STUDY OF THE EFFECT OF SERUM-FREE MEDIA ON THE CULTIVATION OF LEISHMANIA PROMASTIGOTES IN VITRO

Journal of science. Lyon №70/2025 3 BIOLOGICAL SCIENCES STUDY OF THE EFFECT OF SERUM-FREE MEDIA ON THE CULTIVATION OF LEISHMANIA PROMASTIGOTES IN VITRO Aliyeva Sh., PhD in biological sciences V.Akhundov Scientific Research Medical Preventive Institute Azerbaijan Az1000, 216, M.Topchubashov st., Baku Huseynova F., PhD in medical sciences V.Akhundov Scientific Research Medical Preventive Institute Azerbaijan Az1000, 216, M.Topchubashov st., Baku Abseynova Z., V.Akhundov Scientific Research Medical Preventive Institute Azerbaijan Az1000, 216, M.Topchubashov st., Baku Eyvazli S., V.Akhundov Scientific Research Medical Preventive Institute Azerbaijan Az1000, 216, M.Topchubashov st., Baku Masimova I. V.Akhundov Scientific Research Medical Preventive Institute Azerbaijan Az1000, 216, M.Topchubashov st., Baku ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ БЕССЫВОРОТОЧНЫХ СРЕД НА КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПРОМАСТИГОТ LEISHMANIA İN VİTRO Алиева Ш. Кандидат биологических наук Научно-Исследовательский Институт Медицинской Профилактики им. В.Ахундова Азербайджан Az1000, 216, ул. М.Топчубашов, Баку Гусейнова Ф. Кандидат медицинских наук Научно-Исследовательский Институт Медицинской Профилактики им. В.Ахундова Азербайджан Az1000, 216, ул. М.Топчубашов, Баку Абсейнова З. Научно-Исследовательский Институт Медицинской Профилактики им. В.Ахундова Азербайджан Az1000, 216, ул. М.Топчубашов, Баку Эйвазли С. Научно-Исследовательский Институт Медицинской Профилактики им. В.Ахундова Азербайджан Az1000, 216, ул. М.Топчубашов, Баку Масимова И. Научно-Исследовательский Институт Медицинской Профилактики им. В.Ахундова Азербайджан Az1000, 216, ул. М.Топчубашов, Баку https://doi.org/10.5281/zenodo.17256209 Abstract Leishmaniasis is a global transmissible parasitic disease. The disease is widespread in 98 countries worldwide, with an annual incidence of approximately 0,7–1 million people and 26,000–65,000 deaths. Flagellated protozoa of the genus Leishmania are the causative agents of leishmaniasis. To effectively combat this disease, to create drugs and a vaccine, it is necessary to obtain a long-term culture of pathogens in vitro. The main requirement for creating a vaccine is the production of a large volume of promastigotes. At present, creating an optimal medium Journal of science. Lyon №70/2025 4 that would support this condition is a significant challenge. There are different types of media used for Leishmania, which mostly require fetal bovine serum as an expensive supplement. Availability of serum is a problem in some parts of tropical and subtropical countries involved in leishmaniasis. There is also a risk of various contaminants in this serum. Several studies have been conducted to replace fetal bovine serum in the culture medium with various other components to reduce the above-mentioned problems. The results of these studies showed that the Leishmania parasite was able to grow and survive in various serum-free media as well as in serum-supplemented media. Аннотация Лейшманиоз — это глобальное сложное трансмиссивное паразитарное заболевание. Это заболевание широко распространено в 98 странах мира ежегодной заболеваемостью около 0,7–1 миллиона человек и 26 000–65 000 смертей. Жгутиконосные простейшие рода Leishmania являются возбудителями лейшманиоза. Для эффективной борьбы с этим заболеванием, для создания лекарственных препаратов и вакцины требуется получение длительной культуры возбудителей in vitro. Основным требованием для создания вакцины является производство большого объема промастигот. В данное время создание оптимальной питательной среды, которая способствовала бы этому состоянию, является существенной проблемой. Существуют различные типы сред, используемых для Leishmania, которые в основном требуют эмбриональной бычьей сыворотки в качестве дорогостоящей добавки. Доступность сыворотки является проблемой в некоторых частях тропических и субтропических стран, вовлеченных в лейшманиоз. Существует также риск различных загрязнений в этой сыворотке. Было проведено несколько исследований по замене эмбриональной бычьей сыворотки в питательной среде другими различными компонентами для уменьшения вышеупомянутых проблем. Результаты этих исследований показали, что паразит Leishmania способен расти и выживать в различных средах в отсутствие сыворотки так же хорошо, как и в среде с добавлением сыворотки. Keywords: in vitro cultivation, Leishmania promastigotes, serum-free medium, L.major, L.tarentolae. Ключевые слова: культивирование in vitro, промастиготы Leishmania, бессывороточная среда, L.major, L.tarentolae. Введение Лейшманиоз — это глобальное сложное трансмиссивное паразитарное заболевание, вызываемое облигатным внутриклеточным паразитом рода Leishmania. Паразит передается в метациклической форме млекопитающим-хозяевам через укусы инфицированных самок москитов рода Phlebotomine во время их кровососания (16). Это заболевание широко распространено в 98 странах в некоторых частях тропических и субтропических зон с мировой ежегодной заболеваемостью около 0,7–1 миллиона человек и 26 000–65 000 смертей. Около 350 миллионов человек подвержены риску этого инфекционного заболевания (18). Для эффективной борьбы с этим заболеванием, для создания лекарственных препаратов и вакцины требуется получение длительной культуры возбудителей in vitro. За последние десятилетия для культивирования паразита Leishmania использовались различные виды сред, которые подразделяются на две основные группы: полутвердые двухфазные среды и жидкие монофазные среды. Эти среды (RPMI-1640, M199, BHI и NNN, а также Schneider’s Drosophila), нуждаются в обогащении путем добавления соответствующего количества крови или FBS (fetal bovine serum) для стимуляции деления клеток и поддержки долгосрочного роста промастигот Leishmania (8, 3). FBS (эмбриональная бычья сыворотка) содержит важные компоненты, такие как большое количество факторов роста, содержащих гормоны, витамины, транспортные белки и факторы адгезии, которые все имеют решающее значение для непрерывного поддержания и размножения культивируемого паразита (17, 9). Использование такого дорогостоящего компонента как FBS создает определенные проблемы и также повышает риск контаминации (2). Таким образом, требуется надежная замена животной сыворотки (4). Основная часть Важность культивирования клеток в бессывороточных средах сегодня широко признана. Бессывороточное культивирование паразитов Leishmania является экономически эффективным и улучшает крупномасштабное производство этих паразитов. До сих пор было предпринято несколько попыток найти подходящие заменители FBS путем разработки различных веществ, таких как вещества животного происхождения (10), изолят соевого белка (15) и смесь пептона и различных экстрактов (17, 14), а также некоторые определенные бессывороточные среды (14, 1). В исследовании Abdalla Hassan Sharief et al. (14) описана простая питательная среда для первичной изоляции и последующего культивирования промастигот Leishmania без использования сыворотки или цельной крови. Была описана сравнительно простая формула среды (CML) с использованием обычных, доступных и недорогих ингредиентов, которые могут заменить FBS, для культивирования промастигот Leishmania. Эта среда поддерживала рост паразитов со скоростью, сопоставимой с той, которая получена с использованием среды RPMI-1640 с добавлением сыворотки. Промастиготы Leishmania, размноженные в CML, продемонстрировали умеренную или высокую инфекционную способность при тестировании на линии макрофагальных клеток J774. Не было отмечено существенной разницы между штаммами Leishmania, культивируемыми в новой модифицированной Journal of science. Lyon №70/2025 5 среде, и штаммами, выращенными в среде RPMI1640, в инфекционности и репликативном потенциале их клеток. Использование новой CML может легко заменить другие двухфазные или жидкие среды из-за простоты приготовления и мгновенного использования, разумной цены, доступности ингредиентов и длительного срока хранения, который составляет 30–45 дней. Тот факт, что эта среда схожа с другими питательными средами по долговечности и количеству образующихся паразитов, может дать ей преимущество перед другими используемыми в настоящее время средами. В течение 8 недель непрерывного культивирования промастиготы L.donovani и L.major демонстрировали быстрое размножение как в среде RPMI-1640, так и в среде CML. Рост промастигот достиг наивысшего уровня на 6-й неделе культивирования, оставался стабильным в течение короткого периода после этого, а затем слегка снизился или регрессировал на 8-й неделе. Размножение изолятов Leishmania в среде CML оказалось близким к размножению изолятов, выращенных в среде RPMI-1640 в течение первых шести недель. В работе Ali SA et al. (1) описана полусинтетическая, автоклавируемая жидкая среда, не требующая включения сыворотки плода теленка (FCS) для успешного культивирования промастигот Leishmania in vitro. Паразиты выращивались в коммерчески доступной среде 199 с добавлением 10% FCS и 2% мочи млекопитающих, а рост сравнивался с той же средой без FCS. Рост паразитов в полусинтетической среде без FCS оказался немного лучше, чем в среде 199 с добавлением FCS. Santarem N et al. (13) отмечают, что идеальная питательная среда для промастигот Leishmania должна сохранять основные характеристики промастигот, обнаруженных у москитов (морфология и инфекционность). Исследователи проанализировали морфологию, жизнеспособность, прогрессию клеточного цикла и инфекционность. Они разработали простую среду без сыворотки (cRPMI). Паразиты, растущие в разных средах, демонстрировали разные биологические характеристики и различную инфекционность in vitro и in vivo. Разработанная среда cRPMI оказалась менее дорогой заменой традиционной среды с добавлением сыворотки для поддержания промастигот in vitro. Было выявлено что cRPMI идеально подходит для поддержания паразитов в лабораторных условиях, уменьшая ожидаемую потерю вирулентности с течением времени, типичную для культивирования паразитов. В другой работе (5) исследователи стремились оценить новую бессывороточную среду в культуре паразита Leishmania для будущей цели разработки живой вакцины против Leishmania. Среди различных видов Leishmania L.tarentolae является паразитом ящериц и непатогенен для человека. Этот паразит представлен как важный инструмент для производства рекомбинантных белков из-за его характеристик. Также имеется ряд других преимуществ: короткое время генерации в культуральной среде 6-10 часов, простое и доступное требование к питательным веществам, высокая скорость роста и простота в работе (6). L.tarentolae имеет потенциал и уже продемонстрировал эффективный подход для разработки безопасной и эффективной живой профилактической вакцины против инфекций Leishmania (12). В настоящей работе исследователи разработали простую, легкую в обращении, монофазную бессывороточную среду, названную CSFM, чтобы продемонстрировать ее потенциал для культивирования живого непатогенного рекомбинантного L.tarentolae , секретирующего Ppsp15-EGFP в качестве вакцинной мишени и патогенной формы Leishmania (L.major ). Кроме того, инфекционность паразита L.major в восприимчивой модели мышей BALB/c были подтверждены в присутствии этой новой бессывороточной среды. Использовались три типа L.tarentolae - штамм L.tarentolae Tar II (ATCC 30.267) дикого типа; L.tarentolae , экспрессирующий EGFP (L.tarentolae -EGFP) и рекомбинантный L.tarentolae -PpSP15EGFP, а также штамм L.major дикого типа (MRHO/IR/75/ER). На первом этапе промастиготы культивировались при 26°C в среде M199 с добавлением 5% инактивированной нагреванием FBS. Питательная среда M199 была предоставлена в качестве стандартной среды. Рекомбинантный L.tarentolae, секретирующий PpSP15-EGFP и дикий тип L.major культивировались в бессывороточной (CSFM) и сывороточно-дополненной среде. Затем оценивались и сравнивались скорость роста, экспрессия белка и инфекционность культивируемых паразитов в обоих условиях. Поведение роста рекомбинантного паразита L.tarentolae -PpSP15-EGFP, исследованное микроскопически в среде CSFM, сравнивали с обычной средой M199 с 5% FBS. Выяснилось, что среда CSFM, также, как и M199 с 5% FBS, может поддерживать рост паразита L.tarentolae -PpSP15-EGFP. Слегка значимая разница наблюдалась на 2-3-е дни после инокуляции (p <0,05); однако уровень роста в другие дни был схожим, и никаких значимых различий обнаружено не было (p >0,05). Проводилось ежедневное микроскопическое наблюдение за подвижностью паразита во время культивирования, и паразиты были обнаружены в нормальном размере с соответствующей подвижностью. Эти результаты описывают способность среды CSFM поддерживать размножение паразита L.tarentolae -PpSP15EGFP. Итак, в данном исследовании новая среда без сыворотки, названная CSFM, сравнивалась с M199, обогащенной 5% FBS, как коммерчески доступной и широко используемой жидкой средой для оценки морфологических и биологических критериев паразитов L.tarentolae -PpSP15-EGFP и L.major дикого типа. Было обнаружено, что типичный внешний вид промастигот L.tarentolae -PpSP15-EGFP - жгутиконосцы, подвижные и нормального размера в среде CSFM, точно такой же, как у паразитов, культивируемых в M199 с 5% FBS. Скорость роста промастигот L.major в среде CSFM оказалась схожей с M199, дополненной 5% FBS. Как показано, не было Journal of science. Lyon №70/2025 6 никаких существенных различий в уровне скорости роста L.major , культивируемых в среде CSFM, по сравнению с контрольной группой во все указанные временные точки (p > 0,05). В настоящем исследовании ученые стремились заменить FBS экономически эффективными дополнительными веществами для культивирования и размножения паразита Leishmania, особенно для культивирования паразита L.tarentolaePpSP15EGFP в пользу разработки вакцин и терапевтических целей, которые требовали безопасных условий для производственного процесса. В этой связи, чтобы найти подходящую замену FBS, были исследованы потребности паразитов Leishmania в питании. Известно, что потребности паразитов Leishmania в аминокислотах сложны. В прошлом были проведены некоторые исследования для определения необходимых аминокислот для промастигот Leishmania путем удаления каждой аминокислоты отдельно из культуральной среды, и результаты показали, что аминокислоты, включая триптофан, фенилаланин, аргинин, лейцин, лизин, валин, серин, гистидин, тирозин и треонин, необходимы для выживания и непрерывного культивирования промастигот Leishmania (11). Также известно, что гем является важной биомолекулой, действующей как критический регуляторный компонент в окислительном метаболизме, хранении и транспорте кислорода и передаче сигнала у различных видов Leishmania , в конечном итоге влияя на рост и выживание паразита. Уже показано, что паразит Leishmania и другие простейшие, например, трипаносоматиды, имеют метаболический дефект и лишены необходимых ферментов для синтеза этой молекулы. Поэтому необходимо получать гем из окружающей среды (7). Другие питательные вещества, необходимые паразиту Leishmania, включают витамины, такие как никотиновая кислота, фолиевая кислота, биотин, тиамин, рибофлавин и пантотенат (13). Анализ иммуноблоттинга показал, что профиль экспрессии белка PpSP15-EGFP в промастиготах L.tarentolae -PpSP15-EGFP, выращенных в среде CSFM, с точки зрения молекулярной массы и относительной интенсивности аналогичен обогащенной сывороткой культуральной среде. Эти результаты ясно продемонстрировали, что паразиты L.tarentolae -PpSP15-EGFP способны размножаться и способны выживать в среде CSFM. Исследование также продемонстрировало, что паразит, выращенный в среде CSFM, обладал такой же способностью, по сравнению с M199 с 5% FBS, заражать мышей BALB/c. Мазки показали нормальные морфологические характеристики промастигот L.major , выращенных в обеих средах. Измерение паразитарной нагрузки и отека подушечек лап со значительным поражением показало надлежащую инфекционную силу промастигот L.major в обеих средах. Следовательно, рост в этой бессывороточной среде не оказал влияния на типичные морфологические характеристики и инфекционность паразита L.major . Эти результаты ясно продемонстрировали, что удаление FBS из-за замены другими питательными веществами в среде CSFM не оказало влияния на паразита на уровне инфекционности in vivo. В целом эти данные подтверждают, что среда CSFM благодаря своим компонентам, включая незаменимые и заменимые аминокислоты, витамины, высокое содержание глюкозы и другие питательные вещества, способна поддерживать рост и инфекционность как L.tarentolae -PpSP15-EGFP, так и L.major дикого типа. Другим важным вопросом является то, что CSFM имеет доступные ингредиенты с легким доступом, а также является экономически эффективной. Кроме того, эта питательная среда может использоваться в ферментере для массового производства Leishmania для вакцинации и терапевтических целей. Это исследование показало, что CSFM может быть перспективной заменой среды с добавлением FBS в культуре паразитов Leishmania для создания живой вакцины. Выводы Проведенные исследования показывают, что для культивирования in vitro промастигот Leishmania можно использовать менее дорогостоящие бессывороточные питательные среды. Удаление FBS из состава питательных сред не оказывает влияния на паразита на уровне инфекционности in vivo. Список литературы: 1. Ali SA, Iqbal J, Ahmad B, Masoom M. A semisynthetic fetal calf serum-free liquid medium for in vitro cultivation of Leishmania promastigotes. The American journal of tropical medicine and hygiene. 1998;59(1):163–165. doi: 10.4269/ajtmh.1998.59.163. 2. Brunner D, Frank J, Appl H, Schöffl H, Pfaller W, Gstraunthaler G. The serum-free media interactive online database. Alternatives to animal experimentation. 2010;27(1):53–62. doi: 10.14573/altex.2010.1.53. 3. de Almeida Rodrigues I, da Silva BA, dos Santos ALS, Vermelho AB, Alviano CS, Rosa MdSS. A new experimental culture medium for cultivation of Leishmania amazonensis: its efficacy for the continuous in vitro growth and differentiation of infective promastigote forms. Parasitology research. 2010;106(5):1249–1252. doi: 10.1007/s00436-0101775-4. 4. Gstraunthaler G. Alternatives to the use of fetal bovine serum: serum-free cell culture. Alternatives to animal experimentation. 2003;20(4):275–281. 5. Habibzadeh S, Doroud D, Taheri T, Seyed N, Rafati S. Leishmania Parasite: the Impact of New Serum-Free Medium as an Alternative for Fetal Bovine Serum. Iran Biomed J. 2021;25(5):349–358. doi: 10.52547/ibj.25.5.349. 6. Klatt S, Simpson L, Maslov DA, Konthur Z. Leishmania tarentolae: Taxonomic classification and its application as a promising biotechnological expression host. PLoS neglected tropical diseases. 2019;13(7):e0007424. doi: 10.1371/journal.pntd.0007424. 7. Laranjeira-Silva MF, Hamza I, Pérez-Victoria JM. Iron and Heme Metabolism at the Leishmania– Journal of science. Lyon №70/2025 7 Host Interface. Trends in Parasitology. 2020;36(3):279–289. doi: 10.1016/j.pt.2019.12.010. 8. Merlen T, Sereno D, Brajon N, Rostand F, Lemesre JL. Leishmania spp: completely defined medium without serum and macromolecules (CDM/LP) for the continuous in vitro cultivation of infective promastigote forms. The American journal of tropical medicine and hygiene. 1999;60(1):41–50. doi: 10.4269/ajtmh.1999.60.41. 9. Mesalam A, Lee KL, Khan I, Chowdhury M, Zhang S, Song SH, Joo MD, Lee JH, Jin JI, Kong IK. A combination of bovine serum albumin with insulin– transferrin–sodium selenite and/or epidermal growth factor as alternatives to fetal bovine serum in culture medium improves bovine embryo quality and trophoblast invasion by induction of matrix metalloproteinases. Reproduction, fertility and development. 2019;31(2):333–346. doi: 10.1071/RD18162. 10. Muniaraj M, Lal C, Kumar S, Sinha P, Das P. Milk of cow (Bos taurus), buffalo (Bubalus bubalis), and goat (Capra hircus): a better alternative than fetal bovine serum in media for primary isolation, in vitro cultivation, and maintenance of Leishmania donovani promastigotes. Journal of clinical microbiology. 2007;45(4):1353–1356. doi: 10.1128/JCM.01761-06. 11. Nayak A, Akpunarlieva S, Barrett M, Burchmore R. A defined medium for Leishmania culture allows definition of essential amino acids. Experimental parasitology. 2018;185:39–52. doi: 10.1016/j.exppara.2018.01.009. 12. Pirdel L, Farajnia S. A non-pathogenic recombinant Leishmania expressing Lipophosphoglycan 3 against experimental infection with Leishmania infantum. Scandinavian journal of immunology. 2017;86(1):15–22. doi: 10.1111/sji.12557. 13. Santarem N, Cunha J, Silvestre R, Silva C, Moreira D, Ouellette M, Cordeiro-Da-Silva A. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 2014;141(2):192–205. doi: 10.1017/S0031182013001388. 14. Sharief AH, Khalil EAG, Omer SA, Abdalla HS. Innovative serum-free medium for in vitro cultivation of promastigote forms of Leishmania species. Parasitology international. 2008;57(2):138–142. doi: 10.1016/j.parint.2007.10.003. 15. Sidana A, Alam A, Farooq U. Soy protein isolate: A substitute of fetal bovine serum for the in vitro cultivation of Leishmania donovani. Legume researchan international journal. 2018;41(2):218–221. 16. Steverding D. The history of leishmaniasis. Parasites and vectors. 2017;10(1):82. doi: 10.1186/s13071-017-2028-5. 17. Van der Valk J, Mellor D, Brands R, Fischer R, Gruber F, Gstraunthaler G, Hellebrekers L, Hyllner J, Jonker F, Prieto P, Baumans V. The humane collection of fetal bovine serum and possibilities for serumfree cell and tissue culture. Toxicology in vitro. 2004;18(1):1–12. doi: 10.1016/j.tiv.2003.08.009. 18. WHO. Leishmaniasis. 2020. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/leishmaniasis.