SÜTÇÜ SIĞIRLARDA GENOM BOYU İLİŞKİ ANALİZİ ÇALIŞMALARI

103 | SAĞLIK BİLİMLERİ ALANINDA ULUSLARARASI AKADEMİK ÇALIŞMALAR VE TEORİK BİLGİLER-IV BÖLÜM 7 SÜTÇÜ SIĞIRLARDA GENOM BOYU İLİŞKİ ANALİZİ ÇALIŞMALARI Ali Osman TURGUT1 Davut KOCA2 DOI: https://dx.doi.org/10.5281/zenodo.10408073 1 Siirt Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Zootekni Anabilim Dalı, Siirt, Türkiye, E-posta: aosman.turg[email protected]du.tr, ORCID: 0000-0001-6863-0939 2Van Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı, Van, Türkiye, E-posta: [email protected]u.tr, ORCID: 0000-0002-7962-6959 SAĞLIK BİLİMLERİ ALANINDA ULUSLARARASI AKADEMİK ÇALIŞMALAR VE TEORİK BİLGİLER-IV | 104 105 | SAĞLIK BİLİMLERİ ALANINDA ULUSLARARASI AKADEMİK ÇALIŞMALAR VE TEORİK BİLGİLER-IV GİRİŞ Genom boyu ilişki analizi çalışmaları (genome-wide association studies; GWAS), genom boyunca binlerce genetik varyasyonun ilgilenilen bir fenotiple olan ilişkini inceleyen ve genotip-fenotip ilişkisini ortaya koyan bir moleküler yaklaşımdır. Bu yaklaşım, insanlarda ve hayvanlarda yürütülen genetik çalışmalarına yeni bir boyut ve ivme kazandırmıştır (Barsh ve ark., 2012; Tam ve ark., 2019). GWAS çalışmaları ilk olarak insanlarda başlamıştır. Bu bağlamda genellikle hastalıklarla ilişkili genetik varyasyonların belirlenmesi noktasında önemli bir avantaj yakalamıştır. İnsanlarda başlayan bu çalışmalar daha sonra evcil memeli hayvanlara da tatbik edilmeye başlanmıştır. Özellikle DNA dizileme platformlarının gelişmesi ve yaygın kullanılmasıyla evcil hayvanlarda yürütülen GWAS çalışmalarının sayısı hızlı bir şekilde artmıştır. Özellikle 2005 yılından sonra geliştirilmeye başlanan tek nükleotid polimorfizmi (single nucleotide polymorphism; SNP) çipleri (veya array) sayesinde memeli hayvanlarda yürütülen GWAS çalışmaları önemli bir hız kazanmıştır. Günümüzde pek çok farklı hayvan türü için geliştirilmiş çok sayıda SNP çipi bulunmaktadır. Bu çiplerin yoğunluğu 3000 SNP’den başlayıp 777000 SNP’ye kadar değişmektedir (Eggen ve ark., 2012; Wiggans ve ark., 2017). GWAS çalışmalarının en yaygın olarak yürütüldüğü çiftlik hayvanı türü sığır türüdür. Verim yönü olarak incelendiğinde ise daha çok süt sığırı yetiştiriciliğinde GWAS uygulamalarının yaygın olduğu görülmektedir. Bu bağlamda süt sığırı yetiştiriciliğinde başta ekonomik önemi olan süt verimi, süt kalitesi, fertilite, büyüme, reprodüktif parametreler gibi kantitatif karakterler olmak üzere hatalık direnci ve ısı stresi gibi konularda da GWAS çalışmaları yürütülmektedir (Dikmen ve ark., 2015; Paiva ve ark., 2020; Mohammadi ve ark., 2020; Carthy ve ark, 2022; Heaton ve ark., 2022). Yapılan bu çalışmalarda verim özellikleri ile ilişkili SNP’ler ve aday genler belirlenerek verim özelliklerini etkileyen moleküler mekanizmalar ortaya konulmaya çalışılmaktadır. Bu kitap bölümünde süt sığırı yetiştiriciliğinde yürütülen GWAS çalışmaları özetlenmeye çalışılmıştır. SAĞLIK BİLİMLERİ ALANINDA ULUSLARARASI AKADEMİK ÇALIŞMALAR VE TEORİK BİLGİLER-IV | 106 1. GWAS AŞAMALARI DENEY VE DİZAYNI Klasik bir GWAS çalışması; DNA ve fenotipik bilginin toplanması, hayvanların SNP çipleri veya yeni nesil dizileme yöntemleriyle genotiplendirilmesi, SNP kalite kontrolü (SNP quality control; SNP QC), istatistiksel ilişki analizi (genotip-fenotip ilişki analizi) ve sonuçların değerlendirilmesi aşamalarından oluşmaktadır. İlişki analizi sonrasında ilgili SNP’ler genom veri tabanlarında incelenerek verim özelliği ile yüksek önem derecesinde ilişkili olduğu belirlenen SNP’lerin hangi kromozomal lokasyonda ve hangi gen üzerinde yer aldığı tespit edilerek ilgili kalitatif veya kantitatif özellikle ilişki aday genler belirlenebilmektedir (Uffelman ve ark., 2021). Daha sonrada yolak analizleri ile ilgili genlerin birbirleriyle olan ilişkileri ve verim özelliği üzerine etkili moleküler mekanizma ortaya konulmaktadır (Paiva ve ark., 2020). GWAS çalışmalarında ilişkili analizinde önem derecesi genom boyunda yapılan incelemeye nedeniyle klasik kabul gören p değeri 0.05, incelenen SNP sayısına bölünerek yeni bir istatistiksel önem derecesi belirlenmektedir. Bonferroni correction olarak isimlendirilen bu yaklaşım yürütülen GWAS çalışmalarının çoğunluğunda uygulanmaktadır (Han ve ark., 2009). Örneğin sütçü sığırlarda 50000 SNP’nin tek seferde analize tabi tutulduğu ele alınırsa düzeltilmiş p değeri = 0.05/50000 = 0.000001 olarak hesaplanabilir. Ancak düzeltilmiş p değeri hesaplanırken SNP QC aşamasını geçen SNP sayısı dikkate alınmaktadır (Mohammadi ve ark., 2020).GWAS çalışmalarında ilk ve en önemli aşamalardan biri analiz edilecek dosya formatlarının hazırlanmasıdır. Sütçü sığırlarda yaygın olarak kullanılan SNP çiplerinin çıktı dosyaları genellikle PLINK formatına dönüştürülmektedir. PLINK dosya formatı genotip ve fenotip bilgilerini belirli bir düzen içerisinde barındıran dosya formatıdır. Bu dosya formatları; SNP bilgisi, SNP’nin kromozomal lokasyonu, genotip bilgisi, birey bilgisi ve mevcut pedigri bilgileri ve fenotip bilgilerini içeren özel bir dosya formatıdır. PLINK dosyalarına, hastalıkla ilgili çalışmalarda genellikle ikili kodlama yapılırken (hasta=1, sağlıklı=2), kantitatif analizde direkt olarak elde edilen fenotipik veri girilmektedir (Purcell ve ark., 2007). Hastalıkla ilişkili yürütülen çalışmalar genellikle vakakontrol (case-control) çalışması şeklinde dizayn edilmektedir. İnsan klinik çalışmalarında genellikle 1:4 vaka kontrol oranı altın standart olarak kabul edilmektedir (Kang ve ark., 2009). Ancak yeterli örneklem büyüklüğünde 1:1 vaka kontrol oranının çalışmanın güvenilirliğini artırdığı belirtilmektedir (Moore ve ark., 2019). Kantitatif bir verim özelliği yönünden yapılacak analizde ise direkt olarak her birey için elde edilen fenotipik değer fenotip dosyasına işlenmektedir (Purcell, 2007). Sayının artması ile de güvenilirliğin artmaktadır. Ancak tabi ki bu durum yürütülen çalışmanın ekonomik yükünün artmasına da neden olmaktadır. Bu nedenle GWAS çalışmaların etkili ve uygun örneklem boyutunun belirlenmesi önemli bir husustur. 107 | SAĞLIK BİLİMLERİ ALANINDA ULUSLARARASI AKADEMİK ÇALIŞMALAR VE TEORİK BİLGİLER-IV 2. SÜTÇÜ SIĞIRLARDA GWAS ÇALIŞMALARI Sütçü sığırlarda farklı verim özellikleri, ısı stresi ve kalıtsal hastalıklar ve hastalık direnci ile ilişkili genetik varyasyonların ve aday genlerin belirlenmesinde GWAS yaygın olarak kullanılmaktadır. Verim özellikleri bakımından değerlendirildiğinde farklı sütçü sığır ırkında süt verimi, süt kompozisyonu ve farklı reprodüktif parametreler; kalıtsal hastalıklar yönünden değerlendirildiğinde intestinal atreziler ve çeşitli enfeksiyöz hastalıklarla ilişkili genetik varyasyonların belirlenmesinde GWAS uygulamasından yararlanılmaktadır. 2.1. Süt Verim Özellikleri Sığırlarda süt verimi, hayvansal üretimin artırılması ve ekonomik kazanç getirisi noktasında önemli bir verim özelliğidir. Sütün miktarının yanısıra, kompozisyonun ve diğer kalite parametrelerinin de yüksek olması istenmektedir. Süt verim özellikleri genetik yapı ve çevresel faktörlerden önemli ölçüde etkilenmektedir. (Wiggans ve ark., 2017; Turgut ve ark., 2023; Koca ve ark., 2023b). GWAS çalışmalarının en yaygın yürütüldüğü verim özelliği süt verim özelliğidir. Farklı sütçü sığır ırklarında yürütülen GWAS çalışmaları sayesinde süt verimini etkileyen çok sayıda genetik varyasyon ve aday gen belirlenmiştir. Bu bağlamda, EEF2K (eukaryotic elongation factor 2 kinase), KLHL1 (kelch like family member 1) (Yue ve ark., 2017), DGAT1 (diacylglycerol O-acyltransferase 1), PDE4B (phosphodiesterase 4B), ANO2 (anoctamin 2) (Kim ve ark., 2021), CPSF1 (Cleavage and polyadenylation specificity factor 1) (Nayeri ve ark., 2016) genlerinin süt verimi ile doğrudan ilişkili olduğu bildirilmektedir. Yapılan başka bir çalışmada ise kromozom 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14, 21 ve 23 üzerinde yer alan toplam 46 SNP’nin süt verimini; kromozom 2, 4, 9 ve 22 üzerinde yer alan toplam 20 SNP’nin süt yağ oranını; kromozom 1, 4, 7, 9 10 ve 23 üzerinde bulunan 32 SNP’nin süt proteinini ve kromozom 6 ve 14 üzerindeki toplam 6 SNP’nin ise somatik hücre sayısını etkilediği bildirilmiştir (Silva ve ark., 2020). Mai ve ark., (2010) Danish Jersey ırkı sığırlarda yaptıkları çalışmada süt verimi, süt proteini ve süt yağı ile ilişkili çok sayıda SNP tespit etmişlerdir. Benzer şekilde Nayeri ve ark., (2016) farklı otozomal kromozomlar üzerinde bulunan ve süt verimini etkileyen 173 SNP, süt yağını etkileyen 381 SNP süt proteinini etkileyen 32 SNP tespit etmişleridir. Ayrıca süt yağı ve proteinini etkileyen SNP’lerin büyük çoğunluğunun kromozom 5 (BTA5) ve kromozom 14 (BTA14) üzerinde bulunduğu belirlenmiştir. Sığırlarda yapılan diğer çalışmalarda da süt verim özellikleri ile ilişkili çok sayıda SNP’nin varlığı ortaya konulmuştur (Maxa ve ark., 2012; Paiva ve ark., 2020). Genel olarak incelendiğinde süt verim özelliklerini etkileyen gen bölgelerinin çoğunluğunun sığırlarda 14. Kromozom üzerinde olduğu görülmektedir. SAĞLIK BİLİMLERİ ALANINDA ULUSLARARASI AKADEMİK ÇALIŞMALAR VE TEORİK BİLGİLER-IV | 108 2.2. Reprodüktif Verim Özellikleri Sütçü sığırlarda reprodüktif verim özellikleri ekonomik kazancı etkileyen en önemli verim özelliklerindendir. Fertilite oranı, erken gelişmişlik, pubertas yaşı ve ilk buzağılama yaşı, gebelik oranı, doğum kolaylığı, buzağı doğum ağırlığı ve buzağı sütten kesim yaşı önemli reprodüktif parametrelerdir. Ancak reprodüktif parametrelerde kalıtım derecesinin (heritability) genel olarak düşüktür olması bu özelliklerin iyileştirilmesindeki en önemli engellerin başında gelmektedir (Hawken ve ark., 2012). Bu bağlamda GWAS, reprodüktif verim özelliklerin etkileyen SNP’lerin tespit edilmesi ve reprodüktif parametrelerin iyileştirilmesi noktasında önemli avantajlar sunmaktadır. Sütçü sığırlarda reprodüktif parametreler üzerinde çok sayıda GWAS çalışması yürütülmektedir. Bu çalışmalar reprodüktif parametreler ile ilişkili fizyolojik yolaklar ve fertiliteyi etkileyen genetik varyasyonların ve aday genlerin belirlenmesine önemli katkılar sunmaktadır (Grigoletto ve ark., 2020). Anti-Müllerian hormon (AMH) sığırlarda fertiliteyi etkileyen önemli indikatörlerden biridir. Sütçü sığırlarda AMH’ın antral folikül sayısı ve embryo kalitesi ile ilişki olduğu bildirilmektedir. Serum AMH düzeyleri sütçü sığırlarda bir fertilite markırı olarak kabul edilmektedir (Koca ve ark., 2023a). Yapılan GWAS çalışmaları sayesinde serum AMH düzeyini etkileyen bazı genomik bölgeler tespit edilmiştir (Gobikrushanth ve ark., 2018; Nawaz ve ark., 2018; Grigoletto ve ark., 2020). Holstein ırkı sığırlarda özellikle kromozom 11 üzerindeki çok sayıda SNP’nin serum AMH düzeyini etkilediği ortaya konulmuştur. AMH düzeyini etkileyen en önemli aday genin ise DENND1A olduğu tespit edilmiştir (Nawaz ve ark., 2018). Bazı sütçü ırklarda dişi hayvanların seçimi genellikle dişi fertilite indeksi (DFİ) olarak isimlendirilen yönteme göre gerçekleştirilmektedir. DFİ; inek ve düvelerde gebelik başına düşen tohumlama sayısı, servis periyodu, ilk ve son tohumlama arası süre ve gebelik oranı gibi parametrelere bakılarak hesaplanmaktadır. Höglund ve ark., (2015) Nordic Red Cattle ırkında yaptıkları çalışmada kromozom 6’da GPR125, kromozom 13’de ANKRD60, kromozom 15’de GRAMD1B ve kromozom 24’de ZNF521 genlerinin DFİ ile ilişkili olduğunu belirlemişlerdir. Başka bir çalışmada Sahana ve ark., (2010) FTİ ile ilişki çok sayıda SNP belirlemişler ve bu SNP’lerin kromozom 1, 3, 5, 7, 9, 10, 13, 19, 20, 24 ve 29 üzerinde bulunduğunu belirlemişlerdir. 109 | SAĞLIK BİLİMLERİ ALANINDA ULUSLARARASI AKADEMİK ÇALIŞMALAR VE TEORİK BİLGİLER-IV Sütçü sığırlarda progeni boğaların seçiminde kızların gebelik oranları önemli bir kriterdir. Bu bağlamda 2008 yılından bu yana suni tohumlama boğalarının seçiminde kızların gebelik oranları da değerlendirmeye alınmıştır. Yürütülen GWAS çalışmaları ile boğaların kızlarının gebelik oranlarını etkileyen çok sayıda genomik bölge belirlenmiştir. Peñagaricano ve ark., (2011) Holstein ırkı boğalarda yaptıkları çalışmada gebelik oranları ile ilişkili çok sayıda genomik bölgenin varlığını ortaya koymuşlar ve DYNC1I2, ZNF541, CACNA1H ve ROGDI genlerinin gebelik oranları ilişkili aday genler olduğunu tespit etmişlerdir. Yürütülen diğer çalışmalarda da reprodüktif parametrelerle ilişkili çok sayıda SNP ve aday gen belirlenmiştir. Mohammadi ve ark., (2020) sığırlarda yürüttükleri çalışmada damızlıkta kullanım yaşı, ilk buzağılama yaşı, buzağılama aralığı, gebelik süresi, gebelik oranı ve gebelik başına düşen tohumlama sayısı gibi reprodüktif parametrelerle ilişkili olan çok sayıda yeni aday gen belirlemişlerdir. Bu bağlamda Holstein ırkı sığırlarda OSTN, DPP6, EphA5, CADPS2, Rfc1, ADGRB3, Myo3a, C10H14orf93, KIAA1217, RBPJL, SLC18A2, GARNL3, NCALD, ASPH, ASIC2, OR3A1, CHRNB4, CACNA2D2, DLGAP1, GRIN2A ve ME3 genlerinin reprodüktif parametrelerle ilişkili olduğunu tespit etmişlerdir. 2.3. Kalıtsal Hastalıklar GWAS yaklaşımı kongenital hastalıkların belirlenmesi noktasında önemli avantaj sunmaktadır. Çoğunlukla kongenital hastalıkların ortaya çıkışına neden olan genetik faktörler bilinmemektedir. Klasik moleküler yaklaşımlarla kongenital hastalıkların ortaya çıkışına neden olan varyasyonların tespiti mümkün olmamaktadır. Bu bağlamda GWAS yaklaşımı ile hızlı ve tüm genom boyunca yürütülen çalışmalar kalıtsal hastalıklarla ilişkili genomik bölgelerin tespitine olanak tanımaktadır. Intestinal atreziler sığırlarda sıklıkla şekillenen kongenital hastalıklardandır. Intestinal atrezi, bağırsak lümeninin doğuştan kapalı olması ile karakterize bir hastalıktır. Atrezi bağırsağın dudenomun, jejenum, ileum, kolon veya anüs kısımlarında meydana gelmekte ve fekal içeriğin dışarı çıkışına engel olmaktadır. Hastalıktan etkilenen buzağılar genellikle bir hafta içerisinde ölmekte veya ötenazi edilmektedir. Ancak bu hastalık moleküler mekanizmasına yönelik bilgi birikimi sınırlıdır. Intestinal atrezilerin sebeplerine yönelik GWAS çalışmaları da sınırlı sayıdadır. Keane ve ark., (2023), yaptıkları çalışmada GWAS ile farklı intestinal atrezi alt tipleri ile ilişkili 18 genomik bölgede toplam 31 SNP tespit etmişlerdir. Bununla birlikte anne doğum sayısı ve yavru cinsiyetinin de intestinal atrezi oluşumu ile ilişkili olduğunu tespit etmişlerdir. Jersey ırkında yürütülen bir başka çalışmada da intestinal atrezilerle ilişkili toplam 16 SNP belirlenmiş ve bu SNP’lerin SAĞLIK BİLİMLERİ ALANINDA ULUSLARARASI AKADEMİK ÇALIŞMALAR VE TEORİK BİLGİLER-IV | 110 14’ünün kromozom 14, kalan 2 SNP’nin ise kromozom 26 üzerinde bulunduğu belirlenmiştir (Carthy ve ark., 2022). Konjestif kalp yetmezliği sığırlarda görülen önemli kalıtsal hastalıklardandır. Hastalık genellikle cor pulmonalenin genişlemesiyle karakterizedir (Moxley ve ark., 2019). Bu hastalığının genetik kökenine ilişkin yürütülen GWAS çalışmaları, hastalıkla ilişkili genetik varyasyonların varlığını ortaya koymaktadır. Konu ile ilgili Heaton ve ark., (2022), yürüttükleri çalışmada, genlerinin konjestif kalp yetmezliği ile yüksek düzeyde ilişki gösteren SNP’lerin ARRDC3 ve NFIA genleri üzerinde bulunduğunu belirlemişlerdir. Sığırlarda görülen önemli kalıtsal kusurlardan biri de ayak ve bacaklarda meydana gelen malformasyonlardır. Bu malformasyonlar hayvanların verim ve reprodüktif özelliklerini etkileyerek ciddi ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Bu malformasyonun kalıtsal kökeni de kesin olarak bilinmemektedir. Ancak yapılan bir çalışmada ayak ve bacak malformasyonları ilişkili aday genler belirlenmiştir. De Lima Silva ve ark., (2023) yaptıkları çalışmada GWAS ile TG7, EXT1, ITGA1, PPARD, SCUBE3, and SHOX genlerindeki varyasyonların ayak ve bacak malformasyonları ilişki olabileceğini ortaya koymuşlardır. 2.4. Isı Stresi Isı stresi özellikle Holstein ırkı sığırlarda ciddi ekonomik kayıplara neden olabilen önemli bir durumdur. Genellikle tropikal bölgelerde yetiştirilen Zebular (Bos İndicus) Avrupa kökenli Bos Taurus türünün ırklarına göre ısı stresine daha dayanıklıdır. Isı stresine karşı tolerans aynı popülasyondaki hayvanlar arasında farklılık göstermektedir (Cheruiyot ve ark., 2021). Bu durum ısı stresine karşı bireyler arasındaki genetik varyasyonların etkisine işaret etmektedir (Cheruiyot ve ark., 2021; Dikmen ve ark., 2015). GWAS yaklaşımı bu noktada ısı stresine karşı tolerans ile ilişkili moleküler mekanizmanın daha iyi anlaşılması noktasında önemli bir fırsat sunmaktadır. Cheruiyot ve ark., (2021), Holstein ırkı sığırlarda yaptıkları çalışmada ısı stresine karşı toleransla ilişkili potansiyel 61 genomik bölgenin varlığını ortaya koymuşlardır. Yaptıkları analizde ısı stresine karşı toleransla ilişkili önemli aday genlerin sinir sistemi üzerine etkili olan TPR1, ITPR2, and GRIA4 NPFFR2, CALCR ve GHR olduğunu tespit etmişlerdir. Bir başka çalışmada ise Bohlouli ve ark., (2022) ısı stresi toleransı ile ilişkili toplam 38 potansiyel aday gen belirlemişler ve bu genlerden bazılarının AMFR, ADGRB1, DENND3, DUSP16, EFR3A, EMP1, ENSBTAG00000003838, 111 | SAĞLIK BİLİMLERİ ALANINDA ULUSLARARASI AKADEMİK ÇALIŞMALAR VE TEORİK BİLGİLER-IV EPS8, MGP, PIK3C2G, STYK1, TMEM71, GSG1, SMARCE1, CCDC57 ve FASN olduğunu tespit etmişlerdir. Bu genlerin aynı zamanda yağ asidi sentezinde de rol oynadığını belirlemişlerdir. Dikmen ve ark., (2015) Holstein ırkı sığırlarda yaptıkları çalışmada PGR, ASL, ACAT2, HSD17B7, ARL6IP1 ve SERPINE2 genlerinin ısı stresine karşı termo regülasyonda etkili olabileceğini belirlemişlerdir. 3. SONUÇ GWAS memelilerde fenotipik varyasyonlarla ilişkili genetik varyasyonların ve aday genlerin tespitine olanak tanıyan güncel bir yaklaşımdır. Bu yöntem sütçü sığırlarda da verim özellikleri başta olmak üzere verimi etkileyebilecek kalıtsal ve metabolik hastalıkların moleküler mekanizmasının daha iyi anlaşılması noktasında önemli avantajlar sunmaktadır. Bu bağlamda GWAS sütçü sığırlarda başta süt verimi olmak üzere, süt kompozisyonu, süt kalitesi, reprodüktif parametreler, ısı stresi ve sebebi bilinmeyen çok sayıda hastalığın genetik kökeninin ortaya konulmasında yaygın olarak kullanılmaktadır. Özellikle yeni nesil dizileme yöntemlerinin kullanımının daha da yaygınlaşmasıyla GWAS yaklaşımının önümüzdeki yıllarda da gerek verim özelliklerinin iyileştirilmesi gerekse hastalıkların moleküler mekanizmasının daha iyi anlaşılmasına yönelik önemli katkılarının devam edeceği söylenebilir.