Morphological changes in Leidig cells during long -term lead incorporation: an experimental study on an animal model = Морфологічні зміни клітин Лейдіга при тривалій інкорпорації свинцю: експериментальне дослідження на тваринній моделі

187 УДК 611.018:612.66:546.48:616-092.1 DOI http://dx.doi.org/10.5281/zenodo.17314438 Т. Є. Нарбутова МОРФОЛОГІЧНІ ЗМІНИ КЛІТИН ЛЕЙДІГА ПРИ ТРИВАЛІЙ ІНКОРПОРАЦІЇ СВИНЦЮ: ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ НА ТВАРИННІЙ МОДЕЛІ Одеський національний медичний університет Author’s Information Т. Є. Нарбутова - ORCID 0000-0002-6774-195X Summary. Narbutova T. E. MORPHOLOGICAL CHANGES IN LEIDIG CELLS DURING LONG -TERM LEAD INCORPORATION: AN EXPERIMENTAL STUDY ON AN ANIMAL MODEL . – The Odessa National Medical University; e-mail: narbuto[email protected]m. Male infertility is an urgent medical and social problem that is gaining alarming proportions in the world. One of the key pathogenetic mechanisms of its development is the dysfunction of Leydig cells (LC), which are responsible for the synthesis of testosterone. The article investigates the effect of chronic incorporation of lead acetate on the morphology and ultrastructure of LC in BALB/c mice. It was found that lead causes dose-dependent changes: interstitial edema, mitochondrial dystrophy, a decrease in the number and density of secretory granules, which indicates a decrease in steroidogenic activity. The most pronounced disorders were observed in animals that received lead for 90 days. The results obtained are consistent with modern ideas about the role of LC in the regulation of male reproductive function and confirm the toxic effect of lead on the hypothalamic-pituitary-testicular axis. Morphological changes in CL can be used as diagnostic markers in studies of male infertility. Key words: lead, Leydig cell morphology, electron microscopy, steroidogenesis. Реферат. Нарбутова Т. Є. МОРФОЛОГІЧНІ ЗМІНИ КЛІТИН ЛЕЙДІГА ПРИ ТРИВАЛІЙ ІНКОРПОРАЦІЇ СВИНЦЮ: ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ НА ТВАРИННІЙ МОДЕЛІ. Чоловіче безпліддя є актуальною медико-соціальною проблемою, що набуває загрозливих масштабів у світі. Одним із ключових патогенетичних механізмів його розвитку є порушення функції клітин Лейдига (КЛ), які відповідають за синтез тестостерону. У статті досліджено вплив хронічної інкорпорації ацетату свинцю на морфологію та ультраструктуру КЛ у мишей BALB/c. Встановлено, що свинець викликає дозозалежні зміни: набряк інтерстицію, дистрофію мітохондрій, зменшення кількості та щільності секреторних гранул, що свідчить про зниження стероїдогенної активності. Найбільш виражені порушення спостерігались у тварин, які отримували свинець протягом 90 діб. Отримані результати узгоджуються з сучасними уявленнями про роль КЛ у регуляції репродуктивної функції чоловіків та підтверджують токсичний вплив свинцю на гіпоталамо - гіпофізарно-тестикулярну вісь. Морфологічні зміни КЛ можуть бути використані як діагностичні маркери у дослідженнях чоловічого безпліддя. Ключові слова: свинець, морфологія клітин Лейдига, електронна мікроскопія, стероїдогенез. Актуальність. Чоловіче безпліддя є серйозною медико-соціальною проблемою, що набуває все більшої актуальності у світі. За даними Всесвітньої організації охорони здоров’я (ВООЗ), на безпліддя страждають приблизно 10–15% подружніх пар, і в половині випадків причиною є чоловічий фактор [1]. Водночас, у 5–15% випадків причини безпліддя -------------------------------------------- © Нарбутова Т. Є. 188 залишаються неясними навіть після комплексного обстеження. У країнах Європи спостерігається стійка тенденція до зниження якості сперми. Згідно з метааналізом, проведеним у 2017 році, кількість сперматозоїдів у чоловіків із західних країн зменшилася на 52,4% між 1973 і 2011 роками — з 99 млн до 47 млн на мл [2]. Ця криза особливо виражена в регіонах Європи, Північної Америки, Австралії та Нової Зеландії, і пов’язана з впливом ендокринних руйнівників, екологічними чинниками та змінами способу життя [2]. За даними медичного порталу UFMM, чоловіче безпліддя в нашій країні досягає 30– 50% серед усіх випадків безпліддя, що підтверджує високий рівень поширеності патологій репродуктивної системи у чоловіків [1]. Серед основних причин — варикоцеле, інфекційнозапальні захворювання, ендокринні порушення, а також несприятливі екологічні та соціальні фактори. Оновлені рекомендації Американської урологічної асоціації (AUA) та Американського товариства репродуктивної медицини (ASRM) 2024 року також акцентують на важливості обстеження чоловіка-партнера у безплідній парі, зокрема на аналізі спермограми та дослідженні гормонального профілю [3]. Хронічне отруєння свинцем є одним із найважливіших факторів ризику порушення репродуктивної функції у чоловіків. Свинець здатен кумулюватися в тканинах яєчка, зокрема в клітинах Лейдига (КЛ), де він порушує стероїдогенез, знижує експресію ферментів, що беруть участь у синтезі тестостерону, та змінює їх морфологію [4]. Це призводить до розвитку гіпогонадизму — синдрому, що характеризується низьким рівнем тестостерону, порушенням сперматогенезу та вторинними статевими дисфункціями. Дослідження показали, що свинець впливає на гіпоталамо-гіпофізарно-тестикулярну вісь, знижуючи рівень гонадотропінів і тестостерону, а також викликає дегенеративні зміни в КЛ, включаючи зменшення кількості мітохондрій, вакуолізацію цитоплазми та порушення мембранних структур. Це прямо пов’язано з розвитком чоловічого безпліддя, що підтверджено клінічними та експериментальними дослідженнями [5, 6, 7]. Мета дослідження Вивчити морфологічні та ультраструктурні зміни клітин Лейдига при кумуляції свинцю в організмі, з метою встановлення патогенетичних механізмів розвитку гіпогонадизму та чоловічого безпліддя. Матеріал та методи. Дослідження проводили на мишах лінії BALB/c другого покоління з однаковою вагою, контрольні і експериментальні тварини утримувались в однакових умовах віварію зі стандартним харчовим та питним режимом. Експериментальні групи отримували водний розчин ацетату свинцю в дозі 0,01мг/г перорально впродовж 30ти, 60-ти та 90 діб через місяць після народження. До того експериментальні тварини отримували вплив дії ацетату свинцю трансплацентарно, а потім з молоком матері. Інкорпорацію ацетату свинцю проводили розділивши мишей на експериментальні групи 1, 2, 3 (відповідно до строків інкорпорації ацетату свинцю) по 7 осіб у кожній, окремо утримували контрольні групи (к1, к2, к3) відповідного віку до кожної експериментальної групи. Сім’яники видаляли під глибоким ефірним наркозом. Одразу після вимірювання правий сім’яник заливали у парафін для світлової мікроскопії, а лівий сім’яник заливали у епонові смоли для приготування напівтонких та тонких зрізів для електронної мікроскопії. Експеримент проводили з дотриманням усіх вимог міжнародних конвенцій про тварин. Результати та обговорення Дослідження показало, що у мишей к1 групи частка інтерстицію складає 0,19% загальної площі зрізу і представляє собою дуже тонкі прошарки сполучної тканини з кровоносними та лімфатичними судинами з невеликою кількістю КЛ. Ці клітини розташовані групами, переважно в місцях повороту сім’яного канальця у тісному зв’язку з судинами. Розмір цих клітин варіює, переважають клітини середнього розміру. Розрізняють світлі і темні клітини Лейдига. Цитоплазма темних клітин заповнена великими осміофільними гранулами, що займають майже усю цитоплазму (рис.1). 189 Рис. 1. КЛ миші BALB/c 1к групи. Електронна мікрофотографія. Зб.5000. 1 — ядро; 2 — ядришко; 3 — перинуклеолярний гетерохроматин; 4 — ядерні пори; 5 — секреторні включення; 6 — зона міжклітинних контактів. Інкорпорація свинцю мишам 1 групи приводить до відносного збільшення частки інтерстицію до 0, 81% від загальної площі зрізу, в основному за рахунок інтерстиціального набряку та збільшення розміру КЛ. Ці клітини мають просвітлене ядро, в каріоплазмі виявляються слабозабарвлені залишки ядерець. Відмічається зменшення кількості секреторних гранул (рис.2). Рис. 2. Фрагмент цитоплазми КЛ миші BALB/c 1 групи (30 діб інкорпорації ацетату свинцю). Електронна мікрофотографія. Зб. 8000. 1 — балонна дистрофія; 2 — секреторні гранули; 3 — руйнування крист мітохондрій. На 60 добу клітини Лейдига групи к2 представляють собою великі округлі або овальні клітини з еухромним ядром, що має одне функціонально активне ядерце. У цитоплазмі мається помірна кількість гормонпродукуючих органел та секреторних гранул (рис. 3). Розмір та кількість гранул варіює в залежності від функціональної активності клітин. Відмічається залежність між станом КЛ (тінкторіальними властивостями цитоплазми, наявністю та станом ядерця, кількістю секреторних гранул та ядерноцитоплазмотичним співвідношенням) та секреторною активністю прилеглих звивистих сім’яних канальців. 190 У стромальному компоненті сім’яників мишей 2 групи, що отримували ацетат свинцю впродовж 60 діб, спостерігали помірний набряк. Частка інтерстицію склала 0, 43% від загальної площі зрізу. Темні КЛ формують невеликі групи з 5-6 клітин, які тягнуться вздовж судин. Їх цитоплазма містить велику кількість ліпідних секреторних гранул. Електронна мікроскопія виявляє велику кількість мітохондрій з просвітленням матриксу та частково зруйнованими кристами. Світлі КЛ демонструють меншу збереженість ультраструктур, зокрема мітозондрій, та значне зменшення стероїдо вмісних секреторних гранул (рис. 4). Рис. 3. Фрагмент інтерстицію сім’яника миші BALB/c к2 групи. Електронна мікрофотографія. Зб. 6000. 1 — ядро КЛ; 2 — фрагмент цитоплазми КЛ з секреторними гранулами; 3 — циркулюючий еозинофільний лейкоцит; 4 — стінка гемокапіляра. Рис. 4. Фрагмент інтерстицію сім’яника миші BALB/c 2 групи (60 діб інкорпорації ацетату свинцю). Електронна мікрофотографія. Зб. 5700. 1 — ядро ендотеліоцита судини; 2 — фрагмент цитоплазми КЛ. На 90 добу експерименту у тварин контрольної групи к3 загальний план організації інтерстиційної тканини не міняється. Основна частина КЛ складається із світлих великих та середніх за розмірами клітин. Їх ядра круглі або овальні з переважання еухроматину, одним ексцентрично розташованим ядерцем, нуклеолемма формує інвагінації. Ці клітини містять округлі мітохондрії, цистерни агранулярної енддоплазматичної сітки, секреторні включення (рис.5). 191 Рис. 5. Фрагмент сім’яника миші BALB/c к3 групи. Напівтонкий зріз. Забарвлення толуідиновим синім. Зб. 600. 1 — стінка звивистого сім’яного канальця; 2 — КЛ світла; 3 — КЛ темна; 4 — кровоносна судина. У мишей групи 3, що отримувала ацетат свинцю впродовж 90 діб в інтерстиції спостерігаються найвираженіші зміни. Спостерігаються набухання та потовщення волокон сполучної тканини, набряк. В судинах спостерігаються сладжі та стази. Частка інтерстицію за рахунок змін зростає до 1,1% від загальної площі зрізу. В КЛ спостерігаються зміни енергетичного апарату у вигляді просвітлення матриксу мітохондрій та руйнування крист, зменшення загальної кількості мітохондрій. Кількість секреторних гранул значно зменшена, їх розміри також малі, або пиловидні, спостерігаються явища гідропічної дистрофії різного ступеня вираженості (рис. 6). Темні КЛ, як і в інших групах, формують групи біля судин і демонструють кращу збереженість внутрішньоклітинних структур. Рис. 6. Фрагмент інтерстицію сім’яника миші BALB/c 3 групи (90 діб інкорпорації ацетату свинцю). Електронна мікрофотографія. Зб. 5700. 1 — ендотеліоцит судини зі значними дистрофічними змінами; 2 —клітина Лейдига; 3 — структурні компоненти сласної оболонки звивистого сім’яного канальця. Значення КЛ для чоловічого здоров’я та їх морфофункціональний стан є об'єктом дослідження та обговорення багатьох науковців. Так de Mattos K, Pierre KJ та ін. детально описують роль секреторних гранул клітин Лейдига як маркерів активного стероїдогенезу. Підкреслюється, що гранули містять ферменти та ліпідні компоненти, необхідні для синтезу тестостерону. Взаємодія з лютеїнізуючим гормоном (ЛГ) активує сигнальні каскади, що 192 стимулюють утворення гранул та секрецію андрогенів, критичних для сперматогенезу, лібідо та загальної репродуктивної функції чоловіка [8]. У міні-огляді Bhattacharya I. та Dey S. висвітлють морфогенез КЛ та їх функціональну еволюцію. Автори зазначають, що гранули в цитоплазмі КЛ є індикаторами їх стероїдної активності, особливо в період статевого дозрівання [9]. Встановлено, що кількість та щільність гранул корелює з рівнем тестостерону, що визначає розвиток чоловічих статевих ознак, сперматогенез та сексуальну поведінку. Це повністю співпадає зі змінами КЛ, які спостерігаються у тварин контрольних груп к1, к2, к3, коли миші дорослішають і стають статевозрілими. Отже, КЛ відіграють ключову роль у регуляції чоловічої репродуктивної функції через синтез тестостерону — основного андрогену, що визначає розвиток вторинних статевих ознак, сперматогенез та сексуальну поведінку. Як зазначено, порушення функціональної активності КЛ, зокрема зменшення кількості секреторних гранул та порушення ультраструктури, є центральним патогенетичним механізмом при гіпогонадизмі [5, 6]. Автори підкреслюють, що токсичні впливи (в тому числі і свинець), ендокринні порушення або вікові зміни можуть призводити до зниження тестостероногенезу, що проявляється клінічно у вигляді зниження лібідо, еректильної дисфункції, втрати м’язової маси та остеопенії. Морфологічні зміни в клітинах Лейдига, включаючи зміни структури мітохондрій, зменшення їх кількості, порушення структури ендоплазматичної сітки та зменшення гранул, є маркерами зниження стероїдогенної активності та можуть бути використані як діагностичні критерії у дослідженнях чоловічого безпліддя. Зазначені зміни збігаються з тими, що були характерні для тварин, що отримували ацетат свинцю. Це підтверджує негативний вплив свинцю на репродуктивну функцію. Lei та співавт. (2025) розкривають складну регуляцію функції клітин Лейдига під впливом лютеїнізуючого гормону (ЛГ). Автори демонструють, що ЛГ не лише стимулює тестостероногенез, а й регулює проліферацію, диференціацію та циркадну активність КЛ. Важливим є те, що секреторні гранули в цитоплазмі КЛ є кінцевим етапом гормональної активації, і їх кількість прямо залежить від рівня ЛГ. Це підтверджує, що порушення гормонального сигналінгу, зокрема при токсичному впливі свинцю, може призводити до зниження тестостерону та порушення репродуктивної функції. Важливим є те, що свинець впливає не тільки на КЛ, а і на інші тканини і органи, що чинить додатковий непрямий вплив на стероїдогенез через зміни у гіпоталамо-гіпофізарно-тестикулярну вісі [10]. У своїй монографії Zirkin B. та ін. також розглядають роль гранул клітин Лейдига як структурних елементів, що забезпечують накопичення та секрецію стероїдів. Автори демонструють, що порушення формування гранул, зокрема при токсичному впливі (наприклад, свинець), призводить до зниження тестостероногенезу, що негативно впливає на фертильність, статеву функцію та метаболічне здоров’я чоловіків [11]. Rajendran і Devi [12] систематизують механізми токсичної дії свинцю на чоловічу репродуктивну систему. Автори підкреслюють, що свинець порушує функцію клітин Лейдига через оксидативний стрес, апоптоз та порушення мембранних структур. Вони також вказують, що зменшення кількості мітохондрій та секреторних гранул у КЛ є маркером зниження стероїдогенезу. Це узгоджується з нашими експериментальними даними, де тривала інкорпорація свинцю спричиняє виражені дегенеративні зміни в КЛ, що може бути патогенетично пов’язано з розвитком гіпогонадизму та безпліддя. Висновки 1. Свинець викликає дозозалежні морфологічні та ультраструктурні зміни клітин Лейдига, що проявляються набряком інтерстицію, дистрофією КЛ та зменшенням кількості секреторних гранул. 2. Зниження стероїдогенної активності клітин Лейдига при впливі свинцю корелює з порушенням гормонального балансу та потенційним розвитком гіпогонадизму. 3. Секреторні гранули є маркерами функціональної активності КЛ, і їх кількість та структура можуть бути використані як діагностичні критерії у дослідженнях чоловічого безпліддя. 4. Тривала інкорпорація свинцю спричиняє найвираженіші патологічні зміни, що підтверджує його токсичний вплив залежно від строків інкорпорації. 193 Література/References: 1. Brannigan RE, Hermanson L, Kaczmarek J, et al. Updated data on the management of male infertility. Health-ua [Internet]. 2025 Apr 18 [cited 2025 Sep 23]. Available from: https://health-ua.com/urologiya-i-andrologiya/reproduktivne-zdorovia-colovika/80073onovleni-dani-shhodo-menedzmentu-colovicogo-bezpliddia 2. UFMM. Чоловіче безпліддя. Причини, лікування. Медичний портал UFMM [Internet]. [cited 2025 Sep 23]. Available from: https://www.ufmm.org.ua/stati/cholovichebezpliddya-prichini-likuvannya/ 3. Luchytskyi VE. Ендокринні аспекти чоловічого безпліддя. Health-ua [Internet]. 2021 Sep 8 [cited 2025 Sep 23]. Available from: https://healthua.com/endocrinology/xvorobi-statevix-zaloz/66862-endokrinn-aspekti-cholovchogo-bezplddya 4. Gandhi J, Hernandez RJ, Chen A, Smith NL, Sheynkin YR, Joshi G, Khan SA. Impaired hypothalamic-pituitary-testicular axis activity, spermatogenesis, and sperm function promote infertility in males with lead poisoning. Zygote. 2017 Apr;25(2):103–110. doi: 10.1017/S0967199417000028 5. Sofikitis N, Giwercman A, Minhas S, Kaltsas A, Tharakan T, Pozzi E, Salonia A. Male Hypogonadism. In: Primer on Urology. Springer; 2025. p. 807–828. doi: 10.1007/978-3031-55405-6_57 6. Rambhatla A, Atmoko W. Hypogonadism in Infertile Men: A Clinical Minefield. In: Current and Future Advances in Male Infertility. Springer; 2024. p. 283–302. doi: 10.1007/978-3-031-62648-7_14 7. Bhattacharya I, Sen Sharma S, Majumdar SS. Etiology of Male Infertility: an Update. Reprod Sci. 2024;31:942–965. doi: 10.1007/s43032-023-01401-x 8. de Mattos K, Pierre KJ, Tremblay JJ. Hormones and Signaling Pathways Involved in the Stimulation of Leydig Cell Steroidogenesis. Endocrines. 2023;4(3):573–594. doi: 10.3390/endocrines4030041 9. Bhattacharya I, Dey S. Emerging concepts on Leydig cell development in fetal and adult testis. Front Endocrinol. 2023;13:1086276. doi: 10.3389/fendo.2022.1086276 10. Lei T, Yang Y, Yang W-X. Luteinizing Hormone Regulates Testosterone Production, Leydig Cell Proliferation, Differentiation, and Circadian Rhythm During Spermatogenesis. Int J Mol Sci. 2025;26(8):3548. doi:10.3390/ijms26083548 11. Zirkin B, Huhtaniemi I, Lamb DJ, Papadopoulos V, editors. Leydig Cells: Formation, Regulation and Function in Health and Disease. Springer; 2025. doi: 10.1007/978-3-031-96376-6 12. Rajendran S, Devi AS. LeadToxicity on Male Reproductive System and its Mechanism: A Review. Research Journal of Pharmacy and Technology. 2018;11(5):1851–1856. doi: 10.5958/0974-360X.2018.00228.7 Внесок автора (-ів). Робота є одноосібною. Авторка прочитала й погодилися з опублікованою версією рукопису. Фінансування. Це дослідження не отримало зовнішнього фінансування. Висновок комісії по біоетиці Для проведення дослідження отримано позитивне рішення комісії з біоетики Одеського національного медичного університету (протокол № 17 від 01.11.2023), дотримано основних положень «Європейської конвенції щодо захисту хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях», 1986 (додаток №2) та «Міжнародних рекомендацій (етичний кодекс) щодо проведення медико-біологічних досліджень з використанням тварин», прийняті у 1985 році Радою міжнародних наукових організацій (додаток №3). Заява про доступність даних. Вся інформація знаходиться у відкритому доступі, дані щодо конкретного пацієнтаможуть бути отримані на запит у провідного автора. Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів. Застосування штучного інтелекту – не застосовували Робота надійшла в редакцію 19.08.2025 року. Рекомендована до друку на засіданні редакційної колегії після рецензування