, se verificó si se había caracterizado la reacción enzimática que desempeñaban. Las estructuras de cristal de cada región de FluG fueron obtenidas de Protein Data Bank (PDB) (Berman et al., 2002). 13.5. Modelado de FluG mediante MAESTRO El modelado de FluG se llevó a cabo utilizando el programa MAESTRO, proporcionado por Schrödinger Suite, versión 2017-1 (Sastry et al., 2013). Primero, se llevó a cabo un preprocesado de la estructura de cristal candidata a ser utilizada como molde. Para ello, dentro del programa MAESTRO, se utilizó la aplicación Protein MATERIALES Y MÉTODOS 57 Preparation Wizard para eliminar moléculas de agua, añadir los átomos de hidrógeno y detectar problemas estructurales del modelo. Las cadenas laterales de aminoácidos que faltaban en el modelo, se generaron utilizando la aplicación Prime (Jacobson et al., 2004), mientras que los estados de protonación de cada cadena lateral fueron generados utilizando la herramienta EPIK a pH = 7 (Shelley et al., 2007). Acto seguido, se procedió a la minimización del modelo utilizando el campo de fuerza OPLS3 (Shivakumar et al., 2010; Harder et al., 2016). Una vez finalizado el procesado de los cristales, se procedió a construir los modelos de FluG con las estructuras de cristal tratadas, utilizando el programa Prime. El alineamiento utilizado para la generación de los modelos de cada región de FluG fue el obtenido por la herramienta SWISS-MODEL. 14. Microscopía de fluorescencia La localización subcelular de FluG en Aspergillus nidulans se analizó utilizando el microscopio invertido Zeiss Axio Observer Z1 equipado con una lente de inmersión en aceite (63x, Plan Apochromat), una cámara Axiocam MRm Rev.3, una fuente de luz externa Zeiss HXP 120C para los experimentos de epifluorescencia y los filtros verde (filtro 38 HE, excitación 470/40; emisión 525/50), rojo (filtro 43 HE, excitación 545/25; emisión 605/70) y DAPI (filtro 49; excitación 365 nm; emisión 445 nm). El análisis de las imágenes obtenidas en el microscopio se realizó mediante el software de libre acceso Fiji versión 2.0.0-rc-54/1.51g (www.fiji.sc/) (Schindelin et al., 2012). PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE fluG 64  ausA, mientras que como cepas receptoras de los metabolitos, se utilizó un mutante  fluG el cual no sintetiza ningún metabolito que esté aguas debajo de FluG, y la cepa cfwA2, la cual contiene una mutación en el gen npgA que codifica una 4-fosfopanteteinil transferasa (PPTasa) (Márquez-Fernández et al., 2007). Esta última cepa está afectada en la biosíntesis de la penicilina, la síntesis de pigmentos, la síntesis de lisina, la biosíntesis de sideróforos (Oberegger et al., 2003), así como en la síntesis de varios policétidos entre los que se encuentra el DHA. Curiosamente, tanto el crecimiento vegetativo y desarrollo asexual y sexual están afectados en el mutante cfwA2. Los defectos que manifiesta este mutante tanto en la producción de metabolitos como en el desarrollo del hongo, lo convirtieron en un candidato adecuado para el experimento de contacto, para analizar que cepas son capaces de complementar los defectos de distintos mutantes. Los resultados de los primeros experimentos de contacto llevados a cabo utilizando como donantes una cepa silvestre y un mutante ΔausA para transmitir el metabolito a la cepa aceptora ∆fluG se muestran en la Figura 12B. La formación de un frente de esporas amarillas perteneciente a la cepa ∆fluG confirma que un mutante ΔausA puede inducir la esporulación de la misma forma que una cepa silvestre, lo cual indica que la molécula señalizadora de FluG está presente en esta cepa, que no produce DHA. A B Figura 12. A) Esquema del experimento de contacto y transmisión de la molécula inductora de la esporulación. La zona de contacto entre las dos cepas se muestra en amarillo, debido a que la cepa receptora es capaz de desarrollar esporas B) Representación de los experimentos de contacto entre una cepa esporulante (WT y  ausA) y una cepa fluffy (  fluG y cfwA2). Las zonas de contacto en las que se han desarrollado las esporas amarillas pertenecientes a las cepas fluffy, están indicadas con flechas blancas. Barra de escaña = 5 mm PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE fluG 65 Por otro lado, los resultados obtenidos de un segundo experimento de contacto mostrado en la figura del Anexo 1 confirman que tanto la cepa silvestre, como la cepa ∆fluG y la ΔausA transmiten el metabolito a la cepa cfwA2, debido a que en la zona de contacto se han desarrollado conidióforos de color amarillo pertenecientes a esta cepa. Esta cuestión se trata más a fondo en el Anexo 1. 2.3. La deleción del gen fluG afecta tanto al desarrollo asexual, como al sexual en Aspergillus nidulans Estudios anteriores se centraron en el efecto de FluG sobre el desarrollo asexual (Lee y Adams, 1994; Yager et al., 1998; D'Souza et al., 2001) sin aportar datos sobre la formación de cleistotecios. Sin embargo, un estudio llevado a cabo en Aspergillus flavus sobre la caracterización de un mutante fluG, desveló que este mutante está afectado principalmente en el desarrollo sexual (Chang et al., 2012). Resultados posteriores aportaron evidencia que FluG actúa con el complejo Velvet, formado por los reguladores del desarrollo y metabolismo secundario VeA, VelB y LaeA (Chang et al., 2013). Teniendo en cuenta estos datos, se decidió explorar el papel de FluG en el desarrollo sexual de A. nidulans, llevando a cabo un contaje de cleistotecios en una cepa silvestre y un nulo del gen fluG (Figura 13). Figura 13. Contaje de cleistotecios (estructuras círculares, melanizadas con un color oscuro) en una cepa WT y  fluG (Izquierda ), junto con los discos en los que reflejan los fenotipos obtenidos en MMA y MCA (Derecha ). Barra de escala = 0,5 cm PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE fluG 66 Los resultados (Figura 13) muestran que en medio mínimo la producción de cleistotecios por unidad de área (cm2) en una cepa  fluG se ve reducida en un 46%, mientras que, en medio completo, no se desarrolla ninguna estructura sexual. Estos resultados demuestran claramente que FluG es necesario en el desarrollo asexual y sexual de Aspergillus nidulans, especialmente en un medio rico en nutrientes. 2.4. FluG presenta una distribución homogénea en el citoplasma Ante la divergencia de resultados citados anteriormente, se decidió investigar la localización de FluG in vivo mediante microscopía de fluorescencia. El estudio de la localización de FluG se llevó a cabo etiquetando la proteína fluorescente GFP (PM  27 kDa), la cual emite fluorescencia de color verde. La proteína GFP se etiquetó en los extremos Ny C-terminal y se comprobó si el etiquetado tenía algún efecto en la función de la proteína. Se utilizó la misma aproximación para etiquetar a FluG con el epítopo no fluorescente 3xHA, el cual es menos voluminoso que GFP (PM  3 kDa) y facilita el estudio de las proteínas. Por otro lado, teniendo en cuenta que estudios anteriores comprobaron que FluG tiene una baja expresión basal durante las etapas del crecimiento y desarrollo asexual del hongo (Lee y Adams, 1994; Etxebeste et al., 2010a), se sustituyó el promotor nativo por el promotor inducible alcA, el cual se induce en presencia de alcohol o treonina (Sealy-Lewis y Lockington, 1984). Una vez obtenidas todas las cepas etiquetadas de FluG (Figura 14), se observó que las cepas etiquetadas en el extremo C-terminal exhibían un fenotipo fluffy, semejante al observado HA::fluG fluG::HA Figura 14. Fenotipos de los mutantes etiquetados con los epítopos GFP y HA3x en los extremos Ny C-terminal de FluG, tras haberlos incubado durante 72 h. Barra de escala = 1 cm PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE fluG 67 en una cepa  fluG. Este efecto se observó también con el epítopo HA3x, lo cual indica que, el etiquetado afectaba drásticamente a la función. Se descartó este último etiquetado en los experimentos de microscopía. Por otro lado, los etiquetados efectuados con ambas proteínas en el extremo Nterminal mostraron un fenotipo silvestre. La cepa con el etiquetado de GFP en el extremo N-terminal, era cultivada en un medio con glucosa (en el que el promotor no está activo), se observó un descenso significativo en la conidiación (Figura 15). Este resultado es coherente con la funcionalidad del promotor. En el caso de la cepa con promotor alcA, se analizó la expresión de la proteína después de cambiar la fuente de carbono a la treonina. La determinación del tiempo requerido para inducir la expresión de proteína etiquetada bajo el control del promotor alcA, se llevó a cabo monitorizando el patrón de expresión de la proteína FluG en las cepas etiquetadas en el extremo Ny C-terminal de con ambas proteínas, mediante Western blot (Figura 15 y Anexo 2). Los resultados obtenidos en el experimento de detección de la proteína GFP muestran una banda de aproximadamente 124 kDa correspondiente al etiquetado de FluG con la proteína GFP en las cepas alcA::GFP::fluG y fluG::GFP (Figura 15). Por un lado, se observó que, después de haber inducido la expresión de fluG bajo el promotor alcA con treonina en la cepa alcA::GFP::fluG, el nivel de expresión de GFPFluG aumentaba Figura 15. Detección de los etiquetados FluG-GFP y GFP-FluG y aclA::GFP::FluG mediante Western Blot. PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE fluG 68 con el tiempo, como se puede observar en los periodos de dos horas reflejados en la Figura 15. Sin embargo, no se pudo detectar la banda correspondiente a la proteína etiquetada en la cepa GFP::fluG. Por otro lado, los resultados de detección del epítopo HA3x (Anexo 2) muestran al menos una banda de aproximadamente 100 kDa en los etiquetados de ambos extremos Ny C-terminal, junto con otras bandas de menor tamaño, lo cual sugiere que la proteína FluG está siendo degradada. Cabe destacar que las dos cepas etiquetadas con ambas proteínas (GFP y HA3x) en el extremo C-terminal, las cuales están expresadas bajo promotor nativo, mostraron una banda mucho más intensa a la misma altura en comparación con la observada en la cepa HA3x::fluG. Teniendo en cuenta que en todos los experimentos se cargó la misma cantidad de proteína en el gel, este último resultado sugiere que la expresión de FluG se ve alterada al etiquetarla en el extremo C-terminal (en cuyo caso, parece que no se produce una forma funcional de la proteína, como se ha apuntado anteriormente). Tras haber estudiado la detección de la proteína FluG en las cepas etiquetadas con HA3x y GFP, se procedió a analizar la localización de las que tenían el etiquetado GFP mediante la técnica de microscopía de fluorescencia. Teniendo en cuenta los antecedentes que sugieren que FluG pueda tener una localización nuclear, la localización de los núcleos se llevó a cabo etiquetando la histona H1 con mRPF y mCherry en las cepas GFP::fluG y alcA::GFP::fluG, respectivamente. Estas proteínas emiten una fluorescencia de color rojo cuando son observadas mediante microscopía de fluorescencia. Dado que FluG está etiquetado con la una proteína que emite una fluorescencia verde, en el caso de que ambas proteínas se colocalizasen en el mismo compartimento celular, la fluorescencia que se observa durante la microscopía de fluorescencia sería de color amarillo. Figura 16. A) Resultados de fluorescencia obtenidos con la cepa fluG::GFP. B) Resultados de fluorescencia obtenidos con la cepa GFP::fluG; H1::mRFP. Barra de escala = 10 m A B PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE fluG 69 En acuerdo con los resultados obtenidos en los experimentos Western blot, la cepa fluG::GFP, emitía una señal de fluorescencia por todo el citoplasma (Figura 16A). En la cepa GFP::fluG expresada bajo promotor nativo, en cambio, no se detectó fluorescencia. (Figura 16B). En la cepa alcA::GFP::fluG, se monitorizó la localización de FluG después de haber inducido la expresión del promotor alcA con treonina durante 2 horas (Figura 17C). En esta última, a tiempo 0 horas no se detectó ninguna señal de fluorescencia, al igual que en la cepa GFP::fluG expresada bajo promotor nativo. Después de haber inducido la expresión de alcA con treonina durante 2 horas, se observó que GFP-FluG presentaba una distribución homogénea en el citoplasma de la hifa. La señal roja que emitían los núcleos confirma que GFP-FluG está mayormente ausente del compartimento nuclear, relegado principalmente al citoplasma. Por otro lado, la proteína parece estar ausente del lumen de las vacuolas (parte magnificada marcada con flechas blancas). Los resultados obtenidos en el experimento de microscopía indicaron que FluG está distribuido homogéneamente por todo el citoplasma de las células vegetativas. Figura 17. Resultados de fluorescencia obtenidos con la cepa alcA::GFP::fluG; H1::mCherry.. La fluorescencia verde corresponde a la localización de FluG y la fluorescencia roja corresponde a la localización de los núcleos. Barra de escala = 10 m PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE fluG 70 3. Discusión En este capítulo se ha abordado la relación de FluG con el DHA, el efecto que tiene la ausencia de FluG en el ciclo sexual y se ha verificado la localización que muestra in vivo. En lo referente a la relación con el DHA, como ya postuló el estudio de RodriguezUrra et al. (2012), se confirma que el factor DHA no es el factor de FluG. Si bien este último estudio resaltó el papel del DHA como un metabolito secundario que induce la esporulación, estudios posteriores donde han analizado mutantes con un fenotipo altamente esporulante, han demostrado que estos mutantes tienen una alteración en el metabolismo secundario en el que destacan un aumento tanto en la expresión como la síntesis del DHA (Guerriero et al., 2017; Jain et al., 2018; Thieme et al., 2018). Así como la caracterización fenotípica del mutante nulo del gen ausA, el cual no produce DHA, desveló que esta cepa mostraba niveles de esporulación semejantes a los observados en una cepa silvestre, los experimentos de contacto confirmaron que este mutante era capaz de revertir el fenotipo aconidial en la zona de contacto de las colonias adyacentes  fluG y cfwA2. Este resultado confirma que el DHA no está implicado directamente en la inducción de la esporulación llevada a cabo por FluG. Cabe resaltar que la complementación observada en una colonia cfwA2 en contacto con una cepa  fluG sugiere que existen más metabolitos que inducen la esporulación, ya que una cepa cfwA2 no produce DHA (Márquez-Fernández et al., 2007). Por otro lado, el hecho de que una cepa  fluG fuera capaz de inducir la conidiación en la zona de contacto de una cepa cfwA2 puede estar relacionado con el amplio papel que desarrolla este último gen. El estudio llevado a cabo por Kim et al. (2015) confirmaba que el fenotipo letal causado por una cepa nula en el gen npgA podía ser parcialmente revertido si al hongo se le añadía un concentrado filtrado de un WT, el cual contenía intermediarios del metabolismo, durante el desarrollo asexual. Este hecho confirma que la adición de los metabolitos excretados por el hongo no es suficiente para inducir un fenotipo silvestre. Dejando a un lado el desarrollo asexual, la caracterización fenotípica en torno al desarrollo sexual de una cepa  fluG confirmó que FluG tiene un papel importante en la PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE fluG 71 regulación del ciclo sexual. Este resultado está en concordancia con las observaciones llevadas a cabo por Chang et al. (2012), en el que detalla que la deleción de fluG en Aspergillus flavus tiene efecto tanto en el desarrollo asexual como el sexual del hongo. El desarrollo asexual y sexual de A. nidulans, está condicionado por las condiciones lumínicas, las cuales son detectadas por el complejo velvet. En este aspecto, varios estudios han relacionado a FluG con la respuesta a la luz. Sin embargo, los experimentos de localización mediante microscopía de fluorescencia llevados a cabo en este estudio confirmaron que FluG muestra una distribución homogénea mayoritariamente por todo el citoplasma de las hifas vegetativas, de acuerdo con las primeras observaciones (Lee y Adams, 1994) y la ausencia de fluorescencia amarilla en el núcleo, descartan que FluG entre de manera general al compartimento nuclear en A. nidulans (Chang et al., 2013). Cabe destacar que varios estudios relacionan la actividad de FluG con el gen veA (velvet) (Yager et al., 1998; Ruger-Herreros et al., 2011), el cual tiene un papel importante en la respuesta a la luz (Mooney y Yager, 1990). Yager et al. (1998) describieron mutaciones puntuales del gen fluG entre los que se encontró un mutante insensible a la luz roja (fluG701) y tres mutantes que suprimían la insensibilidad a la luz provocada por el alelo veA1 (fluG10sveA1; veA1, fluG20sveA1; veA1, fluG30sveA1; veA1). Este mismo estudio confirmó por un lado que el metabolito de FluG solo se sintetizaba en presencia de la luz en cepas con un fondo genético sensible (veA) e insensible (veA1) a la luz. Por otro lado, este estudio resaltó también que la complementación se observaba solo en aquellas cepas nulas en el gen fluG con un fondo genético veA1 (Yager et al., 1998). Por otro lado, los fenotipos observados de los diferentes mutantes etiquetados en los extremos Ny C-terminal de FluG confirman también que el extremo C-terminal cumple una función importante en la actividad de FluG, ya que estos mutantes muestran un fenotipo aconidial y una sobreexpresión del gen fluG. Esta sobreexpresión coincide con el resultado obtenido por Yager et al. (1998), en el que el mutante fluG30sveA1; veA1, el cual tiene dos aminoácidos más en el extremo C-terminal, muestra una sobreexpresión de fluG. Por otro lado, de acuerdo con los resultados obtenidos por Chang et al. (2013), el fenotipo aconidial observado en el mutante etiquetado en el extremo C-terminal podría sugerir que este extremo cumple una función semejante a la observada en A. flavus, en el que en extremo C-terminal de FluG interacciona con el extremo N-terminal de LaeA y el extremo N-terminal de VelB del complejo trimérico VelB-VeA-LaeA. Sin embargo, PRIMERA APROXIMACIÓN A LA FUNCIÓN DE fluG 72 teniendo en cuenta que estos experimentos de interacción se realizaron en levadura, no se puede confirmar que esta interacción ocurra también dentro del hongo. Los resultados recogidos en este primer capítulo reflejan un espectro de acción de FluG más amplio que el que se conocía antes, ya que este abarca tanto el desarrollo asexual como el sexual. Por un lado, queda confirmado que el papel de FluG en el desarrollo asexual no está directamente relacionado con el DHA, ya que un mutante  ausA que no sintetiza este metabolito secundario y muestra niveles de esporulación semejantes a los observados en una cepa silvestre. Por otro lado, en este estudio se ha observado por primera vez la localización de FluG in vivo, confirmando que FluG se localiza mayoritariamente en el citoplasma, excluido del núcleo. Finalmente, el estudio de las distintas cepas etiquetadas de FluG ha permitido identificar que el extremo Cterminal de esta proteína tiene una función importante asociada tanto con el desarrollo del hongo como la expresión del mismo gen, aspecto que se discutirá en posteriores capítulos. Estos hechos, nos han conducido a llevar a cabo un estudio bioinformático en profundidad de la secuencia proteica de FluG, utilizando las últimas herramientas y bases de datos accesibles. CAPÍTULO IV: ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 80 Mediante un alineamiento de las secuencias seleccionadas de cada subgrupo con la región N-terminal, se calculó el porcentaje de identidad de la matriz (PIM), en base a la identidad media conservada entre dos candidatos (Tabla del Anexo 5). El mismo proceso se llevó a cabo utilizando las estructuras de cristal propuestas por Seibert y Raushel (2005), para determinar con más fiabilidad tanto los residuos catalíticos presentes en la región N-terminal, junto con la homología que presenta esta región con el la estructura de cristal de la enzima candidata. En este caso, el factor que determina la similitud estructural de la región N-terminal con el cristal utilizado como modelo se reflejó como QMEAN (Qualitative Model Energy ANalysis) (Benkert P. et al., 2011). Este factor, representa una función que recoge la calidad de la alineación global (la estructura de cristal) y la residual (cada residuo) de la secuencia de interés, frente al modelo utilizado como estructura de cristal (Tabla 19). Se considera un QMEAN aceptable cuando los valores son superiores a -4. Tabla 19. Resultados obtenidos del alineamiento de la región N-terminal de FluG con los cristales propuestos por (Seibert y Raushel, 2005) de cada subgrupo. En cada subgrupo se detalla, por un lado, la cobertura que tiene el cristal con la región N-terminal de FluG y la conservación de los aminoácidos que se unen a los metales. Los aminoácidos conservados están resaltados en verde. Por otro lado, se detalla el porcentaje de identidad que conserva esta región con la estructura de cristal de la enzima de cada subgrupo, junto con la conservación estructural reflejada como valor QMEAN. (*) No se pudo generar un modelo debido a la baja calidad de la homología. Subgrupo Enzimas y nombre del pdb Cobertura con FluG Residuos alineados Identidad de secuencia (%) QMEAN 1 2 3 4 5 6 7 8 I PTE (1HZY) 239-406 HxH - - K H H - D 12,16 -4,10 II PHP (1BF6) 240-406 HxH - - E H H - D 10,67 -6,51 III ADA (1AM4) 15-382 HxH H H D 27,48 -8,79 IV AGD (1O12) HxH E H H D * * V DAA (1M7J) 110-405 HxH C H H D 32,03 -8,25 VI RDP (1ITQ) 234-406 HxD E H H D 12,50 -7,32 VII URI - HxH H D - - ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 81 Los datos obtenidos en la Tabla 19 y la Tabla del Anexo 5 indican que la región Nterminal de FluG guarda una mayor similitud con las amidohidrolasas de tipo I (AMDH_1), al contrario de lo que se había obtenido en la primera aproximación (Tabla 16). No obstante, el grupo de las AMDH_1 está representado por una amplia variedad de enzimas que catalizan reacciones muy distintas, a pesar de tener en común gran parte de los residuos catalíticos que las unen a los centros metálicos (Seibert y Raushel, 2005). Esta razón, nos llevó a profundizar en la búsqueda de estructuras de cristal que tuvieran similitud con la región N-terminal, con el objetivo de poder crear un modelo cristalino de la región N-terminal de FluG. 2.2.2. Tercera Etapa. Búsqueda de homólogos cristalinos de la región N-terminal Tras determinar la similitud de secuencia con amidohidrolasas del tipo I, se procedió a la búsqueda de estructuras de cristal resueltas que conservasen homología con la región N-terminal. Las estructuras de cristal obtenidas mediante Swiss-Model, junto con información relevante en torno a la cobertura e identidad y con la homología estructural de estos cristales con la región de interés, se recogen en la tabla del Anexo 6. Todos los cristales candidatos seleccionados, a excepción del cristal 2QPX, estaban caracterizados previamente (Tabla 20). En cuanto 2QPX, solo se contaba con la estructura. Los cristales tienen varias funciones enzimáticas asignadas. Por tanto, se dividieron en dos grupos: aquellos cuya función enzimática había sido caracterizada y publicada, y aquellos que solo tenían una función predicha. Ambos grupos contienen candidatos que cubren la región N-terminal al completo (aas 1-410) o parcialmente (aas 185-410), siendo estos últimos los mayoritarios. Por otro lado, la similitud con la región N-terminal oscila entre el 12% y el 19% en la mayoría de los modelos. Sin embargo, se puede observar que los cristales 2QPX y 4HJW muestran valores superiores al 20% (29,32 y 23,04, respectivamente). Sin embargo, los valores del factor QMEAN obtenidos de cada modelo generado demuestran que solo el modelo 3IRS supera el valor aceptable de -4. Sin embargo, solo abarca parte de la región N-terminal (aas 185-410) y su función enzimática no ha sido caracterizada. ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 82 En vista de los resultados, se optó por seleccionar aquellos cristales que hubieran sido caracterizados, cubrieran la totalidad de la región N-terminal en la medida de lo posible, y exhibieran un valor QMEAN lo más cercano posible al -4. Se tuvieron en cuenta también otros candidatos que, aunque no estuvieran caracterizados, cubrieran la totalidad de la región N-terminal de FluG y exhibieran un valor QMEAN aceptable. Los cristales seleccionados están recogidos en la Tabla 20. Tabla 20. Cristales homólogos a la región N-terminal de FluG. En cada cristal se especifica por un lado el nombre pdb, la función asignada, los ligandos presentes en el cristal, el organismo del que proviene y la referencia de la publicación. Por otro lado, se detalla la cobertura que tiene el cristal con la región Nterminal de FluG, el porcentaje de identidad que conserva esta región con la estructura de cristal y la conservación estructural reflejada como valor QMEAN. Cristal Función Cobertura con FluG Identidad de la secuencia QMEAN Ligandos Organismo Referencia 1J5S Uronato isomerasa 5-408 14,68 -5,26 - Thermotoga maritima Schwarzenbacher R. et al 2003 3HK8 Uronato isomerasa 5-408 14,25 -6,93 Zn + HDL Bacillus halodurans Nguyen TT. Et al., 2009 4HJW Uracil-5-carboxilato decarboxilasa 185-410 23,04 -5,73 Zn Metarhizium anisopliae Xu S. et al., 2013 6DXQ 4-oxalomesaconato hidratasa 185-409 16,84 -4,58 Zn + 7QD Sphingobium sp. SYK-6 Hogancamp TN. Et al., 2018 6E6I Hidrolasa de enlace meta del compuesto 2,2',3-trihydroxi-3'- metoxi-5,5'- dicarboxibifenil 185-410 16,49 -5,49 Zn + HVS Sphingobium sp. SYK-6 Kuatsjah E. et al., 2018 4IFK 2-amino-3carboximuconato 6semialdehido decarboxilasa 185-410 13,59 -5,60 Zn Pseudomonas fluorescens Huo L. et al., 2013 3DC8 Dihidropirimidinasa 236-409 16,56 -4,84 Zn Sinorhizobium meliloti MartinezRodriguez S. et al., 2010 2QPX Amidohidrolasa metalodependiente TIM-barrel fold 4-406 29,32 -4,10 Zn Lactobacillus paracasei ATCC 334 Joint Center for Structural Genomics (JCSG) ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 83 Una vez seleccionados los candidatos, se procedió a catalogar al grupo de amidohidrolasas que pertenecía cada cristal, utilizando para ello la herramienta HMMER. Tanto los candidatos seleccionados como la predicción obtenida están reflejados en la Tabla 21. De la misma forma, se analizó la conservación de los residuos catalíticos de los cristales catalogados en la Tabla 20 y la región N-terminal de FluG, la cual se presenta en la tabla del Anexo 7. Tabla 21. Resultados del análisis de los cristales homólogos a la región N-terminal de FluG con la herramienta de predicción funcional HMMER. Cristales homólogos a la región N-terminal de FluG. En cada caso se detalla la cobertura que tiene el cristal con la región N-terminal de FluG y la predicción funcional, junto con la cobertura de aminoácidos predicha con la herramienta HMMER. Por otro lado, se adjunta una imagen con la disposición de las regiones funcionales delimitadas por la herramienta HMMER. Cristal Función Cobertura con FluG Predicción HMMER Cobertura HMMER Imagen HMMER 1J5S Uronato isomerasa 8-408 UxaC 2-449 3HK8 Uronato isomerasa 5-408 - - 4HJW Uracil-5carboxilato decarboxilasa 185-410 Amidohidro_2 9-373 6DXQ 4-oxalomesaconato hidratasa 185-409 Amidohidro_2 5-330 6E6I Hidrolasa de enlace meta del compuesto 2,2',3-trihydroxi-3'- metoxi-5,5'- dicarboxibifenil 185-410 Amidohidro_2 3-330 4IFK 2-amino-3carboximuconato 6semialdehido decarboxilasa 185-410 Amidohidro_2 6-331 3DC8 Dihidropirimidinasa 236-409 Amidohidro_1 47-419 2QPX Amidohidrolasa metalodependiente TIM-barrel fold 4-406 Amidohidro_2 201-368 FluG - - Amidohidro_2 243-407 ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 84 Una vez analizados los resultados de la Tabla 21, se pudo apreciar que las enzimas homólogas a la región N-terminal de FluG pertenecen a los subgrupos amidohidrolasa de tipo I, II y uronato isomerasa (UxaC). Tanto el cristal 2QPX como la región N-terminal comparten parte de la proteína, la cual es homóloga a las amidohidrolasas de tipo II. Los resultados de la conservación de los residuos catalíticos en cada cristal, desvelaron que los únicos residuos conservados en todas las amidohidrolasas son aquellos que se unen al metal M, correspondientes a los residuos H20; H22 y D354 en FluG. El siguiente residuo que parece estar más conservado es H264 en FluG, cuyo papel es también el de unión al metal M o M. Otro residuo que parece tener una alta conservación en la mayoría de las enzimas, es el correspondiente a la H298 en FluG. Puesto que la conservación de los residuos observada en la Tabla del Anexo 7 muestra un amplio espectro de actividades enzimáticas, para la siguiente fase se dio más prioridad a aquellas enzimas que abarcaran la totalidad de la región N-terminal (Tabla 21) y exhibieran un índice QMEAN aceptable (Tabla 20). La combinación de ambos datos indicó que esta región conservaba todos los residuos correspondientes a la estructura de cristal 3DC8, la cual tiene una actividad dihidropirimidinasa. Sin embargo, los valores la cobertura de este cristal solamente abarcaban el rango 236-409, con un valor QMEAN de - 4,84. Por otro lado, se observó que los cristales 1J5S y 3HK8, a pesar de contar con un valor QMEAN pobre, abarcaban gran parte de la región N-terminal y los residuos de unión al M estaban conservados en FluG. Finalmente, se comprobó que el candidato 2QPX (el cual no había sido caracterizado) conservaba todos los residuos correspondientes a una dihidropirimidinasa, además de cubrir casi al completo la región N-terminal de FluG (4-406) con una homología estructural muy aceptable, reflejado por un valor QMEAN de - 4,30. Por lo tanto, adoptamos a 1JS5, 3HK8 y 2QPX como modelo porque abarcan la totalidad de la región. 2.2.3. Tercera Etapa. Generación del modelo estructural de la región N-terminal La búsqueda de cristales homólogos a la región N-terminal de FluG permitió identificar una gran variedad de homólogos que, posteriormente fueron analizados en detalle para descartar los menos adecuados para usarlos como molde. Una vez finalizado el proceso de criba, los cristales que fueron seleccionados para modelar ambas regiones de FluG están detallados en la Tabla 22. ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 85 Una vez optimizados los modelos de las estructuras de cristal candidatas para esta región, se utilizaron como molde para modelar la región N-terminal. Los aminoácidos de FluG se alinearon con el modelo en base del alineamiento obtenido con Swiss-Model, y se calculo el porcentaje de identidad y similitud que comparte la secuencia de FluG con la estructura usada para el modelado empleando la herramienta Prime del programa Maestro (Schrödinguer Suites) (Tabla 22). Tabla 22. Los modelos utilizados para modelar la región N-terminal de FluG, junto con los ligandos presentes en cada cristal. Se detallan los valores correspondientes a la cobertura del cristal con esta región de FluG, el porcentaje de similitud, identidad y huecos presentes en el proceso de modelado. Zn: Zinc. HDL: Ácido D-Arabinohidroxámico. La superposición de los tres modelos a partir de los cristales (Figura 20, Figura 21 y Figura 22), permite observar distintos grados de conservación en lo que respecta a los residuos catalíticos de interés (Tabla del Anexo 7). En 1J5S, a pesar de no haber un metal presente en el cristal, los residuos H30, H32 y D397 se coordinan al M. Como se puede observar en la Figura 20, el modelo predicho de la región N-terminal FluG que se ha generado a partir de la estructura de 1J5S conserva todos los residuos mencionados anteriormente (H20, H22 y D354) con una disposición espacial semejante. N-terminal de FluG Cristal 1J5S 3HK8 2QPX Ligandos - Zn + HDL Zn Cobertura 5-408 5-408 4-406 % Similitud 22 26 43 % Identidad 10 10 25 % Huecos 25 22 11 ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 86 En 3HK8, los residuos H26, H28 y el D355 se coordinan al ion de Zn2+ (M). Por otro lado, el residuo D355 se coordina también al sustrato para asistir la reacción de isomerización (Nguyen et al., 2009). Como se puede observar en la Figura 21, el modelo predicho de la región N-terminal que se ha generado a partir de la estructura de 3HK8 conserva todos los residuos mencionados anteriormente (H20, H22 y D354) con una disposición espacial adecuada para formar las mismas interacciones que se observan en cristal 3HK8 con el ion de Zn2+ y el sustrato. Figura 20. Alineación estructural del modelo 1J5S (verde ), con la estructura modelada de FluG (gris), basada en la plantilla 1J5S. Los residuos conservados en FluG son H20, H22, H264 y D354. ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 87 En el caso de 2QPX, los residuos H17, H19 y D317 se coordinan con el primer ion de Zn2+ (M), mientras que los residuos H227 y H263 se coordinan al segundo ion de Zn2+ (M). Por otro lado, se predice que una lisina (K166) sufre una carbamilación posttraduccional para formar un puente entre los dos iones de Zn2+, y que una tirosina (Y171) puede interaccionar con el sustrato en algunas amidohidrolasas. Como se puede observar en la Figura 22, el modelo predicho de la región N-terminal de FluG que se ha generado a partir de la estructura de 2QPX conserva todos los residuos mencionados anteriormente (H20, H22, K192, H264, H298 y D354) con una disposición espacial adecuada para formar las mismas interacciones que se observan en la estructura de 2QPX con los iones de Zn2+ y el agua hidrolítica, junto con la tirosina (Y197) la cual puede interaccionar con el sustrato (Figura 22). Sin embargo, teniendo en cuenta que la actividad de la enzima 2QPX no ha sido caracterizada, no se puede afirmar del todo que todos los residuos cumplan el mismo papel que en la proteína molde. No obstante, teniendo en cuenta que los residuos conservados en esta enzima se asemejan a aquellos presentes en una dihidropirimidinasa (Lohkamp et al., 2006; Hsieh et al., 2013), se podría asumir que los residuos de 2QPX y FluG cumplirían la misma función. Figura 21 . Alineación estructural del modelo 3HK8 (verde ), con la estructura modelada de FluG ( gris ), basada en la plantilla 3HK8. El Mα est coordinado a H20, H22 y D354. El sustrato (HDL) está coordinado al metal. ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 88 2.3. Estudio bioinformático de la región C-terminal 2.3.1 Segunda Etapa. Conservación de los residuos catalíticos predichos Las predicciones situaban la región C-terminal como una GSI. Los residuos clave de esta actividad tienen que ver con las dos etapas de mecanismo catalítico. En la primera etapa, la reacción requiere la participación de ATP para formar un intermediario activado, el -glutamil fosfato (Eisenberg et al., 2000). Este intermediario reacciona en una segunda etapa con una molécula de amonio, para formar glutamina. Esta reacción es central en el metabolismo del nitrógeno y tiene lugar en todos los organismos (Stadtman y Ginsburg, 1974; Eisenberg et al., 2000). Los residuos catalíticos que participan en la reacción catalizada por la GS de Salmonella typhimurium (glnA; pdb: 1FPY), a menudo empleada como modelo (Gill y Eisenberg, 2001) se detallan en la Tabla 23. La estructura de cristal se empleó como base para la numeración los residuos. Para poder determinar la conservación de los residuos catalíticos de FluG con otras GSIs, se eligió como referencia la estructura de cristal 1FPY de S. typhimurium. Los datos de la conservación junto con el papel que desempeña cada uno de los residuos catalíticos (Eisenberg et al., 2000) se reflejan en la Tabla 23. Figura 22. Alineación estructural del modelo 2QPX (verde ), con la estructura modelada de FluG ( gris ), basada en la plantilla 2QPX. El Mα est coordinado a H20, H22, K192 y D354; el Mβ se coordina a K192, H264 y H298. Una molécula de agua se coordina con ambos metales y D354 ( línea azul discontinua). ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 89 Tabla 23. Residuos catalíticos de la estructura de cristal 1FPY, junto con su función, que participan en la síntesis de glutamina y que están conservados en la región C-terminal de FluG (Eisenberg et al., 2000; Murray et al., 2013). Están marcados en gris los residuos que no están conservados. Residuos Función 1FPY FluG D50 S481 Extrae el protón del ion de amonio para formar amoniaco E130 E564 Se une al metal Mg2+ (M) E132 E566 Se une al metal Mg2+ (M); susceptible a interaccionar con inhibidores E213 E626 Se une al metal Mg2+ (M) y a la molécula de NH3 E221 E633 Se une al metal Mg2+ (M) H270 H682 Se une al metal Mg2+ (M), mediante el nitrógeno H272 H684 Interacciona con el -fosfato del ATP R322 R720 Interacciona con el grupo amida del glutamato E328 W726 Extrae el protón del estado de transición para formar glutamina y ADP R340 R739 Polariza el -fosfato del ATP que formará el intermediario -glutamil fosfato R345 R744 Interacciona con el ATP en el estado de transición E358 E752 Se une al metal Mg2+ (M) El análisis comparativo de la homología entre la estructura de cristal de 1FPY y la región C-terminal de FluG desveló una similitud del 20,05% y un valor QMEAN de - 4,23. Teniendo en cuenta que el cristal cubre gran parte de la región C-terminal de FluG (431-863) el valor QMEAN muestra que FluG presenta una similitud considerable. En cuanto a la conservación de residuos catalíticos, se observó que no se conservaban aquellos que interaccionan con el amonio (Tabla 23, fondo gris). Este dato indica que la glutamina no es el producto probable de la reacción. En consecuencia, se profundizó en la búsqueda de estructuras de cristal que tuvieran mayor similitud con las zonas diferenciadas. ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 96 fluG) divergen de esta función. Sin embargo, los resultados obtenidos en la Tabla B del Anexo 12 muestran que todos los genes pauA1-6 comparten una identidad de secuencia y estructural similares. Este resultado indica que, si bien todas estas enzimas comparten una considerable homología estructural, este método no permite determinar las diferencias en afinidad por distintas poliaminas. Sería plausible, por tanto, que la mayor afinidad por el sustrato podría estar relacionada con la conservación de otros residuos, así como las distancias, polaridad u otros aspectos en torno a dichos residuos. De esta forma, al igual que en apartados anteriores, se llevó a cabo un análisis en el que se verificó la conservación de los residuos catalíticos predichos para una GS en los genes pauA1-6, representando los resultados en la Tabla 27. Tabla 27. La conservación de los residuos catalíticos de cada gen pauA1-7, frente a la región C-terminal de FluG. La función adscrita de los residuos es la correspondiente a las GS. Residuos Función en las GS FluG PauA1 PauA2 PauA3 PauA4 PauA5 PauA6 PauA7 S481 P58 P50 P54 P58 P28 P54 V42 Extrae el protón del NH4+ E564 E146 E140 E143 E146 E101 E143 E131 Unión M E566 E148 E142 E145 E148 E103 E145 E133 Unión M E626 E211 E205 E208 E211 E166 E208 E180 Unión M y NH3 E633 E218 E212 E215 E218 E173 E215 E187 Unión M H682 H268 H261 H264 H268 H222 H265 H236 Unión M mediante N H684 H270 H263 H266 H270 H224 H267 H238 Interacción -fosfato ATP R720 R320 R314 R316 R320 R275 R317 R290 Interacción amida (Glu) W726 Y326 S320 Y322 Y326 A281 Y323 W296 Extrae protón para formar glutamina y ADP R739 R338 R332 R334 R338 R293 R335 R308 Polariza -fosfato ATP para formar -glutamil fosfato R744 R343 R337 R339 R343 R298 R340 R313 Interacción ATP E752 E355 E349 E351 E355 E310 E352 E332 Unión M 438 458 452 454 458 413 455 443 Nº de aminoácidos ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 97 El análisis de la conservación de residuos catalíticos demostró claramente que los residuos encargados de la acepción y modificación del amonio no estaban conservados en los genes pauA1-7 ni en fluG. Este resultado, vuelve a indicar que una de las diferencias más notables entre una GS y una enzima que lleva a cabo la -glutamilación de un sustrato distinto al amonio reside en la conservación de estos residuos. Al comparar los residuos catalíticos que sustituían tanto al aspartato (D) como al glutamato (E), se pudo observar que en todos los genes pauA1-6, el asparato estaba sustituido por una prolina (P), un aminoácido apolar (a pH fisiológico) alifático, mientras que el glutamato (E) estaba sustituido por una tirosina (Y; cadena lateral hidrofóbica) (pauA1, pauA3, pauA4, pauA6), una serina (S; cadena lateral polar sin carga) (pauA2) o una alanina (A; cadena lateral hidrofóbica y muy pequeña) (pauA5). Si bien el conjunto de resultados obtenidos reforzó la hipótesis de que la región Cterminal de FluG está más estrechamente relacionada a las enzimas -glutamil ligasas de poliaminas, se procedió a investigar en profundidad las propiedades catalíticas de PauA7, detalladas por Ladner et al. (2012), las cuales serán objeto de un tratamiento experimental en el quinto capítulo. 2.5. Los genes homólogos a las dos regiones de FluG están presentes en bacterias, hongos y plantas La presencia de secuencias de origen procariota identificadas en la secuencia de FluG condujo a un análisis la distribución de esas secuencias en otros organismos. Para ello, se utilizó la herramienta pBLAST, empleando la secuencia proteica de FluG como plantilla. La búsqueda reveló la existencia de homólogos de las dos regiones de FluG en bacterias, hongos y plantas. No obstante, los dos dominios se encontraron dentro del mismo polipéptido en hongos y plantas (Figura 24). ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 98 La búsqueda limitada a los homólogos de FluG encontrados en Aspergilli desveló la existencia de ortólogos en 14 especies. Estos ortólogos mostraron una media de conservación del 70  4 % con la secuencia de A. nidulans (Anexo 13). Por otro lado, se procedió a comprobar si los residuos catalíticos predichos para la región Ny C-terminal de FluG (Tabla del Anexo 7 y Tabla 25, respectivamente) estaban o no conservados en los ortólogos de FluG. Los resultados detallados en el Anexo 14 confirman que los ortólogos de FluG en Aspergilli conservan todos los residuos catalíticos en ambas regiones. De la misma forma, se llevó a cabo estudio más detallado sobre especies de hongos en los que se podían encontrar ortólogos de FluG (Anexo 14). En este caso, se pudo confirmar que está presente tanto en hongos divergentes tempranos (no forman conidióforos), como en varias especies de hongos ascomicetos (con especies que tienen conidióforos simples y complejos) y en hongos basidiomicetos (no forman conidióforos). Figura 24. Distribución de secuencias proteicas homólogas de FluG en bacterias, hongos y plantas. Los homólogos de FluG en bacterias se encuentran separados, mientras que, en hongos y planta, muestran la misma disposición que FluG. Los colores representan en verde la región amidohidrolasa, en gris en ‘linker’ y en rojo la región GSI. ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 99 Por otro lado, se llevó a cabo el mismo procedimiento con el conjunto de las secuencias encontradas en los tres reinos, las cuales se alinearon para analizar la conservación de residuos con funciones antes identificadas. Se elaboró así un mapa de conservación de cada aminoácido para las regiones Ny C-terminal de FluG (Figura 25). Los resultados revelan zonas de alta conservación en bacterias, hongos y plantas. Se comprobó también si los residuos catalíticos predichos para ambas regiones de FluG estaban o no conservados en las secuencias homólogas y se marcó su localización en la Figura 25. Los resultados obtenidos reflejan que los residuos catalíticos están localizados en zonas de alta conservación (rojas), lo cual demuestra que los homólogos de FluG presentes en bacterias, hongos y plantas tienen estos residuos conservados. De la misma forma, se pudo observar que todos lo residuos citados anteriormente para ambas regiones (Tabla del Anexo 7 y Tabla 25) están conservados en todos los Aspergilli (Anexo 15). Figura 25. Representación de la conservación de los residuos de los homólogos de FluG en bacterias, hongos y plantas. Las regiones Ny C-terminal están representadas por separado. La conservación de los residuos se indica de menor a mayor en color verde y rojo , respectivamente. Localización de los residuos catalíticos está indicada mediante líneas que conectan la localización de dichos residuos en cada reino. H: Histidina. K: Lisina. Y: Tirosina. D: Aspartato. E: Glutamato. R : Arginina. ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 100 2.6. Las dos regiones de FluG están presentes en operones de bacterias En vista de que las dos secuencias en FluG tienen homólogos que se expresan por separado en procariotas, se optó por profundizar en el estudio de la localización de estas secuencias dentro del genoma de bacterias con el objeto de esclarecer si podrían participar en los mismos procesos metabólicos (Mathis et al., 2000). Como primera aproximación, se efectuó una búsqueda de operones bacterianos que al menos incluyesen una GSI y una amidohidrolasa. Una vez identificados, se revisaron también los genes adyacentes Figura 26. Figura 26. Disposición de los operones que conservan genes homólogos a las regiones Ny C-terminal de FluG. En verde se muestran los genes ortólogos a la región N-terminal de FluG, los cuales codifican predichas amidohidrolasas metalodependientes. En azul se muestran los genes ortólogos a la región C-terminal de FluG, los cuales codifican predichas GSI. En naranja , se muestran genes que están relacionados con el transporte y la degradación de fuentes de nitrógeno. En morado , se muestran genes que están relacionados con la biosíntesis de peptidoglucano y ácido pAminobenzóico. ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 101 Los resultados de la Figura 26 reflejaron que las secuencias afines a la amidohidrolasa y GSI observadas en el gen fluG se encontraban separadas. Si bien todos los homólogos de FluG encontrados en hongos y plantas contenían primero el dominio amidohidrolasa y después el dominio GSI, en bacterias, la gran mayoría de los operones codificaban primero el gen GSI (GlnA) y posteriormente la predicha amidohidrolasa (Metal dependent amidohydrolase). Varios estudios llevados a cabo en Mycobacterium tuberculosis (Hayward et al., 2009) y Streptomyces coelicolor (Rexer et al., 2006) desvelaron que ambos organismos contienen cuatro genes homólogos a las GSI (glnA1-4). En M. tuberculosis, la función de la predicha GSI de la Figura 26 corresponde al gen glnA3 (Strong et al., 2003), cuya función no ha sido descrita. Sin embargo, en S. coelicolor, el gen glnA3 de la Figura 26 tiene una función -glutamil putrescina ligasa (Krysenko et al., 2017). En el resto de operones, se observó que varios genes adyacentes podían estar relacionados con procesos de transporte (PotE, LivM, AA_permease) (Kashiwagi et al., 1992) y degradación (PuuD, GabT, LdcC, YafJ) (Kurihara et al., 2006) de distintas fuentes de nitrógeno, así como a la biosíntesis de peptidoglucano (FtsI) (Wissel et al., 2005) y ácido p-Aminobenzoico (AbgB) (Hussein et al., 1998). 3. Discusión Los resultados obtenidos en este capítulo confirman que FluG está formado por dos regiones diferenciadas, unidas por una secuencia de aproximadamente veinte aminoácidos. Si bien estudios anteriores llevados a cabo por (Rexer et al., 2006) y (Lee y Adams, 1994) ya mencionaron que FluG contenía dos dominios con similitud a una amidohidrolasa y una GSI, este estudio ha delimitado la extensión de aminoácidos correspondientes a los dominios amidohidrolasa en la región N-terminal y el dominio GSI en la región C-terminal. Cabe resaltar también que la presencia de dos secuencias PEST en FluG, pueden indicar una vida media celular corta de la proteína (Rechsteiner y Rogers, 1996). Por un lado, la región N-terminal tiene similitud con una amidohidrolasa de tipo 2, la cual forma parte de una amplia familia de enzimas que comparten características estructurales (Seibert y Raushel, 2005). Además, estas enzimas conservan ligandos metálicos y residuos catalíticamente importantes. Estos residuos comprenden cuatro ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 102 histidinas y un aspartato, que actúan como enlaces catalíticos para unirse a uno o dos iones metálicos en los sitios catalíticos (Seibert y Raushel, 2005). El análisis de este grupo de amidohidrolasas y la búsqueda de cristales homólogos a la región N-terminal, ha permitido identificar los residuos catalíticos conservados en otras secuencias. Este análisis ha desvelado que esta región conserva tres residuos (H20, H22 y D354) cuyo papel es la coordinación del ligando metálico M (Nguyen et al., 2009; Martinez-Rodriguez et al., 2010). Teniendo en cuenta que los cristales candidatos cumplen distintas funciones enzimáticas, cabe destacar que la conservación de estos tres residuos en todas las estructuras indica la importancia que tienen en este grupo de amidohidrolasas. Por este motivo, estos tres residuos fueron seleccionados como candidatos para ser mutados puntualmente en FluG (siguiente capítulo). Se ha confirmado que FluG conserva todos los residuos catalíticos correspondientes a amidohidrolasas cíclicas (Nam et al., 2005), como las dihidropirimidinasas (Lohkamp et al., 2006; Hsieh et al., 2013) y las hidantoinasas (Cheon et al., 2002) que participan en la ruta de degradación de las pirimidinas como el uracilo (U) y la timina (T). Estas enzimas, además de tener los tres residuos que se coordinan con el primer ligando metálico M (H20, H22 y D354), contienen otros dos residuos (H264 y H298) que se coordinan con un segundo ligando metálico M, junto con la conservación estructural de una lisina (K192) y una tirosina (Y197) que podrían coordinarse a los dos ligandos (M y M) y unirse al sustrato, respectivamente (Hsieh et al., 2013). Sin embargo, teniendo en cuenta que la estructura de cristal de la dihidropirimidinasa (3DC8), no abarca la totalidad de la región N-terminal FluG, se seleccionó un cristal (2QPX) que, a pesar de no tener información sobre su actividad enzimática, conserva todos los residuos catalíticos correspondientes a una dihidropirimidinasa y exhibe la mejor similitud estructural entre todos los candidatos encontrados para la región N-terminal de FluG. La creación del modelo de la región N-terminal, utilizando 2QPX como molde, ha confirmado que todos los residuos mencionados anteriormente exhiben una conservación estructural semejante a la observada en 2QPX. Este resultado propició la utilización de este candidato para llevar a cabo una sustitución heteróloga de la región N-terminal de FluG en el siguiente capítulo. ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 103 La región C-terminal de FluG presenta una clara similitud con una GSI, sin embargo, un análisis detallado reveló que FluG está relacionado con enzimas que catalizan una actividad -glutamil ligasa (Kurihara et al., 2008; Ladner et al., 2012; Takeo et al., 2013). La búsqueda de cristales homólogos a la región C-terminal, permitió identificar entre varios candidatos que codifican una GSI, un cristal (4HPP, gen PA5508) que codifica una -glutamil ligasa específica de aminas aromáticas (Ladner et al., 2012). Los residuos que actúan sobre la unión del metal y la orientación del glutamato generalmente se conservan entre las enzimas GSI y las -glutamil ligasas (Ladner et al., 2012), como se ha podido confirmar en FluG en este trabajo. De la misma forma, la conservación de los residuos que se unen a los metales, invita a postular que los inhibidores de las GS (PPQ, P3S) puedan también afectar a la función de FluG. Sin embargo, la mayor diferencia entre las enzimas GSI y las -glutamil ligasas reside en la interacción entre dos residuos (un glutamato y un aspartato) que protegen el intermediario γ-glutamil fosfato y eliminan un protón de la molécula de amonio (formando amoníaco) para propiciar la sustitución por el fosfato en el γ-glutamil fosfato (Murray et al., 2013). En este estudio, se ha podido confirmar que estos residuos no están conservados en las secuencias de las -glutamil ligasas, la región C-terminal y aquellos homólogos de las GSI que no catalizan la síntesis de glutamina (Kurihara et al., 2008; Ladner et al., 2012; Krysenko et al., 2017). Para levar a cabo una prueba experimental que aclare este punto, se han seleccionado una serie de residuos para llevar a cabo mutaciones puntuales en el siguiente capítulo, con el objetivo de determinar su importancia en la actividad de a región C-terminal de FluG. En la búsqueda llevada a cabo para la selección de residuos catalíticos y genes candidatos para sustituir ambas regiones de FluG, se pudo encontrar más información en torno a la función que llevan a cabo los homólogos que mostraron tener una buena similitud estructural con la región C-terminal de FluG. Los informes del gen PA5508 han asociado su actividad con la ruta de utilización de las poliaminas junto con otros seis genes parálogos en Pseudomonas aeruginosa PAO1, siendo este gen el único que no se inducía en presencia de sustratos de poliaminas (Yao et al., 2011). Investigaciones posteriores realizadas por Ladner et al. (2012) mostraron que la preferencia del sustrato de PA5508 era más fuerte para las aminas aromáticas (catecolaminas) que para las aminas lineales (poliaminas). La comparación llevada a cabo entre las siete secuencias PauA1-7 y la región C-terminal de FluG ha mostrado que tanto la secuencia PauA7 como esta ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 104 región, conservan una menor identidad en comparación con los PauA1-6. Este resultado puede indicar que el papel enzimático de FluG pueda estar más estrechamente relacionado al de una -glutamil ligasa con preferencia para las aminas aromáticas, que a una - glutamil ligasa con preferencia para aminas lineales como la putrescina. Teniendo en cuenta que los informes sobre la función de los homólogos de FluG se ha descrito en bacterias, otro de los aspectos que suscitó interés fue saber en qué especies se pueden encontrar sus homólogos. De esta forma, se confirmó que existen secuencias homólogas a las dos regiones de FluG en bacterias (Strong et al., 2003; Rexer et al., 2006), hongos (Schumacher et al., 2015; Li et al., 2017; Chen et al., 2020) y plantas (Mathis et al., 1999; Trevaskis et al., 2002; Doskočilov et al., 2011; Silva et al., 2015), sin embargo, en bacterias, estas regiones se encuentran por separado. Cabe resaltar también que, en los tres reinos, todas las secuencias homólogas a FluG conservan todos los residuos catalíticos que se han detallado en este capítulo. Este hecho podría sugerir que FluG pueda cumplir el mismo papel en hongos y plantas. Sin embargo, basándonos en la caracterización de los homólogos de FluG en otros Aspergilli (Mah y Yu, 2006; Ogawa et al., 2010; Chang et al., 2012; Wang et al., 2015), no se puede afirmar que el papel de -glutamil ligasa que se le ha adscrito a FluG se haya conservado en los diferentes reinos, más aún teniendo en cuenta que ambas regiones se encuentran por separado en bacterias. Con respecto a las predicciones que han adscrito a FluG actividades de dos enzimas de origen procariota, se ha atribuido a eventos de fusión y fisión impulsados por la evolución paráloga de bacterias a hongos (Mathis et al., 2000), como ha podido ocurrir con los homólogos de FluG en bacteria. Cabe destacar que este hecho también puede darse entre diferentes especies de hongos mediante translocación o inversión cromosómica (Leonard y Richards, 2012). En este caso, se ha confirmado que los homólogos bacterianos de FluG se encuentran organizados en operones, cuyo papel es, generalmente, desconocido. En el caso de los operones encontrados en Mycobacterium tuberculosis) y Streptomyces coelicolor, se ha observado que ambos organismos contienen cuatro genes homólogos a las GSI (glnA1-4) (Rexer et al., 2006; Hayward et al., 2009), de los cuales glnA3 (Strong et al., 2003; Rexer et al., 2006) es el que está presente en ambos operones. La generación del nulo del gen glnA3 de Streptomyces coelicolor no exhibió defectos en la esporulación, demostrando que el papel de este gen es distinto al de la región C-terminal FluG (Rexer et al., 2006). Un estudio posterior ANÁLISIS DE SECUENCIA Y PREDICCIÓN FUNCIONAL DE FLUG 105 llevado a cabo por Krysenko et al. (2017) desveló que el gen glnA3 tiene actividad - glutamil putrescina ligasa, la cual está implicada en la ruta de degradación de las poliaminas y su posterior utilización como fuente de nitrógeno (Kurihara et al., 2008). Se desconoce que papel puede tener el gen adyacente que codifica la amidohidrolasa en estas bacterias, pero la disposición cercana entre las secuencias predichas de GSI y amidohidrolasa, indica posiblemente una conexión funcional (Strong et al., 2003; Iyer et al., 2009). La información obtenida en este capítulo ha permitido, por un lado, seleccionar los residuos catalíticos candidatos a ser mutados puntualmente para poder determinar su importancia en la función de FluG. Por otro lado, se llevará a cabo la separación de las regiones Ny C-terminal de FluG y se expresaran individualmente y por separado dentro del hongo, con el objetivo de verificar la función que cumple cada uno. Finalmente, se sustituirán las dos regiones de FluG por uno de los candidatos bacterianos que se han utilizado para el modelado de FluG, para comprobar si estos homólogos son capaces de llevar a cabo in vivo la función nativa de FluG. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG 112 valor intermedio (Anexo 16). Estos resultados indican que ambas regiones son funcionales cuando se expresan por separado, ya que, por un lado, en MMA se midieron niveles de conidiación semejantes a los observados en las cepas WT y C-terminal. Por otro lado, en MCA, el valor de C duplicó el obtenido en la cepa C-terminal, sin embargo, este valor representaba la mitad del valor de C obtenido en la cepa WT. En resumen, se confirmó que la región N-terminal tiene un papel de apoyo a la región C-terminal en la producción de conidias en condiciones de alta disponibilidad de nutrientes, especialmente, cuando ambas regiones se expresan en el mismo polipéptido. 2.2. La expresión por separado de las regiones Ny C-terminal de FluG afecta al desarrollo sexual Los resultados obtenidos en el apartado anterior demostraron que al menos, en el desarrollo asexual, las regiones Ny C-terminal cumplen funciones distintas, dependiendo de la condición del medio en el que es cultivado el hongo. Teniendo en cuenta los antecedentes y los resultados recogidos en la Figura 28 del primer objetivo, se procedió al contaje de cleistotecios de los mutantes que contenían las regiones Ny Cterminal de FluG (Figura 28). Los valores del contaje de cleistotecios están detallados en el (Anexo 17). Figura 28. Contaje de cleistotecios por unidad de área (Cleistotecios/Área) en una cepa WT,  fluG, N-terminal (aa1– aa406), C-terminal (aa427–aa865) en MMA (gris oscuro) y MCA (gris claro). CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG 113 Los resultados muestran que en medio mínimo la producción de cleistotecios por unidad de área en los mutantes Ny C-terminal es semejante al de una cepa  fluG. En medio completo, la cepa que expresa la región N-terminal no desarrolla ninguna estructura sexual. Sin embargo, en las mismas condiciones, el mutante que contiene la región C-terminal genera la misma cantidad de cleistotecios que una cepa silvestre. Los resultados demuestran que los el número más alto de cleistotecios en ambos medios se consigue cuando ambas regiones están presentes. La región C-terminal es esencial para que se lleve a cabo el desarrollo sexual en medio completo. 2.3. La sustitución de los residuos conservados afecta a la función de FluG Las mutaciones sobre los residuos equivalentes a H20, H22 y D354 en la región Nterminal de FluG (Figura 22) habían sido descritas como esenciales para la actividad de amidohidrolasas (Kim y Kim, 1998; Li et al., 2006; Lohkamp et al., 2006; Nguyen et al., 2009). Con el objeto de probar el efecto de sustituciones en esos mismos residuos sobre la función de FluG, se construyeron tres mutantes en los que se sustituyeron los aminoácidos por una alanina: simple (D354), doble (H20-H22) y triple (H20-H22-D354). La misma estrategia se siguió para la región C-terminal, donde los residuos E566, E626, H682, R720, R739, R744 y E752 se seleccionaron en base a trabajos anteriores (Kurihara et al., 2008; Ladner et al., 2012; Murray et al., 2013). Ninguna de estas sustituciones dio lugar a la predicción de cambios conformacionales importantes cuando se testaron frente a modelos de homología (Materiales y Métodos, Maestro (Schrödinguer®). Los fenotipos observados para el conjunto de los mutantes se muestran en la Figura 29 (Se incluye en mayor tamaño en el Anexo 18). Los valores de producción de conidias y el peso seco por unidad de área están detalladas en el Anexo 16. Todas las mutaciones en la región N-terminal exhibieron valores de C más bajos con respecto a la cepa WT en ambos medios. En MMA, fueron ligeramente inferiores. En MCA, sin embargo, se observaron diferencias notables. Por un lado, el mutante H20AH22A presentó un nivel de conidiación superior al mutante D354A, y este, a su vez, superó al mutante triple (H20A-H22A-D354A) (Figura 29). Esto indica un efecto aditivo de las mutaciones. En la región C-terminal, las mutaciones en los residuos E566, E626, H682, R720, R739, R744 y E752 derivaron en cambios drásticos. En MMA, todas las cepas mutantes CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG 114 presentaron valores de C más bajos en comparación con la cepa silvestre, pero a su vez, superiores a los obtenidos en la cepa  fluG. Esto indica que las mutaciones puntuales resultaron en una inactivación parcial de la actividad. En MCA, los valores de C fueron muy bajos, acercándose a los obtenidos en la cepa  fluG. Sin embargo, el mutante R739A presentó un fenotipo divergente con valores de C estadísticamente superiores en MCA en comparación a los otros mutantes de esta región (Figura 29). En conjunto, los resultados muestran que las mutaciones puntuales en ambas regiones afectan a la función biológica atribuible a cada una de las regiones, confirmando la funcionalidad de los residuos conservados en cada una de ellas. 2.4. Niveles de expresión del gen fluG en distintos mutantes Para determinar que los fenotipos observados no eran producto de una expresión génica alterada, las cepas fueron examinadas por qPCR y comparadas con la de la cepa WT, como se muestra en la Figura 30 (Se incluye en mayor tamaño en el Anexo 19). Con la excepción del mutante  fluG, todos mutantes presentaron niveles de transcripción iguales o superiores a los observados en la cepa WT. La cuantificación de la expresión de fluG en todos los mutantes indicó que el nivel de expresión era superior al observado en Figura 29. Fenotipos y ratios de C/Área (millones/cm2) de todos los mutantes FluG, tras haberlos incubado durante 72 h. Cepa silvestre (WT) junto con el nulo de fluG (  fluG) y los mutantes puntuales de ambas regiones en MMA y MCA. Los valores C/Área que son estadísticamente diferentes (valor P <0,05) al WT ( ∗) y el  fluG (#) están marcados. Los valores de C/Área en medio mínimo (MMA) están representados en gris oscuro, y los valores de C/Área en medio completo (MCA), están representados en gris claro. Barra de escala = 1 cm CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG 115 la cepa WT en la mayoría de ellos. Teniendo en cuenta que las mutaciones causaron una funcionalidad aminorada en términos fenotípicos, estos niveles de expresión descartan que los fenotipos observados se deban a niveles de expresión reducidos. Estos resultados sugieren que la regulación de FluG pueda estar condicionada por el nivel de actividad que esté llevando a cabo, siendo su ausencia una señal para que aumente la expresión de fluG. 2.5. La sustitución heteróloga de ambas regiones de FluG por sus homólogos bacterianos complementan su función Apoyados por las homologías estructurales observadas entre las regiones Ny Cterminal con las de Lactobacillus paracasei (LSEI_0440) y Pseudomonas aeruginosa (PA5508), respectivamente, se construyeron cepas en las que las secuencias bacterianas se expresaron bajo el promotor nativo de fluG en combinaciones que incluían tres quimeras proteicas (LSEI_0440+C-terminal; N-terminal+PA5508; LSEI_0440+ PA5508) y un único polipéptido (PA5508). Figura 30. Los valores de expresión de fluG para cada cepa en MMA se muestran en el gráfico. Todas las muestras fueron tomadas después de 18 h de crecimiento vegetativo. Las siglas se refieren a lo siguiente: WT, cepa silvestre;  fluG, mutante nulo del gen fluG; N-terminal, región (1-406); C-terminal, región (427-865); N + C separados [N] y N + C separados [C], mutante de región separada Ny C-terminal; H20A-H22A / D354A / H20A-H22A-D354A, mutantes puntuales de la región N-terminal; E566A / E626A / H682A / R720A / R739A / R744A / E752A, mutantes puntuales de la región C-terminal. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG 116 Los fenotipos de las cepas mutantes se muestran en la Figura 31. Los valores de C obtenidos en las cepas LSEI_0440+C-terminal y N-terminal+PA5508 fueron significativamente más altos que la cepa WT en MMA. En las mismas condiciones, el PA5508 y el LSEI_0440+PA5508 mostraron valores de C estadísticamente similares en comparación con la cepa WT. Por otro lado, los valores de C de las tres quimeras de proteínas (LSEI_0440+C-terminal; N-terminal+PA5508; LSEI_0440+PA5508) fueron estadísticamente similares a la cepa WT en MCA. Sin embargo, la cepa que expresaba el polipéptido PA5508 solo exhibió un valor significativamente más bajo en comparación con el WT en el mismo medio. Figura 31. Fenotipos y ratios de C/Área (millones/cm2) de todos los mutantes de sustitución de FluG, tras haberlos incubado durante 72 h. Cepa silvestre (WT) junto con el nulo de fluG (  fluG) y los mutantes de sustituciones heterólogas LSEI_0440+C-terminal (FluG), N-terminal (FluG)+PA5508, LSEI_0440+PA5508 y PA5508 solo en MMA y MCA. Los valores C/Área que son estadísticamente diferentes (valor P <0,05) al WT ( ∗) y el  fluG (#) están marcados. Los valores de C/Área en medio mínimo (MMA) están representados en gris oscuro, y los valores de C/Área en medio completo (MCA), están representados en gris claro. Barra de escala = 1 cm CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG 117 Los resultados demuestran que la proteína codificada por el gen LSEI_0440 puede reemplazar funcionalmente la región N-terminal de FluG. Por otra parte, la proteína codificada por PA5508 cumple el papel de la región C-terminal de FluG, ya sea como un solo polipéptido (mutante PA5508), o fusionada a la región N-terminal de FluG (quimera N-terminal+PA5508). De acuerdo con los resultados mencionados anteriormente, el hecho de que la quimera que expresa la proteína fusionada de LSEI_440 y PA5508 exhiba un fenotipo estadísticamente comparable a una cepa WT confirma que ambas enzimas bacterianas pueden funcionar conjuntamente para reemplazar a ambas regiones FluG. 2.6. La sustitución heteróloga de FluG por su homólogo de planta, NodGS, no complementa su función Siguiendo la misma estrategia que se llevó a cabo con los homólogos bacterianos, se construyó una cepa que contenía la secuencia del gen NodGS de Arabidopsis thaliana la cual se expresó bajo el promotor nativo de fluG. Los fenotipos tanto de la cepa mutante, como la cepa silvestre y se muestran en la Figura 32. Los resultados observados demuestran que NodGS no es capaz de complementar la función de FluG, ya que los fenotipos obtenidos en el mutante NodGS, es similar a los obtenidos en un mutante nulo del gen fluG. Figura 32. Fenotipo de la cepa silvestre (WT) junto con el nulo de fluG (  fluG) y el mutante NodGS, tras haberlo incubado durante 72 h. Cepa silvestre (WT) junto con el nulo de fluG (  fluG) y el mutante NodGS. Barra de escala = 1 cm CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG 118 2.7. Precisiones sobre la actividad enzimática de la región C-terminal Tras la demostración de la capacidad de la secuencia 4HPP para suplantar la función de la región C-terminal, se consideró oportuno realizar un examen más detallado de la secuencia y estructura de esta enzima. El trabajo llevado a cabo por Ladner et al. (2012) tenía como objetivo la identificación de las diferencias más notables entre una GS y los genes que son homólogos a las GS, pero no comparten dicha función como es el caso de los genes pauA1-7. Teniendo en cuenta que a los genes pauA1-6 ya se les asignó un papel en la degradación de poliaminas en estudios anteriores (Lu et al., 2002; Chou et al., 2008; Yao et al., 2011; Yao et al., 2012), su investigación de centró en llevar a cabo una evaluación estructural y bioquímica del gen pauA7 (PA5508). El estudio bioquímico desveló que esta enzima no exhibía la actividad de una GS porque era incapaz de formar glutamina. Sin embargo, mostraba una actividad -glutamil ligasa con preferencia por sustratos como las aminas heterocíclicas o catecolaminas, tales como la tryptamina, serotonina y la dopamina (Ladner et al., 2012). CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG 119 2.7.1. El extremo C-terminal tiene mayor similitud con una -glutamil ligasa La resolución del cristal de la proteína PA5508, afloró una serie de diferencias estructurales en comparación con la estructura de cristal de la GS de Salmonella typhimurium (1FPY). Por un lado, se resaltaba que mientras la GS de S. typhimurium adopta un estado oligomérico de dos hexámeros coordinados por el extremo C-terminal de la proteína (también conocido como correa helicoidal) para formar un dodecámero, la proteína PauA7 formaba hexámeros, debido a que el extremo C-terminal se pliega hacia el interior de la proteína, quedando inaccesible para cualquier tipo de interacción (Figura 33). Ladner et al. (2012) relacionaron este fenómeno con la ausencia de una región de aproximadamente 55 aminoácidos presente en la GS de Salmonella typhimurium, la cual forma dos láminas beta que impiden el plegamiento del extremo C-terminal. En la estructura de PauA7 se observó que esta región estaba formada por aproximadamente 12 aminoácidos sin estructura, siendo esta la razón por la que el extremo C-terminal puede tener acceso al plegamiento hacia el interior de la proteína (Figura 33). Figura 33. Representación de la conformación que adopta el extremo C-terminal (amarillo) y la región de las dos láminas beta (azul ) en los cristales 1FPY (rojo) y 4HPP (verde). A) En el cristal 1FPY, el extremo C-terminal está orientado hacia el exterior, quedando accesible para interaccionar con otra subunidad. Las dos láminas beta bloquean la movilidad del extremo C-terminal. B) En el cristal 4HPP, debido a la ausencia de las dos láminas beta, el extremo C-terminal queda se pliega hacia el interior de la proteína, quedando inaccesible para cualquier tipo de interacción. A B CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG 120 Teniendo en cuenta estos indicios, se procedió a analizar cual de los modelos del extremo C-terminal de las dos proteínas modelo (1FPY o 4HPP) guardan mayor similitud estructural con el extremo C-terminal de FluG, valiéndonos para ello de los valores QMEAN que la herramienta Swiss-Model calcula por cada aminoácido. Así mismo, se procedió también a analizar la región en la que Ladner et al. (2012) observaron la ausencia de dos láminas beta (Figura 33), para poder determinar si esta región que FluG contiene los aminoácidos necesarios para formar esta estructura en el cristal 1FPY. Los resultados obtenidos se representan en forma de modelos de FluG obtenidos con el cristal 1FPY (Figura 34) y el cristal 4HPP (Figura 35), junto con un resumen en la Tabla A y la Tabla B del Anexo 20. Tras analizar los resultados obtenidos en la Tabla A del Anexo 20, el promedio de los valores QMEAN individuales obtenido para los trece aminoácidos que pueden formar la correa helicoidal sugiere que la estructura que adopta la proteína PauA7 en el cristal 4HPP es la que mayor similitud estructural presenta para esta región de FluG, ya que los valores QMEAN que presenta FluG son superiores para esta conformación. Cuando se comparó la región que está formada por dos láminas beta en el cristal 1FPY con la proteína PauA7 y con FluG, los resultados obtenidos en la Tabla B del Anexo 20 Figura 34. Conformación que adopta el extremo C-terminal (amarillo) y la región de las dos láminas beta ( azul) en los modelos 1FPY (rojo ) y la región C-terminal modelada con el cristal 1FPY ( morado). A) En el cristal 1FPY, el extremo C-terminal está orientado hacia el exterior, quedando accesible para interaccionar con otra subunidad. Las dos láminas beta bloquean la movilidad del extremo C-terminal. B) En el modelo de la región C-terminal, debido a la ausencia de las dos láminas beta, el extremo C-terminal puede plegarse hacia el interior de la proteína. A B CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG 121 mostraron que ambas proteínas carecen de los aminoácidos necesarios para formar la estructura compuesta por dos láminas beta. Si bien FluG contiene 11 aminoácidos más que PauA7 en esta región, el modelo de FluG construido con el cristal 1FPY demostró que FluG no formaba una estructura semejante a las láminas beta (mostradas en azul) presentes en la GS de S. typhimurium (Figura 34). Por otro lado, el modelo de FluG construido con el cristal 4HPP, demostró que FluG, si bien se extendía 10 aminoácidos más que en modelo 4HPP, esta región conservaba una mayor similitud con la -glutamil ligasa de P. aeruginosa (Figura 35). 2.7.2. El dominio -Grasp de FluG es similar al de ambas GS y -glutamil ligasas Otra característica estructural importante de las GS reside en el extremo N-terminal, el cual adopta una estructura de seis laminas beta (de las cuales, cuatro están interlineadas), también conocido como -Grasp, tal y como se muestra en la Figura 36. Esta región es especialmente importante porque conserva el residuo catalítico aspartato el cual extrae el protón del amonio, y también porque una vez la proteína se coordina para formar un hexámero, el -Grasp interacciona con la región C-terminal (catalítica) de la unidad adyacente (Figura 36). Figura 35. Conformación que adopta el extremo C-terminal (amarillo) y la región de las dos láminas beta ( azul) en los modelos 4HPP (verde) y la región C-terminal modelada con el cristal 4HPP (morado ). A) En el cristal 4HPP, debido a la ausencia de las dos láminas beta, el extremo C-terminal queda se pliega hacia el interior de la proteína, quedando inaccesible para cualquier tipo de interacción. B) En la región C-terminal, tampoco están presentes las dos láminas beta, y el extremo C-terminal puede plegarse hacia el interior de la proteína. A B CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG 128 funcionalmente importantes en las GS y las -glutamil ligasas, cumplen una función importante en FluG (Ladner et al., 2012). Los análisis de expresión de los mutantes, han desvelado que, si bien la expresión de todos los mutantes es al menos tan abundante a la observada en una cepa silvestre, la mayoría de los mutantes, han exhibido una expresión considerablemente superior. Este hecho también ha sido previamente reportado por Lee y Adams (1994) y Yager et al. (1998), quienes reportaron una expresión aberrante de FluG por mutaciones que afectaban a su función. Este hecho sugiere que FluG pueda estar autoregulado mediante algún factor de transcripción que pueda responder (Thieme et al., 2018), a los niveles de sustrato o producto de la enzima. En lo que respecta a la posible función enzimática de FluG se refiere, un estudio llevado a cabo por Margelis et al. (2001), sustituyó heterologamente el gen fluG de A. nidulans por la GS (glnA) del organismo procariota Anabaena sp., confirmando que este último no revertía los defectos causados por la ausencia de FluG. Si bien, esta aproximación sirvió para descartar que FluG tuviera la actividad enzimática de una GS, teniendo en cuenta que en el Capítulo IV las estructuras homólogas a la región Ny Cterminal de FluG que se encontraron, eran originarias de Lactobacillus paracasei y Pseudomonas aeruginosa, se procedió a sustituir heterologamente las dos regiones de FluG por sus homólogos bacterianos, para comprobar si son capaces de llevar a cabo in vivo la función nativa de FluG. Los resultados han demostrado que ambas proteínas codificadas por los genes LSEI_0440 y PA5508 cumplen el papel de la región Ny Cterminal de FluG, respectivamente. Cabe destacar que el hecho de haber observado un fenotipo semejante al de la cepa silvestre en la quimera con ambos genes bacterianos fusionados, sugiere que la función enzimática que cumplen estas enzimas, sea similar o idéntica a la que lleva a cabo FluG. Por otro lado, se pudo observar que el gen NodGS, homólogo a FluG en A. thaliana, no complementó la función nativa en A. nidulans. Si bien, se pudo confirmar que NodGS conserva todos los residuos catalíticos predichos, es posible que los codones que codifican los aminoácidos no sean los óptimos para llevar a cabo la traducción a la velocidad óptima, junto con su posterior plegamiento de la proteína (Plotkin y Kudla, 2011). No obstante, teniendo en cuenta los informes que se han reportado en torno a la función de NodGS (Doskočilov et al., 2011) y su homólogo en Medicago truncatula CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE FLUG 129 (Trujillo, 2019), es muy probable que la función que desempeñan estos homólogos sea distinta o se haya especializado lo suficiente como para no complementar el papel de FluG en A. nidulans. Finalmente, en análisis bioinformático llevado a cabo en profundidad comparando la región C-terminal con la estructura de cristal de la -glutamil ligasa PauA7, indica que ambas comparten dominios similares, como una correa helicoidal orientada hacia el interior de la proteína y la ausencia de dos láminas beta. No obstante, se han detectado también diferencias tanto en la conservación de una tyrosina candidata a ser adenilada, como la falta de conservación de los residuos candidatos a interaccionar con el sustrato, lo cual implica que se necesitaría llevar a cabo un trabajo experimental más exhaustivo para valorar la importancia de estos residuos. CAPÍTULO VI: DISCUSIÓN GENERAL DISCUSIÓN GENERAL FluG está acreditado como uno de los primeros factores de acción temprana en la inducción de la conidiación (Park y Yu, 2012). Sin embargo, su caracterización ha seguido una sinuosa trayectoria, que ha mantenido la incógnita en cuanto a su papel el desarrollo asexual. El trabajo pionero de Adams y colaboradores (Lee y Adams, 1994; Wieser et al., 1994), apuntó el carácter enzimático de este factor, como una hipotética glutamina sintetasa de tipo I, mientras que estudios posteriores no permitieron elucidar la función precisa (Margelis et al., 2001). Posteriormente, otros trabajos relacionaron al factor con la luz (Yager et al., 1998; Ruger-Herreros et al., 2011) y el complejo Velvet (Chang et al., 2013), desviando el enfoque inicial, quedando así la función en un estado de indefinición. Tras el trabajo presentado en esta tesis, la función enzimática inicialmente hipotetizada por Lee y Adams (1994) queda precisada y parcialmente confirmada, si bien permanecen aún sin demostrar las reacciones precisas que desempeña. En cualquier caso, la información aportada en este estudio da cabida para hipotetizar sobre la posible naturaleza de estas reacciones y el papel que pueden jugar en el contexto general del desarrollo asexual y del funcionamiento del micelio como unidad multicelular. Una enzima bifuncional Los resultados de este estudio han demostrado que FluG consta de dos regiones con actividades enzimáticas predichas (una amidohidrolasa y una -glutamil ligasa) capaces de desempeñar sus funciones por separado al igual que sus ortólogas bacterianas. Las enzimas bifuncionales, así como los complejos multienzimáticos, están justificados por el aumento de eficacia que propicia la proximidad espacial entre las unidades catalíticas, minimizando así las ineficacias relacionadas con la difusión de los intermediarios. En el caso de FluG, se trata de dos enzimas unidas por una secuencia que carece de estructura. A falta de un conocimiento más específico sobre las reacciones de las dos enzimas, el análisis funcional basado en el número de esporas obtenido permite extraer conclusiones en el ámbito de los procesos biológicos afectados. En medio mínimo, en el que existe una cierta limitación nutritiva, los resultados indicaron que la región Cterminal (en adelante -glutamil ligasa) es capaz de llevar a cabo la función biológica relacionada con el desarrollo asexual sin aportación aparente por parte la región Nterminal (en adelante amidohidrolasa). Estudios anteriores ya indicaron que la región Cterminal era imprescindible para la actividad de FluG (D'Souza et al., 2001). En el medio DISCUSIÓN GENERAL completo, en el que el aporte de nitrógeno orgánico es considerable, la actividad amidohidrolasa juega un papel determinante para mantener niveles de conidiación comparables con los de la cepa silvestre. En su ausencia, se observa un desequilibrio morfogenético en favor del crecimiento vegetativo (Figura 38). Dado que la actividad fundamental de FluG se centra en la -glutamil ligasa, comenzaremos por analizar esta actividad. Las enzimas bacterianas que han sido capaces de sustituir la función nativa en este estudio participan en la degradación de fuentes complejas de nitrógeno, principalmente aminas, para formar compuestos más simples que Figura 38. Representación de la hipotética utilización que tienen la región N-terminal (azul) y la región C-terminal (verde) de FluG, empleando un intermediario metabólico abundante en hifas cultivadas en MMA ( rojo) y MCA (MMA (rojo ) + Extracto de levadura ( morado ). En MMA, la región C-terminal de FluG es suficiente para llevar a cabo la esporulación. En MCA, se considera que la región N-terminal es necesaria para procesar un intermediario metabólico sintetizado en presencia del extracto de levadur. Se especula que el producto de la región N-terminal pueda servir como sustrato de la región C-terminal o que una vez transformado por la región N-terminal, deje de funcionar como señalizador del crecimiento. Las estructuras tridimensionales de ambas regiones se han obtenido a partir de las estructuras de cristal obtenidas de los homólogos bacterianos de Lactobacillus paracasei para la región N-terminal (2QPX), y Pseudomonas aeruginosa para la región C-terminal (4HPP). La imagen del conidióforo ha sido modificada a partir de (Rodriguez-Romero et al., 2010). DISCUSIÓN GENERAL puedan ser procesados hacia otros procesos metabólicos como el crecimiento, la síntesis de proteínas o la comunicación con otros organismos (Reitzer, 2003; van Heeswijk et al., 2013; Luengo y Olivera, 2020). Un ejemplo es el proceso de degradación de varias aminas lineales como la putrescina (Kurihara et al., 2008; Krysenko et al., 2017), la cadaverina, etanolamina (Krysenko et al., 2019) y aminas aromáticas (Arora, 2015) como la anilina (Takeo et al., 2013) o síntesis de la metilamina (Yamamoto et al., 2008) mediante la - glutamilación. Si bien este proceso fue atribuido a ciertas proteínas homólogas a las inicialmente categorizadas como GS, estudios más detallados demostraron que estas efectúan una -glutamilación. La enzima -glutamil ligasa PauA7 (Ladner et al., 2012) que sustituye funcionalmente la actividad de FluG in vivo guarda cierta similitud de secuencia con una GS, pero su función es la -glutamilación de catecolaminas (Figura 39). Esta propiedad también se ha atribuido más recientemente a otras enzimas no homólogas a las GS que cumplen la misma función sobre aminas aromáticas como la tiramina (Wang et al., 2014). Figura 39. Esquema del tipo de aminas cuya utilización por -glutamil ligasas ha sido confirmada. Estas aminas, una vez - glutamiladas ( producto -glutamilado ), son procesadas por rutas alternativas que pueden derivar en la degradación de estas mismas para emplearlas como fuente de nitrógeno, o, alternativamente, se postula que la glutamilación pudiese resultar dar lugar a la señal que destine el compuesto a otros procesos como la señalización del inicio de procesos como la conidiación o el desarrollo sexual. DISCUSIÓN GENERAL A lo largo de la escritura de esta tesis, la publicación de nuevos estudios centrados en la resolución de estructuras de cristal ha permitido encontrar una nueva enzima candidata, denominada -glutamil metilamida sintetasa (GmaS) (Wang et al., 2020). Se ha podido verificar que la enzima GmaS, al igual que la enzima PauA7, tiene estrecha similitud con una GS. No obstante, no conserva los dos residuos catalíticos presentes en una GS, los cuales interaccionan con el amonio, y llevan a cabo el último paso para formar el producto. Cabe resaltar también que otro estudio ha reportado la capacidad que tienen las enzimas GmaS de utilizar distintos tipos de aminas alifáticas (lineales) y aromáticas (cíclicas) como sustrato para posteriormente -glutamilarlas (Pan et al., 2020). Las evidencias recogidas en torno a la actividad tan versátil que presentan las enzimas - glutamil ligasas, invita a pensar que FluG pueda también conservar cierta promiscuidad por un abanico de sustratos destinados tanto al crecimiento como a la diferenciación del micelio. Los resultados obtenidos en esta tesis mediante mutaciones puntuales en los residuos catalíticos predichos y la sustitución de su homólogo bacteriano, apoyan la interpretación de que FluG puede estar cumpliendo una función enzimática semejante a la -glutamilación de uno o varios sustratos. El objetivo último, reportado en bacterias, es la degradación de poliaminas. Varios estudios han resaltado la importancia de la putrescina (Sneath, 1955; Guzmán-de-Peña et al., 1998) y la espermidina (Jin et al., 2002) en las etapas del desarrollo asexual, desarrollo del tubo germinativo y el metabolismo secundario de A. nidulans y en el desarrollo asexual de otros hongos (Mead et al., 2013). Sin embargo, no se ha reportado un requerimiento directo de poliaminas exógenas para la producción de conidióforos y su presencia en el medio no contribuyen a inducir o aumentar los niveles de conidiación (U. Ugalde, comunicación personal). Por tanto, parece poco probable que el proceso en el que participa esta enzima sea equiparable al observado en bacterias que emplean las poliaminas como fuente de carbono y nitrógeno. Una posibilidad a considerar podría ser que FluG intervenga sobre intermediarios resultantes de procesos de autofagia, como la degradación de purinas y pirimidinas, o el ciclo de la urea, como se verá más tarde. Una vez formulada una propuesta sobre la actividad -glutamil ligasa, pasamos examinar la actividad amidohidrolasa, recordando que esta actividad es especialmente relevante en condiciones de alta disponibilidad de nitrógeno orgánico (aminoácidos y DISCUSIÓN GENERAL ácidos nucléicos). Los análisis de secuencia no han permitido identificar posibles ortólogos. Sin embargo, los residuos conservados corresponden a los de una dihidropirimidinasa bacteriana, la cual participa en la síntesis y degradación de las pirimidinas (Lohkamp et al., 2006). Esta función es llevada a cabo en A. nidulans por un enzima filogenéticamente distante (Aleksenko et al., 1999). En este contexto, no se puede especular en detalle sobre los sustratos posibles de la amidohidrolasa. Sin embargo, es probable que estén relacionados con procesos de autofagia, como la degradación de purinas (Gournas et al., 2011) y pirimidinas (Aleksenko et al., 1999). En el caso de las purinas, la degradación de la adenina resulta en la formación moléculas cíclicas como la el ácido úrico o la xantina, las cuales siguen siendo degradados hasta formar productos como la alantoina, urea o el amonio. Cabe resaltar que los residuos catalíticos tanto en la deaminasas de la amina (NadA) (Oestreicher et al., 2008) como la ureasa (UreB) (Kappaun et al., 2018), están conservados en la amidohidrolasa. No obstante, ambas proteínas no comparten similitud estructural. En el caso de las pirimidinas, tanto el uracilo como la timina se podrían degradar dando lugar a la -alanina o -aminoisobutirato (Schnackerz y Dobritzsch, 2008). Los productos de la amidohidrolasa podrían ser -glutamilados, evitando que la ruta de degradación culminase en la acumulación de glutamina, un reconocido estimulante del crecimiento vegetativo en Neurospora crassa (Cardenas y Hansberg, 1984). En este punto, cabe recordar que el fenotipo resultante de la ausencia de FluG es, precisamente un fenotipo de crecimiento vegetativo desbocado en fase aérea. El sentido global de esta configuración enzimática será abordado en la siguiente sección. La función de FluG en el contexto del micelio Estudios sobre la génesis y desarrollo del micelio, y particularmente en A. nidulans, muestran que, tras la germinación, tiene lugar una fase de crecimiento vegetativo, a la que sucede la emergencia de los primeros conidióforos (Cohen, 1973). En ese periodo denominado periodo de competencia (16 horas), se ha establecido que la colonia adquiere la competencia para iniciar el desarrollo asexual (Axelrod et al., 1973). Todavía no se ha establecido con claridad qué parámetros son los que definen la consecución de esa competencia (Noble y Andrianopoulos, 2013), pero puede que se trate de una