Instauración del fundamento terapéutico de la inhibición de la vía de señalización Lefty-Smad en el Glioblastoma

0 Alejandro Elúa Pinín Tesis Doctoral San Sebastián, País Vasco 2022 INSTAURACIÓN DEL FUNDAMENTO TERAPÉUTICO DE LA INHIBICIÓN DE LA VÍA DE SEÑALIZACIÓN LEFTY-SMAD EN EL GLIOBLASTOMA (cc) 2022 Alejandro Elúa Pinín (cc by 4.0) 1 1 AGRADECIMIENTOS En primer lugar, quiero realizar una reflexión y mostrar un eterno agradecimiento a los verdaderos responsables y motores de este trabajo, a vosotros los Enfermos. Probablemente nunca leáis esta Tesis, seguramente nunca conozcáis los resultados de este estudio, pero quiero dejar constancia de una irrefutable certeza: los que realmente nos motiváis a los Clínicos y Básicos cada día sois vosotros. A veces se nos olvida que todo lo que hacemos en el hospital y en el laboratorio es por y para vosotros. Siento que, con el paso del tiempo, esa primera motivación genuina que todos los profesionales del ámbito de la salud una vez sentimos, a la que llamamos VOCACIÓN, que hace tan bello y agradecido nuestro trabajo, poco a poco se va desgastando, diluyendo, y se va transformando en acción rutinaria. Pasamos de trabajar con gusto para ayudar, a trabajar lo justo porque es lo que toca. Y por si algún día caigo en este engaño de la mente, aquí dejo escritas estas líneas para intentar volver atrás. En definitiva, gracias a todos los pacientes enfermos de Glioblastoma, en especial a IZM, por recordarnos cada día a los Clínicos y Básicos que el trabajo duro en proyectos como el que a continuación se describe merecen cada gota de sudor y cada segundo que a este dedicamos. Es imprescindible que el lector de este documento comprenda que la consecución de este trabajo es fruto del esfuerzo directo e indirecto de MUCHAS personas a las cuales quiero darles las gracias. En primer lugar, a mi familia. A mi madre, a mi padre y a mi hermano. A mis tías y tíos, a mis primas y primos, a mis abuelos. Cada uno de vosotros me habéis enseñado algo que ha determinado mi personalidad y carácter, y que ha forjado la persona que ha conseguido escribir este documento. A mis amigos, que habéis me habéis apoyado y soportado mi ausencia durante estos últimos meses de escritura. A todo el personal de planta de la 2ª 3ª. Al Servicio de Neurocirugía del Hospital Donostia, desde el Jefe de Servicio, el Dr Úrculo, hasta los residentes (Pelayo, Patri), pasando por todos los Adjuntos (Alicia, Mariano, Nico, Mikel, Patri, José, Leti); Al personal de quirófano (limpieza, enfermería, celadores) Al equipo de anestesia. Al equipo de CMI. A todo el equipo del comité de tumores. Sin vosotros y sin el apoyo que me habéis prestado, cada uno a vuestra manera, cada uno con su pequeña aportación que hace que al final todo funcione, este proyecto no hubiese sido posible. A mis Directores, Ander y Nico que me habéis ido guiando a los largo de estos años en este gran Trabajo científico. 2 A Mariano Arrázola, mi tutor. Desde que llegué a la residencia me preguntaste si quería hacer la tesis doctoral en el arduo terreno de la investigación básica. Me dijiste: - ¿Tienes algo que hacer por las tardes? No, ¿verdad? Pues, ala, al laboratorio hasta terminar la tesis (xd) -. Desde entonces me has animado y motivado en los momentos clave, y por eso te doy este profundo y sincero agradecimiento. A Joaquín Andermatten, compañero de laboratorio, de quirófano y de aventuras. A Ander Saenz, por la infinita pacencia que has tenido, por tu espíritu docente, tu energía y tu optimismo. Esta tesis es tan tuya como mía. A Verónica Moncho, por ayudarme en la recta final con los últimos experimentos. A todos los investigadores del Biodonostia que participasteis de un modo u otro en este proyecto; Jaione, Mikel, Maddalen, Estefanía, Aizpea y muchos otros que se me quedan en el tintero. Cuando bebas agua, recuerda la fuente. - Proverbio chino. Agradece a la llama su luz, pero no olvides el pie del candil que paciente la sostiene. - Rabindranath Tagore (1861-1941) Filósofo Indio 3 2 ABREVIATURAS GBM: Glioblastoma Multiforme H.U.D: Hospital Universitario de Donostia LOE: Lesión Ocupante de Espacio WHO: World Health Organization TC: Tomografía Computerizada RM: Resonancia Magnética TGFB: Transforming Growth Factor Beta SNC: Sistema Nervioso Central SMAD: Small Mothers Against Decapentaplegic WHO: World Health Organization WT: “Wild Type” NOS: “Not Otherwise Specificated” IDH: Isocitrato deshidrogenasa MGMT: O6 Metil Guanin Metil Transferasa EGFR: Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico EGF: Factor de Crecimiento Epidérmico TGFα: Factor de crecimiento transformante alfa ADN: Ácido Desoxirribonucleico TKI: Inhibidor de Receptor Tirosin Quinasa ARF: “Adenosine diphosphate-Ribosylation Factor “ KDa: Kilodalton ATRX: Alfa -thalassemia X-linked intellectual disability ALT: “alternative lengthening of Telomers” DAXX: “death-domain-associated protein” RM: Resonancia Magnética FLAIR: “increased T2-weighted Fluid-Attenuated Inversion Recovery” LCR: líquido Cefaloraquídeo DSC: Dynamic susceptibility contrast rCBV: volumen de fujo sanguíneo cerebral relativo 4 GSC: Glial stem cells GTR: Gross Total Resection RT: radioterapia TMZ: Temozolomida RANO: Response Assessment in NeuroOncology RC: Respuesta Completa RP: Respuesta Parcial BHE: Barrera Hematoencefálica NICE: “National Institute for Health and Care Excellence” TAC: Tomografía Axial Computerizada. IHQ: Inmunohistoquímica RT: Retrotranscripción TTF: “Tumor-Treating Fields” EMT: Transición Epitelial-Mesenquimal PDGF: Factor de crecimiento epidérmico derivado de plaquetas FGFR2: Factor de crecimiento fibroblástico II mTOR: “mammalian target of Rapamycin” AMPK: “AMP-activated protein kinase” GDFs: Factores de Diferenciación Y Crecimiento. BMP: “bone morphogenic proteins” SARA: “Smad anchor for receptor activation” SBE: “SMAD Binding Element” FDA: “Food and Drug Administration NCCN: “National Comprehensive Cancer Network” VEGF-A: “Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular A” TTF: “Tumor-Treating Fields” TMB: ”Tumor Mutational Burden” TAMs: “Tumor Associated Macrophages” SMAD: “small mothers against decapentaplegic” GSC: Glioma Stem Cell NSC: Neural Stem Cells DAPK: death associated protein kinasa DAXX: Death Associated protein six TNF “Tumor Necrosis Factor” NF-kappaB: “Nuclear Factor kappa-lightchain-enhancer of activated B cells” PDGFRA “platelet-derived growth factor receptor A” 5 3 RESUMEN El Glioblastoma es el tumor cerebral primario más frecuente y agresivo del Sistema Nervioso Central. Presenta un pronóstico muy pobre, con una mediana de supervivencia menor a los 15 meses, y los costes en la sociedad rondan los 200.000 euros por paciente. Desde la publicación del Protocolo STUPP en el año 2005 ningún Fármaco ha mejorado la escasa mediana de supervivencia que logra el fármaco alquilante Temozolomida (menor del 5% a los 5 años) La ausencia de nuevas moléculas/estrategias efectivas en el tratamiento del GBM desde entonces en la práctica clínica justifica la investigación y búsqueda de nuevos compuestos. La superfamilia de la vía TGFb (Transforming Growth Factor Beta), tiene un papel crucial en la regulación de la transcripción de genes involucrados en la supervivencia, proliferación diferenciación y apoptosis celular en diferentes tejidos. Existen una serie de proteínas llamadas SMAD (Small Mothers Against Decapentaplegic) que actúan como transductores de los ligandos de la superfamilia de la vía TGFb (Transforming Growth Factor Beta), regulando su actividad. La superfamilia TGFb y las proteínas SMAD están desregulados en cáncer. Diferentes estudios teorizan que múltiples tejidos tumorales secretan unas moléculas anti-SMAD responsables en parte del aumento de la proliferación celular. Una de estas moléculas inhibidoras de SMAD es conocida como LEFTY, la cual está sobreexpresada en cáncer y parece regular la población de células madre en diferentes tumores. En esta Tesis hemos caracterizado la expresión de LEFTY, que parece estar sobreexpresada en la población de células madre de glioma y en biopsias clínicas de Glioblastoma. De hecho, sus altos niveles correlacionan con peor supervivencia de los pacientes postulándose como una novedosa y atractiva diana terapéutica. Mediante un anticuerpo monoclonal anti-LEFTY hemos inhibido esta proteína y observado que se produce una disminución de la proliferación y de la capacidad de auto-renovación celular y un aumento de la apoptosis y senescencia tanto en cultivos celulares de líneas tumorales convencionales como en células madre de glioma derivadas de pacientes. Estos resultados in vitro fueron ampliados a modelos animales in vivo donde hemos identificado que el anticuerpo monoclonal anti-LEFTY provoca una disminución en la capacidad tumorogénica de las células de Glioblastoma y que ejerce una acción sinérgica con el agente quimioterápico Temozolomida. En resumen, hemos demostrado que la vía LEFTY-SMAD está alterada en el Glioblastoma y que su inhibición reduce de manera drástica la actividad maligna de las células de glioma. Estos resultados postulan la inhibición de LEFTY como una estrategia terapéutica prometedora en el tratamiento de esta agresiva neoplasia del Sistema Nervioso Central. 6 4 ÍNDICE 1 AGRADECIMIENTOS ............................................................................................................... 1 2 ABREVIATURAS ...................................................................................................................... 3 3 RESUMEN .............................................................................................................................. 5 4 ÍNDICE .................................................................................................................................... 6 5 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 8 5.1 Generalidades del glioblastoma .................................................................................... 8 5.1.1 Definición y Epidemiología: ................................................................................... 8 5.1.2 Clasificación: .......................................................................................................... 9 5.2 Diagnóstico: ................................................................................................................. 15 5.2.1 Manifestaciones clínicas: .................................................................................... 15 5.2.2 Características radiológicas: ................................................................................ 16 5.3 Tratamiento ................................................................................................................. 18 5.3.1 Cirugía: ................................................................................................................ 18 5.3.2 Quimioterapia y Radioterapia: ............................................................................ 20 5.3.3 Valoración de la Respuesta al tratamiento: ........................................................ 21 5.3.4 Manejo terapéutico del Glioblastoma Recurrente ............................................. 25 5.3.5 Nuevas Terapias en el Glioblastoma ................................................................... 26 5.4 Biología molecular del glioblastoma ........................................................................... 30 5.4.1 Hallmarks del Glioblastoma ................................................................................ 30 5.4.2 Vía de señalización TGFB ..................................................................................... 44 5.4.3 LEFTY: .................................................................................................................. 48 5.4.4 Células Madre de Glioma .................................................................................... 53 6 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 55 7 MATERIAL Y MÉTODOS: ...................................................................................................... 56 7.1 Cultivo celular .............................................................................................................. 56 7.1.1 Líneas celulares: .................................................................................................. 56 7.2 Ensayos funcionales .................................................................................................... 57 7.2.1 Ensayo de formación de esferas y capacidad de auto renovación de células madre de Glioma (GNS)....................................................................................................... 57 7.2.2 Ensayo de diferenciación de Células Madre de Glioma (GNS) ............................ 58 7.2.3 Ensayo de viabilidad celular MTT ........................................................................ 58 7 7.2.4 Senescencia ......................................................................................................... 59 7.3 Ensayo de Carcinogénesis IN VIVO .............................................................................. 59 7.3.1 Generación de tumores subcutáneos ................................................................. 59 7.4 Análisis de la expresión de proteínas .......................................................................... 60 7.4.1 Extracción y cuantificación de proteína. ............................................................. 60 7.4.2 Western Blot ....................................................................................................... 60 7.4.3 Inmunofluorescencia ........................................................................................... 62 7.4.4 EdU (5-etinilo-2´-deoxiuridina): .......................................................................... 62 7.4.5 Inmunohistoquímica ........................................................................................... 63 7.4.6 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA.................................................................... 64 7.4.7 Análisis Estadístico .............................................................................................. 65 8 RESULTADOS ....................................................................................................................... 66 8.1 La expresión de las diferentes proteínas de la vía señalización LEFTY-SMAD es heterogénea en biopsias de glioblastoma. ............................................................................. 66 8.2 La sobrexpresión de LEFTY se asocia a una menor supervivencia en biopsias de Glioblastoma. .......................................................................................................................... 67 8.3 Los niveles de expresión de LEFTY están aumentados en líneas celulares de Glioblastoma y en líneas de células madre de glioma ............................................................ 70 8.4 LA EXPRESIÓN DE LEFTY Y SMAD CAMBIA EN FUNCIÓN DEL ESTADO DE DIFERENCIACIÓN CELULAR. ..................................................................................................... 71 8.5 La inhibición farmacológica de LEFTY disminuye la viabilidad de las células madre de Glioma y de las células de Glioblastoma ................................................................................. 73 8.6 La inhibición Farmacológica de LEFTY reduce las características tumorogénicas de las células madre de Glioma y de las células de Glioblastoma .................................................... 75 8.7 La modulación de la vía SMAD afecta a la capacidad de autorrenovación tumoral. .. 76 8.8 La inhibición Farmacológica de LEFTY reduce el crecimiento tumoral en modelos de experimentación animal ......................................................................................................... 77 8.9 El anticuerpo anti-LEFTY actúa de forma sinérgica con la Temozolomida reduciendo el volumen tumoral en modelos de experimentación animal ................................................ 82 9 DISCUSIÓN ........................................................................................................................... 84 10 CONCLUSIONES ............................................................................................................... 89 11 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 90 8 5 INTRODUCCIÓN 5.1 GENERALIDADES DEL GLIOBLASTOMA 5.1.1 Definición y Epidemiología: Los Gliomas son tumores que derivan de las células de la Glía, las cuales fueron descritas en 1850 por el patólogo Alemán Rudolf Virchow (Chvátal & Verkhratsky, 2018) Glía en Griego significa “cola“ , es decir , la neuroglia es el conjunto de células que ”unen“ a las Neuronas. Cumplen diversas funciones entre las que destacan soporte estructural y metabólico. En este grupo se encuentran los astrocitos , oligodendrocitos , microglía , ependimocitos y células de Schwann (Jessen, 2004) De cada uno de estas estirpes celulares se origina un tipo de tumor. (Astrocitoma, oligodendroglioma, ependimoma, etc) El Glioblastoma es un tumor derivado de la población astrocitaria de las células gliales. Es el tumor primario del SNC más frecuente en la población adulta. (Adamson et al., 2009) Representa más del 60 % de todos los tumores cerebrales en la población adulta(Rock et al., 2012) y entre el 3-15% en la población pediátrica (K. K. Das & Kumar, 2017).Su incidencia es de aproximadamente 3 por 100.000 habitantes en las diferentes series a nivel global en la población adulta (B. Chen et al., 2021; Hanif et al., 2017; Stupp et al., 2010) y 0.85 por cada 100.000 habitantes en la población pediátrica(K. K. Das & Kumar, 2017). Presenta una menor incidencia en países en vías de desarrollo aunque se cree que es debido a que está siendo infradiagnósticado respecto a los países más desarrollados (Ohgaki, 2009) Es más frecuente en hombres que en mujeres y su incidencia es mayor en la población caucásica. Se han reportado casos en todos los grupos de edad, sin embargo su pico de incidencia se sitúa entre los 55 y los 60 años de edad (B. Chen et al., 2021; K. K. Das & Kumar, 2017; Ohgaki, 2009) El pronóstico de estos pacientes es muy pobre siendo la mediana de supervivencia de aproximadamente 15 meses tras realizar el tratamiento según el protocolo STUPP (Rock et al., 2012; Stupp et al., 2005; Thakkar et al., 2014). Solamente un 4,7 % de los pacientes presentan una supervivencia mayor a 5 años (Ostrom et al., 2013) y menos de un 1 % de los pacientes viven más de 10 años tras el diagnóstico (Tykocki & Eltayeb, 2018) 15 5.2 DIAGNÓSTICO: 5.2.1 Manifestaciones clínicas: Los pacientes con tumores cerebrales pueden presentar diferentes signos y síntomas dependiendo de la localización de este, del tamaño, de la velocidad de crecimiento del tumor y del edema que genere. El síntoma más frecuente es la cefalea, generalmente holocraneal que se intensifica durante el descanso nocturno del paciente. Con frecuencia los pacientes y familiares consultan debido a embotamiento mental, desorientación, confusión, alteraciones de memoria, alteraciones del equilibrio y cambios en la personalidad. También se pueden dar déficits neurológicos como alteraciones sensitivas y déficits de fuerza en extremidades. Alteraciones del lenguaje son frecuentes cuando la localización del tumor se encuentra cercana a las áreas motoras y sensitivas del lenguaje. Otra forma de presentación pueden ser las crisis comiciales parciales o complejas. La presentación clínica de estos tumores suele ser rápida y generalmente la evolución de la clínica desde su inicio hasta que es diagnosticada no suele superar los 6 meses(Stark et al., 2012) En cuanto a la localización, el 95 % de los tumores se originan a nivel supratentorial. El lóbulo más afectado es el frontal ( 43% ) seguido del temporal (28%) , parietal(25%) y occipital (3%)(Ali Kahn et al., 2003; Larjavaara et al., 2007) Aunque su prevalencia a nivel infratentorial es muy escasa , también pueden originarse en troco cerebral , cerebelo y médula espinal. (Hur et al., 2008; Malik et al., 2017; Timmons et al., 2018) Figura 4: Localización del Glioblastoma en el SNC. Más del 95 % de los Glioblastomas se dan a nivel supratentorial y solamente un 3-4 % se dan a nivel infratentorial. Figura creada con Biorender.com 16 5.2.2 Características radiológicas: Tras la sospecha clínica de lesión ocupante de espacio en el parénquima cerebral se realiza una TC (Tomografía Computarizada) para confirmarlo. El glioblastoma se comporta como una lesión situada a nivel subcortical, heterogénea , hipodensa , de forma ovoide irregular, con edema vasogénico perilesional abundante que suele causar desplazamiento de estructuras vecinas y de línea media. El centro de dicha lesión se muestra más hipodenso que la periferia y existe una captación de contraste yodado abigarrada (H. Singh et al., 2002) Hoy la prueba diagnóstica más usada y que más información aporta al clínico en los primeros pasos del manejo de este tumor cerebral es la RM (Resonancia Magnética) Además de en el diagnóstico, es una pieza clave en el seguimiento del enfermo tras el tratamiento (lo veremos en detalle más adelante). El Glioblastoma se comporta como una lesión hipointensa en las imágenes potenciadas en T1 e hiperintenso en las imágenes potenciadas en T2. En la secuencia FLAIR (“increased T2-weighted Fluid-Attenuated Inversion Recovery”), el Glioblastoma también se aprecia hiperintenso comparado con el con el tejido sano circundante . Dicha secuencia elimina la señal que proviene del LCR (líquido Cefaloraquídeo ) y muestra el edema causado por la microinfilatración tumoral en el tejido circundante. El volumen FLAIR pretumoral parece no asociarse con la Supervivencia pero sí lo hace el volumen FLAIR postradioterapia (Garrett et al., 2017; Grossman et al., 2017) La disrupción de la BHE ( barrera hematoencefálica )producida por la lesión se hace patente al visualizar la captación de Gadolinio en la RM. Presenta , al igual que en el escáner una captación variable que va desde la captación en anillo más o menos esférico a la captación abigarrada y desestructurada (Nelson & Cha, 2003) Como sabemos la perfusión sanguínea de estas lesiones está aumentada en estas lesiones y esto lo podemos valorar mediante secuencias DSC ( Dynamic susceptibility contrast ) en las cuales se valora el spin eco que genera en paso de contraste ( Gadolinio) antes durante y después en la zona dónde se encuentra la lesión. Así se puede valorar el rCBV (volumen de fujo sanguíneo cerebral relativo) que está muy aumentado en los tumores cerebrales de alto grado como el Glioblastoma (Boxerman et al., 2016). La RM funcional y la secuncias DTI que permiten realizar tractografías y localizar áreas del cerebro altamente elocuentes han permitido aumentar el grado de resección quirúrgica de dichas lesiones (Abdullah et al., 2013) (Shukla et al., 2017) La MRSI ( Magnetic resonance spectroscopic image) es una técnica que permite determinar la cantidad de un determinado metabolito en una determinada región al ser sometido un tejido a una onda electromagnética. El Glioblastoma presenta generalmente una disminución de N-acetilaspartato (metabolito que disminuye al haber pérdida o daño neuronal) , una aumento de la Colina, la cual aumenta ante la proliferación celular. El Lactato está aumentado en regiones donde predomina la hipoxia y los Lípidos en regiones de necrosis. (Shimizu et al., 1996) Más adelante veremos como estas novedosas técnicas de imagen presentan un papel fundamental en el seguimiento de los pacientes con Glioblastoma después del tratamiento. 17 Figura 5: Imágenes de Tomografía Computerizada urgente de dos paciente del H.U.D que acudieron al Servicio de Urgenicas por Cefalea y focalidad neurológica A):TC sin contraste en el que se parecía LOE frontal derecha con importante edema vasogénico y compresión de astas frontales derechas. B) y C) : TC sin y con contraste yodado en el que se aprecia LOE localizada a nivel de atrio ventricular con captación de contraste en anillo, centro necrótico y edema perilesional. Figura 6: Imágenes de Resonancia Magnética de un paciente del H.U.D. A) Secuecia T1 con Gadolinio cortes coronal y axial. Se aprecia LOE frontal derecha con captación de contraste en anillo , centro hipointenso y edema vasogénico perilesional. B) Secuencia Flair corte coronal. Hiperintensidad de la lesión y abundante edema vasogénico circundante. C) Estudio de Perfusión sobre una secuencia T1-GAD. Se aprecian elevadas ratios de perfusión , compatible con Glioblastoma 18 5.3 TRATAMIENTO Tras la confirmación de la sospecha clínica mediante las pruebas de imagen anteriormente comentadas se da inicio al tratamiento, el cual se asienta sobre tres pilares fundamentales; cirugía, la cual debe lograr la máxima resección tumoral posible que sea segura, radioterapia: en total 60 Gy y Quimioterapia: Temozolomida, usada inicialmente simultánea con la RT y posteriormente de forma adyuvante (Stupp et al., 2005). 5.3.1 Cirugía: Hemos de tener en cuenta una serie de consideraciones preoperatorias. Debido al gran edema vasogénico que estas lesiones presentan,en la actualidad, se lleva a cabo un tratamiento con Glucorticoides (generamente Dexametasona 4 mg cada 8 horas ) Dicha sustancia actúa sobre los canales de K + alterando la permeabilidad de los capilares peritumorales y mejorando el aclaramiento de agua extracelular de la barrera hematoencefálica (Cenciarini et al., 2019). De este modo conseguimos una adecuada relajación del parénquima cerebral y por tanto una cirugía más segura. Es importante saber que los Glucocorticoides presentan una elevada morbilidad ya que presentan efectos secundarios como miopatía, metabolismo anormal de la glucosa, complicaciones gastrointestinales, irritabilidad, ansiedad, insomnio y está relacionado con un alto riesgo de infección por neumonía (Kostaras et al., 2014). Además se ha visto que la Dexametasona induce un aumento de la proliferación y angiogénesis in vitro e in vivo de la población de GSC (Glioma Stem Cells) (Aldaz et al., 2020; Luedi et al., 2018) por lo que cada vez se cuestiona más su uso en el tratamiento del Glioblastoma. En cuanto a los fármacos antiepilépticos son recomendables siempre que se vaya a realizar estimulación cortical o subcortical debido a alto riesgo de crisis comiciales intraoperatorias. Tras la cirugía, se debe llevar a cabo una pauta descendente hasta su retirada. Si el paciente no ha presentado crisis no está indicado el tratamiento profiláctico (Glantz et al., 2000). Los objetivos de la cirugía en el Glioblastoma son: máxima resección segura, obtención de tejido para realización de diagnóstico anatomopatológico , mejora de las condiciones para optar a QMT y RT , retraso del empeoramiento clínico y mejora de la calidad de vida del paciente .En cuanto a los predictores de buen pronóstico relacionados con el tratamiento del Glioblastoma , el grado de resección es el más importante de todos. Cuanto mayor es el grado de resección tumoral mayor es la supervivencia de estos pacientes, siendo los que alcanzan una mayor supervivencia los que presentan GTR (Gross Total Ressection) seguidos de RT (radioterapia) y TMZ (Temozolomida). La resección tumoral debe ser mayor al 74 % de la masa para que la resección tenga un efecto significativo en la supervivencia (Y. M. Li et al., 2016; Wolbers, 2014) sin que el paciente presente un deterioro de la función neurológica. Para conseguir este objetivo contamos con técnicas quirúrgicas y herramientas intraoperatorias que nos ayudan a conseguir una cirugía más segura. Una de estas es la resección quirúrgica con mapeo funcional intraoperatorio ya sea con el paciente dormido o despierto que nos permite valorar dónde se localizan ciertas áreas elocuentes como la regiones del lenguaje, cálculo, lectura, escritura, motoras, sensitivas, etc. (Lowenstein & Castro, 2012). Existen sustancias fluorescentes que nos permiten visualizar restos tumorales en los márgenes quirúrgicos. El 5 ALA (5-aminolevulinic acid) es un aminoácido precursor del grupo hemo que se le da al paciente que va a ser intervenido 6 horas antes de la cirugía a una dosis de 20 mg/Kg. Las células tumorales lo metabolizan en la mitocondria produciéndose protoporfirina IX , cuando estas células son expuestas a una luz azul con una longitud de onda 400-410 nm , debido a la gran cantidad de PP IX que acumulan desprenden fluorescencia roja y pueden distinguirse del parénquima cerebral 19 sano incrementando la GTR y por tanto la Supervivencia (Certo et al., 2020; Waqas et al., 2017). Existe otra sustancia fluorescente perteneciente al grupo de los Xantenos conocida como Flouresceína Sódica. Su uso en Neurocirugía se remonta al año 1948. Se aplica por vía intravenosa en el momento en el que se incide la piel del paciente. Esta sustancia viaja en el torrente sanguíneo y pasa a la matriz extracelular del parénquima cerebral en las áreas en dónde la BHE está dañada, siguiendo el mismo mecanismo de actuación que el contraste de la RM, el Gadolinio. Esta sustancia absorbe luz y emite una luz de unos 560 nm de longitud de onda que puede ser vista por el ojo humano empleando unos filtros específicos. De este modo , veremos que el área tumoral será fluorescente mientras que el tejido sano no lo será , guiándonos de este modo en la resección (Bömers et al., 2020; Della Puppa et al., 2019). Otra herramienta fundamental en el quirófano es el Navegador. Dicho instrumento consiste en un ordenador en el cual introducimos un estudio de imagen determinado del paciente que vamos a operar y un equipo de seguimiento, óptico o magnético, que nos permite mostrarle a la computadora dónde están en el espacio determinados puntos del estudio de imagen. De este modo durante la cirugía podremos saber en todo momento en qué región del parénquima cerebral nos encontramos respecto al estudio de imagen introducido , permitiéndonos realizar cirugías más seguras , y con unos márgenes de resección mayores (Gerard et al., 2017). Figura 7: A: Lesión temporal derecha sugestiva de Glioma de alto grado de paciente del Hospital Universitario de Donostia B: Colocación quirúrgica del paciente: Decúbito supino, cabeza fijada a la mesa quirúrgica con cabezal de Mayfield y lateralizada hacia la izquierda. C: Una vez realizada la craneotomía y durotomía se aprecia corteza cerebral sana y corteza cerebral tumoral (flecha azul) D: Misma imagen que la anterior pero vista con modo que permite ver la luz amarilla de la Fluoresceína tras ser expuesta a luz azul de 494nm en las zonas dónde la BHE está rota. E: Quirófano de Neurocirugía del H.U.D F: Resección quirúrgica macroscópicamente completa. Lecho tumoral (flecha verde) 20 5.3.2 Quimioterapia y Radioterapia: Tras la cirugía, el postoperatorio y la comprobación de la correcta cicatrización de las heridas quirúrgicas se lleva a cabo el tratamiento complementario , cuyos pilares fundamentales son la Quimoterapia (con Temozolomida) y la Radioterapia (Radiación X). La Temozolomida es un agente alquilante, que de forma espontánea, al entrar en contacto con un PH mayor a 7 se hidroliza en su forma activa. Es liposoluble y atraviesa la BHE. Su mecanismo antiproliferativo consiste en la adición de un grupo alquilo ( CnH2n+1 ) al extremo O o N de una base Nitrogenada del ADN. En concreto la forma activa de la TMZ añade grupos Metilo (CH3) al O6 de la Guanina. De esta forma se interrumpe la transcripción y replicación del ADN. (Strobel et al., 2019; Tsang et al., 1991) La radioterapia consiste en el empleo de radiaciones ionizantes, generalmente Rayos X , para dañar las células tumorales. Para ello se emplea un acelerador médico lineal que se encarga de acelerar fotones para que estos choquen contra un metal pesado y generar rayos X que serán conformados y dirigidos de forma específica contra el tumor a tratar. Dicha radiación produce la ionización de ciertas moléculas de la célula, radicales libre y alteraciones en el ADN y muestro celular. Estos efectos son mucho mayores en las células que están proliferando que en las que están quiescentes. (Dunne-Daly, 1999) La máxima dosis de radiación que el cerebro puede tolerar son 20-25 Gy en una sola dosis o 60 Gy si se da de forma fraccionada.(Smart, 2017) El protocolo de tratamiento que se utiliza en la actualidad después de lograr la máxima resección segura consiste en dar 60 Gy de Radioterapia de forma fraccionada en 6 semanas, es decir,30 días de tratamiento en los que cada día se dan 2 Gy de radiación de forma concomitante con TMZ 75mg/m2 al día, diariamente, durante 6 semanas. Tras un mes de descanso se inicia una segunda etapa de tratamiento con TMZ en monoterapia 150-200mg/m2 diariamente durante 5 días cada 28 días durante 6 ciclos. Este protocolo ha mostrado una aumento de la mediana de supervivencia (de unos dos meses de media) respecto al tratamiento con Radioterapia exclusivamente en diferentes estudios.(Feng et al., 2017; Szczepanek et al., 2013; Stupp et al., 2005) Tras la finalización de este protocolo de tratamiento las guías NICE : “ National Institute for Health and Care Excellence” recomiendan la realización de RM de control cada 3-6 meses durante los primeros dos años, cada 6-12 meses hasta los 5 años y anualmente a partir de los 5 años de la finalización del tratamiento. El 50 % de los pacientes presentarán progresión o recurrencia a los 6.5 meses desde la finalización del protocolo STUPP(Stupp et al., 2005) Figura 8: Esquema del tratamiento del Protocolo Stupp: TMZ+RT concomitante durante 6 semanas + 6 ciclos de 5 días de TMZ cada 28 días. 21 Figura 9: A: Sala de radioterapia. B: Estudio de planificación de radioterapia en paciente con Glioblastoma frontal. Imágenes cedidas por cortesía del Servicio de Oncología Radioterápica del Hospital Universitario de Donostia. 5.3.3 Valoración de la Respuesta al tratamiento: En 1990 Macdonald publicó una serie de criterios que permitían valorar la respuesta al tratamiento de los Gliomas de alto grado de una forma objetiva. (Macdonald et al., 1990).Los criterios basan en la valoración de tres pilares: mediciones de los diámetros perpendiculares de la región captante de contraste en TAC (Tomografía Axial Computerizada) o RM (Resonancia Magnética), el incremento o disminución de la dosis de Corticoides y los cambios en la exploración neurológica. Es decir, un criterio radiológico (CT O RM) criterio clínico (estado neurológico) y criterio farmacológico (dosis de corticoides). Debemos saber que los estudios de imagen se comparan con el estudio de imagen justamente posterior a la máxima resección quirúrgica. En función de dichas variables los pacientes se asignaban a 4 grupos de respuesta al tratamiento: Respuesta completa, en la cual se aprecia una desaparición de la captación de contraste junto con una estabilidad o mejoría del estado neurológico en ausencia de corticoterapia; Respuesta parcial, en el cual se aprecia reducción igual o superior al 50 % del volumen de tejido captante de contraste, y estabilidad del estado neurológico y de la dosis de corticoterapia; Progresión de enfermedad o incremento en el 25 % del volumen captante, empeoramiento del estado neurológico y estabilidad o aumento de corticoterapia; Enfermedad estable o cualquier otra escenario diferente a los comentados anteriormente. Los criterios de Mcdonald fueron ampliamente empleados, pero presentaban una serie de limitaciones que comentaremos a continuación: En ocasiones, tras el tratamiento con Quimio-Radioterapia en la RM se aprecian captaciones de Gadolinio mayores a las existían en la RM postoperatoria que desaparecen con el paso de los 22 meses y que no tiene que ver con progresión tumoral, si no con el daño de la radiación al tejido cerebral. Este escenario se conoce como Pseudoprogresión y no es tenida en cuenta en los criterios de Macdonald. El Bevacizumab, anticuerpo monoclonal anti VEGF-A, produce una disminución de la permeabilidad capilar. Esto hace que la captación de contraste se mantenga estable o disminuya de una forma muy eficaz. Sin embargo, hasta en un 40 % de los pacientes esta estabilidad o disminución en la captación de contraste está acompañada de un incremento del volumen tumoral visto en secuencias T2/FLAIR. (Delgado-López et al., 2018). Este escenario se conoce como Pseudorespuesta y tampoco está considerado en los criterios de Mcdonald. Para dar respuesta a las limitaciones de los criterios anteriormente mencionados se estableció en el año 2010 un grupo de trabajo multidisciplinar en el que estaban incluidos Radiólogos, Oncólogos, neurólogos , Neurocirujanos y Neuropsicólogos conocido como grupo RANO (Response Assessment in Neuro-Oncology) (Wen et al., 2010). Los cambios más importantes introducidos fueron: • La definición de lo que era medible radiológicamente y lo que no: se define como enfermedad medible cuando se pueden delimitar por RM los diámetros máximos perpendiculares entre sí de al menos una lesión que mida 10mm, visible en dos o más cortes axiales de 5mm. • La valoración de la secuencia T2/FLAIR además del T1-Gadolinio. • La introducción de los conceptos Pseudorespuesta y Pseudoprogresión. Se establecieron 4 grupos de respuesta que pasamos a describir a continuación: Respuesta Completa (RP): Se tienen que dar todas las condiciones que siguen a continuación 1. Desaparición completa de todas las lesiones con captación de contraste, medibles y no medibles, durante al menos 4 semanas 2. No aparición de nuevas lesiones. 3. Estabilidad o mejoría de las lesiones sin captación de contraste(T2/FLAIR) 4. El paciente debe estar sin corticoterapia y presentar mejoría o estabilidad neurológica. Respuesta Parcial (RP): Se tienen que dar todas las condiciones que siguen a continuación 1. Reducción del 50 % o más de la suma de los productos de los diámetros mayores transversales de todas las lesiones captantes durante al menos 4 semanas. 2. No progresión de lesiones no medibles 3. No aparición de nuevas lesiones 4. Estabilidad o mejoría de lesiones sin captación de contraste (T2/FLAIR) mientras el paciente tiene una dosis de corticoides igual o inferior a las que presentaba cuando se realizó la RM basal. 5. El paciente debe presentar estabilidad o mejoría clínica. 23 Enfermedad Estable: 1. Estabilidad de las lesiones no captantes (T2/FLAIR) mientras el paciente se encuentra con dosis de glucocorticoides iguales o menores a las que presentaba cuando se realizó la RM basal. Progresión de Enfermedad: Se tiene que dar CUALQUIERA de las siguientes: 1. Incremento del tamaño de las lesiones captantes del 25 % en comparación con la menor lesión captante de la RM basal o con la mejor respuesta obtenida. 2. Incremento en tamaño de las lesiones no captantes (T2/FLAIR) mientras el paciente presenta dosis estables o incrementadas de glucocorticoides comparado con la RM basal 3. Cualquier nueva lesión 4. Deterioro clínico que solamente se pueda explicar por la progresión tumoral. 5. Necesidad de incrementar dosis de glucocorticoides. Figura 10: Ejemplo de Pseudorespuesta: Imagen de RM de paciente con Glioblastoma frontal derecho del H.U.D antes (A) y después (B) de tratamiento con Bevacizumab. Secuencias T1-Gad y Flair. En la imagen B se observa una disminución en la captación de gadolinio y un aumento en el volumen de tejido hiperintenso en el Flair en comparación con la imagen A. Típica imagen de pseudorespuesta tras manejo con Bevacizumab. 24 Figura 11: Ejemplo de Progresión Radiológica: Imagen de RM de paciente con Glioblastoma parietal izquierdo del H.U.D. Secuencias T1-Gad y Flair. En la imagen B se observa aumento de la captación de gadolinio y un aumento en el volumen de tejido hiperintenso en el Flair en comparación con la imagen A. 31 • Adquisición de alteraciones en los receptores de la superficie celular: Este mecanismo implica que los receptores de la superficie celular, normalmente Tirosina Kinasa, que transducen las señales de crecimiento hacia el circuito citoplasmático, están sobreexpresados Esta sobrexpresión consigue que la célula puede sobreproliferar incluso con un nivel ambiental normal de FG. Los receptores también pueden sufrir alteraciones estructurales que conducen a la señalización de crecimiento independiente del ligando. Como ejemplo de receptores de superficie celular alterados tenemos al • EFGR (Epidermal Growth Factor Receptor). Este es un receptor transmembrana del tipo tirosin quinasa perteneciente a la familia de receptores ErbB ( EGFR , HER2/neu , Her 3 y Her 4 ) cuyo gen se encuentra localizado en el cromosoma 7p12 (H. Zhang et al., 2007). Este receptor puede ser activado por varios ligandos entre los que se encuentran EGF y TGFα. Tras dicha activación se fosforilan los residuos de Tirosina produciéndose una activación de la vía MAPK, lo que , tras la activación en cadena de diferentes proteínas intracelulares, conlleva a la activación del complejo mTOR y la inactivación de P27 lo que produce el aumento de la proliferación , supervivencia y síntesis de ADN celular(Narita et al., 2002; Tanaka et al., 2011). Existen diferentes tipos de alteraciones del EGFR: La sobreexpresión de este receptor se da en el 2289 % de los astrocitomas de grado IV, y consiste en un aumento de la trascripción del gen sin que exista alteraciones en el ADN. Las amplificaciones se observan en el 34-64% de los astrocitomas de grado IV, siendo la polisomía del cromosoma 7 la más frecuente alteración del número de copias de EGFR en Gliomas. Dichas amplificaciones ocurren en 57,4% de los GBM primarios , mientras que solamente se dan en el 8 % de los secundarios (C. W. Brennan, Verhaak, McKenna, Campos, TCGA Research Network, et al., 2013; Maire & Ligon, 2014) Las delecciones de determinados dominios de extracelulares del EGFR dan lugar a cinco variantes de las cuales dos son Oncogénicas : EGFR vII (delección de exones 14 y 15) y EGFR vIII (delección de exones 15-15) Siendo esta última la más frecuentes(An et al., 2018). En diferentes estudios se ha valorado la expresión de EGFR como marcador pronóstico de la enfermedad o de respuesta a tratamiento en casos de administración de EGFR ITKs (Erlotinib, Gefitinib) o anticuerpos monoclonales contra EGFR (Cetuximab, Nimotuzumab) sin embargo muestran resultados contradictorios y por lo tanto el estatus de EGFR como marcador clínico es controvertido (Saadeh et al., 2018). 32 Figura 12: La activación del EGFR desencadena señales que promueven proliferación y supervivencia celular. • Adquisición de alteraciones en los componentes del circuito citoplasmático de las principales vías de señalización del crecimiento celular: Tras la activación de un receptor celular se produce una activación de moléculas citoplamáticas que son las encargadas de la transducción de la señal. En ocasiones las células tumorales presentan alteraciones a este nivel lo que genera que se puedan activar señales proliferativas sin la estimulación continua de los receptores. La principal cascada mitogénica está constituida por SOS-Ras-Raf -MAPK entre otros. Una cuarta parte de todos los tumores humanos presentan alteraciones en las proteínas RAS. El 2 % de los Glioblastomas presentan mutaciones en las diferentes proteínas RAS. (C. W. Brennan, Verhaak, McKenna, Campos, McLendon, et al., 2013; Holmen & Williams, 2005; The Cancer Genome Atlas Research Network, 2008). 5.4.1.2 Evasión de los supresores de Crecimiento: El ciclo celular en un tejido normal consta de cuatro fases: Fase G1en la cual la célula crece de tamaño y duplica orgánulos pero no cambia el contenido genética. Fase S en la cual la célula duplica el material genético. Fase G2 la célula aumenta su tamaño y se prepara para la fase M (mitosis y citocinesis). Después de la fase M, la célula puede mantener la fase inicial G1 o pasar al estado de reposo G0, saliendo del ciclo celular Fig 13 33 Las células normales reciben señales antiproliferativas para mantener la inactividad celular y la homeostasis tisular. Todas estas señales son que impiden que la célula pase de la fase G1 a la fase S son procesadas principalmente por la proteína del retinoblastoma (pRB) que forma parte de la vía p16INK4a ⁄CDK4 ⁄ RB1.Esta vía funciona de la siguiente manera: Cuando la pRB está hipofosforilada , bloquea a los factores de transcripción E2F responsables del paso de la célula de la fase G1 a la fase S. p16INK4a se encarga del bloqueo a las CDK que son las que fosforilan a p RB, impidiendo su función como supresor de tumores (Fåhraeus et al., 1996). Las mutaciones en esta vía se encuentran en el 50 % de los Glioblastomas primaries y en el 40 % de los secundarios (Biernat et al., 1997) En el estudio del TCGA (The Cancer Genoma Atlas) el 78 % de las muestras de Glioblastoma presentaban mutaciones en la vía de señalización de p RB (The Cancer Genome Atlas Research Network, 2008). Figura 13: Fases del Ciclo Celular. Creado con BioRender.com 5.4.1.3 Activación de invasión y metástasis: Las metástasis a distancia en el Glioblastoma son extremadamente raras , se dan en menos del 0,5 % de los pacientes y se cree que es debido a una suma de factores : la rápida progresión tumoral sumado al aislamiento del SNC del resto del organismo gracias a la BHE (Rossi et al., 2020) Sin embargo la invasión de zonas cerebrales adyacentes al tumor es frecuente y se produce en poco tiempo. Las células de Glioblastoma presentan una expresión disminuida de Conexina 43, una de las proteínas fundamentales en el correcto funcionamiento de las uniones celulares GAP o en hendidura. Esta alteración de las uniones entre células tiene un papel importante en la capacidad invasiva de este tumor (Aftab et al., 2015) Un mecanismo fundamental en el proceso de invasión tumoral del Glioblastoma es la Transición EpitelialMesenquimal (EMT) de las células tumorales. A continuación, daremos unas pinceladas sobre este concepto. La EMT es un proceso biológico mediante el cual células polarizadas epiteliales, adheridas a la membrana basal, se desprenden de dicha membrana basal y adquieren características de células mesenquimales. Como hemos dicho, es un proceso biológico que ocurre de forma natural en el organismo durante la embriogénesis , en la cual las células epiteliales adquieren la movilidad necesaria para la gastrulación y la formación de la cresta 34 neural (Knecht & Bronner-Fraser, 2002) y durante el proceso de cicatrización de las heridas. La EMT se produce también en células de diferentes tumores y les permite adquirir características más favorables para la invasión y metástasis. Este proceso parece ser reversible y estar muy influenciado por el microambiente tumoral (Dumont et al., 2008) La hipoxia tisular y el proceso inflamatorio del entorno tumoral activan una serie de cambios epigenéticos que desencadenan la EMT (Charles et al., 2011) En concreto parece que la la hipoxia tisular y la llegada de células inflamatorias desencadenan la liberación de TGFb , factor de crecimiento epidérmico derivado de plaquetas ( PDGF) y Factor de crecimiento fibroblástico II (FGFR2) que desencadena la activación de una serie de factores de transcripción como son Twist , Snail , Slug , Zeb etc. requeridos para el inicio de la EMT (Nagaishi et al., 2012). Tras este proceso las células tumorales pierden la E-caderina (glucoproteína que participa en la formación de las uniones intercelulares) y se desanclan de la matriz , adquiriendo gran capacidad de movilidad, de invasión y presentando mayor Resistencia a los agentes genotóxicos y a la apoptosis (Dongre & Weinberg, 2019; Iwadate, 2016; Kalluri & Weinberg, 2009). 5.4.1.4 Inmortalidad Replicativa Las células humanas presentan una capacidad finita de división. Si dejamos en una placa de cultivo células dividiéndose veremos qué pasado cierto tiempo presentarán un stop de ese proceso replicativo. Ese primer punto de control es el que conocemos como senescencia replicativa ejercido sobre todo a través de las vías de p 53 y de p16/ Ink4a (Collado et al., 2007). Si alteramos las vías anteriores de forma que la célula pueda seguir dividiéndose todavía más llegará un punto en el que se producirá una muerte celular masiva en nuestra placa de cultivo. En ocasiones, una célula de ese cultivo (1 de 10 7 ) escapa a esa muerte celular masiva y continua dividiéndose de forma ininterrumpida. Decimos que esa célula se ha inmortalizado (Irfan Maqsood et al., 2013) Lo que hace que las células humanas presenten una capacidad finita de división son los Tolómeros.Estos son estructuras de recubrimiento situadas al final de los cromosomas circulares de los organismos eucariotas. Consisten en secuencias de 6 nucleótidos (TTAGGG y su complementario) que se repiten en tándem unas 2000 veces. Su función es la de dar estabilidad a los cromosomas , evitar que estos se fusionen , protegiendo así los genes (Hug & Lingner, 2006). La replicación del ADN produce un acortamiento de los telómeros debido a la imposibilidad de la ADN polimerasa 3 de añadir pares de bases al extremo 5´. Cuando el telómero es demasiado corto se producen errores en la replicación que llevan a la célula a la senescencia replicativa. Uno de los mecanismos de escape de la senescencia replicativa de las céulas tumorales consiste en la ampliación de estas estructuras. Esto ocurre debido a mutaciones en • TERT, ATRX, DAXX: La Telomerasa es una ribonucleoproteína transcriptasa inversa. Se encarga de ampliar los telómeros para evitar su degradación y que así la célula pueda seguir dividiéndose al añadir desoxiribonucleótidos a los extremos de los telómeros. Presenta un componente ribonucleotídico (TER) y un componente proteico (TERT) que 35 es el que tiene la actividad Transcriptasa Inversa. Es en el promotor de esta subunidad (TERTp) dónde se hallan las mutaciones que originan una telomersa hiperactivada que permite que las células tumorales escapen a la Senescencia replicativa (O’Sullivan & Karlseder, 2010) Existen dos tipos mutaciones en este gen ( C228T y C250T), son mutuamente excluyentes y se encuentran hasta en el 80 % de todos los gliomas y en el 50 % de los Glioblastomas(Eckel-Passow et al., 2015; Olympios et al., 2021) En cuanto a TERTp como factor pronóstico independiente los estudios son contradictorios y hay evidencia tanto a favor como en contra. En la actualidad las terapias dirigidas contra TERTp están siendo investigadas y aún no hay ningún fármaco comercializado(Hewer et al., 2017; Pekmezci et al., 2017). Además del alargamiento de los telómeros dependientes de la Telomerasa existe una vía alternativa mediante la cual la célula tumoral consigue alargar los telómeros a través de un mecanismo independiente de la telomerasa. Dicho mecanismo se denomina ALT(“ alternative lengthening of Telomers”) y está presente en el 75 % de los Glioblastomas secundarios que presentan expresión normal de Telomerasa y TERT WT(Fan et al., 2019) La ATRX , también conocida como Helicasa ATRX dependiente de ATP o Helicasa II ligada al cromosoma X es una proteína remodeladora de los complejos de cromatina que junto a DAXX (“death-domain-associated protein”) añade la histona H3.3 a la cromatina nuclear impidiendo el proceso ALT.(De La Fuente et al., 2011; Haase et al., 2018). Figura 14: Debido a la imposibilidad de la ADN Polimerasa 3 de añadir pares de bases en el segmento 5´, se produce un acortamiento progresivo de los extremos de los telómeros. La telomerasa es la enzima que se encarga de añadir pares de bases al extremo 5´. Figura Creada con BioRender.com 36 5.4.1.5 Inducción de la angiogénesis: Todas las células del organismo requieren estar situadas a una distancia de menos de 150 micras de un capilar para poder llevar a cabo sus requerimientos homeostáticos (Bryant, 1984) Durante la embriogénesis se produce el desarrollo de nuevas células endoteliales que se agrupan formando una estructura vascular (vasculogénesis) además del brote de nuevos vasos sanguíneos a partir de los ya formados (angiogénesis) Este proceso se mantiene quiescente durante nuestra edad, salvo que se necesite la formación de nuevos vasos como puede ser en procesos de adaptación fisiológica al deporte o en el caso de autoreparación tisular (Papetti & Herman, 2002). Este balance se mantiene mediante la correcta regulación de factores pro y antiangiogénicos que se unen a receptores de las células endoteliales. Durante la tumorogénesis, en un estado temprano del desarrollo tumoral, se produce un cambio angiogénico que altera el balance a favor de las sustancias angiogénicas. El VEGF (Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular) y el FGF 1 y 2 son las principales proteínas que tras unirse a receptores Tirosin-Kinasa de las células endoteliales estimulan la vasculogénesis y angiogénesis. Por la contra TSP-1 es un péptido que se une al receptor CD36 de las células endoteliales impidiendo su proliferación y migración (Hanahan & Folkman, 1996). La hipoxia del microambiente del Glioblastoma estimula la liberación de VEGF por las células tumorales, la vasculogénesis y la angiogénesis. Estudios recientes indican que las Glioma Stem cells, además de sus conocidas capacidades (Ahmed et al., 2013) (gran capacidad de autorrenovación, capacidad de formación de tumores tras xenotransplante, resistencia a quimioterapia y radioterapia) tienen un papel fundamental en la formación de nuevos vasos intratumorales ya que sufren un cambio fenotípico y derivan en células endoteliales y pericitos (S. Das & Marsden, 2013). 5.4.1.6 Evasión de la muerte celular: La capacidad de un tumor para expandirse no solo viene determinada por la capacidad de sus células para proliferar sino por la capacidad de sus células de evadir la muerte celular programada. La resistencia a la apoptosis es una característica que se da en todos los tipos tumorales (Hanahan & Weinberg, 2000) La apoptosis consiste en la inactivación de una célula o grupo de células de una forma controlada de forma que tras la activación de este proceso las membranas celulares se rompen, el citoplasma y los esqueletos nucleares se descomponen, el citosol se extruye, los cromosomas se degradan y el núcleo se fragmenta, todo en un lapso de 30 a 120 min.(Wong, 2011) La maquinaria apoptótica está constituida por una serie de sensores que monitorizan las señales intra y extracelulares y una serie de efectores que desencadenan la respuesta. En cuanto a los sensores que reciben señales de extracelulares tenemos a ligandos que emiten señales de supervivencia como IGF1 , IGF2 e IL3 y sus correspondientes receptores transmembrana, y ligandos que emiten señales de muerte celular programado como son TNF alfa y FAS. En el interior celular tenemos sensores que monitorizan el estado de la célula, el más conocido es • P53, el guardián del genoma: Este sensor está localizado en el cromosoma 17p13.1. y codifica la proteína p53 la cual está compuesta por 293 aminoácidos y tiene un peso molecular de 53KDa. Dicha proteína funciona como factor de transcripción y está formada por diferentes dominios. El dominio de mayor tamaño (98 residuos) es el que se une al ADN y el que acumula el mayor número de mutaciones de este gen en el GBM. Los otros dominios se comunican con vías que regulan su actividad transcripcional. 37 (Joerger & Fersht, 2008). La función de P 53 consiste en mantener la integridad del genoma respondiendo a estímulos nocivos (daño del ADN celular, genotoxiciadad, activación de señales de crecimiento aberrantes, activación de oncogenes) promoviendo detención del ciclo celular , senescencia y apoptosis. Además, p53 presenta un papel importante en la regulación del metabolismo celular, autofagia , invasión , metástasis , microambiente e inmunidad (Kastenhuber & Lowe, 2017). Antes de pasar a describir las mutaciones que más frecuentemente se dan en la vía P53 debemos explicar brevemente el funcionamiento de la vía p53-ARF-MDM2/4: Cuando un estímulo estresante se produce se activan una serie de proteínas ( MYC, E2F1, E1A ) que activan la proteína ARF (miembro de la superfamilia RAS) la cual produce degradación de MDMD2 y MDM4, proteínas que regulan negativamente a P53 por lo que se produce un aumento de la concentración de p53 (Sherr, 1998) Dicha vía está desregulada en el 84 % de los GBM (Cancer Genome Atlas Research Network et al., 2013). La mutación más frecuente es la delección homozigota del locus de ARF , la cual ocurre en el 60% de los GBM. Dicha delección impide la degradación de MDM2 y M2M4 por lo que estás mantendrán concentraciones anormalmente bajas de p53. Las mutaciones que más frecuentemente afectan al gen que codifica p53 son las mutaciones puntuales sin sentido en el dominio de unión al ADN. La prevalencia de las mutaciones en TP53 varían entre GBM primario y secundario ( 30%-65%) (Xiong et al., 2020) y los diferentes subtipos de GBM (Proneural 54%, mesenquimal 32% , neural 21% y clásico 0%) Otro de los mecanismos por los cuales se puede deteriorar la actividad de p53 es por la amplificación de las regiones que codifican MDM2 Y MDM4, esto se da en el 7-14 % de los GBM(Crespo et al., 2015; Verhaak et al., 2010; Y. Zhang et al., 2018). Figura 15: El estrés oncogénico favorece la activación del supresor de tumores ARF quien inactiva a MDM2 generando una mayor expresión de P53. Figura Creada con BioRender.com 38 Las señales enviadas por estos sensores convergen en unas proteínas de la familia Bcl2 que pueden ser proapoptóticas como Bax, Bid, Bak y Bim o antiapoptóticas como Bcl2, bclXL y Bcl W que cuando se activan alteran la permeabilidad mitocondrial impidiendo o permitiendo la liberación de Citocromo C. Este citocromo activa dos Caspasas, 8 y 9 que desencadenan la activación en cadena de múltiples caspasas que se encargarán de destruir los orgánulos y el material genético celular .Además de las mutaciones mencionadas en P53 existen mutaciones sobre todos los componentes de la vías implicadas en la apoptosis, las más frecuentes se dan sobre Bcl-2, Bcl xL, Bid, Bak, Bax, Bad, Bim, caspasas-8, -10, -9 y Fas entre otros (Blahovcova et al., 2015; Steinbach & Weller, 2004). 39 Además de lo comentado hasta ahora debemos mencionar una vía que tiene un papel fundamental en la regulación de la supervivencia y apoptosis celular, la vía PI3KAKT. Esta vía funciona de la siguiente manera: La unión de ligandos como IGF 1 e IGF 2 a receptores TK activan a la proteína PIK3. Esta a su vez provoca la activación de AKT la cual migra al núcleo e inactiva factores de transcripción de genes proapoptóticos como las proteínas FOX. Por lo tanto, esta vía es una vía que promueve la Supervivencia celular. El principal regulador de esta vía es • PTEN: El locus de este gen se encuentra en el cromosoma 10q23.Codifica una proteína de 403 aminoácidos y un peso molecular de 48 KDa. Presenta dos dominios principales, el dominio C2 mediante el cual se ancla a la membrana celular y el dominio catalítico que presenta la función fosfatasa (Worby & Dixon, 2014) PTEN actúa como supresor de tumores ya que inhibe la vía PI3K/AKT/mTOR la cual está relacionada con aumento de la proliferación , crecimiento y supervivencia entre otras funciones. (Knobbe et al., 2002).El mecanismo mediante el cual inhibe esta vía es el siguiente: cuando PI3K se activa mediante la acción de un factor de crecimiento unido a su receptor, produce la fosforilación de un lípido de membrana, PIP2, que pasa a PIP3, el cual es el responsable de la activación de AKT. PTEN retira un grupo fosfato de PIP 3 que pasa a PIP 2 lo que frena la vía PI3K/AKT(Álvarez-Garcia et al., 2019)(Worby & Dixon, 2014).Las mutaciones que producen disminución de la función de PTEN son frecuentes en GBM. Hasta en el 85 % de los GBM presentan delecciones en este gen según el Atlas del genoma del Cáncer (Cancer Genome Atlas Research Network et al., 2013). Sin embargo no se observan diferencias en la frecuencia de mutaciones de este gen en los diferentes subtipos de GBM(Verhaak et al., 2010). Figura 16: PTEN actúa como supresor de tumores al inhibir la vía PIK3/AKT. Dicha vía culmina con la inactivación de genes proapoptóticos promoviendo la supervivencia celular. 40 5.4.1.7 Evasión de la respuesta inmune Los diferentes efectores del sistema inmune constantemente detectan y eliminan células cancerosas de nuestro organismo. Los tumores que consiguen crecer y ser significativos consiguen de alguna manera evitar esta vigilancia inmunológica. Modelos experimentales animales a los que se les ha suprimido la respuesta inmune celular ( linfocitos T y Natural Killers) presentan una incidencia muy elevada de tumores (Teng et al., 2008). Como vimos en el apartado de Nuevas Terapias, la evasión de la respuesta inmune ha sido estudiada en los últimos años y ha originado la el campo de la Inmunoterapia. 5.4.1.8 Reprogramación del metabolismo energético: Las células tumorales que han ido seleccionándose, empleando cada uno de los Hallmarks explicados previamente, presentan una tasa muy elevada de replicación en comparación con las células normales. Esta alta tasa replicativa conlleva un gasto energético muy elevado. Las células tumorales necesitan desarrollar un metabolismo más eficiente que sus vecinas no tumorales (Hanahan & Weinberg, 2011) ¿Cómo logran las células tumorales obtener esta gran cantidad de energía? Para explicarlo debemos antes conocer las rutas metabólicas celulares normales. Como sabemos, la principal fuente de energía celular es la Glucosa. Dicho metabolito sufre un proceso oxidativo tras el cual se obtiene Adenosín Trifosfato (ATP). Existen 2 rutas de Glicólisis que se dan en función de la disponibilidad de OXÍGENO en el ambiente celular. La glucólisis aerobia consiste en la oxidación de la molécula de glucosa en el citosol hasta obtener piruvato. El piruvato se transforma en ActilCoA y entra en la mitocondria. Comienza entonces el ciclo de Krebs mediante el cual, el AcetilCoA se une al Oxalacetato formando Citrato. A consecuencia de estas reacciones del Ciclo de Krebs se forman moléculas de NADH. El NADH de la matriz mitocondrial entrará en las crestas mitocondrales e intervendrá en la cadena respiratoria con la consiguiente formación de ATP. A modo resumen; tras el metabolismo aeróbico de una molécula de Glucosa se obtienen 38 moléculas de ATP (Naifeh et al., 2021). En cambio, cuando no se dispone de Oxígeno suficiente, se produce la Glucolisis anaeróbica, proceso que se da en el citosol en el cual la molécula de Glucosa se transforma en 2 moléculas de Piruvato y estas a su vez en 2 moléculas de Lactato gracias a la enzima Piruvato Deshidrogenasa. Como consecuencia de la Glucolisis anaeróbica se obtienen 2 moléculas de ATP por cada molécula de Glucosa (Melkonian & Schury, 2021). 47 1: Aumento de la expresión de los inhibidores de CDK: Como hemos visto en apartados anteriores, cuando CDK4/6 se une a Cliclina, este complejo fosforila a p RB, haciendo que este libere al Complejo de Transcripción E2F que tenía secuestrado. EF2 migrará al núcleo y participará en la transcripción de genes encargados de pasar de la fase G1 a la fase S. En las células de Glioma, la activación de TGFb resultará en la activación del complejo SMAD que se unirá a complejos de transcripción como FoxO o C/EBPb dando lugar la activación de p15/INK4b and p21/CIP1, dos de los principales inhibidores de CDK (Seoane et al., 2004). 2: Disminución de la expresión de c-Myc: Tras la activación del complejo SMAD y su migración al núcleo este se une a factores de Trascripción E2F4/5 Y A C/EBPb lo que disminuirá la expresión de c-Myc, por lo que no podrá activar a las CDK ni inhibir a p15 y p21. Figura 21: Esquema en el que se aprecia cómo la activación del complejo SMAD y su unión a diferentes factores de transcripción regula negativamente la actividad proliferativa de la célula. Figura Creada con BioRender.com Estimulación de la Diferenciación y Apoptosis Celular: TFG b promueve la diferenciación de las Neural Stem Cells cultivadas in vitro (Izsak et al., 2020) Además TFGb promueve la apoptosis celular mediante la activación de la trancripción de DAPK, que activa la apoptosis mediada por p53. (Jang et al., 2002), aumento de la trasncripción BAX y disminución de BCL2 y BCLxl , lo cual 48 promueve la liberación de Citocromo c de la mitocondria y por tanto genera activación de la cascada apoptótica (Bakhshayesh et al., 2012) Supresión de la inmortalización y mantenimiento de la estabilidad cromosómica: Estudios en modelos in vivo e in vitro muestran que el silenciamiento del gen TGF b produce una disminución en la apoptosis y un aumento de alteraciones cromosómicas cuando los tejidos son expuestos a fármacos alquilantes y a radiaciones ionizantes. (Ewan et al., 2002; Glick et al., 1996) 5.4.2.4 TGFB como oncogén: Como hemos comentado anteriormente, el acúmulo de mutaciones sobre las moléculas encargadas de llevar a cabo la respuesta reguladora de la vía TGF b produce que esta se convierta en una vía de señalización que promueve el desarrollo tumoral a través de los siguientes mecanismos: Aumento de la proliferación celular: Anteriormente comentamos la importancia de las vías que dependen de c-Myc, p21 y p15 en el control de la proliferación celular. Pues en estados celulares protumorales de Glioma encontramos alteraciones en SMAD , PI3K, y FoxG1 que median la resistencia al control de la proliferación celular inducida por TGFb (Seoane et al., 2004). Aumento de la migración e invasión celular: El Glioblastoma presenta una gran capacidad para invadir el parénquima cerebral sano. Esto es debido a la producción de proteasas que degradan la Matriz Extracelular permitiendo el avance celular (Rao, 2003). TGBb1 exógeno aumenta directamente la movilidad celular mediante el aumento de la expresión de integrinas  y  y ciertas metaloproteasas en células de Glioma in vitro (Platten et al., 2000; Wick et al., 2001). Aumento de la angiogénesis: La elevada proliferación microvascular es una de las características histológicas fundamentales de Glioblastoma. El TFGb participa en el aumento de los vasos tumorales mediante el aumento de la transcripción de VEGF (“Vascular Endotelial Growth Factor”), FGF (“Fibroblastic Growth Factor”) y PAI-1 (“Plasminogen Activator Inhibitor”). (Guerrero & McCarty, 2017) Ciertos estudios sugieren que la hipoxia tisular y el TGFb realizan una acción sinérgica en la regulación de la transcripción del VEGF, ya que una determinada región del promotor del gen VEGF presenta regiones de unión de ADN para SMADs y HIF(Hipoxia-Inducible factor (Sánchez-Elsner et al., 2001). Mantenimiento de las GSC: Como veremos en el apartado siguiente las Glioma Stem Cells presentan un papel importante en malignidad del Gliolastoma ya que son las responsables de su resistencia a la quimiorradioterapia y recurrencia tumoral. La señalización autocrina de TGFb presenta un papel importante en la capacidad de autorrenovación de las GSC al inducir la transcripción de Sox4 y Sox2 (Ikushima et al., 2009) 5.4.3 LEFTY: A continuación, nos centraremos en una molécula en concreto perteneciente a la superfamilia TGFb, la cual es una de las principales dianas de nuestro estudio. Estructura: es una proteína que forma parte de la superfamilia TGF b. El locus de LEFTY se encuentra en el cromosoma (1q42.1) y contiene 3 genes, dos de los cuales son funcionales y un tercero (LEFTY 3) el cual es un pseudogén. LEFTY es secretada como un polipéptido de 42 KDa 49 que después es escindido en 2 dando lugar a sus dos isoformas LEFTY 1 (LEFTY A) y LEFTY 2 (LEFTY B) (Ulloa & Tabibzadeh, 2001). Ambas moléculas son prácticamente idénticas, el 96% de su secuencia es igual y ambas proteínas difieren en solamente 16 aminoácidos (Yashiro et al., 2000). Figura 22: El loci de LEFTY se encuentra en el cromosoma 1. Se secreta como un polipéptido que después es escindido en dos isoformas, LEFTY 1 y LEFTY 2. Figura Creada con BioRender.com Función: LEFTY tiene un papel fundamental en la regulación de la vía TGFb, en concreto de la vía de señalización activada por NODAL, una molécula de la familia TGFb(Ulloa & Tabibzadeh, 2001) Para poder entender mejor la función de Lefty explicaremos brevemente las principales características de la vía NODAL: Como hemos mencionado anteriormente, NODAL es una proteína codificada por el gen del mismo nombre situado en el cromosoma 10 (10q22.1). Forma parte de los ligandos de la familia del TGFb y es secretada como un precursor que se activa en el espacio extracelular. Una vez en su forma activa, NODAL se une con un correcptor EGF-CFR conocido como CRIPTO. Este complejo NODAL-CRIPTO se une a los receptores transmembrana serina/treonina kinasa tipo I y tipo II (ALK4 y ACTRIIB)(Bianco et al., 2002) Una vez formado este complejo NODAL(ligando)- CRIPTO(correceptor)-ALK4-ACTRIIB(receptor) se produce la posforilación de SMAD2 / SMAD 5 lo que desencadena la cascada de señalización SMAD de la vía TGFb con la consecuente migración del complejo R-SAMAD/Co-SMAD al núcleo y regulación de la transcripción genómica. El papel de LEFTY consiste en la regulación de esta vía. En concreto LEFTY bloque la activación de la vía y detiene la cascada de señalización de diferentes formas: LEFTY se une al complejo NODAL-CRIPTO impidiendo que este se una a los receptores transmembrana (Schier, 2003) LEFTY también impide la fosforilación de las R-SMAD por el complejo Ligando-Receptor 50 evitando la activación de la cascada SMAD. Además de esto LEFTY evita la translocación del complejo SMAD al núcleo celular impidiendo que formen complejos de transcripción genómica (Ulloa & Tabibzadeh, 2001). Debemos saber que, entre otras acciones, la activación de esta vía por NODAL favorece la transcripción de LEFTY, estableciéndose así una regulación negativa de la vía (Schier, 2003). Figura 23: LEFTY actúa como inhibidor de la vía NODAL al impedir la activación de la cascada de señalización dependiente de las proteínas SMAD. Figura Creada con BioRender.com PAPEL FISIOLÓGICO DE LEFTY DURANTE LA EMBRIOGÉNESIS: Como hemos visto NODAL y LEFTY funcionan de forma conjunta, formando un ciclo regulatorio. La cascada de señalización que establecen a través del complejo SMAD presenta un papel fundamental durante el desarrollo embrionario: A continuación, realizaremos una breve explicación de los eventos en los que participa NOD AL-LEFTY de forma fisiológica: Debemos saber que tras la fecundación del óvulo por el espermatozoide comienza una etapa conocida como desarrollo embrionario que dura 8 semanas y que está dividida a su vez en varias 51 subetapas. De estas, las que a nosotros nos interesan por la implicación de NODAL son la pregastrulación y la gastrulación. La gastrulación consiste en el proceso mediante el cual el embrioblasto, que consiste en una estructura formada por solamente una capa de células, pasa a tener tres capas: endodérmica , mesodérmica y ectodérmica. Durante estas etapas se establece el eje proximal-distal (PD), anterior-posterior (AP) y derecha-izquierda (DI) del embrión. El primer eje que se establece es el PD: Inicialmente, la activación de NODAL en el Epiblasto proximal induce la expresión de LEFTY en el Epiblasto distal, y esto genera un gradiente en la expresión NODAL (J. Brennan et al., 2001). Sucesivamente la expresión de NODAL quedará limitado al epiblasto proximal donde se formar la Estría Primitiva dónde dará comienzo la Gastrulación. Tras el proceso de gastrulación, la expresión de NODAL queda confinada a la porción más proximal de la Estría Primitiva, región que tomará el nombre de NODO VENTRAL y en la que se iniciará el proceso de LEFTY RIGHT ASIMTRY (Proceso que da nombre a la proteína LEFTY). La activación de nodal desde el Nodo mediante interacciones con Correceptores Cripto en la Placa Lateral Mesodérmica definen el lado izquierdo. En el lado derecho la expresión de LEFTY y un flujo ciliar hacia la izquierda impiden que NODAL ejerza su función en el lado derecho, estableciéndose así una asimetría en izquierda -derecha.(Little & Norris, 2021) Mutaciones homozigotas en SMAD 2, LEFTY, NODAL son mortales para el embrión en desarrollo. Mutaciones Heterocigotas conllevan importantes alteraciones craneofaciales en el neonato (Nomura & Li, 1998) condiciones como situs inversus, ambiguous o heterotaxia (Schweickert et al., 2017). Debemos saber que LEFTY y NODAL , están altamente expresados en células Stem humanas por lo que son considerados marcadores de células Stem (Wei et al., 2005). Figura 24: La expresión de LEFTY y NODAL regula la determinación de los ejes en la embriogénesis. P: proximal, D: distal, Po: posterior, A: anterior, R: derecha, L: izquierda. Figura Creada con BioRender.com 52 Como hemos visto LEFTY presenta una importante función reguladora durante la embriogénesis, pero ¿cómo se asocia esto con cáncer?, pues bien, en la última década diferentes artículos relacionan la alteración de diferentes vías regulatorias embrionarias con el desarrollo tumoral. Un ejemplo es el estudio in vivo que realizaron Hendrix y colaboradores en el que introdujeron dos grupos de células de melanoma, uno altamente agresivo y otro pobremente agresivo, en el embrión de pez zebra en el estado de bástula. Lo que se encontraron fue que las células altamente agresivas presentaron la capacidad de inducir la formación de un eje embrionario prácticamente completo. Lo cual sugiere que las vías de desarrollo embrionarias son funcionantes en las células tumorales con elevada capacidad tumoral.(J. T. Lee & Herlyn, 2006; Topczewska et al., 2006) Numerosos estudios teorizan sobre la implicación de vías de la superfamilia TGFb relacionadas con embriogénesis fisiológica ( vías NODAL y BMP, ambas reguladas por LEFTY ) en el mecanismo tumorogénico de diferentes linajes celulares. (Buijs et al., 2007; Fu & Peng, 2011; C.-C. Lee et al., 2010; Lombardo et al., 2011; T. Wang et al., 2017; G. Xu et al., 2004; Zhao et al., 2008) Lefty en Cáncer : Escasas son las publicaciones en las que se estudie el papel de LEFTY en Cáncer. A continuación, daremos una pincelada a los estudios que describen las principales características de este inhibidor de SMAD, que parece actuar como oncogén: En 2018 Matsumoto et al analizaron la expresión de LEFTY en Carcinoma de Ovario de células claras viendo que estaba elevada. Relacionaron un aumento de la expresión de LEFTY con un aumento en las propiedades EMT/CSC de estas células (Matsumoto et al., 2018). Zabala et al publicaron un estudio reciente en el que LEFTY , mediante la inhibición de SMAD 2 y SMAD 5 , estimula la renovación celular y la proliferación en el epitelio basal de la mama y en células cancerosas de mama in vivo (Zabala et al., 2020). En cuanto a LEFTY en Glioblastoma, Matsumoto et al publicaron un estudio en 2020 en el que observaron que este inhibidor de SMAD, era upregulado en las condiciones hipóxicas , y originaba un aumento de la supervivencia celular mediante cambios en la apoptosis , proliferación y características de la EMT y las GSC (Matsumoto et al., 2020). 53 5.4.4 Células Madre de Glioma El Glioblastoma es uno de los tumores que más heterogeneidad intratumoral presenta. Patel et al realizaron un RNA-seq de 430 células de 5 tumores diferentes de Glioblastoma encontrando una gran variabilidad intercelular a nivel molecular (Patel et al., 2014). Variabilidad molecular quiere decir que dentro del mismo tumor, existen poblaciones celulares con alteraciones en diferentes moléculas de diferentes vías celulares. Esto genera poblaciones celulares diferentes dentro de un tumor, cada una de ellas caracterizada por presentar diferentes ventajas adaptativas respecto a las células sanas. Así podemos encontrar un clon cuyas alteraciones moleculares le hayan conferido una gran resistencia a la hipoxia, otro clon con capacidad para evadir la respuesta inmune, otro que presente una elevada resistencia al daño a su ADN etc. Dentro de un tumor encontramos un subgrupo celular que presenta las diferentes capacidades comentadas anteriormente sumadas a una gran capacidad de autorrenovación, este subgrupo celular se conoce como Células Madre de Glioma o Glioma Stem Cells (GSC) y vamos a detenernos a comentar sus principales características y su peso en la patogénesis del Glioblastoma. La historia de las Glioma Stem Cells comenzó en 1994 cuando Dick et al publicaron una proliferación mantenida de células de Leucemia de humano en ratones inmunosuprimidos (Lapidot et al., 1994). A partir de ahí comenzaron a buscarse en otros tumores estas células que podían diferenciarse en modelos in vivo y que presentaban elevada capacidad de autorenovación. En los años 2003 y 2004 Singh et al encontraron un subgrupo celular dentro de los tumores cerebrales que presentaba la capacidad de autorrenovación y de generación de tumores humanos al ser inyectada en modelos animales, las Glioma Stem Cells (S. K. Singh et al., 2003, 2004). Este subgrupo celular podría definirse en base a una serie de criterios funcionales que deben cumplirse en su totalidad : célula del tejido tumoral que presenta la capacidad de autorrenovarse , que al ser inyectada modelos de experimentación genera tumores que presentan a su vez heterogeneidad intratumoral (Gimple et al., 2019).Debemos destacar que este subgrupo celular NO tiene un marcador patognomónicos si no que presentan una serie de marcadores lo caracterizan. Los marcadores más característicos incluyen proteínas intracelulares como SOX2, OLIG2, MYC, and NESTIN y proteínas de membrana celular como CD133, L1CAM, CD44, and A2B5 (Hassn Mesrati et al., 2020). El aspecto más destacable de las Glioma Stem Cells es que son las responsables que ciertos tumores presenten quimioresistencia y radioresistencia mediante la activación de puntos de control de respuesta al daño del ADN y al presentar una elevada capacidad reparación del material genético celular (Bao, Wu, McLendon, et al., 2006).También son las responsables de la recurrencia tumoral tras el tratamiento (Auffinger et al., 2015).Estas células además favorecen la angiogégenis microvascular mediante diferentes mecanismos como son la diferenciación en células endoteliales o pericitos o la liberación de moléculas proangiogénicas (Bao, Wu, Sathornsumetee, et al., 2006). Otra de sus características es la capacidad que presentan de contribuir al silenciamiento de la inmunidad en el microambiente tumoral (Ma et al., 2018). 54 Figura 25: Las GSC se caracterizan por la capacidad de generar tumores heterogéneos en animales de experimentación y ser las responsables de las características más agresivas del Glioblastoma. Figura Creada con BioRender.com 55 6 OBJETIVOS El objetivo principal de este proyecto es estudiar la implicación de la vía de LEFTY en la progresión y tratamiento del Glioblastoma. Para el desarrollo del estudio hemos realizado una división del objetivo principal en Objetivos específicos que son 1: Estudiar la expresión y relevancia clínica de Lefty en Glioblastoma: 1.1 Caracterización de la expresión de las proteínas LEFTY y SMAD en líneas celulares de Glioblastoma. 1.2 Caracterización de la expresión de las proteínas LEFTY y SMAD en biopsias humanas de Glioblastoma y correlación con la supervivencia. 2: Estudiar el impacto de la inhibición farmacológica LEFTY en la capacidad tumorogénica del Glioblastoma: 2.1 Evaluar como la inhibición farmacológica de LEFTY afecta al crecimiento del Glioblastoma in vitro. 2.2 Evaluar cómo la inhibición farmacológica de LEFTY afecta la población de células madre de glioma. 2.3 Evaluar como la inhibición farmacológica de LEFTY afecta al crecimiento del Glioblastoma in vivo. 2.4 Evaluar cómo la inhibición farmacológica de LEFTY afecta al crecimiento del Glioblastoma de manera combinada a quimioterapia. 56 7 MATERIAL Y MÉTODOS: 7.1 CULTIVO CELULAR 7.1.1 Líneas celulares: Las líneas celulares de Glioma con las que trabajamos en la realización de este proyecto fueron las siguientes: U87, U251, U373, A 172, T 98, GNS 166, GNS 179. Las primeras 5 líneas mencionadas son líneas celulares obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y fueron cultivadas de forma adherente en medio DMEM (Medio de cultivo Eagle modificado por Dulbeco, Gibco, Waltham, MA, USA) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (Gibco), glutamina (2 mM), penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (100 μg/mL). Las dos siguientes, las células madre de Glioma o GNS (Glioma Neural Stem Cell) 166 y 179 son células madre de Glioma derivadas de paciente y fueron cedidas por el Dr Steve Pollard del Centre for Regenerative Medicine and Edinburgh Cancer Research Centre de la Universidad de Edimburgo (Ref Pollard SM 2009 Cell Stem Cell). Fueron cultivadas en adhesión tras tratar la superficie de cultivo con 10 μg/mL de Laminina (L2020, Sigma Aldrich) durante 3 h a 37 °C en un medio selectivo para células madre medio : DMEM/F12 (Medio de cultivo Eagle modificado por Dulbeco, Ham F12, Sigma) en proporción 1:1 y suplementado con B27 10x (Gibco) N2 100x (Gibco), glucosa 45% y 20 ng/mL de factores de crecimiento de fibroblastos (bFGF,R&D Systems) y epidérmico (EGF, Sigma, St. Louis, MO, USA) Los cultivos de células madre de esferas en suspensión fueron realizados en placas no tratadas para evitar la adherencia, en medio de cultivo selectivo para células madre (descrito anteriormente) y sometidas a disgregación enzimática con acutasa (Invitrogen A1110501) para su subcultivo.Trabajamos también con la línea celular NHA de Astrocitos primarios obtenidos de córtex cerebral humanos ( ScienCell Research Laboratories #1800) de que empleamos como control.Todas las líneas celulares se mantuvieron en condiciones de cultivo estándar a 37°C de temperatura, 95% de humedad, 21% de O2 y 5% de presión de CO2. Todos los procedimientos se realizaron en campanas de flujo laminar de seguridad Clase II (nivel de seguridad biológica 2; Class II Biohazard Safety Cabinet, ESCO). LÍNEA CELULAR TIPO CELULAR ORIGEN MEDIO DE CULTIVO PROCEDENCIA U87 Glioma Glioblastoma DEMEN+10%SBF ATCC(HTB-14) U251 Glioma Glioblastoma DEMEN+10%SBF ATCC U373 Glioma Glioblastoma DEMEN+10%SBF ATCC(HTBJ-17) A172 Glioma Glioblastoma DEMEN+10%SBF ATCC(CRL-1620) T98 Glioma Glioblastoma DEMEN+10%SBF ATCC(CRL-1690) GNS166 Célula madre de glioma. Glioblastoma DMEN/F12 Steve Pollard GNS179 Célula madre de glioma. Glioblastoma DMEN/F12 Steve Pollard NHA Astrocito Cerebro sano DEMEN+10%SBF Sceince Cell #1800 Tabla 1: Características de las líneas celulares empleadas. 63 7.4.5 Inmunohistoquímica Realizamos inmunohistoquímicas (IHQ) con el objetivo de identificar y cuantificar la expresión de diferentes proteínas de interés en los tumores generados en el tejido subcutáneo de modelos animales. 7.4.5.1 TUMORES DE ENSAYOS IN VIVO Los tumores generados en el tejido subcutáneo de los ratones inmunodeprimidos (Fox1Nu/Fox1/un) fueron extraídos y fijados en 10% de formalina durante 48 horas a temperatura ambiente para posteriormente ser embebidos en parafina y cortados en secciones de 4 μm de grosor con un microtomo. Los cortes fueron desparafinados, rehidratados mediante baños sucesivos en alcoholes decrecientes e incubados en tampón citrato en ebullición durante 10 minutos para la recuperación antigénica. A continuación, se incubaron en solución de bloqueo (PBS-0,3% Tritón X-100-5% FBS) y fueron incubados con los correspondientes anticuerpos primarios [Tabla 4 ] a 37°C durante 2 horas. Tras la incubación con el anticuerpo primario, los cortes se lavaron e incubaron con los anticuerpos secundarios [Tabla 10]. Posteriormente las muestras fueron incubadas durante 10 minutos a temperatura ambiente con el sustrato 3,3'Diaminobenzidina (DAB, Cat. No. SPR-DAB-060, Spring Bioscience), produciéndose como producto de la reacción DAB oxidada, un precipitado marrón detectable en el tejido. Las tinciones se observaron en un microscopio Eclipse 80i y fueron procesadas con el software NIS Elements Advances Research (Nikon). Anticuerpo ESPECIE DE ORIGEN DILUCIÓN REFERENCIA Primarios Fosfo-Histona 3 Ratón 1:1000 Abcam Ab 14955 SOX2 Conejo 1:500 Milipore AB5603 Caspasa 3 Conejo 1:1000 RDSystems AF835 LEFTY 1 Conejo 1:1000 Ab 22569 p-SMAD2 Conejo 1:1000 Invitrogen 10125104 p-SMAD5 Conejo 1:1000 Invitrogen 163254884 Ki67 Conejo 1:250 Abcam16667 Secundarios Goat anti-rabbit HRP Cabra 1:2000 Santa Cruz Biotechnology Sc2004 Goat anti-mouse HRP Cabra 1:2000 Santa Cruz Biotechnology Sc2004 Tabla 4: Características de los anticuerpos primarios y secundarios empleados en IHQ. 64 7.4.6 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA Con el objetivo de estudiar la expresión de los ARN mensajeros (ARNm) de los genes de interés en líneas celulares de glioma mediante PCR cuantitativa, se purificó el ARN y se obtuvo el ADN complementario (ADNc) mediante una reacción de retrotranscripción (RT). 7.4.6.1 EXTRACCIÓN DE ARN TOTAL Para el aislamiento del ARN celular se lisaron las células con una solución monofásica de tiocianato de guanidina y fenol (Trizol® Cat. No. AM-9738, Life Technologies). La lisis en Trizol se realizó durante 10 minutos a temperatura ambiente mediante pipeteo vigoroso. Posteriormente se añadieron 200 μL de cloroformo (Cat. No. C2432, Sigma), se mezcló mediante inversión y se dejó actuar 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente las muestras se centrifugaron a 12.000 x g a 4°C durante 10 minutos (microcentrífuga 22R, Beckman Coulter) obteniendo así 3 fases bien definidas: una fase superior, acuosa, formada por el ARN, una interfase que contenía el ADN y una fase inferior que contenía las proteínas. La fase superior con el ARN se trasvasó a nuevos tubos tratados con DEPC (Dietil pirocarbonato, Cat. No. 159220, Sigma) y se descartaron el resto de las fases. Se añadieron 500 μL de alcohol isopropílico (Cat. No. I9516, Sigma) y 1 μL de glicógeno (5 μg/μL) (Cat. No. AM9510, Ambion) y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente para precipitar el ARN. Se realizó otra centrifugación a 12.000 x g a 4°C durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante, se añadió 1 mL de etanol al 75% y se centrifugó a 7.000 x g a 4°C durante 5 minutos para lavar el precipitado. Finalmente, se descartó el sobrenadante, se secó el pellet en una cámara de vacío durante 10 minutos y se resuspendió con agua libre de ARNasas. La concentración y pureza del ARN aislado se determinó mediante la medición de la absorbancia a 260 y 280 nm en un espectrofotómetro Nanodrop-1000 (Thermo Scientific). 7.4.6.2 TRANSCRIPCIÓN REVERSA (RT) Para la obtención del ADN complementario de cadena simple se realizó la retrotranscipción mediante el método de cebadores aleatorios y el Kit MultiScribeTM Reverse Transcriptase (Cat. N° 4311235, Life Technologies), partiendo de 1 μg de ARN total. Las muestras se sometieron a los siguientes ciclos de temperatura en un termociclador BioRad C1000 Thermal Cycler: incubación de 10 minutos a 25°C, fase de calentamiento a 37°C durante 120 minutos y fase de calentamiento final a 85°C durante 5 minutos. El ADNc resultante se diluyó en agua libre de ARNasas a una concentración final de 4 ng/μL. 7.4.6.3 PCR CUANTITATIVA (qRT-PCR) Para determinar los niveles de expresión de los genes de interés se utilizó la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qRT-PCR), que se basa en la reacción de PCR para amplificar el producto específico, y permite la monitorización del proceso ciclo a ciclo. Se empleó ADN complementario como molde, dos cebadores específicos y una mezcla de reacción (Absolute SYBR Green mix (Cat. N° 4368706G, Applied Biosystem) que contiene 65 desoxirribonucleótidos (dNTPs), enzima ADN polimerasa y el fluoróforo SYBR Green, el cual se intercala en los ácidos nucleicos de doble cadena y permite la cuantificación del producto en cada ciclo. Las PCR se realizaron en placas de 96 pocillos (cada muestra por triplicado) y en cada pocillo se dispusieron 20 ng de ADNc en un volumen final de 12 μL constituidos por 6μL de Absolute SYBR Green mix, 0,75 μL de agua libre de ARNasas y 0,25 μL de mezcla de cebadores (forward y reverse) específicos para cada gen de estudio [Tabla 5] a una concentración de 0,4 μM. La reacción se llevó a cabo en un termociclador LightCycler 96 (Roche) con los siguientes ciclos de temperatura: ciclo de 120 segundos a 50°C; 1 ciclo de 600 segundos a 95°C, 41 ciclos de 15 segundos a 95°C y 60 segundos a 60°C y un último paso de disociación consistente en 10 segundos a 95°C, 60 segundos a 60°C y 1 segundo a 97°C. Como gen de control interno para corregir las variaciones de los niveles de ADNc se usó la amplificación de GAPDH (Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa). Para realizar la cuantificación relativa de los niveles de expresión génica se utilizó la fórmula 2-ΔΔCt, que consiste en calcular la expresión normalizada del gen de interés en la muestra con respecto a las muestras de referencia. Los datos se presentan como el “cambio de veces de expresión” del gen diana normalizado con el gen control y a su vez relativizada respecto a la correspondiente muestra control. GEN SECUENCIA FORWARD SECUENCIA REVERSE GAPDH ATGGGGAAGGTGAAGGTCGG GACGGTGCCATGGAATTTGC LEFTY-1 AGAGCTGGCGATGACTGAAC AAACTGAGCAAGGGCTCTCC LEFTY-2 ACGTGAGGGCCCAGTATGTA TCCATGCCGAACACCAGC SMAD-2 GCCGGGAGGTTCGATACAAG AGTCTCTTCACAACTGGCGG SMAD-5 GCGGCCGAGCTGCTAATAAA CAGCTTCCTTTTCGCGAGC Tabla 5: Secuencias de cebadores empleados. 7.4.7 Análisis Estadístico Los datos mostrados en el presente trabajo representan la media ± error estándar de la media (SEM). Las medias fueron comparadas mediante el test estadístico t de Student y los datos se representaron usando GraphPad 8. Los asteriscos indican los diferentes grados de significación estadística: #p<0,1 * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001; *** p<0.0001. Los análisis de correlación se basaron en el coeficiente de Pearson cuando las muestras estaban normalmente distribuidas o el coeficiente de Spearman cuando no estaban normalmente distribuidas. El análisis de la normalidad se realizó mediante el test de Kolmogorov-Smirnov, usando el software GraphPad 8. Para los estudios de asociación entre supervivencia y otras variables se empleó el método de Regresión de COX. 66 8 RESULTADOS 8.1 LA EXPRESIÓN DE LAS DIFERENTES PROTEÍNAS DE LA VÍA SEÑALIZACIÓN LEFTY-SMAD ES HETEROGÉNEA EN BIOPSIAS DE GLIOBLASTOMA. Inicialmente estudiamos la expresión de LEFTY1, LEFTY2, SMAD2 y SMAD5 en biopsias tumorales de glioblastoma. Para ello, empleamos el portal GlioVis (Bowman et al., 2017) donde están almacenados y accesibles datos de muestras de Glioblastomas del TCGA. Analizamos la expresión de estos 3 genes según tres plataformas de secuenciación diferentes RNA-seq, Agilent-4502A y HG-U133A. La expresión, a nivel transcripcional, de los genes citados en las muestras de glioblastoma fueron comparados con los obtenidos en tejido sano cerebral, usado como control en cada estudio. Los niveles de LEFTY1 se encuentran disminuidos en las biopsias de glioblastoma independientemente de la plataforma utilizada (Fig. 30A), mientras que los de LEFTY2 están aumentados respecto al tejido sano cerebral (Fig. 30B). En cuanto a las SMAD; los niveles de SMAD2 no parecen estar alterados en 2 de las plataformas mientras que en RNA-seq están elevados (Fig. 30C). Por último, la expresión de SMAD5 está elevada al ser comparada con el tejido cerebral control (Fig. 30D). Los resultados obtenidos sugieren que la expresión de los genes de interés es heterogénea. Figura 30: Expresión de los genes de interés en biopsias de glioblastoma obtenidas en portal GlioVis. Boxplot del log2 de la FPKM de expresión de A) LEFTY1 B) LEFTY2 C) SMAD2 D) SMAD5 en biopsias de Glioblastoma de la base de datos del TCGA. 67 8.2 LA SOBREXPRESIÓN DE LEFTY SE ASOCIA A UNA MENOR SUPERVIVENCIA EN BIOPSIAS DE GLIOBLASTOMA. Consultamos el Portal Gliovis (Bowman et al., 2017) para determinar cómo se relacionaba la supervivencia con la expresión de LEFTY y SMAD. Analizamos, por un lado, una cohorte de muestras del TCGA que incluye Glioblastomas primarios, secundarios y recurrentes; y; por otro lado, analizamos específicamente la cohorte de Glioblastomas recurrentes. Los resultados muestran que, en ambas cohortes, los pacientes con mayor expresión de LEFTY, tanto de LEFTY 1 como de LEFTY 2, en las muestras analizadas, presentaban una menor supervivencia que aquellos con niveles bajos de LEFTY. Parece que en la cohorte que analiza la expresión de LEFTY específicamente en los Glioblastomas recurrentes estas diferencias en la supervivencia son todavía más significativas. Dentro de la cohorte que incluye Glioblastomas primarios, secundarios y recurrentes, la mediana de supervivencia es de 12,4 meses en los niveles altos de LEFTY 1 y de 12,7 en los niveles bajos de LEFTY 1. En cuanto a LEFTY 2, la mediana de supervivencia es de 11,4 meses en los niveles altos y de 13,9 meses en los niveles bajos. En la cohorte que incluye exclusivamente Glioblastomas recurrentes, la mediana de supervivencia es de 8.2 meses en los niveles altos de LEFTY 1 y de 10.8 en los niveles bajos de LEFTY 1. En cuanto a LEFTY 2, la mediana de supervivencia es de 8.15 meses en los niveles altos y de 10.5 meses en los niveles bajos. Figura 31: Análisis de supervivencia Kaplan-Meier: A) y B) Análisis de supervivencia de pacientes con muestras de GBM primarios, recurrentes y secundarios en función del nivel de expresión de LEFTY 1 y LEFTY 2 C) y D) Análisis de la supervivencia de pacientes con muestras de GBM recurrentes en función del nivel de expresión de LEFTY1 y LEFTY2. 68 Analizamos también la relación entre la supervivencia y la expresión de SMAD 2 y SMAD 5 en cohortes de Glioblastoma que incluía muestras de Glioblastoma primario, secundario y recurrente y de forma individual por subgrupos (primario, secundario y recurrente) y no encontramos diferencias significativas en cuanto a la supervivencia en función de la expresión de SMAD 2 y SMAD 5. Figura 32: Análisis de supervivencia Kaplan-Meier: A) Análisis de supervivencia de pacientes con muestras de GBM primarios, recurrentes y secundarios en función del nivel de expresión de SMAD2 B) Análisis de supervivencia de pacientes con muestras de GBM primarios , recurrentes y secundarios en función del nivel de expresión de SMAD 5. Una vez estudiados los datos disponibles en bases de datos públicas llevamos a cabo un estudio similar en pacientes de nuestro centro. En este caso nos centramos en estudiar la expresión de LEFTY a nivel proteico. Para ello realizamos un estudio inmunohistoquímico de muestras de Glioblastoma de pacientes intervenidos en el año 2014 y 2015 por el Servicio de Neurocirugía en nuestro centro. Analizamos la expresión de LEFTY en 65 muestras y a cada muestra se le asignó un nivel que dividimos en negativo/bajo (-), intermedio (+/-) y alto (+). Los casos en cada grupo fueron 12, 40 y 10 respectivamente. Tres de las muestras presentaban daños por lo que no las incluimos en ninguno de los grupos. A continuación, pretendimos asociar la expresión de LEFTY a la supervivencia de los pacientes, que están incorporadas en la base de datos del Servicio de neurocirugía de manera coordinada con el comité de neuro-oncología. Observamos que, de las 66 muestras, había algunas que provenían del mismo paciente o no sé tenía información completa por lo que nos quedamos con un total de 40 individuos. Para reforzar la estadística y 69 buscar diferencias más claras, las agrupamos en 2 cohortes: LEFTY alto y LEFTY bajo. En este caso, la expresión de LEFTY está aumentada en el 52,5 % de los pacientes de nuestra muestra. Figura 33: Estudio inmunohistoquímico de las muestras de 40 pacientes intervenidos de Glioblastoma en el año 2014 y 2015 por el Servicio de Neurocirugía del Hospital Universitario de Donostia. Realizamos una división de las muestras en dos grupos, LEFTY bajo (A) Lefty intermedio (B) Y LEFTY alto (C). Tras analizar la supervivencia de cada uno de estos 40 pacientes llevamos a cabo un Modelo de Regresión de Cox. Parece existir una asociación entre una mayor expresión de LEFTY y una menor supervivencia de los pacientes de nuestra muestra, sin embargo, las diferencias no son estadísticamente significativas. Figura 34: Análisis de supervivencia Kaplan-Meier. Analizamos la supervivencia en función del grado de expresión de LEFTY. Los resultados muestran que parece existir cierta asociación entre niveles de expresión más altos y una menor supervivencia. 70 8.3 LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE LEFTY ESTÁN AUMENTADOS EN LÍNEAS CELULARES DE GLIOBLASTOMA Y EN LÍNEAS DE CÉLULAS MADRE DE GLIOMA Analizamos la expresión de las proteínas de interés: LEFTY, SMAD2, SMAD 5, p-SMAD2 y pSMAD5 en diferentes líneas celulares de Glioblastoma, compradas en la ATCC, y la comparamos frente a una línea de astrocitos primarios derivada de individuos sanos (NHA). Los resultados del Western Blot reflejaron que LEFTY se expresa en todas las líneas celulares estudiadas y que sus niveles son mayores en comparación con los astrocitos sanos (Fig. 35). Las líneas de glioma que más expresión mostraban son la línea U87 y T98 en este orden (Fig. 35). En cuanto a las SMAD, observamos una disminución de la expresión de SMAD2 total en células de glioma respecto a la NHA, sobre todo en las líneas U87 y T98, consistente con los niveles de LEFTY) mientras que los niveles de SMAD5 total parecen no estar disminuidos. Realizamos también la medición de la expresión de las proteínas de interés en dos líneas de células madre de Glioma (GSC) derivadas de pacientes denominadas GNS166 y GNS179 (Ref Pollard SM 2009 Cell Stem Cell). En este caso, los resultados mostraron que la expresión de LEFTY era muy alta en estas células. Marcadamente mayor que los astrocitos sanos NHA y similares a las líneas de glioma U87 y T98, que presentaban los niveles más altos. En cuanto a los niveles de SMAD total, la expresión de SMAD 2 y SMAD 5 era similar a los astrocitos o estaba ligeramente aumentada (Fig. 35). A continuación, completamos el análisis de expresión de los genes de interés en las líneas celulares convencionales analizando sus niveles de ARNm mediante RT-PCR cuantitativa. Todas las líneas celulares fueron comparadas con la línea U87 la cual fue la que mostraba una expresión más elevada de LEFTY a nivel proteico. En este caso, los resultados muestran una expresión heterogénea tanto en LEFTY como SMAD, que no se ajusta de manera precisa con lo observado en los Western Blot. Figura 35: Expresión de los genes de interés en líneas celulares de glioma. A) Análisis de expresión de proteína, mediante western blot de LEFTY1, SMAD2 y SMAD5 en distintas líneas tumorales convencionales de glioma y en GSCs (dos líneas denominadas GNS166 y GNS179). NHA es línea humana primaria de astrocitos usada como control. B) Análisis de expresión de mRNA de indicados genes en las líneas tumorales indicadas. 71 8.4 LA EXPRESIÓN DE LEFTY Y SMAD CAMBIA EN FUNCIÓN DEL ESTADO DE DIFERENCIACIÓN CELULAR. Los resultados del apartado anterior sugieren que los niveles de LEFTY están enriquecidos en la población de células madre de glioma derivadas de pacientes. Para completar el estudio de la expresión de LEFTY, y las SMAD, en las células madre de glioma, analizamos su expresión mediante Western Blot y RT-PCR cuantitativa en las diferentes líneas celulares de Glioblastoma crecidas en medio estándar y tras cultivarlas en un medio selectivo para células madre, de forma que estas creciesen como oncosferas (2ry CSC) y adquiriesen características de célula madreindiferenciadas (Ref Garros-Regulez 2016). En primer lugar, analizamos los niveles de mRNA y observamos que tanto LEFTY (1 y 2) como las SMAD presentan una mayor expresión a nivel transcripcional en las oncosferas (Figura 36) A nivel proteico, los niveles de LEFTY están enriquecidos en las oncoesferas, sobre todo en U251 y A172 y excepto U373, mientras que los niveles totales de SMAD 2 y 5 parecen mantenerse constantes. Figura 36: Análisis de expresión de LEFTY1, LEFTY2, SMAD2 y SMAD5 en distintas líneas tumorales convencionales de glioma antes y después de ser cultivadas en condiciones de célula madre como oncosferas. A) Análisis de la expresión de proteína de los genes de interés en las líneas celulares de Glioblastoma. B) Análisis de la expresión de los genes mediante la cuantificación de ARNm mediante RTPCR cuantitativa. 72 A continuación, realizamos un ensayo inverso al anteriormente comentado. Lo que hicimos fue cultivar las células madre de Glioma derivadas de pacientes GNS166 y GNS179 en su medio estándar (selectivo para células madre) y siguiendo un protocolo de diferenciación que consiste en cultivarlas en presencia de suero fetal bovino (FBS) y en ausencia de factores de crecimiento Fibroblástico y Epidérmico (FGF y EGFR). De esta manera comparamos la expresión de LEFTY, SMAD 2 y SMAD 5 en las líneas GNS166 y GNS179 en su forma indiferenciada y diferenciada. Los resultados mostraron una clara disminución en los niveles proteicos de LEFTY, y un aumento de SMAD 5 total (Fig 37). Figura 37: Análisis de expresión de proteína de indicados genes en las líneas de GSCs GNS166 y GNS179 cultivadas en condiciones de célula madre y tras 10 días en medio de diferenciación. 79 Figura 42: La inhibición Farmacológica de LEFTY reduce el crecimiento tumoral en modelos de experimentación animal. Se establecieron dos brazos de tratamiento compuestos por 3 animales con 4 tumores cada uno en el grupo control, y 4 animales con 4 tumores cada uno en el grupo tratado. Se inocularon 10 uL de anti-LEFTY de forma intratumoral dos veces por semana durante 3 semanas. A) y B) Ralentización del crecimiento tumoral en el grupo tratado respecto al grupo control. C) Caracterización inmunohistológica de los tumores generados en modelos IN VIVO. 80 Figura 43: La inhibición Farmacológica de LEFTY reduce el crecimiento tumoral en modelos de experimentación animal. Se establecieron dos grupos, uno control con 8 animales con un tumor por animal y otro de tratamiento con 6 animales y un tumor por animal. El fármaco anti-LEFTY se inoculó intratumoralmente, 5 días a la semana durante 2 semanas, a una concentración de 1 ug/uL: Ralentización del crecimiento tumoral en el grupo tratado respecto al grupo control. Durante el período de Wash Out los efectos del anticuerpo se mantienen y el crecimiento tumoral continúa siendo lineal. Figura 44: La inhibición Farmacológica de LEFTY reduce el crecimiento tumoral en modelos de experimentación animal. Fotografía de comparación entre el grupo tratado con anticuerpo Anti-LEFTY y el grupo control. 81 Figura 45: La formación de oncosferas primarias se ve disminuida en las células obtenidas de tumores tratados con anticuerpo Anti-LEFTY. 82 8.9 EL ANTICUERPO ANTI-LEFTY ACTÚA DE FORMA SINÉRGICA CON LA TEMOZOLOMIDA REDUCIENDO EL VOLUMEN TUMORAL EN MODELOS DE EXPERIMENTACIÓN ANIMAL A continuación, decidimos llevar a cabo un nuevo ensayo en el cual valoramos cual es el efecto sobre el crecimiento tumoral del inhibidor de LEFTY cuando este se usa de forma combinada con el fármaco Gold standard en el tratamiento del glioblastoma, el agente quimioterápico Temozolomida. Para ello inoculamos 500.000 células U87 en el tejido subcutáneo de ratones inmunodeprimidos, dejamos crecer los tumores, y cuando estos alcanzaron un volumen entre 25-50 mm3 establecimos 3 grupos; Un grupo control en el que se inyectaría placebo (DMSO), un grupo de tratamiento con Temozolomida que se inyectaría durante 5 días seguidos, y un tercer grupo de ratones que se tratarían con 5 días de Temozolomida seguido de 3 semanas de anticuerpo anti-LEFTY que sería inyectado cada 3 días. Ambos fármacos fueron administrados de forma intratumoral. Realizamos mediciones del volumen tumoral de forma seriada mientras duró el ensayo. En primer lugar, observamos que los tumores alcanzaron 25-50 mm3 en el día 29 post inyección, momento en el que se pincharon los animales con placebo o con Temozolomida. El seguimiento del tratamiento mostró una clara ralentización del crecimiento tumoral en el grupo tratado con Temozolomida (Fig 46 A). De hecho, a los 2-3 días de acabar el experimento (día 53 del experimento) los controles crecieron de manera continua y significativa hasta alcanzar un volumen medio de 16003 a los 43 días de experimento, mientras que los tratados con TMZ no superaron los 250 mm3 y los seleccionados para ser tratados también con anticuerpo estaban en 50 mm3. Esta diferencia se mantuvo hasta el final del experimento ya que los controles siguieron creciendo hasta alcanzar un volumen medio de 1500mm3 a los 54 días de experimento, los tratados con TMZ no superaron los 200mm3 (Fig .46 A). A continuación, se realizó el tratamiento con el anticuerpo anti-LEFTY con 9 inyecciones entre los días 29 y 50 del experimento. En este caso, se comparó la progresión del grupo tratado con Temozolomida frente al tratado con Temozolomida y Anticuerpo Anti-LEFTY. De manera notoria, este último grupo no solo mostró un detenimiento del crecimiento tumoral si no la disminución de tamaño de algunos tumores. De hecho, el tratamiento con LEFTY provocó que el volumen de los tumores pasara de 60 mm3 en el día 4 a 50 mm3al acabar le experimento el día 54 (Fig. 46 AB). Por el contrario, los tratados sólo con Temozolomida pasaron de 70 mm3 a 270 mm3. El peso de los tumores tras el sacrificio confirmó las diferencias entre los 3 grupos. Mientras que los controles tenían un peso medio de 1,25 gramos, los tratados con Temozolomida alcanzaron un peso de 0,2 gramos y los de doble tratamiento 0,09 gramos (Fig. 46C-D) La tinción inmunohistoquímica mostró una significativa reducción de la expresión de LEFTY 1 en los tumores tratados frente a los controles siendo esta mayor en el grupo de los tratados con TMZ y anti-LEFTY (Fig 46 E) 83 Estos resultados confirman el potencial anti-tumoral tanto de la Temozolomida como del anticuerpo anti-LEFTY y sugieren que ambos fármacos podrían actuar de forma sinérgica. Figura 46: Efecto la modulación de la vía SMAD junto con el efecto alquilante de la TMZ producen una disminución del volumen tumoral in vivo. Se establecieron 3 grupos, un grupo control con 5 animales, otro tratado con TMZ con 15 animales y un tercer grupo tratado con TMZ y anti-LEFTY con 15 animales. Se generó un tumor por animal esta vez. Finalmente obtuvimos 4 tumores en el grupo control, 10 en grupo TMZ y 11 en el grupo TMZ+ anti-LEFTYA. Se realizaron 5 inyecciones diarias de TMZ intraperitoneal a una concentración de 5mg /Kg y 3 inyecciones de anti-LEFTY intratumoral , 3 veces por semana durante 3 semanas: A) y B) Disminución del volumen tumoral in vivo. C) y D) Los tumores tratados muestran un peso significativamente menor que los controles E) Disminución de la expresión de LEFTY en los tumores tratados. 84 9 DISCUSIÓN El Glioblastoma es el tumor cerebral primario más frecuente y más agresivo del SNC (Thakkar et al., 2014) Los costes directos e indirectos de este tumor suman unos 200.000 euros por paciente tratado (Raizer et al., 2015; Undabeitia et al., 2018). Cada año son diagnosticadas unas 1500 personas en nuestro país, lo que supone un gran coste para nuestra sociedad. A diferencia de los que ha ocurrido con otros tipos de tumores (Ades et al., 2017; McQuade et al., 2017; S. Yu et al., 2020), los avances en tratamiento del Glioblastoma son prácticamente inexistentes. Desde la implantación del protocolo STUPP en 2005 y a pesar de los numerosas líneas de investigación abiertas en la búsqueda de nuevos tratamientos farmacológicos, ninguno ha mejorado la escasa mediana de supervivencia que logra la Temozolomida ( 5 % a los 5 años ) cuando se combina con la máxima resección quirúrgica y la radioterapia (E. K. Liu et al., 2020; Stupp et al., 2005) Como hemos comentado previamente, de las docenas de terapias investigadas desde la aparición del protocolo STUPP solamente dos de ellas han sido aprobadas por la FDA e introducidas en las guías terapéuticas para el manejo del Glioblastoma (Nabors et al., 2020), pero ninguna de ellas ha conseguido grandes mejoras en la Supervivencia Global de los pacientes con esta terrible enfermedad. (Gilbert et al., 2014; Stupp et al., 2017) Por todo lo relatado anteriormente creemos que la inversión de recursos en la investigación y estudio de nuevas vías de señalización celular involucradas en el proceso bilógico del Glioblastoma que permitan desarrollar nuevas moléculas efectivas en su tratamiento está ampliamente justificada. Siguiendo esta línea, hace años que nuestro Centro presenta un proyecto de Medicina Traslacional en el que clínicos y básicos trabajan en equipo construyendo un flujo bidireccional que va de la cabecera del paciente al laboratorio y viceversa. Dentro de este proyecto, comenzamos hace pocos años con la caracterización de una vía de señalización que parece estar desregulada en el Glioblatoma multiforme y la búsqueda de su silenciamiento farmacológico. Dicha vía es la de LEFTY-SMAD. La cual forma parte de una de las más complejas, constantes y pleiotrópicas de todas las vías de señalización celular, la vía de la superfamilia del TGFb. (Ulloa & Tabibzadeh, 2001) Lefty (left-right determination factor) es una proteína sintetizada como precursor de 42kDa que es escindida en dos de 34 y 28 kDa.(Ulloa et al., 2001) Estas proteínas se conocen como Lefty 1 ( Lefty A) y Lefty 2 ( Lefty B) y tienen un papel fundamental en la regulación de la vía de la Superfamilia TGF b , en concreto de la regulación de las vías Nodal y BMP . LEFTY es un inhibidor de la vía TGFb ya que impide la fosforilación de SMAD 2 y SMAD 5 (Ulloa & Tabibzadeh, 2001; Zabala et al., 2020) , bloquea la unión de NODAL con su receptor transmembrana e inactiva el cofactor Cripto el cual es necesario para el correcto acoplamiento de NODAL al receptor transmembrana (Ulloa & Tabibzadeh, 2001) La función principal y más estudiada de LEFTY y SMAD consiste en su papel regulador de diferentes procesos embrionarios (Shiratori & Hamada, 2014) Sin embargo, recientes publicaciones relacionan el papel de la señalización SMAD con la carcinogénesis, si bien , no está definido su papel, apareciendo esta vía como promotora del desarrollo tumoral (W. Chen et al., 2019; Guo et al., 2015; X. Xu et al., 2019; Zhu et al., 2021) y como supresora de tumores (Miura et al., 2019; Zabala et al., 2020) En el caso concreto de LEFTY, el último trabajo de Zabala et al., establece de manera robusta que su silenciamiento 85 reduce de manera muy severa la actividad de las células madre tumorales postulándolo como una novedosa y atractiva diana terapéutica. En concreto, 2 estudios han dado alguna pincelada sobre la expresión y función de LEFTY en glioblastoma. Matsumoto et al analizó la expresión de LEFTY en 95 muestras de regiones perinecróticas de glioblastoma y observó que estaba elevado (Matsumoto et al., 2020).En cambio Sun et al observaron que la expresión proteica de LEFTY medido mediante Western Blot en células de Glioma (GBM8401 y células de GBM del China Center for Type Culture Collection) era prácticamente inexistente (Sun et al., 2014). En línea con estos resultados observamos que la expresión de LEFTY es heterogenea pero que se encuentra elevada en la mayoría de biopsias humanas establecida en la cohorte de pacientes del Hospital Donostia. Además, completamos el análisis transcripcional de LEFTY-1, LEFTY 2, SMAD 2 y SMAD 5 en diferentes muestras de Glioblastoma del portal Gliovis comparándolas con muestras de tejido no tumoral para ver si se confirmaba un patrón de expresión robusto entre las proteínas citadas anteriormente. Los datos resultantes fueron heterogéneos para los 4 genes consultados. Observamos que los niveles de Expresión de LEFTY 2 estaban elevados, mientras que los de LEFTY 1 se encontraban disminuidos. LEFTY 1 y LEFTY 2 tienen una homología de más del 95% y hay que estudiar en detalle las sondas usadas para poder dar respuesta a la expresión diferencial entre ellas y con lo observado a nivel de proteína. Los niveles de SMAD2 no parecen estar alterados en 2 de las cohortes mientras que en la tercera están elevados. Por último, la expresión de SMAD5 está elevado en las muestras de glioblastoma de la TCGA al ser comparados con el tejido cerebral control. Es importante destacar que la activación de SMAD se produce por fosforilación, dato no recogido en estos análisis por lo que debemos ser prudentes con la interpretación de estos resultados. Estos datos heterogéneos son congruentes con los estudios a cerca de la expresión de SMAD que se han realizado en Glioblastoma. Zhang et al observaron que la expresión de SMAD 2 estaba disminuida Glioblastoma (L. Zhang et al., 2006). Por el contrario Horst et al encontraron que la expresión del ARNm de SMAD 2 aumentaba según se incrementaba el grado de malignidad de los gliomas analizados (Horst et al., 1992) A continuación, quisimos obtener información clínica. En concreto, saber si existía alguna asociación entre niveles de expresión de LEFTY y SMAD y la supervivencia de los pacientes con Glioblastoma.A pesar de la existencia de los estudios mirando expresión de LEFTY o SMAD en glioblastoma, no hemos encontrado ninguna publicación que trate sobre este punto. Empleamos las muestras del Portal Gliovis (Bowman et al., 2017) y analizamos dos cohortes , una en la que se incluía una mezcla de muestras de Glioblastomas Primarios, Secundarios y Recurrentes , y otra en la que solamente se incluían los recurrentes. Las curvas de Supervivencia de Kaplan Meier muestran que existe una asociación significativa entre niveles de expresión elevados, tanto de LEFTY 1 como de LEFTY 2, y una menor supervivencia de los pacientes, sobre todo en aquellos que eran recurrentes, en los que la mediana de supervivencia era de 2,4 meses menor en aquellas muestras en los que la expresión de LEFTY estaba aumentado. En cuanto SMAD no se aprecia que haya ninguna asociación entre niveles de expresión y supervivencia. Sin embargo, estos datos hacen pensar que probablemente LEFTY pueda tener un papel en la patogénesis del Glioblastoma. 86 En el año 2005 Wei et al compararon los genes más expresados en líneas de células Stem de ratones y humanos y observaron que LEFTY, entre otros marcadores como SOX 2 , Oct 4 y NODAL, estaba muy expresado en células Stem de ambas especies, este resultado les hizo hipotetizar que LEFTY debe tener un papel importante en el proceso de autorrenovación celular en ambas especies (Wei et al., 2005).Ante la ausencia de información contundente a cerca de la expresión y función de LEFTY y SMAD en el Glioblastoma, decidimos ampliar nuestro análisis y llevar a cabo la caracterización de la expresión de ARN-m y proteico en diferentes líneas convencionales de Glioblastoma y en varias líneas celulares de GSCs. Realizamos también ensayos de diferenciación y desdiferenciación celular con las líneas anteriormente comentadas. Empleamos como control de los ensayos una línea de astrocitos sanos. Nuestros resultados muestran que LEFTY está expresado en todas las líneas celulares siendo sus niveles más altos en altos en la población de células madre de glioma derivadas de pacientes. Además, parece que la expresión de LEFTY se modifica en función del estado de diferenciación celular, aumentado cuanto más indiferenciada está la célula y disminuyendo cuando esta se diferencia. Estos datos están en línea con el trabajo de Wei, lo publicado por Zabala et al, 2020 que identifica a LEFTY como un gene relevante para la regulación de las células madre tumorales de mama (Ulloa et al., 2001; Zabala et al., 2020), y por el trabajo de Matsumoto que muestra que niveles elevados de LEFTY promueven la actividad tumoral y la adquisición de características de células madre en Glioblastoma (Matsumoto et al., 2020). Ulloa et al y Zabala teorizan que LEFTY inhibe no solo al complejo SMAD2/SMAD3/SMAD4 sino también a SMAD5 (Ulloa et al., 2001; Zabala et al., 2020) lo que es compatible con nuestros resultados que muestran que la expresión de SMAD 2 parece estar disminuida en las líneas tumorales en comparación con las líneas sanas. La expresión de SMAD 5 parece estar aumentada cuando las células se encuentran en una fase más diferenciada. Según los datos anteriores queda claro que las células de Glioblastoma presentan una expresión elevada de LEFTY y parece que es tanto más elevada cuando más indiferenciada sea la población celular. En el año 2014, Sun et al observaron que la sobrexpresión de LEFTY en células de glioblastoma originaba una reducción de la proliferación y de la invasión y un aumento de la apoptosis de dichas células tumorales (Sun et al., 2014). Sin embargo, seis años más tarde,Matsumoto et al estudiaron LEFTY, también en Glioblastoma y observaron que la hipoxia tisular favorecía la sobreexpresión de dicha proteína y que su sobre-expresión ejercía un efecto promoviendo la supervivencia celular al influir sobre la apoptosis, proliferación y características EMT/CSC, (Matsumoto et al., 2020) En el año 2015 Dong et al realizaron ensayos de silenciamiento de SMAD 2 y SMAD 3 mediante trasnfección lentiviral de ARN de horquilla corta (Sh ARN) en células U251 de Glioblastoma. Después realizaron ensayos de proliferación y comprobaron que el silenciamiento del complejo SMAD producía un aumento de la proliferación celular en células de Glioblastoma.(Dong et al., 2015) Ese mismo año, Yu et al publicaron un artículo en el que mostraba resultados similares a los de Dong al. En primer lugar, analizaron la expresión proteica de SMAD 2 y 3 de muestras de pacientes intervenidos de Glioblastoma y comprobó que la expresión estaba elevada. A continuación, silenciaron SMAD 2 y SMAD 3 en células de Glioblastoma A172 y U87 mediante transfección lentiviral de ARN de horquilla corta (Sh ARN) y realizaron estudios de viabilidad celular comprobando un aumento de la proliferación de las células de Glioblastoma.Esta acción parece estar mediada por p27 (Y. Yu & Ran, 2015). P 27 tiene como función detener el ciclo 87 celular impidiendo que la célula entre en división. En condiciones normales , TGFb/SMAD aumenta los niveles de P27 , esta a su vez inhibe a CDK/CICLINA lo que impide que RB(proteína del retinoblatoma ) active a E2F ( factores de transcripción de genes necesarios para el paso de célula en Fase G0 a G1/S) (Donovan & Slingerland, 2000) Este es un mecanismo mediante el cual la regulación de la vía SMAD puede afectar a la proliferación de las células de Glioblastoma. Basándonos en lo expuesto anteriormente decidimos llevar a cabo una serie de ensayos en los cuales inhibimos la proteína LEFTY, mediante el empleo de un anticuerpo monoclonal antiLEFTY, con el cual tratábamos las células tumorales durante 72h, para así regular la señalización SMAD en tres líneas convencionales de Glioblastoma (U87, U251, A172) y dos líneas de célula madre de Glioma (GNS166, GNS179). La viabilidad celular se vio significativamente disminuida (un 40 % menos) tras la exposición celular durante 72 horas al anticuerpo monoclonal antiLEFTY. Para conocer qué proceso biológico influía en esta disminución de la viabilidad celular, decidimos cuantificar mediante estudio inmunohistoquímico marcadores de Proliferación (Edu y Fosfohistona 3), Apoptosis (Caspasa 3) y Senescencia (B-Galactosidasa), en células tratadas y en células no tratadas. Observamos que el bloqueo de LEFTY genera un aumento mayor al 50 % en la cuantificación de células positivas para marcadores de Senescencia y Apoptosis y una disminución similar en los marcadores de proliferación. Como vimos anteriormente, nuestros resultados y los de otros autores indican que LEFTY debe tener un papel importante en el proceso de autorrenovación de ciertas células tumorales. Decidimos comprobar este supuesto testando dicha capacidad de autorrenovación de células de Glioblastoma U87 tras inhibir LEFTY mediante la acción de un anticuerpo anti-LEFTY. Para ello realizamos ensayos de formación de oncoesferas, las cuales disgregábamos, para después medir la capacidad que tenían de volver a formar nuevas esferas (2ry spheres) Los resultados mostraron que las células a las que se les había inhibido LEFTY formaban un 60 % menos de esferas que aquellas a las que no se lo había inhibido. Nuestros resultados parecen indicar que LEFTY tiene un papel relevante en la caracterización Stem de la célula de Glioblastoma y en su capacidad de autorrenovación. En línea con nuestros resultados, Matsumoto et al publicaron un estudio en 2018 en el que observaron que la sobreexpresión de LEFTY en cáncer de Ovario originaba que las células adquiriesen marcadores mesenquimales (Vimentina, N-Cadherina) y de CSC (SOX 2, ALDH y CD 44) y su inhibición mediante Sh ARN hacía que estos disminuyesen, teorizando que LEFTY está relacionado con las características EMT-CSC de estas células tumorales. (Matsumoto et al., 2018) El mecanismo mediante el cual LEFTY genera este efecto no lo hemos estudiado a nivel molecular, sin embargo, varios estudios en Glioblastoma indican que la potenciación de la vía BMP inhibe las principales características de las GSC. (J. Lee et al., 2008; Piccirillo et al., 2006) Chirasani et al estudiaron el papel de la vía BMP en Glioblastoma y afirman que la exposición de Glioma Stem Cell humanas y a la proteína morfogenética ósea 7(BMP7) induce la diferenciación de las células madre tumorales, atenúa la expresión de marcadores de tipo madre y reduce la autorrenovación y la capacidad de iniciación tumoral mediante la activación del eje SMAD 1/5/8 y la consecuente regulación negativa del factor de transcripción Olig2.(Chirasani et al., 2010) Hemos de destacar que los estudios que hemos analizado hasta ahora llevaron a cabo silenciamiento genético de LEFTY mediante transfección lentiviral de Sh ARN. Nuestro grupo fue un paso más allá al emplear un anticuerpo monoclonal anti-LEFTY como estrategia farmacológica. Finalmente decidimos valorar cómo afectaría la inhibición de LEFTY al crecimiento tumoral de Glioblastomas subcutáneos generados en modelos experimentales inmunosuprimidos. Para ello 88 realizamos dos experimientos. En el primero comparamos el crecimiento tumoral entre un grupo tratado con anticuerpo anti-LEFTY (tratamiento durante diez días mediante inyección subcutánea intratumoral de 10 μL) y un grupo control. En el segundo comparamos el crecimiento tumoral en un grupo tratado exclusivamente con TMZ durante 5 días, un grupo tratado con TMZ durante 5 días + Anti-LEFTY 3 semanas y un grupo control. Los resultados del primer ensayo mostraron que los tumores en los que LEFTY había sido inhibido, mostraron un crecimiento ralentizado respecto a los controles, de forma que a los 25 días de tratamiento. Al igual que en el estudio in vitro, para esclarecer qué proceso biológico estaba tras esta realentización del crecimiento tumoral, analizamos los marcadores de apoptosis y proliferación mediante técnicas de inmunohistoquímica,en cortes de tumores tratados y no tratados. La expresión del marcador de apoptosis (caspasa 3) fue significativamente más baja en el grupo tratado y el marcador de proliferación Ki 67 significativamente más elevado en el grupo control. El segundo ensayo mostró que el tratamiento conjunto entre TMZ y Anti-LEFTY produce una ralentización del crecimiento tumoral significativamente mayor que en el grupo tratado exclusivamente con TMZ y que, además, este tratamiento conjunto no solo ralentiza si no que disminuye el volumen en algunos tumores sugiriendo que pueda existir un efecto sinérgico entre ambos fármacos. Según nuestros resultados podemos decir que la inhibición de LEFY produce una disminución de la capacidad tumorogénica de las células de Glioblastoma in vitro e in vivo debido a un aumento de la Apoptosis y de la Senescencia y una disminución de la Proliferación y de la capacidad de autorrenovación. En nuestro estudio no hemos analizado los mecanismos moleculares mediante los cuales estos procesos se llevan a cabo, sin embargo, estos podrían deberse a la pérdida de influjo inhibitorio de LEFTY sobre vías de la superfamilia TGFb como son BMP y NODAL. En células sanas y durante las primeras etapas del desarrollo neoplásico, la vía TGFb favorece la supresión tumoral(Ikushima & Miyazono, 2010; Yeh et al., 2019) mediante diferentes mecanismos como son: el control de la proliferación celular mediante la activación de proteínas como p15/INK4b , p27Kip1, p21Cip1, con la consecuente de la detención del ciclo celular (Chu et al., 2008; C.-Y. Li et al., 1995) ; la activación de la apoptosis al interactuar con proteínas como DAPK (death associated protein kinase) , FAS y su efector BIM, SHIP que inhibe la vía de supervivencia celular PI3K-Akt , DAXX (Death Associated protein six) etc (Schuster & Krieglstein, 2002) ; y mediante la inactivación de Cáncer Stem Cells a través de la activación de PTEN con la consecuente inactivación de PI3K/AKT (Lombardo et al., 2011) o mediante la downregulacioón del factor de transcripción Olig 2(Chirasani et al., 2010) . Sin embargo, etapas más avanzadas del cáncer, mutaciones en diferentes niveles de esta vía le aportan un papel protumoral. La sobreexpresión de LEFTY, molécula inhibidora de la vía TGF b, puede ser una de estas alteraciones que promueva ese efecto protumoral. La pleiotropicidad de la vía hace difícil elucidar qué alteraciones moleculares originan cada uno de los efectos observados en nuestra investigación por lo que futuros estudios más concretos son necesarios para desentramar los complejos flujos de señales moleculares de esta vía, que participan en la tumorogenicidad del Glioblastoma. En resumen y para concluir debemos saber que la proteína LEFTY inhibe las proteínas SMAD, las cuales canalizan la señalización de multitud de ligandos de la superfamilia TGFb y ejercen múltiples acciones en la homeostasis celular que tienen un papel protagonista en el desarrollo del cáncer. Según nuestros estudios la expresión de LEFTY está alterada en el Glioblastoma y su regulación mediante la inhibición de LEFTY disminuye las características oncogénicas in vitro e in vivo postulándose como una estrategia terapéutica en el manejo del Glioblastoma. 95 hypermethylation is a common event in primary human neoplasia. Cancer Research, 59(4), 793-797. Ewan, K. 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