Moleküler Biyoloji ve Genetikte Güncel Çalışmalar I
Full text
MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Editör Işık Didem KARAGÖZ Lyon 2025
MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Editör Işık Didem KARAGÖZ Lyon 2025
Moleküler Biyoloji ve Genetikte Güncel Çalışmalar I Editor • Prof. Dr. Işık Didem KARAGÖZ • Orcid: 0000-0001-6527-2750 Cover Design • Motion Graphics Book Layout • Motion Graphics First Published • October 2025, Lyon e-ISBN: 978-2-38236-947-0 DOI: 10.5281/zenodo.17447649 copyright © 2025 by Livre de Lyon All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without prior written permission from the Publisher. The author or authors of the relevant section are responsible for any copyright infringement that may occur due to the images and graphics used in the book. The editor or publisher does not assume responsibility in this regard. Publisher • Livre de Lyon Address • 37 rue marietton, 69009, Lyon France website • http://www.livredelyon.com e-mail • [email protected]
I ÖNSÖZ Değerli Okuyucular, “Moleküler Biyoloji ve Genetikte Güncel Çalışmalar I” adlı bu kitabın sunulmasından büyük bir heyecan ve memnuniyet duymaktayız. Moleküler biyoloji ve genetik, canlı sistemleri en temel düzeyde anlamamızı sağlayan, sürekli gelişen ve yaşam bilimlerinin hemen her alanını derinden etkileyen dinamik bilim dallarıdır. Bu alanlardaki çığır açıcı keşifler, sağlık, çevre ve biyoteknoloji gibi kritik sektörlerde devrim niteliğinde ilerlemelerin önünü açmaktadır. Bu kitap, alanında yetkin araştırmacılar tarafından kaleme alınmış, geniş bir yelpazedeki güncel ve önemli konuları bir araya getirmektedir. Amacımız, okuyuculara moleküler biyoloji ve genetiğin en son trendleri, metodolojik yenilikleri ve çeşitli uygulama alanları hakkında kapsamlı ve derinlemesine bir bakış açısı sunmaktır. Kitabımızın içeriği, disiplinler arası bir yaklaşımla, bugünün bilimsel zorluklarına ışık tutan Kodlamayan RNA’lar, Leishmania Türlerinde Moleküler ve Genetik Mekanizmalar, Hücre Ölüm Yolakları Moleküler Mekanizması ve Gelecek Perspektifleri, TET Enzimleri ve DNA Metilasyonu, Moleküler Biyolojide Biyoinformatik, Mikrobiyota Analizlerinde Kullanılan Yeni Nesil Dizileme Yöntemleri, Gıda Katkı Maddesi Lesitin, Mikotoksinler ve Geçici Reseptör Potansiyeli (TRP) Kanalları, Plastiklerin Zebra Balığının Üremesi Üzerindeki Toksik Uygulamalarının Etkisi ve Gıda Katkı Maddelerinin Toksik Etkilerinin Araştırılması başlıklardan oluşmaktadır. Bu kitap, lisansüstü öğrencilerden akademisyenlere, araştırmacılardan ilgili profesyonellere kadar moleküler biyoloji ve genetiğe ilgi duyan herkes için değerli bir kaynak olmayı hedeflemektedir. Kitabın hazırlanmasında emeği geçen tüm bölüm yazarlarına değerli katkıları ve titiz çalışmaları için içtenlikle teşekkür ederim. Kitabımızın, bilim dünyasına yeni tartışmalar, araştırmalar ve fikirler katmasını diler, okuyucularımıza verimli bir okuma deneyimi sunmasını temenni ederim. Saygılarımla, Prof. Dr. Işık Didem KARAGÖZ Editör
II MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I
III İÇİNDEKİLER ÖNSÖZ I BÖLÜM I. KODLAMAYAN RİBONÜKLEİK ASİTLER 1 AleynaBegümKILIÇ&IşıkDidemKARAGÖZ BÖLÜM II. LEISHMANIA TÜRLERİNDE MOLEKÜLER VE GENETİK MEKANİZMALAR: KONAK BAĞIŞIKLIK YANITI VE YENİ ANTİLEISHMANIAL YAKLAŞIMLAR 19 BaycanMOR BÖLÜM III. HÜCRE ÖLÜM YOLAKLARI: MOLEKÜLER MEKANİZMASI VE GELECEK PERSPEKTİF 39 DilaraEMERCE&DidemIşıkKARAGÖZ BÖLÜM IV. TET (TEN-ELEVEN TRANSLOCATION) ENZİMLERİ VE DNA METİLASYONU 63 LeylaTUTAR&HikmetDİNÇ BÖLÜM V. MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİDE BİYOİNFORMATİK 73 MehdiESLAMI&UğurVURAL&ZeynepÇELIK& BerkayGÜZELAYDIN&İbrahimHalilKILIÇ BÖLÜM VI. MİKROBİYOTA ANALİZİNDE KULLANILAN YENİ NESİL DİZİLEME YÖNTEMLERİ 105 NurullahÇiftçi BÖLÜM VII. GIDA KATKI MADDESİ LESİTİN 129 BuseERİÇYEL&NalanYILDIRIMDOĞAN BÖLÜM VIII. MİKOTOKSİNLER VE GEÇİCİ RESEPTÖR POTANSİYELİ (TRP) KANALLARI 139 MügeMAVİOĞLUKAYA BÖLÜM IX. PLASTİKLERİN ZEBRA BALIĞI (DANIO RERIO)’NIN ÜREMESİ ÜZERİNDEKİ TOKSİK UYGULAMALARININ ETKİSİ 155 EbruMERMER&ÖzgeZENCİRTANIR BÖLÜM X. GIDA KATKI MADDELERİNİN TOKSİK ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASINDA ZEBRA BALIĞI MODELİ 173 ÖzgeZENCİRTANIR&NalanYILDIRIMDOĞAN
KODLAMAYAN RİBONÜKLEİK ASİTLER 7 3.1.2.EpigenetikDüzenleme Non-kodlayan RNA’lar (ncRNA’lar), yalnızca protein sentezinde görev alan pasif moleküller değil, aynı zamanda epigenetik düzenleme süreçlerinin aktif aktörleridir ve bu nedenle hücresel kimliğin, farklılaşmanın ve hastalık gelişimlerinin anlaşılmasında büyük öneme sahiptir. Özellikle uzun nonkodlayan RNA’lar (lncRNA’lar), DNA metiltransferazları belirli genom bölgelerine yönlendirerek CpG adacıklarının metilasyonunu kontrol edebilmekte ve bu yolla gen susturulmasını sağlayarak kalıcı epigenetik hafızanın oluşumuna katkıda bulunmaktadır (Statello vd., 2021). Bunun yanı sıra ncRNA’lar, histon metiltransferazları, asetiltransferazları ve Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) gibi epigenetik düzenleyici komplekslerle etkileşime girerek histon modifikasyonlarını düzenlemekte ve kromatin yapısını yeniden şekillendirmektedir (Butler vd., 2016). Ayrıca kromatin döngülerinin oluşumunda rol alarak uzak enhancerdan promotora kadar uzun mesafeli genetik etkileşimlerin kurulmasını sağlamaktadır (Morselli ve Dieci, 2022). Ayrıca bazı lncRNA’lar genomik imprinting mekanizmalarında kritik işlevler üstlenerek allel gen susturulmasına aracılık etmektedir (Diba Dedacha Jilo vd., 2024). Tüm bu mekanizmalar, epigenetik hafızanın korunmasına, hücre kimliğinin sürekliliğine ve çevresel uyaranlara verilen yanıtların düzenlenmesine katkı sağlamakta, dolayısıyla ncRNA’ların epigenetik düzenlemedeki merkezi rolünü ortaya koymaktadır (Pillai vd., 2024). Epigenetik düzenlemede en iyi bilinen ve en çok çalışılan örneklerden biri Xist (X-inactive specific transcript) lncRNA’sıdır. Kadın memelilerde iki X kromozomu bulunmasına rağmen genetik dengelemin korunması gerekir. Bu nedenle Xist, inaktive edilecek X kromozomunun yüzeyine yayılır ve epigenetik susturma sürecini başlatır. Mekanizma şu şekildedir: 1. Kaplama (Coating): Xist transkripti, inaktive edilecek X kromozomunun tüm yüzeyini kaplar. 2. Kompleks Toplama: Xist, PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) gibi epigenetik baskılayıcı kompleksleri hedef bölgeye çeker. 3. Histon Modifikasyonu: PRC2, histon H3 üzerinde H3K27me3 (trimetilasyon) işaretini bırakır. 4. DNA Metilasyonu ve Kromatin Yoğunlaşması: Ardından DNA metilasyonu artar, kromatin yoğunlaşarak heterokromatin yapısına dönüşür.
8 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 5. Kalıcı Susturma: Bu süreç sonunda X kromozomu kalıcı olarak susturulur ve transkripsiyona kapalı hale gelir. Bu örnek, bir lncRNA’nın yalnızca gen ekspresyonunu değil, tüm bir kromozomun epigenetik olarak “sessizleştirilmesini” sağlayabileceğini gösteren en güçlü kanıttır (Brockdorff ve Turner, 2015; Statello vd., 2021). Şekil 3. Xist lncRNA, X Kromozomu İnaktivasyonu (Brockdorff ve Heard, 2021). 3.1.3.RNAİşlenmesiveStabiliteKontrolü Non-kodlayan RNA’lar (ncRNA’lar), hücresel fonksiyonların hassas kontrolünde yalnızca gen ekspresyonu ve epigenetik mekanizmaları yönlendirmekle kalmaz, aynı zamanda RNA moleküllerinin işlenmesi ve stabilitesinin düzenlenmesinde de merkezi rol oynar; bu sayede hücreler protein üretimini ve gen ürünü dengesini dinamik bir şekilde kontrol edebilir (Statello vd., 2021). Bu süreç, mRNA ve diğer RNA moleküllerinin ömrünü, çeviri etkinliğini ve işlevselliğini belirleyerek hücre içi protein düzeylerinin hassas kontrolünü sağlar. Örneğin, microRNA’lar (miRNA’lar) hedef mRNA’ların 3’UTR bölgelerine bağlanarak translasyonlarını inhibe eder veya degradasyona uğratır, böylece protein üretimini hızlı ve dinamik şekilde kontrol eder (Bartel, 2018). Uzun ncRNA’lar (lncRNA’lar) ise miRNA’ları bağlayarak onları hedef mRNA’lardan uzaklaştırabilir; bu “sponge” mekanizması sayesinde
KODLAMAYAN RİBONÜKLEİK ASİTLER 9 mRNA’ların stabilitesi artar ve belirli gen ürünlerinin ifade düzeyi korunur (Wang vd., 2019). Ayrıca ncRNA’lar, alternatif splicing süreçlerini yönlendirerek farklı protein izoformlarının üretimini düzenler ve hücresel yanıtların çeşitliliğini artırır. Tüm bu mekanizmalar, RNA moleküllerinin işlenmesini ve stabilitesini kontrol ederek hücre içi homeostazın korunmasına ve çevresel streslere karşı esnek yanıt verilmesine olanak tanır (Kornienko ve Guenzl, 2021). RNA işlenmesi ve stabilitesinin ncRNA’lar tarafından düzenlenmesi, hücrelerin protein üretimini hassas şekilde kontrol etmesini sağlar ve çevresel streslere hızlı yanıt vermelerine olanak tanır, bu da hücresel homeostaz ve sağlıklı işleyiş için kritik bir mekanizmadır (Statello vd., 2021). RNA işlenmesi ve stabilite kontrolü konusunu en önemli örneklerinden biri; küçük nükleer RNA’lar (snRNA’lar) dır. snRNA’lar, yaklaşık 150 nükleotid uzunluğunda, çekirdek içinde lokalize olmuş ncRNA molekülleridir ve özellikle pre-mRNA splicing sürecinde merkezi roller üstlenir (Will ve Lührmann, 2011). Mekanizması şu şekildedir: 1. Spliceosome Kompleksine Katılım: snRNA’lar, spliceosome adı verilen çok proteinli kompleksin dinamik parçalarıdır. Bu kompleks, pre-mRNA üzerindeki intron-ekzon sınırlarını tanır ve doğru splicing için gereken yapısal düzenlemeleri sağlar. 2. Splice Site Tanıma: U1 snRNA, 5’ splice site’e bağlanarak spliceosome’un doğru yerde assemble olmasını sağlar. U2 snRNA ise branch point adeninini tanır ve bağlanır. Bu etkileşimler, hatalı splicing’i önler ve mRNA stabilitesini korur. 3. Alternatif Splicing Kontrolü: snRNA’lar, belirli ekzonların seçimini yönlendirerek farklı mRNA izoformlarının üretilmesine aracılık eder. Bu sayede hücreler çevresel değişimlere ve stres koşullarına esnek yanıt verebilir. 4. RNA Stabilitesinin Korunması: Doğru splicing, mRNA’nın bozulmasını önler ve işlevsel proteinlerin üretimini garanti eder. snRNA’lar, RNA işlenmesi ve stabilitesinin korunmasında merkezi bir mekanizma sunar; H19 veya MALAT1 gibi lncRNA’lardan farklı olarak spliceosome’un yapısal ve fonksiyonel bir parçası olarak doğrudan görev alır. Bu mekanizma, hücresel homeostazın korunması, protein üretiminin doğruluğu ve gen ekspresyonunun hassas düzenlenmesi için hayati öneme sahiptir (Love, 2023; Tholen vd., 2024).
10 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Şekil 4. Spliceosomal snRNA’ların Modifikasyonlarını ve Etkileri (Rodrigues vd., 2023) 3.2.KodlamayanRNA’larınHastalıklardakiRolüveKlinikPotansiyeli Hastalıklarla ilişkili olarak ncRNA’lar, hücresel homeostazın bozulduğu durumlarda gen ekspresyonunu düzenleyerek hem hastalık progresyonunu hem de tedaviye yanıtı etkiler.Kodlamayan RNA’ların (ncRNA’ların) hastalıklarla ilişkisi, gen ekspresyonunu ve hücresel fonksiyonları modüle etmeleri üzerinden ortaya çıkar; bu moleküller çeşitli biyolojik süreçlerde düzenleyici rol üstlenerek kanserden kardiyovasküler hastalıklara, nörodejeneratif bozukluklardan inflamatuvar hastalıklara kadar geniş bir yelpazede patogenez mekanizmalarını etkiler (Li vd., 2020). Kanser patogenezinde, lncRNA ve circRNA’lar tümör hücrelerinde proliferasyon, metastaz ve tedaviye direnç süreçlerini düzenlerken, miRNA’lar hedef mRNA’ların translasyonunu baskılayarak tümör mikroçevresini doğrudan modüle eder (Goyal vd., 2025; Mitra vd., 2025). Örneğin HOTAIR ve H19 gibi lncRNA’lar, epigenetik modülasyon yaparak tümör hücrelerinde autophagy süreçlerini tetikler ve kemoterapiye direnç mekanizmalarını artırır (Goyal vd., 2025). Klinik araştırmalarda, bu ncRNA’ların ekspresyon düzeyleri tümör tipini ve evresini belirlemede biyomarker olarak kullanılmakta, sıvı biyopsilerle ölçülerek invaziv olmayan izlem ve prognoz değerlendirmesi yapılabilmektedir (Mitra vd., 2025). Kardiyovasküler hastalıklarda, lncRNA’lar endotel fonksiyonu, miyokardiyal hipertrofi ve fibrozis süreçlerini etkilerken, miRNA profilleri kalp yetmezliği ve ateroskleroz gibi durumlarda hastalık aktivitesini yansıtan potansiyel biyomarkerlar olarak öne çıkar (Cooke, 2025; Quinones vd., 2025).
KODLAMAYAN RİBONÜKLEİK ASİTLER 11 Nörolojik hastalıklarda, lncRNA ve circRNA’lar sinaptik plastisite, nöroinflamasyon ve nöron hayatta kalma süreçlerini modüle ederek Alzheimer ve Parkinson gibi hastalıklarda farklı ekspresyon profilleri sergiler; bu profiller periferik kan veya beyin dokusu örneklerinden izlenerek hastalığın seyrini değerlendirmede kullanılır (Alzarea vd., 2025). İnflamatuvar hastalıklarda ise ncRNA’lar, inflamatuvar sitokinlerin üretimini ve inflamasyon yollarını düzenleyerek romatoid artrit, Crohn hastalığı ve lupus gibi hastalıkların progresyonunu etkiler; bu durum, periferal kan ve doku örneklerinden ncRNA ölçümleri ile izlenebilir (Li vd., 2020). Terapötik uygulamalar açısından, antisens oligonükleotitler (ASO’lar), siRNA ve CRISPR/Cas9 tabanlı stratejilerle hedef ncRNA’ların ekspresyonu modüle edilmekte ve bu yaklaşımlar hem kanser hem kardiyovasküler hem de nörolojik hastalık modellerinde klinik denemelerde test edilmektedir (Xu vd., 2021; Mitra vd., 2025). Ayrıca, ncRNA’ların klinik araştırmalarda biyomarker ve tedavi hedefi olarak kullanımı, kişiselleştirilmiş tıp stratejilerinin geliştirilmesinde önemli bir adım olarak değerlendirilmektedir; bu sayede hastalıkların erken tanısı, progresyon izleme ve hedefe yönelik tedavi planlaması daha güvenilir hâle gelmektedir (Cooke, 2025; Goyal vd., 2025). Tüm bu bulgular, ncRNA’ların hem hastalık mekanizmalarında hem de klinik uygulamalarda merkezi bir rol üstlendiğini göstermektedir. Bu bulgular, kodlamayan RNA’ların sadece hastalık mekanizmalarını moleküler düzeyde şekillendirmedeki kritik rollerini ortaya koymakla kalmayıp, aynı zamanda klinik tanı, prognoz ve hedefe yönelik terapötik stratejiler geliştirmedeki merkezi potansiyelini de göstermektedir. Şekil 5. Hastalıklarda lncRNA’ların Rolü (Wang vd., 2019)
12 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 3.3.GelecekPerspektifi Kodlamayan RNA’ların (ncRNA’lar), gen düzenlenmesinden epigenetik modifikasyonlara ve hücresel sinyal yolaklarının kontrolüne kadar uzanan geniş işlevsel spektrumu, gelecekteki klinik araştırmalara yön verecek en önemli moleküler araçlardan biri olacağını ortaya koymaktadır. Özellikle sıvı biyopsi temelli tanı yaklaşımlarında, ncRNA’ların erken teşhis ve prognozda kullanılabilir biyobelirteçler olarak potansiyeli giderek artmaktadır (Dragomir vd., 2018). Ayrıca antisens oligonükleotitler, miRNA inhibitörleri, lncRNA hedefli terapiler ve CRISPR/Cas9 gibi ileri genom düzenleme teknolojilerinin ncRNA’lar ile birleştirilmesi, kanser, kardiyovasküler hastalıklar ve nörodejeneratif bozukluklar başta olmak üzere çok sayıda hastalıkta kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirilmesine olanak tanıyacaktır (Goyal vd., 2025). Bununla birlikte, ncRNA’ların pleiotropik etkileri, hücresel bağlama özgü fonksiyonları ve hedefleme zorlukları, klinik uygulamalara geçişte hâlâ çözülmesi gereken kritik engellerdir (Li vd., 2020; Cooke, 2025). Özellikle kanser, kardiyovasküler hastalıklar, metabolik bozukluklar ve nörodejeneratif hastalıklarda ncRNA’ların biyobelirteç olarak kullanımı, sıvı biyopsi tabanlı yaklaşımlar sayesinde erken teşhis ve tedaviye yanıt takibinde umut vadetmektedir (Zhan vd., 2023). Özellikle RNA-seq ve single-cell transcriptomics yöntemleri, hücreler arası heterojenliği çözümlemekte kritik bir rol oynamaktadır (Zhu vd., 2017). Bunun yanında, yapay zekâ destekli biyoinformatik araçların gelişmesiyle ncRNA etkileşim ağlarının sistem biyolojisi düzeyinde modellenmesi, hedefe yönelik daha hassas ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejilerinin tasarlanmasına imkân sağlayacaktır (Goyal vd., 2025). Terapötik açıdan bakıldığında, antisens oligonükleotitler, siRNA’lar, miRNA mimikleri ve CRISPR/Cas9 gibi genom düzenleme teknolojileri ncRNA hedefli müdahalelerle birleştirildiğinde hem kanser tedavilerinde hem de kronik hastalıkların yönetiminde devrim niteliğinde ilerlemeler beklenmektedir (Li vd., 2020; Cooke, 2025). Bununla birlikte, ncRNA’ların pleiotropik etkileri, hücre tipine özgü fonksiyonları ve potansiyel yan etkileri klinik uygulamalara geçişte hâlâ çözülmesi gereken önemli engeller olarak karşımızda durmaktadır (Quinones vd., 2025). Bu nedenle gelecekte multidisipliner yaklaşımlar-moleküler biyoloji, klinik bilimler, farmakoloji ve yapay zekâ tabanlı analizlerin birleşimi-ncRNA araştırmalarının translasyonel tıpta daha etkin kullanılmasını sağlayacaktır. Sonuç
KODLAMAYAN RİBONÜKLEİK ASİTLER 13 olarak, ncRNA’ların gelecek perspektifi, sadece hastalık mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına değil, aynı zamanda tanı, prognoz ve terapötik müdahalelerde çığır açıcı yeniliklerin gelişmesine işaret etmektedir. Önümüzdeki on yıl içinde bu moleküllerin, kişiselleştirilmiş tıp uygulamalarında hem biyobelirteç hem de terapötik ajan olarak klinik rutine girmesi kuvvetle muhtemeldir (Dragomir vd., 2018; Goyal vd., 2025; Quinones vd., 2025). 4. Sonuç Non-coding RNA’lar, hücresel biyoloji ve klinik araştırmaların odak noktalarından biri haline gelmiştir. Gen ekspresyonunun düzenlenmesinden epigenetik kontrol mekanizmalarına, RNA stabilitesinin korunmasından bozulmasına kadar geniş bir yelpazede kritik görevler üstlenirler. Hastalık biyolojisinde, özellikle kanser, nörodejeneratif ve kardiyovasküler hastalıklarda belirgin roller oynayarak hem tanı hem de tedavi stratejilerinde değerli hedefler sunmaktadırlar. Dolaşımdaki ncRNA’ların biyomarker potansiyeli, non-invaziv tanı yöntemlerinde önemli fırsatlar yaratmaktadır. Ancak, fonksiyonlarının karmaşıklığı, hücre/tip özgüllüğü ve klinik validasyon eksiklikleri gibi sınırlılıklar, bu potansiyelin tam olarak kullanılmasını kısıtlamaktadır. Gelişmiş teknolojiler-RNA-seq, single-cell analizi, CRISPR tabanlı yaklaşımlar ve yapay zekâ-ncRNA araştırmalarında yeni ufuklar açmakta ve gelecekte kişiselleştirilmiş tedavi yaklaşımlarına olanak tanımaktadır. Bu bağlamda, ncRNA’ların biyolojik anlamının daha derinlemesine anlaşılması ve klinik uygulamalara entegrasyonu, önümüzdeki yıllarda biyomedikal araştırmaların en yenilikçi alanlarından biri olmaya devam edecektir. Tablo 1: ncRNA’ların Avantajlar ve Sınırlılıklar Avantajlar Sınırlılıklar Hücresel süreçlerde (gen ekspresyonu, epigenetik düzenleme, RNA stabilitesi) temel düzenleyici rol üstlenmeleri Fonksiyonel ağlarının yüksek kompleksite göstermesi ve hücre/tip özgüllüğü Hastalık biyolojisinde (özellikle kanser ve nörodejeneratif hastalıklar) tanı ve tedavi için güçlü aday olmaları Klinik validasyon ve standardizasyon eksikliklerinin translasyonel uygulamaları kısıtlaması Dolaşımda stabil bulunmaları sayesinde non-invaziv biyomarker potansiyeli taşımaları Terapötik modülasyonlarında off-target etkiler ve immün yanıt riskleri
14 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Kaynakça Alshahrani, A. (2024). A brief review of noncoding RNA. Journal of the Medical and Health Sciences of Genetics, 25(1), 553. Alzarea, S. I., et al. (2025). Non-coding RNA-mediated gene regulation in Alzheimer’s disease. PubMed Central. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/ PMC12454739/ Anger, A. M. Armache, J. P. Berninghausen, O., Habeck, M., Subklewe, M., Wilson, D. N., & Beckmann, R. (2013). Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature, 497(7447), 80–85. Bartel, D. P. (2018). Metazoan MicroRNAs. Cell, 173(1), 20–51. Birney, E., Stamatoyannopoulos, J. A., Dutta, A., Guigó, R., Gingeras, T. R., Margulies, E. H., & Dermitzakis, E. T. (2007). Identification and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot project. Nature, 447(7146), 799–816. Brockdorff, N. & Heard, E. (2021). Biological function of long noncoding RNA (lncRNA) Xist. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 9, 645647. Brockdorff, N. & Turner, B. M. (2015). Dosage compensation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 7(3), a019406. Butler, A. A., Webb, W. M., & Lubin, F. D. (2016). Regulatory RNAs and control of epigenetic mechanisms: Expectations for cognition and cognitive dysfunction. Epigenomics, 8(1), 135-151. Cooke, J. P. (2025). The rapidly emerging field of RNA therapies for cardiovascular disease. Cardiology Plus, 10(2), 79–82. Diba Dedacha Jilo, B. K. Abebe, J. Wang, J. Guo, A. Li & L. Zan (2024). Long non-coding RNA (lncRNA) and epigenetic factors: their role in regulating the adipocytes in bovine. Frontiers in Genetics, 15. Dragomir, M., Chen, B., & Calin, G. A. (2018). Exosomal lncRNAs as new players in cell-to-cell communication. Translational Cancer Research, 7(Suppl. 2), S243–S252. Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., & Tuschl, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature, 411(6836), 494–498. Esteller, M. (2011). Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Genetics, 12(12), 861–874. Goyal, H., Parwani, S., & Kaur, J. (2025). Long non-coding RNAs and autophagy: Dual drivers of cancer progression. Nature Communications, 16(1), 1–15.
KODLAMAYAN RİBONÜKLEİK ASİTLER 15 Gupta, A. & Singh, R. (2023). Emerging role of long non-coding RNAs in cancer therapeutics. Frontiers in Oncology, 13, 1223456. Ha, M. & Kim, V. N. (2014). Regulation of microRNA biogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 15(8), 509–524. Kiss, T. (2002). Small nucleolar RNAs: An abundant group of noncoding RNAs. Cell, 109(2), 145–148. Kopp, F. & Mendell, J. T. (2018). Functional classification and experimental dissection of long noncoding RNAs. Cell, 172(3), 393–407. Kornienko, A. E. & Guenzl, P. M. (2021). Long non-coding RNAs in RNA processing and regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 22(12), 827–844. Kristensen, L. S., Andersen, M. S., Stagsted, L. V. W., Ebbesen, K. K., Hansen, T. B., & Kjems, J. (2019). The biogenesis and biology of circular RNAs. Nature Reviews Genetics, 20(11), 675–691. Kung, J. T. Y. Colognori, D. & Lee, J. T. (2013). Long noncoding RNAs: Past, present, and future. Genetics, 193(3), 651–669. Lauretti, E. (2021). The neurobiology of non-coding RNAs and Alzheimer’s disease. Progress in Neurobiology, 205, 102118 Li, Y., Shan, G., Teng, Z.-Q., & Wingo, T. S. (2020). Editorial: Non-coding RNAs and human diseases. Frontiers in Genetics, 11, Article 523. Lin, S. & Gregory, R. I. (2015). MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer, 15(6), 321–333. Love, S. L. (2023). Pre-mRNA splicing-associated diseases and therapies. Frontiers in Molecular Biosciences, 10, 10399480. Matera, A. G., & Wang, Z. (2014). A day in the life of the spliceosome. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 15(2), 108–121. Mitra, A. G., et al. (2025). Non-coding RNA in cancer: Pathogenesis to therapeutic applications. ScienceDirect. https://www.sciencedirect.com/science/ article/pii/S2468867325000355 Morey, C., & Avner, P. (2004). Employment opportunities for non-coding RNAs. FEBS Letters, 567(1), 27–34. Morselli, M., & Dieci, G. (2022). Epigenetic regulation of human noncoding RNA gene transcription. Biochemical Society Transactions, 50(2), 723736. Pan, Y. Zhang, X. & Li, J. (2018). Inhibitory effect of microRNA-21 on pathways and targets in cancer cells. Journal of Cellular Biochemistry, 119(12), 10123–10135.
16 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Panni, S. Lovering, R. C. Porras, P. & Orchard, S. (2020). Non-coding RNA regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms, 1863(6), 194417. Pillai, R., Thamarai, R., Sivasamy, S., & Mallik, S. (2024). Epigenetic frontiers: miRNAs, long non-coding RNAs and nanomaterials are pioneering to cancer therapy. Epigenetics & Chromatin, 17, Article 554. Quagliata, L. Matter, M. S., Piscuoglio, S., Arabi, L., & Ruiz, C. (2023). Long non-coding RNA HOTTIP/HOXA13 expression is associated with disease progression and predicts outcome in hepatocellular carcinoma patients. Hepatology, 77(2), 456–468. Quinones, N. B., Belluomo, R., Juni, R. P., & Boon, R. A. (2025). Long non-coding RNA based therapy for cardiovascular disease. Journal of Cardiovascular Translational Research. https://doi.org/10.1007/s12265-02510686-z Rodrigues, K. S., dos Santos Rodrigues, A., Moura, C. F., & et al. (2023). IARA: a complete and curated atlas of the biogenesis of spliceosome machinery during RNA splicing. Life Science Alliance, 6(3), e202201593. Schimmel, P. (2018). The emerging complexity of the tRNA world. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 19(1), 45–58. Sehgal, L. Sethi, G. & Kumar, S. (2023). FAS-antisense 1 lncRNA and production of soluble versus membrane Fas in B-cell lymphoma. Leukemia, 37(4), 1023–1035. Siomi, M. C., Sato, K., Pezic, D., & Aravin, A. A. (2011). PIWI-interacting small RNAs: The vanguard of genome defence. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 12(4), 246–258. Slack, F. J. & Chinnaiyan, A. M. (2019). The role of non-coding RNAs in oncology. Cell, 179(5), 1033–1055. Statello, L. Guo, C. J. Chen, L. L. & Huarte, M. (2021). Gene regulation by long non-coding RNAs and its biological functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 22(2), 96–118. Tholen, J., et al. (2024). Branch site recognition by the spliceosome. RNA Journal, 30(8), 1234–1245. Wang, K. C. Yang, Y. W. Liu, B. Sanyal, A. Corces-Zimmerman, R., Chen, Y., & Chang, H. Y. (2019). Long noncoding RNA-mediated regulation of gene expression. Cell, 179(3), 607–624. Will, C. L. & Lührmann, R. (2011). Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 3(7), a003707.
LEISHMANIA TÜRLERİNDE MOLEKÜLER VE GENETİK MEKANİZMALAR . . . 23 sinyal yolaklarını baskılayarak, patojenin eliminasyonu için gerekli konak bağışıklık yanıtlarını zayıflatabilir (Kawai ve Akira, 2011; Kong vd., 2017; Saha vd., 2019). Bu tür manipülasyonlar, parazitin çoğalması ve kalıcılığı için elverişli bir hücre içi mikroçevre oluşturduğundan, Leishmania’nın hayatta kalması açısından kritik öneme sahiptir. Makrofajların efektör fonksiyonlarına doğrudan müdahalenin yanı sıra, Leishmania enfeksiyonu, konağın bağışıklık sistemindeki sitokin profilini de değiştirmektedir. Enfeksiyonun ardından genellikle anti-inflamatuvar sitokinlerin artışı ve IFN-γ gibi pro-inflamatuvar sitokinlerin üretiminde azalma ile karakterize edilen belirgin bir sitokin ortamı kayması gözlemlenir. Bu değişim, kısmen patojene özgü moleküler örüntülerin (PAMPs) tanınması ve bağışıklık yanıtlarının başlatılmasında kritik rol oynayan TLR aracılı sinyal yolakları üzerinden gerçekleşmektedir (Kawai ve Akira, 2011; Richard vd., 2012; Kawasaki ve Kawai, 2014). Ayrıca, bu TLR sinyal kaskadı, IL-10 ve arjinaz üretiminin aktivasyonuna yol açarak, parazitin hayatta kalmasını kolaylaştıran immünosupresif bir mikroçevrenin oluşumuna katkı sağlamaktadır (Kawasaki ve Kawai, 2014; Osorio vd., 2014). TLR’ler, bu bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesinde kilit düzenleyici unsurlar olarak görev yapmaktadır. Bu reseptörler, çeşitli mikrobiyal bileşenleri tanıyarak, doğal ve kazanılmış bağışıklık sistemlerinin aktivasyonundan sorumlu sinyal kaskadlarını başlatır. Leishmania’nın TLR’lerle etkileşimi sonucunda ortaya çıkan sinyalleme, yalnızca sitokin üretimini teşvik etmekle kalmaz, aynı zamanda makrofaj polarizasyonunu da değiştirebilir; bu durum sıklıkla, doku onarımını destekleyen ve inflamatuvar yanıtları sınırlayan M2-benzeri fenotiplerin baskın hale gelmesine yol açar (Li vd., 2015; Morimoto vd., 2019; Yan vd., 2023). Makrofajların bu şekilde fonksiyonel ve fenotipik olarak değişmesi, Leishmania’nın konak bağışıklık yanıtını manipüle ederek eliminasyondan kaçınması ve konak içinde çoğalmasını ile kalıcılığını sürdürmesi açısından kritik bir mekanizmadır (Osorio vd., 2014; Yan vd., 2023). Dolayısıyla Leishmania türlerini içeren konak-parazit etkileşimlerinin moleküler temeli, parazitin hücreye giriş, hücre içi hayatta kalma ve bağışıklık yanıtından kaçınma süreçlerinde kullandığı sofistike mekanizmaların çeşitliliğini ortaya koymaktadır. Parazitin yapışmasında yüzey glikokonjugatların rolü, makrofaj fonksiyonlarının baskılanması ve TLR sinyal yolakları aracılığıyla sitokin profillerinin değiştirilmesi, bu etkileşimlerde kritik öneme sahiptir. Bu mekanizmaların ayrıntılı bir şekilde anlaşılması, konak bağışıklık yanıtını güçlendirebilecek ve leishmaniasis için etkili tedavi stratejilerinin geliştirilmesine olanak sağlayabilecek hedefe yönelik terapilerin tasarlanması açısından büyük önem taşımaktadır.
24 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 4. Konak Bağışıklık Yanıtı ve Kompleman Sistemi Etkileşimi Komplement sistemi, konak bağışıklık yanıtının temel bir bileşeni olarak, farklı patojenlere karşı çok yönlü bir savunma mekanizması sağlar ve doğal (innate) bağışıklık ile kazanılmış (adaptive) bağışıklık sistemleri arasındaki etkileşimi düzenleyen kritik bir köprü görevi görür. Komplement aktivasyonu, bağışıklık yanıtının etkinliğini artırır ve patojen varlığında homeostazın korunmasına katkıda bulunan çeşitli fizyolojik süreçleri düzenler. Başlangıçta doğal bağışıklık sisteminin bir bileşeni olarak tanımlanan komplement sistemi, aynı zamanda kazanılmış bağışıklıkta da önemli düzenleyici rollere sahiptir. Komplement kaskadının aktivasyonu, anafilatoksinler (C3a ve C5a) gibi efektör moleküllerin üretimi ile sonuçlanır; bu moleküller, makrofajlar ve nötrofiller gibi diğer bağışıklık hücrelerini çekip aktive eder. Bu efektör moleküller, inflamatuvar yanıtları güçlendirir ve T ile B lenfositlerinin aktivitelerini yönlendirerek doğal ve kazanılmış bağışıklık yan dallarını birbirine bağlar (Dunkelberger ve Song, 2009; Killick vd., 2017). Komplement bileşenlerinin, patojenleri fagositoz yoluyla yok edilmek üzere işaretleyen opsonizasyon süreçleri aracılığıyla temizlemeyi kolaylaştırma yeteneği, onların konak için hızlı ve etkili bir savunma mekanizmasındaki kritik işlevini göstermektedir (Bernet vd., 2003; Killick vd., 2017). Komplement sisteminin karmaşık yapısı, diğer bağışıklık sinyal yolaklarıyla karşılıklı etkileşimleri de içermektedir. Örneğin, komplement reseptörleri, TLR’ler gibi çeşitli bağışıklık reseptörleriyle etkileşime girerek inflamatuvar yanıtı artırır (Köhl, 2006; Ray vd., 2018). Bu etkileşim, komplement sisteminin rolünün yalnızca patojen eliminasyonu ile sınırlı olmadığını; aynı zamanda kazanılmış bağışıklık yanıtını düzenleyen ve güçlendiren bir köprü işlevi gördüğünü göstermektedir. Bu güçlendirme, antijen sunan hücrelerin aktivasyonu aracılığıyla gerçekleşir ve bu durum, söz konusu hücrelerin antijenleri T ve B lenfositlerine nasıl işleyip sunduklarını etkiler (Köhl, 2006; Killick vd., 2017). Ayrıca, son çalışmalar, komplement aktivasyonunun kanser ve otoimmün hastalıklar gibi belirli durumlarda ek işlevlere sahip olduğunu ortaya koyarak, onun doğrudan savunma yanıtlarının ötesinde patofizyolojideki önemini vurgulamaktadır (Fujita, 2013; Killick vd., 2017). Komplement sisteminin aşırı aktivasyonu, doku hasarına ve inflamatuvar durumların kötüleşmesine yol açabilir. Regülatör proteinler, bu dengenin korunmasında kritik bir rol oynar; komplement aktivasyonunun aşırı inflamasyon veya bağışıklık patolojisine dönüşmesini önler (Rambach vd., 2008; Dunkelberger ve Song, 2009). Komplement aktivasyonu ile düzenlenmesi arasındaki dinamik denge, travma
LEISHMANIA TÜRLERİNDE MOLEKÜLER VE GENETİK MEKANİZMALAR . . . 25 veya enfeksiyon gibi zorlu koşullar sırasında bağışıklık toleransı ve yanıtının birçok yönünü belirler (Chakraborty vd., 2018). Dolayısıyla komplement sistemi, konak savunma mekanizmasının kritik bir öğesi olup, doğal ve kazanılmış bağışıklık yanıtlarını birleştiren bir etkileşim ağı aracılığıyla işlev gösterir. Çok yönlü rolü; patojenlerin opsonizasyonu, inflamatuvar aracılar üretimi ve bağışıklık tepkilerini homeostazı koruyacak şekilde hassas ve düzenleyici fonksiyonları içerir. Bu sayede enfeksiyon tehditlerine karşı etkili bir savunma sağlar. Komplement aktivitesinin ince detaylarını anlamak, bağışıklık bozuklukları, enfeksiyonlar ve güçlendirilmiş bağışıklık yanıtı gerektiren durumlar için terapötik yaklaşımların geliştirilmesi açısından hayati öneme sahiptir (Haeger, 1993; Bernet vd., 2003; Fujita, 2013). 5. Moleküler Temelli Antileishmanial Yaklaşımlar Leishmaniasis ile mücadelede moleküler temelli yaklaşımlar, özellikle mevcut antileishmanial ilaçlar ve güçlü biyolojik aktivite sergileyen yeni bileşiklerin keşfi açısından son yıllarda önemli ilgi görmüştür. Mevcut tedavilerin moleküler mekanizmalarının ve direnç profillerinin anlaşılması, yeni kinazolinon türevlerinin keşfi ile birlikte, bu ihmal edilmiş tropikal hastalıkla mücadele için kapsamlı bir çerçeve sunmaktadır. Mevcut antileishmanial terapiler, miltefosin ve sodyum stiboglukonat (SSG) dahil olmak üzere, toksisite ve ilaç direncinin ortaya çıkması ile ilişkili sınırlamalara sahip olup, alternatif tedavi arayışları zorunlu olmuştur (Sharma vd., 2013; Prinsloo vd., 2020). İlaç direnci, çeşitli mekanizmalar aracılığıyla ortaya çıkabilir; bunlar arasında ilaç alımında azalma, ilaç etkinliğinin hücre dışına atılımının artması ve parazit içindeki moleküler hedeflerde değişiklikler yer almaktadır (Eddaikra vd., 2019; Das vd., 2022). Konak hücrelerdeki sitotoksisiteyi minimuma indirirken Leishmania türlerini etkili bir şekilde hedefleyebilecek seçici tedavilere olan ihtiyaç hâlen önemini korumaktadır (Fróes vd., 2023). Çok sayıda çalışma, potansiyel tedavilerin etkinlik ve güvenlik profillerini değerlendirmek için seçicilik indekslerinin (SI) belirlenmesinin gerekliliğini vurgulamaktadır; bu yaklaşım, daha yüksek antileishmanial aktiviteye sahip ve daha düşük sitotoksisite profiline sahip yeni bileşiklerin geliştirilmesini yönlendirmektedir (Vale-Costa vd., 2012; Mor vd., 2025). Özellikle kinazolinon türevleri, antileishmanial alanda umut verici adaylar olarak öne çıkmış olup, Leishmania parazitlerine karşı geliştirilmiş biyolojik aktiviteleri ile dikkat çekmektedir. Çeşitli çalışmalar, bu türevlerin önemli antileishmanial özelliklerini korurken, miltefosin gibi geleneksel ilaçlara
26 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I kıyasla daha yüksek seçicilik sergilediklerini bildirmektedir (Birhan vd., 2014; Prinsloo vd., 2020; Mostafa vd., 2021; Mor vd., 2025). Örneğin, Sharma ve arkadaşları tarafından yürütülen araştırmalar, bazı kinazolinon hibritlerinin Leishmania donovani’ye karşı güçlü bir aktivite gösterdiğini ve uygun seçicilik profilleri sunduğunu ortaya koymakta, bu da onları terapötik ajanlar olarak cazip kılmaktadır (Sharma vd., 2013; Prinsloo vd., 2020). Ayrıca, Birhan ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilen çalışmalar, yeni sentezlenen kinazolinon türevlerinin standart ilaç miltefosinden daha üstün performans gösterdiğini ortaya koymakta ve bu durumun, molekülün leishmaniasis üzerindeki etkinliğini önemli ölçüde etkileyen yapı-aktivite ilişkisiyle doğrudan bağlantılı olduğunu vurgulamaktadır (Mostafa vd., 2021). Bu bileşiklerin geliştirilmesi genellikle IC₅₀/CC₅₀ değerlendirmeleri gibi titiz analizleri de içermektedir. Bu değerlendirmeler, potansiyel antileishmanial ajanların terapötik pencerelerinin anlaşılması açısından kritik öneme sahiptir. Örneğin, Sosa ve arkadaşları tarafından yürütülen bir çalışmada, epigallokateşin gallat dâhil bazı kateşinlerin, belirli IC₅₀ değerleriyle önemli antileishmanial etkiler gösterdiği ve in vitro ortamda etkili tedavi potansiyeli sunduğu rapor edilmiştir (Ralph vd., 2020). Ayrıca, yeni bileşiklerin etkinliği genellikle hücre kültürü modelleri kullanılarak değerlendirilir. Bu sayede hem parazitik büyüme inhibe edilir hem de konak hücreler üzerindeki sitotoksisite kontrol edilerek güvenli bir terapötik indeks sağlanır (Sosa vd., 2020; Das vd., 2022). Moleküler doklama ve hedef protein analizini içeren in silico modelleme, bu deneysel değerlendirmeleri tamamlayarak kinazolinon türevleri ile moleküler hedefleri arasındaki bağlanma afinitelerini ve etkileşimleri öngörür. Bu hesaplamalı yaklaşım, etki mekanizmalarını ve potansiyel direnç mekanizmalarını ortaya çıkarmaya yardımcı olarak, hedefe yönelik ilaç tasarım sürecine katkı sağlar (Koutsoni vd., 2019; Hassan, 2022). Moleküler modelleme ile biyolojik etkinlik arasındaki ilişki, araştırmacıların maliyetli ve zaman alıcı in vitro ve in vivo çalışmalara geçmeden önce öncül bileşikleri optimize etmelerine olanak tanır. Buna ek olarak, nanoteknoloji ve ilaç taşıma sistemlerindeki son gelişmeler, antileishmanial ajanların etkinliğini ve güvenliğini artırmak için yeni olanaklar sunmaktadır. Örneğin, 17-AAG gibi bileşiklerin lipozomlarda kapsüllenmesi, terapötik indeksin artırılması ve sistemik toksisitenin minimize edilmesi için bir strateji olarak gösterilmektedir (Petersen vd., 2018). Nanoformülasyonların ilaç çözünürlüğünü ve hücresel alımını artırmadaki rolü, leishmaniasis tedavisinde klinik uygulamalarda önemli bir potansiyel ortaya koymaktadır (Fróes vd., 2023; Silva vd., 2023).
LEISHMANIA TÜRLERİNDE MOLEKÜLER VE GENETİK MEKANİZMALAR . . . 27 Sonuç olarak, moleküler temelli yaklaşımlar hem mevcut tedavilerin sınırlılıklarını aşmak hem de yeni ilaç adaylarının sunduğu potansiyeli maksimize etmek için çok boyutlu ve stratejik bir çerçeve sunmaktadır. Kimyasal sentez, biyolojik değerlendirme ve hesaplamalı modellemenin uyumlu entegrasyonu, antileishmanial ilaç keşif sürecinin etkin ve sistematik bir şekilde ilerlemesini mümkün kılmaktadır. 6. Omik ve Genetik Teknolojilerin Leishmania Araştırmalarındaki Rolü Leishmania araştırmalarında omik ve genetik teknolojilerin rolü, bu parazitlerin biyolojisinin anlaşılmasında, ilaç direnci mekanizmalarının aydınlatılmasında ve yeni terapötik hedeflerin keşfedilmesinde kritik öneme sahiptir. Genomik, transkriptomik, proteomik ve metabolomik gibi çeşitli omik yaklaşımlar, Leishmania türlerinin karmaşık biyolojisine ilişkin önemli bilgiler sağlamıştır. Bu teknolojik ilerlemeler, CRISPR/Cas9 ve RNA interferansı (RNAi) gibi etkili gen düzenleme teknikleriyle birleştirildiğinde, araştırmacıların Leishmania patogenezinin ve konak etkileşimlerinin moleküler mekanizmalarını ayrıntılı bir şekilde çözümlemelerine olanak tanımaktadır. 6.1.GenomikYaklaşımlar Genomik stratejiler, Leishmania biyolojisinin anlaşılmasında temel bir rol oynamaktadır. Özellikle yeni nesil dizileme (NGS) teknolojileri, Leishmania genomlarının kapsamlı analizlerini mümkün kılarak, virülans ve ilaç direnci ile ilişkili genetik varyasyonların tanımlanmasına olanak sağlamıştır (Cantacessi vd., 2015; Adán‐Jiménez vd., 2024). Örneğin, Leishmania donovani’nin genom ve transkriptomunun tam olarak birleştirilmesi, patojenite ve ilaç direnci mekanizmalarının anlaşılmasında kritik olan gen modellerini ortaya koymuştur (Camacho vd., 2019; Camacho vd., 2023). Bu genomik bilgi, özellikle farklı Leishmania türlerine özgü virülans faktörlerini hedef alan terapötik stratejilerin geliştirilmesinde hayati öneme sahiptir (Abbasi ve Saeedi, 2022). 6.2.TranskriptomikYaklaşımlar Transkriptomik çalışmalar, özellikle RNA-seq, gen ekspresyonunun çeşitli uyarıcılara, antileishmanial ilaçlar da dâhil, verdiği yanıtların anlaşılmasını önemli ölçüde geliştirmiştir. Yüksek çözünürlüklü transkriptomik analizler, ilaç direncinde rol oynayan genlerin farklı ifade seviyelerini ortaya koymuştur
28 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I (Andrade vd., 2020; Salloum vd., 2021). Örneğin, yaşam döngüsü aşamalarında transkript seviyelerindeki değişimler, Leishmania’nın metabolik adaptasyonları ve konak içindeki hayatta kalma stratejileri hakkında ipuçları sunmaktadır (Rastrojo vd., 2013). Bu durum, özellikle parazitlerin konak bağışıklık yanıtından nasıl kaçındığını anlamak açısından önemlidir; zira enfekte dendritik hücrelerde gözlemlenen karmaşık transkripsiyonel profiller, bu mekanizmaları ortaya koymaktadır (Margaroni vd., 2022). 6.3.ProteomikYaklaşımlar Proteomik çalışmalarında, kütle spektrometrisi entegrasyonu, araştırmacıların Leishmania’nın farklı yaşam evrelerinde ifade edilen proteinleri tanımlamasına ve nicelendirmesine olanak sağlamış, böylece patojenite ile ilişkili proteomik manzaraya dair önemli bilgiler sunmuştur (Silva vd., 2011; Adán‐ Jiménez vd., 2024). Evreye özgü proteinlerin tanımlanması, hastalık progresyonu ve tedavi etkinliği için potansiyel biyobelirteçlerin ortaya çıkarılmasına imkân tanır (Silva vd., 2022). Ayrıca, proteogenomik yaklaşımlar da gelişmiş olup, proteomik ve genomik verileri birleştirerek, parazitin virülansı açısından kritik olan yeni protein fonksiyonlarını ve post-translasyonel modifikasyonları ortaya çıkarmaktadır (Silva vd., 2022). 6.4.MetabolomikYaklaşımlar Metabolomik, yani metabolitlerin ve metabolik yolların incelenmesi, genomik, transkriptomik ve proteomik analizlerden elde edilen bilgileri tamamlar. Bu yaklaşım, Leishmania’nın gelişimi ve konak bağışıklık sistemi ile etkileşimi sırasında meydana gelen metabolik adaptasyonları çözümlemede etkili olmuştur (Muxel vd., 2019). Örneğin, Leishmania amazonensis ile makrofaj enfeksiyonu sırasında L-arginin metabolizmasındaki değişiklikler, bağışıklık yanıtlarında farklılıklara yol açmış ve konak-parazit metabolik etkileşimlerinin önemini göstermiştir (Muxel vd., 2019). Mevcut terapilere yanıt olarak metabolomik değişimlerin profillenmesi, potansiyel yeni ilaç hedeflerinin tanımlanması ve direnç mekanizmalarının anlaşılması açısından araştırmacılara yol göstermektedir (Scheltema vd., 2010). 6.5. CRISPR/Cas9 ve RNAi gibi gen düzenleme teknolojilerinin kullanımı CRISPR/Cas9 ve RNAi teknolojilerinin ortaya çıkışı, Leishmania araştırmalarında genetik manipülasyonu devrim niteliğinde bir biçimde
LEISHMANIA TÜRLERİNDE MOLEKÜLER VE GENETİK MEKANİZMALAR . . . 29 değiştirmiş, gen fonksiyonlarını analiz etmek ve ilaç hedeflerini doğrulamak için hassas gen düzenlemelerine olanak sağlamıştır (Ishemgulova vd., 2018). Araştırmacılar, parazitin yaşam döngüsünde rol oynayan genleri başarılı bir şekilde devre dışı bırakarak, virülans ve direnç mekanizmalarının anlaşılmasını derinleştirmiştir (Ishemgulova vd., 2018). Bu tekniklerin uygulanması, gen kırılmalarının Leishmania biyolojisi üzerindeki etkilerini modellemeye ve böylece yeni terapötik yaklaşımların keşfine zemin hazırlamaktadır. 6.6.Multi-omicsentegrasyonuileyenibiyobelirteçveilaçhedefikeşfi Multi-omik verilerin entegrasyonu, biyobelirteç ve ilaç hedefi keşfini geliştirebilir ve biyolojik sistemlerin bütünsel bir görünümünü sunar (Horácio vd., 2021). Sistem biyolojisi gibi teknikler, büyük miktarda biyolojik veriyi sentezlemek için hesaplamalı araçlar kullanarak, Leishmania ile konak arasındaki karmaşık etkileşimleri ortaya çıkarabilir (Horácio vd., 2021). Bu entegrasyon, hastalık progresyonunu ve terapötik yanıtları yöneten karmaşık etkileşim ağlarının anlaşılmasında kritik öneme sahiptir. 6.7.Yapayzekâdestekliverianalizivesistembiyolojisiperspektifleri Yapay zeka ve makine öğreniminin omik verilerin analizinde kullanımı, Leishmania araştırmalarında öncü bir alan olarak öne çıkmakta ve geleneksel analizlerle fark edilemeyen örüntülerin tanımlanmasına olanak sağlamaktadır (Fernández-Prada vd., 2017). Yapay zeka, genomik, transkriptomik, proteomik ve metabolomik çalışmaların yüksek boyutlu verilerini analiz ederek yeni biyobelirteçlerin keşfini kolaylaştırabilir. Ayrıca, konak-parazit etkileşimlerinin anlaşılmasını derinleştirerek, leishmaniasis’e karşı etkili aşı ve terapötik stratejilerin geliştirilmesine katkı sağlayabilir. Sonuç olarak, omik teknolojiler ile genetik manipülasyonun birleşimi, Leishmania araştırmalarında derin etkiler yaratmış; parazitin biyolojisi, patogenezi ve terapötik yanıtlarının anlaşılmasını büyük ölçüde ilerletmiştir. Çok boyutlu verilerin entegrasyonu ve yenilikçi hesaplamalı araçların kullanımı, alandaki ilerlemeyi sürdürecek ve leishmaniasisin etkili bir şekilde kontrol altına alınması için kritik olan yeni biyobelirteçler ve terapötik hedeflerin keşfini yönlendirecektir. 7. Gelecek Perspektifler Moleküler ve genetik verilerin translasyonel tıpa entegrasyonu, özellikle parazitik hastalıklar bağlamında, kişiselleştirilmiş terapötik stratejilerin geliştirilmesi için sağlam bir temel sunmaktadır. Translasyonel tıp, bilimsel
30 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I keşiflerin temel araştırmalardan klinik uygulamalara hızla aktarılmasını hedefleyerek, hastalık yönetimi ve hasta sonuçlarını iyileştirmeyi amaçlar. Bu sürecin kritik bir yönü, bireysel hasta profillerine ve hastalık durumlarına özgü biyobelirteçler ile terapötik hedeflerin tanımlanmasıdır. Bu durum daha etkili tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine olanak tanır (Wang ve Wang, 2021). Ayrıca, yapılan çalışmaklar, kesin moleküler bilginin, akut hastalık yönetiminden kronik hastalık yönetimine geçişi kolaylaştırarak, spesifik klinik fenomlara uygun kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımlarının önünü açtığını vurgulamaktadır (Wang ve Fan, 2021; Wang ve Wang, 2021). Parazitik hastalıklar alanında, kişiselleştirilmiş terapötik stratejiler, konak-parazit etkileşimlerinin moleküler düzeyde anlaşılması ile giderek daha mümkün hâle gelmektedir. Örneğin, IL-21/IL-21R ekseni, sıtma gibi enfeksiyonlar sırasında bağışıklık yanıtlarını düzenlemede kritik bir rol oynamakta ve konak bağışıklığını güçlendirecek potansiyel terapötik müdahalelere işaret etmektedir (Solaymani-Mohammadi vd., 2019). Benzer şekilde, Singh’in belirttiği üzere, patojenik mekanizmaların daha iyi anlaşılması, parazitlerin genetik ve moleküler özelliklerini dikkate alan hedefe yönelik tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine olanak sağlamaktadır (Singh, 2021). Genomik veriler ve biyoinformatik araçlardan elde edilen ilaçlanabilir hedeflerin tanımlanması hem konak bağışıklık profiline hem de parazitin özgün özelliklerine uygun kişiselleştirilmiş tedavi rejimlerinin oluşturulması açısından kritik öneme sahiptir (Francisco vd., 2020; Singh, 2021). Moleküler biyoloji ve genetik mühendisliği tekniklerindeki, özellikle CRISPR/Cas9 sistemleri gibi ilerlemeler, hedefe yönelik yeni ilaç ve aşı geliştirme potansiyelini artırmaktadır. Bu teknolojiler, parazitik organizmalara özgü kritik metabolik yolları hedefleyen yeni terapötik ajanların geliştirilmesine olanak tanıyan hassas genom düzenlemelerine imkân sağlar (Schacker ve Seimetz, 2019). Birçok çalışmanın vurguladığı üzere, parazitlerdeki spesifik metabolik yolları hedef alan hedefe yönelik terapiler, yalnızca terapötik etkinliği artırmakla kalmayıp, parazitik enfeksiyonların tedavisinde devam eden bir zorluk olan ilaç direnci sorununu da azaltabilir. Birden fazla yolu hedefleyen ilaç kombinasyonları, direnç gelişme olasılığını azaltırken tedavi etkinliğini artırmada umut verici sonuçlar göstermiştir (Barrow vd., 2020; Tom vd., 2025). Ayrıca, parazitlerin genetik bilgisi ve moleküler profillerinden yararlanan yenilikçi aşı geliştirme yaklaşımları ortaya çıkmakta ve özelleştirilmiş terapötik stratejilerin gerekliliğini vurgulamaktadır. Araştırmalar, parazit genomlarından elde edilen spesifik antijenlerin kullanımı ile konaklarda immünojenik yanıtın önemli ölçüde artırılabileceğini ve böylece etkili aşıların geliştirilebileceğini
LEISHMANIA TÜRLERİNDE MOLEKÜLER VE GENETİK MEKANİZMALAR . . . 31 göstermektedir (Dunay vd., 2018; Singh, 2021; Morales-Luna vd., 2024). Ayrıca, nanomedisin araştırmaları, terapötiklerin hedefe yönelik olarak iletilmesine olanak tanıyarak, parazitik hastalıklara karşı tedavilerin özgüllüğünü ve etkinliğini artırma potansiyelini ortaya koymaktadır (Tijjani vd., 2022). Dolayısıyla, moleküler ve genetik verilerin translasyonel tıpa katkısı, parazitik hastalıklarda kişiselleştirilmiş terapötik stratejilerin geliştirilmesi açısından kritik öneme sahiptir. Güncel genetik bilgiler ve yenilikçi teknolojilerden yararlanılarak, hedefe yönelik ilaç ve aşı geliştirme potansiyeli büyük ölçüde artırılmakta ve bu sayede bu karmaşık enfeksiyonların tedavi yaklaşımları köklü bir şekilde dönüştürülmektedir. 8. Sonuç Leishmania araştırmalarında moleküler ve genetik yaklaşımlar, parazitin biyolojisi, patojenitesi, genetik çeşitliliği ve tedaviye yanıtlarının anlaşılmasında merkezi bir rol oynamaktadır. CRISPR-Cas9, PCR, MLST ve diğer ileri genetik teknikler, parazit genomunun detaylı analizini, gen fonksiyonlarının belirlenmesini ve temel genlerin potansiyel ilaç hedefleri olarak tanımlanmasını mümkün kılmaktadır. Bu yöntemler, Leishmania türleri arasındaki genetik polimorfizmin, melezleşme olaylarının ve mitochondrialnükleer genom uyumsuzluklarının anlaşılmasına katkı sağlamakta; bu bilgiler, hastalık epidemiyolojisinin izlenmesi, virülans faktörlerinin belirlenmesi ve etkili aşı adaylarının geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Öte yandan, immünogenetik çalışmalar ve genom-immün yanıt entegrasyonu, konak genetik arka planlarının enfeksiyon duyarlılığını nasıl etkilediğini ortaya koyarak, risk altındaki popülasyonlar için hedefe yönelik ve kişiselleştirilmiş müdahalelerin tasarlanmasını mümkün kılmaktadır. Moleküler ve genetik araştırmalar ayrıca kemogenomik analizler aracılığıyla ilaç direnci profillemesini sağlayarak, mevcut tedavi protokollerinin optimize edilmesine ve yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesine zemin hazırlamaktadır. Disiplinlerarası iş birliği, genetikçiler, epidemiyologlar ve klinik araştırmacılar arasındaki entegrasyonu güçlendirerek, Leishmania enfeksiyonlarının kontrolünde daha kapsamlı ve etkili yöntemlerin uygulanmasını mümkün kılmaktadır. Sonuç olarak, moleküler ve genetik metodolojilerin translasyonel araştırmalara entegrasyonu, sadece parazitin biyolojisi ve patojenik mekanizmaları hakkında derinlemesine bilgi sağlamakla kalmayıp, aynı zamanda yeni ilaç ve aşı adaylarının geliştirilmesi, direnç mekanizmalarının anlaşılması ve kamu sağlığı müdahalelerinin iyileştirilmesi açısından da kritik bir araç olarak öne çıkmaktadır. Bu bütüncül yaklaşım,
32 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I leishmaniasis’in küresel tehdit oluşturduğu günümüzde, hem bilimsel hem de klinik açıdan sürdürülebilir ve etkili kontrol stratejilerinin temelini oluşturmaktadır. Kaynakça Abbasi, E. and Saeedi, S. (2022). A perspective on human leishmaniasis and new methods with therapeutic strategies for prevention, diagnosis, and treatment. Adán‐Jiménez, J., Sánchez-Salvador, A., Morato, E., Solana, J., Aguado, B., & Requena, J. (2024). A proteogenomic approach to unravel new proteins encoded in the leishmania donovani (hu3) genome. Genes, 15(6), 775. Afrin, F., Khan, I., & Hemeg, H. (2019). Leishmania-host interactions-an epigenetic paradigm. Frontiers in Immunology, 10. Andrade, J., Gonçalves, L., Liarte, D., Lima, D., Guimarães, F., Resende, D., … & Murta, S. (2020). Comparative transcriptomic analysis of antimony resistant and susceptible leishmania infantum lines. Parasites & Vectors, 13(1). Andrade-Narváez, F., Wynsberghe, N., Sosa-Bibiano, E., & Loría-Cervera, E. (2017). Eco-epidemiological and immunological features of localized cutaneous leishmaniasis in southeastern mexico: thirty years of study. Aoki, J., Muxel, S., Laranjeira‐Silva, M., Zampieri, R., Müller, K., Nerland, A., … & Floeter‐Winter, L. (2020). Dual transcriptome analysis reveals differential gene expression modulation influenced by leishmania arginase and host genetic background. Microbial Genomics, 6(9). Barrow, P., Dujardin, J., Fasel, N., Greenwood, A., Osterrieder, N., Lomonossoff, G., … & Lalle, M. (2020). Viruses of protozoan parasites and viral therapy: is the time now right?. Virology Journal, 17(1). Beattie, L., Evans, K., Kaye, P., & Smith, D. (2008). Transgenic leishmania and the immune response to infection. Parasite Immunology, 30(4), 255-266. Bernet, J., Mullick, J., Singh, A., & Sahu, A. (2003). Viral mimicry of the complement system. Journal of Biosciences, 28(3), 249-264. Birhan, Y., Bekhit, A., & Hymete, A. (2014). Synthesis and antileishmanial evaluation of some 2,3-disubstituted-4(3h)-quinazolinone derivatives. Organic and Medicinal Chemistry Letters, 4(1). Bussotti, G., Piel, L., Pescher, P., Domagalska, M., Rajan, K., Cohen‐ Chalamish, S., … & Späth, G. (2021). Genome instability drives epistatic adaptation in the human pathogenleishmania. Proceedings of the National Academy of Sciences, 118(51).
39 BÖLÜM III HÜCRE ÖLÜM YOLAKLARI: MOLEKÜLER MEKANİZMASI VE GELECEK PERSPEKTİF CellDeathPathways:MolecularMechanismsandFuture Perspectives Dilara EMERCE1& Didem Işık KARAGÖZ2 1(Lisans Öğrencisi), Kilis 7 Aralık Üniversitesi, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü E-mail: dilaraemer[email protected] ORCID:0009-0002-9178-2943 2(Prof. Dr.), Gaziantep Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0001-6527-2750 1. Giriş Hücre ölümü, doku homeostazının korunması, bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesi ve hasarlı ya da patojenik hücrelerin elimine edilmesi için temel bir biyolojik süreçtir. Programlanmış hücre ölümü (PCD), genetik olarak kontrol edilen ve aktif biçimde düzenlenen hücresel ölüm şekillerini tanımlar. Kavram ilk kez 1960’larda ortaya atılmış olsa da, bu süreçlerin moleküler mekanizmaları günümüzde halen araştırmaların merkezinde yer almaktadır. Son yıllarda yapılan çalışmalar, PCD’nin yalnızca apoptoz ile sınırlı olmadığını; otofaji, nekroptoz, piroptoz ve ferroptoz gibi farklı türleri de kapsadığını göstermiştir (Qian vd., 2024). Bu süreçlerden apoptoz, uzun süre genetik olarak kodlanmış hücresel intihar programı şeklinde kabul edilmiş ve özellikle onkojenik mutasyonları barındıran anormal hücrelerin ortadan kaldırılması yoluyla kanserin engellenmesinde kritik bir rol oynamıştır. Ancak kanser hücreleri, apoptotik sinyalleşmeyi baskılayan mutasyonlar geliştirerek bu ölümden kaçabilmekte ve tümör progresyonuna katkıda bulunmaktadır (Wang vd., 2024). Bunun yanında otofaji, nekroptoz, piroptoz ve ferroptoz gibi alternatif
40 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I yolaklar da hücresel kaderin belirlenmesinde ve hastalıkların patogenezinde önemli roller üstlenmektedir. Bu nedenle, hücre ölüm mekanizmalarının detaylı olarak anlaşılması, hastalıkların moleküler temellerinin aydınlatılması ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi açısından büyük önem taşımaktadır. Sonuç olarak, hücre ölüm mekanizmaları yalnızca hücresel dengeyi korumakla kalmayıp aynı zamanda hastalıkların gelişiminde ve tedavisinde belirleyici rol oynamaktadır. Bu nedenle, bu yolakların moleküler düzeyde anlaşılması, biyomedikal araştırmalar ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi açısından kritik öneme sahiptir. 2. Hücre Ölüm Yollarının Sınıflandırılması ve Mekanizması Hücre ölüm türleri programlanmış hücre ölümü (PCD) ve programlanmamış hücre ölümü olarak ikiye ayrılır. Programlanmış hücre ölümü, genler tarafından kontrol edilen programlı ve düzenli hücre ölümüdür. Bunlar; apoptoz, otofaji, piroptoz, nekroptoz ve ferroptoz’dur. Programlanmamış hücre ölümü ise ani gelişen ve programsız ölüm tipi olan nekroz’dur. 2.1.ProgramlanmışHücreÖlümü(PCD) Şekil 1. Programlanmış hücre ölümü (PCD) Programlanmış hücre ölümü (PCD), embriyogenez ve organ morfogenezi ile yakından ilişkili olup, gelişimsel süreçler ve doku homeostazisinin sürdürülmesinde temel bir rol üstlenir. Ayrıca, bağışıklık sisteminin düzenlenmesinde kritik öneme sahiptir; lenfosit havuzlarının oluşumu ve korunmasında görev alarak immün yanıtın dengelenmesine katkıda bulunur. Hücresel stres tarafından da indüklenebilen PCD, hasar görmüş hücrelerin
HÜCRE ÖLÜM YOLAKLARI: MOLEKÜLER MEKANİZMASI VE GELECEK . . . 41 elimine edilmesinde ve organizmanın bakteriyel ya da viral patojenlere karşı savunmasında vazgeçilmez bir mekanizma olarak işlev görür (Qian vd., 2024). 2.1.1.Apoptoz Apoptoz ilk olarak 1972’de Kerr ve arkadaşları tarafından tanımlanmış olup programlanmış hücre ölümünün temel yapısıdır. Kaspaz kaskadı ile tanımlanmış olan bu süreç inflamatuar tepkileri ortaya çıkarmadan hücre ölümüne neden olmaktadır (Qian vd., 2024). Yani morfolojik olarak, nekrotik hücreler, endoplazmik retikulum ve mitokondri gibi organellerin şişmesi, plazma zarının yırtılması ve hücrenin parçalanması ile karakterize edilir (Stekovic ve Madeo, 2013). Apoptoz, çeşitli yolların aracılık ederek apoptotik vezikül oluşumunun da eşlik ettiği farklı morfolojik ve biyokimyasal özelliklere sahip olup en iyi çalışılmış en erken programlanmış hücre ölümüdür (He vd., 2024). Apoptoz yolu aynı zamanda; Intrinsik (içsel-mitokondriyal) ve ekstrinsik (dışsal-ölüm resepörü) apoptotik yol olarak ikiye ayrılır. Intrinsik apoptotik yol, pro-apoptotik faktörleri yani sitokrom c gibi mitokondriden sitoplazmaya salan ve kaspaz kaskadına neden olan mitokondriyal dış zar geçirgenliği tarafından doğrudan tetiklenmiş olur. Daha sonrasında ekstrinsik (ölüm reseptör) yol, Fas, TNF vb. gibi ölüm yolu sinyallerini alarak apoptozu indükler (He vd., 2024). Şekil 2. (A) İçsel yol (mitokondriyal apoptoz): DNA hasarı ya da büyüme faktörlerinin yokluğu gibi hücresel stres durumları, proapoptotik BH3-only proteinlerini (örneğin Bid, Bim, Puma) aktive eder. Bu proteinler, Bax ve Bak’ın etkinleşmesini sağlayarak oligomerleşmelerine yol açar. Oligomerleşen Bax/Bak
42 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I kompleksleri, mitokondriyal dış zar üzerinde gözenekler oluşturur ve sitokrom c’nin sitoplazmaya salınmasına neden olur. Sitokrom c, Apaf-1 ve ATP ile birleşerek apoptozom adı verilen kompleksin oluşumunu tetikler. Apoptozom, procaspase-9’un aktif forma dönüşmesini sağlar. Aktive edilen caspase-9, efektör caspazları (caspase-3, caspase-7) parçalayarak etkinleştirir ve sonuç olarak hücre yıkımı ile apoptoz meydana gelir. (B) Dışsal yol (ölüm reseptörü aracılı apoptoz): Hücre yüzeyindeki ölüm reseptörlerine (örneğin Fas, DR4, DR5) ölüm ligandlarının (FasL,TRAIL) bağlanması reseptörlerin trimerleşmesini sağlar. Bu süreçte adaptör protein FADD reseptörlere bağlanarak procaspase-8’in toplanmasına aracılık eder. Böylece ölüm indükleyici sinyal kompleksi (DISC) oluşur ve caspase-8 aktif hale gelir. Aktif caspase-8 doğrudan efektör caspazları aktive ederek ya da Bid’i parçalayarak içsel yol ile bağlantı kurar (Wang vd., 2024). 2.1.1.1.İntrinsic(İçsel-Mitokondriyal)Yol: Apoptozun intrinsik yolu bir dizi pro-apoptotik ve anti-apoptotik B hücreli lenfoma 2 olan yani BCL-2 ailesi proteinleri tarafından hücresel streslere yanıt vererek düzenlenir. Prove anti-apoptotik Bcl-2 ailesi üyeleri arasındaki dengenin korunması, mitokondriyal bütünlüğün düzenlenmesi ve hücre kaderinin belirlenmesi için kritik öneme sahiptir. İçsel yol da apoptotik hücrelerin hücre yüzeylerinde değişikliklere uğratarak, fagositler tarafından tanınmayı ve yutulmayı kolaylaştırarak hücrenin parçalanmasıyla sonuçlanır (Mustafa vd., 2024). Bu yolda DNA hasarı, oksidatif stres ve büyüme faktörünün eksikliğide dahil olmak üzere farklı hücresel stres biçimleri tarafından da tetiklenebilmektedir (Wang vd., 2024). Serbest bırakılan sitokrom c ise apoptozom kompleksini oluşturması için APAF1 bağlanarak çoklu prokaspaz-9 proteinlerinin toplanmasına sebep olur. Prokaspaz-9, APAF-1 ile homodimerler ve heterodimerler oluşturarak olgun kaspaz-9’a kendi kendine bölünmeyi ve aynı zamanda apoptozom kompleksinden ayrılmayı kolaylaştırır. Aktif kaspaz-9; efektör kaspaz-3, -6 ve -7’yi sırayla parçalayarak aktive eder (Loftus vd., 2022). Bcl-2ailesiproteinlerininrolü: BCL-2 protein ailesi, bu yolun birincil düzenleyicisi olarak kabul edilmektedir ve aynı zamanda içsel yolun kontrolünde önemli rol oynar. Ortak işlevlerine ve dizilerine dayanarak, bu aile üç ana gruba ayrılabilir: Sadece BH3 proteinleri (tBID, BIM), pro-apoptotik (BAX, BAK) ve anti-apoptotik proteinler (BCL-2, BCL-XL) (Mantri ve Doshi, 2025). Bcl-2 ve Bcl-xL gibi antiapoptotik
HÜCRE ÖLÜM YOLAKLARI: MOLEKÜLER MEKANİZMASI VE GELECEK . . . 43 proteinler, proapoptotik proteinleri yok ederek mitokondriyal işlevi sürdürür. Bax, Bak, Bid, Bim ve Puma gibi proapoptotik proteinler, apoptotik uyaranlar üzerine sadece BH3 proteinleri aktive eder aynı zamanda dış mitokondriyal zarın oligomerizasyonuna ve geçirgenliğine yol açmaktadır (Wang vd., 2024). BH-3 proteinleri, belirli uyaranlara yanıt olarak aktive edilen ilk düzenleyici faktörlerdir. Bu proteinler, pro-apoptotik üyeleri doğrudan etkinleştirerek ya da anti-apoptotik proteinlerin fonksiyonlarını baskılayarak görev yapar. Sonuçta mitokondriyal dış zarın geçirgenliği artar ve bu durum, mitokondriyal zarlar arası boşluktan sitoplazmaya sitokrom c’nin salınmasını sağlayarak hücre ölüm sürecini başlatır. Sitokrom c, Apoptotik proteaz aktive edici faktör-1 (Apaf-1) ile etkileşime girerek prokaspaz-9’un tetiklenmesini sağlar ve birlikte apoptozom adı verilen multimerik protein kompleksini oluşturur. Apaf-1’e bağlanan sitokrom c, kaspaz-9’un doğrudan toplanmasını ve aktivasyonunu kolaylaştırır. Aktive edilen kaspaz-9, ardından kaspaz-3 ve kaspaz-7’yi parçalayarak etkinleştirir ve böylece apoptoza yol açan aşağı akıştaki proteolitik kaskadı başlatır. TP53 geni, genom bütünlüğünün korunmasında kritik rol oynayan p53 proteini kodlar. p53, stres sinyalleriyle aktive olarak apoptozu indükler ve proapoptotik BCL-2 ailesi üyelerinin ekspresyonunu düzenler. Sitokrom c, apoptotik proteinlerin anti-apoptotik proteinlere göre oranı yükselmeye başladığında mitokondriden sitoplazmaya salınmaya başlar bu da apoptozomun oluşmasıyla apoptoza neden olmaktadır (Mantri ve Doshi, 2025). 2.1.1.2.Extrinsic(dışsal-hücreölüm)Yolu: Apoptozun dışsal yolu, hücre yüzeyindeki spesifik reseptörlere bağlanan hücre dışı ölüm ligandları ile başlatılır. Bu süreç, başlatıcı kaspaz olan kaspaz8’in aktivasyonu ile tetiklenir; ardından kaspaz-3 ve kaspaz-7 gibi efektör kaspazların etkinleşmesiyle apoptoz gerçekleşir. Bu mekanizma, enfekte olmuş veya transformasyona uğramış hücrelerin elimine edilmesinde bağışıklık sistemi açısından kritik öneme sahiptir. Ölüm reseptörleri, ligand bağlanmasının ardından trimerizasyon geçirir. Bu yoldaki temel ligand–reseptör çiftleri arasında Fas reseptörü (FAS) ile Fas ligandı (FASL), tümör nekroz faktörü reseptörü-1 (TNFR1) ile tümör nekroz faktörü (TNF) ve TRAIL-R1/ TRAIL-R2 (DR4/DR5) ile tümör nekroz faktörü ile ilişkili apoptozu indükleyen ligand (TRAIL) yer alır. Apoptozun devam etmesi için gerekli olan kaspaz-3/7’nin aktivasyonuna, kaspaz-9’un içsel yoldaki rolüyle, kaspaz-8 bölünmesine teşvik eder. Bununla birlikte, kaspaz-10’un spesifik işlevi ise belirsizliğini korumaktadır. TNF reseptör (TNFR) sinyallemesi, sadece hücre ölümünü
44 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I tetiklemekle kalmayıp, aynı zamanda farklı bağlamlarda inflamasyon ve hücre sağkalımını da düzenleyen önemli bir mekanizmadır. TNFR aktive olduğunda, TNFR’a bağlı adaptör proteini TRADD, TNF reseptör ilişkilendirici faktör 2 (TRAF2) aracılığıyla reseptörle ilişkili protein kinaz 1 (RIPK1) ve hücresel apoptoz inhibitör proteinleri (cIAP’lar) ile kompleks I’i oluşturur. cIAP’lar, RIPK1’in Lys63-bağlantılı ubiquitinlenmesini sağlayarak klasik IkB kinaz komplekslerinin kompleks I’e çekilmesini artırır ve böylece NF-κB yolunun aktivasyonuna katkıda bulunur. Kompleks I bileşenlerinden olan cIAP’lar, TGF-β aktive kinaz 1 (TAK1) veya Tank-bağlayıcı kinaz 1 (TBK1) gibi proteinlerin işlevsel olarak inhibe edilmesi durumunda, sinyal iletimi kompleks II’ye (ripoptosom) kayar. Kompleks II, RIPK1, Fas-assosye edilmiş ölüm domaini (FADD), kaspaz-8 ve cFLIP’ten oluşur. Burada cFLIP ve kaspaz-8 arasındaki denge kritik öneme sahiptir; cFLIP, TRADD ve FADD aracılığıyla kaspaz-8 aktivasyonunu baskılayarak apoptozu sınırlar. Ripoptosomun proapoptotik aktivitesi yalnızca düşük cFLIP seviyeleri altında ortaya çıkar. Kaspaz-8 inhibe edildiğinde, RIPK1’in parçalanması gerçekleşmediği için hücre kaderi nekroptoza yönelir. Ayrıca, kaspaz-8 aktivasyonu BID proteininin parçalanmasını sağlayarak tBID formunu oluşturur. tBID, mitokondriyal dış membran permeabilizasyonunu (MOMP) tetikler ve SMAC salınımını artırır; bu süreç XIAP’ın apoptozu engelleyen etkisini ortadan kaldırarak intrinsik ve ekstrinsik apoptoz yolları arasında önemli bir bağlantı sağlar (Qian vd., 2024). 2.1.2.Piroptoz Piroptoz, inflamatuar özellikleri ile apoptoz ve nekrozdan ayrılan benzersiz bir programlanmış hücre ölümü biçimidir. Bu süreçte inflamazomların etkinleşmesi ve kaspaz aktivasyonu kritik rol oynar. Genellikle enfeksiyonlar ve çeşitli patolojik durumlar tarafından tetiklenen piroptoz, inflamatuar kaspazların aktivasyonu sonucunda hücre zarında gasdermin kaynaklı gözeneklerin oluşmasıyla gerçekleşir. Bu olay, hem hücre ölümünü hem de güçlü bir inflamatuar yanıtın ortaya çıkmasını sağlar (Qian vd., 2024; Wang vd., 2024). Piroptoz, ilk olarak Zychlinsky ve arkadaşları tarafından 1992’de tanımlanan, başlangıçta apoptozun bir alt türü olarak değerlendirilen, ancak 2001’de ayrı bir hücre ölüm modu olarak kavramsallaştırılan programlanmış hücre ölümüdür. Bu süreç, kaspaz-1 başta olmak üzere inflamatuar kaspazların aktivasyonu ile başlar ve gasdermin ailesi proteinlerinin (özellikle GSDMD) kesilmesi ve polimerizasyonu sonucunda hücre zarında gözeneklerin oluşumu ile karakterizedir. Apoptoza kıyasla daha hızlı gerçekleşir ve proinflamatuar
HÜCRE ÖLÜM YOLAKLARI: MOLEKÜLER MEKANİZMASI VE GELECEK . . . 45 sitokinlerin yoğun salınımıyla seyreder. Piroptoz, zaman zaman “sekonder nekroz” olarak da adlandırılır. Bunun nedeni, fagositik temizliğin gerçekleşmediği durumlarda apoptotik hücrelerin ikincil nekroza uğraması, hücre şişmesi ve zar bütünlüğünün bozulmasıyla inflamatuar içeriklerin salınmasıdır. Bu özellikleri ile piroptoz, enfeksiyonlara ve inflamatuar süreçlere karşı konak savunmasında önemli bir mekanizma olarak öne çıkar (He vd., 2024). Şekil 3. Piroptoz şematik gösterimi (He vd., 2024). Piroptoz, inflamatuar özelliklere sahip programlanmış bir hücre ölüm şeklidir ve üç temel yol ile sınıflandırılır: Kanonik yol, kanonik olmayan yol ve alternatif yol. Kanonik yol (Kaspaz-1 bağımlı yol): İnflamazom kompleksleri ASC’yi (apoptosis-associated speck-like protein) toplar ve ona bağlanır. Bu yapı, prokaspaz-1’in ASC odaklarına toplanarak aktive olmasını sağlar. Aktive kaspaz-1, pro-IL-1β ve pro-IL-18’i işleyerek olgun sitokinlere dönüştürür. Ayrıca gasdermin D’yi (GSDMD) keserek N-terminal fragmanı (GSDMD-NT) açığa çıkarır. GSDMD-NT plazma zarında gözenekler oluşturarak IL-1β ve IL-18 salınımına, su girişine, hücre şişmesine ve piroptotik hücre ölümüne yol açar. Kanonik olmayan yol: Bakteri kaynaklı lipopolisakkarit (LPS), kaspaz-4/5 (insanda) veya kaspaz-11’i (farede) doğrudan tanır ve aktive eder. Aktif kaspaz-4/5/11, GSDMD’nin bölünmesine yol açarak gözenek oluşumu ve piroptozu indükler. Alternatif yol: Burada farklı kaspazlar gasdermin ailesi üzerinden piroptozu tetikler. Olgun kaspaz-3, gasdermin E’yi (GSDME) keserek piroptozu başlatır.
46 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Benzer şekilde, kaspaz-8 gasdermin C’nin (GSDMC) bölünmesini sağlar (He vd., 2024). 2.1.3.Otofaji Otofaji, hasarlı, yaşlanmış veya fazla biyomakromoleküllerin ve organellerin lizozomlar aracılığıyla parçalanarak geri dönüştürülmesini sağlayan, evrimsel olarak yüksek derecede korunmuş bir katabolik mekanizmadır. Otofaji, Yunanca “kendi” ve “yeme” kelimelerinden türetilmiştir. Bu süreç, hücre içi bileşenlerin yıkımı ve küçük moleküllerin serbest bırakılması yoluyla yeniden kullanımına imkân tanır. Otofaji, temel olarak hücresel homeostazın korunmasında görev yapar ve normal fizyolojik koşullar altında hücre dengesini sürdürmek için kritik öneme sahiptir. Fizyolojik rolünün ötesinde otofaji, besin yoksunluğu, hipoksi, endoplazmik retikulum (ER) stresi ve diğer dış stres faktörleri altında bir hücresel hayatta kalma mekanizması olarak da işlev görür. Ancak bazı durumlarda, aşırı otofajik aktivite otofajik hücre ölümü olarak adlandırılan programlanmış hücre ölümü tipine yol açabilir. Kanser biyolojisinde otofaji çift yönlü bir role sahiptir. Hücre içi bileşenleri geri dönüştürerek enerji üretimi ve biyosentez için gerekli substratları sağlar, bu sayede tümör hücrelerinin çoğalmasını ve hayatta kalmasını destekleyebilir. Ayrıca, sitotoksik tedavilere maruz kalan kanser hücrelerinin otofaji yoluyla stres koşullarına adapte olması, tedavi direncine katkıda bulunur. Bu nedenle, yerleşik tümörlerde otofajinin inhibe edilmesi, tümör hücrelerinin hayatta kalma ve büyüme yeteneklerini azaltarak terapötik fayda sağlayabilir (Qian vd., 2024; Wang vd., 2024). Otofaji üç tipte sınıflandırılır: Makrootofaji, mikrootofaji ve şaperon aracılı otofaji (CMA). Mikrootofajide, sitoplazmik organeller veya veziküller, makrootofajiye kıyasla daha yüksek özgüllük göstererek doğrudan lizozomlarla etkileşime girer ve onlarla kaynaşır. Buna karşın, şaperon aracılı otofaji (CMA) kargo tanıma sürecinde sitoplazmik şaperonlara dayanır. Substrat proteinleri, şaperonlar aracılığıyla seçilir ve lizozomal membran proteini LAMP-2A üzerinden tanınarak lizozoma taşınır; bu sayede lizozomal füzyon ve degradasyon gerçekleşir. Güncel araştırmaların büyük bir kısmı makrootofaji üzerine odaklanmaktadır. Bu süreç, hedeflenen sitoplazmik kargonun önce çift zar yapılı veziküller (otofagozomlar) içinde izole edilmesi ve ardından lizozomlarla kaynaşarak parçalanması ile karakterizedir. Bu bağlamda “otofaji” terimi özellikle makrootofajiyi ifade edecektir (Qian vd., 2024). Hücresel bileşenlerin lizozomal mekanizmalar yoluyla parçalanmasını içeren katabolik bir süreç olan otofaji, yunanca “kendi” ve “yeme” kelimelerinden türetilmiştir.
HÜCRE ÖLÜM YOLAKLARI: MOLEKÜLER MEKANİZMASI VE GELECEK . . . 47 2.1.3.1.OtofajininMolekülerMekanizmaları Otofaji, hücresel homeostazın korunmasında kritik rol oynayan, evrimsel olarak korunmuş bir katabolik süreçtir. Bu mekanizma, sitoplazmik kargonun lizozomlarda degradasyona uğratılmasıyla işlev görür ve çok basamaklı bir düzenlemeye tabidir. Otofaji süreci, başlatma, çekirdeklenme, uzamaolgunlaşma ve füzyon-parçalanma olmak üzere dört ana fazda incelenebilir. Başlatma: Otofaji, ULK1/2–ATG13–FIP200–ATG101 kompleksinin aktivasyonu ile başlar. Bu kompleks, besin ve enerji sensörleri olan mTORC1 ve AMPK tarafından düzenlenir. Besin açısından zengin koşullarda, mTORC1 ULK1/2 ve ATG13’ü fosforile ederek kompleksi inhibe eder. Besin yoksunluğu durumunda ise mTORC1 baskısı kalkar ve otofaji aktive olur. Enerji kıtlığında, AMPK doğrudan ULK1 kompleksini aktive ederek otofajiyi indükler. Bu durum, mTORC1 ve AMPK arasında otofajiyi kontrol eden kritik bir çapraz düzenleme olduğunu göstermektedir. Çekirdeklenme: Aktive ULK1 kompleksi, sınıf III PI3K kompleksinin (VPS34, Beclin-1, ATG14L, p150) aktivasyonunu tetikler. Bu kompleks, fosfatidilinositol-3-fosfat (PI3P) üretimini artırarak PI3P bağlayıcı proteinlerin fagofor bölgesine toplanmasını sağlar. Beclin-1, bu fazın kilit düzenleyicisi olup, anti-apoptotik Bcl-2 proteini tarafından inhibe edilebilir. Çekirdeklenme sırasında, sitoplazmada lipozomal özellikler taşıyan kavisli bir zar yapısı olan fagofor oluşur ve bu yapı ilerleyen aşamalarda genişleyerek sitoplazmik kargoyu içine alır. Uzama ve Olgunlaşma: Fagoforun genişlemesi ve kapanması için iki ubikuitin-benzeri konjugasyon sistemi gereklidir. ATG12-ATG5-ATG16L kompleksi, ATG7 ve ATG10’un aracılığıyla oluşur ve fagoforun membran uzamasını destekler. LC3 konjugasyon sistemi; ATG8/LC3, ATG4 tarafından işlenerek LC3-I formuna dönüştürülür, ardından ATG7 ve ATG3 aracılığıyla fosfatidiletanolamin (PE) ile konjuge edilir ve LC3-II formunu alır. LC3-II, otofajinin önemli bir belirteci olup, membran genişlemesi ve kargo tanıma için kritik öneme sahiptir. Füzyon ve Parçalanma: Olgunlaşan otofagozom, lizozomlarla birleşerek otolizozom oluşturur. Bu füzyon sürecinde otofagozomal zar üzerindeki Q-SNARE proteinleri (ör. STX17, SNAP29) ile lizozomal zar üzerindeki R-SNARE proteinleri (ör. VAMP7, VAMP8) etkileşir. Füzyon sonucunda, lizozomal hidrolazlar kargoyu parçalayarak amino asitler ve yağ asitleri gibi temel biyomolekülleri açığa çıkarır. Bu ürünler sitoplazmaya geri kazandırılarak
48 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I yeniden biyosentez ve enerji üretiminde kullanılır (Qian vd., 2024; Wang vd., 2024). Şekil 4. Otofajik kesecik oluşumunda rol oynayan mekanizmalar. A. mTor kompleksi. B. Lipid kinaz Vps34, düzenleyici enzim Vps15 ve Atg6’dan (Beclin) oluşan PI3K kompleksi. C. İki ubikitin benzeri mekanizmanın rol oynadığı zar uzaması (Arslan vd., 2011). 2.1.3.2.KanserdeOtofajininRolü Otofaji, kanserde bağlama bağlı olarak hem tümör baskılayıcı hem de tümör destekleyici etkiler gösterebilen, çift yönlü bir süreçtir. Kanserin erken evrelerinde otofaji, tümör baskılayıcı bir mekanizma olarak işlev görür. Hasarlı organellerin ve proteinlerin yıkımını sağlayarak hücresel hasarın birikimini önler, genomik stabiliteyi korur ve oksidatif stres ile kronik inflamasyonu azaltır. Bu etkiler onkogenez riskini düşürür. Ayrıca, metabolik stres veya kemoterapötik ajanların etkisi altında, otofajik hücre ölümünü tetikleyebilir. Buna karşın, ilerlemiş tümörlerde otofaji genellikle hücresel adaptasyonu kolaylaştırarak tümör hücrelerinin hayatta kalmasına ve proliferasyonuna katkı sağlar. Tümör hücreleri, tümör mikroçevresinde (TME) görülen metabolik stres, hipoksi ve besin kısıtlılığı koşullarına karşı otofajiyi bir hayatta kalma stratejisi olarak kullanır. Bu süreç, hücre içi bileşenlerin geri dönüştürülmesiyle enerji üretimi ve biyosentez için gerekli substratların sağlanmasına aracılık ederek tümör büyümesini destekler. Ayrıca, otofaji sitotoksik tedavilere karşı
HÜCRE ÖLÜM YOLAKLARI: MOLEKÜLER MEKANİZMASI VE GELECEK . . . 55 demir, kararsız demir havuzuna (LIP) katılır ve burada Fenton reaksiyonları ile ROS üretimini artırır. Bu oksidan stres, membran lipidlerinde peroksidasyona yol açar. Ferroptozun düzenlenmesinde GPX4 ve sistin/glutamat antiporter sistemi Xc⁻ kritik rol oynar; her ikisi de antioksidatif savunma sağlayarak lipid peroksidasyonunu sınırlar. (D) Piroptoz: Piroptoz inflamatuar kaspazların aktivasyonu ile ortaya çıkan, proinflamatuar bir hücre ölüm şeklidir. Kaspaz-1, -4, -5 ve -11’in aktivasyonu, gasdermin D’nin (GSDMD) bölünmesine yol açar. Ortaya çıkan N-terminal fragman plazma zarında gözenekler oluşturarak hücre şişmesi, membran parçalanması ve inflamatuar sitokinlerin (örn. IL-1β, IL-18) salınmasına neden olur (Wang vd., 2024). 3. Gelecek Perspektif (Yeni Keşfedilen Hücre Ölüm Yolakları) 3.1.PANoptoz(PAN=Pyroptosis+Apoptosis+Necroptosis) PANoptosis, piroptoz, apoptoz ve nekroptozu kapsayan, doğuştan gelen bağışıklık tetikleyicileriyle ortaya çıkan özgün bir programlı hücre ölümü (PCD) biçimidir. Bu süreç, farklı PCD yollarının unsurlarını birleştiren PANoptosis adlı çok bileşenli protein kompleksinin aracılığıyla gerçekleşir. PANoptosis’in biyolojik sonuçları, piroptoz, apoptoz ve nekroptoz arasında etkileşim ve düzenleyici örtüşmelerle şekillenir; böylece her bir yolun tek başına sahip olduğu sınırlamaları aşar. PANoptozom bu sürecin merkezinde yer alırken yalnızca NLRP3 inflamatuarı ve ASC dahil olduğu inflamatuar bileşenlerin bir kümesini oluştururkenaynı zamanda kaspaz-8, kaspaz-3, RIPK1, RIPK3 ve MLKL gibi apoptotik ve nekroptotik moleküller için aynı zamanda bir bağlantı noktasını da oluşturur. PANoptozisin aktivasyonu; NLRP3 inflamazomunun engellenmesini ya da GSDMD üretiminin kısıtlanması gibi tek bir programlı nekrotik yolun baskılanması, PANoptoz ile gerçekleşen hücre ölümünü ortadan kaldırmak için yetersiz kaldığı için önemli gerçeği ortaya çıkarır. Spesifik aktivatörler tarafından yönetilen ve PANoptosome’un gözetimi altında düzenlenen PAN optozinflamatuar PCD yolunu özetler. Bu yol, piroptoz, apoptoz ve nekroptozun temel özelliklerini kapsar (Gao vd., 2024).
56 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Şekil 8. PANoptoz Mekanizmaları. PANoptoz, kaspazlar ve RIPK’ler tarafından yönlendirilen ve apoptoz, piroptoz ve nekroptoz özelliklerine sahip PANoptozom tarafından düzenlenen doğuştan gelen bir immün, litik ve inflamatuar hücre ölüm yoludur. Farklı tetikleyici faktörler, PANoptoza neden olmak için farklı PANoptozomların oluşumunu indükleyebilir. Bugüne kadar bilinen ana sensörler ZBP1, AIM2, pirin, NLRP12, RIPK1 ve NLRP3’tür. Bu sensörler, daha sonra RIPK1, kaspaz-8, RIPK3 ve kaspaz-1 gibi katalitik efektörler ASC veya FADD adaptörlerine bağlanarak PANoptozomu oluşturur ve böylece hücrelerin PANoptozuna neden olmaktadır (Gao vd., 2024). 3.2.Disulfidptosis(Disülfid-stresTemelliHücreÖlümü) Disülfit bağları, alt birimler arası ve içi çapraz bağlar oluşturarak proteinlerin ikincil, üçüncül ve dördüncül yapılarını koruyan, görece kararlı yapılardır. Bu bağlar, proteinlere hem fiziksel hem de kimyasal stabilite kazandırır. Nature Cell Biology dergisinde yayımlanan yakın tarihli bir çalışma, apoptoz, nekroptoz, piroptoz, otofaji, ferroptoz ve cuproptozis gibi bilinen
HÜCRE ÖLÜM YOLAKLARI: MOLEKÜLER MEKANİZMASI VE GELECEK . . . 57 hücre ölümü türlerinden farklı, yeni bir programlanmış hücre ölümü biçimi olan “disülfidpitoz” tanımlamaktadır (Zheng vd., 2023). Çözünen taşıyıcı aile 7 üye 11 (SLC7A11)’in yüksek ekspresyonu (SLC7A11^yüksek), glikoz yoksunluğu koşullarında aşırı hücre içi disülfit birikimine yol açar. Onarım mekanizmalarından yoksun hücrelerde bu durum disülfit stresine neden olur ve özgün bir mekanizmaya sahip, alışılmadık bir hücre ölümü biçimi olan disülfidpitozu tetikler. Disülfidptozun aktivasyonu üç ayırt edici özellik gerektirebilir: (1) Yüksek SLC7A11 ekspresyonu, hücre dışından sistein alımını artırırken hücre içi glutamatın dışarıya taşınmasına aracılık eder; bu durum, aşırı hücre içi sistein birikimine yol açarak hücre metabolizmasında disülfid stresine katkıda bulunur. (2) Glikoz açlığı koşulları, pentoz fosfat yolu (PPP) üzerinden indirgenmiş nikotinamid adenin dinükleotid fosfatın (NADPH) üretimini engelleyerek metabolik dengeyi bozar. (3) Aktin hücre iskeleti proteinleri arasında anormal disülfid bağlarının oluşumu gözlenir. Bu koşullar bir araya geldiğinde, aktin iskelet proteinleri arasında disülfid bağlarının artışı, aktin kasılması ve plazma zarından ayrılma ile sonuçlanır. Nihayetinde bu süreç, aşırı disülfid birikimine bağlı hücre büzülmesi ve ölümüne yol açar (Zheng vd., 2023). Şekil 9. Glikoz Açlığı Koşullarında Apoptoz ve Disülfidpitoz Mekanizması (Zheng vd., 2023).
58 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Hücre kaderi, çevresel ve genetik faktörlerin etkileşimi ile belirlenir. Bu sürecin merkezinde redoks homeostazı yer alır. Redoks dengesinin bozulması oksidatif strese yol açar ve bu da reaktif oksijen türlerinin (ROS) birikmesine neden olur. ROS artışı, hücrelerin hasarı sınırlamak için glutatyon (GSH) gibi antioksidan moleküller sentezlemesini zorunlu kılar. GSH biyosentezi, hücre dışından sistin alımını gerektirir. Bu işlev, fosfolipid tabakasına gömülü sistin/ glutamat antiport sistemi (Sistem Xc⁻) tarafından sağlanır. Sistem Xc⁻, hafif zincir SLC7A11 ve ağır zincir SLC3A2’den oluşur; her sistin alımı eş zamanlı olarak bir glutamatın hücre dışına taşınması ile gerçekleşir. Hücre içine alınan sistin, düşük çözünürlüğe sahip olduğundan, NADPH kullanılarak çözünür sisteine indirgenir. Ardından sistein, γ-glutamilsistein sentetaz ve glutatyon sentetaz tarafından glutatyon sentezine katılır. Böylece aşırı ROS ortadan kaldırılarak oksidatif stres baskılanır. Ancak bu sürecin sürdürülebilmesi için pentoz fosfat yolu (PPP) üzerinden NADPH üretimi için yeterli glikoz kaynağı gereklidir. Glikoz açlığı veya glikoz alımının blokajı altında, hücreler farklı yanıtlar gösterir: · SLC7A11^düşük hücrelerde, glikoz eksikliği G6P oluşumunu azaltır, PPP ve glikoliz yoluyla NADPH ve piruvat üretimini sınırlar. Bunun sonucunda TCA döngüsü ve mitokondriyal oksidatif fosforilasyon baskılanır. Bu enerji ve redoks dengesizliği, Bax/Bak aktivasyonu ve sitokrom c salınımı ile sonuçlanır; ardından kaspaz-3 aktivasyonu, PARP yıkımı ve membran kabarması gözlenir. Bu süreç hücreyi apoptoza yönlendirir. · SLC7A11^yüksek hücrelerde ise, glikoz açlığı koşullarında artan sistin alımı ve NADPH tükenmesi, aşırı sistein indirgenmesine yol açar. Bu durum, hücre içinde disülfid birikimi ve buna bağlı disülfid stresi oluşturur. Disülfid stresi, Rac–WRC–Arp2/3 sinyal yolunu aktive ederek aktin hücre iskeleti proteinlerinde anormal disülfid bağlarının oluşumunu tetikler. Sonuçta aktin filamentlerinde kasılma ve plazma zarından ayrılma meydana gelir. Bu süreç, hücre büzülmesi ve ölümle sonuçlanan yeni bir programlı hücre ölümü biçimi olan disülfidpitozu indükler. Özetle, glikoz açlığı altında hücre kaderi SLC7A11 ekspresyon düzeyine bağlıdır: SLC7A11 düşük hücreler apoptoza yönelirken, SLC7A11 yüksek hücreler disülfid birikimi sonucu disülfidpitoza girer. Bu mekanizmada kritik belirleyici faktör, redoks homeostazını korumak için gerekli NADPH düzeyleri ve sistin metabolizmasının dengelenmesidir (Zheng vd., 2023; Xiao vd., 2024).
HÜCRE ÖLÜM YOLAKLARI: MOLEKÜLER MEKANİZMASI VE GELECEK . . . 59 3.3.Paraptosis(YenidenCanlananİlgi) Apoptoz ve nekroz gibi iyi tanımlanmış hücre ölümü biçimleri kapsamlı şekilde araştırılmış olsa da, son yıllarda yürütülen çalışmalar daha az anlaşılan ancak hücresel fizyoloji ve patolojide önemli rol oynayan alternatif hücre ölüm mekanizmalarını ortaya koymuştur. Bu mekanizmalardan biri, kanser tedavisi ve direnç gelişimindeki potansiyel rolü nedeniyle dikkat çeken, apoptotik olmayan bir hücre ölümü türü olan paraptozdur. Paraptoz, ilk kez 2000 yılında Sperandio ve arkadaşları tarafından tanımlanmış ve morfolojik özellikleri, biyokimyasal profili ve spesifik apoptoz inhibitörlerine verdiği yanıt bakımından apoptozdan farklı olduğu gösterilmiştir. Yunanca para (yanında/ilgili) ve apoptoz kelimelerinden türetilen “paraptoz” terimi, o dönemde bilinen hücre ölümü biçimleri olan nekroz, apoptoz ve otofaji gibi yolaklardan ayrı yeni bir yol olarak önerilmiştir. Günümüzde ise Hücre Ölümü İsimlendirme Komitesi tarafından paraptoz, düzenlenmiş hücre ölümü (RCD) türlerinden biri olarak sınıflandırılmaktadır (Kunst vd., 2024). 3.3.1.Paraptoz:KanserTedavisiİçinAlternatifBirYol Kanser, oldukça karmaşık ve dirençli bir hastalık grubunu temsil eder. Programlı hücre ölümü (PCD) mekanizmalarının indüklenmesi, kanser hücrelerinin kontrolsüz çoğalmasını engellemek için etkili bir strateji olarak görülmektedir. Ancak kanser hücreleri, farklı kaçış mekanizmaları geliştirerek bu ölüm yollarından kurtulabilmektedir. Önemli bir nokta, kanser hücrelerinin belirli bir PCD yoluna karşı direnç geliştirdiğinde, alternatif bir hücre ölüm yoluna daha duyarlı hale gelebilmesidir. Bu bağlamda paraptoz, kanser hücre ölümünde potansiyel bir “yedek yol” olarak dikkat çekmektedir. Kanser hücrelerinin hızlı proliferasyonu, yanlış katlanmış veya katlanmamış proteinlerin birikmesine neden olarak endoplazmik retikulum (ER) stresini artırır ve aynı zamanda mitokondride reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini yükseltir. Paraptoz indükleyiciler, protein yıkımını azaltarak ve ROS oluşumunu artırarak kanser hücrelerini aşırı ER ve oksidatif stres karşısında savunmasız hale getirebilir. Nitekim daha önceki çalışmalarda paraptoz indükleyen bileşiklerin, bazı ilaç dirençli kanser hücrelerinde etkili olduğu bildirilmiştir. Örneğin, yumurtalık kanseri fare modellerinde, elaiophylin, platin, taksan ve RP inhibitörlerine dirençli hücrelerde paraptozu tetikleyerek güçlü bir antitümör etki göstermiştir. Benzer şekilde, ginsenosid Rh2 ve everolimus kombinasyonu hem vahşi tip hem de osimertinib dirençli akciğer kanseri hücrelerinde paraptozuindüklemiştir. Dolayısıyla, paraptoz indükleyiciler, özellikle diğer PCD türlerine karşı
60 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I edinilmiş veya içsel direnç geliştiren kanser hücreleri için umut verici bir tedavi stratejisi sunmaktadır (Xu vd., 2024). Şekil 10. Paraptozis çalışmasında gelecek perspektiflerinin şematik diyagramı. Paraptoz, kanser tedavisinde önemli bir potansiyel uygulama alanı sunmaktadır. Ancak, paraptozun tümör mikroçevresindeki rolü dikkate alınmalı ve bu süreç kanser tedavisine uyarlanırken göz önünde bulundurulmalıdır. Henüz tanımlanmamış olan paraptoz biyobelirteçlerinin belirlenmesi, tümör mikroçevresindeki işlevinin aydınlatılması açısından kritik öneme sahiptir. Ayrıca, paraptoz ile diğer programlı hücre ölümü (PCD) türleri arasındaki ilişkilerin ortaya konması, yeni ilaçların geliştirilmesi ve terapötik stratejilerin optimize edilmesi için değerli olacaktır (Xu vd., 2024). 4. Sonuç Hücre ölümü yolakları, hücresel yaşam döngüsünün ayrılmaz bir parçası olarak organizma sağlığının korunmasında kritik roller üstlenmektedir. Apoptoz, otofaji, nekroptoz, piroptoz ve ferroptoz gibi programlanmış ölüm türleri ile nekroz gibi programlanmamış hücre ölümü, farklı uyaranlar ve moleküler mekanizmalar aracılığıyla gerçekleşmektedir. Günümüzde, panoptosis, paraptozis ve disülfidptozis gibi yeni tanımlanan yolakların da eklenmesiyle bu süreçlerin çeşitliliği daha iyi anlaşılmaya başlanmıştır. Hücre ölüm yollarının kanser, nörodejeneratif hastalıklar, enfeksiyonlar ve immün yanıtlar üzerindeki belirleyici etkisi, bu mekanizmaların yalnızca biyolojik işlevler açısından değil, aynı zamanda terapötik hedefler bakımından da önemli olduğunu göstermektedir.
HÜCRE ÖLÜM YOLAKLARI: MOLEKÜLER MEKANİZMASI VE GELECEK . . . 61 Gelecekte yapılacak çalışmalar, bu yolakların daha ayrıntılı moleküler çözümlenmesine ve hastalıklarla ilişkilerinin aydınlatılmasına odaklanmalı; böylece yeni nesil tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine katkı sağlamalıdır. Kaynakça Mantri, S., & Doshi, G. M. (2025). Reactivating apoptotic pathways in cancer: A review of novel therapeutic approaches. European journal of pharmacology, 1003, 177965. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2025.177965 Arslan, D. Ö., Korkmaz, G., & Gözüaçık, D. (2011). Otofaji: Bir hücresel stres yanıtı ve ölüm mekanizması. [Yayınlanmamış rapor]. Sabancı Üniversitesi. Gao, X., Ma, C., Liang, S., Chen, M., He, Y., & Lei, W. (2024). PANoptosis: New insights into regulated cell death and its potential role in cardiovascular diseases (Review). International Journal of Molecular Medicine, 54(3), 74.15 He, R., Liu, Y., Fu, W., He, X., Liu, S., Xiao, D., & Tao, Y. (2024). Mechanisms and cross-talk of regulated cell death and their epigenetic modifications in tumor progression. Molecular Cancer, 23, 267. Kunst, C., Tümen, D., Ernst, M., Tews, H. C., Müller, M., & Gülow, K. (2024). Paraptosis—A distinct pathway leading to cell death. International Journal of Molecular Sciences, 25(21), 11478. Laster, S. M., Wood, J. G., & Gooding, L. R. (1988). Tumor necrosis factor can induce both apoptic and necrotic forms of cell lysis. The Journal of Immunology, 141(8), 2629–2634 Loftus, L. V., Amend, S. R., & Pienta, K. J. (2022). Interplay between Cell Death and Cell Proliferation Reveals New Strategies for Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences, 23(9), 4723. Mustafa, M., Ahmad, R., Tantry, I. Q., Ahmad, W., Siddiqui, S., Alam, M., Abbas, K., Moinuddin, Hassan, M. I., Habib, S., & Islam, S. (2024). Apoptosis: A Comprehensive Overview of Signaling Pathways, Morphological Changes, and Physiological Significance and Therapeutic Implications. Cells, 13(22), 1838. Qian, S., Long, Y., Tan, G., Li, X., Xiang, B., Tao, Y., Xie, Z., & Zhang, X. (2024). Programmed cell death: molecular mechanisms, biological functions, diseases, and therapeutic targets. About MedComm, 5(12), e70024. Stekovic, S., & Madeo, F. (2013). Cell death pathways. Biochimica et biophysica acta, 1833(12), 3447. Stockwell, B. R., Friedmann Angeli, J. P., Bayır, H., Bush, A. I., Conrad, M., Dixon, S. J., … Zhang, D. D. (2017). Ferroptosis: A regulated cell death
62 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I nexus linking metabolism, redox biology, and disease. Cell, 171(2), 273–285. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.09.021 Wang, S., Guo, S., Guo, J., Du, Q., Wu, C., Wu, Y., & Zhang, Y. (2024). Cell death pathways: molecular mechanisms and therapeutic targets for cancer. MedComm, 5(9), e693. Xiao, F., Li, H. L., Yang, B., Che, H., Xu, F., Li, G., Zhou, C. H., & Wang, S. (2024). Disulfidptosis: A new type of cell death. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death, 29(9-10), 1309–1329. Xu, C. C., Lin, Y. F., Huang, M. Y., Zhang, X. L., Wang, P., Huang, M. Q., & Lu, J. J. (2024). Paraptosis: A noncanonical cell death paradigm for cancer therapy. Acta Pharmacologica Sinica, 45(2), 223–237. Zheng, T., Liu, Q., Xing, F., et al. (2023). Disulfidptosis: A new form of programmed cell death. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 42, 137
63 BÖLÜM IV TET (TEN-ELEVEN TRANSLOCATION) ENZİMLERİ VE DNA METİLASYONU TET(Ten-ElevenTranslocation)EnzymesandDNAMethylation Leyla TUTAR1* & Hikmet DİNÇ2 1 (Öğr.Gör.) Gaziantep İslam Bilim ve Teknoloji Üniversitesi, Sağlık Hizmetleri MYO, Gaziantep, Türkiye E-mail: [email protected], [email protected], ORCID: 0000-0001-5274-9257 2 (Doç.Dr.) Gaziantep İslam Bilim ve Teknoloji Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Gaziantep, Türkiye E-mail: [email protected], [email protected] ORCID: 0000-0003-1823-1790 1. Giriş Epigenetik, DNA dizisinde değişikliğe sebep olmadan, gen ekspresyonlarında meydana gelen kalıtsal değişiklikleri ifade etmektedir. Bu mekanizma DNA dizisini doğrudan değiştirmeden gen ifadesinde değişikliklere sebep olarak fenotipe yansıyarak kalıtılabilmektedir. Bir organizmanın fenotipi, genom ve epigenom arasındaki etkileşimlerin ürünüdür (Şekil 1). Genom, döllenmeden itibaren yaşam boyunca sabit kalır; ancak hücreler, dokular ve organizma, çevresel uyaranlara yanıt olarak gen aktivitesinin epigenetik olarak yeniden programlanması sonucunda farklı epigenomlar geliştirir. Bu yeniden programlama olayları, yaşam döngüsü boyunca fenotipik değişikliklere yol açmaktadır (Smith ve Meissner, 2013; Klug vd., 2016; Kim ve Costello, 2017). * Corresponding author: [email protected], ORCID Number of authors: 0000-0001-5274-9257
64 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Şekil 1. Bir Organizmanın Fenotipi, Genom ve Epigenom Arasındaki Etkileşimler (Klug vd., 2016) Epigenetik düzenlemeler üç temel mekanizma ile gerçekleşebilmektedir; DNA metilasyonu, histon modifikasyonu ve kodlamayan RNA (non-coding RNA-ncRNA) ile ilişkili gen susturulması. Bu değişiklikler canlı yaşamının ilk evrelerinden başlayıp, hayatı boyunca sürebilen dinamik ve geri dönüşümlü bir süreçtir. Canlının yaşamında yalnızca sahip olduğu kalıtsal özelliklerin değil aynı zamanda genlerle birlikte dış etkenlerin de canlı genomunda bir dizi düzenlemeyle, hücrelerin farklılaşmasında, hangi genin nerede hangi oranda ifade edileceğini belirleyen süreçlerin bütünüdür (Berger vd., 2009; Al Aboud vd., 2023). Epigenetik düzenlemeler, kromatin yapısını, lokusların transkripsiyonel olarak erişilebilirliğini ve gen ekspresyon seviyelerini belirler (Sawan vd., 2008). Epigenetik, moleküler temele sahip karmaşık bir olgudur. İdentik genoma sahip hücre ve organizmaların farklı fenotipe sahip olmaları epigenetik sayesinde aydınlatılabilmektedir. Epigenetik mekanizmalar memelilerde normal gelişim ve doku spesifik ekspresyonların devamlılığı için gereklidir. Doku spesifik epigenetik mekanizmalar değişkendir ve bu karmaşık moleküler mekanizma sadece gelişim döneminde değil hayat boyunca özel hücresel olaylara uyarlanmaktadır. Epigenetik mekanizmalar genomik damgalanma, X kromozom inaktivasyonu gibi birçok önemli mekanizmada görev alırken, bu düzenlenmenin bozulması kanser, otoimmün ve nörolojik hastalıklar gibi sağlık sorunlarının ortaya çıkmasına sebep olmaktadır (Goll ve Bestor, 2005; Kohli ve Zhang, 2013; Cheishvili vd., 2015; Engin vd., 2021). DNA Metilasyonu, Epigenetik düzenlenmeler arasında sıklıkla güncel literatürde yerini alan mekanizmadır. DNA metilasyonu, Sitozin bazının 5. karbonuna bir metil (-CH3) grubunun eklenmesi olarak ifade edilmektedir (Goll ve Bestor, 2005; Moore vd., 2013; Valente vd., 2023). DNA metilasyon süreci bir dizi enzim ailesi tarafından gerçekleştirilen bir süreçtir. DNA
TET (TEN-ELEVEN TRANSLOCATION) ENZİMLERİ VE DNA METİLASYONU 71 Kim, U., & Lee, D. S. (2023). Epigenetic Regulations in Mammalian Cells: Roles and Profiling Techniques. Molecules and cells, 46(2), 86–98. Kiselev, I. S., Kulakova, O. G., Boyko, A. N., & Favorova, O. O. (2021). DNA Methylation As an Epigenetic Mechanism in the Development of Multiple Sclerosis. Acta naturae, 13(2), 45–57. Klug, W.S., Cummings, M.R., Spencer, C.A and Palladino M.A. (2016). Concepts of Genetics. 11th Edition. England: Pearson Education. Kohli, R. M., & Zhang, Y. (2013). TET enzymes, TDG and the dynamics of DNA demethylation. Nature, 502(7472), 472–479. Koivunen, P., & Laukka, T. (2018). The TET enzymes. Cellular and molecular life sciences : CMLS, 75(8), 1339–1348. Lorsbach, R., Moore, J., Mathew, S. et al. (2003). TET1, a member of a novel protein family, is fused to MLL in acute myeloid leukemia containing the t(10;11)(q22;q23). Leukemia 17, 637–641. Lu, F., Liu, Y., Jiang, L., Yamaguchi, S., & Zhang, Y. (2014). Role of Tet proteins in enhancer activity and telomere elongation. Genes & development, 28(19), 2103–2119. Lu, X., Zhao, B. S., & He, C. (2015). TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chemical reviews, 115(6), 2225–2239. Melamed, P., Yosefzon, Y., David, C., Tsukerman, A., & Pnueli, L. (2018). Tet Enzymes, Variants, and Differential Effects on Function. Frontiers in cell and developmental biology, 6, 22. Moore, L., Le, T. & Fan, G. (2013). DNA Methylation and Its Basic Function. Neuropsychopharmacol 38, 23–38. Ono, R., Taki, T., Taketani, T., Taniwaki, M., Kobayashi, H., & Hayashi, Y. (2002). LCX, leukemia-associated protein with a CXXC domain, is fused to MLL in acute myeloid leukemia with trilineage dysplasia having t(10;11) (q22;q23). Cancer research, 62(14), 4075–4080. Pawlowska, E., Szczepanska, J., Derwich, M., Sobczuk, P., Düzgüneş, N., & Blasiak, J. (2025). DNA Methylation in Periodontal Disease: A Focus on Folate, Folic Acid, Mitochondria, and Dietary Intervention. International Journal of Molecular Sciences, 26(7), 3225. Rasmussen, K. D., & Helin, K. (2016). Role of TET enzymes in DNA methylation, development, and cancer. Genes & development, 30(7), 733–750. Rudenko, A., Dawlaty, M. M., Seo, J., Cheng, A. W., Meng, J., Le, T., Faull, K. F., Jaenisch, R., & Tsai, L. H. (2013). Tet1 is critical for neuronal activityregulated gene expression and memory extinction. Neuron, 79(6), 1109–1122.
72 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Sawan, C., Vaissière, T., Murr, R., Herceg, Z. 2008. “Epigenetic drivers and genetic passengers on the road to Cancer”, Mutation Research, 642(1-2), 1–13. Smith, Z. D., & Meissner, A. (2013). DNA methylation: roles in mammalian development. Nature reviews. Genetics, 14(3), 204–220. Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Iyer, L. M., Liu, D. R., Aravind, L., & Rao, A. (2009). Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science (New York, N.Y.), 324(5929), 930–935. Valente, A., Vieira, L., Silva, M.J., Ventura, C. (2023). The Effect of Nanomaterials on DNA Methylation: A Review. Nanomaterials, 13, 1880. Wang, S. S., Lewis, M. J., & Pitzalis, C. (2023). DNA Methylation Signatures of Response to Conventional Synthetic and Biologic DiseaseModifying Antirheumatic Drugs (DMARDs) in Rheumatoid Arthritis. Biomedicines, 11(7), 1987. Xin, YJ., Yuan, B., Yu, B. et al. Tet1-mediated DNA demethylation regulates neuronal cell death induced by oxidative stress. Sci Rep 5, 7645 (2015). Xu, C., Liu, K., Lei, M., Yang, A., Li, Y., Hughes, T. R., & Min, J. (2018). DNA Sequence Recognition of Human CXXC Domains and Their Structural Determinants. Structure (London, England:1993), 26(1), 85–95.e3. Yu, H., Wang, Z., Ma, J. et al. (2025). The establishment and regulation of human germ cell lineage. Stem Cell Res Ther 16, 139. Yu, Z., Genest, P. A., ter Riet, B., Sweeney, K., DiPaolo, C., Kieft, R., Christodoulou, E., Perrakis, A., Simmons, J. M., Hausinger, R. P., van Luenen, H. G., Rigden, D. J., Sabatini, R., & Borst, P. (2007). The protein that binds to DNA base J in trypanosomatids has features of a thymidine hydroxylase. Nucleic acids research, 35(7), 2107–2115. Zhang, X., Zhang, Y., Wang, C., & Wang, X. (2023). TET (Ten-eleven translocation) family proteins: structure, biological functions and applications. Signal transduction and targeted therapy, 8(1), 297.
73 BÖLÜM V MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİDE BİYOİNFORMATİK BioinformaticsinMolecularMicrobiology Mehdi ESLAMI¹ & Uğur VURAL² & Zeynep ÇELIK³ & Berkay GÜZELAYDIN⁴ & İbrahim Halil KILIÇ⁵ ¹(Lisans Öğrencisi), Marmara Üniversitesi, İstanbul, Türkiye E-mail:[email protected] ORCID: 0000-0002-3448-7916 ² (Doktora Öğrencisi), Gaziantep Üniversitesi, Gaziantep, Türkiye E-mail: [email protected] ORCID: 0009-0008-7820-734X ³ (Doktora Öğrencisi), Gaziantep Üniversitesi, Gaziantep, Türkiye E-mail: [email protected] ORCID: 0009-0003-6517-0596 ⁴ (Lisans Öğrencisi), Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi, Çanakkale, Türkiye E-mail: [email protected] ORCID: 0009-0004-1268-2069 ⁵ (Prof. Dr.), Gaziantep Üniversitesi, Gaziantep, Türkiye E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0002-0272-5131 1. Giriş Biyoinformatik, modern bilimsel disiplinler genelinde, bilhassa biyolojik bilimler alanında büyük ölçekli veri kümelerinin katlanarak yayılmasının doğal bir sonucu olarak ortaya çıkmıştır. Bu üstel büyüme, bu devasa
74 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I bilgi hacmini etkili bir şekilde organize etme, analiz etme ve anlamlı içgörüler çıkarma konusunda zorlu bir problem sunmaktadır. Manuel işlemenin-ki bu saatler, günler, hatta yıllar sürebilir-pratik imkansızlığı, otomatik ve sofistike analitik yaklaşımlara olan kritik ihtiyacı belirginleştirmektedir. Bu zorunluluk, biyoinformatiği modern biyolojik araştırmanın vazgeçilmez bir köşe taşı olarak ön plana çıkarmıştır. Öyle ki, biyoinformatiğin gücünden ve araçlarından yararlanılmadan çığır açan biyolojik araştırmaların yürütülmesi neredeyse imkansız hale gelmiştir. Özünde, biyoinformatik, biyolojik veriyi anlamak için hesaplamalı yöntemlerin ve yazılım araçlarının geliştirilmesine ve uygulanmasına adanmış dinamik ve disiplinlerarası bir alandır. Özellikle muazzam ölçekli ve doğası gereği karmaşık veri kümeleriyle uğraşırken önemi belirginleşir. Biyoinformatik, temel biyoloji, kimya ve fizik gibi alanların yanı sıra bilgisayar bilimi, veri bilimi, bilgisayar programlama, bilgi mühendisliği, ileri matematik ve titiz istatistik gibi çeşitli bilimsel ve teknolojik alanlardan ilkeleri ve metodolojileri sorunsuz bir şekilde bütünleştirir. Bu disiplinlerin sinerjik kombinasyonu, biyoinformatiğin karmaşık biyolojik bilgi dokusunu titizlikle analiz etmesini ve yorumlamasını sağlar. Oxford İngilizce Sözlük tarafından sağlanan resmi tanım, bu alanın kapsamını ve özünü daha da aydınlatmaktadır. Tanıma göre (Moleküler) biyoinformatik, “biyolojiyi moleküller açısından (fiziksel kimya anlamında) kavramsallaştırma ve bu moleküllerle ilişkili bilgiyi büyük ölçekte anlamak ve organize etmek için ‘informatik tekniklerini’ (uygulamalı matematik, bilgisayar bilimi ve istatistik gibi disiplinlerden türetilmiş) uygulama” olarak ifade edilir. Bu tanım, alanın ikili odağını zarif bir şekilde özetler: Biyolojik olayları kantitatif bir mercekten moleküler düzeyde anlama ve ardından bu tür gözlemlerden üretilen devasa veri miktarlarını yönetmek ve anlamlandırmak için hesaplamalı stratejiler kullanma. Esasen, biyoinformatik, moleküler biyolojiye özel olarak tasarlanmış sofistike bir yönetim bilgi sistemi işlevi görerek, temel araştırmadan klinik ilerlemelere kadar uzanan sayısız pratik uygulama sunar (Pruitt vd., 2005; O’Meara vd., 2023). Biyoinformatiğin bilimsel keşif üzerindeki dönüştürücü etkisi yadsınamaz. Gen ifade profilleme gibi görevleri basitleştiren gelişmiş algoritmalar ve araçlar sayesinde araştırmayı hızlandırdı. Büyük miktarda genomik, proteomik ve metabolomik veriyi analiz etme yeteneği, biyolojik süreçler ve hastalık mekanizmaları hakkında daha derin bir anlayışa yol açtı. İlaç keşfi,
MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİDE BİYOİNFORMATİK 75 kişiselleştirilmiş tıp ve tarımsal biyoteknoloji gibi alanlarda inovasyonun temel taşıdır. Biyoinformatikbugünnedenvazgeçilmezdir? Biyoinformatik, modern bilimde vazgeçilmez bir alan olarak ortaya çıkmıştır; bunun temel nedeni, bilim insanlarını biyolojik veri kümelerinin geniş ve karmaşık manzaralarında gezinme ve bunları anlama konusunda yetkilendirmesidir. Yeni nesil dizileme (NGS), proteomik ve metabolomik gibi biyolojik araştırma teknolojilerindeki hızlı gelişmeler, DNA ve RNA’nın kesin dizilerinden proteinlerin karmaşık üç boyutlu yapılarına ve metabolik yolların karmaşık ağlarına kadar uzanan eşi benzeri görülmemiş bir veri patlamasına yol açmıştır. Sofistike araçlar olmadan, bu bilgi seli bunaltıcı olacak ve büyük ölçüde yorumlanamaz kalacaktı. Biyoinformatik, bu devasa biyolojik veri akışını hız ve benzersiz doğrulukla sistematik olarak analiz etmek, görselleştirmek ve yorumlamak için gerekli hesaplamalı ve istatistiksel çerçeveleri, algoritmaları ve yazılım araçlarını sağlamak üzere devreye girer. Biyoinformatiğin dönüştürücü etkisi, araştırma zaman çizelgelerini hızlandırma, deneysel sonuçların hassasiyetini artırma ve çok sayıda bilimsel disiplinde çığır açan keşifleri katalize etme yeteneğinde belirgindir. Biyoinformatik, tıp, tarım, genetik, biyoteknoloji ve çevre bilimi gibi alanlarda kişiselleştirilmiş sağlığı destekler. Hastalık genlerini belirleyerek, ilaç hedefleri keşfederek ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirerek tıp alanında öncüdür. DNA dizisi analiziyle kistik fibroz, Huntington hastalığı ve kanser gibi kalıtsal hastalıklardaki mutasyonları saatler içinde tespit edebilir, bu da tanı ve tedavi kararlarını hızlandırır. Biyoinformatik, insan sağlığının yanı sıra gıda güvenliği ve iklim değişikliği gibi küresel sorunlarda da önemli rol oynar. Tarımda, bitki genomlarını inceleyerek kuraklığa direnç, artan verim, besin içeriği ve hastalıklara karşı direnç sağlayan genleri belirler. Bu, küresel nüfusu desteklemek ve iklim değişikliğine uyum sağlamak için kritik olan geliştirilmiş mahsul çeşitlerinin hızla geliştirilmesini sağlar. Biyoinformatik, biyoteknolojide (enzim, protein, mikrobiyal sistem tasarımı), çevre biliminde (mikrobiyal toplulukları anlama, kirleticileri izleme, biyoçeşitliliği gözlemleme) araçsaldır. Ham biyolojik veriyi eyleme dönüştürülebilir içgörülere dönüştürme yeteneği, çağdaş bilimde temel önemini vurgular.
76 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 2. Biyoinformatiğin Tarihsel Gelişimi Genomik, biyoteknoloji ve bilgi teknolojilerini birleştiren bir alan olan biyoinformatik, geniş genomik veriyi yönetmek ve yorumlamak üzere ortaya çıkmıştır. Görünüşte modern olmasına rağmen, kökenleri 1960’lara, 50 yıldan daha öncesine dayanmaktadır. Paulien Hogeweg ve Ben Hesper, terimi 1970 yılında, biyotik sistemlerdeki bilgi süreçlerine atıfta bulunarak ortaya atmışlardır. Margaret O. Dayhoff, Walter M. Fitch ve Russell F. Doolittle gibi öncüler kritik rol oynamıştır. 1970 öncesi erken biyoinformatik, DNA’ya ilişkin sınırlı anlayış nedeniyle protein analizine odaklanmıştır. Watson, Crick ve Franklin 1953’te DNA’nın çift sarmalını aydınlatmış olsa da, DNA dizilemesi çok daha sonra gelmiştir. “Biyoinformatiğin annesi ve babası” olarak tanınan Margaret Dayhoff, 1960 yılında ilk de novo protein dizi birleştiricisi olan COMPROTEIN’i geliştirmiştir. Ayrıca, tek harfli amino asit kodunu ve ilk biyolojik dizi veritabanı olan Atlas of Protein Sequence and Structure’ı 1965 yılında oluşturmuştur (Pruitt vd., 2005). Evrimsel içgörüler, Atlas’ın protein dizilerinin türlerin evrimsel tarihini yansıttığını ortaya çıkarmasıyla ortaya çıkmıştır. Zuckerkandl ve Pauling 1963’te “Paleogenetik” terimini türetmiş ve “moleküler saat” kavramını önermiştir. Needleman–Wunsch algoritması (1970), ikili protein dizi hizalaması için ilk dinamik programlamayı sağlamış ve CLUSTAL gibi pratik çoklu dizi hizalama yöntemlerine yol açmıştır (Katoh ve Standley, 2013). Dayhoff, Schwartz ve Orcutt, 1978’de amino asit ikameleri için ilk olasılıksal model olan PAM matrisini tanıtmıştır. 1970’ler, genetik kodun çözülmesi ve Maxam–Gilbert (1976) ile Sanger (1977) gibi yeni dizileme yöntemleriyle teşvik edilen DNA analizine geçişi işaretlemiştir. Roger Staden’ın 1979 tarihli “Staden Package” yazılımı, Sanger dizileme okumalarını analiz eden ilk yazılımdı. Joseph Felsenstein, 1981’de DNA’dan filogenetik ağaçları çıkarmak için ilk maksimum olabilirlik yöntemini geliştirmiştir. 1980’ler, gen klonlama (Jackson, Symons, Berg, 1972) ve PCR (Kary Mullis) gibi moleküler yöntemlerdeki ilerlemelerin yanı sıra bilgisayar erişilebilirliğinin artmasına tanık olmuştur. Wisconsin Üniversitesi Genetik Bilgisayar Grubu (GCG) 1984’te yazılım paketini piyasaya sürmüş, bunu DNASTAR takip etmiştir. Ücretsiz Yazılım Hareketi biyoinformatiği etkilemiş, EMBOSS gibi projelere yol açmıştır. EMBL, GenBank ve DDBJ gibi büyük dizi veritabanları 1986-1987’de birleşerek INSDC’yi oluşturmuştur (Pruitt vd., 2005).
MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİDE BİYOİNFORMATİK 77 Bioinformatics dergisi ve NCBI kurulmuştur. Perl ve Python gibi betik dilleri, Bio-modülleri ile öne çıkmıştır. 1990’lar, Haemophilus influenzae’nın (1995) ilk tam genom dizilemesi ve İnsan Genomu Projesi ile genomik çağını başlatmıştır. World Wide Web (WWW), EMBL, NCBI ve BLAST’ın çevrimiçi erişilebilir hale gelmesiyle veri paylaşımında devrim yaratmıştır (Altschul vd., 1990). Protein katlanması zorlu bir alan olarak kalsa da, yapısal biyoinformatik gelişmiş ve daha sonra GPU’lar tarafından desteklenmiştir. 2000’ler, Yeni Nesil Dizileme (NGS) ile “Biyolojik Büyük Veri”ye yol açan yüksek verimli biyoinformatiği getirmiştir. Bu durum, yeni depo altyapılarını ve Genomik Standartlar Konsorsiyumunu (2005) zorunlu kılmıştır. Yüksek performanslı ve işbirlikçi hesaplama girişimleri ortaya çıkmış, şirketler ve topluluk hesaplaması (BOINC) kaynak katkısında bulunmuştur. 2010’lardan günümüze, Yapay Zeka (AI) ve makine öğrenimi (ML) entegre edilmiş, AlphaFold (Jumper vd., 2021) protein yapısı tahmininde devrim yaratmıştır. Tek hücreli ve uzamsal omik teknolojiler, biyolojik çalışmalar için eşi benzeri görülmemiş bir çözünürlük sağlayarak yeni biyoinformatik araçları gerektirmiştir. Biyoinformatiğin tarihsel gelişimi, deneysel teknolojilerdeki her sıçramanın, yeni hesaplama paradigmalarına olan ihtiyacı ve dolayısıyla metodolojik çözümleri doğrudan tetiklediğini göstermektedir. Bu, verinin türü ve hacmindeki değişimin, algoritma tasarımını ve yazılım altyapısını sürekli olarak yönlendirdiği anlamına gelir. İleriye bakıldığında, biyoloji ve hesaplamanın ayrılmaz hale gelmesiyle “biyoinformatik” teriminin eskimiş hale gelebileceği, alanın tüm canlı organizmaları anlamak için bütünsel biyolojik modellemeye doğru ilerlediği öngörülmektedir. AI, kuantum hesaplama ve kişiselleştirilmiş tıptaki ilerlemeler alanı daha da şekillendirecektir. 3. Biyoinformatikteki Temel Kavramlar Biyoinformatiği anlamak, onun temel kavramlarını kavramayı gerektirir: genomik, transkriptomik, proteomik, sistem biyolojisi ve metagenomik. Bu alanlar, moleküler bilginin farklı katmanlarını temsil eder ve biyoinformatiğin çok boyutlu biyolojik araştırmada ele aldığı biyolojik bağlamı ve hesaplama zorluklarını sağlar. Bu kavramlar, biyolojik bilginin potansiyelinden (Genomik) eylemine (Transkriptomik ve Proteomik) ve nihayetinde toplu, entegre bağlamına (Sistem Biyolojisi ve Metagenomik) doğru hiyerarşik bir çözümleme sunar.
78 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I ● Genomik: Genomik, yapısı, işlevi, evrimi ve haritalanması dahil olmak üzere bir organizmanın tüm genomunun incelenmesidir. Yeni nesil dizileme (NGS) gelişimi ile artık tüm genomlar hızla dizilenebilmekte ve muazzam hacimli veriler üretilmektedir. Biyoinformatik, genom dizilerinin birleştirilmesinde, gen konumlarının tahmin edilmesinde (gen anotasyonu), mutasyonların belirlenmesinde (varyant çağrısı) ve türler arası genomların karşılaştırılmasında (karşılaştırmalı genomik) merkezi bir rol oynar (Mount, 2004; Lesk, 2019). ● Transkriptomik: Transkriptomik, belirli koşullar altında veya belirli hücre tiplerinde genom tarafından üretilen eksiksiz RNA transkriptleri setine odaklanır. RNA-seq ve mikrodizi teknolojileri kullanılarak, biyoinformatik araçları gen ifade desenlerini analiz eder, alternatif ekleme olaylarını tespit eder ve transkript bolluğunu nicelendirir. Bu, araştırmacıların gen ifadesinin çevresel veya gelişimsel ipuçlarına yanıt olarak dinamik olarak nasıl değiştiğini anlamalarını sağlar (Conesa vd., 2016). ● Proteomik: Proteomik, hücrenin temel fonksiyonel molekülleri olan proteinlerin yapısı, işlevi ve etkileşimleri ile ilgilenir. Biyoinformatik yöntemleri, diziden protein yapısını tahmin etmek, protein modifikasyonlarını analiz etmek, protein-protein etkileşimlerini haritalamak ve proteomik profilleri koşullar arasında karşılaştırmak için kullanılır. UniProt, STRING ve AlphaFold gibi araçlar hesaplamalı proteomik için merkezi öneme sahiptir (Jumper vd., 2021; UniProt Konsorsiyumu, 2023). ● Sistem Biyolojisi: Sistem biyolojisi, hücreler veya organizmalar içindeki genler, proteinler ve diğer biyomoleküller arasındaki karmaşık etkileşimleri modellemeyi amaçlar. Bireysel bileşenlerin analizinin ötesine geçerek tüm biyolojik ağların bütünleyici bir görünümüne yönelir. Biyoinformatik, dinamik süreçleri simüle etmek (örn. sinyal yolları), gen düzenleyici ağları oluşturmak ve genomik, transkriptomik ve proteomik verilerin birlikte analiz edildiği multiomik entegrasyonu gerçekleştirmek için kritik öneme sahiptir (Kitano, 2002; Oulas vd., 2019). ● Metagenomik: Metagenomik, bireysel türlerin kültüre edilmesine gerek kalmadan, doğrudan çevresel örneklerden (örn. toprak, okyanus, insan bağırsağı) mikrobiyal toplulukların incelenmesidir. Karışık popülasyonlardan ekstrakte edilen DNA’nın analizi yoluyla, biyoinformatik tür bileşimini, fonksiyonel gen içeriğini ve ekolojik dinamikleri belirlemeye yardımcı olur. Çevresel mikrobiyoloji, tarım ve mikrobiyom çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır (Quince vd., 2017). Metagenomik, özellikle laboratuvarda
MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİDE BİYOİNFORMATİK 79 kültüre edilmesi zor veya imkansız olan mikroorganizmaları doğrudan inceleme yeteneği sayesinde biyolojik keşif için kritik bir kapı açar. 4. Biyoinformatiğin Moleküler Biyolojideki Uygulamaları Biyoinformatik, yüksek verimli dizileme (HTS) teknolojilerinin ortaya çıkması ve sofistike veri analizi gereksinimi nedeniyle çeşitli moleküler biyoloji disiplinleri arasında kritik bir rol oynamaktadır. Hesaplamalı yöntemlerin biyolojik verilerle entegrasyonu, genetik varyasyonlar, gen ifadesi, protein işlevleri ve mikrobiyal topluluklar hakkında daha derin bir anlayışa olanak tanır. 4.1.GenomDizilemeveAnotasyon Ham Dizi Verilerinin İşlenmesi: Dizi verilerinin, özellikle RNA’nın dinamik yapısı ve kütüphane hazırlama aşamasındaki önyargılar nedeniyle işlenmesi zorluklar içerir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için sofistike biyoinformatik ve tam uzunlukta yakalama protokolleri gereklidir (PardoPalacios vd., 2024). Genom Montaj Yaklaşımları: Dizi verileri, pangenomlar gibi montaj kavramlarına entegre edilmektedir. Kısa okumalarla transkript montajı zorlu bir süreçti ve pangenom anotasyonu, temsil ettikleri grafik yapıları nedeniyle varyasyonu doğru bir şekilde yakalamak için yeni yöntemler gerektirmektedir (Eizenga vd., 2021). Tek bir referans genoma bağımlılıktan, popülasyon varyasyonunu kapsayan grafik tabanlı pangenomlara geçiş, biyoinformatiğin genom çeşitliliğini anlama yeteneği açısından önemli bir ilerlemedir. Dizi Hizalama ve Eşleştirme: Transkribe edilmiş RNA’nın eşlenmesi, genin varlığına dair hayati kanıtlar sunar ve gen terminallerinin belirlenmesine yardımcı olur. Uzun okumalı RNA-seq teknolojileri, eşlemeyi iyileştirir ve karmaşık ekzonik yapıları yüksek çözünürlükle çözümleyebilir (Pardo-Palacios vd., 2024). Gen Tahmini: Bu süreç, ampirik veriyi hesaplamalı yöntemlerle birleştirir. Ab initio ve karşılaştırmalı yöntemler, tek başına hesaplama yöntemlerinin sınırlı kalması nedeniyle, RNA dizileme ve uzun okumalı verilerle birlikte kullanılarak doğruluğu artırır (Card vd., 2019; Brůna vd., 2021). Bu, doğru gen anotasyonunun yalnızca algoritmik tahminlere değil, aynı zamanda yüksek kaliteli deneysel kanıtlara dayanması gerektiğini gösterir. Fonksiyonel Anotasyon: Protein kodlama durumunu onaylamak için homoloji tabanlı yöntemler ve deneysel veriler kullanılır. Kanıtlar, ortolojinin
80 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I oluşturulması ve ökaryotik gen kataloglarının tanımlanması için kritik olan proteomik, ribozom ilişkisi ve filogenetik korunum gibi unsurları içerir. Bu süreçte küçük ORF’lerin doğru bir şekilde karakterize edilmesi zorlukları devam etmektedir (Samandi vd., 2017). Yapısal Anotasyon: Bu, kodlamayan ve düzenleyici elementlerin genom üzerindeki haritalanmasını içerir. Promotör tespiti (örn. CAGE), kodlamayan RNA tahmini (lncRNA’lar, kısa RNA’lar) ve kanonik olmayan yapılar için uzman kürasyonu hayati öneme sahiptir (Hoshino vd., 2017). Genom Anotasyon Hatları (Pipeline): Otomatikleştirilmiş hatlar, ab initio, karşılaştırmalı ve RNA-seq verilerini entegre eder. BRAKER2 ve MAKER bu tür hatlara örnek teşkil eder. Standardizasyon (Ensembl, NCBI) ve referans katalogları (GENCODE, RefSeq, CCDS) kamusal referanslar olarak hizmet ederek veri tutarlılığı açısından kritik öneme sahiptir (Pruitt vd., 2005; Harrow vd., 2012; Card vd., 2019; Brůna vd., 2021). Karşılaştırmalı Genomik ve Anotasyon Doğrulaması: Türler arası karşılaştırmalar, anotasyonları doğrular ve yeni keşifler yapılmasını sağlar. Ortolojinin oluşturulması bu süreçte temeldir. Anotasyon hatları sürekli güncellemeler gerektirir ve uzman/topluluk kürasyonu, hataları düzelterek ve bilim insanlarını sürece dahil ederek anotasyon kalitesini artırır (Harrow vd., 2012; Pruitt vd., 2018). Görselleştirme ve Veritabani Entegrasyonu: GENCODE, RefSeq ve CCDS gibi standartlaştırılmış veritabanları, kamuya açık ve güvenilir referanslar olarak işlev görür (Pruitt vd., 2005; Harrow vd., 2012; Pruitt vd., 2018). Genom Anotasyonunda Yükselen Trendler: İlerlemeler arasında doğru anotasyon için yapay zeka/makine öğrenimi (AI/ML) kullanımı, pangenom anotasyon yöntemleri, hücresel çeşitliliği incelemek için tek hücreli uzun RNAseq, protistler için metagenom anotasyonu ve gerçek zamanlı tüm-transkriptom kaydı yer almaktadır (Eizenga vd., 2021; O’Meara vd., 2023; Pardo-Palacios vd., 2024). 4.2.FilogenetikAnaliz Yüksek verimli dizileme teknolojisi, moleküler sistematiği kökten değiştirmiştir ve filogenomiğin genom ölçekli veri kümeleri kullanarak evrimsel ilişkileri yeniden yapılandırmasını sağlamaktadır. Bu analizlerin çıktısı filogenetik ağaçlardır.
MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİDE BİYOİNFORMATİK 87 Yapısal Tahmin ve Doğrulama 3D Yapı Tahmininde Dönüşüm I-TASSER platformu (2010), iplik geçirme ve yinelemeli montaj rafinasyonu kullanarak yapı ve fonksiyon tahminine olanak tanır. AlphaFold2 (AF2)’nin ortaya çıkışı, transformatör mimarisi ve dikkat mekanizmalarını kullanarak uzun menzilli bağımlılıkları yakalama yeteneği nedeniyle yapısal tahmin alanını dönüştürmüştür. SMFold gibi dil modelleri de, yüksek güvenilirliğe sahip yapıları tek bir diziden hızlıca tahmin edebilmektedir. Yapısal Sınıflandırma ve Kalite Değerlendirmesi Yapısal verilerin düzenlenmesi için SCOP, CATH ve InterPro gibi veritabanları kritik öneme sahiptir. SCOP ve CATH, farklı metodolojilere dayansalar da, protein alan tanımlarının yaklaşık %70’inde uyum sergilemektedir. Model kalitesini değerlendiren çalışmalar, kaba taneli yapısal karşılaştırma yöntemlerinin, 6 Å›a kadar atomik koordinat hatalarına karşı nispeten sağlam olduğunu göstermiştir (Canatalay vd., 2025). Ancak, AF2’nin Predicted Local Distance Difference Test (pLDDT) metriklerinin, tekli mutasyonların protein stabilitesi üzerindeki deneysel etkileriyle çok zayıf bir korelasyonu vardır, bu da termodinamik doğruluk için fizik tabanlı yöntemlerin gerekliliğini vurgular (Canatalay vd., 2025). Moleküler Dinamik (MD) Simülasyonları MD simülasyonları, proteinlerin konformasyonel dinamiklerini inceleyerek DL ile tahmin edilen statik yapıları doğrular ve rafine eder. Bu simülasyonlar, özellikle AlphaFold2’nin zayıf kaldığı termodinamik ve dinamik davranışların anlaşılması için elzemdir. Uygulamalar: Fonksiyonel Çıkarım ve İlaç Tasarımı Yapı Tabanlı Fonksiyonel Çıkarım Yerel yapısal karşılaştırma (örn. SiteEngine) ve boşluk tanımlama (örn. CAVER) gibi yapı tabanlı yöntemler, özellikle düşük dizi benzerliğine sahip proteinler için biyokimyasal fonksiyonu tahmin eder (Canatalay vd., 2025).
88 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Protein Etkileşimleri ve İlaç Hedefleme Protein-protein etkileşimlerini (PPI) tahmin etmek için ProMate gibi yapı tabanlı programlar kullanılır (Canatalay vd., 2025). PPI bilgileri, IntAct gibi birincil veritabanlarından ve deneysel ve hesaplamalı verileri birleştiren STRING gibi entegre veritabanlarından toplanır. Yapı Tabanlı İlaç Tasarımı’nda (SBDD) evrensel bir teknik olan Ligand Yerleştirme (docking), AutoDock protokolü ve AutoDock Vina/GPU gibi araçlarla gerçekleştirilir. Yerleştirme çalışmaları, küçük moleküllerin bağlanma bölgelerini (ceplerini) ve afinitelerini tahmin ederek sanal taramaya olanak tanır. Derin öğrenme ile protein yapısı tahmini bilimsel bir dönüm noktasıdır. Ancak, fonksiyon, stabilite ve dinamikleri tam anlamak için bu sonuçların Moleküler Dinamik simülasyonları, DCA tabanlı kontak tahminleri ve yapısal sınıflandırma sistemleriyle (CATH/SCOP) entegrasyonu şarttır. Gelecekteki araştırmalar, termodinamik ve kinetik parametreleri yüksek doğrulukla tahmin etmek için derin öğrenme modellerini fizik tabanlı enerji fonksiyonlarıyla birleştirecektir. 4.5.CRISPR-Cas9KılavuzRNATasarımı Prokaryotlarda adaptif bir bağışıklık sistemi olan CRISPR-Cas sistemi, yabancı genetik elementlere karşı koruma sağlamak için RNA aracılı nükleaz kesimi kullanır. CRISPR/Cas ile gen düzenleme, genomda çift sarmallı kırılmalar (DSB’ler) oluşturmayı içerir ve bunlar, gen nakavt için homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya spesifik değişiklikler için homoloji yönelimli onarım (HDR) ile onarılır. Cas9 Enzimi Bu “moleküler makas”, tipik olarak künt uçlar üreterek DNA’yı keser. Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), geniş hedeflemeye izin veren bir 5′-NGG protospacer-bitişiği motifi (PAM) tanır. Ancak, SpCas9 benzer dizileri de keserek hedef dışı etkilere yol açabilir. sgRNA (tek kılavuz RNA) Kılavuz RNA (gRNA) hedef DNA’yı tanır. Çoğu CRISPR-Cas9 uygulaması için, crRNA ve tracrRNA, kullanım kolaylığı için tek bir kılavuz RNA’da (sgRNA) birleştirilir. 20 nükleotitlik kılavuz bölgesi, Cas9’u hedefe yönlendirir. sgRNA, kendini kesmeyi önlemek için bir PAM içermemelidir.
MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİDE BİYOİNFORMATİK 89 sgRNA (Kılavuz RNA) Tasarımı Etkili ve güvenli gen düzenleme, hedef özgüllüğü ve düzenleme verimliliğine odaklanan sgRNA tasarımına bağlıdır. ● Hedef Belirleme: sgRNA’nın yalnızca istenen bölgeye bağlandığından ve kestiğinden emin olmak kritik öneme sahiptir. ● Verimlilik İyileştirme: İç stabiliteyi artırmak (örn. G:C çiftleri), sgRNA bolluğunu artırmak (diziyi kısaltmak), bozunmayı azaltmak (DR eklemek) ve hibridizasyon enerjisini ayarlamak (kimerik DNA-RNA) verimliliği artırır. sgRNA’ları kısaltmak (17-18 bp), hedef dışı etkileri önemli ölçüde azaltır. Kimyasal modifikasyonlar da stabiliteyi artırabilir. ● Yazılım ve Araçlar: Benchling, IDT, CRISPOR (Concordet ve Haeussler, 2018) ve CRISPR-P 2.0 gibi biyoinformatik araçları sgRNA tasarımına, hedef içi verimliliğe ve hedef dışı tahminine yardımcı olur. Hedef Dışı Etki Tahmini CRISPR/Cas sistemleri, sgRNA’nın homolog bölgeleri kısmen tanıması nedeniyle istenmeyen hedef dışı mutasyonlara neden olabilir. Bu hedef dışı etkiler, amaçlanmayan gen aktivasyonuna/inaktivasyonuna, kromozomal yeniden düzenlemelere ve genomik istikrarsızlığa yol açabilir ve terapötik kullanımı sınırlayabilir. Yüksek hedef içi verimliliğe ve minimum hedef dışı etkilere sahip optimal sgRNA’lar tasarlamak kritik öneme sahiptir. ● Verimlilik Tahmin Faktörleri: GC içeriği (%40-60 ideal): Stabilite ve esnekliği dengeler. Dizi yapısal stabilitesi (RNA katlanması): Etkili Cas protein etkileşimi için kritik öneme sahiptir. sgRNA’nın hedef DNA’ya bağlanma enerjisi: Başarılı kesim için kritik öneme sahiptir. ● Verimlilik Puanlama Yazılımı: Rule Set 2, CRISPRscan ve Azimuth (makine öğrenimi) (Hiranniramol vd., 2020), hedef dışı etkileri tahmin eder ve sgRNA verimliliğini değerlendirir. CRISPR-Cas Varyantları ve Yeni Nesil Sistemler Birçok CRISPR-Cas varyantı, çeşitli uygulamalar için benzersiz özellikler sunar. ● Cas12a (Cpf1): Yalnızca tek bir crRNA gerektirir, 5′-TTTV PAM tanır (daha geniş hedefleme), 5 nükleotit kademeli kesikler yapar ve genellikle daha düşük hedef dışı oranlara sahiptir (Zetsche vd., 2015). Bazı Cas12 efektörleri daha küçüktür ve viral dağıtıma yardımcı olur.
90 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I ● Cas13: Özellikle tek sarmallı RNA’yı (ssRNA) hedefler ve keser. “Teminat aktivitesi” SHERLOCK gibi teşhislerde kullanılır. Cas13, gen ifadesini RNA düzeyinde susturabilir (RNA nakavt) (Abudayyeh vd., 2017). İnaktif Cas13a (dCas13a) RNA manipülasyonu için kullanışlıdır. ● dCas9: Katalitik olarak inaktif Cas9 (dCas9) DNA’yı kesmez, ancak DNA bağlanmasını sürdürür. Efektör alanlarla birleştirilerek gen ifadesini aktive edebilir (CRISPRa) veya baskılayabilir (CRISPRi) veya epigenetik modifikasyonları modüle edebilir. Her CRISPR-Cas sisteminin benzersiz kılavuz RNA tasarım kuralları vardır ve Cas13design gibi özel yazılımlar gerektirir. 4.6.MetagenomikveMikrobiyomAnalizleri Metagenomik ve Mikrobiyom: Fark Nedir? ● Metagenomik: Bireysel kültürleme ihtiyacını atlayarak, kolektif genomlarını (metagenom) analiz ederek tüm mikrobiyal toplulukları inceler. Shotgun metagenomik dizileme (mWGS), tüm mikrobiyal genomları yakalar, genleri ve işlevlerini ortaya çıkarır. ● Mikrobiyom Analizi: Konakçıyla ilişkili mikrobiyal toplulukların (mikrobiyom) yapısına ve bileşimine odaklanır. Geleneksel olarak taksonomi için 16S ribozomal RNA (rRNA) gen dizilemesi kullanılmıştır, şimdi genomik çağa taşınmıştır. 16S rRNA dizilemesi (filotipleme): Mikrobiyal taksonomiyi ve göreceli bolluğu belirler, “kim var?” sorusunu yanıtlar. Sınırlı fonksiyonel bilgi ve çoklu gen kopyaları nedeniyle aşırı temsil potansiyeli vardır. Shotgun metagenomikler (mWGS): Tüm mikrobiyal genomları yakalar, hem taksonomiyi hem de fonksiyonları ortaya çıkarır. Genleri nicelendirerek ve işlevlerini çıkararak “kim var?” ve “ne yapıyor?” sorularını yanıtlar. Örnek İşleme ve Dizileme Yaklaşımları A. 16S rRNA Amplikon Dizileme ● 16S rRNA geninin spesifik amplifikasyonu: 16S rRNA geninin belirli bir bölgesini PCR kullanarak çoğaltır, ardından klonlama ve dizileme yapılır. ● Daha düşük maliyet, daha hızlı: Bakteriyel çeşitlilik ve bolluk için nispeten hızlı ve uygun maliyetlidir. ● Sınırlı çözünürlük: Bir filogenetik çerçeve sağlar, ancak sınırlı fonksiyonel detaylar, kusurlu tür düzeyinde sınıflandırma ve PCR yanlılıkları içerir.
MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİDE BİYOİNFORMATİK 91 B. Tüm Genom Shotgun Metagenomikler ● Tüm örnek DNA’sının rastgele dizilenmesi: Bir örnekten tüm DNA’yı çıkarır ve rastgele diziler, genel gen içeriği ve fonksiyonel yetenekleri sağlar. ● Türleri, fonksiyonel genleri vb. belirler: Mikrobiyal taksonomiyi, fonksiyonel genleri (örn. antibiyotik direnci) ve mobil genetik elementleri tanımlar. ● Daha büyük veri, karmaşık analiz: Dizi varyasyonu ve düzensiz bolluk nedeniyle montaj ve analiz için zorlayıcı, geniş, karmaşık veri setleri üretir. Biyoinformatik Hatlar ve Araçlar A. Veri İşleme ve Kalite Kontrol ● FastQC, Cutadapt, Trimmomatic: Kalite kontrol, adaptör kırpma, kopyaları kaldırma ve düşük kaliteli okumaları filtreleme araçlarıdır. ● Özellikle konakçı gibi kontaminant DNA’sını temizler. DADA2 (Callahan vd., 2016), Deblur: Amplikon verileri için gürültü giderme algoritmaları, amplikon dizi varyantları (ASV’ler) oluşturmak için dizileme hatalarını düzeltir. DADA2 bir hata modeli oluşturur; Deblur aynı dizileri çöker. DADA2 genellikle 16S/18S rRNA için önerilir. B. Hat Sistemleri ● Yerel Hizalama: Kısa okumalar için BLASTP, Bowtie, BWA; daha uzun okumalar için BLASR, Minimap2. BURST hızlı bir hizalayıcıdır. ● Hizalama Gerektirmeyen Sınıflandırma: Kraken ve CLARK, taksonomiyi atamak için kmer tabanlı yaklaşımlar kullanır. ● Belirsiz Sınıflandırmayı Çözme: MEGAN, En Düşük Ortak Atayı (LCA) kullanır; PathoID ve Kraken, olasılıksal yeniden atama ve bolluk tahminleri sunar. ● Referans Veritabanı İyileştirmesi: Pan-genom kavramını veya ayrımcı genleri kullanır (örn. MetaPhlan belirteç genleri kullanır). ● Referans Genişletilmiş Yaklaşımlar: mOTU, topluluk profilleme ve karakterize edilmemiş taksonları tespit etmek için tek kopyalı belirteç genlerini ve HMM’leri kullanır. ● Dizi Tabanlı Topluluk Profilleme: MASH (MinHASH algoritması), paylaşılan kmerlere dayalı olarak metagenomları hızla karşılaştırır. ● Genom Montajı ve Binleme: Montaj için metaSPAdes, MEGAHIT; contig’leri metagenomla birleştirilmiş genomlara (MAG’lar) binlemek için MetaBAT.
92 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I ● Fonksiyonel Açıklama: KEGG, MetaCyc, UniProtKB, UniRef, eggNOG, HUMAnN3, çeşitli yöntemler (HMM’ler, BLAST) kullanarak genlere ve yollara fonksiyonlar atamak için kullanılır. Taksonomik Sınıflandırma ve Çeşitlilik Metrikleri A. Taksonomik Sınıflandırma ● Amplikon verileri: Başta belirteç genleri (örn. 16S rRNA) kullanarak filogenetik sınıflandırma (“kim var?”) için. FastGroup ve DOTUR gibi araçlar. ● Shotgun verileri: Bilinen ve yeni taksonlar için zengin bilgi sağlar: Referans veritabanlarıyla eşleştirme: INSDC, NCBI RefSeq, GTDB, vb. Hizalama tabanlı yöntemler: Bowtie, BWA, BURST. Hizalama gerektirmeyen yöntemler: Kraken, CLARK (kmer tabanlı, LCA yaklaşımı). Referans genişletilmiş yöntemler: mOTU (belirteç genleri, HMM’ler). Genom Çözünürlüklü Metagenomlar (MAG’lar): Kültürlenmemiş organizmaların filogeni ve taksonomisi için mWGS’den genomların yeniden yapılandırılması. B. Alfa ve Beta Çeşitliliği ● Alfa çeşitliliği: Tek bir örnek içindeki çeşitlilik (zenginlik, eşitlik). FastGroup, DOTUR gibi araçlar. ● Beta çeşitliliği: Örnekler arasındaki topluluk bileşimindeki farklılıklar. SONS, AMOVA, LIBSHUFF, UNIFRAC, TreeClimber (16S tabanlı) gibi araçlar; MASH (shotgun verileri için kmer tabanlı); karşılaştırmalı topluluk genomikleri. C. Çekirdek Metrik Analizi ● Çekirdek Mikrobiyom: Konakçılarda evrensel olarak korunmuş mikrobiyal taksonları veya fonksiyonları tanımlar. ● Pan-genom kavramı: Bir “tür genomu”, paylaşılan genlerden oluşan bir çekirdek ve değişken genlerden oluşan bir “vazgeçilebilir genom” içerir. ● Fonksiyonel koruma: metagenomlar, taksonomik bileşim değişse bile genellikle korunmuş fonksiyonel potansiyel gösterir (fonksiyonel yedeklilik). Mikrobiyal Toplulukların Görselleştirilmesi ● Genel Görselleştirme Araçları: Matplotlib, ggplot2, OriginPro, GraphPad Prism.
MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİDE BİYOİNFORMATİK 93 ● Web Tabanlı Araç Setleri: Mikrobiyolojide çoklu-omik görselleştirme için MicrobioSee. ● Özel Grafik Türleri: Beta Çeşitliliği: Dendrogramlar, düzenleme grafikleri (PCoA). Göreceli Bolluk: Heatmap’ler, çubuk grafikler, pasta grafikler. Alfa Çeşitliliği: Dağılım grafikleri, kutu grafikleri. Çekirdek Taksonlar: UpsetR grafikleri, Venn diyagramları. Mikrobiyal Etkileşimler: Korelogramlar, ağ analizi grafikleri. ● Genom Binleme Görselleştirmesi: Kapsam, GC ve taksonomik bilgi ile MAG’ları görselleştirmek için gbtools. ● Etkileşimli Görselleştirme: Metagenomik verilerin farklı ölçeklerinde gezinmek için esastır. Metagenomik ve Mikrobiyom Analizlerinin Uygulamaları ● Tür Bileşimi ve Fonksiyonel Gen İçeriğinin Tanımlanması: Mikrobiyal varlığın ve yeteneklerin anlaşılması. ● Ekolojik Dinamikler: Zaman ve koşullar içinde topluluk değişikliklerinin incelenmesi. ● Çevresel Mikrobiyoloji: Besin döngüsü, biyoremediasyon, ekosistem sağlığındaki roller. ● Tarım: Bitki/toprak mikrobiyomları aracılığıyla mahsullerin iyileştirilmesi. ● Mikrobiyom Çalışmaları: Sağlık, hastalık ve müdahalelere yanıtta insan bağırsak mikrobiyomu. ● Yeni Genlerin ve Fonksiyonların Keşfi: Örn. antibiyotik direnç genleri. Metagenomikte Yükselen Trendler ● AI/ML Yöntemleri: Doğru genom anotasyonu için (O’Meara vd., 2023). ● Pan-genom Anotasyonu: Pan-genom grafik yapılarındaki genlerin açıklanması (Eizenga vd., 2021). ● Tek Hücreli Uzun RNA-seq: İzolasyon olmadan hücresel çeşitliliğin profillenmesi. ● Protist Metagenom Anotasyonu: Kültürleme olmadan protistler için metagenomik/metatranskriptomik. ● Gerçek Zamanlı Kayıt: Hücrelerden çevrelerindeki tüm transkriptom kayıtları.
94 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 5. Başlıca Biyoinformatik Veritabanları Biyoinformatik, sürekli büyüyen biyolojik veri hacmini depolamak, organize etmek ve erişilebilir kılmak için çok çeşitli veritabanlarına dayanır. ● Nükleotit Dizi Depoları: GenBank (NIH genetik dizi veritabanı) ve EMBL (Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı), DNA ve RNA dizileri için birincil arşiv veritabanlarıdır. Japonya DNA Veri Bankası (DDBJ) da Uluslararası Nükleotit Dizi Veritabanı İşbirliğine (INSDC) katkıda bulunarak veri standardizasyonu ve paylaşımını sağlar. Belge ayrıca Margaret Dayhoff’un ilk biyolojik dizi veritabanı olarak erken Atlas of Protein Sequence and Structure’dan (1965) bahseder. dbEST, GenBank’ın Eksprese Edilmiş Dizi Etiketleri (EST’ler) içeren bir bölümüdür. RFam ve DFam, sırasıyla RNA aileleri ve tekrarlayıcı DNA elementleri için özel veritabanlarıdır. ● Protein Dizisi ve Fonksiyon Veritabanları: UniProt (Evrensel Protein Kaynağı), protein dizisi ve fonksiyonel bilgilerden oluşan kapsamlı, yüksek kaliteli ve serbestçe erişilebilir bir kaynaktır. Eski PIR-PSD ve Swiss-Prot veritabanları da dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan gelen verileri entegre eder. neXtProt, insan proteinine odaklanan bir bilgi kaynağıdır. ● Protein ve Makromoleküllerin 3D Yapıları: Protein Veri Bankası (PDB), biyolojik makromoleküllerin üç boyutlu yapısal verilerini depolar. SCOP (Proteinlerin Yapısal Sınıflandırması) ve CATH (Sınıf, Mimari, Topoloji, Homolog süperaile) protein yapılarının hiyerarşik sınıflandırmalarıdır (Orengo vd., 1997). MMDB (Makromoleküler Veritabanı) NCBI tarafından sürdürülür. BMRB (Biyolojik Manyetik Rezonans Bankası), biyolojik makromoleküllerin NMR spektroskopik verilerini depolar. ● Karşılaştırmalı Genomik ve Genom Tarayıcıları: Ensembl, kararlı, otomatik olarak açıklanmış insan genom dizilerini sağlar ve seçilmiş ökaryotik genomlar için bir depodur. NCBI Genom Veri Görüntüleyici ve VISTA, genomik dizileri keşfetme ve karşılaştırma araçlarıdır. GOLD (Genomlar Çevrimiçi Veritabanı), tamamlanmış ve devam eden genom dizileme projeleri hakkında bilgi sağlar. ● Yol ve Metabolizma Veritabanları: KEGG (Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi), metabolik yolları ve diğer biyolojik süreçleri incelemek için genomik, kimyasal ve sistemik fonksiyonel bilgileri entegre eden biyolojik bir veritabanıdır. REACTOME, açık kaynaklı, manuel olarak küratörlüğü yapılmış ve hakemli bir yol veritabanıdır. Diğer özel metabolik ve enzim veritabanları arasında HMDB (İnsan Metabolom Veritabanı) ve KinMap (insan kinomu verilerinde etkileşimli gezinme) bulunur.
MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİDE BİYOİNFORMATİK 95 ● Diğer Önemli Veritabanları: InterPro, proteinleri aileler halinde sınıflandırır ve alanları ve bölgeleri tahmin eder. PROSITE ve Pfam, protein aileleri ve alanları veritabanlarıdır. GeneDB, prokaryotik ve ökaryotik organizmalar için bir genom veritabanıdır. MGI (Fare Genomu Bilişimi) ve RGD (Sıçan Genomu Veritabanı), model organizma veritabanlarıdır. 6. Biyoinformatik Araçları ve Programlama Dilleri Biyoinformatik, biyolojik verileri işlemek, analiz etmek ve görselleştirmek için çeşitli araçlardan ve programlama dillerinden yararlanır. ● Programlama Dilleri: Python, okunabilirliği, kapsamlı kütüphaneleri (Biopython, BioPandas, Scikit-Bio gibi) ve betikleme, otomasyon, dizi analizi, gen ifade analizi, moleküler yerleştirme ve protein yapısı tahmini için uygunluğu nedeniyle biyoinformatikte en popüler dil olarak yaygın şekilde tanınır. R, istatistiksel hesaplama, veri analizi ve grafik çıktıları için esastır ve diferansiyel ifade analizi dahil olmak üzere genomik veri analizi için Bioconductor’da geniş bir paket koleksiyonuna sahiptir. Bash (Linux komut satırı), büyük veri setlerini işlemek, görevleri otomatikleştirmek ve komut satırı araçlarını çalıştırmak için kritik öneme sahiptir. Perl, tarihsel olarak betikleme ve metin manipülasyonu için önemliydi ve hala hızlı harmanlama ve veritabanı etkileşimleri için kullanılmaktadır. C++, genellikle hesaplama açısından yoğun görevler ve Python veya R kodunu hızlandırmak için kullanılır. Java (BioJava ile), karmaşık kod tabanları ve GUI çalışması için kullanılır. ● Temel Biyoinformatik Araçları: BLAST (Temel Yerel Hizalama Arama Aracı), veritabanlarında benzer dizileri bulmak için DNA ve protein dizileri dahil olmak üzere birincil biyolojik dizi bilgilerini karşılaştırmak için temel bir algoritma ve programdır (Altschul vd., 1990). EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite), dizi analizi için bir araç koleksiyonudur. Galaxy, biyoinformatik analiz iş akışlarını oluşturmak, çalıştırmak ve paylaşmak, tekrarlayan görevleri otomatikleştirmek için web tabanlı bir platformdur (Blankenberg vd., 2014). Jupyter Notebooks, kodu, görselleştirmeleri ve anlatı metnini entegre eden etkileşimli ve tekrarlanabilir araştırma ortamları sağlar (Granger ve Perez, 2021). ● Çoklu Dizi Hizalama Araçları: MAFFT, MUSCLE ve Clustal Omega, evrimsel homolojiyi sağlamak için dizileri hizalamak için yaygın olarak kullanılmaktadır (Katoh ve Standley, 2013). ● Filogenetik Ağaç Oluşturma Yazılımı: IQ-TREE, RAxML, PhyML (Maksimum Olabilirlik için), MrBayes ve BEAST (Bayes çıkarımı için)
96 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I evrimsel ilişkileri yeniden yapılandırmak için kullanılır (Bouckaert vd., 2014; Stamatakis, 2014; Trifinopoulos vd., 2016). ● RNA-seq Analiz Araçları: FastQC, Trimmomatic, Cutadapt (kalite kontrol için), STAR, HISAT2, Bowtie (okuma hizalaması için), featureCounts, HTSeq, Salmon, StringTie2 (gen nicelleştirme için), DESeq2, EdgeR (diferansiyel gen ifadesi için) yaygın olarak kullanılmaktadır (Robinson vd., 2010; Love vd., 2014). ● Görselleştirme Araçları: ggplot2 (R), Matplotlib (Python), FigTree ve iTOL (Interactive Tree Of Life), veri ve filogenetik ağaçların grafiksel temsillerini oluşturmak için kullanılır (Wickham, 2016). 7. Biyoinformatikte Makine Öğrenimi ve Yapay Zeka Makine Öğrenimi (ML) ve Yapay Zeka (AI) entegrasyonu, biyoinformatiği dönüştürerek büyük biyolojik veri setlerinin verimli analizini ve yorumlanmasını sağlamıştır. ● Uygulamalar: Protein Yapısı Tahmini: AlphaFold gibi AI araçları, protein fonksiyonunu ve ilaç tasarımını anlamak için derin etkileri olan amino asit dizilerinden protein 3D yapılarının tahmininde benzeri görülmemiş bir doğruluk elde etmiştir (Jumper vd., 2021). Genomik Varyant Yorumlama: ML, karmaşık genomik verileri analiz etmek, hastalık biyobelirteçlerini tanımlamak ve genetik mutasyonların etkilerini tahmin etmek için kritik öneme sahiptir. İlaç Keşfi: AI ve ML, potansiyel ilaç hedeflerini belirleyerek, ilaç adaylarını tarayarak ve optimize ederek ve ilaç-protein etkileşimlerini tahmin ederek ilaç keşfini hızlandırır (O’Meara vd., 2023). Gen İfadesi Analizi: ML algoritmaları, gen ifade profillerini sınıflandırmak, hastalıklarla ilişkili genleri tanımlamak ve mikro dizi tabanlı ifade profillemesindeki gizli kalıpları ortaya çıkarmak için kullanılır. Kişiselleştirilmiş Tıp: AI, bireysel genetik profillere dayalı tedavilerin özelleştirilmesini artırır, terapötik yaklaşımları benzersiz genetik yapılara göre uyarlar. Biyomedikal Görüntü Analizi: AI, biyomedikal görüntülerin analizine katkıda bulunarak teşhis ve araştırmalara yardımcı olur. Kalıp Tanıma ve Veri Madenciliği: ML algoritmaları, büyük veri setlerinde insanların ayırt etmesi zor olabilecek kalıpları ve bağlantıları bulmada üstündür. 8. Klinik ve Teşhis Uygulamaları Biyoinformatik, sağlık hizmetlerinde ilerlemeleri yönlendiren modern klinik ve teşhis uygulamalarının temel bir bileşenidir.
MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİDE BİYOİNFORMATİK 103 Regev, A., Koonin, E. V., & Zhang, F. (2015). Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 163(3), 759–771. Zhang, Y. (2010). The iterative threading assembly refinement (I-TASSER) server for structure and function prediction.
105 BÖLÜM VI MİKROBİYOTA ANALİZİNDE KULLANILAN YENİ NESİL DİZİLEME YÖNTEMLERİ NextGenerationSequenceMethodsUsedin MicrobiotaAnalysis Nurullah Çiftçi (Dr. Öğr. Üyesi) Kafkas Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D. Kars, Türkiye E mail: [email protected] ORCID:0000-0002-8934-0575 1. Giriş Son yıllarda, insan mikrobiyomu (mikroorganizmalarımızın tüm genomu) konusundaki bilgimizde büyük bir artış yaşanmıştır. Genom dizileme teknolojilerindeki ve metagenomik analizlerdeki ilerlemeler, bilim insanlarının bu mikroorganizmaları ve işlevlerini incelemelerine ve mikrobiyom konak etkileşimlerini hem sağlıklı hem de hastalıklı durumlarda araştırmalarına olanak sağlamıştır. İnsan mikrobiyomunun yaklaşık 100 trilyon mikroorganizma içerdiği tahmin edilmekte olup, bunların büyük çoğunluğu bağırsakta yer almaktadır (Moon, 2016; Schroeder ve Bäckhed, 2016). 1.1.MikrobiyotaNedir? Mikrobiyota, vücudumuzda bulunan yararlı ve zararlı mikroorganizmaların tamamını ifade eder. Bağırsaklarda yoğun olarak bulunsa da ağız, deri ve üreme organları gibi birçok bölgede de mikroorganizmalar bulunabilmektedir. Her bireyin mikrobiyotası, genetik faktörler, beslenme düzeni, çevresel koşullar ve yaşam tarzına bağlı olarak farklılık göstermektedir. İnsan mikrobiyotası, karmaşıklığı insan genomunu aşan bakteri, virüs, mantar ve parazit topluluklarından oluşmaktadır. Avrupa İnsan Bağırsak Mikrobiyotası,
106 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Metagenomik Projesi ve İnsan Mikrobiyom Projesi gibi büyük ölçekli metagenomik çalışmalar, insan genomunda yaklaşık 23.000 gen bulunmasına karşın, 3,3 milyon benzersiz protein kodlayan gen tanımlamıştır (Qin vd., 2010). Bu çalışmalar, normal bağırsak mikrobiyotasının sağlığa olan yararlı işlevlerini genetik düzeye kadar inceleyerek ortaya koymuştur. İnsan mikrobiyotası; bağışıklık sisteminin gelişimi, patojenlere karşı savunma, kısa zincirli yağ asitlerinin üretimi yoluyla konak enerji metabolizmasında rol oynayan beslenme, vitamin sentezi ve yağ depolanması gibi konak beslenmesiyle ilgili işlevlerin yanı sıra insan davranışı üzerinde etkili olması gibi çok çeşitli işlevlere sahiptir. Bu yönleriyle, insan vücudunun doğru işleyebilmesi için vazgeçilmez bir organ olarak kabul edilmektedir (Qin vd., 2010; Lozupone vd., 2012). İnsan mikrobiyomu, konak genomundan farklı olarak oldukça dinamik bir yapıya sahiptir ve yaşam boyunca çeşitli içsel ve çevresel faktörlere yanıt olarak değişkenlik göstermektedir. Konak genomu nispeten sabit kalırken, mikrobiyom; erken gelişim dönemleri, diyet, antibiyotik kullanımı ve özellikle hastalık gibi durumlara karşı duyarlıdır ve yaşamın farklı evrelerinde bileşiminde belirgin değişiklikler meydana gelmektedir (Lozupone vd., 2012). Bu değişikliklerin en dramatik olanları, bebeklik ve erken çocukluk döneminde gözlemlenmektedir (Palmer vd., 2007). Doğumdan itibaren bağırsak mikrobiyotası çeşitli faktörlerden etkilenerek şekillenmektedir. Bu faktörler arasında gebelik süresi (zamanında ya da prematüre doğum), doğum şekli (vajinal doğum veya sezaryen), beslenme türü (anne sütü veya formül mama), annenin beslenme durumu (aşırı kilolu ya da malnütrisyon) ve doğum sonrası dönemde antibiyotik kullanımı yer almaktadır (Meropol ve Edwards, 2015). Erken yaşam döneminde mikrobiyotanın gösterdiği bu yapısal karmaşıklık, konağın bağışıklık sistemi ile kurduğu dengeyi (immün homeostazı) doğrudan etkilemekte ve bu etkileşim bireyin ilerleyen yaşamındaki sağlık durumu üzerinde belirleyici bir rol oynamaktadır (Charbonneau vd., 2016). Sağlıklı bir insan bağırsak mikrobiyotası, başta Bacteroidetes ve Firmicutes olmak üzere, en az 1000 farklı bakteri türünü içeren zengin bir mikrobiyal topluluğu barındırmaktadır. Mikrobiyom bileşiminin sağlıklı bireylerde nasıl yapılandığının anlaşılması, mikrobiyotada meydana gelen değişimlerin insan sağlığı üzerindeki etkilerinin ve çeşitli hastalıklara yatkınlığın daha iyi anlaşılmasını sağlamaktadır. Bu nedenle, mikrobiyomun referans düzeydeki kompozisyonunun ortaya konması, hem tanısal hem de tedaviye yönelik yaklaşımların geliştirilmesinde kritik bir öneme sahiptir. Bağırsak mikrobiyomu
MİKROBİYOTA ANALİZİNDE KULLANILAN YENİ NESİL DİZİLEME . . . 107 yalnızca bakterilerden ibaret değildir; virüsler, mantarlar ve parazit türleri de bu ekosistemde yer almaktadır. Ancak, bu mikroorganizmalar üzerine yapılan araştırmalar, bakterilerle karşılaştırıldığında oldukça sınırlı kalmıştır. Bakterilerle çalışmak teknik açıdan daha kolaydır. Özellikle 16S rRNA gen dizileme yöntemi sayesinde bakteriler hızlı, maliyetsiz ve etkili bir şekilde tanımlanabilmektedir. Bu yöntem, yalnızca bakterilere özgü bir gen bölgesini hedef alarak tür düzeyine kadar ayrım yapılmasına olanak tanımaktadır. Buna karşılık, virüsler için böyle evrensel bir gen hedefi bulunmamaktadır. Viral genomların çeşitliliği çok fazladır ve standart analiz yöntemleri henüz yeterince gelişmiş değildir. Benzer şekilde, mantarların tanımlanmasında kullanılan ITS (Internal Transcribed Spacer) dizileme yöntemi de daha karmaşık ve sınırlayıcıdır. Parazitlerin ise hem mikrobiyotadaki sayıları daha azdır hem de genetik analizleri teknik olarak daha zordur (Sanz vd., 2015; Amon ve Sanderson, 2017). 1.2.MikrobiyotanınİnsanSağlığındakiRolü Mikrobiyom kompozisyonundaki değişikliklerin hastalık patogenezindeki rolü henüz tam olarak netlik kazanmamıştır. En büyük zorluklardan biri, mikrobiyal dengenin bozulmasının (disbiyoz) literatürde hastalıkla ilişkili olup olmadığını belirlemek ve nedensellik ile sonucu birbirinden ayırabilmektir. Mikrobiyota ile ilişkili olduğu düşünülen hastalıkların bir kısmına aşağıda değinilmiştir. 1.2.1.İnflamatuvarBağırsakHastalığı(İBH) İnflamatuvar bağırsak hastalığı (İBH), bağırsak mikrobiyotası ile ilişkilendirilen en kapsamlı şekilde çalışılmış insan hastalıklarından biridir. Sağlıklı bireyler ile İBH hastalarının bağırsak mikrobiyotası arasında tür zenginliği ve tür çeşitliliği açısından anlamlı farklılıklar gözlenmiştir. Yapılan bir çalışmada, İBH hastalarında bakteri çeşitliliğinin azaldığını; Firmicutes ve Bacteroidetes filumlarının azaldığını, buna karşılık Proteobacteria filumunun oranının arttığını göstermiştir (Manichanh vd., 2006). Güncel araştırmalar, İBH patogenezinin çevresel faktörler (örneğin sigara, diyet ve stres) ile konağın genetik yatkınlığı arasındaki etkileşime bağlı olduğunu ve bu sürecin kommensal mikrobiyota tarafından modüle edilerek patojenik veya koruyucu bağışıklık yanıtlarının aktive edildiğini öne sürmektedir (Sartor, 2006). Hayvan modelli bir çalışmadan elde edilen veriler de bağırsak mikrobiyotasının İBH patogenezindeki rolünü desteklemektedir (Gkouskou vd., 2014).
108 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 1.2.2.NekrotizanEnterokolit Nekrotizan enterokolit’in patogenezi çok faktörlü olmakla birlikte, bağırsak mikrobiyotasının bu süreçte kritik bir rol oynadığı düşünülmektedir. Hem insanlarda hem de hayvan modellerinde yapılan çalışmalar, NEK gelişen prematüre bebeklerde bakteri çeşitliliğinde azalma ve Proteobacteria oranında artış gibi mikrobiyal değişiklikler olduğunu göstermiştir. Ancak bu bulgular literatürdeki diğer çalışmalar ile tutarlılık göstermemekte olup, bugüne kadar doğrudan sorumlu tutulan tek bir mikroorganizma grubu tanımlanamamıştır (Grishin vd., 2013). 1.2.3.AtopikHastalıklar Egzama, astım ve besin alerjileri gibi atopik hastalıkların insidansı günümüzde artış göstermektedir. Bu durum sıklıkla “hijyen hipotezi” ile ilişkilendirilir. Gelişmiş ve hijyenik toplumlarda yaşamın erken dönemlerinde mikrobiyal antijenlerle yeterli düzeyde karşılaşılmaması, bağırsak mikrobiyotasının bileşimini bozarak bağışıklık sisteminin gelişimini olumsuz etkileyip alerjik hastalıkların ortaya çıkmasına neden olabilir (Wold, 1998). Örneğin, Bacteroides fragilis gibi türlerin bağışıklık reseptörleri üzerinden sinyal iletim yollarını aktive ederek immün tolerans oluşturduğu bildirilmiştir (Round vd., 2011). Ayrıca, evde evcil hayvan bulunması, kırsal bölgede yaşama ve kardeş sayısı gibi çevresel faktörlerin bebek mikrobiyotasını etkileyerek astım ve alerjilere karşı koruyucu etki sağladığı gösterilmiştir (Ege vd., 2011). Sezaryenle doğan, formül mama ile beslenen ve antibiyotiklere maruz kalan bebeklerde atopik hastalıkların görülme sıklığı daha yüksek oranda bildirildiği için epidemiyolojik veriler de bu ilişkiyi desteklemektedir (Riiser, 2015). 1.2.4.Tip1Diyabet Bağırsak mikrobiyotası, metabolik–immün eksenin düzenlenmesinde önemli rol oynamaktadır (Sanz vd., 2015). Tip 1 diyabetle ilişkili spesifik mikrobiyal kompozisyonlar ve fonksiyonlara dair bulgular henüz tutarlılık göstermemekle birlikte, bazı bakterilerin potansiyel etkileri bildirilmektedir. Örneğin, Bifidobacteria cinsinin koruyucu rol oynadığı, Proteobacteria’nın ise hastalık riski oluşturduğu öne sürülmektedir. Yaşam tarzı kaynaklı mikrobiyota değişikliklerinin (doğum şekli ve beslenme gibi) de diyabet gelişimiyle ilişkili olduğu bilinmektedir. Örneğin, sezaryenle doğan bebeklerde tip 1 diyabet gelişme riskinin yaklaşık %20 oranında arttığı bildirilmektedir (Charbonneau vd., 2016).
MİKROBİYOTA ANALİZİNDE KULLANILAN YENİ NESİL DİZİLEME . . . 109 1.2.5.OtizmSpektrumBozukluğu(OSB) Bağırsak mikrobiyotası, endokrin (kortizol), immün (sitokinler) ve nöral (vagus siniri ve enterik sinir sistemi) yolaklar aracılığıyla bağırsak– beyin eksenini modüle ederek insan davranışlarını etkileyebilmektedir. Otizm spektrum bozukluğu (OSB) tanısı almış çocukların bağırsak mikrobiyotasında, gelişimsel olarak tipik çocuklara kıyasla anlamlı farklılıklar tanımlanmıştır. Ancak, bu farklılıkların OSB patogenezindeki etkisini net olarak ortaya koymak için daha ileri araştırmalara ihtiyaç duyulmaktadır (Ding vd., 2017). 2. Birinci Nesil Dizileme Teknolojisi Mikrobiyotanın yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin anlaşılması, başta gastrointestinal hastalıklar olmak üzere pek çok sistemik hastalığın patogenezine ışık tutmaktadır. Bu karmaşık mikrobiyal topluluğun doğru şekilde tanımlanabilmesi ve analiz edilebilmesi için gelişmiş moleküler testlerin kullanımı hayati önem taşımaktadır. Geleneksel kültür yöntemlerinin yetersiz kaldığı durumlarda, moleküler biyoloji teknikleri sayesinde mikrobiyal çeşitlilik çok daha hassas, kapsamlı ve doğru bir biçimde ortaya konabilmektedir. Yeni Nesil Dizileme (NGS) sistemlerine geçmeden önce, DNA dizi analizinin tarihçesini kısaca gözden geçirmek yararlı olacaktır. 1977 yılında Frederick Sanger, zincir sonlandırma yöntemine dayanan (Sanger sekanslama olarak bilinir) DNA dizi analiz teknolojisini geliştirmiştir. Aynı yıl Walter Gilbert ise DNA’nın kimyasal olarak modifiye edilmesi ve spesifik bazlardan parçalanmasına dayalı alternatif bir dizi analiz yöntemi ortaya koymuştur. Sanger dizileme yöntemi, yüksek verimliliği ve düşük radyoaktivite gereksinimi nedeniyle, “birinci nesil” teknoloji olarak benimsenmektedir (Sanger vd., 1977). Bu dönemde DNA dizi analizi oldukça zahmetli ve radyoaktif materyallerin kullanımını gerektirmekteydi. Yıllar süren iyileştirmelerin ardından, Applied Biosystems firması 1987 yılında ilk otomatik dizi analiz cihazı olan AB370 modelini tanıtmıştır. Bu cihaz, dizi analizinde kapiler elektroforez yöntemini kullanarak işlemi daha hızlı ve daha doğru hale getirmiştir. AB370 cihazı, aynı anda 96 baz tespit edebilmekte, günde yaklaşık 500 bin baz okuyabilmekte ve okuma uzunluğu 600 baza kadar ulaşabilmekteydi. Mevcut model olan AB3730xl, 1995 yılından bu yana günlük 2,88 milyon baz dizileyebilmekte ve 900 baz uzunluğuna kadar okuma yapabilmektedir. 1998 yılında geliştirilen otomatik dizileme cihazları ve bunlara entegre yazılımlar, kapiler elektroforez tabanlı sistemlerle çalışan ve Sanger dizileme teknolojisini kullanan platformlar
110 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I olarak, 2001 yılında tamamlanan İnsan Genom Projesi’nin temel araçlarını oluşturmuştur (Collins vd., 2003). 2.1.SangerDizilemedenNGS’yeEvrim Bu büyük ölçekli proje, dizi analizinin hızını ve doğruluğunu artırırken, aynı zamanda maliyet ve iş gücünü azaltacak yeni nesil, güçlü dizileme teknolojilerinin geliştirilmesini büyük ölçüde teşvik etmiştir. Bununla birlikte, X-Prize Genom Yarışması gibi girişimler de NGS teknolojilerinin gelişimini hızlandırmıştır. Yeni nesil dizileme teknolojileri, Sanger yönteminden farklı olarak yüksek verimlilik, eş zamanlı çoklu analiz yapabilme (massively parallel sequencing) ve düşük maliyet gibi avantajlara sahiptir. NGS sistemleri sayesinde genom dizilemesi daha ulaşılabilir hale gelmiş olsa da, bu teknolojilerin ardından gelen veri analizi ve biyolojik yorumlama süreçleri, genomların anlaşılmasında halen önemli bir dezavantajı bulunmaktadır (Mardis, 2008). Bu dizileme işlemi sonrasında elde edilen kısa okuma verileri, biyoinformatik analizler aracılığıyla insan referans genomuna hizalanarak bir araya getirilir. İnsan genomundaki üç milyar bazın her biri birden fazla kez dizilendiği için yüksek kapsama derinliği elde edilir; bu da hem yüksek doğrulukta veri üretimi sağlar hem de beklenmedik DNA varyasyonlarının tespitine olanak tanır. NGS teknolojileri, tüm genomun dizilenmesi amacıyla kullanılabileceği gibi, analiz belirli gen bölgeleri ile sınırlı tutularak da uygulanabilir. Bu kapsamda yalnızca protein kodlayan yaklaşık 22.000 geni kapsayan tüm ekzom (whole exome) ya da belirli birkaç gen hedeflenebilir (Behjati ve Tarpey, 2013). 3. Yeni Nesil Dizileme (NGS) Teknolojilerine Genel Bakış 2004 ile 2006 yılları arasında geliştirilen yeni nesil dizileme teknolojileri, biyomedikal araştırmalarda köklü bir dönüşüm yaratmış ve dizileme veriminde çarpıcı bir artışa neden olmuştur. Bu önemli artış, tekil DNA moleküllerinin çoklu ve paralel biçimde dizilenmesine olanak sağlayan nanoteknoloji temelli ilkeler ve yenilikler sayesinde mümkün olmuştur. Yüksek verimlilik ve tek molekül dizileme yeteneğinin bir araya gelmesi, kullanılan platformdan bağımsız olarak, NGS teknolojilerinin ayırt edici özelliklerindendir (Mardis, 2013). NGS teknolojileri, gelişmiş işlem prosedürleri sayesinde veri toplama ve analiz süreçleriyle daha etkin biçimde bütünleştirilmiş; böylece, önceki nesil emek yoğun ve düşük verimli Sanger dizileme yöntemlerinden uzaklaşmayı sağlamış ve dizileme verisinde olağanüstü bir artışı mümkün kılmıştır. İkinci
MİKROBİYOTA ANALİZİNDE KULLANILAN YENİ NESİL DİZİLEME . . . 111 nesil dizileme yaklaşımları (örneğin Illumina veya Ion Torrent platformları), DNA›nın parçalanması, uç düzeltme (end-repair), adaptör ligasyonu, yüzeye tutunma ve in-situ amplifikasyon adımlarını içermektedir. Bu sistemlerde, kısa okuma (short-read) teknolojileri kullanılır; yani milyonlarca bireysel dizileme reaksiyonu aynı anda paralel olarak gerçekleştirilmesine olanak sağlamaktadır. Ancak kısa okuma teknolojilerinin doğası gereği, uzun DNA dizilerinin tamamının analiz edilebilmesi için yeniden birleştirme (reassembly) işlemi gerekmektedir. Bu durum, özellikle yapısal varyasyonlar veya düşük kompleksiteli bölgeler gibi genomun zorlu kısımlarında teknik sınırlılıklar yaratmaktadır (Hu vd., 2021). Buna karşılık, üçüncü nesil dizileme teknolojileri (Pacific Biosciences veya Oxford Nanopore platformları), 10 kb ve üzeri okuma uzunluklarına ulaşabilmektedir. Bu uzun okuma teknolojileri, kısa okumalarla karşılaşılan tekrarlayan genom dizileri ve yapısal varyasyonların tespiti gibi zorlukları aşmakta önemli avantajlar sunmaktadır. İkinci nesil yöntemlerle karşılaştırıldığında, üçüncü nesil dizilemede süreç daha az kütüphane hazırlık adımı gerektirir ve parçalanmamış DNA moleküllerini gerçek zamanlı olarak doğrudan hedef alır. Ancak bu teknolojilerde temel sınırlayıcı faktör, analiz için gerekli olan yüksek moleküler ağırlıklı DNA’nın elde edilmesidir. Üçüncü nesil teknolojilerin erken dönemlerde ikinci nesil yöntemlere kıyasla sahip olduğu başlıca dezavantaj, okuma doğruluğunun daha düşük olmasıdır. Ancak bu durum, özellikle yazılım analizlerindeki ilerlemelerle birlikte zaman içinde sürekli olarak iyileştirilmektedir (Mardis, 2013; Hu vd., 2021). Mevcut teknolojiler ve bunlara ilişkin avantajlar ya da dezavantajlar göz önünde bulundurulduğunda, kısa veya uzun okuma dizileme yöntemlerinin seçimi, araştırma ya da klinik uygulamanın amacına göre belirlenmektedir. Bugüne dek araştırma ve klinik gereksinimler, teknolojik gelişmeleri yönlendirmiştir. Ancak bu teknolojilerin sınırlılıkları, bilimsel keşiflerin ve klinik uygulamaların daha da ileriye taşınmasını zaman zaman kısıtlamıştır. 3.1.YeniNesilDizilemeTeknolojisininAvantajlarıveSınırlamaları Yeni nesil dizileme teknolojileri, genomik analizde devrim yaratarak geleneksel Sanger dizileme yöntemlerine kıyasla daha yüksek verimlilik, hız ve maliyet etkinliği sağlamıştır. 2000’li yılların başından itibaren hızla gelişen bu teknolojiler, genetik araştırmaların yanı sıra klinik tanı, tarama ve kişiselleştirilmiş tıp uygulamalarında da yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, NGS teknolojilerinin bazı teknik ve biyoinformatik sınırlılıkları da mevcuttur.
112 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Avantajları: Yüksek Verim ve Paralellik: NGS, milyonlarca DNA fragmanını eş zamanlı olarak dizileyebilme kapasitesine sahiptir. Bu yüksek düzeyde paralel işlem kapasitesi sayesinde büyük genomlar kısa sürede analiz edilebilmektedir. Düşük Maliyet: Birim baz başına maliyet açısından değerlendirildiğinde, NGS teknolojileri, Sanger dizilemeye göre çok daha ekonomiktir. Bu durum, geniş ölçekli popülasyon çalışmalarının yapılabilmesini mümkün kılmıştır. Yüksek Hassasiyet ve Derinlik: Özellikle hedefe yönelik dizileme (targeted sequencing) uygulamalarında yüksek derinlik sağlanarak düşük frekanslı varyantların tespiti mümkün hale gelmiştir. Çok Yönlülük: Tam genom dizileme (Whole Genome Sequencing), tüm ekzom dizileme (Whole Exome Sequencing), RNA dizileme (RNA-Seq), epigenetik analizler ve mikrobiyom çalışmaları gibi farklı uygulamalara olanak tanımaktadır. Dezavantajları: Veri Analizi Zorlukları: NGS, büyük miktarda veri üretir ve bu verilerin analizi için gelişmiş biyoinformatik altyapı, algoritmalar ve uzmanlık gereklidir. Özellikle varyant anotasyonu ve klinik yorumlama süreçleri halen standartlaşma sorunları ile karşı karşıyadır. Okuma Uzunluğu Sınırlamaları: Kısa okuma (short-read) tabanlı platformlar (örneğin Illumina) kompleks genomik bölgelerde (örneğin tekrar dizileri veya yapısal varyantlar) yeterli doğruluk sağlayamayabilir. Bu durum, uzun okuma (long-read) teknolojilerine olan ihtiyacı artırmaktadır. Hata Oranları: NGS platformlarının bazıları (özellikle üçüncü nesil dizileme teknolojileri) belirli hata profillerine sahiptir. Bu nedenle, düşük frekanslı varyantların güvenilir tespiti için doğrulama yöntemlerinin kullanılması gerekebilir. Hazırlık ve Kütüphane Oluşturma Süreçleri: Numune hazırlığı ve kütüphane oluşturma süreçleri hassas ve zaman alıcıdır. Bu aşamalardaki küçük teknik hatalar, dizileme kalitesini doğrudan etkileyebilir. Veri Depolama ve Güvenliği: Üretilen veri miktarı, özellikle tam genom dizileme uygulamalarında, büyük ölçekli depolama altyapılarına ve güvenliğe duyulan ihtiyacı artırmaktadır. Bu da maliyetleri dolaylı olarak etkileyebilir. Yeni nesil dizileme teknolojileri, genomik biliminin gelişiminde itici bir güç olmuş ve biyomedikal araştırmaların sınırlarını önemli ölçüde genişletmiştir.
MİKROBİYOTA ANALİZİNDE KULLANILAN YENİ NESİL DİZİLEME . . . 119 renk ile tanımlanır. LED ışık kaynakları ve optik filtreler aracılığıyla bu renkler algılanır ve dizilenen DNA’nın baz dizisi belirlenir. Her bir baz, farklı dalga boylarında emisyon yapan floresanlarla işaretlendiğinden, cihaz bu sinyalleri ayrıştırarak doğru sırayla nükleotid dizilimini ortaya çıkarır (Buermans ve den Dunnen, 2014; Van Dijk vd., 2014; White vd., 2017). Kısaca Çalışma şu şekilde özetlenebilir: 1. Biyolojik Materyalin Elde Edilmesi Çalışmaya uygun doku, hücre ya da organizmadan biyolojik örnek toplanır. 2. Genomik DNA İzolasyonu Elde edilen biyolojik materyalden saf ve yüksek kalitede genomik DNA izole edilir. 3. Hedef Bölgelerin Seçimi Dizilenecek olan gen, bölge veya tüm genom belirlenir. 4. DNA’nın Kesilmesi ve Kütüphane Hazırlığı DNA, enzimatik reaksiyonlarla küçük parçalara ayrılır. Adaptör dizileri eklenerek dizileme kütüphanesi oluşturulur. 5. Kütüphane Amplifikasyonu DNA kütüphanesi PCR gibi yöntemlerle çoğaltılır (amplifiye edilir). 6. DNA Sekanslama (Dizileme) Oluşturulan DNA kütüphanesi, platforma uygun şekilde dizilenir. Paralel dizileme ile milyonlarca DNA parçası aynı anda okunur. 7. Ham Veri (Raw Data) Elde Edilmesi Dizileme sonucunda temel okuma verileri (örneğin FASTQ dosyaları) elde edilir. 8. Verilerin Haritalanması Ham diziler, referans genoma hizalanır (mapping). 9. Varyant Analizi ve Yorumlama Genetik varyasyonlar (SNP, indel vb.) belirlenir. Varyantların biyolojik ve klinik önemi değerlendirilir. 10. Doğrulama (Validation)
120 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Elde edilen sonuçlar, gerekirse Sanger dizileme ya da tekrar NGS ile doğrulanır. 11. Segregasyon Analizi Aday patojenik varyantların aile bireylerinde kalıtım modeli incelenir. 12. Raporlama Tüm analiz sonuçları, bilimsel ya da klinik anlamda sunulmak üzere raporlanır. Sonuç ve Değerlendirme Yeni nesil dizileme teknolojileri, genomik analizde devrim yaratarak hem temel biyolojik araştırmalar hem de klinik uygulamalarda çığır açıcı gelişmelere zemin hazırlamıştır. Sanger dizilemenin sınırlamalarını aşarak milyonlarca DNA molekülünün eş zamanlı dizilenmesini mümkün kılan bu teknolojiler, yüksek verimlilik, hassasiyet ve maliyet etkinliği gibi avantajları sayesinde genom biliminin ana itici güçlerinden biri hâline gelmiştir. NGS sistemleri, ikinci ve üçüncü nesil platformlar olarak sınıflandırılmakta olup, kısa ve uzun okuma yetenekleriyle farklı analiz ihtiyaçlarına cevap vermektedir. İkinci nesil sistemler (örn. Illumina, Ion Torrent), yüksek doğrulukta kısa okuma verileri sunarken, üçüncü nesil sistemler (örn. PacBio, Oxford Nanopore) ise uzun okuma yetenekleri sayesinde yapısal varyasyonların, tekrarlayan bölgelerin ve epigenetik modifikasyonların analizinde önemli avantajlar sağlamaktadır. Her iki yaklaşım da kendi içinde avantajlar ve sınırlamalar barındırmakta; bu nedenle kullanılacak dizileme teknolojisinin seçimi, büyük ölçüde analiz hedeflerine, biyolojik örnek türüne ve bütçeye bağlıdır. Özellikle mikrobiyota analizlerinde, 16S rRNA, 18S rRNA, ITS bölgeleri ve shotgun metagenomik dizileme gibi hedefe yönelik yöntemler yaygın olarak tercih edilmektedir. Bu yöntemler, mikrobiyal toplulukların taksonomik ve fonksiyonel yapılarının belirlenmesinde güçlü araçlar sunmaktadır. 16S dizileme düşük maliyetli ve hızlı olmasına karşın, sadece sınırlı gen bölgelerine odaklanması nedeniyle fonksiyonel analizde yetersiz kalabilmektedir. Bu açığı kapatmak amacıyla geliştirilen shotgun metagenomik yaklaşımlar, tüm genomik içeriğin analizine olanak tanısa da yüksek maliyet ve veri analiz zorluğu gibi dezavantajlara sahiptir. Bu nedenle, PICRUSt gibi öngörüye dayalı analiz araçları, 16S verilerini kullanarak fonksiyonel tahmin yapılabilmesini sağlayan değerli bir ara çözüm sunmaktadır.
MİKROBİYOTA ANALİZİNDE KULLANILAN YENİ NESİL DİZİLEME . . . 121 NGS teknolojilerinin gelişimiyle birlikte elde edilen verilerin büyüklüğü, veri analizi, depolama ve güvenliği gibi alanlarda yeni zorlukları da beraberinde getirmiştir. Bu noktada, gelişmiş biyoinformatik altyapılar, standart analiz protokolleri ve etik veri yönetimi uygulamaları, NGS’nin etkinliğini sürdürülebilir kılmak için kritik öneme sahiptir. Sonuç olarak, NGS teknolojileri sayesinde genomik araştırmalar daha hızlı, derinlemesine ve geniş kapsamlı hâle gelmiştir. Ancak bu teknolojilerin potansiyelinden tam anlamıyla faydalanılabilmesi için platform seçiminin dikkatle yapılması, teknik sınırlılıkların farkında olunması ve elde edilen verilerin doğru şekilde analiz edilmesi gerekmektedir. Önümüzdeki dönemde, biyoinformatik yazılımlar, daha düşük hata oranlarına sahip uzun okuma sistemleri ve maliyet etkin çözümlerle desteklenen NGS platformları sayesinde hem araştırma hem de klinik alanlarda çok daha ileri düzey uygulamalar mümkün olacaktır. Yeni nesil dizileme (Next-Generation Sequencing, NGS) teknolojileri, mikrobiyota araştırmalarında devrim niteliğinde bir dönüşüm yaratmıştır. Yüksek verimlilik, hassasiyet ve düşük maliyet gibi avantajları sayesinde, daha önce mümkün olmayan derinlikte ve kapsamda mikrobiyal topluluk analizleri gerçekleştirilebilmektedir. 16S rRNA, 18S/ITS bölgelerine yönelik hedefe yönelik dizileme yaklaşımları ile mikrobiyal çeşitlilik hızlı ve ekonomik biçimde belirlenebilirken, shotgun metagenomik sekanslama sayesinde bu toplulukların fonksiyonel potansiyeli doğrudan analiz edilebilmektedir. Ayrıca, üçüncü nesil dizileme teknolojileri (örn. Oxford Nanopore ve PacBio), uzun okuma uzunluklarıyla kompleks ve tekrarlayan bölgelerin analizine imkân tanıyarak mikrobiyotanın daha doğru ve bütüncül şekilde karakterize edilmesini sağlamaktadır. Böylece, NGS yöntemleri, mikrobiyom temelli tanı, hastalık takibi, tedavi yanıtı değerlendirmesi ve kişiselleştirilmiş tıp gibi alanlarda yeni ufuklar açmıştır. Her ne kadar NGS teknolojileri mikrobiyota analizlerini daha erişilebilir hâle getirmiş olsa da, bazı teknik ve analitik zorluklar devam etmektedir. Kısa okuma platformları, özellikle yapısal varyasyonlar ve tekrarlayan bölgelerde sınırlı çözünürlük sunarken; uzun okuma teknolojileri ise hâlen daha yüksek hata oranlarına ve veri doğruluğu sorunlarına sahiptir. Ayrıca, örnek hazırlama süreçlerindeki teknik hassasiyet ve standardizasyon eksiklikleri, dizileme kalitesini doğrudan etkileyebilmektedir. Üretilen büyük veri hacminin analizinde yaşanan zorluklar, gelişmiş biyoinformatik altyapılara ve uzmanlığa olan ihtiyacı artırmaktadır. Bunun yanı sıra, 16S verisinden fonksiyonel içerik tahmini yapan öngörüye dayalı analiz yöntemleri (örneğin PICRUSt), bazı koşullarda etkili
122 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I sonuçlar verse de, doğrudan ölçümle elde edilen shotgun metagenomik verilere göre daha sınırlı doğruluk sunmaktadır. Bu bağlamda, algoritma iyileştirmeleri, referans veritabanlarının genişletilmesi ve hata oranlarının düşürülmesi, gelecekteki gelişim alanlarını oluşturmaktadır. Yeni nesil dizileme teknolojileri, yalnızca temel bilimsel araştırmalar için değil, aynı zamanda klinik uygulamalar açısından da büyük bir potansiyele sahiptir. Mikrobiyomun sağlık ve hastalıkla ilişkili rolünü daha iyi anlamak, bireye özgü tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesini mümkün kılmaktadır. Örneğin, bağırsak mikrobiyotasının metabolik hastalıklar, bağışıklık sistemi bozuklukları ve nörolojik durumlarla ilişkisi giderek daha fazla ortaya konmakta ve bu ilişkiler, tanı ve tedavi stratejilerine entegre edilmektedir. Ancak bu potansiyelin etkin şekilde kullanılabilmesi için, teknik doğruluk kadar veri güvenliği, etik kurallar ve klinik geçerlilik konularında da dikkatli adımlar atılması gerekmektedir. Ayrıca, NGS’nin günlük klinik pratikte kullanılabilirliğinin artırılması, maliyetetkin modellerin geliştirilmesi ve sonuçların yorumlanmasında hekimlere destek sağlayacak araçların oluşturulmasıyla mümkün olacaktır. Kaynakça Amon, P., & Sanderson, I. (2017). What is the microbiome?. Archives of disease in childhood. Education and practice edition, 102(5), 257–260. Ari Ş, Arikan M. Next-generation sequencing: advantages, disadvantages, and future. Plant omics: Trends and applications: Springer; 2016. p. 109-35. Ashton, P. M., Nair, S., Dallman, T., Rubino, S., Rabsch, W., Mwaigwisya, S., Wain, J., & O’Grady, J. (2015). MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island. Nature biotechnology, 33(3), 296–300. Barott, K. L., Rodriguez-Mueller, B., Youle, M., Marhaver, K. L., Vermeij, M. J., Smith, J. E., & Rohwer, F. L. (2012). Microbial to reef scale interactions between the reef-building coral Montastraea annularis and benthic algae. Proceedings. Biological sciences, 279(1733), 1655–1664. Behjati, S., & Tarpey, P. S. (2013). What is next generation sequencing?. Archives of disease in childhood. Education and practice edition, 98(6), 236– 238. Buermans, H. P., & den Dunnen, J. T. (2014). Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et biophysica acta, 1842(10), 1932–1941.
MİKROBİYOTA ANALİZİNDE KULLANILAN YENİ NESİL DİZİLEME . . . 123 Chaffron, S., Rehrauer, H., Pernthaler, J., & von Mering, C. (2010). A global network of coexisting microbes from environmental and whole-genome sequence data. Genome research, 20(7), 947–959. Charbonneau, M. R., Blanton, L. V., DiGiulio, D. B., Relman, D. A., Lebrilla, C. B., Mills, D. A., & Gordon, J. I. (2016). A microbial perspective of human developmental biology. Nature, 535(7610), 48–55. Cho, I., & Blaser, M. J. (2012). The human microbiome: at the interface of health and disease. Nature reviews. Genetics, 13(4), 260–270. Collins, F. S., Morgan, M., & Patrinos, A. (2003). The Human Genome Project: lessons from large-scale biology. Science (New York, N.Y.), 300(5617), 286–290. Collins, R. E., & Higgs, P. G. (2012). Testing the infinitely many genes model for the evolution of the bacterial core genome and pangenome. Molecular biology and evolution, 29(11), 3413–3425. Ding, H. T., Taur, Y., & Walkup, J. T. (2017). Gut Microbiota and Autism: Key Concepts and Findings. Journal of autism and developmental disorders, 47(2), 480–489. Dominy, S. S., Lynch, C., Ermini, F., Benedyk, M., Marczyk, A., Konradi, A., Nguyen, M., Haditsch, U., Raha, D., Griffin, C., Holsinger, L. J., ArastuKapur, S., Kaba, S., Lee, A., Ryder, M. I., Potempa, B., Mydel, P., Hellvard, A., Adamowicz, K., Hasturk, H., … Potempa, J. (2019). Porphyromonas gingivalis in Alzheimer’s disease brains: Evidence for disease causation and treatment with small-molecule inhibitors. Science advances, 5(1), eaau3333. Ege, M. J., Mayer, M., Normand, A. C., Genuneit, J., Cookson, W. O., Braun-Fahrländer, C., Heederik, D., Piarroux, R., von Mutius, E., & GABRIELA Transregio 22 Study Group (2011). Exposure to environmental microorganisms and childhood asthma. The New England journal of medicine, 364(8), 701–709. Fierer, N., Leff, J. W., Adams, B. J., Nielsen, U. N., Bates, S. T., Lauber, C. L., Owens, S., Gilbert, J. A., Wall, D. H., & Caporaso, J. G. (2012). Crossbiome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 109(52), 21390–21395. Gkouskou, K. K., Deligianni, C., Tsatsanis, C., & Eliopoulos, A. G. (2014). The gut microbiota in mouse models of inflammatory bowel disease. Frontiers in cellular and infection microbiology, 4, 28.
124 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Grishin, A., Papillon, S., Bell, B., Wang, J., & Ford, H. R. (2013). The role of the intestinal microbiota in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery, 22(2), 69–75. Harris, J. K., Caporaso, J. G., Walker, J. J., Spear, J. R., Gold, N. J., Robertson, C. E., Hugenholtz, P., Goodrich, J., McDonald, D., Knights, D., Marshall, P., Tufo, H., Knight, R., & Pace, N. R. (2013). Phylogenetic stratigraphy in the Guerrero Negro hypersaline microbial mat. The ISME journal, 7(1), 50–60. Hert, D. G., Fredlake, C. P., & Barron, A. E. (2008). Advantages and limitations of next-generation sequencing technologies: a comparison of electrophoresis and non-electrophoresis methods. Electrophoresis, 29(23), 4618–4626. Hu, T., Chitnis, N., Monos, D., & Dinh, A. (2021). Next-generation sequencing technologies: An overview. Human immunology, 82(11), 801–811. Ip, C. L. C., Loose, M., Tyson, J. R., de Cesare, M., Brown, B. L., Jain, M., Leggett, R. M., Eccles, D. A., Zalunin, V., Urban, J. M., Piazza, P., Bowden, R. J., Paten, B., Mwaigwisya, S., Batty, E. M., Simpson, J. T., Snutch, T. P., Birney, E., Buck, D., Goodwin, S., … MinION Analysis and Reference Consortium (2015). MinION Analysis and Reference Consortium: Phase 1 data release and analysis. F1000Research, 4, 1075. Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., & Green, J. L. (2012). Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance. PLoS computational biology, 8(10), e1002743. Knight R, Jansson J, Field D, Fierer N, Desai N, Fuhrman JA, et al. Unlocking the potential of metagenomics through replicated experimental design. Nature biotechnology. 2012;30(6):513-20.microbial mat. The ISME journal. 2013;7(1):50-60. Laver, T., Harrison, J., O’Neill, P. A., Moore, K., Farbos, A., Paszkiewicz, K., & Studholme, D. J. (2015). Assessing the performance of the Oxford Nanopore Technologies MinION. Biomolecular detection and quantification, 3, 1–8. Lozupone, C. A., Stombaugh, J. I., Gordon, J. I., Jansson, J. K., & Knight, R. (2012). Diversity, stability and resilience of the human gut microbiota. Nature, 489(7415), 220–230. Mardis E. R. (2008). The impact of next-generation sequencing technology on genetics. Trends in genetics: TIG, 24(3), 133–141. Málaga, D. R., Brusius-Facchin, A. C., Siebert, M., Pasqualim, G., SaraivaPereira, M. L., Souza, C. F. M., Schwartz, I. V. D., Matte, U., & Giugliani, R.
MİKROBİYOTA ANALİZİNDE KULLANILAN YENİ NESİL DİZİLEME . . . 125 (2019). Sensitivity, advantages, limitations, and clinical utility of targeted nextgeneration sequencing panels for the diagnosis of selected lysosomal storage disorders. Genetics and molecular biology, 42(1 suppl 1), 197–206. Manichanh, C., Rigottier-Gois, L., Bonnaud, E., Gloux, K., Pelletier, E., Frangeul, L., Nalin, R., Jarrin, C., Chardon, P., Marteau, P., Roca, J., & Dore, J. (2006). Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn’s disease revealed by a metagenomic approach. Gut, 55(2), 205–211. Mardis E. R. (2013). Next-generation sequencing platforms. Annual review of analytical chemistry (Palo Alto, Calif.), 6, 287–303. Meehan, C. J., & Beiko, R. G. (2012). Lateral gene transfer of an ABC transporter complex between major constituents of the human gut microbiome. BMC microbiology, 12, 248. Meropol, S. B., & Edwards, A. (2015). Development of the infant intestinal microbiome: A bird’s eye view of a complex process. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews, 105(4), 228–239. Merriman, B., Ion Torrent R&D Team, & Rothberg, J. M. (2012). Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis, 33(23), 3397–3417. Moon Y. (2016). Microbiome-Linked Crosstalk in the Gastrointestinal Exposome towards Host Health and Disease. Pediatric gastroenterology, hepatology & nutrition, 19(4), 221–228. Morgan, X. C., Tickle, T. L., Sokol, H., Gevers, D., Devaney, K. L., Ward, D. V., Reyes, J. A., Shah, S. A., LeLeiko, N., Snapper, S. B., Bousvaros, A., Korzenik, J., Sands, B. E., Xavier, R. J., & Huttenhower, C. (2012). Dysfunction of the intestinal microbiome in inflammatory bowel disease and treatment. Genome biology, 13(9), R79. Palmer, C., Bik, E. M., DiGiulio, D. B., Relman, D. A., & Brown, P. O. (2007). Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS biology, 5(7), e177. Parks, D. H., & Beiko, R. G. (2013). Measures of phylogenetic differentiation provide robust and complementary insights into microbial communities. The ISME journal, 7(1), 173–183. Qin, J., Li, R., Raes, J., Arumugam, M., Burgdorf, K. S., Manichanh, C., Nielsen, T., Pons, N., Levenez, F., Yamada, T., Mende, D. R., Li, J., Xu, J., Li, S., Li, D., Cao, J., Wang, B., Liang, H., Zheng, H., Xie, Y., … Wang, J. (2010). A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature, 464(7285), 59–65.
126 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Ravi, R. K., Walton, K., & Khosroheidari, M. (2018). MiSeq: A Next Generation Sequencing Platform for Genomic Analysis. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 1706, 223–232. Rhoads, A., & Au, K. F. (2015). PacBio Sequencing and Its Applications. Genomics, proteomics & bioinformatics, 13(5), 278–289. Riiser A. (2015). The human microbiome, asthma, and allergy. Allergy, asthma, and clinical immunology : official journal of the Canadian Society of Allergy and Clinical Immunology, 11, 35. Round, J. L., Lee, S. M., Li, J., Tran, G., Jabri, B., Chatila, T. A., & Mazmanian, S. K. (2011). The Toll-like receptor 2 pathway establishes colonization by a commensal of the human microbiota. Science (New York, N.Y.), 332(6032), 974–977. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74(12), 5463–5467. Sanz, Y., Olivares, M., Moya-Pérez, Á., & Agostoni, C. (2015). Understanding the role of gut microbiome in metabolic disease risk. Pediatric research, 77(1-2), 236–244. Sartor R. B. (2006). Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn’s disease and ulcerative colitis. Nature clinical practice. Gastroenterology & hepatology, 3(7), 390–407. Schadt, E. E., Turner, S., & Kasarskis, A. (2010). A window into thirdgeneration sequencing. Human molecular genetics, 19(R2), R227–R240. Schroeder, B. O., & Bäckhed, F. (2016). Signals from the gut microbiota to distant organs in physiology and disease. Nature medicine, 22(10), 1079–1089. Segata, N., & Huttenhower, C. (2011). Toward an efficient method of identifying core genes for evolutionary and functional microbial phylogenies. PloS one, 6(9), e24704. Smillie CS, Smith MB, Friedman J, Cordero OX, David LA, Alm EJ. Ecology drives a global network of gene exchange connecting the human microbiome. Nature. 2011;480(7376):241-4. Valles-Colomer, M., Blanco-Míguez, A., Manghi, P., Asnicar, F., Dubois, L., Golzato, D., Armanini, F., Cumbo, F., Huang, K. D., Manara, S., Masetti, G., Pinto, F., Piperni, E., Punčochář, M., Ricci, L., Zolfo, M., Farrant, O., Goncalves, A., Selma-Royo, M., Binetti, A. G., … Segata, N. (2023). The person-to-person transmission landscape of the gut and oral microbiomes. Nature, 614(7946), 125–135.
MİKROBİYOTA ANALİZİNDE KULLANILAN YENİ NESİL DİZİLEME . . . 127 van Dijk, E. L., Auger, H., Jaszczyszyn, Y., & Thermes, C. (2014). Ten years of next-generation sequencing technology. Trends in genetics:TIG, 30(9), 418–426. White, S. J., Laros, J. F. J., Bakker, E., Cambon-Thomsen, A., Eden, M., Leonard, S., Lochmüller, H., Matthijs, G., Mattocks, C., Patton, S., Payne, K., Scheffer, H., Souche, E., Thomassen, E., Thompson, R., Traeger-Synodinos, J., Van Vooren, S., Janssen, B., & den Dunnen, J. T. (2017). Critical points for an accurate human genome analysis. Human mutation, 38(8), 912–921. Wold A. E. (1998). The hygiene hypothesis revised: is the rising frequency of allergy due to changes in the intestinal flora?. Allergy, 53(46 Suppl), 20–25. Zaneveld, J. R., Lozupone, C., Gordon, J. I., & Knight, R. (2010). Ribosomal RNA diversity predicts genome diversity in gut bacteria and their relatives. Nucleic acids research, 38(12), 3869–3879. Zhong, Y., Xu, F., Wu, J., Schubert, J., & Li, M. M. (2021). Application of Next Generation Sequencing in Laboratory Medicine. Annals of laboratory medicine, 41(1), 25–43.
GIDA KATKI MADDESİ LESİTİN 135 sağlığı üzerine etkilerini literatür çalışmaları incelenerek ortaya çıkarılmıştır. Mevcut verilere göre, lesitinin insan sağlığı üzerine genellikle zararlı etkileri olmadığı görülmüştür. Bu doğrultuda, tüm gıda katkı maddelerinin zararlı olduğu yönünde genel bir kanaate varmak doğru değildir. Nitekim lesitinin güvenliği ile ilgili çalışmalarda, bu maddenin güvenlik açısından ciddi sorun teşkil etmediğini gösterilmiştir. Fakat, yapılan çalışma yetersizliği ve nörodavranışsal etkileri üreme ve gelişimsel toksikoloji açısından yeterli verinin olmaması, endişeleri tam anlamda giderememiştir. Bu nedenle, bu alanda daha fazla ve kapsamlı çalışma yapılmasına ihtiyaç duyulmaktadır. Kaynaklar Akyıl, S., İlter, İ., Koç, M., & Kaymak-Ertekin, F. (2016). Alglerden elde edilen yüksek değerliükli bileşiklerin biyoaktif/biyolojik uygulama alanları. Akademik Gıda, 14(4), 418–423. Amézqueta, S., Fernández-Pumarega, A., Farré, S., Luna, D., Fuguet, E., & Rosés, M. (2020). Lecithin liposomes and microemulsions as new chromatographic phases. Journal of Chromatography A, 1611, 460596. Atman, Ü. C. (2004). Gıda katkı maddeleri ve gıda kontrolü. Sted, 13(3), 86–88. Bayram, H. M., & Öztürkcan, A. (2020). Gıda katkı maddelerinin mikrobiyota üzerine etkisi. Gıda, 45(5), 1030–1046. Brownawell, A. M., Carmines, E. L., & Montesano, F. (2011). Safety assessment of AGPC as a food ingredient. Food and Chemical Toxicology, 49(6), 1303–1315. Cox, S., Sandall, A., Smith, L., Rossi, M., & Whelan, K. (2021). Food additive emulsifiers: A review of their role in foods, legislation and classifications, presence in food supply, dietary exposure, and safety assessment. Nutrition Reviews, 79(6), 726–741. Dvir, E., Elman, A., Simmons, D., Shapiro, I., Duvdevani, R., Dahan, A., ... & Friedman, J. E. (2007). DP-155, a lecithin derivative of indomethacin, is a novel nonsteroidal antiinflammatory drug for analgesia and Alzheimer’s disease therapy. CNS Drug Reviews, 13(2), 260–277. EFSA. (2016). Panel on Additives and Products or Substances Used in Animal Feed (FEEDAP). Safety and efficacy of lecithins for all animal species. EFSA Journal, 14(8), 4561. EFSA. (2017). Scientific opinion on the re-evaluation of lecithins (E 322) as food additives. EFSA Journal, 15(6), 4742.
136 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I EFSA (2020). Panel on Food Additives and Flavourings (FAF). Safety of use of oat lecithin as a food additive. EFSA Journal, 18(1), 5969. Garti, N. (1999). What can nature offer from an emulsifier point of view: Trends and progress? Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 152(1–2), 125–146. Hasenhuettl, G. L., & Hartel, R. W. (2008). Overview of food emulsifiers. In G. L. Hasenhuettl & R. W. Hartel (Eds.), Food emulsifiers and their applications (2nd ed.). Springer Science+Business Media. Homayoonfal, M., Mousavi, S. M., Kiani, H., Askari, G., Desobry, S., & Arab-Tehrany, E. (2021). Encapsulation of Berberis vulgaris anthocyanins into nanoliposome composed of rapeseed lecithin: A comprehensive study on physicochemical characteristics and biocompatibility. Foods, 10(3), 492. Honda, K., Enoshima, T., Oshikata, T., Kamiya, K., Hamamura, M., Yamaguchi, N., ... & Wakigawa, K. (2009). Toxicity studies of Asahi Kasei PI, purified phosphatidylinositol from soy lecithin. The Journal of Toxicological Sciences, 34(3), 265–280. Johnson, W., Bergfeld, W. F., Belsito, D. V., et al. (2020). Kozmetiklerde kullanılan lesitin ve diğer fosfogliseridlerin güvenlik değerlendirmesi. Uluslararası Toksikoloji Dergisi, 39(2_suppl), 5S–25S. Kantekin Erdoğan, M. N. (2014). Kısmi gliseritlerin mayonezin emülsiyon stabilitesi ve reolojisi üzerine etkisi [Yüksek lisans tezi, Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü]. Kara, H. H., & Bor, Y. (2019). A review on: Production, usage, health effect and analysis of mono-and diglycerides of fatty acids. Helal ve Etik Araştırmalar Dergisi, 1(1), 40–47. Karatepe, T. U., & Ekerbiçer, H. Ç. (2017). Gıda katkı maddeleri. Sakarya Tıp Dergisi, 7(4), 164–167. Nguyen, N. T. (2018). Acinetobacter soli SP2 capable of high-efficiency degradation of food emulsifier polysorbate 80. Current Microbiology, 75(7), 896–900. Özbek, Ç. Y., & Güzeler, N. (2021). Guar gam ve süt endüstrisinde kullanım olanakları. Paper presented at the Istanbul International Modern Scientific Research Congress, İstanbul, Türkiye. Özgen, I., & Hazarhun, E. (2019). Gıda etiketlerindeki E-kodlu katkı maddelerinin helal gıda kapsamında incelenmesi. Balıkesir University Journal of Social Sciences Institute, 22(41), 1–14.
GIDA KATKI MADDESİ LESİTİN 137 Polat, Y. (2007). Buğday ununa balkabağı tozu ilavesinin unun ekmeklik kalitesi üzerine etkisi [Yüksek lisans tezi, İstanbul Teknik Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü]. İstanbul Teknik Üniversitesi Açık Erişim Tez Arşivi. Robert, C., Penhoat, A., Couëdelo, L., Monnoye, M., Rainteau, D., Meugnier, E., ... & Michalski, M.-C. (2023). Natural emulsifiers lecithins preserve gut microbiota diversity in relation with specific faecal lipids in high fat-fed mice. Journal of Functional Foods, 105, 105540. Sanapalli, B. K. R., Kannan, E., Balasubramanian, S., Natarajan, J., Baruah, U. K., & Karri, V. V. S. R. (2018). Yara iyileşmesi için 5-aminosalisilik asitten oluşan pluronik lesitin organojeli. Drug Development and Industrial Pharmacy, 44(10), 1650–1658. Yazıcı, G. N., & Özer, M. S. (2020). Emülgatörlerin yumurta ikame yardımcısı olarak kek üretiminde kullanımı. Türkiye 13. Gıda Kongresi (Bildiri). Yeşilöz, R. (2018, Ağustos). Titanyum dioksit ve lesitin kitosan nano partiküllerinin in vitro genotoksik ve sitotoksik değerlendirmesi [Yüksek lisans tezi, YÖK Ulusal Tez Merkezi]. Zhang, S., Xiao, H., & Li, N. (2022). The characterization of polysorbate. Current Protocols, 2(7), e489.
139 BÖLÜM VIII MİKOTOKSİNLER VE GEÇİCİ RESEPTÖR POTANSİYELİ (TRP) KANALLARI MycotoxinsandTransientReceptor Potential(TRP)Channels Müge MAVİOĞLU KAYA1 1(Dr. Öğr. Üyesi) Kafkas Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, 36100 Kars, Türkiye E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0003-1276-3745 1. Giriş Geçici reseptör potansiyeli (TRP) kanalları elektriksel, kimyasal, mekanik ve termal uyarıları algılayıp bu uyaranları iyonik akımlara dönüştürerek görme, işitme, tat, koku ve dokunma algısı gibi hücresel yanıt oluşturan polimodal moleküler reseptörlerdir (Voets vd., 2005; Talyzina vd., 2025). TRP türevlerini araştırma çalışmaları memelilerde 28 TRP kanalının bulunduğunu ortaya çıkarmıştır. Bunlar dizi benzerliklerine göre TRPA (ankirin), TRPC (kanonik), TRPM (melastatin), TRPML (mukolipin), TRPP (polikistin) ve TRPV (vanilloid) (Şekil 3) olmak üzere alt ailelere ayrılmışlardır (Şekil 1) (Zheng, 2013).
140 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Şekil 1. TRP kanallarının elektron mikroskobu yapıları. (A) TRPV1’in kriyo-elektron mikroskop yapıları. Mavi çizgiler hücre zarının konumunu göstermektedir. (B) TRPV1 kriyo-elektron mikroskop TRPV1 ankirin benzeri tekrar alanlarının ve Kv2.1 transmembran alanlarının kristal yapıları. (C) Shaker potasyum kanalının kriyo-elektron mikroskop yapısı. A ve C için ölçek çubuğu 10 nm (Zheng, 2013). Şekil 2. İnsan TRP kanallarının filogenisi (Nilius ve Owsianik, 2011).
MİKOTOKSİNLER VE GEÇİCİ RESEPTÖR POTANSİYELİ (TRP) KANALLARI 141 1.1.TRPKanalAktivasyonu Canlı hücre içerisinde TRP kanallarının aktive edilmesi diasilgliserol (DAG) veya metabolitleri olan çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) aracılığıyla gerçekleşmektedir. PUFA’lar diseksiyon edilmiş fotoreseptör hücrelerinde TRP ve TRPL kanallarını aktive eder. DAG ve PUFA’lar böcek hücrelerinde TRPL kanallarını aktive etmektedir. Fosfatidik asit ile fosforlanmış DAG molekülünün gözde bozunmasıda TRP ve TRPL aktivasyonuna neden olur. DAG kinaz mutantlarda DAG’nin fosfatidik asit yerine PUFA’lara yönlendirilmesi, PUFA seviyelerini arttırarak kanal aktivitesinin artmasını sağlayabilmektedir (Martín, 2023). Şekil 3. TRPV1›in yapısı ve etkileşim bölgeleri. (A). Sıcaklıkla birlikte artan nosiseptör aktivasyonu; sıcak noktalar, kapsaisin, pozitif ve negatif yüklü iyonlar, ATP, kalmodulin ve kanal duyarlılığında rol oynayan protein kinaz A ve protein kinaz C fosforilasyon bölgeleri için için bağlanma bölgeleridir. (B). birincil habercinin alındığı gözenek alanında polimodal, soğuğu ve sıcağı algılayan reseptörler kapsaisin gibi iritanlar, pozitif ve negatif yüklü iyonlar, mekanik stres, asit, ve ısı gibi farklı uyaranlara yanıt veren üst ve alt kanallar içermektedir (Gao vd., 2024).
142 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 2. Mikotoksinler Mantarlar, benzersiz ve karmaşık yapılara sahip çeşitli ikincil metabolitler üretir (Yin vd., 2023). Mikotoksinler, bazı mantar türlerinin doğal olarak oluşan toksik sekonder metabolitleridir. İnsan ve hayvan sağlığı üzerinde zararlı etkileri olduğu kanıtlanmış gıda kirleticileridir. Bağışıklık sistemini baskılayıcı ve kanserojen yapıları özellikle endişe vericidir. Dünya Sağlık Örgütü’ne (WHO) göre, dünya gıda arzının % 25’i mikotoksinlerle kontaminedir (MarroquínCardona vd., 2014). 2.1.MikotoksinlerinSınıflandırılması Yaygın olarak mikotoksinler onları sentezleyen mantara göre sınıflandırılır. Ancak tek bir mantar türü birçok mikotoksin sentezlemekle birlikte, aynı mikotoksin farklı mantar türleri tarafından da üretilebilir. Aspergillus, Penicillium ve Fusarium cinsleri sağlık ve ekonomik bakımdan önemli görülen mikotoksinlerin çoğunu üretmektedir (Loftus, 2018). Küfler ve mayaları kapsayan mantarlar gıda endüstrisinde çift yönlü rol oynar. Örneğin, fermantasyonla fermente ürün üretiminde ve peynirlerin olgunlaşmasında rol oynadıkları gibi insan sağlığını etkileyen ve ekonomik kayıplara neden olan gıda bozulmalarıdan da sorumludurlar. Dünya genel olarak her yıl 10 kişiden birinin gıda zehirlenmesinden etkilediği bilinmektedir. Gıda kaynaklı hastalıklar, parazitler, kimyasallar ve patojenlerce kirlenmiş gıdaların tüketilmesinden kaynaklanan bir sonuç olarak tanımlanmaktadır. Dünya çapında mantar kontaminasyonu ile tarım ürünlerinin üçte biri yok olmaktadır. Mikotoksinlere maruz kalan insanlarda karaciğer kanseri ve sinir sistemi hasarları sıklıkla görülmekle birlikte mikotoksin maruziyeti doğurganlığı ve bağışıklık sistemini de etkilemektedir (Thery vd., 2019). Bu mikotoksinler sitotoksisite, hepatoksisite, genotoksisite, immünotoksisite, üreme toksisitesi ve gastrointestinal toksisiteye sahiptir (Deng vd., 2023).
MİKOTOKSİNLER VE GEÇİCİ RESEPTÖR POTANSİYELİ (TRP) KANALLARI 143 Şekil 4. Sağlık ve tarımsal ekonomi açısından en önemli mikotoksinler: Deoksinivalenol (DON), Okratoksin A (OTA), aflatoksin M1 (AFM1), patulin, T-2 toksini ve zearalenonun (ZEN) molekül yapıları (Loftus, 2018). 2.1.1. Deoksinivalenol (DON): En yaygın toksinlerden biri olan ve kusmuk toksini olarakta bilinenen deoksinivalenol (DON), B tipi trikotesen mikotoksindir (Şekil 4). Yaygın olarak tahıllarda ve hayvan yemi gibi tahıl yan ürünlerinde bulunan Fusarium cinsinin sekonder metabolitidir. İnsanlarda ve hayvanlarda ishal, kusma, iştahsızlık, gastroenterit, endotoksemi ve septik şok gibi akut toksisitelere ve hatta ölüme dahi neden olur. Konak bitkiler mikotoksinleri üridin difosfat-glukoziltransferaz enzimleri sayesinde glukozile ederek, serbest DON’un konjugatı olan DON-3-glukozit (D3G) formunda bitki yüzeyinde salgılarlar (Qin vd., 2022). Yapılan bir çalışmada fareler tarafından uzun süreli DON tüketiminin immünoglobulin A (IgA) ve IgA immün kompleksi seviyelerinin artmasına neden olduğu gösterilmiştir (Loftus, 2018). 2.1.2. Okratoksin A (OTA): Yapısal olarak izokumarin türevi olan okratoksin A (OTA), (Şekil 4) Aspergillus ve Penicillium cinsinin bazı türleri tarafından üretilen bir mikotoksindir. Kimyasal yapısının daha kararlı ve yarı ömrünün daha uzun olması nedeniyle böbrek, karaciğer ve timüs gibi organları etkilemektedir. Bağışıklık baskılayıcı ve kanserojen özellikleri nedeniyle de insan sağlığını tehdit eden bir mantar sekonder metabolitidir. OTA ayrıca nörotoksiktir ve t-RNA sentetaz ile rekabet ederek protein sentezini baskılayabilir
144 MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİKTE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I (Mavioğlu Kaya vd., 2023). Yapılan çalışmalar OTA’nın siklooksijenaz-2’yi, nükleer faktör-kappa B’yi ve siklin-D1’i fosforilleyerek fare epidermisi hücre proliferasyonunu indüklediğini göstermiştir (Park vd., 2019). Aflatoksin M1 (AFM1) ve OTA’nın kıyaslandığı bir çalışmada, 4 μg/mL OTA ‘ya maruz kalmanın insan bağırsak epitel hücrelerinin bütünlüğünü bozduğu, 4 μg/mL AFM1’in ise bozmadığı saptanmıştır. Ayrıca OTA ve AFM1’e birlikte maruziyetin, bağırsak bütünlüğünü bozmada sinerjik bir etkiye sahip olduğu belirtilmektedir (Gao vd., 2018). Uzun yıllardır, tarlada yetiştirilirken veya hasat ve depolama sırasında mantarlarla enfekte olmuş bitkilerden elde edilen çeşitli gıda maddelerinin aynı anda farklı mikotoksinler içerebileceği bilinmektedir. Tek bir küf tarafından çok sayıda mikotoksin üretilebilir; özellikle birçok Aspergillus ve Penicillium cinsi, çevresel ve substrat koşullarına bağlı olarak aynı anda birkaç mikotoksini birlikte üretebilir. Bu durum özellikle okratoksin A (OTA) ve sitrinin (CTN) için geçerlidir. OTA ve sitrinin (CTN)’ nin in vitro Vero hücrelerinde sinerjistik etkiye sahip olduğunun açıklandığı bir çalışmada, in vivo olarak her iki mikotoksinin de farklı kromozom aberasyonlarına-boşluklar, halkalar, kırıklar ve sentrik füzyonlara-neden olduğu saptanmıştır (Rahim vd., 2008). 2.1.3. Aflatoksin B1 (AFB1) ve Aflatoksin M1 (AFM1): Aspergillus mantar türü hasat edilen ürünlerde hayatta kalma şansını artırmak için (Zhu vd., 2016), oldukça kanserojen, toksik bir madde olan aflatoksin (Şekil 4) üretir (Saleh vd., 2018). Aflatoksinler ve metabolitleri, hücrelerin plazma membranından geçebilen ve hücre içi bileşenleri hedefleyebilen küçük, lipofilik (Boss, 2020), hepatotoksik, teratojenik, kanserojen ve bağışıklık baskılayıcı olan en toksik mikotoksinlerdir (Tan, 2019). AFM1 süt ürünlerinde gıda güvenliğini tehdit eder şekilde diğer mikotoksinlerle birlikte yaygın olarak bulunur (Gao vd., 2018). AFB1 ise, Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı tarafından Grup-1A kanserojen olarak sınıflandırılır (Tablo 1) ve bu mikotoksin sınıfı arasında en toksik mikotoksin olarak kabul edilir. Aflatoksine maruz kalma, sıçanlarda karaciğer hasarına ve kansere ve in vitro insan karaciğer hücrelerinde DNA lezyonlarına neden olabilir (Zhu vd., 2016). Gametler için toksik olan aflatoksinlerin üreme üzerindeki etkileri evcil hayvanlarda ve fare modellerinde bildirilmiştir (Boss, 2020). Ayrıca aflatoksin maruziyeti ile tümör oluşumu arasındaki ilişki Çin ve Güney Afrika’da yüksek düzeyde diyet aflatoksinine maruz kalan popülasyonlarda, p53 tümör baskılayıcı genindeki mutasyonların (kodon 249›da G→T transversiyonu) yüksek sıklıkta saptanması ile açıklanmıştır (Lahiani vd., 2017).