Mikrobiyolojide Güncel Çalışmalar III

MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III Editörler Zülal AŞÇI TORAMAN Yasemin ÜSTÜNDAĞ Lyon 2025 MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III Editörler Zülal AŞÇI TORAMAN Yasemin ÜSTÜNDAĞ Lyon 2025 Mikrobiyolojide Güncel Çalışmalar III Editors • Prof. Dr. Zülal AŞÇI TORAMAN • Orcid: 0000-0001-5202-8564 • Prof. Dr. Yasemin ÜSTÜNDAĞ • Orcid: 0000-0002-0002-5510 Cover Design • Motion Graphics Book Layout • Motion Graphics First Published • October 2025, Lyon e-ISBN: 978-2-38236-950-0 DOI: 10.5281/zenodo.17453517 copyright © 2025 by Livre de Lyon All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without prior written permission from the Publisher. The author or authors of the relevant section are responsible for any copyright infringement that may occur due to the images and graphics used in the book. The editor or publisher does not assume responsibility in this regard. Publisher • Livre de Lyon Address • 37 rue marietton, 69009, Lyon France website • http://www.livredelyon.com e-mail • [email protected] I ÖNSÖZ Mikrobiyoloji bilimi, sağlık ve yaşam bilimlerinin temel alanlarından biri olarak, mikroorganizmaların insan, hayvan ve çevre üzerindeki etkilerini anlamada önemli bir konuma sahiptir. Son yıllarda genomik, moleküler biyoloji ve biyoteknoloji alanlarında kaydedilen ilerlemeler, mikrobiyal etkileşimlerin, patogenez mekanizmalarının ve antimikrobiyal direnç süreçlerinin daha derinlemesine incelenmesine olanak sağlamıştır. Bu doğrultuda hazırlanan “Mikrobiyolojide Güncel Çalışmalar III” adlı bu kitap, alanın farklı alt disiplinlerinde yürütülen güncel araştırmaları ve yeni yaklaşımları bir araya getirmektedir. On beş bölümden oluşan eser; mikrobiyota ve insan sağlığı ilişkisi, probiyotikler, antimikrobiyal direnç, bakteriyofajlar, biyofilm oluşumu, yeni antifungal ajanlar, tüberküloz tanısında miRNA’ların kullanımı gibi çağdaş konuları kapsamaktadır. Ayrıca paraziter enfeksiyonlar, yara iyileşmesinde mikrobiyal metabolitler ve ilaç yeniden konumlandırma stratejileri de kitapta ele alınan güncel temalar arasındadır. Her biri alanında uzman akademisyenler tarafından kaleme alınan bölümler, güncel literatür doğrultusunda hazırlanmış olup, mikrobiyolojiye ilişkin teorik bilgilerin klinik ve uygulamalı yaklaşımlarla bütünleştirilmesini amaçlamaktadır. Bu eserin, mikrobiyoloji alanında çalışan araştırmacılara, lisansüstü öğrencilere ve klinisyenlere güncel bir başvuru kaynağı sunmasını diliyoruz. Saygılarımızla, Editörler Prof. Dr. Zülal AŞÇI TORAMAN & Prof. Dr. Yasemin ÜSTÜNDAĞ Mikrobiyolojide Güncel Çalışmalar III 2025 III CONTENTS ÖNSÖZ I BÖLÜM I. GEBELİKTE STREPTOCOCCUS AGALACTIAE: EPİDEMİYOLOJİ, PATOGENEZ VE KORUNMADA YENİ YAKLAŞIMLAR 1 EmineHAMŞUOĞLU&ElifYAPRAKÇOLAK& NizamiDURAN BÖLÜM II. PSEUDOMONAS AERUGİNOSA: KLİNİK ÖNEMİ VE TANI YÖNTEMLERİ 19  ResulEkremAKBULUT BÖLÜM III. TÜBERKÜLOZ HASTALIĞININ LABORATUVAR TANISINDA miRNA’LARIN ROLÜ 31 ZülalAŞÇITORAMAN&SencelORUÇ& YaseminÜSTÜNDAĞ&BernaERDAL BÖLÜM IV. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ENFEKSİYONLARINA KARŞI BAĞIŞIKLIK TEPKİLERİNDE miRNA’LARIN ROLÜ 43 YaseminÜSTÜNDAĞ&TuğbaBAŞTÜRK& ZülalAŞÇITORAMAN&ErdemKÖROĞLU BÖLÜM V. BAKTERİYOFAJLAR 67 GülfemNurYILDIZ&MuratKARAMEŞE BÖLÜM VI. MİKROBİYAL BİYOFİLMLER VE KRONİK ENFEKSİYONLARLA İLİŞKİSİ 87 RukiyeASLAN&HülyaŞİMŞEK BÖLÜM VII. YARA İYİLEŞMESİNDE SİYANOBAKTERİYEL BİYOAKTİF METABOLİTLER 101 TünayKARAN&UFUKÜLKER BÖLÜM VIII. ANTİMİKROBİYAL DİRENÇLE MÜCADELEDE İLAÇ YENİDEN KONUMLANDIRMA 117 RukiyeASLAN&HülyaŞİMŞEK BÖLÜM IX. ANTİMİKROBİYAL PEPTİTLER 127 Gonca ŞİMŞEK1 & Zeynep SÜMER BÖLÜM X. YENİ NESİL ANTİFUNGAL AJANLAR: REZAFUNGİN VE İBREXAFUNGERP 153 SinemAYAZ IV   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III BÖLÜM XI. TRICHOMONAS VAGINALIS’IN SERVİKAL KANSERDEKİ ROLÜ 163 ÖzgeYILMAZLI BÖLÜM XII. DÜNDEN BUGÜNE BLASTOCYSTİS SP.: TANI, TEDAVİ VE ETKİLERİ ÜZERİNE YENİ YAKLAŞIMLAR 173 MaksutŞAHİN&MiladAFŞAR&MuhammedYASUL BÖLÜM XIII. MİKROBİYOTADAN SAĞLIĞA: PROBİYOTİKLERİN BİLİNENLERİ VE YENİ PERSPEKTİFLERİ 193 ElifYAPRAKÇOLAK&NizamiDURAN BÖLÜM XIV. KANSER VE MİKROBİYOTA ETKİLEŞİMİ 207 AbdulhamitÇALI&BerzanEKMEN GEBELİKTE STREPTOCOCCUS AGALACTIAE: EPİDEMİYOLOJİ . . .   7 da görülebilmektedir. Antimikrobiyal tedaviye genellikle penisilin grubu antibiyotiklerle iyi yanıt alınır, ancak invaziv olgularda mortalite oranının %20’ye kadar çıkabildiği bildirilmiştir. Ayrıca kistik fibrozisli gebelerde GBS enfeksiyonlarının daha sık görüldüğü, bu olguların daha ağır seyir gösterebildiği belirtilmiştir (8). Nosokomiyal bulaş, gebelik ve postpartum dönemde gözlenen GBS enfeksiyonlarının azımsanmayacak bir kısmını oluşturur; yapılan çalışmalarda invaziv olguların %20’den fazlasının hastane kaynaklı olduğu bildirilmiştir (40). Sonuç olarak, GBS enfeksiyonları gebelikte hem anne hem de fetüs için ciddi morbidite riski taşımakta; bu nedenle erken tanı, taşıyıcılık taraması ve uygun intrapartum antibiyotik profilaksisi, enfeksiyonun kontrolünde temel stratejiler olarak öne çıkmaktadır. 8. Yenidoğan Enfeksiyonları Erken başlangıçlı grup B streptokok (GBS) enfeksiyonları, genellikle yaşamın ilk 24 saatinde ortaya çıkar ve sepsis, pnömoni ve solunum sıkıntısı gibi ağır klinik tablolarla seyreder (41, 42). Enfeksiyonların %90’a yakın kısmı ilk 24 saat içinde görülür ve enfeksiyon çoğunlukla doğum öncesinde veya doğum sırasında gerçekleşen vertikal bulaş ile ilişkilidir (9). Perinatal bulaş membranların sağlam olduğu durumlarda da görülebilmekle birlikte erken veya uzamış membran rüptürü GBS bulaş riskini belirgin şekilde artırmaktadır (43). Prematürite, uzamış membran rüptürü (>18 saat), maternal ateş ve düşük doğum ağırlığı erken başlangıçlı enfeksiyonların en önemli risk faktörleridir (44). Fetüsün kontamine amniyotik sıvıyı aspirasyonu patojenin immatür mukozal bariyerleri geçmesine olanak tanımakta ve bu durum pnömoni ve bakteriyemiye, dolaşıma karışan bakteriler ise kan-beyin bariyerini aşarak menenjite neden olabilmektedir (45). CDC verilerine göre erken başlangıçlı enfeksiyonların insidansı 10.000 canlı doğumda 5-6 olarak bildirilmiştir, ancak oranlar bölgesel ve etnik farklılıklar gösterebilmektedir (18). Gebeler genitoüriner ve gastrointestinal sistemlerde asemptomatik GBS taşıyıcısı olduklarından, doğum sırasında gerçekleşen bulaş tüm neonatal GBS enfeksiyonlarının yaklaşık %80’ini oluşturmaktadır (46). Bu nedenle 35-37. gebelik haftalarında yapılan rektovajinal kültür taraması ve doğum sırasında uygulanan intrapartum antibiyotik profilaksisi, erken başlangıçlı enfeksiyonların önlenmesinde en etkili yaklaşımlardır (47). 8   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III Geç başlangıçlı GBS enfeksiyonları, doğumdan sonraki 7-89. günler arasında ortaya çıkar ve menenjit ile bakteriyemi en sık klinik tablolardır. Erken forma göre mortalite daha düşük olsa da, menenjit gelişen bebeklerin %20-40’ında uzun dönemli nörolojik sekeller (örneğin serebral palsi, işitme kaybı, görme bozukluğu veya bilişsel yetersizlik) görülmektedir (48). Bulaş yalnızca anneden vertikal geçiş yoluyla değil, aynı zamanda hastane veya toplum kaynaklı yatay bulaş ve anne sütü aracılığıyla da gerçekleşebilir. Ayrıca GBS, sağlam amniyotik membranları invaze etme yeteneği sayesinde intrauterin dönemde fetüsü etkileyerek amniyonit, ölü doğum veya düşük gibi olumsuz gebelik sonuçlarına da yol açabilir (49). 9. Erişkinlerde GBS Enfeksiyonları Streptococcus agalactiae, yalnızca yenidoğan ve gebelik döneminde değil erişkinlerde de giderek artan öneme sahip bir patojendir. Sağlıklı bireylerde genital ve gastrointestinal sistem kolonizasyonu oldukça yaygındır; popülasyonun yaklaşık %30’undan fazlasında asemptomatik kolonizasyon bildirilmiştir (50). Kadınlarda kolonizasyon oranı %25-40 arasında değişirken, gebelerde bu oran %20-30’a kadar ulaşabilmektedir. Gebelerde kolonizasyon durumunda bebeklerin yaklaşık yarısında da kolonizasyon görülebilir (51). İntrapartum antibiyotik profilaksisi uygulamalarının yaygınlaşmasıyla neonatal GBS enfeksiyonları belirgin şekilde azalmış olsa da, gebelik dışı erişkin popülasyonda invaziv GBS enfeksiyonlarının insidansı artmaya devam etmektedir (10). Bu durum GBS’nin yalnızca obstetrik değil, erişkin sağlığı açısından da klinik olarak önemli bir patojen olduğunu göstermektedir. İleri yaş (>65), diabetes mellitus, malignite, HIV enfeksiyonu, kronik alkol kullanımı ve immünsüpresyon gibi sistemik hastalıklar invaziv GBS enfeksiyonu için başlıca risk faktörleri arasında yer almaktadır (52). Bu bireylerde enfeksiyonlar sıklıkla pnömoni, ürosepsis, yumuşak doku enfeksiyonları, artrit ve endokardit gibi klinik tablolarla seyretmektedir. Genç erkeklerde ve gebe olmayan kadınlarda yapılan çalışmalarda %30’un üzerinde kolonizasyon oranları bildirilmiştir. Buna karşın gebe olmayan erişkinlerde invaziv hastalık insidansının 100.000 kişide 4-7 arasında değiştiği bildirilmiştir (53). Erişkinlerde invaziv hastalık insidansı 100.000 kişi başına 4-7 olgu arasında değişmekte olup, bu oran yaşlı bireylerde belirgin şekilde artmaktadır (54). Özellikle huzurevlerinde yaşayan yaşlı bireylerde enfeksiyon gelişme riskinin, toplumda yaşayan yaşıtlarına kıyasla yaklaşık dört kat daha yüksek olduğu bildirilmiştir (55). Ayrıca, nosokomiyal enfeksiyonlar erişkin GBS GEBELİKTE STREPTOCOCCUS AGALACTIAE: EPİDEMİYOLOJİ . . .   9 olgularının %20’sinden fazlasını oluşturmakta olup bu durum hastane kaynaklı bulaşın da erişkin enfeksiyonlarında önemli bir etken olduğunu göstermektedir (56). Kolonizasyonun oluşumunda yalnızca biyolojik değil, çevresel ve davranışsal faktörler de etkili olabilir. Rahim içi araç (RİA) kullanımı sık cinsel ilişki, tampon kullanımı, düşük el hijyeni, bazı antifungal ilaçlar ve süt ürünleri tüketimi GBS kolonizasyonu ile ilişkilendirilen faktörler arasında yer almaktadır. GB yalnızca konak özelliklerine değil aynı zamanda yaşam tarzı ve çevresel koşullara da duyarlı bir patojendir (57). 10. Korunma ve Tedavi Yaklaşımları 10.1.İntrapartumAntibiyotikProfilaksisi(IAP) Erken başlangıçlı Grup B Streptococcus enfeksiyonlarının önlenmesinde en yaygın strateji; gebelerin 35-37. haftalarda rektovajinal kültürle taranması ve doğumdan en az 2-4 saat önce başlanan intrapartum antibiyotik profilaksisi (IAP) uygulamasıdır (46). Penisilin G, IAP’de altın standart olarak kabul edilmektedir (47). Ancak, az gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde IAP uygulaması, maliyet, sağlık altyapısının yetersizliği ve doğum öncesi tarama imkanlarının sınırlı olması nedeniyle oldukça kısıtlıdır. Gelişmekte olan ülkelerde, maliyet, sağlık altyapısı eksikliği ve tarama imkanlarının yetersizliği nedeniyle IAP’nin yaygın uygulanamadığı bildirilmektedir (58). IAP’nin etkinliği ve güvenliği halen tartışmalıdır; çünkü bu yaklaşım doğum sırasında gebelerin yaklaşık üçte birine intravenöz antibiyotik verilmesini gerektirir. Son yıllarda yapılan bazı çalışmalar, gebelikte ve doğum sırasında verilen antibiyotiklerin yenidoğan bağırsak mikrobiyotasını olumsuz etkileyebileceğini ve ilerleyen dönemde alerji, astım ve obezite gibi hastalıklara yatkınlık oluşturabileceğini ileri sürmektedir (59). IAP yalnızca erken başlangıçlı GBS hastalıklarını azaltmada etkilidir, geç başlangıçlı enfeksiyonlar, ölü doğumlar veya GBS’ye bağlı prematürite üzerinde belirgin koruyucu etki göstermemektedir (46). Bu sınırlılıklar nedeniyle, gelecekte daha kapsamlı ve kalıcı korunma stratejilerinin geliştirilmesi gerekmektedir. 10.2.AşıGeliştirmeÇalışmaları Maternal antikorların neonatal korumadaki rolü uzun süredir bilinmektedir. Serotip-spesifik kapsüler polisakkarit antikorlarının varlığı, neonatal invaziv GBS enfeksiyon riskini anlamlı düzeyde azaltmaktadır (60). GBS aşı çalışmalarının 10   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III kökeni 1970’lere dayansa da, ilk geliştirilen polisakkarit esaslı aşılar düşük immünojenisite nedeniyle sınırlı kalmıştır. Günümüzde polisakkarit-protein konjuge aşılar ön plandadır; bu stratejiyle gebelerde güçlü bir antikor yanıtı oluşturulmakta ve bu antikorların plasenta aracılığıyla fetüse geçerek pasif bağışıklık sağlaması hedeflenmekte ve böylece yenidoğanın doğum sonrası ilk aylarda GBS enfeksiyonlarına karşı korunması amaçlanmaktadır (61). Transplasental IgG transferi 34. gebelik haftasından itibaren belirginleştiği için, gebelerin 28. haftadan itibaren aşılanması en uygun dönem olarak değerlendirilmektedir. Bu şekilde bebeğe geçen antikorların yaklaşık ilk üç ayda invaziv GBS enfeksiyonlarına karşı koruma sağladığı gösterilmiştir. Bunun yanında yalnızca kapsüler antijenleri değil, Alfa-C ve Rib-A gibi yüzey proteinlerini hedefleyen multikomponent protein bazlı aşı adayları da geliştirilmektedir. Bu proteinlere karşı maternal serum IgG varlığının neonatal koruma ile ilişkili olduğu bildirilmiştir (62). Henüz klinik kullanıma sunulmuş bir GBS aşısı bulunmamakta ise de bu aşılar hem annede kolonizasyonu azaltmayı hem de yenidoğanlarda invaziv hastalıkları önlemeyi hedefleyen geleceğin en umut verici stratejileri arasında değerlendirilmektedir (18). 10.3.Tedavi İntravenöz Penisilin G, Grup B Streptococcus için intrapartum antibiyotik profilaksisinde altın standart olarak kabul edilmektedir (47, 50). Uygulamada genellikle 5 milyon ünite intravenöz yükleme dozu, ardından doğum sonlanıncaya kadar her 4 saatte bir 2.5-3 milyon ünite idame dozu önerilmektedir. Penisilin bulunmadığında ampisilin, 2 g yükleme ve ardından her 4 saatte 1 g idame dozu ile kullanılabilir (47). Beta-laktam alerjisi olan hastalarda, klindamisin veya vankomisin alternatif seçeneklerdir. Ancak klindamisin yalnızca duyarlılık testlerinde hem klindamisine hem de eritromisine duyarlı izolatlarda tercih edilmelidir. Çünkü eritromisin direnci, erm genlerinin varlığı nedeniyle indüklenebilir klindamisin direncini tetikleyebilmektedir. Bu nedenle eritromisine dirençli izolatlarda, klindamisine duyarlılık gösterilse dahi 900 mg IV klindamisin (8 saatte bir) yerine 1 g IV vankomisin (12 saatte bir) önerilmektedir (47, 63). GBS halen penisilin ve diğer β-laktamlara karşı duyarlılığını korumaktadır. Ancak son yıllarda makrolid ve linkozamid grubu antibiyotiklere karşı direnç oranlarında artış bildirilmiştir. (18) Bu nedenle eritromisin artık profilaksi veya tedavide önerilmemektedir (64, 18). Aynı şekilde, kolonize ve invaziv izolatlarda klindamisin direncinde belirgin artış rapor edilmiştir (18,64). Bu nedenle GEBELİKTE STREPTOCOCCUS AGALACTIAE: EPİDEMİYOLOJİ . . .   11 eritromisin profilaksi veya tedavide önerilmemekte, klindamisin direncindeki artış da kullanımını sınırlamaktadır. Bazı çalışmalarda invaziv GBS izolatlarında penisilin ve ampisiline karşı azalmış duyarlılık bildirilmiş olsa da bu bulgu henüz klinik olarak direnç olarak kabul edilmemektedir (18, 65). Nadir çalışmalarda penisilin ve ampisiline karşı azalmış duyarlılık bildirilmişse de bu durum klinik direnç olarak kabul edilmemektedir. (66) Profilaksinin etkinliği açısından antibiyotiğin doğumdan en az 4 saat önce başlanması önerilmektedir. (18) Ancak doğum eylemi hızlı ilerleyen olgularda 4 saatten kısa süreli uygulamaların da fetal enfeksiyon riskini anlamlı düzeyde azalttığı bildirilmiştir. Bu nedenle, aktif doğum eylemi sırasında başvuran gebelere bile antibiyotik başlanması önerilmektedir. 11. Sonuç ve Öneriler Streptococcus agalactiae gebelik ve neonatal dönemde ciddi morbidite ve mortaliteye yol açan, küresel ölçekte önemini koruyan bir patojendir. Erken tanı, etkili tarama ve uygun antibiyotik profilaksisi sayesinde erken başlangıçlı GBS enfeksiyonlarında belirgin bir azalma sağlanmış olsa da geç başlangıçlı hastalıklar, intrauterin komplikasyonlar ve maternal enfeksiyonlar açısından halen önemli bir tehdit oluşturmaktadır. Bu durum, yalnızca antibiyotik profilaksisine dayalı mevcut yaklaşımların kapsayıcılık ve sürdürülebilirlik açısından yetersiz kaldığını göstermektedir. Maternal rektovajinal tarama programlarının standartlaştırılması, antibiyotik direncinin bölgesel izlenmesi ve klindamisin-vankomisin duyarlılığının düzenli olarak raporlanması mevcut koruma stratejilerinin etkinliğini artırmak açısından kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte profilaktik antibiyotiklerin yenidoğan mikrobiyotası üzerindeki olası olumsuz etkileri de dikkate alınmalı ve daha güvenli ve uzun vadeli yaklaşımlara yönelinmelidir. İlerde özellikle maternal aşılama üzerine yoğunlaşmalıdır. Serotip-spesifik veya konjuge GBS aşılarının geliştirilmesi yalnızca neonatal enfeksiyonların değil aynı zamanda maternal kolonizasyonun da azaltılmasını sağlayarak çift yönlü koruma sağlayabilecekir. Sonuç olarak Streptococcus agalactiae enfeksiyonlarının kontrolü sadece obstetrik bir sorun değil aynı zamanda küresel bir halk sağlığı önceliği olarak ele alınmalıdır. Tarama, profilaktif çalışmalar, direnç izlemi ve aşılama yaklaşımlarının içeren bir strateji anne ve yenidoğan sağlığını korumada temel belirleyici olacaktır. 12   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III Kaynakça 1. Prevention of Group B Streptococcal Early-Onset Disease in Newborns: ACOG Committee Opinion, Number 797. Obstet Gynecol. 2020;135(2):e51e72. doi:10.1097/AOG.0000000000003668 2. Morgan JA, Zafar N, Cooper DB. Group B Streptococcus and Pregnancy. In: StatPearls. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; August 11, 2024. 3. Coggins SA, Puopolo KM. Neonatal Group B Streptococcus Disease. Pediatr Rev. 2024;45(2):63-73. doi:10.1542/pir.2023-006154 4. Low JM, Lee JH, Foote HP, Hornik CP, Clark RH, Greenberg RG. Incidence of group B Streptococcus early-onset sepsis in term neonates with second-line prophylaxis maternal intrapartum antibiotics: a multicenter retrospective study. Am J Obstet Gynecol. 2024;230(6):673.e1-673.e8. doi:10.1016/j.ajog.2023.10.035 5. Steer PJ, Russell AB, Kochhar S, Cox P, Plumb J, Gopal Rao G. Group B streptococcal disease in the mother and newborn: a review. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2020;252:526-533. doi:10.1016/j.ejogrb.2020.06.024 6. Madrid L, Seale AC, Kohli-Lynch M, et al. Infant group B Streptococcal disease incidence and serotypes worldwide: systematic review and metaanalyses. Clin Infect Dis. 2017;65(suppl_2):S160-S172. doi:10.1093/cid/cix656 7. Seale AC, Bianchi-Jassir F, Russell NJ, et al. Estimates of the burden of group B Streptococcal disease worldwide for pregnant women, stillbirths, and children. Clin Infect Dis. 2017;65(suppl_2):S200-S219. doi:10.1093/cid/cix664 8. Stephens K, Charnock-Jones DS, Smith GCS. Group B Streptococcus and the risk of perinatal morbidity and mortality following term labor. Am J Obstet Gynecol. 2023;228(5S):S1305-S1312. doi:10.1016/j.ajog.2022.07.051 9. Farley MM. Group B Streptococcal disease in nonpregnant adults. Clin Infect Dis. 2001;33(4):556-561. doi:10.1086/322696 10. Francois Watkins LK, McGee L, Schrag SJ, et al. Epidemiology of invasive group B Streptococcal infections among nonpregnant adults in the United States, 2008-2016. JAMA Intern Med. 2019;179(4):479-488. doi:10.1001/ jamainternmed.2018.7269 11. Andreu A, Sanfeliu I, Barranco M, et al. Group B Streptococcal disease in adults: incidence, clinical spectrum, and outcome. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2003;22(5):314-318. 12. Watkins LK, McGee L, Schrag SJ, et al. Epidemiology of group B Streptococcal disease in the United States, 1999–2019. Clin Infect Dis. 2019;69(10):1740-1747. GEBELİKTE STREPTOCOCCUS AGALACTIAE: EPİDEMİYOLOJİ . . .   13 13. Caliot É, Dramsi S, Chapot-Chartier MP, et al. Role of the group B antigen of Streptococcus agalactiae: a peptidoglycan-anchored polysaccharide involved in cell wall biogenesis. PLoS Pathog. 2012;8(6):e1002756. doi:10.1371/ journal.ppat.1002756 14. Kwatra G, Cunnington MC, Merrall E, et al. Prevalence of maternal colonization with group B Streptococcus: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 2016;16(9):1076-1084. 15. Teatero S, Ferrieri P, Fittipaldi N. Increasing incidence of invasive group B Streptococcus serotype IV infections in adults, United States, 2008– 2015. Emerg Infect Dis. 2015;21(11):1909-1916. 16. Li J, Ji W, Gao K, et al. Molecular characteristics of group B Streptococcus isolates from infants in southern mainland China. BMC Infect Dis. 2019;19(1):812. doi:10.1186/s12879-019-4434-0 17. Burcham LR, Spencer BL, Keeler LR, et al. Determinants of group B Streptococcal virulence potential among vaginal clinical isolates from pregnant women. PLoS One. 2019;14(12):e0226699. doi:10.1371/journal.pone.0226699 18. Verani JR, McGee L, Schrag SJ; Division of Bacterial Diseases, CDC. Prevention of perinatal group B Streptococcal disease: revised guidelines. MMWR Recomm Rep. 2010;59(RR-10):1-36. 19. Shabayek S, Abdellah AM, Salah M, Ramadan M, Fahmy N. Alterations of the vaginal microbiome in healthy pregnant women positive for group B Streptococcus colonization during the third trimester. BMC Microbiol. 2022;22(1):313. doi:10.1186/s12866-022-02730-8 20. Alonso R. Streptococcus agalactiae infections: clinical aspects and treatment. Rev Esp Quimioter. 2018;31(6):498-502. 21. Jung E, Romero R, Suksai M, et al. Clinical chorioamnionitis at term: definition, pathogenesis, microbiology, diagnosis, and treatment. Am J Obstet Gynecol. 2024;230(3S):S807-S840. doi:10.1016/j.ajog.2023.02.002 22. Bogiel T, Ziółkowski S, Domian A, Dobrzyńska Z. An applicaion of real-time PCR and CDC protocol may significantly reduce the incidence of Streptococcus agalactiae infections among neonates. Pathogens. 2022;11(9):1064. doi:10.3390/pathogens11091064 23. Baracco GJ. Infections caused by group C and G Streptococcus (Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis and others): epidemiological and clinical aspects. Microbiol Spectr. 2019;7(3):10.1128/microbiolspec.gpp30016-2018. doi:10.1128/microbiolspec.gpp3-0016-2018 14   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 24. Ahmed N, Tariq P, Naim A. Viridans group Streptococci and dental caries: an overview. Int J Biol Biotech. 2023;20(1):3-16. 25. Bimpong G. Diagnostic evaluation and risk factors of Streptococcus agalactiae infection among pregnant women [doctoral dissertation]. Cape Coast, Ghana: University of Cape Coast; 2023. 26. Liu Y, Liu J. Group B Streptococcus: virulence factors and pathogenic mechanism. Microorganisms. 2022;10(12):2483. 27. Uchiyama S, Sun J, Fukahori K, et al. Dual actions of group B Streptococcus capsular sialic acid provide resistance to platelet-mediated antimicrobial killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(15):7465-7470. doi:10.1073/pnas.1815572116 28. Maisey HC, Doran KS, Nizet V. Recent advances in understanding group B Streptococcus colonization and infection: implications for prevention and treatment. Clin Microbiol Rev. 2008;21(1):123-149. 29. Avci FY, Kasper DL. How bacterial carbohydrates influence the adaptive immune system. Annu Rev Immunol. 2009;28:107-130. 30. Liu GY, Doran KS, Lawrence T, Turkson N, Puliti M, Tissi L, Nizet V. Sword and shield: linked group B Streptococcal β-hemolysin/cytolysin and carotenoid pigment function to subvert host phagocyte defense. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(40):14491-14496. doi:10.1073/pnas.0406143101 31. Baron MJ, Filman DJ, Prophete GA, Hogle JM, Madoff LC. Identification of a glycosaminoglycan binding region of the alpha C protein that mediates entry of group B Streptococci into host cells. J Biol Chem. 2007;282(14):10526-10536. doi:10.1074/jbc.M610616200 32. Cheng Q, Stafslien D, Purushothaman SS, Cleary P. The group B Streptococcal C5a peptidase is both a specific protease and an invasin. Infect Immun. 2002;70(5):2408-2413. doi:10.1128/IAI.70.5.2408-2413.2002 33. Lindahl G, Stålhammar-Carlemalm M, Areschoug T. Surface proteins of Streptococcus agalactiae and related bacteria. Clin Microbiol Rev. 2005;18(1):102-127. 34. Burcham LR, Le Breton Y, Radin JN, et al. Identification of zincdependent mechanisms used by group B Streptococcus to overcome calprotectinmediated stress. mBio. 2020;11(6):e02302-20. doi:10.1128/mBio.02302-20 35. Huang J, Chen C, Yao W, et al. Hyaluronidase contributes to Streptococcus agalactiae invasion. Infect Immun. 2014;82(9):4448-4456. 36. Kolar SL, Kyme P, Tseng CW, et al. Group B Streptococcus hyaluronidase promotes immune evasion. J Biol Chem. 2015;290(14):89108919. GEBELİKTE STREPTOCOCCUS AGALACTIAE: EPİDEMİYOLOJİ . . .   15 37. Zhang T, Tong C, Wang J, Gao S, Li K, Wang X. An analysis of the vaginal microbiota in women positive for group B Streptococcus during the third trimester of pregnancy. BMC Microbiol. 2025;25(1):454. doi:10.1186/ s12866-025-04184-0 38. Maidment TI, Pelzer ES, Borg DJ, et al. Group B Streptococcus vaginal colonisation throughout pregnancy is associated with decreased Lactobacillus crispatus and increased Lactobacillus iners abundance. Front Cell Infect Microbiol. 2024;14:1435745. doi:10.3389/fcimb.2024.1435745 39. Cho CY, Tang YH, Chen YH, et al. Group B Streptococcal infection in neonates and colonization in pregnant women: an epidemiological retrospective analysis. J Microbiol Immunol Infect. 2019;52(2):265-272. 40. Miselli F, Frabboni I, Di Martino M, et al. Transmission of group B Streptococcus in late-onset neonatal disease: a narrative review of current evidence. Ther Adv Infect Dis. 2022;9:20499361221142732. doi:10.1177/20499361221142732 41. Hansen SM, Uldbjerg N, Kilian M, Sørensen UB. Dynamics of Streptococcus agalactiae colonization in women during and after pregnancy. J Clin Microbiol. 2004;42(1):83-89. 42. Yang MJ. Group B Streptococcus infections: clinical spectrum and pathogenesis. Korean J Pediatr Infect Dis. 2011;18(1):1-9. 43. Puopolo KM, Lynfield R, Cummings JJ; Committee on Fetus and Newborn; Committee on Infectious Diseases. Management of infants at risk for group B Streptococcal disease. Pediatrics. 2019;144(2):e20191881. doi:10.1542/peds.2019-1881 44. Stoll BJ, Hansen NI, Sánchez PJ, et al. Early-onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues. Pediatrics. 2011;127(5):817-826. doi:10.1542/peds.2010-2217 45. White CP, Warshawsky B, Ofner M, et al. Invasive group B Streptococcus disease in Ontario, 1992–2001. Can J Infect Dis. 2000;11(2):105-111. 46. Schrag SJ, Verani JR. Intrapartum antibiotic prophylaxis for prevention of perinatal group B Streptococcal disease. Clin Microbiol Rev. 2013;26(2):241256. 47. Richter SS, Heilmann KP, Beekmann SE, et al. Changing epidemiology of group B Streptococcal infection in adults. Clin Infect Dis. 2017;65(8):13731379. 48. Jackson LA, Hilsdon R, Farley MM, et al. Neonatal group B Streptococcal disease: long-term neurologic outcomes. Pediatrics. 1995;95(6):1033-1039. 16   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 49. Mavenyengwa RT, Maeland JA, Moyo SR. Group B Streptococcus colonization and transmission. Afr J Reprod Health. 2010;14(4):65-72. 50. Raabe VN, Shane AL. Group B Streptococcus (Streptococcus agalactiae). Microbiol Spectr. 2019;7(2):10.1128/microbiolspec.gpp3-00072018. doi:10.1128/microbiolspec.GPP3-0007-2018 51. Russell NJ, Seale AC, O’Driscoll M, et al. Maternal colonization with group B Streptococcus and serotype distribution worldwide: systematic review and meta-analyses. Clin Infect Dis. 2017;65(suppl_2):S100-S111. doi:10.1093/ cid/cix658 52. Schuchat A. Group B Streptococcal disease in newborns: a global perspective on prevention. Biomed Pharmacother. 1995;49(1):19-25. doi:10.1016/0753-3322(96)82573-X 53. Zhu Y, Lin XZ. Updates in prevention policies of early-onset group B Streptococcal infection in newborns. Pediatr Neonatol. 2021;62(5):465-475. doi:10.1016/j.pedneo.2021.05.007 54. Lamagni TL, Keshishian C, Efstratiou A, et al. Emerging trends in the epidemiology of invasive group B Streptococcal disease in England and Wales, 1991-2010. Clin Infect Dis. 2013;57(5):682-688. doi:10.1093/cid/cit337 55. Baldan R, Droz S, Casanova C, et al. Group B Streptococcal colonization in elderly women. BMC Infect Dis. 2021;21(1):408. doi:10.1186/ s12879-021-06102-x 56. Shen J, Dotel R, Colaco CMG. A retrospective review of group B Streptococcus bacteremia in Western Sydney, Australia, 2011-2023. IJID Reg. 2025;15:100610. doi:10.1016/j.ijregi.2025.100610 57. Liao Q, Zhang XF, Mi X, Jin F, Sun HM, Wang QX. Influence of group B Streptococcus and vaginal cleanliness on the vaginal microbiome of pregnant women. World J Clin Cases. 2022;10(34):12578-12586. doi:10.12998/ wjcc.v10.i34.12578 58. Seedat F, Stacker B, Madhi SA. Intrapartum antibiotic prophylaxis and neonatal outcomes in low-income countries. Lancet Infect Dis. 2019;19(6):e122-e134. 59. Mazzola G, Murphy K, Ross RP, et al. Modulation of the infant gut microbiota by intrapartum antibiotic prophylaxis. Front Microbiol. 2016;7:1034. 60. Dangor Z, Kwatra G, Izu A, et al. Correlation between maternal serotype-specific capsular antibody and protection against invasive infant GBS disease. Vaccine. 2015;33(48):6793-6799. PSEUDOMONAS AERUGİNOSA: KLİNİK ÖNEMİ VE TANI YÖNTEMLERİ   23 birlikte görülmesi olasıdır (12). Kültür öncesi ön bilgi sağlaması en büyük avantajıdır. 3.1.3.Kültürveİzolasyon Kültür, P. aeruginosa tanısında altın standarttır. Bakteri, kanlı agar, MacConkey agar ve cetrimide agar gibi besiyerlerinde tipik koloni morfolojisi ile tanınabilir. Koloniler genellikle metalik parlaklık gösterir ve ürettiği pigment (piocyanin) sebebi ile mavi-yeşil renkte olabilir. Ayrıca kendine has “üzüm benzeri” koku yayması ise tanı için yol gösterici olabilir (12). 3.1.4.BiyokimyasalTestlerveİdentifikasyon Oksidaz gibi bazı biyokimyasal testler de P. aeruginosa tanısında anlamlı olabilir. Oksidaz pozitifliği, P. aeruginosa’ya özgü olmasa da bazı bakteriler arasından ayrımına yardımcı olabilir. 42 °C’de üreme yeteneği ve pigment üretimi (piocyanin, pyoverdin, pyorubin) gibi özellikler de önemlidir. Bu testler, hızlı ön tanı için kültür bulgularıyla birlikte değerlendirilmesi uygundur (12). 3.1.5.OtomatizeTanıSistemleri Günümüzde birçok laboratuvar, P. aeruginosa tanısında otomatize sistemler (VITEK 2, Phoenix, MicroScan vb.) kullanmaktadır. Bu sistemler, biyokimyasal reaksiyon profillerini analiz ederek hızlı ve güvenilir identifikasyon sağlar. Otomatize yöntemler özellikle yoğun iş yüküne sahip hastanelerde zaman ve iş gücü açısından avantajlıdır (13). 3.2.Moleküler(Genotipik)TanıYöntemleri 3.2.1. Nükleik Asit Amplifikasyon Testleri (PCR, Real-Time PCR, MultipleksPCR) Moleküler teknikler, bakterinin türe özgül korunmuş gen bölgelerini tanımlayarak bakteriye ait genotipik özellikleri net olarak vermektedir. Nükleik asit amplifikasyon yöntemlerinin keşfi, kültüre ihtiyaç duymadan mikroorganizmaları daha hızlı, daha doğru ve daha ucuz olarak saptaması nedeniyle mikroorganizmaların tanımlanmasında kullanılmaktadır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) nükleik asit tanısında en çok tercih edilen yöntemlerden biridir. PCR, DNA varlığını tespit etmeye yönelik bir yöntem olması, enfeksiyon etkenlerini canlı ve/veya ölü hücreden kaynaklanan pozitif test sonucu verebilmektedir (14). Real-time PCR, reaksiyon devam ederken artan floresansın tespit edilmesi ve bu artışın gerçek zamanlı olarak belirlenmesine olanak 24   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III sağlayan aynı zamanda kantitatif PCR (quantitative-PCR) olarak da ifade edilen yöntemdir (15). Multipleks PCR ise tek bir reaksiyon tüpü içerisinde birden fazla etkenin tespit edilmesine fırsat sunmaktadır. Her biri farklı floresan boya ile işaretlenmiş problar kullanılmaktadır. Her boyadan gelen sinyal reaksiyon tüpü içerisindeki farklı bir etken hakkında bilgi vermektedir (15). 3.2.2.İleriMolekülerYöntemler(LAMP,PNA-FISH) Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), PCR yöntemine göre daha hızlı, daha ucuz ve benzer spesifikliğe sahip tanı sağlayan nükleik asit çoğaltma yöntemidir. LAMP, yeni hastalıkların/patojenlerin ortaya çıkması ve mevcut hastalıkların/patojenlerin yeniden ortaya çıkması için tanı ve önleme için etkili bir araçtır (16). Peptid nükleik asit-fluorescence in situ hybridization (PNAFISH) yöntemi, floresan etiketli bir PNA probunun hedef mikroorganizmanın belirli bir 16S veya 23S rRNA dizisine tamamlayıcı bağlanmasına dayanır (17). 3.2.3. Tipleme ve Epidemiyolojik Çalışmalar İçin Yöntemler (PFGE, MLST,MALDI-TOFMS) Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), DNA moleküllerinin daha iyi ayrıştırılması amacıyla elektrik alnının yönü belirli periyotlarda değiştirilen bir elektroforez yöntemidir. İzolatların birbiri ile ilişkisini ortaya koymada altın standart olarak kabul edilmektedir. Enfeksiyon kontrolü, bulaş yollarının belirlenmesi ve salgınların tespiti gibi birçok alanda kullanılmaktadır (15). Çok lokuslu dizi tipleme (MLST), dizi tabanlı bir genotipleme yöntemidir. P. aeruginosa için MLST›de, yedi gen lokusunun ~400 bp uzunluğundaki dizileri, DNA dizilerini belirlemek için PCR ile çoğaltılır. Lokusun DNA dizisi, PubMLST web sitesi aracılığıyla mevcut olan bir dizi allele dayanarak alel ve bakteri türünü belirler (18). Bir diğer alternatif tanımlama yöntemi de Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)’dir. Proteomik analiz yaparak klinik örneklerde bulunan proteinlerin iyonizasyonu sonucunda çok kısa sürede düşük maliyet, yüksek verimlilik ile cins ve tür düzeyinde hızlı tanı koymak için klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında yerini almıştır (18). 3.2.4. Yeni Nesil Yaklaşımlar (Metagenomik Analiz, Tam Genom Dizileme) Metagenomik analiz, özellikle kültüre edilemeyen mikroorganizmaların doğal yaşam ortamlarından direk DNA’larının izole edilmesi ve farklı PSEUDOMONAS AERUGİNOSA: KLİNİK ÖNEMİ VE TANI YÖNTEMLERİ   25 dizileme teknikleri kullanılarak analiz edilmesidir. Polimikrobiyal enfeksiyon örneklerinde kültürden bağımsız olarak P. aeruginosa DNA’sı tespit edilebilir ve var olan diğer mikrobiyal topluluk yapısını ortaya çıkarır (19). Tam genom dizileme (whole-genome sequencing, WGS) ise hem tür tanısı hem de direnç ve virülans genlerinin kapsamlı analizi için giderek daha fazla kullanılmaktadır (20). Bu yöntemler, gelecekte fenotipik testlerin yerini kısmen alabilecek potansiyele sahiptir. Özetle, doğru duyarlılık testi sonuçları, enfeksiyonun etkin bir şekilde tedavi edilebilmesi için kritik önemlidir. Yanlış negatif sonuçlar, tedavi başarısızlığına yol açabileceği gibi, yanlış pozitif sonuçlar da gereksiz antibiyotik kullanımını artırabilir. Bu nedenle, rutin laboratuvarlarda hem fenotipik hem de gerektiğinde moleküler doğrulama yöntemlerinin birlikte kullanılması önerilir (21). 4. Antibiyotik Duyarlılık Testleri Pseudomonas aeruginosa’nın klinik açıdan bu kadar önemli olmasında en kritik etkenlerden biri, çoklu ilaca direnç geliştirme kapasitesidir. Duyarlılık test sonuçlarının mutlaka identifikasyon sonuçları ile birlikte değerlendirilmesi önerilmektedir. Bazı bakteriler antibiyotiklere karşı doğal veya sonradan kazanılmış dirence sahip olabilirler. Örneğin, Gram-negatif bakteriler hücre duvarında bulunan dış membran yapıları nedeniyle vankomisin gibi glikopeptidlere doğal olarak dirençlidir. Benzer şekilde beta-laktam grubu antibiyotikler Gram-negatiflere karşı belirgin post antibiyotik etki göstermezken, P. aeruginosa’ya gösterdikleri uzamış post antibiyotik etkidir (22). Bu sebeplere bağlı olarak doğru antibiyotik duyarlılık testleri hem tedavi planlaması hem de direnç profilinin izlenmesi açısından zorunludur. Klinik laboratuvarlarda uygulanan yöntemler, genellikle Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) veya Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Komitesi (EUCAST) kriterlerine göre standartlaştırılır (23). 4.1DiskDifüzyon(Kirby–Bauer)Yöntemi Disk difüzyonu, antimikrobiyal duyarlılık testine (ADT) yönelik en eski yaklaşımlardan biridir ve rutin klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında en yaygın kullanılan ADT yöntemlerinden biri olmaya devam etmektedir. McFarland 0.5 standardında hazırlanan bakteri süspansiyonu, Müller-Hinton agara yayılır. Tek plağa en fazla altı antibiyotik diski olacak şekilde eklenir. Disklerin etrafında oluşan zon çapları, EUCAST klinik kesme noktası tablolarına göre duyarlı, az duyarlı veya dirençli olarak yorumlanır ve rapor edilir (24). P. aeruginosa için 26   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III imipenem, meropenem, ceftazidim, piperasilin-tazobaktam, aminoglikozitler ve fluorokinolonlar sıklıkla test edilir (25). 4.2MinimumİnhibitörKonsantrasyonuBelirlemeYöntemleri Minimum İnhibitör Konsantrasyonu (MİK), in vitro koşullarda, bir mikroorganizmanın büyümesini tamamen önleyen antimikrobiyal ajanın en düşük konsantrasyon değeridir. MİK belirlemede agar ve seyrelteme (dilüsyon) yöntemleri kullanılmaktadır. Seyreltme yöntemleri, agarda veya sıvı bir ortamda MİK belirlemeyi sağlayan yöntemdir. MİK değerlerini belirlemek için, tüm kantitatif yöntemler agar veya et suyu şeklinde Müller-Hinton ortamını kullanır. Agar seyreltme yönteminde, 1 mL hacimde elde edilen antibiyotik konsantrasyonlarının her biri, 45-50 °C sıcaklıkta 19 mL sıvı Müller-Hinton agar ortamına eklenir ve 9 cm çapında Petri kaplarına dökülür. Sıvı mikrodilüsyon, agar dilüsyonun referans yöntem olduğu mecillinam ve fosfomisin dışında, hızlı üreyen aerop bakterilerin antibiyotik duyarlılık testleri için referans yöntemdir. Makro besiyeri seyreltme yöntemi, geliştirilen ilk yöntemlerden biridir ve halen referans yöntem olarak kullanılmaktadır. Bu test genellikle 1 mL’den fazla besiyeri içeren cam test tüplerinde gerçekleştirilir. Her teste, antimikrobiyal ajan ilave edilmemiş besiyeri içeren iki test tüpü dahil edilmelidir. Bu tüplerden birine test organizması eklenir, diğerine ise organizma eklenmeden besiyeri sterilliğini kontrol etmek için kullanılmalıdır. Mikro besiyeri seyreltme yöntemi, rutin testler için küçük hacimler kullanan makro seyreltme yönteminin bir uyarlamasıdır. 96 kuyucuklu mikrotitre plastik plakalar kullanır. Bu sistemin avantajı, küçük hacimlerde reaktif kullanması ve çok sayıda bakterinin nispeten hızlı bir şekilde test edilmesine olanak sağlamasıdır. Gradyan yöntem; önceden tanımlanmış bir antibiyotik konsantrasyon gradyanı ile emdirilmiş E-test şeritlerinin kullanılmaktadır. Bu yöntem basit ve hızlı olması rutin mikrobiyolojik teşhislerde, uygulanabilir hale getirmiştir. Ancak, son yıllarda şeritler kullanılarak disk difüzyon yönteminin kullanımı önemli ölçüde azalmıştır (26,27). 4.3OtomatizeSistemler Sonuçların yorumlanmasındaki belirsizlikler, iş gücü yoğunluğu ve sonuçların elde edilmesi için gereken uzun süreler nedeniyle, antibiyotik duyarlılık profillerini belirlemek için daha güvenilir ve kullanımı kolay olan otomatik sistemlerin kullanımı yaygınlaşmıştır. Şu anda piyasada, numune işleme sürelerini ve çabayı azaltmayı, sonuçların otomatik olarak PSEUDOMONAS AERUGİNOSA: KLİNİK ÖNEMİ VE TANI YÖNTEMLERİ   27 yorumlanmasını ve laboratuvar bilgi sistemleri ile kolay entegrasyonu hedefleyen sistemler (VITEK®, BD PhoenixTM, SensititreTM, Micro-scan walk away®) bulunmaktadır (28). 4.4MolekülerYöntemler Bu testler tipik olarak birkaç dakikadan birkaç saat içinde sonuç sağlar ve izole edilmiş bakteriler üzerinde yapılmasının yanı sıra, öncül kültür gerektirmeden doğrudan belirli hasta örnekleri üzerinde yapılabilir. Bu tür teşhisler, bir veya az sayıda direnç faktörünü tespit edecek şekilde yapılandırılabilir veya alternatif olarak tek bir numuneden fazla mikroorganizmayı ve direnç genini/mutasyonunu tespit eden sendromik paneller olarak yapılandırılabilir. P. aeruginosa da özellikle antibiyotik direncine neden olan genler (blaVIM, blaNDM, blaKPC, mcr) tespit edilebilir (29). 5. Sonuç Pseudomonas aeruginosa, özellikle yoğun bakım ünitelerinde hastane kaynaklı enfeksiyonların başlıca etkenlerinden biridir. Antimikrobiyal direnç oranlarının artışı, klasik fenotipik yöntemlerle hızlı tanı konulmasını zorlaştırmakta ve tedavi seçeneklerini kısıtlamaktadır (30). Mevcut sınırlamalar, mikroorganizmaların hızlı tespitini sağlayan alternatif tanı yöntemlerine olan ihtiyacı önemli ölçüde vurgulamaktadır. Günümüzde bu sistemler altın standart olarak kabul edilir ve klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarında onlarca yıldır kullanılan son derece güvenilir sistemlerdir. Ancak, bu sistemler çoğunlukla bakteriyel metabolizmaya dayalı değişiklikleri tespit etmeye dayanır ve saf kültür izolatları gerektirir. Bu nedenlerden dolayı, patojenler için antibiyotik duyarlılık profillerini elde etmek uzun zaman alır ve bu da uygun hedefli tedavinin sağlanmasında gecikmeye neden olur (28). Bu nedenle, araştırmalar artık saf klinik izolatlara olan ihtiyacı ortadan kaldırabilen hızlı AST sistemleri geliştirmeye yönelmektedir. Bu yeni sistemler, doğrudan veya numunelerin basit bir ön işleme tabi tutulması yoluyla, hasta numunelerinden veya pozitif kültür numunelerinden doğrudan AST tayini için kullanılabilir. Klasik yöntemlerin (disk difüzyon, MİK tayini, biyokimyasal testler) düşük maliyeti ve kolay ulaşılabilirlik gibi avantajlarına rağmen, genetik düzeyde veri sağlayamadıkları için özellikle direnç genlerinin izlenmesinde yeterli olmamaktadır. 28   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III Sonuç olarak, P. aeruginosa’da antimikrobiyal dirençle mücadelede en etkili strateji; klasik fenotipik testler, ileri düzey moleküler tiplendirme analizleri ile beraber kullanıldığı hibrit bir yaklaşım olacaktır. Bu sayede hem klinisyenlerin tedavi etkinliği hem de enfeksiyon kontrol programları güçlenmesi sağlanırken, hastane kaynaklı salgınların önlenmesi mümkün hale gelecektir. Kaynakça 1. Botelho J, Grosso F, Peixe L. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa–Mechanisms, epidemiology and evolution. Drug Resist Updat. 2019;44:100640. doi:10.1016/j.drup.2019.07.002 2. Oliver A, Rojo-Molinero E, Arca-Suarez J, et al. Pseudomonas aeruginosa antimicrobial susceptibility profiles, resistance mechanisms and international clonal lineages: Update from ESGARS-ESCMID/ ISARPAE Group. Clin Microbiol Infect. 2024;30(4):469-480. doi:10.1016/j. cmi.2023.12.026 3. Lister PD, Wolter DJ, Hanson ND. Antibacterial-resistant Pseudomonas aeruginosa: Clinical impact and complex regulation of chromosomally encoded resistance mechanisms. Clin Microbiol Rev. 2009;22(4):582-610. doi:10.1128/ CMR.00040-09 4. Gürpınar Ö, Köseoğlu-Eser Ö. Pseudomonas aeruginosa resistome and epidemic high-risk clones. Klimik Derg.2022;35(2):55-63. doi:10.36519/ kd.2022.4002 5. Rocha AJ, Barsottini MRDO, Rocha RR, Laurindo MV, Moraes FLLD, Rocha SLD. Pseudomonas aeruginosa: Virulence factors and antibiotic resistance genes. Braz Arch Biol Technol. 2019;62:e19180503. doi:10.1590/1678-43242019180503 6. Qin S, Xiao W, Zhou C, Li W, Li Y, Zhang X. Pseudomonas aeruginosa: pathogenesis, virulence factors, antibiotic resistance, interaction with host, technology advances and emerging therapeutics. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):199. doi:10.1038/s41392-022-01056-1 7. Thi MTT, Wibowo D, Rehm BHA. Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int J Mol Sci. 2020;21(22):8671. doi:10.3390/ijms21228671 8. de Sousa T, Hébraud M, Dapkevicius MLNE, et al. Genomic and metabolic characteristics of the pathogenicity in Pseudomonas aeruginosa. Int J Mol Sci. 2021;22(23):12892. doi:10.3390/ijms222312892 PSEUDOMONAS AERUGİNOSA: KLİNİK ÖNEMİ VE TANI YÖNTEMLERİ   29 9. Yang D, Xu Z, Wang Y, et al. Paeonol attenuates quorum-sensing regulated virulence and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Front Microbiol. 2021;12:692474. doi:10.3389/fmicb.2021.692474 10. Davies J, Davies D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol Mol Biol Rev. 2010;74(3):417-433. doi:10.1128/ mmbr.00016-10 11. Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS. Bailey & Scott’s Diagnostic Microbiology. 14th ed. Elsevier; 2016. 12. Brooks GF, Carroll KC, Butel JS, Morse SA. Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology. 28th ed. McGraw-Hill Education; 2022. 13. van Belkum A, Durand G, Peyret M, et al. Rapid clinical bacteriology and its future impact. Ann Lab Med.2020;40(2):103-113. doi:10.3343/ alm.2013.33.1.14 14. Eser Ö. Moleküler tanı testlerinin direnç tayininde kullanımı: Gramnegatif bakteriler için hızlı moleküler tanı yöntemleri. ANKEM Derg. 2012;26(Ek 2):86-91. 15. Durmaz R, Özgen E, Barış O, eds. Moleküler Mikrobiyoloji Tanı ve Epidemiyoloji. Akademisyen Kitabevi; 2022:99-112. 16. Panno S, Matić S, Tiberini A, et al. Loop mediated isothermal amplification: Principles and applications in plant virology. Plants. 2020;9(4):461. doi:10.3390/plants9040461 17. Oliveira R, Barbosa A, Sousa M, Azevedo NF, Cerqueira L, Almeida C. Using peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA-FISH) to detect Campylobacter spp. in food samples. LWT. 2024;198:115922. doi:10.1016/j.lwt.2022.115922 18. Sawa T, Momiyama K, Mihara T, Kainuma A, Kinoshita M, Moriyama K. Molecular epidemiology of clinically high‐risk Pseudomonas aeruginosa strains: Practical overview. Microbiol Immunol. 2020;64(5):331344. doi:10.1111/1348-0421.12776 19. Uçarlı C. Mikrobiyom analizinde metagenomik yaklaşımlar. In: Yılmaz Ö, ed. Mikrobiyota İçimizdeki Evren.2022:159-171. 20. Kwong JC, McCallum N, Sintchenko V, Howden BP. Whole genome sequencing in clinical and public health microbiology. Pathology. 2015;47(3):199210. doi:10.1097/PAT.0000000000000235 21. Bassetti M, Vena A, Croxatto A, Righi E, Guery B. How to manage Pseudomonas aeruginosa infections. Drugs Context. 2018;7:212527. doi:10.7573/dic.212527 30   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 22. Köksal İ. Antibiyotik duyarlılık testleri: Laboratuvardan kliniğe. ANKEM Derg. 2010;24(Ek 2):159-161. 23. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 34th ed. CLSI supplement M100. CLSI; 2024. 24. Matuschek E, Brown DF, Kahlmeter G. Development of the EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine microbiology laboratories. Clin Microbiol Infect.2014;20(4):O255-O266. doi:10.1111/1469-0691.12373 25. Kahlmeter G, Brown DFJ, Goldstein FW. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) recommendations for the disk diffusion method for antimicrobial susceptibility testing. Clin Microbiol Infect. 2003;9(12):1163-1170. doi:10.1111/j.1469-0691.2006.01454.x 26. Kowalska-Krochmal B, Dudek-Wicher R. The minimum inhibitory concentration of antibiotics: Methods, interpretation, clinical relevance. Pathogens. 2021;10(2):165. doi:10.3390/pathogens10020165 27. Qaiyumi S. Macroand microdilution methods of antimicrobial susceptibility testing. In: Schwalbe R, Steele-Moore L, Goodwin AC, eds. Antimicrobial Susceptibility Testing Protocols. Boca Raton, FL: CRC Press; 2007:75-79. 28. Puttaswamy S, Gupta SK, Regunath H, Smith LP, Sengupta S. A comprehensive review of the present and future antibiotic susceptibility testing (AST) systems. Arch Clin Microbiol. 2018;9(3). doi:10.4172/1989-8436.100083 29. Banerjee R, Patel R. Molecular diagnostics for genotypic detection of antibiotic resistance: current landscape and future directions. JAC Antimicrob Resist. 2023;5(1):dlad018. doi:10.1093/jacamr/dlad018 30. European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). Molecular Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae and Other GramNegative Bacteria. ECDC; 2023. (Erişim tarihi: 23 Ağustos 2025) 31 BÖLÜM III TÜBERKÜLOZ HASTALIĞININ LABORATUVAR TANISINDA MIRNA’LARIN ROLÜ TheRoleOfMirnasInLaboratory DiagnosisOfTuberculosisDisease ZülalAŞÇITORAMAN1&SencelORUÇ2&YaseminÜSTÜNDAĞ3 &BernaERDAL4 1 (Prof.Dr.), Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Elazığ/Türkiye E-mail: [email protected] ORCID:0000-0001-5202-8564 2 (Yük.Lis.Öğr.), Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Elazığ/Türkiye E-mail: [email protected] ORCID: 0009-0007-3449-2989 3 (Prof.Dr.), Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Elazığ/Türkiye E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0002-0002-5510 4 (Doç. Dr.), Namık Kemal Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Tekirdağ/Türkiye E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0003-3378-7926 32   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 1. Giriş Tüberküloz (TB), solunum yolu aracılığıyla bulaşan, kronik seyirli ve ciddi morbidite ile mortaliteye yol açan bir enfeksiyon hastalığıdır. Hastalığın etkeni olan Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), hücre içi yaşam döngüsüne sahip olup özellikle makrofajları enfekte eder. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) verilerine göre, her yıl yaklaşık 10 milyon kişi tüberküloza yakalanmakta ve 1,5 milyon kişi bu hastalık nedeniyle hayatını kaybetmektedir. Bu rakamlar, tüberkülozun günümüzde hâlâ küresel bir halk sağlığı tehdidi olduğunu göstermektedir. (1) Mycobacterium tuberculosis’in en dikkat çekici özelliği, konağın bağışıklık sisteminden kaçma yeteneğidir. Patojen, konak hücre içinde uzun süre latent (gizli) olarak kalabilir ve bağışıklık sisteminin zayıflamasıyla birlikte aktif enfeksiyon oluşturabilir. Enfeksiyonun seyri; bakterinin virülans faktörleri, konağın genetik özellikleri ve immün yanıtın etkinliği gibi faktörlerle belirlenir (2). Tüberkülozun tanı ve tedavisinde önemli ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, hastalığın eradikasyonu hâlen sağlanamamıştır. Özellikle çoklu ilaca dirençli (MDR-TB) ve yaygın dirençli (XDR-TB) tüberküloz formları, küresel ölçekte ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. Bu nedenle, tüberkülozun erken tanısı ve etkili tedavisi için yeni biyolojik belirteçlerin ve moleküler hedeflerin belirlenmesi büyük önem taşımaktadır (3). Son yıllarda yapılan moleküler biyoloji ve genetik araştırmalar, mikroRNA’ların (miRNA) enfeksiyon hastalıklarının patogenezinde kritik düzenleyici roller üstlendiğini ortaya koymuştur. miRNA’lar, gen ekspresyonunu posttranskripsiyonel düzeyde kontrol eden küçük, kodlamayan RNA molekülleridir. Bu moleküller, bağışıklık sistemi hücrelerinin aktivasyonu, farklılaşması ve inflamatuar yanıtlarının düzenlenmesinde etkin rol oynamaktadır (4). Tüberküloz enfeksiyonunda miRNA’ların hem bağışıklık yanıtlarının kontrolünde hem de patojenin hücre içi sağkalımında etkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, miRNA’lar tüberkülozun hem tanısında biyobelirteç hem de tedavisinde hedef molekül olarak değerlendirilmektedir (5). Bu kitap bölümünde, tüberküloz enfeksiyonunun konak hücre miRNA’ları üzerindeki etkileri, miRNA’ların tüberküloz tanısında biyobelirteç olarak kullanım potansiyelleri ve miRNA tabanlı terapötik uygulamalar ayrıntılı biçimde ele alınacaktır (5). TÜBERKÜLOZ HASTALIĞININ LABORATUVAR TANISINDA MIRNA’LARIN ROLÜ   39 ve ilaç dirençli formlar ciddi bir küresel tehdit oluşturmaktadır. Bu durum, yeni biyobelirteçlerin ve tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesini zorunlu kılmaktadır (8). mikroRNA’ların tüberkülozun patogenezinde ve konağın bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesinde merkezi bir rol oynadığını açıkça göstermektedir. miRNA’lar, enfekte hücrelerde otofaji, apoptoz ve sitokin sinyallemesi gibi kritik süreçleri düzenleyerek bakterinin hücre içi sağkalımını etkiler. Bu nedenle, belirli miRNA’ların ekspresyon düzeylerinin incelenmesi, tüberkülozun tanı ve tedavi sürecinde önemli bilgiler sağlayabilir (2). Tüberküloz tanısında miRNA’ların biyobelirteç olarak kullanımı, klasik yöntemlere kıyasla hızlı, özgül ve minimal invaziv bir alternatif sunmaktadır. Ancak bu potansiyelin klinik uygulamaya geçebilmesi için, örnekleme ve analiz protokollerinin standardize edilmesi, büyük hasta gruplarında doğrulama çalışmalarının yapılması gerekmektedir (5). Terapötik açıdan bakıldığında, miRNA’lar konak hedefli tedavi (hostdirected therapy, HDT) stratejilerinin önemli bileşenleri olabilir. Özellikle miRNA inhibitörleri ve mimiklerinin geliştirilmesi, enfeksiyon kontrolünü güçlendirebilir ve mevcut ilaç rejimlerinin etkinliğini artırabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımların güvenliği, spesifikliği ve dokuya hedeflenmesiyle ilgili teknik engellerin aşılması gerekmektedir (6). Gelecekte, genom düzenleme teknolojileri (örneğin CRISPR-Cas sistemleri) ile miRNA tabanlı tedavilerin entegrasyonu, kişiselleştirilmiş tüberküloz tedavilerinin önünü açabilir. Aynı zamanda, yapay zekâ destekli biyoinformatik analizlerin, miRNA biyobelirteçlerinin tanımlanması ve doğrulanmasında önemli bir rol üstleneceği öngörülmektedir (25). Sonuç olarak, miRNA’ların tüberkülozun tanı ve tedavisindeki potansiyeli büyüktür. Bu küçük moleküller, hem hastalığın biyolojisini anlamada hem de yenilikçi tanısal ve terapötik stratejiler geliştirmede geleceğin anahtar bileşenlerinden biri olacaktır. Kaynaklar 1. Daniel EA, Alipoor SD, WHO. Global Tuberculosis Report 2019. Geneva: World Health Organization; 2019. 2. Agrawal P, Upadhyay A, Kumar A. microRNA as biomarkers in tuberculosis: a new emerging molecular diagnostic solution. Diagn Microbiol Infect Dis. 2024;108(1):116082. doi:10.1016/j.diagmicrobio.2023.116082 40   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 3. Wang J, Jia Z, Wei B, et al. MicroRNA-27a restrains the immune response to mycobacterium tuberculosis infection by targeting IRAK4, a promoter of the NF-κB pathway. Int J Clin Exp Pathol. 2017;10(9):9894-9901. Published 2017 Sep 1.. 4. McKiernan PJ, Lynch P, Ramsey JM, Cryan SA, Greene CM. Knockdown of Gene Expression in Macrophages by microRNA Mimic-Containing Poly (Lactic-co-glycolic Acid) Microparticles. Medicines (Basel). 2018;5(4):133. Published 2018 Dec 15. doi:10.3390/medicines5040133 5. Liu F, Chen J, Wang P, et al. MicroRNA-27a controls the intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis by regulating calcium-associated autophagy. Nat Commun. 2018;9(1):4295. Published 2018 Oct 16. doi:10.1038/ s41467-018-06836-4. 6. Felekkis K, Touvana E, Stefanou Ch, Deltas C. microRNAs: a newly described class of encoded molecules that play a role in health and disease. Hippokratia. 2010;14(4):236-240 7. Etna MP, Sinigaglia A, Grassi A, et al. Mycobacterium tuberculosisinduced miR-155 subverts autophagy by targeting ATG3 in human dendritic cells. PLoS Pathog. 2018;14(1):e1006790. Published 2018 Jan 4. doi:10.1371/ journal.ppat.1006790. 8. Tribolet L, Kerr E, Cowled C, et al. MicroRNA Biomarkers for Infectious Diseases: From Basic Research to Biosensing. Front Microbiol. 2020;11:1197. Published 2020 Jun 3. doi:10.3389/fmicb.2020.01197. 9. Kruh-Garcia NA, Wolfe LM, Dobos KM. Deciphering the role of exosomes in tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 2015;95(1):26-30. doi:10.1016/j.tube.2014.10.010 10. Alipoor SD, Tabarsi P, Varahram M, et al. Serum Exosomal miRNAs Are Associated with Active Pulmonary Tuberculosis. Dis Markers. 2019;2019:1907426. Published 2019 Feb 11. doi:10.1155/2019/1907426 11. Wang J, Jia Z, Wei B, et al. MicroRNA-27a restrains the immune response to mycobacterium tuberculosis infection by targeting IRAK4, a promoter of the NF-κB pathway. Int J Clin Exp Pathol. 2017;10(9):9894-9901. Published 2017 Sep 1. 12. Weber JA, Baxter DH, Zhang S, et al. The microRNA spectrum in 12 body fluids. Clin Chem. 2010;56(11):1733-1741. doi:10.1373/clinchem.2010.147405 13. Pedersen JL, Bokil NJ, Saunders BM. Developing new TB biomarkers, are miRNA the answer?. Tuberculosis (Edinb). 2019;118:101860. doi:10.1016/j. tube.2019.101860 TÜBERKÜLOZ HASTALIĞININ LABORATUVAR TANISINDA MIRNA’LARIN ROLÜ   41 14. Liu F, Chen J, Wang P, et al. MicroRNA-27a controls the intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis by regulating calcium-associated autophagy. Nat Commun. 2018;9(1):4295. Published 2018 Oct 16. doi:10.1038/ s41467-018-06836-4 15. Tamgue O, Gcanga L, Ozturk M, et al. Differential Targeting of c-Maf, Bach-1, and Elmo-1 by microRNA-143 and microRNA-365 Promotes the Intracellular Growth of Mycobacterium tuberculosis in Alternatively IL-4/IL-13 Activated Macrophages. Front Immunol. 2019;10:421. Published 2019 Mar 19. doi:10.3389/fimmu.2019.00421 17. Zhou YL, Zhang L, Zhou Z, et al. Antibody Modified NanoparticleMediated Delivery of miR-124 Regulates Apoptosis via Repression the Stat3 Signal in Mycobacterial-Infected Microglia. J Biomed Nanotechnol. 2018;14(12):2185-2197. doi:10.1166/jbn.2018.2650 18. Kumar M, Sahu SK, Kumar R, et al. MicroRNA let-7 modulates the immune response to Mycobacterium tuberculosis infection via control of A20, an inhibitor of the NF-κB pathway. Cell Host Microbe. 2015;17(3):345-356. doi:10.1016/j.chom.2015.01.007 19. Rosas-Taraco AG, Higgins DM, Sánchez-Campillo J, Lee EJ, Orme IM, González-Juarrero M. Local pulmonary immunotherapy with siRNA targeting TGFβ1 enhances antimicrobial capacity in Mycobacterium tuberculosis infected mice. Tuberculosis (Edinb). 2011;91(1):98-106. doi:10.1016/j.tube.2010.11.004 20. Zhang Y, Zhang X, Zhao Z, Zheng Y, Xiao Z, Li F. Integrated bioinformatics analysis and validation revealed potential immune-regulatory miR-892b, miR-199b-5p and miR-582-5p as diagnostic biomarkers in active tuberculosis. Microb Pathog. 2019;134:103563. doi:10.1016/j. micpath.2019.103563 21. van der Ree MH, de Vree JM, Stelma F, et al. Safety, tolerability, and antiviral effect of RG-101 in patients with chronic hepatitis C: a phase 1B, double-blind, randomised controlled trial. Lancet. 2017;389(10070):709-717. doi:10.1016/S0140-6736(16)31715-9 22. Trang P, Wiggins JF, Daige CL, et al. Systemic delivery of tumor suppressor microRNA mimics using a neutral lipid emulsion inhibits lung tumors in mice. Mol Ther. 2011;19(6):1116-1122. doi:10.1038/mt.2011.48 23 Dzmitruk V, Apartsin E, Ihnatsyeu-Kachan A, Abashkin V, Shcharbin D, Bryszewska M. Dendrimers Show Promise for siRNA and microRNA Therapeutics. Pharmaceutics. 2018;10(3):126. Published 2018 Aug 8. doi:10.3390/pharmaceutics10030126 42   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 24. Alexander M, Hu R, Runtsch MC, et al. Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin. Nat Commun. 2015;6:7321. Published 2015 Jun 18. doi:10.1038/ncomms8321 25. Nam GH, Choi Y, Kim GB, Kim S, Kim SA, Kim IS. Emerging Prospects of Exosomes for Cancer Treatment: From Conventional Therapy to Immunotherapy. Adv Mater. 2020;32(51):e2002440. doi:10.1002/ adma.202002440 43 BÖLÜM IV MYCOBACTERIUMTUBERCULOSIS ENFEKSİYONLARINA KARŞI BAĞIŞIKLIK TEPKİLERİNDE MIRNA’LARIN ROLÜ TheRoleOfmiRNASInImmuneResponsesto MycobacteriumTuberculosisInfections Yasemin ÜSTÜNDAĞ1 & Tuğba BAŞTÜRK2 & Zülal AŞÇI TORAMAN3 & Erdem KÖROĞLU4 1 (Prof.Dr.), Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Elazığ/Türkiye, E-mail: [email protected] ORCID:0000-0002-0002-5510, 2 (Yük.Lis.Öğr.), Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Elazığ/Türkiye, E-mail: [email protected] ORCID: 0009-0007-6632-8008 3 (Prof.Dr.), Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,. Elazığ/Türkiye, E-mail: [email protected] ORCID:0000-0001-5202-8564 4(Arş. Gör. Dr.), Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Elazığ/Türkiye, E-mail: erdemkr[email protected], ORCID: 0000-0001-6710-7804 44   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 1. Giriş Tüberküloz (verem) insanlık tarihinin en eski ve en bulaşıcı hastalıklarından birisidir. Etkeni Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis)’tir. Dünyada, çoğunluğu gelişmiş ülkelerde olan vakalar olmak üzere sıklıkla görülmekte ve ölüm oranı da belirgin seviyede yüksek olan bir hastalıktır. Dünyanın yaklaşık 1/3’ünün enfekte olduğu ancak aktif hastalık geliştirmediği tahmin edilmektedir. Ülkemizde 20. yüzyılın ilk yarısında oldukça çok görülmüştür ve ölüm oranları yüksektir. Verem savaş dispanserleri o dönemde kurulmuş ve salgının atlatılmasında etkisi oldukça büyük olmuştur. Bulaş yüzey teması ile değil enfekte kişilerin konuşması, öksürmesi ve hapşırması sırasında M. tuberculosis basillerini içeren enfeksiyöz partiküllerin havaya karışmasıyla çevreye yayılır ve duyarlı kişileri enfekte eder. Bu basiller solunduğunda bir konakçıya girer ve burada solunum mukozasıyla temas eder. Solunum mukozası, antimikobakteriyel peptitler, immünoglobulinler, sitokinler ve kemokinler içeren hava yolu yüzey sıvısı ile kaplıdır. Mikroorganizma solunum mukozasından kaçabilir ve tip II epitel hücreleri, makrofajlar ve dendritik hücreler tarafından oluşturulan alveollere ulaşabilir. Doğal öldürücü hücreler, İnterlökin-2 (IL-2) ile indüklenen degranülasyon ve İnterferonγ (IFN-γ) gibi sitokin sinyallemesi yoluyla hücre sitotoksisitesine aracılık eder. M. tuberculosis’i kontrol eden nötrofiller tarafından sitokinler üretilerek sitotoksisite sağlanır. Monositler, basillerin kaçışını sağlayan apoptotik cisimler üreten makrofajlara farklılaşırken, diğer makrofajlar onu fagosite eder ve enfeksiyonu kontrol eder. Bir kısmı lenfatiklerle lenf düğümlerine giderler ve kan dolaşımı ile akciğer appekslerine, beyine, kemiklere, böbreklere ve diğer organlara yayılırlar. Bağışıklık sistemi 2 hafta ile 2 ay arasında devreye girerek basillerin yok edilmesini sağlamaya çalışır (1,2). M. tuberculosis, solunduğunda hava yolu epitel hücreleri ve fagositik hücrelerden yani nötrofiller, monositler ve dendritik hücrelerden oluşan birinci bağışıklık savunma hattıyla karşı karşıya kalır ve antijen sunumu gerçekleşir. Böylece, mikroorganizmayı hedef alan farklı efektör işlevlerine sahip M. tuberculosis’e özgü antikorların üretildiği ve B lenfositler tarafından sitokin üretiminin gerçekleştiği bağışıklık tepkisi indüklenir. Bu tür bir antikor üretimi, genellikle B lenfositler antikor üreten plazma hücrelerine dönüştüren CD4(+) T lenfositler tarafından aracılık edilir. CD4(+), T hücreleri enfekte hücrelerde mikobakterileri hücre içinde ortadan kaldırmaya yardımcı olurken, sitotoksik hücreler CD8(+) T lenfosit ile tüberküloz basili taşıyan hücreleri doğrudan yok eder. Edinilmiş bağışıklıkta böyle bir kavram, bağışıklık sistemi hücrelerinin MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ENFEKSİYONLARINA KARŞI . . .   45 ve antikorlarının daha önce patojenlere saldırmak üzere eğitildiğini, bunların ilk bağışıklık tepkisine yol açanlara benzer veya farklı olup olmadıklarını ifade eder. Ancak M. tuberculosis çoğalabileceği makrofajları ve nekroza yol açan alveoler epitel hücrelerini ve nötrofilleri manipüle ederek bir konağın bağışıklık tepkisine karşı farklı kaçınma mekanizmaları geliştirmiştir. Ayrıca olduğu M. tuberculosis’in yok edilmesi gereken antijen işlenmesini ve sunumunu da önler, ancak M. tuberculosis bundan kaçar veya bunu tolere eder. Antijen sunumunun olmaması, esas olarak T aracılı bir lenfosit aracılı bağışıklık tepkisini etkiler. M. tuberculosis, PE-PGRS proteinlerini kodlayan genlere sahiptir ve bu sayede bir konakta hayatta kalabilir ve yanıtını olumlu şekilde immünomodüle edebilir. Dolayısıyla, bir konakçının bağışıklık yanıtı yetersizse ve/veya M. tuberculosis bunu doğru şekilde atlatabiliyorsa, bu tür bir enfeksiyon aktif tüberküloza, yani dünya çapında en fazla vakaya neden olan akciğer tüberkülozuna ve akciğer dışı tüberküloza yol açabilir. Bu primer savunma hattı M. tuberculosis’i hızla ortadan kaldırmayı başarırsa enfeksiyon oluşmaz ama başaramazsa fagositler enfekte olur ve M. tuberculosis bu hücreler içinde çoğalır ve başlangıçta çok az klinik belirtiye neden olur veya hiç klinik belirtiye neden olmaz. Bu klinik olarak inaktif enfeksiyon aşamasına Latent tüberküloz denir. Latent aşamaya sahip olanların küçük bir yüzdesi, birincil enfeksiyondan yıllar veya on yıllar sonra aktif tüberküloz aşamasına ilerler (3,4). Basiller primer enfeksiyon sırasında hematojen ve lenfatik yayılıma uğrar, pulmoner ve mediastinal hiler lenf düğümlerini etkiler. Lenfahematojen yayılım yoluyla farklı organlara ulaşabilir, primer enfeksiyon sırasında veya yaşamın ilerleyen dönemlerinde M. tuberculosis reaktivasyonu sırasında ekstrapulmoner tüberküloz ile sonuçlanabilir. Ekstrapulmoner tüberküloz, herhangi bir konakçı vücut organını etkileyebilir, lenf düğümleri en yaygın bölgedir; ancak plevral, nörolojik, osteoartiküler ve/veya genitoüriner tutulumlar da tanımlanmıştır, her biri bağışıklık sistemi tarafından M. tuberculosis’i yok etmek için tetiklenen akut veya kronik bir inflamatuar yanıtla ilişkili belirli bir klinik sunuma sahiptir (1). Şu anda yapılan çalışmaların bir kısmı, yukarıda belirtilen hücresel bağışıklık tepkilerinin çoğunun M. tuberculosis enfeksiyonu sırasında miRNA›lar tarafından düzenlendiğini göstermektedir. Daha da önemlisi, bu biyolojik süreçlerin miRNA’lar aracılığıyla gerçekleşmesi, muhtemelen M. tuberculosis konak bağışıklık hücreleri içinde hayatta kalmak için uyguladığı önemli stratejilerden biridir. Bu sorunlar M. tuberculosis enfeksiyonunu son yıllarda ciddi bir sağlık sorunu haline getirmiştir (4). 46   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III Modern antibiyotiklerin ve aşıların geliştirilmesiyle insanların birçok bulaşıcı hastalığın üstesinden gelmesine yardımcı olmuştur, ancak tüberküloz hala ortadan kaldırılamamıştır. Bu en kısa sürede yeni tedavilerin bulunmasını gerektirmektedir. Bunun başlıca nedenleri, M. tuberculosis’in antibiyotiklerin baskısı altında hızla ilaca dirençli mutasyonlar göstermesi, yeni M. tuberculosis aşılarının ve etkili anti-tüberküloz ilaçlarının geliştirilmesinin uzun sürmesidir. Diğer bir neden ise, binlerce yıl boyunca konakçı ile birlikte yaşamanın yer aldığı evrimsel süreçler sırasında, M. tuberculosis’in konak bağışıklık sisteminin ortadan kaldırılmasını ve öldürülmesini ustaca önlemesini ve makrofajlarda uzun süre hayatta kalmasını sağlayan bir dizi bağışıklık kaçış mekanizması ile evrimleşmiş olmasıdır (5,6). 1.1.M.tuberculosisEnfeksiyonundamiRNA miRNA’lar, hayvanlarda, bitkilerde ve bazı virüslerde bulunan, gen ifadesini mRNA (haberci RNA) düzeyinde olumsuz yönde düzenleyen yaklaşık 22 nükleotid uzunluğunda, tek zincirli, küçük, kodlamayan RNA’ların önemli bir sınıfıdır. Önceden önemsiz oldukları düşünülürdü ancak yapılan çok sayıda çalışma ile bağışıklık hücrelerinin farklılaşmasının, gelişiminin ve aktivasyonunun düzenlenmesine katılarak bağışıklık tepkilerinde çoklu düzenleyici roller üstlendikleri gösterilmiştir. Bağışıklık durumunu, başlama zamanını ve yönünü (aktivasyon veya inhibisyon) modüle ederek M. tuberculosis enfeksiyonu da dahil olmak üzere hastalığa bağışıklık yanıtında görev alır. Transkripsiyon sonrası düzenleyici roller oynarlar ve çok çeşitli hastalıklar için potansiyel biyobelirteçleri ve tedavi hedefidirler. Ayrıca miRNA’lar makrofajlarda, otofaji ve inflamasyon yanıtlarının düzenlenmesi yoluyla tüberküloz enfeksiyonunun seyrini etkiler (6). Olgun miRNA dizilerinin çoğu, kodlamayan RNA’ların intronları veya ekzonları ile primer miRNA’ların (pre-miRNA) intronlarında yer alır. miRNA genlerinin çoğu, her biri yaklaşık 70 nükleotidden oluşan bir veya birkaç kökilmek yapısı içeren büyük pre miRNA’lar olarak RNA polimeraz II tarafından transkripsiyona uğrar. Çekirdekte, pre-miRNA’lar Drosha tarafından premiRNA’lar adı verilen kök-ilmek yapısına kesilir. Exportin 5 tarafından premiRNA’ların sitoplazmaya aktarılmasından sonra Dicer (7) tarafından halkanın yakınında küçük çift sarmallı RNA’lara (dsRNA’lar) ayrılırlar. Daha sonra miRNA dupleksi, RNA-indüklenen susturma kompleksi (RISC) olarak adlandırılan bir ribonükleoprotein kompleksinin oluşumunu destekleyen bir proteine yüklenir. Olgun miRNA’lar, baz eşleşmesi yoluyla hedef mRNA’larının 3’ ucuna MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ENFEKSİYONLARINA KARŞI . . .   47 yönlendirilir ve bu da mRNA çevirisinin ve mRNA bozunmasının blokajıyla sonuçlanır ve böylece protein ekspresyon seviyeleri azalır. İnsanda miRNA›nın hedefle baz eşleşmesi genellikle kusurludur. İntronik miRNA ekspresyonunun düzenlenmesi, konak genlerinin aynı transkripsiyonel düzenlemesi altındadır. Ayrıca transkripsiyon sonrası düzenleyici yollar, hairpin loop’ların stabilitesini veya işlenmesini etkileyebilir. miRNA’ların protein kodlayan genlerin yaklaşık üçte birinin ifadesini düzenlediği tahmin edilmektedir (8). Çalışmalar, farklı virülans faktörleri ifade eden çeşitli M. tuberculosis suşlarına sahip enfekte makrofajlarda miRNA profillerinin önemli ölçüde farklı olduğunu göstermiştir. Konak bağışıklık savunmalarıyla başa çıkmak ve hayatta kalması için uygun bir ortam yaratmak amacıyla M. tuberculosis, miRNA üretimini içeren bir dizi strateji yoluyla virülans faktörü ifadesini değiştirir. 6-kDa büyüklüğünde erken salgılanan antijenik hedef (ESAT6) protein ailesinin bir üyesi olan M. tuberculosis Rv2346c, tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) ve IL-6 üretimini azaltarak Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ile enfekte makrofajlarda miR-155 ve miR-99b’nin artan ifadesini teşvik ederek hücre içi bakteriyel hayatta kalmayı kolaylaştırır. (9). Bazı deneyler, Rv2346c’nin, miR-155 ve miR-99b’nin yukarı düzenlenmesiyle birlikte P38 fosforilasyonunu artırma potansiyeline sahip olduğunu doğrulamıştır. Bu da nükleer faktör kappa B (NF-Κb) aktivasyonunu inhibe ederek TNF-α ve IL-6 üretimini azalttığını göstermektedir (10). Başka bir virülans faktörü olan EsxA, miR-148a ekspresyonunu aşağı düzenleyerek anti-inflamatuar etkileri zayıflatır. Bu da toll benzeri reseptör-4 (TLR-4) NF-κB aktivasyonunu negatif olarak düzenler. Proinflamatuar faktörler TNF-α ve IL-1β’nin ekspresyonunu teşvik ederek patolojiyi şiddetlendirir. Bu arada, virülans faktörü ESX-1’in, makrofajlarda hayatta kalmasını destekleyen yüksek düzeyde IL-6 ve IL-10 salgılanması ile Mycobacterium marinum (M. marinum) ile enfekte RAW264.7 hücrelerinde miR-147–3p ekspresyonunu inhibe ettiği gösterilmiştir. H37Rv suşu enfeksiyonunda miR-147b’nin artan ekspresyonu, makrofajların canlılığında, N-kadherin ekspresyonunda ve göç etme yeteneğinde bir azalmaya yol açmıştır. M. tuberculosis’den gelen MPT64 proteini, NF-kB/miR-21/B hücreli lenfoma-2 yoluyla miR-21 ekspresyonunu artırarak, BCG’den saflaştırılmış protein türevi ile uyarılan RAW264.7 makrofajlarının apoptozunu inhibe edebilir. Böylece antiapoptotik bir rol oynar ve hücre içi bakteriyel hayatta kalmayı destekler. ESAT-6, mikobakteriyel enfeksiyonda ikili bir rol oynar, her ikisi de Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis) veya Mycobacterium bovis (M. bovis), BCG ile enfekte olmuş farklılaşmış THP-1 hücrelerinde miR-30a- 48   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 3p’yi aktive ederek otofagozomu sınırlar ve miR-155’in yukarı düzenlenmesi yoluyla makrofaj apoptozunu teşvik ederek konakçının M. tuberculosis enfeksiyonuna karşı korunmasını artırır. bu da sitokin sinyallemesinin baskılayıcısı 1’in (SOCS1) üretimini sınırlar. Ancak miRs’yi düzenlemesinin spesifik mekanizmasını ortaya koyamamaktadır. Ek olarak, birkaç miRNA M. tuberculosis enfeksiyonunda farklı şekilde ifade edilir ve M. tuberculosis ile konakçı arasındaki etkileşimi etkiler (11). 1.2.M.tuberculosisEnfeksiyonundaYerAlanmiRNA›larınİnflamatuvar Yanıtı miRNA’lar inflamatuvar yanıtında, sitokin sinyal aktivasyonu, monosit ve nötrofillerin çoğalmasını, lenfositlerin gelişimi ve farklılaşmasını düzenleyerek bağışıklık yanıtında kritik bir rol oynar. miRNA ifadesinin düzensizliği enfeksiyon, kanser ve bağışıklık bozuklukları da dahil olmak üzere bazı hastalıklara neden olur. Navarro ve ark.’ları ilk olarak miRNA’ların bakteriyel enfeksiyonun düzenlenmesinde yer aldığını bulmuş ve Arabidopsis thaliana’nın Pseudomonas syringa flagellin türevi peptitleri tanımasının miR393a transkripsiyonunu indüklediğini ve daha sonra üç F-kutusu oksin reseptörünün ifadesini inhibe ettiğini göstermiştir. Taganov ve ark.’ları miR146’nın lipopolisakkarit tarafından indüklenen monosit ThP-1 hücrelerinde TLR-4 ve sitokin sinyallemesini kontrol ederek bağışıklık yanıtını düzenlediğini ve konakçı hücreleri NF-κB›ye bağlı bir şekilde aşırı inflamasyondan koruduğunu göstermiştir (12). Her bir miRNA yüzlerce geni düzenleyebildiğinden, konak miRNA’larının ifadesi geniş hedef gen düzenleyici ağını etkileyebilmektedir. Sonraki çalışmalar, bakteriyel enfeksiyon ( M. tuberculosis dahil ) üzerine miRNA düzenlemesini yaygın bir yanıt olarak belirlemiş, otofaji ve sinyal yollarında, hücre döngüsünde ve hücre apoptozunda yer alan bağışıklık tepkilerinin modülasyonundan oluşan birden fazla konak hücre işlevi için tahminlerde bulunmuştur. Bu nedenle, M. tuberculosis enfeksiyonunda konak miRNA’ların rollerinin incelenmesi, M. tuberculosis’nin patogenezini ortaya koymak ve anti-tüberküloz ilaç hedeflerini bulmak için oldukça önemlidir (13). 1.3. M. tuberculosis Enfeksiyonu Sırasında SinyalYollarının miRNA AracılıDüzenlenmesi Makrofajların ve bağışıklıkta rol oynayan diğer dokuların plazma zarında bulunan bir desen tanıma reseptörleri (PRR) ailesi olan TLR’ler, Gram negatif bakterilerdeki lipopolisakkarit ve tek zincirli RNA’lar gibi MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ENFEKSİYONLARINA KARŞI . . .   55 açabilmektedir. Dahası, araştırmalar hücre içi M. tuberculosis eliminasyonunun otofaji ile ilişkili olabileceğini ve miRNA›ların bu hücresel kargo yok etme taktiği üzerinde kritik bir etki uyguladığını ileri sürmüştür. Tüberküloz enfeksiyonu sırasında, mikobakteriyel DNA, sitozolik DNA sensörü cGAS tarafından tespit edilmektedir. Tanınma üzerine, otofaji ile ilişkili (ATG) proteinler, otofagozomal membran nükleasyonu (Beclin-1, VPS34, ATG14L), otofagozomal uzama ve olgunlaşma (ATG5, ATG12 , ATG16L1 , ATG4B , ATG3, ATG7 , LC3) ve lizozomal yerleştirme ve füzyon (Syntaxin17, UVRAG) dahil olmak üzere ardışık membran yeniden şekillenmesini ve taşıma olaylarını düzenler (28). Şekil 3. Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonu sırasında mikroRNA tarafından düzenlenen otofaji. Mycobacterium tuberculosis tarafından otofaji başlatıldığında , fagoforu oluşturmak için membran çekirdeklenmesi, otofagozom olgunlaşmasını gerçekleştirmek için uzama ve otofagozomlar ile lizozomlar arasında füzyon gibi çeşitli işlemler sırayla gerçekleşir. MikroRNA’lar (miRNA’lar) farklı şekilde ifade edilir ve otofaji ile ilişkili genler (ATG’ler), UV radyasyon direnci ile ilişkili gen (UVRAG), beclin 1 ve mikrotübül ile ilişkili protein 1 hafif zincir 3 (LC3) gibi otofaji içindeki önemli bileşenleri hedefler. CACNA2D3, kalsiyum voltaj kapılı kanal yardımcı alt birimi alfa2delta3; AMPK, adenozin 5’ monofosfatla aktive edilen protein kinaz; TWEAK, tümör nekroz faktörü benzeri zayıf apoptozis indükleyicisi; ULK1, Unc-51 benzeri otofajiyi aktive eden kinaz 1; VPS, vakuolar protein ayrımı; STAT, sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü; KLF, Krupple benzeri faktör. ↑, yukarı düzenlenmiş; ↓, aşağı düzenlenmiş; ⟶, uyarma; ⟶, engelleme. 56   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III Şekil 4. Otofaji mekanizmasının bileşenleri M. tuberculosis enfeksiyonu sırasında miRNA’ların önemli hedefleridir. Örneğin, M. tuberculosis, insan monositleri ve makrofajlarında DNA hasarıyla düzenlenen otofaji modülatörü 2’nin (DRAM2) 3’-UTR’sini doğrudan hedef alan MIR144*/miR-144–5p ekspresyonunu indükler. Otofaji modülatörü 2, otofajik mekanizmanın temel bileşenleriyle etkileşime girer ve otofaji aktivasyonu, fagozomal olgunlaşma ve M. tuberculosis’i ortadan kaldırma için gereklidir. MIR144* indüklenen Otofaji modülatörü 2 inhibisyonu, insan birincil monositlerinde azalmış otofaji indüksiyonu ve otofajik akışla ilişkilidir. MIR144 seviyeleri, sağlıklı kontrollerle karşılaştırıldığında tüberküloz hastalarından alınan PBMC’lerde azalmış, otofaji modülatörü 2 seviyeleriyle artmıştır. Özellikle, miR-144* düzeyi, bir miRNA profilleme çalışmasında gösterildiği gibi tüberküloz hastalarının PBMC’lerinde yukarı düzenlenmiştir. M. tuberculosis enfeksiyonu tarafından aşağı düzenlenen miRNA’lar ayrıca otofaji modülasyonunda da rol oynar. Örneğin, M. tuberculosis enfeksiyonu, M. tuberculosis ile enfekte makrofajlarda PKCδ ve STAT3’ü aşağı düzenleyerek otofaji için pozitif bir düzenleyici olduğu belirtilen miR-17–5p’nin aşağı düzenlenmesine yol açar. M2 polarizasyonunu yönlendiren ve otofajiyi ve M. tuberculosis’in lizozomlara taşınmasını önleyen bir transkripsiyon faktörü olan KLF4, miR-26a tarafından hedeflenir (23). MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ENFEKSİYONLARINA KARŞI . . .   57 1.7.DendritikHücreFonksiyonununDüzenlenmesi Birkaç miRNA, M. tuberculosis enfeksiyonuna karşı bağışıklık tepkisinde dendritik hücre işlevini düzenlemedeki rolleriyle tanınmıştır. Örneğin, M. tuberculosis tarafından indüklenen miRNA, enfekte dendritik hücrelerde antijen sunumunu baskılayabilir. M. tuberculosis, mikroorganizmalar arasında en yüksek lipid bileşenlerini içerdiğinden, MHC benzeri glikoproteinler olan CD1 molekülleri tarafından lipid antijen sunumu, M. tuberculosis’e karşı adaptif bağışıklık tepkilerinin indüklenmesi için oldukça önemlidir. Tüberküloz hastalarında ve BCG ile enfekte dendritik hücrelerde yukarı düzenlenen bir miRNA olan miR-381–3p›nin dendritik hücrelerdeki CD1c›yi hedef aldığı öne sürülmüştür. Böylece dendritik hücrelerde miR-381–3p›nin inhibisyonu, BCG ile enfekte DC’ler tarafından T hücresi aktivasyonunu artırır. M. tuberculosis ile enfekte DC’lerde ve makrofajlarda yukarı düzenlenen bir miRNA olan miR99 b, TNF-a ve TNFRSF-4 ekspresyonunu hedef alarak dendritik hücrelerde proinflamatuar sitokin üretimini baskılamıştır (29) . 1.8.miRNADüzenleyiciAğı M. tuberculosis enfeksiyonuna yanıt olarak miRNA değişimini inceleyen bir çalışma, sağlıklı donörlerden alınan M. tuberculosis ile enfekte dendritik hücrelerdeki miRNA ifadesinin, miRNA›ların yaklaşık %40›ının farklı şekilde ifade edildiğini ortaya koydu. İlginç bir şekilde, miRNA›ların %3›ü histon modifikasyonu ile promotora özgü bir bölgede zenginleştirilmiştir. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, tam kandaki M. tuberculosis enfeksiyonunun, gen yukarı regülasyonu yerine baskın olarak gen ifadesinin baskılanmasıyla sonuçlandığını gösterdi; bu farklı şekilde ifade edilen miRNA’larla ilişkilidir ve M. tuberculosis enfeksiyonunun miRNA’lar aracılığıyla gen ifadesi üzerindeki inhibe edici rolünü göstermektedir. M. tuberculosis ile enfeksiyonu takiben kemik iliğinden türetilen makrofajların transkripsiyonel yanıtı karakterize edildi ve farklı şekilde ifade edilen genler ile miRNA’lar arasındaki ilişki analiz edildi. Gen ekspresyon imzalarıyla ilişkili 77 miRNA arasında, 4 yukarı düzenlenmiş (miR-24, miR-142, miR-155 ve miR-212) ve 3 aşağı düzenlenmiş (miR-19a, miR-202 ve miR-376a) miRNA dahil olmak üzere 7 miRNA aracılı transkripsiyonel baskılama tahmin edilmektedir. Büyük mikrodizi veri kümelerinden elde edilen miRNA-mRNA eş-düzenleyici ağı, FCGR1A ve CEBPB dahil olmak üzere 21 (19 yukarı düzenlenmiş ve 2 aşağı düzenlenmiş) farklı şekilde ifade edilen genin transkripsiyon faktörleri ve miRNA’lar tarafından eş-düzenlendiğini gösterdi (30) . 58   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 1.9.M.tuberculosisEnfeksiyonunaYanıtOlarakmiRNAEkspresyon Profili Mdalardo T ve arkadaşları tarafından enfeksiyondan 30 ve 60 gün sonra deneysel olarak M. tuberculosis ile enfekte edilen farelerin akciğerlerindeki miRNA ekspresyon profilleri rapor edilmiştir. miR-135 b, miR-21, miR155, miR-146a ve miR-146 b’nin, M. tuberculosis ile enfekte olmuş farelerin akciğerlerinden alınan lökosit alt gruplarında farklı şekilde ifade edildiği daha da doğrulanmıştır. Virülan M. tuberculosis ve virülan olmayan suşla enfekte olmuş birincil insan monosit kaynaklı makrofajlarda ve THP-1 hücrelerinde farklı şekilde ifade edilen miRNA’lar kullanılmıştır. miR-212, M. tuberculosis ile enfekte olmuş THP-1 hücrelerinde virülan M. tuberculosis‘e özgü bir yanıt göstermiştir. İnsan dendritik hücrelerinin genom çapındaki miRNA transkripsiyonel yanıtları, miR-132/212 ailesinin M. tuberculosis virülansına bağlı olarak M. tuberculosis enfeksiyonlarına yanıt olarak indüklendiğini ortaya koydu. Mycobacterium tuberculosis’in hücre duvarı eksik formları, konağın bağışıklık sistemine belirgin bir direnç kazandırır. miR-29 b, Ifng mRNA düzeylerinin baskılanmasıyla ilişkili olabilecek CWD-M. M. tuberculosis grubunda yukarı düzenlendi (31). 1.10.KlinikörneklerdemiRNAprofillemesi Periferik kan ve çoğaltılmış hücre popülasyonları biyobelirteç keşfi için sıklıkla kullanıldığından , M. tuberculosis’li hastalarda periferik kan ve türetilmiş hücrelerin miRNA analizleri için dizi ve aday tabanlı global yaklaşımlar uygulandı. Tüberküloz hastalarından alınan PBMC’lerin global miRNA profillemesi, çeşitli miRNA’ların güçlü şekilde yukarı düzenlenmiş ekspresyonunu (miR-424, miR-155 ve miR-155*) ve aşağı düzenlenmiş ekspresyonunu (miR-146a) gösterdi. Çocuk M. tuberculosis hastalarından alınan PBMC’lerin miRNA profillemesi, miR-1, miR-155, miR-31, miR-146a, miR-10a, miR-125 b ve miR-150’nin aşağı düzenlendiğini ve miR-29’un M. tuberculosis ‘li çocuklarda yukarı düzenlendiğini ortaya koydu. Özellikle, latent veya aktif tüberkülozlu hastalardan ve sağlıklı kontrollerden alınan PBMC’lerin miRNA profillemesi, aktif ve latent tüberküloz arasında 7 farklı şekilde ifade edilen miRNA’yı (miR-130 b*, miR-21*, miR-223, miR-302a, miR-424, miR451, miR-486–5p) ortaya koymuştur (32) . Ekzosomlar veya mikroveziküllerle ilişkili plazma miRNA›ları, hücreler arası iletişimin bir parçası olarak biyolojik işlevler gerçekleştirebilir ve insan hastalıkları için biyobelirteç oldukları ileri sürülmektedir. Tüberküloz MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ENFEKSİYONLARINA KARŞI . . .   59 hastalarının serumunda mikroRNA miR-16 ve miR-155 düzeyleri değişmiştir ve tedaviye verilen yanıtlarla ilişkilidir. Plazma miRNA profilleme çalışmalarında, tüberküloz hastalarının plazmasında let-7b-5p, miR-30 b-5p dahil olmak üzere farklı şekilde ifade edilen miRNA’lar tanımlanmıştır. miR-769–5p, miR-320a ve miR-22–3p’nin M. tuberculosis’de tanısal değere sahip olduğu ileri sürülmektedir. miR-183’ün M. tuberculosis hastalarından alınan serum örneklerinde arttığı ve bu hastalardaki makrofaj aktivitesiyle ilişkili olduğu bulunmuştur (33). Tüberküloz hastalarının plevral efüzyonlarında , idrar ve balgam örneklerinde miRNA profilleri de analiz edilmiştir. Plevral efüzyonların miRNA ekspresyon desenleri, pnömoni veya akciğer kanseri olan hastalarla karşılaştırıldığında tüberküloz hastalarında miR-378i’nin yukarı regülasyonunu ortaya koymuştur. Daha sonra, tüberküloz hastalarının ve iyi huylu lezyonlu hastaların plevral efüzyonlarında farklı ifade edilen ekzosomal miRNA’lar (miR148a-3p, miR-451a ve miR-150–5p) tanımlanmıştır. Tüberküloz hastalarının plevral sıvılarından (PFMC) elde edilen mononükleer hücreler, miR-223, miR144* ve miR-421 ve miR-146a’nın aşağı regüle edilmiş ekspresyonu ile sağlıklı kontrollerden farklı miRNA imzaları göstermiştir. İdrardaki miR-625–3p düzeyi, yayma pozitif hastalarda yayma negatif hastalara göre önemli ölçüde artmıştı ve bu da tanı değerini gösteriyordu (34). Tarama çalışmalarının uyumsuzluğu nedeniyle, tüberküloz tanısı için ortak miRNA biyobelirteçleri şu ana kadar tanımlanamamıştır. Tarama çalışmalarında, özellikle dolaşımdaki miRNA’larda tutarsızlık olması birkaç nedenle açıklanabilir. Başlıca nedenler arasında küçük çalışma grubu boyutları, kompleks çalışma tasarımları ve aday seçimi için yetersiz istatistiksel değerlendirme yer alır. Bir diğer kafa karıştırıcı faktör, dolaşımdaki miRNA’ların alıcı hücreler tarafından alınmasından kaynaklanabilecek yüksek derecede bireyler arası değişkenlik olması gerçeğidir. Ayrıca, örneklerin pre-analitik işlenmesindeki farklılıklar ve belirlenmiş endojen kontrollerin olmaması sonuçların karşılaştırılabilmesini sınırlar. Ek olarak, moleküler tipleme çalışmaları tarafından önerildiği gibi, M. tuberculosis’in genetik soy hatları , virülans ve ilaç direnci profilleri farklı coğrafi bölgeler arasında farklıdır (35). 1.11.miRNAPolimorfizmiveM.tuberculosisDuyarlılığı miRNA’ların M. tuberculosis enfeksiyonuna karşı bağışıklık tepkilerindeki düzenleyici rolü nedeniyle, miRNA’lardaki tek nükleotid polimorfizmleri hedef seçimini ve ekspresyonunu değiştirebilir ve bu da işlevsel değişikliklere neden 60   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III olabilir. TLR sinyal yolunda yer alan 2 SNP, rs2910164 (miR-146a G > C) ve rs3746444 (miR-499 T > C), 337 M. tuberculosis vakasında ve 318 Tibetli ve 757 Han bireyleri de dahil olmak üzere 738 sağlıklı kontrolde analiz edildi. Bir polimorfizm (miR-146a G > C), hem Tibetli hem de Han popülasyonlarında M. tuberculosis riskiyle bir ilişki olduğunu gösterdi. Tibet popülasyonunda miR-499 T > C ile M. tuberculosis arasında bir ilişki gözlemlendi ve C alelini taşıyan bireyler artmış M. tuberculosis riski sergiledi. Ancak, diğer çalışmalarda gösterildiği gibi ne miRNA-499 rs3746444 ne de miRNA-146a rs2910164 İran popülasyonunda M. tuberculosis riskiyle ilişkilendirilmiştir [ 115 , 116 ]. miR-499 T > C SNP’si Çin Uygur popülasyonundadır ve miR-146a C > G, miR-196a2 T > C Çin Kazak popülasyonunda M. tuberculosis riskiyle ilişkilendirilmiştir [ 117 ]. Son zamanlarda yapılan iki meta-analiz çalışması miR-146a G > C ve miR-499 T > C SNP’lerinin M. tuberculosis ile ilişkili olmadığını göstermektedir [ 118 , 119 ]. Ek olarak, miR-632 içindeki rs3742330 A > G, Çin Tibetli popülasyonunda M. tuberculosis için %27 oranında azalmış bir riskle ilişkilendirilmiştir (%95 CI 0,55–0,97, P = 0,03) (24,36). 2. Sonuç M. tuberculosis’e karşı konak bağışıklık yanıtında miRNA’ların ortaya çıkan rolleri M. tuberculosis enfeksiyonda büyük önem göstermeye başlamaktadır. Bu zamana kadar olan çalışmalar miRNA’ların konak bağışıklık yanıtlarını düzenleyen rollerini ve mekanizmalarını ortaya çıkarmış ve M. tuberculosis enfeksiyonunda konak-patojen etkileşiminin daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır. miRNA’lar antimikrobiyal yanıtlar, sitokin üretimi ve otofaji gibi bazı önemli mekanizmalar makrofajlarda rol almış olsa da, özellikle dokudaki dendritik hücreler, alveolar makrofajlar, nötrofiller, B hücreleri, düzenleyici T hücreleri, NK hücreleri, doğuştan gelen lenfoid hücreler ve solunum yolu epitel hücreleri gibi bağışıklık hücresi popülasyonlarında M. tuberculosis ile ilişkili miRNA’ların ifade profili ve düzenleyici etkisi hakkında çok az şey bilinmektedir. Ayrıca, miRNA’ların M. tuberculosis enfeksiyonuna karşı bağışıklık yanıtının düzenlenmesindeki rolü hakkındaki bilgi de sınırlıdır. Ayrıca, birçok çalışma, M. tuberculosis ile sağlıklı bireyler veya aktif ve latent M. tuberculosis arasında ayrım yapabilen farklı şekilde ifade edilen miRNA’ları ortaya çıkarmış ve bu da miRNA’ların M. tuberculosis tanısı için biyobelirteç olarak potansiyel faydasına dair önemli katkılar sağlamıştır. Ancak, miRNA’ların M. tuberculosis tanısı için biyobelirteç olarak kullanımı sınırlıdır. Dolaşım veya doku miRNA biyobelirteçlerini belirlemeyi amaçlayan klinik çalışmalar, M. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ENFEKSİYONLARINA KARŞI . . .   61 tuberculosis tanısını ve yönetimini potansiyel olarak iyileştirebilir. Bu nedenle, miRNA dağıtımının tüberküloz tedavisinde potansiyel kullanımının daha fazla araştırılması gerekmektedir. M. tuberculosis immünolojisini anlamak, yeni tanı ve tedavi araçları geliştirmek için önemlidir ve etkili bir tüberküloz aşısı geliştirmenin temelini oluşturur. Bu hastalık üzerine yapılan araştırmalar, mikobakterilerin karmaşık yapısının daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırır çünkü bu, olağan konak hücre işlevlerini etkiler. Birlikte ele alındığında, bu patojenin ortadan kaldırılmasına ve hastalık gelişiminin önlenmesine yol açar. Eğitimli bağışıklık, insanların mikobakterilere karşı kısmi korumasından da sorumlu gibi göründüğü için göz ardı edilmemelidir. Konak bağışıklık sistemi, tüberküloz basilinin ilerlemesini ve patogenezini durdurmak için geniş bir mekanizma yelpazesi kullanır. Ancak patojen, doğrudan bağışıklık tepkimizden kaçınmaya odaklanarak kendi savunma sistemini geliştirmiştir ve bu nedenle bu incelemede açıklanan klinik belirtilerin gelişmesine yol açmıştır. Granülom oluşumu M. tuberculosis büyümesini kontrol edebilir, ancak artık mikobakterilerin granülomları kendi avantajları için ele geçirebileceği, böylece bağışıklık tepkisini değiştirebileceği ve başlangıçtaki bir pulmoner odaktan hematojen, bronkojenik ve lenfatik yollar aracılığıyla yayılmalarını sağlayabileceği düşünülmektedir. Yeni tedavilerin ve aşıların geliştirilmesi için daha fazla klinik araştırmalara ihtiyaç duyulmaktadır. 3.Kaynakça 1. Fogel N. Tuberculosis: A disease without boundaries. Tuberculosis. 2015;95(5):527-531. doi:https://doi.org/10.1016/j.tube.2015.05.017 2. Divangahi M, Chen M, Gan H, et al. Mycobacterium tuberculosis evades macrophage defenses by inhibiting plasma membrane repair. Nat Immunol. 2009;10(8):899-906. doi:10.1038/ni.1758 3. Moreno GB. Primoinfeccion tuberculosa. Patogenia y clinica. Arch Bronconeumol. 1983;19(6):238-247. doi:https://doi.org/10.1016/S03002896(15)32276-6 4. Dijkman K, Sombroek CC, Vervenne RAW, et al. Prevention of tuberculosis infection and disease by local BCG in repeatedly exposed rhesus macaques. Nat Med. 2019;25(2):255-262. doi:10.1038/s41591-018-0319-9 5. Krol J, Loedige I, Filipowicz W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 2010;11(9):597-610. doi:10.1038/nrg2843 62   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 6. Eulalio A, Schulte L, Vogel J. The mammalian microRNA response to bacterial infections. RNA Biol. 2012;9(6):742-750. doi:10.4161/rna.20018 7. Saliminejad K, Khorram Khorshid HR, Soleymani Fard S, Ghaffari SH. An overview of microRNAs: Biology, functions, therapeutics, and analysis methods. J Cell Physiol. 2019;234(5):5451-5465. doi:10.1002/jcp.27486 8. Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 2004;116(2):281-297. doi:10.1016/S0092-8674(04)00045-5 9. gianni. MicroRNA-708-5p regulates mycobacterial vitality and the secretion of inflammatory factors in Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages by targeting TLR4. European Review. September 30, 2019. Accessed June 29, 2025. https://www.europeanreview.org/article/19019 10. Rothchild AC, Sissons JR, Şafiani Ş, et al. MiR-155–regulated molecular network orchestrates cell fate in the innate and adaptive immune response to Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci. 2016;113(41):E6172-E6181. doi:10.1073/pnas.1608255113 11. Singh Y, Kaul V, Mehra A, et al. Mycobacterium tuberculosis Controls MicroRNA-99b (miR-99b) Expression in Infected Murine Dendritic Cells to Modulate Host Immunity *. J Biol Chem. 2013;288(7):5056-5061. doi:10.1074/ jbc.C112.439778 12. Xiao X, Min JL, Lin WZ, Liu Z, Cheng X, Chou KC. IDrugTarget: Predicting the interactions between drug compounds and target proteins in cellular networking via benchmark dataset optimization approach. J Biomol Struct Dyn. 2015;33(10):2221-2233. doi:10.1080/073 91102.2014.998710 13. Taganov KD, Boldin MP, Chang KJ, Baltimore D. NF-κB-dependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses. Proc Natl Acad Sci. 2006;103(33):12481-12486. doi:10.1073/pnas.0605298103 14. Ciesielska A, Matyjek M, Kwiatkowska K. TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling. Cell Mol Life Sci. 2021;78(4):1233-1261. doi:10.1007/s00018-020-03656-y 15. Horng T, Barton GM, Flavell RA, Medzhitov R. The adaptor molecule TIRAP provides signalling specificity for Toll-like receptors. Nature. 2002;420(6913):329-333. doi:10.1038/nature01180 16. Kawasaki T, Kawai T. Toll-Like Receptor Signaling Pathways. Front Immunol. 2014;5. doi:10.3389/fimmu.2014.00461 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ENFEKSİYONLARINA KARŞI . . .   63 17. Marongiu L, Gornati L, Artuso I, Zanoni I, Granucci F. Below the surface: The inner lives of TLR4 and TLR9. J Leukoc Biol. 2019;106(1):147160. doi:10.1002/JLB.3MIR1218-483RR 18. Liu Y, Wang X, Jiang J, Cao Z, Yang B, Cheng X. Modulation of T cell cytokine production by miR-144* with elevated expression in patients with pulmonary tuberculosis. Mol Immunol. 2011;48(9):1084-1090. doi:10.1016/j. molimm.2011.02.001 19. Zhang ZM, Zhang AR, Xu M, Lou J, Qiu WQ. TLR-4/miRNA32-5p/FSTL1 sinyallemesi, Mycobacterium tuberculosis ile enfekte olmuş makrofajlarda mikobakteriyel sağkalımı ve inflamatuar yanıtları düzenler. Exp Cell Res. 2017;352(2):313-321. doi:10.1016/j.yexcr.2017.02.025 20. Kogan D, Grabner A, Yanucil C, Faul C, Ulaganathan VK. STAT3enhancing germline mutations contribute to tumor-extrinsic immune evasion. J Clin Invest. 2018;128(5):1867-1872. doi:10.1172/JCI96708 21. Weng Q, Zhao M, Zheng J, et al. STAT3 dictates β-cell apoptosis by modulating PTEN in streptozocin-induced hyperglycemia. Cell Death Differ. 2020;27(1):130-145. doi:10.1038/s41418-019-0344-3 22. Yao J, Du X, Chen S, et al. Rv2346c enhances mycobacterial survival within macrophages by inhibiting TNF-α and IL-6 production via the p38/ miRNA/NF-κB pathway. Emerg Microbes Infect. Published online December 1, 2018. doi:10.1038/s41426-018-0162-6 23. Li S, Yue Y, Xu W, Xiong S. MicroRNA-146a Represses MycobacteriaInduced Inflammatory Response and Facilitates Bacterial Replication via Targeting IRAK-1 and TRAF-6. PLOS ONE. 2013;8(12):e81438. doi:10.1371/ journal.pone.0081438 24. Hmama Z, Peña-Díaz S, Joseph S, Av-Gay Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 2015;264(1):220-232. doi:10.1111/imr.12268 25. Lamkanfi M, Dixit VM. Manipulation of Host Cell Death Pathways during Microbial Infections. Cell Host Microbe. 2010;8(1):44-54. doi:10.1016/j. chom.2010.06.007 26. Fujita N, Hayashi-Nishino M, Fukumoto H, et al. An Atg4B Mutant Hampers the Lipidation of LC3 Paralogues and Causes Defects in Autophagosome Closure. Mol Biol Cell. 2008;19(11):4651-4659. doi:10.1091/ mbc.e08-03-0312 27. Sun Q, Shen X, Wang P, Ma J, Sha W. Targeting cyclophilin-D by miR-1281 protects human macrophages from Mycobacterium tuberculosis- 64   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III induced programmed necrosis and apoptosis. Aging. 2019;11(24):12661-12673. doi:10.18632/aging.102593 28. Xu J, Wang ,Yanfei, Tan ,Xiaorong, and Jing H. MicroRNAs in autophagy and their emerging roles in crosstalk with apoptosis. Autophagy. 2012;8(6):873-882. doi:10.4161/auto.19629 29. Chaly Y, Marinov AD, Oxburgh L, Bushnell DS, Hirsch R. FSTL1 promotes arthritis in mice by enhancing inflammatory cytokine/chemokine expression. Arthritis Rheum. 2012;64(4):1082-1088. doi:10.1002/art.33422 30. Liang C, Feng P, Ku B, et al. Autophagic and tumour suppressor activity of a novel Beclin1-binding protein UVRAG. Nat Cell Biol. 2006;8(7):688-698. doi:10.1038/ncb1426 31. Behura A, Das M, Kumar A, et al. ESAT-6 impedes IL-18 mediated phagosome lysosome fusion via microRNA-30a upon Calcimycin treatment in mycobacteria infected macrophages. Int Immunopharmacol. 2021;101:108319. doi:10.1016/j.intimp.2021.108319 32. Wu Z, Lu H, Sheng J, Li L. Inductive microRNA-21 impairs anti-mycobacterial responses by targeting IL-12 and Bcl-2. FEBS Lett. 2012;586(16):2459-2467. doi:10.1016/j.febslet.2012.06.004 33. Qu Y, Ding S, Ma Z, et al. MiR-129-3p favors intracellular BCG survival in RAW264.7 cells by inhibiting autophagy via Atg4b. Cell Immunol. 2019;337:22-32. doi:10.1016/j.cellimm.2019.01.004 34. Holla S, Kurowska-Stolarska ,Mariola, Bayry ,Jagadeesh, and Balaji KN. Selective inhibition of IFNG-induced autophagy by Mir155and Mir31responsive WNT5A and SHH signaling. Autophagy. 2014;10(2):311-330. doi:10.4161/auto.27225 35. Chen Z, Wang T, Liu Z, et al. Inhibition of Autophagy by MiR-30A Induced by Mycobacteria tuberculosis as a Possible Mechanism of Immune Escape in Human Macrophages. Jpn J Infect Dis. 2015;68(5):420-424. doi:10.7883/yoken.JJID.2014.466 36. Yoon JH, Her S, Kim M, Jang IS, Park J. The expression of damageregulated autophagy modulator 2 (DRAM2) contributes to autophagy induction. Mol Biol Rep. 2012;39(2):1087-1093. doi:10.1007/s11033-011-0835-x 37. Guirado E, Schlesinger LS, Kaplan G. Macrophages in tuberculosis: friend or foe. Semin Immunopathol. 2013;35(5):563-583. doi:10.1007/s00281013-0388-2 38. Guirado E, Schlesinger LS, Kaplan G. Macrophages in tuberculosis: friend or foe. Semin Immunopathol. 2013;35(5):563-583. doi:10.1007/s00281013-0388-2 BAKTERİYOFAJLAR   71 RNA virüsü yapısına sahip olan Leviviricetes sınıfı ile tek zincirli DNA içeren Microviridae gibi gruplar, Caudoviricetes dışındaki bakteriyofaj çeşitliliğini yansıtmaktadır (21). Bakteriyofaj sınıflandırmasında yalnızca morfolojik ve genetik veriler değil; konak özgüllüğü, yaşam döngüsü tipi (lizojenik veya liytik), genom büyüklüğü, kapsid simetrisi gibi parametreler de dikkate alınmakta, sınıflandırmalar çok yönlü veri kümeleriyle desteklenmektedir (22). Bu bütüncül yaklaşım, sadece filogenetik ilişkilere değil, aynı zamanda biyolojik işlevlere dayalı sistematik değerlendirmelere de olanak tanımaktadır. 4. Bakteriyofajların Morfolojisi Bakteriyofajlar, bakterilere özgül olarak enfekte olabilen virüslerdir ve boyutları genellikle 20–200 nanometre arasında değişiklik gösterir (23). Oldukça küçük olmalarına rağmen, fajlar hem morfolojik hem de genetik yönden zengin bir çeşitliliğe sahiptir (4). Yapısal olarak tipik bir faj; baş (kapsid), boyun, kuyruk ve kuyruk iplikçiklerinden oluşur (Şekil 1). Kapsid, genetik materyali (DNA veya RNA) içeren protein yapılı bir kafestir ve çoğu fajda ikozahedral simetri gösterir (4, 6). Kuyruk kısmı ise bakteriyel yüzeydeki spesifik reseptörleri tanıyarak bağlanmayı sağlar ve ardından genetik materyalin bakteriye enjeksiyonunu gerçekleştirir (24). Şekil 1. Fajın morfolojisi (25). 72   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III Fajların çoğu çift sarmallı DNA (dsDNA) taşımasına rağmen, daha nadir olarak tek sarmallı DNA (ssDNA), çift sarmallı RNA (dsRNA) veya tek sarmallı RNA (ssRNA) içeren türler de bulunmaktadır. Bu genetik çeşitlilik, fajların farklı bakteriyel konaklara adaptasyonunda önemli bir rol oynar. Fajların sınıflandırılması, morfolojik yapı, nükleik asit tipi ve zarflı olup olmama durumu gibi kriterlere dayanmaktadır. Uluslararası Virüs Taksonomisi Komitesi (ICTV)’nin yaptığı sınıflamaya göre, özellikle Caudovirales takımı, kuyruk yapısına sahip bakteriyofajların büyük kısmını oluşturur (Şekil 2) (26). Bu takım üç ana aileyi kapsar: · Siphoviridae: Uzun, ince ve kasılmayan kuyruk yapısına sahiptir. · Myoviridae (görselde yer almamakla birlikte tanımlanabilir): Uzun ve kasılabilir kuyruk yapısı ile karakterizedir. · Podoviridae: Kısa, kalın ve rijit (kasılmayan) kuyruk yapısına sahiptir (5). Şekil 2: Fajların sınıflandırılması (12). Elektron mikroskobu görüntüsünde, bakteriyofajın konak bakteri hücresinin yüzeyine özgül reseptörler aracılığıyla adsorbe olduğu evre izlenmektedir (27, 28). Bu adsorpsiyon aşaması, fajın konak hücre zarıyla yüksek afiniteli ve özgül bir etkileşime girerek stabil bağlanmasını sağlar. Ardından, kontraktil kuyruk kılıfı aracılığıyla oluşturulan mekanik kuvvetle birlikte faj genomu (genellikle dsDNA), bakteriyel hücre içerisine enjekte edilmeye hazırlanır (25, 29). (Şekil 3) Gözlenen bu yapısal konformasyon, fajların konak özgüllüğüne dayalı hedefli biyolojik araçlar olarak kullanılmasının temelini oluşturmaktadır (26). BAKTERİYOFAJLAR   73 Şekil 3. Myoviridae familyasından T4 fajın elektron mikroskop görüntüsü (25). 5. Yaşam Döngüsüne Göre Fajlar Bakteriyofajlar, enfekte ettikleri konak bakterilerde çoğalma stratejilerine göre iki ana yaşam döngüsü sergilerler: litik ve lizojenik (ılımlı) döngü. Bu iki döngü, yalnızca fajın konağa olan etkisini değil, aynı zamanda bakteriyel evrimdeki rollerini ve terapötik potansiyellerini de belirleyen temel biyolojik süreçlerdir (25, 28, 30). 5.1.LitikDöngü Litik döngü, fajın enfeksiyon sonrası hızlı çoğalma ve konak hücreyi lizise uğratarak yeni faj partiküllerini serbest bırakma sürecidir. Litik fajlar için (Şekil 4) görüldüğü üzere, üreme döngüsünde altı temel aşama bulunur: adsorpsiyon, penetrasyon, transkripsiyon, biyosentez, olgunlaşma ve lizis (4, 31). · Adsorpsiyon: Faj, konak bakterinin yüzeyinde bulunan lipopolisakkarit, teikoik asit, pilus veya flagella gibi özgül reseptörlere bağlanarak enfeksiyon sürecini başlatır. Bu bağlanma; pH, Mg²⁺, Ca²⁺ gibi iyonlar ve çevresel faktörler tarafından etkilenebilir (31, 32) . · Penetrasyon: Adsorpsiyonu takiben, fajın kuyruk kılıfı kasılır ve hücre duvarında delik oluşturarak DNA’sını bakteri sitoplazmasına enjekte eder. Bu sırada faj DNA’sı, nükleazlardan korunmak için dairesel forma geçebilir veya uçlarını korur (4). · Transkripsiyon: Bakteriyel RNA polimeraz, faj genomunun erken bölgelerinde bulunan promotorları tanır ve erken genlerin transkripsiyonunu 74   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III başlatır. Bu genler, konak metabolizmasını faj replikasyonuna uygun hale getirir (33). · Biyosentez: Faj genomuna ait yapı proteinleri (kapsid, kuyruk vb.) ile birlikte yeni DNA moleküllerinin replikasyonu gerçekleşir. Bu aşamada, faj partiküllerinin yapısal bileşenleri sentezlenir (33, 34). · Olgunlaşma: Biyosentezle oluşan yapıların bir araya gelmesiyle olgun faj partikülleri oluşur. DNA, kapsid içerisine paketlenir; kuyruk ve diğer yardımcı yapılar monte edilir (11). · Lizis: Son aşamada, fajın kodladığı endolizin (virolizin) peptidoglikanı parçalar. Holin proteini ise hücre membranında porlar oluşturarak endolizinin hücre duvarına ulaşmasını sağlar. Bu süreç sonucunda hücre parçalanır ve yeni fajlar serbest kalır (35, 36). Şekil 4. Litik döngü evreleri (37). 5.2.LizojenikDöngü Lizojenik fajlar, genomlarını konak DNA’sına entegre ederek profaj formunda pasif şekilde çoğalırlar (35, 36). Bu formdaki DNA, konak hücre ile birlikte replikasyona uğrar ve nesilden nesile aktarılır 36,38. Profaj, repressör proteinler aracılığıyla hem kendi hem de benzer fajların ekspresyonunu baskılar 36. Stres koşullarında (UV, mitomisin C, ısı vb.) profaj aktifleşerek litik döngüye geçebilir (38). Bazı profajlar, konak bakteriye toksin veya direnç genleri kazandırabilir, bu nedenle terapötik kullanımları sınırlıdır (25, 39). Litik ve lizojenik döngülere dair karşılaştırmalı şematik gösterim Şekil 5’te sunulmuştur. BAKTERİYOFAJLAR   75 Şekil 5. Litik ve lizojenik döngülerin karşılaştırmalı şematik gösterimi 5.3.FilamentözFajlar Filamentöz yapıya sahip bazı fajlar, hücreyi lizise uğratmadan membran yoluyla salınırlar. Kronik enfeksiyonlara neden olan bu fajlar, çoğunlukla ssDNA taşırlar ve biyoteknolojik uygulamalarda kullanılırlar (25, 40). 6. Faj Terapisi 6.1.TanımıveTarihçesi Faj terapisi, bakteriyel enfeksiyonların tedavisinde bakteriyofajların kullanıldığı özgün bir biyoterapötik yöntemdir (41). Bu yaklaşım ilk kez 1917 yılında Fransız mikrobiyolog Félix d’Hérelle tarafından tanımlanmış ve başta dizanteri olmak üzere pek çok bakteriyel hastalığın tedavisinde kullanılmıştır (42). Antibiyotiklerin keşfiyle bu terapi arka planda kalmışsa da, günümüzde artan antibiyotik direnci nedeniyle yeniden önem kazanmıştır (43). Özellikle çok ilaca dirençli bakterilerle mücadelede fajların konak özgüllüğü ve litik etkileri sayesinde alternatif bir tedavi seçeneği sunduğu ortaya konmuştur (44). 6.2.FajTerapisininAntibiyotiklereGöreAvantajları Fajlar, antibiyotiklere göre birçok avantaja sahiptir. En başta, konak özgüllüğü sayesinde yalnızca hedef patojene saldırır ve normal mikrobiyotaya zarar vermez (45). Bu seçici etki, disbiyozis ve sekonder enfeksiyon riskini en 76   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III aza indirir (46). Ayrıca fajlar, enfeksiyon alanında çoğalarak “otodozajlama” etkisi gösterirler (47). Antibiyotiklerle çapraz direnç geliştirmezler ve bu yönleriyle klasik tedavilere dirençli bakterilere karşı etkinlik gösterirler (23) . Fajlar biyofilm ortamlarında da etkilidir ve üretim maliyetleri antibiyotiklere kıyasla daha düşüktür (48). Ayrıca farmakokinetik özellikleri, uygulama şekline göre modifiye edilebilir (49). Bunların yanı sıra, bakteriyel enfeksiyonların tedavisinde kullanılan fajlar, çoğunlukla bağışıklık sistemini aktive etmeden etki gösterir, bu da sistemik yan etkilerin minimal olmasına katkı sağlar (50). Tablo 1’de bakteriyofajlar ve antibiyotiklerin karşılaştırılmasına dair detaylı bilgilere yer verilmiştir. Tablo 1. Bakteriyofajlar ve Antibiyotiklerin Karşılaştırılması Bakteriyofajlar Antibiyotikler Yorum Etki spektrumları oldukça dar ve spesifiktir. Etki spektrumları geniştir. Fajların yüksek spesifitelerinden dolayı, faj tedavisi öncesi bakterinin tanımlanması ve duyarlılığının test edilmesi gerekliliği dezavantaj olarak görülebilir. Fakat yine bu spesifite sayesinde disbiyoz ve sekonder enfeksiyon gelişme riski oldukça düşüktür. Antibiyotikler ise geniş spektrumlarından dolayı kullanım kolaylığı sağlarken disbiyoz ve sekonder enfeksiyonlara yol açabilir. Yeni faj izole etmek oldukça hızlı, basit ve düşük maliyetlidir. Yeni antibiyotiklerin geliştirilmesi oldukça zahmetli, uzun ve pahalıdır. Fajların etki mekanizmaları antibiyotik direncinden bağımsız olduğu için ve bakterilerle beraber fajlarda evrimleştiğinden (doğada bir bakteri varsa fajı da vardır ilkesi) çoklu dirence sahip bakterilere karşı yeni fajlar izole etmek kolaydır. Şimdiye kadar bildirilmiş ciddi yan etkileri bulunmamaktadır. Fakat immün sistemi uyarabilirler. Disbiyoz, alerjiler, sekonder enfeksiyonlar gibi çeşitli yan etkiler gösterebilir. Fajların yüksek spesifitesi sayesinde mikrobiyal denge korunduğundan disbiyoz riski yoktur. Fakat fajlar hedef bakterileri parçalayarak endotoksin salınımına neden olabilir, ancak bu etki genellikle hafiftir. Biyofilm yapılarına oldukça etkilidirler. Antibiyotiklerin biyofilm yapılarına penetrasyonu zayıftır. Fajlar biyofilmler içerisinde ilerleyebilir ve EPS üretimini yapan bakterileri öldürerek aşamalı olarak biyofilmi bozar. Ayrıca fajlar depolimeraz gibi enzimlerle de biyofilm yapısını parçalayabilir. Faj tedavisi sonrası fajın aktivitesini düşüren etkenlere (mide asidi, safra tuzları, antikorlar, fagositler) maruziyet olabilir. Aktivite azaltıcı dış etkenlere karşı standardizasyon yapılmıştır. Fajlar, antibiyotiklere göre daha az birikim olduğu için standardize edilmesi zordur. Bu durum terapinin dezavantajı sayılabilir. Fakat fajların çeşitli maddelerle kapsüllenmesi (liposom gibi) sonrası aktivite azalışı önlenebilir. BAKTERİYOFAJLAR   77 6.3.FajSeçimi,İzolasyonuveSaflaştırılması 6.3.1.FajlarınKaynağıveSeçimi Terapide kullanılacak fajların seçimi, etkili bir tedavi açısından kritik önemdedir (37). Fajlar genellikle çevresel kaynaklardan (kanalizasyon, toprak, hastane atıkları vb.) izole edilir (51). İzolasyon sonrası hedef bakteri türüne karşı etkili litik fajlar belirlenmelidir. Bu amaçla çift tabakalı agar yöntemi kullanılarak plaka oluşturma testleri yapılır (52). 6.3.2.SaflaştırmaveKarakterizasyon Fajların saflığı, endotoksin içermemesi ve lizojenik özellik taşımaması önemlidir (2). Bu nedenle saflaştırma aşamasında ultrafiltrasyon, sefalosentrifügasyon ve PEG çöktürmesi gibi yöntemler kullanılır (53). Stokların uzun süreli stabilitesini sağlamak için -80°C’de gliserol veya sukroz varlığında muhafaza edilmeleri önerilmektedir (25). Titre değerleri PFU/mL cinsinden ölçülür. Moleküler karakterizasyon için genetik sekanslama ve restriksiyon analizleri yapılabilir (54). 6.4.FajUygulamaYöntemleri 6.4.1SistemikUygulamalar · İntravenöz: Kan dolaşımına doğrudan ulaşarak sistemik enfeksiyonlarda etkilidir. Ancak immün yanıt riski göz önünde bulundurulmalıdır (55). · İntramüsküler/Subkutan: Yavaş salınım ve daha az sistemik immün yanıt avantajı sunar (56). 6.4.2LokalveEnterikUygulamalar · Oral: Enterik enfeksiyonlarda tercih edilir. Asidik ortamdan korunmaları için mikrokapsülleme gerekebilir (57). · Topikal: Yüzeysel enfeksiyonlar ve yara yerleri için kullanılır. Antibiyotiklere dirençli suşlara karşı etkilidir (58). · Rektal: Gastrointestinal sistemde doğrudan uygulama imkânı sağlar (4). 6.4.3İnhalasyonYöntemi · Aerosol Uygulama: Solunum yolu enfeksiyonlarında kullanılmakta olup, özellikle kanatlı hayvanlarda başarıyla uygulanmıştır. Bu yöntemle bakteriyel akciğer enfeksiyonlarının önlenmesi ve tedavisinde etkili sonuçlar alınmıştır (59). 78   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 6.5.KlinikÇalışmalardanÖrnekler 6.5.1İnsanlardaKullanımı Merril ve arkadaşları, vancomycin dirençli Enterococcus faecium ile enfekte farelerde faj tedavisiyle yüksek oranda iyileşme elde etmişlerdir (55). Polonya’da 1980’lerden itibaren yapılan çok merkezli çalışmalarda ise 150’nin üzerinde hasta üzerinde faj terapisi uygulanmış; süpüratif enfeksiyonlarda özellikle topikal ve oral yolla uygulanan fajların klinik semptomları hafiflettiği gösterilmiştir (60). Bruttin ve Brussow tarafından gerçekleştirilen bir güvenlik çalışmasında ise gönüllülere oral yolla uygulanan E. coli fajlarının herhangi bir yan etki oluşturmadığı ve bağırsak mikroflorası ile etkileşim göstermediği bildirilmiştir (57). 6.5.2HayvanlardaKullanımı Barrow ve arkadaşları, tavuk ve buzağılarda deneysel olarak oluşturulan E. coli enfeksiyonlarında litik fajların septisemi ve menenjit gelişimini önlediğini göstermiştir (61). Huff ve arkadaşlarının aerosol ile gerçekleştirdiği çalışmalarda ise tavuklarda solunum yolu enfeksiyonlarının başarılı şekilde tedavi edildiği rapor edilmiştir (59). Gill ve arkadaşları, ineklerde subklinik mastit tedavisinde faj uygulamalarının hem bakteriyel yükü azalttığını hem de süt kalitesini artırdığını ortaya koymuştur (51). Türkiye’den Sağlam ve arkadaşları da mastitisli ineklerden izole edilen S. aureus fajlarının terapötik potansiyel taşıdığını göstermiştir (25). 6.6FajDirenciveKısıtlamaları Faj terapisi önemli avantajlara sahip olmakla birlikte bazı sınırlılıklar da barındırmaktadır. En önemli sorunlardan biri, hedef bakterilerin zamanla fajlara karşı direnç geliştirebilmesidir (2). Bu direnç mekanizmaları arasında reseptör modifikasyonları, restriksiyon-modifikasyon sistemleri, abortif enfeksiyon mekanizmaları ve CRISPR-Cas sistemleri yer alır (46). Fajlara karşı gelişen direnç, tek bir faj yerine “faj kokteyli” kullanımını gerektirebilir (50). Ayrıca fajların mide asidi, safra tuzları ve lizozim gibi faktörlerden etkilenerek inaktive olması, oral uygulamalarda biyoyararlanımı sınırlayabilir (48). Bu nedenle mikrokapsülleme, polimerik taşıyıcılar ya da liposomal enkapsülasyon teknikleri önerilmektedir (49). Faj üretimi ve standardizasyonu da halen zorluk barındıran alanlardandır (52). Her bir bakteriyel patojen için uygun fajın bulunması, karakterize edilmesi ve GMP (Good Manufacturing BAKTERİYOFAJLAR   79 Practices) koşullarında üretimi zaman alıcıdır (53). Ayrıca ruhsatlandırma süreçleri ve düzenleyici engeller, özellikle Batı ülkelerinde faj terapinin yaygın klinik kullanımını sınırlandırmaktadır (43). Tüm bu nedenlerle, faj terapinin etkinliği kadar, uygulanabilirliği ve üretim süreçlerinin standardizasyonu da dikkatle ele alınmalı ve klinik uygulamalara geçişte multidisipliner bir yaklaşım benimsenmelidir (44) . 7. Güncel Perspektifler ve Gelecek Uygulamalar Bakteriyofajların terapötik potansiyeli, yalnızca doğal litik aktiviteleriyle sınırlı değildir. Moleküler biyoteknoloji ve sentetik biyoloji alanındaki ilerlemeler, fajların terapötik ajanlar olarak yeniden tasarlanmasını mümkün kılmıştır. Günümüzde genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak CRISPRCas sistemleri ile donatılmış, hedef bakterilere spesifik gen taşıyabilen veya antimikrobiyal peptitleri taşıma kapasitesine sahip rekombinant fajlar geliştirilmektedir (62, 63). Bu rekombinant sistemler, klasik fajlara kıyasla hem etki profili hem de hedef özgüllük açısından önemli bir üstünlük sunmaktadır (2). Fajların klinik uygulamaya entegrasyonunda karşılaşılan başlıca zorluklardan biri, ruhsatlandırma ve yasal düzenleme süreçlerindeki belirsizliktir. Avrupa İlaç Ajansı (EMA) ve Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), bireyselleştirilmiş faj tedavilerini konvansiyonel ilaç tanımları içerisinde değerlendirmekte güçlük çekmektedir (33). Özellikle hasta izolatına özel faj üretimi durumunda, her yeni uygulamanın ayrı ruhsat süreci gerektirmesi, klinik araştırmaların ve yaygın kullanımın önünde önemli bir engel teşkil etmektedir. Türkiye’de ise bu alanda henüz net bir mevzuat bulunmamakta, çalışmalar etik kurul değerlendirmeleriyle sınırlı yürütülmektedir (4). Bu bağlamda terapötik etkinliği artırmaya yönelik en önemli stratejilerden biri faj kokteylleridir. Farklı fajların bir araya getirilerek oluşturduğu bu kombinasyonlar, aynı anda birden fazla bakteriyel hedefi etkileyebilmekte ve fajlara karşı direnç gelişme riskini azaltmaktadır (37). Her fajın farklı bir bakteriyel reseptöre bağlanması, bu kombinasyonların geniş spektrumlu ve direnç kırıcı bir potansiyel taşımasını sağlamaktadır 64. Faj kokteyllerini tamamlayıcı nitelikte olan bir diğer gelişme ise bireyselleştirilmiş faj terapileridir. Bu yaklaşımda, hasta bireyden izole edilen bakteriyel patojenlerin moleküler düzeyde tanımlanması ve bu patojene özgü fajların laboratuvar ortamında seçilerek uygulanması esas alınmaktadır. 80   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III Böylelikle, klasik antibiyotiklerin aksine, kişiye özgü tedavi modeli bakteriyel enfeksiyonlar için de mümkün hale gelmektedir (54, 65). Gelecek perspektifinde, bu iki stratejinin (kokteyl ve kişisel terapi) birleşimiyle oluşturulacak entegre sistemlerin, enfeksiyon hastalıklarının yönetiminde çok daha etkin, özgül ve sürdürülebilir tedavi seçenekleri sunacağı öngörülmektedir. 8. Sonuç ve Değerlendirme Antibiyotik direncinin küresel ölçekte yaygınlaşması, bakteriyel enfeksiyonların tedavisinde yeni çözümler geliştirilmesini zorunlu kılmıştır. Bu bağlamda bakteriyofajlar, özgün etki mekanizmaları ve bakteriye özgüllükleri sayesinde yeniden dikkat çekmeye başlamıştır66. Fajların konak spesifitesi, biyofilm yapılarına nüfuz edebilme kabiliyetleri ve enfeksiyon bölgesinde çoğalma özellikleri, onları geleneksel antibiyotiklere karşı üstün kılmaktadır (28, 67). Ancak fajların terapötik potansiyellerinin etkin bir şekilde kullanılabilmesi için bazı temel sorunların çözülmesi gerekmektedir. Öncelikle kullanılacak fajların seçimi, moleküler karakterizasyonu ve güvenilir şekilde üretimi halen ciddi bir standardizasyon ihtiyacı doğurmaktadır (68). Bunun yanı sıra, özellikle oral uygulamalarda karşılaşılan fizyolojik engeller örneğin mide asiditesi ve safra tuzları gibi faktörler fajların biyoyararlanımını sınırlandırabilmektedir (64). Yakın gelecekte rekombinant faj teknolojileri, genetik olarak düzenlenmiş CRISPR-faj hibritleri ve hedefe yönelik gen taşıyıcı sistemlerin klinik tedavilere entegrasyonu beklenmektedir (47, 62). Bu teknolojiler, sadece etki gücünü değil, aynı zamanda güvenlik ve hastaya özel düzenleme kabiliyetini de artıracaktır. Ancak bu gelişmelerin klinik pratiğe yansıyabilmesi, sadece biyoteknolojik değil, aynı zamanda ruhsatlandırma, üretim ölçeklendirmesi ve etik düzenlemelerin yeniden yapılandırılmasını da zorunlu kılmaktadır (69). Faj tedavisinin potansiyeli açıktır; ancak bu potansiyelin etkin şekilde klinik uygulamaya dönüşebilmesi, çok merkezli araştırmalarla desteklenmiş bilimsel altyapı, mevzuat netliği ve disiplinler arası işbirliği ile mümkün olacaktır. 9. Kaynaklar 1. Clokie MR, Millard AD, Letarov AV, Heaphy SJ. Phages in nature. Bacteriophage. 2011;1(1):31-45. 87 BÖLÜM VI MİKROBİYAL BİYOFİLMLER VE KRONİK ENFEKSİYONLARLA İLİŞKİSİ MicrobialBiofilmsAndAssociatedChronicInfections Rukiye ASLAN1 & Hülya ŞİMŞEK2 1 (Dr. Öğr. Üyesi), Sivas Cumhuriyet Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, Sivas/TÜRKİYE E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0001-5843-626X 2 (Prof. Dr.), Yozgat Bozok Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, Yozgat/TÜRKİYE E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0001-8636-9033 1. Giriş Biyofilmler, kendileri tarafından üretilen hücre dışı polimerik bir madde olan ekzopolisakkarit (EPS) matriks içerisinde düzenli ve organize halde yaşayan mikroorganizma topluluklarıdır (1). “Film” sözcüğü, bir yüzeyi kaplayan ince bir tabakayı tanımlarken, “biyofilm” sözcüğü bu tabakayı kaplayan maddenin biyolojik bir materyal olduğunu tanımlamaktadır. “Mikrobiyal biyofilm” sözcüğü ise biyofilm materyalinin mikrobiyal bir örtüden oluştuğunu ifade etmektedir (2). Bu bölümde mikrobiyal biyofilmler ve kronik enfeksiyonlarla ilişkisi ele alınmaktadır. Mikrobiyal bir topluluğun biyofilm olarak nitelendirilebilmesi için dört temel özelliğe sahip olması gerekmektedir. Bu özellikler, kendi kendilerine organizasyon yeteneği, çevresel değişimlere karşı dayanıklılık, tek başlarına izole oldukları durumlara kıyasla topluluk halinde daha etkili olma ve çevresel değişimlere karşı tek bir bireyden ziyade kollektif şekilde tepki verebilme yetenekleridir (3). Mikroorganizmalar biyofilmler sayesinde canlı, 88   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III cansız yüzeylere ve birbirlerine yapışabilmektedir. Planktonik formlarına kıyasla biyofilm içinde bulunan mikroorganizmaların büyüme hızları ve gen ifadeleri farklılık göstermektedir (1). Biyofilm oluşumu için gerekli en temel yapılar; yüzey, mikroorganizma ve glikokalikstir. Matriks, biyofilmi oluşturan tüm hücrelerin içinde yer aldığı, mikroorganizmalar tarafından salgılanan ekstrasellüler yapıda bir materyaldir. Üç boyutlu bir biyofilm yapısının iskeleti EPS’den oluşmaktadır. Bir biyofilm matriksi suda çözünebilen polisakkaritler, hücre dışı DNA (eDNA), proteinler, selüloz, amiloidler, lifler ve lipitler gibi suda çözünmeyen bileşiklerden oluşmaktadır (4,5). Biyofilm yapısı içerisindeki mikroorganizmalar salgıladıkları kimyasal iletişim sinyalleri ile birbirleri ile iletişim kurabilmektedir. Biyofilm yapısı içerisindeki mikroorganizma yoğunluğu belli bir sayının üzerine çıktığında bakteriler tarafından “autoinducer” adı verilen sinyal molekülleri salgılanmakta ve gen ekspresyonu aktive edilmektedir. Böylece bakteriler çevrelerindeki sinyal yoğunluğu algılayarak cevap verebilmektedir. Bakteriler arasında sinyal moleküllerinin yoğunluğuna bağlı olarak geliştirilen bu iletişim dili “Quorum Sensing (QS)” olarak adlandırılmaktadır. QS sayesinde biyofilm yapısı içerisindeki bakterilerin, topluluğu algılaması ve kollektif bir şekilde hareket etmesi gerçekleşmektedir (6,7). Biyofilmler mikroorganizmaların olumsuz koşullara karşı oluşturdukları bir evrim ürünü olarak kabul edilmektedir. Mikroorganizmalar, biyofilm oluşturma yeteneklerini reaktif oksijen ara maddelerinin (ROS) üretimi, yüksek veya düşük sıcaklık, pH dengesindeki bozulmalar, UV/radyasyona maruz kalma, besin eksikliği ve fagositik hücreler gibi konak aracılı saldırılara karşı kendilerini savunma stratejisi olarak kullanmaktadır. Böylece zorlu hayat koşullarında hayatta kalma sürelerini artırmış olurlar. Biyofilm içine gömülü bakterilerin planktonik bakterilere kıyasla olumsuz koşullara karşı 1000 kata kadar daha dirençli olduğu ifade edilmektedir (8,9). Bunlarla birlikte bakteriler biyofilm yapıları sayesinde antibiyotiklerin etkilerinden kurtulabilirler. Biyofilm oluşturan bakterilerin neden olduğu enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde, biyofilm matriksine nüfuz edebilmek için gerekli olan antibiyotik miktarı diğer enfeksiyon hastalıklarına kıyasla daha fazladır. Bu durum da antimikrobiyal direnç (AMD)’nin gelişmesine neden olmaktadır (10). Özetle biyofilm yapısı mikroorganizmaların olumsuz çevre koşullarına, antibiyotiklere ve bağışıklık sistemine karşı direnç kazanmasını sağlamaktadır. Bu durum da kronik enfeksiyonların gelişmesinde önemli rol oynamaktadır. Günümüzde mikrobiyal enfeksiyonların %60’ından fazlasının biyofilm ile ilişkili enfeksiyonlar olduğu bildirilmektedir (11). MİKROBİYAL BİYOFİLMLER VE KRONİK ENFEKSİYONLARLA İLİŞKİSİ   89 2. Mikrobiyal Biyofilm Oluşum Mekanizmaları Mikroorganizmalarda biyofilm oluşumu bir dizi karmaşık biyokimyasal ve genetik kaskadın ardışık aktivasyonu sonucunda gerçekleşen dinamik bir süreçtir (8). Bu süreç şu basamaklardan oluşmaktadır: a. Tutunma ve yapışma: Biyofilm oluşumu bakterilerin yüzeye tutunması ile başlayan dinamik bir süreçtir. Tutunma sürecinde hidrofobik bağlantıların önemli rolü bulunmaktadır. Tutunma işlemi gerçekleştikten sonra biyofilm fenotipinin ortaya çıkması için genetik bir kaskadın işlemesi gerekmektedir. Ardından biyofilm farklılaşmasının başlaması da ortamdan algılanacak QS sinyallerinin yoğunluğuna bağlı olarak gerçekleştirilmektedir (4). Yüzeye tutunan hücreler bakteri hücre zarındaki proteinleri uyararak EPS’nin sentezlenmesini başlatıp, bakterilerin birbirine ve yüzeye tutunmasını sağlamaktadır. EPS polisakkaritler, DNA, proteinler ve diğer moleküllerden oluşan bir yapıdır ve biyofilmin temel yapısal bütünlüğünü sağlamaktadır (12). Bakteriler substratlarına geri dönüşümlü olarak tutunduktan sonra geri dönüşümsüz şekilde bir araya gelerek yüzeylere yapışırlar. Bu süreçte bakterilerin dış yüzeyindeki adezin, fimbria, kamçı, pili ve glikokaliks molekülleri önemli rol oynamaktadır. (8,13-15). b. Mikrokoloni oluşumu (Kolonizasyon): Yüzeye yapışmanın ardından mikroorganizmalar hücre dışı polimerik matriks olan EPS’yi salgılama hızını artırırlar. Yüzeye yapışan bakteriler bir araya gelerek, bölünüp çoğalarak kolonize olurlar. Böylece bir biyofilm yapısının en küçük birimi olan mikrokolonileri oluştururlar (8,13-15). c. Olgun biyofilm oluşumu: Olgunlaşma aşamasında mikroorganizmalar tarafından salgılanan EPS miktarının artması, biyofilm yapısının üç boyutlu bir form kazanmasını sağlamaktadır. Mikrokolonizasyon arttıkça biyofilm yapısı mantar formuna dönüşerek, uzun kulemsi yapılara benzer şekil almaya başlamaktadır. Bu aşamada QS molekülleri mikroorganizmaların popülasyon yoğunluğuna bağlı olarak gen ekspresyonlarının düzenlenmesini kontrol ederek, kolonizasyonun devamını sağlamaktadır. QS molekülleri, biyofilmin olgunlaşması ve yayılması için temel iletişim molekülleri arasında yer almaktadır (8,13-15). Biyofilm yapısı olgunlaşıp, kolonizasyon miktarı arttıkça, mikrokoloniler arasında su kanalları oluşmaya başlamaktadır. Bu kanallar olgun biyofilm yapısı içerisinde primitif bir dolaşım sistemi görevi görmektedir (3). 90   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III d. Dağılma: Olgunlaşmış biyofilm yapısındaki mikroorganizmalar biyofilm oluşumu döngüsünün devamı için pasif olarak ana kütle matriksinden yırtılarak ayrılır, yeni yüzeylere tutunur ve yeni bir biyofilm oluşum döngüsünü başlatır. Böylece bakteri açısından, bakteriyel enfeksiyon yayılmış olur (8,1315). Olgun biyofilm yapısından mikrokolonilerin ayrılması, çevresel faktörlerin etkisiyle gerçekleştiği gibi biyofilm olgunlaşma sürecinin bir parçası olarak da nitelendirilebilmektedir (3). Şekil 1. Biyofilm oluşumunun aşamaları; 1. Tutunma ve yapışma, 2. Mikrokoloni oluşumu (kolonizasyon), 3 ve 4. Olgun biyofilm oluşumu, 5. Dağılma (9,16). 3. Biyofilm Oluşumunu Düzenleyici Faktörler Biyofilm oluşumu hem çevresel hem de mikrobiyal (genetik) faktörler aracılığıyla kontrol edilmektedir. Biyofilm oluşumunun başlatılması ilk planda bakteriyel tutunmanın sağlanması ile gerçekleşmektedir. Mikroorganizmaların hidrofobisitesi, yüzey molekülleri ve hareketlilik uzantılarının varlığı tutunma aşamasında önemli rol oynamaktadır. Bağlanma yüzeyinin pürüzlülüğü daha büyük yüzey alanı sunduğundan kayma kuvvetini durdurur ve biyofilm oluşumunu destekler. Ayrıca hidrofobik nonpolar yüzeyler bakterilerin daha güçlü tutunmasını sağlar. Besin havuzundaki değişiklikler, pH, nem ve oksijen miktarı, hidrodinamik, sıcaklık, ortamın iyon konsantrasyonu, NaCI, CaCI2 ve MgSO4 konsantrasyonları da biyofilm özelliklerini etkileyen çevresel faktörler arasında yer almaktadır. Çevresel faktörlerin yanı sıra içsel biyofilm oluşumu yönünden düzenleyici genetik mekanizmalar da bulunmaktadır. Bakterilerde bazı genlerin varlığında biyofilm oluşumunun desteklendiği buna karşın bazı genlerin bulunmadığı durumlarda biyofilm oluşumunun gerçekleşmediği ifade edilmektedir. Bu genlerin bakterilerde; hareket, bağlanma, zar biyoenerjisi, kemotaksis ve bakteriyofajlarla ilgili işlevlerden sorumlu olduğu bilinmektedir (8,17). MİKROBİYAL BİYOFİLMLER VE KRONİK ENFEKSİYONLARLA İLİŞKİSİ   91 4. Biyofilm Yapısında Bulunan Mikroorganizmaların Özellikleri Biyofilm yapısında yer alan mikroorganizmaların planktonik mikroorganizmalara kıyasla mikrobiyal açıdan birçok avantajı bulunmaktadır. Biyofilm oluşumu mikroorganizmaların UV ışınları, pH değişiklikleri, nem kaybı, osmotik şok gibi olumsuz çevre koşullarına karşı hayatta kalma stratejilerinden biridir. Biyofilm yapısının matriksini oluşturan EPS, mikroorganizmaları fiziksel, kimyasal ve biyolojik stres faktörlerine karşı korumaktadır. Bu yapı aynı zamanda mikroorganizmayı antimikrobiyaller, dezenfektanlar gibi kimyasallara ve konağın immün yanıtlarına karşı koruyan bir bariyer görevi görmektedir. EPS mikroorganizmanın yapışma kabiliyetini artırarak, kolonizasyonu kolaylaştırmaktadır. Böylece mikroorganizma patojenitesine katkı sağlamaktadır (3,4). Biyofilm yapısı içindeki mikroorganizmaların virülansı planktonik mikroorganizma formlarına kıyasla daha yüksektir (18). Biyofilm içerisinde yer alan bakteriler çevre koşulları değiştiğinde aldıkları QS sinyallerine göre tekrar planktonik formlarına dönüşebilme yeteneğindedir. Bu dönüşüm mikroorganizmaların ortama salgıladıkları yeni genler aracılığıyla gerçekleşmektedir. Biyofilm içindeki bakteriler arasında, horizontal gen transferi (HGT) gerçekleşerek plazmid, transpozon gibi genetik materyaller bir bakteriden diğerine aktarılabilmektedir. Böylece bakteriler arasında genetik çeşitlilik oluşumu sağlanmaktadır. Özellikle çoklu-ilaç direnci (ÇİD)’e sahip bakterilerin ortaya çıkmasında biyofilm yapısı oldukça etkilidir (3,4). İlaca dirençli mikroorganizmaların ortaya çıkmasını sağlayan bir diğer mekanizma da biyofilm yapısı içerisinde yer alan metabolik olarak inaktif-persistan bakteri hücrelerinin varlığıdır. Bu hücreler antibiyotiklerin hedeflediği metabolik süreçte yer almadığı için antimikrobiyal tedaviye karşı direnç gelişmesine katkı sağlamaktadır (19). 5. Biyofilmlerin Kronik Enfeksiyonlarla İlişkisi Biyofilmler kronik enfeksiyonların patogenezinde önemli rol oynamaktadır. Biyofilm yapısı, mikroorganizmaları konak immün yanıtı gibi dış etkilerden korumaktadır. Konak savunmasında fagositozun önlenmesi, antikor aracılı opsonizasyonun sınırlandırılması ve mikroorganizmaların kolonizasyonunun kolaylaştırılması sonucunda gelişen mikrobiyal virülansın artışı biyofilmlerin inatçı doğasından kaynaklanmaktadır. Biyofilm yapısı çevresel tüm olumsuz faktörlere karşı bakterinin hayatta kalması için adeta koruyucu bir niş oluşturmaktadır. Bu mekanizmalar, bakteriyel enfeksiyonların kronikleşmesine 92   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III zemin hazırlamaktadır. Kronikleşen enfeksiyonlar uzun süreli antibiyotik kullanımına bağlı olarak direnç geliştirebilmektedir. Kronik enfeksiyonlar sıklıkla tekrar tekrar nüks etmekte, uzun süreli seyir göstermekte ve hatta mortalite ile sonuçlanabilmektedir (20,21). Kronik enfeksiyonların gelişmesi, dünya genelinde AMD’nin kontrolsüz bir şekilde artışından dolayı sağlık kurumları için önemli bir endişe kaynağı oluşturmaktadır. Bu enfeksiyonlarda mikroorganizmaların büyüme ve bölünme ihtiyaçları için kendi içlerinde oluşturdukları iş birliği biyofilm yapısı içerisinde gerçekleşmektedir (22). Biyofilmlerle ilişkili kronik enfeksiyonlar genellikle kronik yara enfeksiyonları, akciğer enfeksiyonları, solunum yolu enfeksiyonları, ortopedik ve implantlarla ilişkili enfeksiyonlar, kronik enfektif endokarditler, idrar yolu enfeksiyonları, kateter enfeksiyonları, oral-dental enfeksiyonlar ve diğer enfeksiyonlar şeklinde görülmektedir (11). 5.1.KronikYaraEnfeksiyonları Biyofilmlerle ilişkili kronik yara enfeksiyonları hastaların hayat kalitesini düşürmekte ve sağlık sistemlerine önemli oranlarda yük getirmektedir. Bu enfeksiyonlar arasında diyabetik ayak yaraları, kronik yaralar, bası ülseri yaraları ve cerrahi yaralar yer almaktadır. Bu biyotik ortamlar, mikrobiyal biyofilmlerin oluşumu için oldukça elverişlidir. Yaralarda gelişen biyofilmler hastalarda önemli bir klinik yük oluşturarak, potansiyel enfeksiyon gelişme riskini artırmakta veya enfeksiyonun iyileşmesinin gecikmesine neden olmaktadır (23,24). Kronik yaralarda biyofilm oluşumu yara iyileşmesinin enflamatuvar fazında başlayarak yaranın kronikleşmesine neden olmaktadır. Biyofilm içindeki bakteriler, yara yüzeyine tutunarak kolonize olmakta, ardından yaranın iyileşmesi için başlatılan kronik enflamatuvar yanıtın engellenmesini tetiklemektedir (25). Yaralardaki biyofilm varlığı antibiyotik direncini artırmakta, enflamatuvar reaksiyonları tetiklemekte ve yara iyileşmesini engellemektedir. İyileşmeyen kronik yaralar ampütasyonla sonuçlanabilmektedir. Bu durum artmış maliyet ve mortaliteye de neden olmaktadır (23). Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ve Enterococcus faecalis biyofilmle ilişkili yara enfeksiyonlarında sıklıkla rastlanan patojen bakteriler arasında ilk sıralarda yer almaktadır (11). Kronik yara enfeksiyonları arasında yer alan diyabetik ayak ülserleri biyofilmle ilişkili kronik yara enfeksiyonlarının en yaygın örneklerindendir. Diyabetik hastalarda gelişen vasküler yetmezlik ve periferik nöropati yara iyileşmesini zorlaştırırken, yarada biyofilm oluşumu enfeksiyonun kronikleşmesine neden olmaktadır. Diyabetik yaralara benzer şekilde yanık yaraları ve bası yaraları MİKROBİYAL BİYOFİLMLER VE KRONİK ENFEKSİYONLARLA İLİŞKİSİ   93 da biyofilm oluşumuna yatkınlık gösteren kronik enfeksiyonlar arasında yer almaktadır (26). 5.2.KronikAkciğerveSolunumYoluEnfeksiyonları Kistik fibrozis (KF), bronşektazi ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) gibi kronik solunum yolu enfeksiyonlarında biyofilm oluşumu bu enfeksiyonların tedavisini zorlaştırmakta ve hastalığın ilerlemesine neden olmaktadır. Kronik akciğer ve solunum yolu enfeksiyonlarında biyofilm oluşumu solunum yolu epitel hücrelerine tutunarak kolonize olan patojenler tarafından gerçekleştirilmektedir. Kolonizasyon ve biyofilm oluşumu kronik enflamasyona ve doku hasarına yol açmaktadır (27). Kronik akciğer enfeksiyonlarında sıklıkla rastlanan bakteriler arasında S. aureus, P. aeruginosa, Haemophilus influenza, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia multivorans, Moraxella catarrhalis, Mycobacterium abscessus ve Achromobacter xylosoxidans gibi patojenler yer almaktadır. P. aeruginosa biyofilmleri özellikle KF hastalarında akciğerlerde fonksiyon bozukluklarına ve solunum yetmezliklerine neden olarak, kronik enfeksiyonların gelişmesine zemin hazırlamaktadır. KF’de mukus yapısındaki değişikliklerden dolayı hava yolu daralmaktadır. Oluşan tıkanıklıklar anaerobik ortamın oluşmasına ve bu ortamla birlikte bazı bakterilerin de biyofilm oluşturmasına zemin hazırlamaktadır (28,29). Aynı şekilde biyofilm oluşumları, KOAH ve bronşektazi hastalarında da hastalığın seyrinin hızlanmasına ve hastanede yatışların artmasına neden olmaktadır (30). 5.3.KronikOrtopedikEnfeksiyonlarveİmplantEnfeksiyonları Medikal teknolojilerin gelişmesine bağlı olarak hastaların kas ve iskelet sistemlerine entegre edilebilen abiyotik yüzeylerin çeşitliliği de artmaktadır. Biyofilmlerle ilişkili kronik ortopedik enfeksiyonlar ve implant enfeksiyonları, protez eklem enfeksiyonları, osteomiyelit ve internal fiksasyon cihazlarına bağlı gelişen enfeksiyonlar gibi durumlarda sıklıkla görülen enfeksiyonlar arasında yer almaktadır. Bu enfeksiyonlardaki biyofilm oluşumunda, implantların veya protezlerin yüzeylerine tutunarak kolonize olan patojen mikroorganizmalar etkendir. Protezlerin ya da implantların yüzeylerinde tutunarak adhere olan patojenler, ardından hastada yayılarak kronik enflamasyona ve doku hasarına yol açabilmektedir (31,32). Bu enfeksiyonlara neden olan patojenler sıklıkla S. aureus, Metisiline dirençli S. aureus (MRSA), Staphylococcus epidermidis, P. aeruginosa ve Enterococcus türleridir. Bu patojenler oluşturdukları biyofilmlerle 94   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III implant ya da protez yüzeylerine tutunarak yayılırlar ve hastalığın ilerlemesine ve tedavilerin zorlaşmasına neden olmaktadırlar (33). 5.4.KronikEnfektifEndokarditler Kalp kapakçıklarını, kalbin endokardiyum tabakasını ve intrakardiyak cihazları etkileyen kronik enfektif endokarditler klasik biyofilm enfeksiyonları arasında yer almaktadır. Biyofilm oluşumu, protez kapak endokarditi veya doğal kapak endokarditi gibi enfeksiyonlarda ciddi klinik sorunlara neden olabilmektedir. Biyofilm varlığı tedavinin zorlaşmasına ve hastalığın kronikleşmesine zemin hazırlar (34). Enfektif endokardit etkenleri arasında S. aureus, Streptococcus viridans, Enterococcus ve Candida türü mikroorganizmalar yer almaktadır (35). Bu patojen bakteriler kalp kapakçıklarının ya da protez kapakların yüzeylerine tutunarak biyofilm oluşturmaktadır. Bu sürecin ardından kronik enflamasyon gerçekleşmektedir. Enfektif endokarditler, hastaların yaşam kalitesini önemli ölçüde etkileyen enfeksiyonlardır. Biyofilm enfeksiyonlarının da endokarditlere eşlik etmesi ile tedavilerin seyri zorlaşarak ve sağlık sistemlerinde ciddi maliyet getirmektedir (36). 5.5. Kronik İdrar Yolu Enfeksiyonları ve Kateter İlişkili İdrar Yolu Enfeksiyonları İdrar yolu enfeksiyonları (İYE) sağlık hizmetleri ile ilişkili enfeksiyonların %40’ını oluşturmaktadır. İYE’nin büyük bir kısmı kateter kullanımı ile ilişkilidir (Kİ-İYE). Bu enfeksiyonların etkeni olan mikroorganizmalar hastanın mikrobiyotasında yer alan endojen mikroorganizmalar ya da hastanede çevreden bulaşan mikroorganizmalar olup, üriner sistem aracılığıyla organizmaya girerek, mesane epiteli veya kateter gibi yüzeylere tutunarak biyofilm oluşturmaktadır. Ardından biyofilm yapıları ile kolonizasyonlarını yaygınlaştırarak ciddi enfeksiyonlara (sepsis, piyelonefrit vb.) neden olmaktadırlar (37). Kİ-İYE, hastanede yatan hastalarda en yaygın komplikasyonlar arasında yer almaktadır. Bu enfeksiyonlar hastane yoğun bakım servislerinde yatışların artışına, aşırı antibiyotik kullanımına, morbidite, mortalite oranlarında ve maliyetlerde artışlara neden olmaktadır. İYE’ye neden olan patojen bakteriler arasında sıklıkla E. coli, Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa, Proteus mirabilis, E. faecalis ve Candida türleri yer almaktadır. Bu patojenler oluşturdukları biyofilm yapısından kaynaklanan, tekrarlayan ve kronikleşmiş enfeksiyonlara neden olurlar (38). MİKROBİYAL BİYOFİLMLER VE KRONİK ENFEKSİYONLARLA İLİŞKİSİ   95 5.6.KronikOralveDentalEnfeksiyonlar Ağız içi, farklı birçok çeşit mikrobiyal topluluğun yaşaması için elverişli karmaşık bir ekosistemdir (4). Oral biyofilmler, patojen bakterilerin diş minesi, dental materyaller, kök yüzeyi, dental implantlar ve diğer oral yüzeylere yapışarak salgıladıkları EPS’ler içerisine gömülü topluluklardır (4). Diş yüzeyine, oral kavitede oluşan biyofilm tabakası “dental plak” olarak adlandırılmaktadır (39). Diş yüzeyi bakterilerin yapışarak biyofilm oluşturması için oldukça elverişli bir alandır. Bundan dolayı ağız içerisinde bol glikokaliks salgılanmış karmaşık yapıda biyofilmler gelişebilmektedir (40). Ağız içerisinde Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Fusobacterium nucleatum, Porphryromonas gingivalis, Candida albicans, Candida tropicalis ve Candida glabrata gibi patojen türler diş yüzeyine, diş eti oluğuna, implantlara ve diğer oral yüzeylere tutunarak biyofilm oluşturmaktadır. Biyofilm oluşumu kronik enflamasyonun gelişmesine zemin hazırlamaktadır. Biyofilm tabakası antimikrobiyal ajanların bakterilere ulaşmasını engelleyerek fiziksel bir bariyer görevi görmektedir. Biyofilm tabakası içinde yer alan persistan hücreler de tedaviye karşı direncin gelişmesinde önemli rol oynamaktadır (4,41-43). Biyofilmlerin neden olduğu kronik oral ve dental enfeksiyonlar; peri-implantit, periodontal hastalıklar, endodontik enfeksiyonlar, diş çürükleri, biyofilm ilişkili diş kayıpları ve implant başarısızlıkları olup, hastaların yaşam kalitesinin önemli ölçüde düşmesine neden olmaktadırlar (44). 5. Sonuç Biyofilmler, mikroorganizmaların hücre dışına salgıladıkları polimerik matriks içindeki organize kompleks yapılardır. Biyofilmler, enfeksiyon hastalıklarının oluşumunda ve kronikleşmesinde etkin rol oynamaktadır. Bakteriler biyofilm oluşturarak antimikrobiyallerden, dezenfektanlardan ve bağışıklık sisteminden korunabilmektedir. Bu durum bakterilerin antimikrobiyal ajanlara karşı dirençli hale gelmesini sağlayarak, enfeksiyon hastalıklarının tedavi sürecini zorlaştırmakta ve standart tedavilere yanıtı azaltmaktadır. Bu doğrultuda konvansiyonel antimikrobiyal tedavi yaklaşımlarının yanında biyofilm yapılarını inhibe ya da eradike eden tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi dirençli mikroorganizmalarla ve enfeksiyon hastalıkları ile mücadelede kritik önem taşımaktadır. Sonuç olarak biyofilmlerin dinamik yapısının anlaşılması, etkin tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi ve kronik enfeksiyonların kontrol altına alınabilmesi açısından oldukça önemlidir. Bu alanda yapılacak çalışmalar hem 96   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III klinikteki başarının artmasına hem de mikrobiyal sistemin anlaşılmasına önemli katkı sağlayacaktır. Kaynakça 1. Rather MA, Gupta K, Mandal M. Microbial biofilm: formation, architecture, antibiotic resistance, and control strategies. Braz J Microbiol. 2021;52(4):1701-1718. 2. Costerton JW, Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 1995;15(3):137-140. 3. Gün İ, Ekinci FY. Biyofilmler: yüzeylerdeki mikrobiyal yaşam. GIDA. 2009;34(3):165-173. 4. Kam-Hepdeniz Ö, Seçkin Ö. Dinamik mikrobiyal bir yaşam: oral biyofilm. SDÜ Sağlık Bilimleri Enstitüsü Dergisi. 2017;8(3):47-55. 5. Neu TR, Lawrence JR. The perfect slime. Flemming HC, Neu TR, Wingender J, editörler. Microbial extracellular polymeric substances (EPS). IWA; 2017: 25-60. 6. Saraçlı MA. “Quorum sensing”: mikroorganizmalar iletişim mi kuruyor? Gülhane Tıp Dergisi. 2006;48:244-250. 7. Marsh PD. Dental plaque: biological significance of a biofilm and community life-style. J Clin Periodontol. 2005;32(6):7-15. 8. Alam A, Kumar A, Tripathi P, Ehtesham NZ, Hasnain SE. Biofilms: a phenotypic mechanism of bacteria conferring tolerance against stress and antibiotics. Hasnain S, Ehtesham N, Grover S, editörler. Mycobacterium tuberculosis: molecular infection biology, pathogenesis, diagnostics and new interventions. Springer; Singapore; 2019. 9. Srivastava A, Verma N, Kumar V, ve ark. Biofilm inhibition/eradication: exploring strategies and confronting challenges in combatting biofilm. Arch Microbiol. 2024;206:212. 10. Shineh G, Mobaraki M, Bappy MJP, Mills DK. Biofilm formation, and related impacts on healthcare, food processing and packaging, industrial manufacturing, marine industries, and sanitation–a review. Appl Microbiol. 2023;3(3):629–665. 11. Del Pozo JL. Biofilm-related disease. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 2017;16(1):51–65. 12. Davey ME, O’toole GA. Microbial biofilms: from ecology tomolecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 2000;64:847867. 13. Donlan RM, Costerton JW. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 2002;15(2):167-193. YARA İYİLEŞMESİNDE SİYANOBAKTERİYEL BİYOAKTİF METABOLİTLER   103 Hücrenin koyu renkli periferik kısmı kromatoplazma ve açık renkli merkezi kısmı nükleoplazmadır (Şekil 1). Yedek besin maddeleri glikojen ve siyanofisin, volitindir. Siyanobakterilerde hücreler genelde ikiye böünerek çoğalır. Eşeysiz üreme görülürken ve eşeyli üremeye rastlanılmaz. İpliksi formlarında hücrelerin ölmesi ile ipliksi yapı parçalara ayrılır ki bu parçalara hormogonium adı verilir. Hormogoniumlar tekrar gelişerek yeni fertler oluşur. Dünya’daki yaşamın evriminde kritik rol oynayan bu organizmalar, geniş biyolojik çeşitliliğe sahiptir ve ekosistemlerdeki karbon, azot ve oksijen döngülerine önemli katkı sağlarlar. Tek hücreli (Synechococcus sp.), kolonial (Gloeocapsa sp.) veya filamentöz (Anabaena sp., Nostoc sp.) formlarda bulunabilirler. Bazı türlerde heterosist (azot fiksasyonu için) ve akinet (spor benzeri yapılar) gibi özelleşmiş hücreler bulunur. Anabaena sp., Nostoc sp. gibi bazı türler atmosferik azotu (N₂) amonyağa (NH₃) dönüştürebilir. (14) Şekil 1. Siyanobakteri hücresinin genel yapısı (15) Siyanobakteriler metabolit çeşitliliği ve biyoteknolojik potansiyeli ile dikkat çeken mikroorganizmalardır. Fotosentetik faaliyetleriyle atmosferik oksijenin büyük bir kısmını üretirler. Ağır metal ve toksik madde temizliğinde kullanılırlar. Lipid ve karbonhidrat içerikleri nedeniyle mikroalgal biyoyakıt üretiminde değerlidirler. (16) Tarımsal biyogübre olarak kullanılabilecek azot bağlayıcı türleri vardır. (17) Ayrıca farmasötik açıdan önemli bileşikler üretmeleri onları doğal ilaç kaynağı haline getirmiştir (4,18). 104   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 3. Siyanobakteriyel Biyoaktif Sekonder Metabolitler Siyanobakteriler çevresel strese karşı birçok koruyucu ve adaptif metabolit üretirler. Peptit ve depsipeptitlerden oluşan çok sayıda sekonder metabolit biyoaktif doğal ürünler içermede ümit vericidir. Anabaena sp., Spirulina sp., Oscillatoria sp. ve Nostoc sp. önemli sekonder metabolitler üretirler. Sekonder metabolit üretimi genetik ve çevresel faktörlere bağlıdır ve bu bileşikler çoğunlukla fikobiliproteinler (fikosiyanin, fikoeritrin), polisakkaritler, fenolik bileşikler, flavonoidler, alkaloidler, peptitler ve lipit türevleridir. Bu mikroorganizmalar ekstrem koşullarda yaşayabilmeleri genetik mühendisliğe uygun olmaları ve sekonder metabolit üretim potansiyelleri nedeniyle biyoteknoloji, ilaç endüstrisi ve çevre teknolojileri gibi birçok alanda araştırılmaktadırlar. Çizelge 1’de gösterildiği gibi antimikrobiyal, antifungal, antikanser, antioksidan ve antiviral etki gösteren bileşikler üretirler ve birçok tıbbi alanda kullanılabilecek değerli biyoaktif bileşiklerin doğal kaynağıdırlar. (19) Siyanobakteriyel metabolitlerin çoğu ilaç potansiyeli göstermektedir Calothrix sp.’den elde edilen Calothrixin A ve C’nin Plasmodium falciparum FAF6 suşunu inhibe ederek antiplazmodial aktivitesi oluğu keşfedilmiştir. Calothrixin A gibi alkaloid yapılı bileşikler DNA topoizomeraz inhibitörü olarak etkilidir. Hücre döngüsü durdurma, apoptoz uyarımı ve anjiyogenez baskılaması yoluyla etki eder. Lynbya majuscula’dan elde edilen kurasin A, kolon ve meme kanserinin büyümesini engeller (4,20). Nostoc sp. türlerinden izole edilen ve üretilen biyoaktif bileşenlerin sayısı artmaktadır. Borofisin Nostoc linckia ve Nostoc spongiaeforme’den izole edilen bor içerikli metabolittir ve kanser hücre hatlarına karşı antitümör aktivite göstermektedir. (21) Siyanobakteriler reaktif oksijen türlerinin (ROS) zararlı etkilerini antioksidan özellik sergileyebilmelerinden dolayı engelleyebilirler. Proliferasyon ve inflamasyon bozukluklarına tedavi edici olan bir dimerik indol alkaloidi olan siktonemin (SCY, 1) Lyngbya arboricola, Nostoc commune, Scytonema geitleri’den izole edilmiştir. (22) Synechocystis sp. türlerinin, Leptolyngbya sp. türlerinin ve Oscillatoria sp. türlerinin metanol özütlerinde antioksidan aktivite bildirilmiştir. (23) Spirulina sp.’nin farklı türlerinden ve özellikle Spirulina platensis’ten elde edilen polisakkaritlerin farklı zarflı virüslere karşı farklı antiviral aktivite gösterdiği bulunmuştur. (24) Herpes simpleks virüsü tip 1 (HSV-1)’ e karşı güçlü antiviral aktiviteye sahip polisakkarit nostoflan, karasal siyanobakteri Nostoc flagelliforme’den izole edilmiştir. (25) Siyanobakteriyel metabolitlerden olan kriptofisin SARS-CoV-2 (COVID-19)’a karşı üstün inhibitör potansiyeli göstermiştir. (26) YARA İYİLEŞMESİNDE SİYANOBAKTERİYEL BİYOAKTİF METABOLİTLER   105 Siyanobakteriler antimikrobiyal özelliklere sahip çok sayıda aktif bileşenlerin kaynağıdır. Hatta bu bakterilerden doğal olarak elde edilen birçok antibiyotik elde edilmiştir. Siyanobakteri Microcoleous lacustris’ten izole edilen ve bir diterpen olan abietan Salmonella typhi, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus’ a karşı antibakteriyel özellikler göstermektedir. (27) Yapılan bir çalışmada Desmonostoc muscorum (Nostocales) ekstresinin Staphylococcus saprophyticus’a karşı güçlü antibakteriyel etki sergilediği tespit edilmiştir. (28) Çizelge 1. Bazı siyanobakteriyel bileşikler ve farmakolojik etkileri (18,20,29,30) Siyanobakteri Bileşik Sınıf Farmakolojik Aktivite Hyella caespitosa Carazostatin Alkaloit Antifungal, antioksidan Lyngbya sp. Lyngbyazothrins A-D Siklik peptitler Antimikrobiyal Nostoc insulare Norharmane Aromatik Antialgal, antifungal, antibakteriyel, antikanser Nostoc commune Mycosporine Lipopeptit, alkaloit Antifungal, antibiyotik, antimitotik, sitotoksik Nostoc muscorum Muscoride Alkaloit Antibiyotik, abtibakteriyel antifungal Nostoc commune Noscomin Diterpen Antibakteriyel Nostoc linckia Nostoc spongiaeforme Borophycin Poliketid Antibakteriyel, sitotoksik Synechocystis trididemni Didemnin Lipopeptit Antikanser,antiviral, immün baskılayıcı Calothrix fusca Calophycin Siklik peptit Sitotoksik Scytonema sp. Scytoscalaro Sesterterpen Antibakteriyel, sitotoksik 4. Yara İyileşmesinde Kullanılan Siyanobakteri Metabolitleri Yaralar doku bütünlüğünün bozulduğu patolojik durumlardır ve iyileşmeleri birçok hücresel ve moleküler etkileşimi gerektirir. Enfeksiyon, oksidatif stres, yetersiz kollajen sentezi gibi faktörler, iyileşmeyi geciktirebilir. Bu nedenle, 106   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III yara bölgesinde antioksidan, antimikrobiyal, antiinflamatuar ve hücre yenileyici etki gösteren ajanlar önem taşımaktadır. (31) Yara iyileşmesi, inflamasyon, proliferasyon ve yeniden modelleme olmak üzere üç temel evreyi içeren dinamik bir biyolojik süreçtir. Günümüzde yara tedavisinde doğal kaynaklı ürünlere olan ilgi artmıştır. Siyanobakteriler içerdiği sekonder metabolitler sayesinde yara iyileşme sürecine katkı sağlayabilecek önemli mikrobiyal kaynaklardır. (32) Spirulina platensis, yüksek protein içeriği ve zengin biyoaktif bileşik kompozisyonuyla dikkat çeken bir siyanobakteridir. Özellikle antioksidan, antiinflamatuar ve immünomodülatör etkileri ile yara iyileşmesinde terapötik bir ajan olarak değerlendirilmektedir. (33,34) Siyanobakteriler içerdikleri zengin sekonder metabolit profilleri ile yara iyileşmesine katkıları daha detaylı araştırılmalıdır. Çizelge 2’de gösterildiği gibi fikobiliproteinler, polisakkaritler, fenolik bileşikler, alkaloidler, peptitler ve lipit türevleri gibi bileşikler farklı farmakolojik etkiler göstererek yara iyileşmesini çeşitli yollarla destekleyebilir (5,8). Çizelge 2. Yara iyileşmesinde etkili bazı siyanobakteiyel bileşikler Biyoaktif Bileşikler Etki Mekanizması Yara İyileşmesine Etkisi Referans C-fikosiyanin NF-κB baskılama, ROS azaltımı İnflamasyon hafiletir ve fibroblast proliferasyonu sağlar. (35) Ekzopolisakkarit Su tutma, immün yanıt uyarımı Granülasyon dokusu oluşumuna katkı sağlar. (36) Fenoller Serbest radikal süpürme ROS baskılama, fibroblast proliferasyon ve göç, büyüme faktörlerini artırma, epitel hücre proliferasyonu sağlar. (37) Karotenoid Lipid zar stabilizasyonu Membranı bütünlüğü sağlar, hücre proliferasyonu ve yara kapanmasını hızlandırır (38) Peptitler Sinyal yolağı aktivasyonu Hücre göçü ve doku yenilenmesi sağlar. (39) 4.1. Fikosiyanin Fikosiyaninler siyanobakteriler ve bazı kırmızı alglerde bulunan, suda çözünebilen fikobiliprotein pigmentleridir. Bunlar, özellikle C-fikosiyanin (C-PC) YARA İYİLEŞMESİNDE SİYANOBAKTERİYEL BİYOAKTİF METABOLİTLER   107 ve allo-fikosiyanin (APC) olmak üzere iki ana formda bulunur. Fikosiyaninlerin antioksidan, antiinflamatuar ve antiproliferatif etkileri vardır. Fikosiyaninler, nükleer faktör kappa-B (NF-κB) yolunu inhibe ederek proinflamatuar sitokinlerin (TNF-α, IL-6, IL-1β) salınımını azaltırlar. Bu etki, yaranın aşırı inflamasyon nedeniyle kronikleşmesini önler. Yapılan in vitro ve in vivo çalışmalarda ROS temizleyici özelliği ile oksidatif stresi azalttıkları, fibroblast çoğalmasını ve kollajen sentezini artırarak epitelizasyonu hızlandırdıkları belirlenmiştir. (40) C-fikosiyanin, LPS-uyarımlı RAW 264.7 makrofajlarında NF-κB aktivasyonunu baskılayarak anti-inflamatuar etki göstermektedir. (35) Başka bir çalışmada bleomisin ile indüklenen C-fikosiyanin pulmoner fibrozis modellerinde TLR2/4-MyD88-NF-κB yolunu baskılayarak inflamasyonu ve fibroblast aktivasyonunu azalttığı tespit edilmiştir. (41) Bir çalışmada Cfikosiyanin içeren S. platensis ekstresinin rat modelinde cilt üzerinde topikal uygulamasında yaranın bir hafta içerinde %80’e yakın kapandığı gözlemlenmiştir. Histolojik incelemelerde fibroblast sayısında artış, kollajen sentezinde hızlanma ve daha az inflamatuar hücre infiltrasyonu saptanmıştır. Ayrıca NF-κB ve TNF-α ekspresyonu azaldığı ve antioksidan enzim aktivitelerinin arttığı tespit edilmiştir. (42) 4.2. Ekzopolisakkaritler Ekzopolisakkaritler (EPS) mikroorganizmalar tarafından hücre dışına salgılanan, genellikle kompleks yapılı, yüksek moleküler ağırlıklı polisakkaritlerdir. Genellikle glukoz, galaktoz, mannoz, rhamnoz, fukoz gibi çeşitli monosakkaritlerden oluşurlar. Bazıları sülfat, asetil, fosfat veya protein gibi yan gruplar içerir. Bu yapılar bakteriler, siyanobakteriler, algler ve bazı mantarlar gibi organizmalar tarafından üretilir ve hücrelerin çevresiyle etkileşimde önemli roller üstlenirler. (43) Nostoc sp., Anabaena sp., Phormidium sp. ve Gloeocapsa sp. gibi siyanobakyterilerde yüksek EPS üretimi bilinir. EPS yüzey nemliliğini artırır, granülasyon dokusunu destekler. Biyofilm oluşturarak yara bölgesini dış etkenlerden koruyabilir ve immünmodülatör etki göstererek makrofaj aktivitesini artırır. Siyanobakteriyel EPS nem tutma, hücre yenilenmesini destekleme ve antimikrobiyal etki gibi özellikleriyle yara iyileşmesinde potansiyel biyomateryal olarak değerlendirilmektedir. (44) Yapılan bir çalışmada Nostoc sp. PCC7936 ve PCC7413 EPS’nin fibroblast göçü ve proliferasyonunu artırarak yara iyileşmesini desteklediği vurgulanmıştır. (45) Başka bir çalışmada Nostoc NIES2111_MUM004 su ekstraktı in vitro scratch assay (yara kapatma testi) ile değerlendirildiğinde % 108   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 42,7 oranında yara kapanması sağlamıştır. (46) Siyanobakteri Anabaena sp. EPS’nin hemostatik özellik gösterip pıhtılaşma süresini anlamlı bir biçimde kısalttığı bildirilmiştir. (47) 4.3. Fenolik Bileşikler Bitkilerde, alglerde ve bakterilerde yaygın olarak bulunan ve biyolojik olarak aktif olabilen sekonder metebolitler insan ve hayvan sağlığına olumlu etkileri vardır. Fenolik bileşikler, yapılarında en az bir hidroksil (OH) grubu taşıyan aromatik halka (benzen) içeren organik bileşiklerdir. Fenolik asitler ve flavanoidler olmak üzere iki ana sınıfa ayrılırlar. Fenolik asitler hidroksisinamik asitler ve hidroksibenzoik asitler; flavanoidler ise fenolik bileşiklerin en önemli grubudur ve flavonoller, flavanonlar, flavonlar, izoflavonoidler, kateşinler olmak üzere gruplara ayrılmaktadır. (48) Flavonoidlerin yara iyileşmesi üzerinde anti-inflamatuar, antioksidan, anjiyogenez ve re-epitelizasyon gibi çok yönlü etkileri bulunmaktadır. (49) Fenolik bileşiklerin güçlü antioksidan özellikler sergilerler ve yara bölgesinde serbest radikaller iyileşmeyi yavaşlatmaktadır. Fenolik bileşikler serbest radikalleri nötralize ederek oksidatif stresi azaltarak hücre hasarı önlenmiş olur. Kafeik asit ve gallik asit gibi fenolik asitler, oksidatif hasara karşı hücreleri koruyarak yara iyileşmesini hızlandırmaktadır. Fenoller proinflamatuar sitokinleri (örneğin TNF α, IL 1β, IL 6) azalttığı ve antiinflamatuar sitokinleri (IL 10 gibi) arttırdığı bilinmektedir. (50,51,52) Ferulik asit ve resveratrol gibi fenolik bileşikler, iltihabı azaltıcı etkileri ortaya konulmuştur. (53,54) Açık yaralar bakterilere karşı savunmasızdır ve bu durumda oluşan enfeksiyon iyileşmeyi bozmaktadır. Fenolik bileşikler, özellikle Gram pozitif bakterilere karşı antimikrobiyal etki göstererek enfeksiyonu önler. Timol, katekol, ve bazı flavonoid türevleri bakteriyel büyümeyi inhibe edebilir. (55,56) Nostoc NIES-2111_MUM004 siyanobakterinin su ekstraktlarındaki fenolik bileşiklerin antioksidan aktiviteleri nedeniyle in vitro yara iyileşmesi açısından etkisi olduğu incelenmiştir. (46) Birçok siyanobakteri türü (Anabaena sp., Tolypothrix tenuis, Lyngbya sp., Phormidium sp.) üzerinde yapılan çalışmalar, fenolik asitler (galik, klorojenik, kafeik, ferulik, vanilik) ve flavonoidlerin (kuersetin, kaempferol, rutin) varlığını doğrulamıştır ve bu bileşiklerin DPPH ve diğer antioksidan testlerinde yüksek etkinlik gösterdiği, yara iyileşmesini destekleyen özellikleri olduğu sunulmuştur. (57,58) YARA İYİLEŞMESİNDE SİYANOBAKTERİYEL BİYOAKTİF METABOLİTLER   109 4.4. Karotenoidler Karotenoidler doğada yaygın olarak bulunan, yağda çözünebilen, sarı, turuncu veya kırmızı pigmentlerdir. Bitkiler, algler, mantarlar, bazı bakteri ve siyanobakteriler dahil olmak üzere pek çok organizmada bulunurlar. Karotenoidlerin serbest radikalleri nötralize ederek hücreleri oksidatif strese karşı koruduğu ve inflamasyonu baskılayarak bağışıklık hücrelerini desteklediği bildirilmiştir. (59) Karotenoidler fibroblastların proliferasyonunu ve kollajen üretimini artırarak deri dokusunun yeniden yapılanmasını desteklerler. Astaksantin ve likopen gibi karotenoidlerin, yara bölgesindeki hücrelerin göçünü teşvik ettiği ve epidermal yenilenmeyi hızlandırdığı gösterilmiştir. (60,61) Yapılan bir çalışmada astaksantin içeren kollajen bazlı hidrojel film, Wistar sıçanlarında hem tam kat eksizyon hem de lineer insizyon modellerinde fibroblast sayısını, kollajen içeriğini, granülasyon dokusu oluşumunu ve epitelizasyon hızını anlamlı biçimde arttırdığı tespit edilmiştir. (62) Bazı karotenoidlerin yara enfeksiyonlarını önleyebilecek antibakteriyel özellikleri de yara iyileşmesine dolaylı katkıda bulunur. (63) Siyanobakterilerde (Synechocystis sp., Phormidium sp., Anabaena sp., Nostoc sp.) gibi β-karoten ve zeaksantin gibi karotenoidlerin yaygın olarak bulunduğu gösterilmiştir. Bu karotenoidler, güçlü antioksidan ve anti-inflamatuar özelliklere sahip olup, doku yenilenmesini teşvik edebileceği bildirilmiştir. (64) 4.5. Peptitler Siyanobakteriler peptit yapısında antibakteriyel, antifungal, antiinflamatuar ve antikanser etkiler gösteren silkik depsipeptitler (mikrosistin, anabaenopeptin), linear peptitler ve lipopeptitler gibi bileşikler içerirler. Yapılan çalışmalarda siyanobakteriyel ekstraktların veya saflaştırılmış peptitlerin fibroblast proliferasyonunu artırdığı, hücre göçünü hızlandırdığı, anjiyogenezi teşvik ettiği ve inflamasyonun azalmasına katkı sağladığı bildirilmiştir. (5,65,66) Araştırmalara göre siyanobakteriyel peptitler yara bölgesindeki bakterilere karşı etkili olarak enfeksiyon riskini azaltmaktadır. Lyngbyapeptidlerin bazı gram-pozitif bakterilere karşı etkili olduğu tespit edilmiştir. Bazı siyanobakteri peptitlerinin de inflamasyonu azaltarak bu süreci normalleştirdiği belirlenmiştir. Spirulina platensis’ten elde edilen peptitler in vitro ve in vivo modellerde antioksidan, antiinflamatuar ve proliferatif etkiler göstererek yara iyileşmesini hızlandırmıştır. S. platensis proteinden elde edilen peptitlerin nanolipozom ile enkapsülasyonu fare modelinde dermal fibroblastlar üzerinde toksisite 110   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III riski olmadan proliferasyon ve migrasyonu arttırdığı, bFGF, CD31, COL1A gibi yara iyileşme markırlarını da yükselttiği tepit edilmiştir. (67) Bu alanda yapılan hayvan modeli çalışmaları ve sınırlı sayıda klinik uygulama ileride siyanobakteriyel peptitlerin yara bakımından potansiyel terapötik ajanlar olabileceğini göstermektedir. 5. Sonuç Siyanobakterilerin yara iyileşmesinde terapötik potansiyeli yapılan in vitro ve in vivo çalışmalar ile ortaya konulmuştur. Bu etkilerin başlıca mekanizmaları, antioksidan, antiinflamatuvar, fibroblast proliferasyonunu teşvik edici ve doku yeniden yapılanmasını hızlandırıcı özelliklerle ilişkilidir. Özellikle Spirulina sp. türlerinden izole edilen fikosiyanin pigmenti, oksidatif stresi azaltarak ve VEGF gibi büyüme faktörlerini aktive ederek yara dokusunda reepitelizasyonu desteklerken; siyanobakterilere özgü ekzopolisakkaritler, immün modülasyon ve hücresel migrasyon üzerinde düzenleyici rol oynamaktadır. Ayrıca siyanobakteri kaynaklı fenoller ve karotenoidler, ROS’ları baskılayarak doku hasarını azaltmakta; biyolojik peptitler ise hücre sinyal yollarını etkileyerek kollajen sentezini artırmaktadır. Bu bileşiklerin sinerjik etkileri, siyanobakterilerin yara iyileştirici potansiyelini artırmakta ve bu mikroorganizmaları biyofarmasötik alanında umut vadeden doğal ajanlar haline getirmektedir. Ancak, mevcut bulguların klinik uygulamalara entegre edilebilmesi için bu maddelerin farmakokinetik profilleri, güvenlilik sınırları ve formülasyon teknikleri üzerine daha kapsamlı çalışmalar yapılması gerekmektedir. Kaynaklar 1. Eming S, A., Martin P, Tomic-Canic M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Sci. Transl. Med. 2014;6(265):1-36. 2. Wijffels RH, Kruse O, Hellingwerf KJ. Potential of industrial biotechnology with cyanobacteria and eukaryotic microalgae. Curr. Opin. Biotech. 2013;24(3):405-413. 3. Garlapati D, Chandrasekaran M, Devanesan A, Mathimani T, Pugazhendhi A. Role of cyanobacteria in agricultural and industrial sectors: an outlook on economically important byproducts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019;103(12):4709-4721. 4. Gademann K, Portmann C. Secondary metabolites from cyanobacteria: complex structures and powerful bioactivities. Curr. Org. Chem. 2008;12(4):326341. YARA İYİLEŞMESİNDE SİYANOBAKTERİYEL BİYOAKTİF METABOLİTLER   111 5. Demay J, Halary S, Knittel-Obrecht A, et al. Anti-inflammatory, antioxidant, and wound-healing properties of cyanobacteria from thermal mud of Balaruc-Les-Bains, France: a multi-approach study. Biomolecules. 2020;11(1):28-49. 6. Abed RM, Dobretsov S, Sudesh K. Applications of cyanobacteria in biotechnology. J. Appl. Microbiol. 2009;106(1):1-12. 7. Sarkar P, Stefi RV, Pasupuleti M, Paray BA, Al-Sadoon MK, Arockiaraj J. Antioxidant molecular mechanism of adenosyl homocysteinase from cyanobacteria and its wound healing process in fibroblast cells. Mol. Biol. Rep. 2020;47(3):1821-1834. 8. de Andrade AF, Porto ALF, Bezerra RP. Photosynthetic microorganisms and their bioactive molecules as new product to healing wounds. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2022;106(2):497-504. 9. Younis NS, Mohamed ME, El Semary NA. Green synthesis of silver nanoparticles by the Cyanobacteria Synechocystis sp.: Characterization, antimicrobial and diabetic wound-healing actions. Mar. Drugs. 2022;20(1):5677. 10. Karma NI, Mellou F, Pavlou P, Siamidi A,Varvaresou A. Compounds of Marine Origin with Possible Applications as Healing Agents. Mar. Drugs. 2024;23(1):5-31. 11. Romay CH, Armesto J, Remirez D, González R, Ledon N, García I. Antioxidant and anti-inflammatory properties of C-phycocyanin from bluegreen algae. Inflamm. Res. 1998;47(1):36-41. 12. Thajuddin N, Subramanian G. Cyanobacterial biodiversity and potential applications in biotechnology. Curr. Sci. 2025;89:47-57. 13. Yadav P, Singh RP, Rana S, et al. Mechanisms of stress tolerance in cyanobacteria under extreme conditions. Stresses. 2022;2(4):531-549. 14. Altuner Z. Sistematik Botanik-I. 8. Baskı. İstanbul-Türkiye:Aktif Yayınevi; 2010. 15. Lee RE. Phycology. Colorado-ABD:Cambridge University;2008. 16. Farrokh P, Sheikhpour M, Kasaeian A, Asadi H, Bavandi R. Cyanobacteria as an eco‐friendly resource for biofuel production: a critical review. Biotechnol. Prog. 2008;35(5):e2835. 17. Chittora D, Meena M, Barupal T, Swapnil P, Sharma K. Cyanobacteria as a source of biofertilizers for sustainable agriculture. Biochem. Biophys. Rep. 2020;22(2020):100737-100747. 18. Singh RK, Tiwari SP, Rai AK, Mohapatra TM. (2011). Cyanobacteria: an emerging source for drug discovery. J. Antibiot. 2011;64(6):401-412. 112   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 19. Hassouani M, Sabour B, Belattmania Z, et al. In vitro anticancer, antioxidant and antimicrobial potential of Lyngbya aestuarii (Cyanobacteria) from the Atlantic coast of Morocco. J. Mater. Environ. Sci. 2017;8(1): 49234933. 20. Sharma NK, Tiwari SP, Tripathi K, Rai AK. Sustainability and cyanobacteria (blue-green algae): facts and challenges. J. Appl. Phycol. 2011;23(6):1059-1081. 21. Rastogi RP, Sinha RP. Biotechnological and industrial significance of cyanobacterial secondary metabolites. Biotechnol. Adv. 2009;27(4):521-539. 22. Pathak J, Richa R, Sonker AS, Kannaujiya VK, Sinha RP. Isolation and partial purification of scytonemin and mycosporine-like amino acids from biological crusts. J. Chem. Pharm. Res. 2015;7(1):362-371. 23. Aydaş SB, Ozturk S, Aslım B. Phenylalanine ammonia lyase (PAL) enzyme activity and antioxidant properties of some cyanobacteria isolates. Food Chem. 2013;136(1):164-169. 24. Khalifa SA, Shedid ES, Saied EM, et al. Cyanobacteria—From the oceans to the potential biotechnological and biomedical applications. Mar. Drugs. 2021;19(5): 241-276. 25. Kanekiyo K, Lee JB, Hayashi K, et al. Isolation of an antiviral polysaccharide, nostoflan, from a terrestrial cyanobacterium, Nostoc f lagelliforme. J. Nat. Prod. 2005;68(7):1037-1041. 26. Naidoo D, Roy A, Kar P, Mutanda T, Anandraj A. Cyanobacterial metabolites as promising drug leads against the Mpro and PLpro of SARSCoV-2: an in silico analysis. J. Biomol. Struct. Dyn. 2021;39(16):6218-6230. 27. Cock IE, Cheesman MJ. (2023). A review of the antimicrobial properties of cyanobacterial natural products. Molecules 2023;28(20):7127-7170. 28. Arguelles E. Chemical composition and potent antibacterial activities of colony-forming cyanobacteria, Desmonostoc muscorum (Nostocales, Cyanophyceae). Int. J. Second. Metab.2024;11(3): 522-532. 29. Wase NV, Wright PC. Systems biology of cyanobacterial secondary metabolite production and its role in drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 2008;3(8):903-929. 30. Niedermeyer THJ. Anti-infective natural products from cyanobacteria. Planta Med. 2015;81(15):1309-1325. 31. Fadilah NIM, Phang SJ, Kamaruzaman N, et al. Antioxidant biomaterials in cutaneous wound healing and tissue regeneration: A critical review. Antioxidants. 2023;12(4):787-822. ANTİMİKROBİYAL DİRENÇLE MÜCADELEDE İLAÇ YENİDEN . . .   119 süreç araştırmacıları mevcut ilaçların yeniden farklı bir amaçla kullanılması çalışmalarına yönlendirmiştir. Geleneksel ilaç geliştirme basamaklarına kıyasla İYK araştırmalarının süresi daha kısa ve daha az maliyetlidir. Üstelik İYK araştırmalarındaki başarı oranı da daha yüksektir (11). Mevcut ilaçların güvenlik profilleri bilindiğinden klinik deneylerdeki risklerin de azaltılmış olduğu düşünülmektedir (12). Bir ilacın yeniden kullanımı yapılan araştırmageliştirme (Ar-Ge) çalışmalarının ardından, Türkiye İlaç ve Tıbbi Cihaz Kurumu (TİTCK), Amerikan İlaç ve Gıda Dairesi (FDA), Avrupa İlaç Ajansı (EMA) ve İngiltere İlaç ve Sağlık Ürünleri Düzenleme Kurumu (MHRA) gibi düzenleyici kurumlar tarafından değerlendirilerek onaylanmakta ve yeniden, yeni amaçla ticari kullanıma sunulmaktadır (13). Son yıllarda FDA tarafından onaylanan yeni ilaçların yaklaşık %30’u İYK araştırmaları sonucunda geliştirilmiştir (14). Ticari olarak talidomid, metformin, finasterid, sildenafil ve hidroksiklorokin gibi birçok ilacın yeniden konumlandırılarak kullanıma sunulduğu bilinmektedir (3,12,15). 3.1.İlaçYenidenKonumlandırma:SüreçveYöntemler İYK sürecinde mevcut ilaçların yeni ve farklı terapötik alanlarda kullanımı sistematik olarak değerlendirilmektedir. Öncelikle in silico araştırmalar kapsamında bilgisayarlı ilaç tasarımları, “high-throughput screening” adı verilen yüksek verimli tarama adımlarının ardından biyoinformatik analizlerle süreç desteklenmektedir (12). Mevcut ilaçların bir kütüphanesi oluşturularak, yeni hedeflerle etkileşimleri test edilmektedir. Bu adımda moleküler docking gibi bilgisayar modelleme teknikleri ile ilaçların hedef proteinlerle etkileşimleri simüle edilmektedir. Böylece mevcut ilaç, potansiyel antimikrobiyal ajan olarak belirlenmektedir (16). Ardından mevcut ilacın farklı mikroorganizmalara karşı etkileri laboratuvar ortamında hücre temelli ve fenotipik tarama yöntemiyle test edilmektedir. Sonraki basamakta, aday ilaçların antimikrobiyal aktivitelerini test etmek için in vitro deneyler yürütülmektedir. Bu deneyler kapsamında mevcut ilacın, bakterinin büyümesini inhibe etme yeteneği ve bakteriyel direnç mekanizmalarına karşı etkinlikleri test edilmektedir. Bu süreçte mevcut ilaçların beklenmedik antimikrobiyal aktivitelerinin ortaya çıkması sağlanmaktadır (17). Daha sonra, mevcut ilacın farmakolojik ve toksikolojik etkilerinin değerlendirilmesi gerçekleştirilmektedir. Öte yandan, mevcut ilaçların güvenlik profilleri bilindiğinden, mevcut güvenlik verileri ile preklinik basamakların daha hızlı bir şekilde tamamlanması sağlanmaktadır. Tüm basamakların ardından, mevcut ilaç yeni amacına yönelik klinik deneylere tabii 120   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III tutulmaktadır. Klinik deneyler kapsamında mevcut ilacın yeni endikasyonlar için etkinliği ve güvenliğinin doğrulanması amaçlanmaktadır (18). Bütün bu deneysel basamakların kombinasyonu İYK araştırmaları sürecinde kapsamlı bir değerlendirme sağlamaktadır. 4. Antimikrobiyal Direnç ve İlaç Yeniden Konumlandırma Yeni antimikrobiyal ilaçların keşfedilmesi oldukça zor, uzun zaman alan, maliyetli ve başarısızlık ihtimali yüksek olan bir süreçtir. Yeni bir ilacın tasarlanma süresi yaklaşık 15 yıl iken, bu süre içerisinde yapılan yüzlerce in vitro, in vivo çalışmalar başta olmak üzere preklinik ve klinik araştırma basamaklarının ardından Ar-Ge çalışmalarının yapılması gerekmektedir. Bu araştırmaların maliyetinin yaklaşık 3 milyar dolar olduğu bilinmektedir. Dolayısıyla yeni bir ilacın keşfedilme sürecinde oldukça yüksek miktarlarda finansal destek gerekmektedir (19). İYK, bir ilacın yeniden keşfedilmesine kıyasla daha hızlı ve ekonomik bir süreçtir. İYK, AMD gibi Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) tarafından küresel acil durum ilan edilen, hızlı çözüm gerektiren halk sağlığı problemlerinde umut verici bir yöntem olarak karşımıza çıkmaktadır (Şekil 1) (12). Şekil 1. İlaç yeniden konumlandırma (20,21). İYK araştırmaları genellikle bilgisayarlı modelleme (in silico analizler), yüksek verimli fenotipik tarama, hücresel ve genetik analizler gibi yöntemlerle gerçekleştirilmektedir (22). İYK’nın klinik uygulamaya daha kısa sürede geçiş, daha düşük Ar-Ge maliyeti ve güvenlik profilinin bilinmesi sayesinde daha düşük toksisite riski gibi avantajları bulunmaktadır (10). ANTİMİKROBİYAL DİRENÇLE MÜCADELEDE İLAÇ YENİDEN . . .   121 Bunların yanında ilaç adaylarının yeniden kullanımına yönelik düzenleyici yönergelerin olmaması, düzenleyici kurumlara bilgi sağlanması süreci, İYK adayı olan bir ilacın amaçlandığı endikasyon için başarısız olması, yeni endikasyon dozlarının belirlenmesi, olası yan etkilerin değerlendirilmesi ve ilaçların bakteriyel hedeflere özgül olması gibi bazı zorlukları da bulunmaktadır (13). 5. Antimikrobiyal Strateji Olarak İlaç Yeniden Konumlandırma İYK hakkında son yıllarda yapılan araştırmalar AMD ile mücadelede önemli bir araç olabileceğine işaret etmektedir. İYK kapsamında ilaçların tek başına ya da özellikle geniş spektrumlu ajanlarla kombinasyon terapilerinde birlikte kullanımı ile etkili antibakteriyel aktiviteler elde edilebilmektedir. Yapılan çalışmalar antikanser, diyabet, antiinflamatuar, immünmodülatör, antiviral ve antiparaziter etkili mevcut ilaçların antimikrobiyal etkinlik gösterdiğine işaret etmektedir (19). İYK, bakterilerdeki AMD mekanizmalarını hedef alarak ilaç direncini kırmayı hedeflemektedir. Kanser tedavisinde kullanılan ilaçların, bakterideki antimikrobiyal enzimleri inhibe ederek antibiyotik direncinin azaltılmasına katkı sağladığı çalışmalarda gösterilmiştir (19,23). Bir çalışma, antitümör ilaç olan mitomisin C’nin, çoklu ilaca dirençli (ÇİD) Acinetobacter baumannii bakterisine karşı antibakteriyel etkinlik gösterdiğini ifade etmiştir (24). Farklı bir araştırma, steroid olmayan antiinflamatuar ilaçların (NSAID), örneğin ibuprofen ve aspirinin Pseudomonas aeruginosa biyofilmine karşı etkili olduğunu bildirmiştir (25). Antidepresan ilaç olan sertralinin bazı bakteriyel ve fungal enfeksiyonlara karşı etkili olduğu birçok çalışmada gösterilmiştir (26-29). Zidovudin gibi AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) hastalığının tedavisinde kullanılan ilaçların Gram-negatif bakterilere karşı etkili olduğu, antihelmintik bir ilaç olan niklozamidin Gram-pozitif bakterilere karşı antibakteriyel etki gösterdiği ve ivermektin gibi antiparaziter ilaçların da potansiyel antibakteriyel etkinliğinin olduğu yapılan çalışmalarda tespit edilmiştir (30-32). Diyabet tedavisinde kullanılan metforminin bakteri metabolizması üzerinde antibakteriyel aktivitesinin varlığı, Romatoid Artrit (RA) tedavisinde kullanılan altın bileşiği olan auranofinin hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakterilere karşı etkili olduğu ve alkol bağımlılığı tedavisinde kullanılan disülfiramın ise bakteri enzimlerini inhibe ederek antibakteriyel etki gösterdiği çalışmalarda gösterilmiştir (33-36). 122   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III 6. İlaç Yeniden Konumlandırma ve Beklentiler Antimikrobiyal dirençle mücadele amacıyla İYK araştırmaları giderek önem kazanmaktadır. Makine öğrenmesi ve yapay zekâ araştırmalarının İYK araştırmalarına entegrasyonu ile sürecin hızla geliştirilmesi öngörülmektedir. Yapay zekâ destekli ilaç taramaları, büyük veri analitiği ve genetik profilleme teknikleri ile gelecek araştırmaların panoramik yelpazede uygulanması ile sürecin farmakodinamik ve farmakokinetik modellemelerle desteklenerek direnç gelişimlerinin öngörülmesinin ardından güncel antimikrobiyal tedavi stratejilerinin geliştirilmesi beklenmektedir. 7. Sonuç AMD küresel bir sağlık sorunu olarak varlığını her geçen gün daha fazla hissettirmektedir. AMD ile mücadele etmek için alternatif stratejiler arasında yer alan İYK araştırmaları, bu sorunla mücadelede umut vadetmektedir. Mevcut ilaçların antimikrobiyal tedavide yeni endikasyonlar için kullanılması zaman ve maliyet açısından büyük avantaj sağlamaktadır. Ancak İYK araştırmalarının başarılı olabilmesi için daha kapsamlı klinik araştırmalara ihtiyaç vardır. Bu alanda yapılacak araştırmaların derinleştirilmesi ile antimikrobiyal mücadelede önemli bir ilerleme sağlanabilir. Kaynakça 1) DSÖ, Dünya Sağlık Örgütü. Antimicrobial resistance. https://www. who.int/news-room/fact-sheets/detail/antimicrobial-resistance. 2023. Erişim tarihi: 6 Şubat, 2025. 2) Miró-Canturri A, Ayerbe-Algaba R, Smani Y. Drug repurposing for the treatment of bacterial and fungal infections. Front Microbiol. 2019;10:41. 3) Barbarossa A, Rosato A, Corbo F, ve ark. Non-antibiotic drug repositioning as an alternative antimicrobial approach. Antibiotics (Basel). 2022;11(6):816. 4) Abushaheen MA, Muzaheed, Fatani AJ, ve ark. Antimicrobial resistance, mechanisms and its clinical significance. Dis Mon. 2020;66(6):100971. 5) Agarwal V, Tiwari A, Varadwaj P. An extensive review on β-lactamase enzymes and their inhibitors. Curr Med Chem. 2023;30(7):783808. 6) Rice LB, Bonomo RA. Mechanisms of resistance to antibacterial agents. Caroll J, Funke KC, Jorgensen G, Landry JH, Warnock ML, Versalovic DW. Manual Clinical Microbiology, 10. Baskı; 2011. ANTİMİKROBİYAL DİRENÇLE MÜCADELEDE İLAÇ YENİDEN . . .   123 7) Li XZ, Plesiat P, Nikaido H. The challenge of efflux-mediated antibiotic resistance in gram-negative bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 2015:28(2):337-418. 8) Prajapati JD, Kleinekathöfer U, Winterhalter M. How to enter a bacterium: bacterial porins and the permeation of antibiotics. Chemical Reviews. 2021;121(9):5158-5192. 9) Singh S, Datta S, Narayanan KB, Rajinish KN. Bacterial exopolysaccharides in biofilms: role in antimicrobial resistance and treatments. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology. 2021:19;140. 10) Kulkarni VS, Alagarsamy V, Solomon VR, Jose PA, Murugeasn S. Drug repurposing: an effective tool in modern drug discovery. Russ J Bioorg Chem. 2023;49(2):157-166. 11) Cüvitoğlu A, Işık Z. Akciğer ve prostat kanseri için ilaç yeniden konumlandırmanın uygulanması. Avrupa Bilim ve Teknoloji Dergisi. 2020;(Özel Sayı):297-304. 12) Pushpakom S, Iorio F, Eyers PA, ve ark. Drug repurposing: progress, challenges and recommendations. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(1):41-58. 13) Uysal İ, Köse U. İlaç keşfi ve yapay zekâ. M. Bilen. Yapay zekanın değiştirdiği dinamikler. Eğitim Yayınevi, 2022. 14) Ashburn TT, Thor KB. Drug repositioning: identifying and developing new uses for existing drugs. Nat Rev Drug Discov. 2004:3(8):673-683. 15) Jun CD. Predictive methods in drug repurposing: gold mine or just a bigger haystack? Drug Discov Today. 2013;18(11-12):523-532. 16) Oprea TI, Overington JP. Computational and practical aspects of drug repositioning. Assay Drug Dev Technol. 2015;13(6):299-306. 17) Thangamani S, Younis W, Seleem MN. Repurposing ebselen for treatment of multidrug-resistant staphylococcal infections. Sci Rep. 2015;26(5):11596. 18) Nosengo N. Can you teach old drugs new tricks? Nature. 2016;534(7607):314-316. 19) Joon P, Dahiya M, Sharma G, ve ark. Drug repurposing: An advance way to traditional drug discovery. Drug Repurposing for Emerging Infectious Diseases and Cancer. 2023;1-25. 20) Carocci A. (Ed). Drug Repositioning in Antimicrobial Therapy (Special Issue). 2023, sayısındaki görselden esinlenilerek çizilmiştir. 21) Smart Servier Medical Art, https://smart.servier.com/ (Yazar tarafından Şekil 1’in Power Point programı ile oluşturulmasında kullanılmıştır). 124   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III Lisanslama: CC BY 4.0. https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.Erişim Tarihi: 13.02.2025. 22) Çelik İN, Arslan FK, Tunç R, Yıldız İ. İlaç keşfi ve geliştirilmesinde yapay zekâ. Ank Ecz Fak Derg. 2021;45(2):400-427. 23) Soo VW, Kwan BW, Quezada H, ve ark. Repurposing of anticancer drugs for the treatment of bacterial infections. Curr Top Med Chem. 2017;17(10):1571176. 24) Cruz-Muñiz MY, López-Jacome LE, Hernández-Durán M, ve ark. Repurposing the anticancer drug mitomycin C for the treatment of persistent Acinetobacter baumannii infections. Int J Antimicrob Agents. 2018;52(6):868. 25) Schneider EK, Reyes-Ortega F, Velkov T, Li J. Antibiotic-nonantibiotic combinations for combating extremely drug-resistant Gram-negative ‘superbugs’. Essays Biochem. 2017;61(1):115-125. 26) Çoban AY, Tanrıverdi-Çaycı Y, Keleş-Uludağ S. Sertralinin antibakteriyel etkinliğinin araştırılması. Mikrobiyol Bul. 2009;43:651-656. 27) Lass-Flörl C, Ledochowski M, Fuchs D, ve ark. Interaction of sertraline with Candida species selectively attenuates fungal virulence in vitro. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003;35:11-15. 28) Ayaz M, Subhan F, Ahmed J, ve ark. Sertraline enhances the activity of antimicrobial agents against pathogens of clinical relevance. J Biol Res (Thessalon). 2015:22(1):4. 29) Munoz-Bellido JL, Munoz-Criado S, Garcìa-Rodrìguez JA. Antimicrobial activity of psychotropic drugs: selective serotonin reuptake inhibitors. Int J Antimicrob Agents. 2000;14(3):177-180. 30) Ng, SMS, Sioson, JSP, Yap, JM, ve ark. Repurposing zidovudine in combination with tigecycline for treating carbapenem-resistant Enterobacteriaceae infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2018;37(1):141148. 31) Rajamuthiah R, Fuchs BB, Conery AL, ve ark. Repurposing salicylanilide anthelmintic drugs to combat drug resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 2015;10(4):e0124595. 32) Kalangadan N, Mary AS, Mani K, ve ark. Repurposing ivermectin and ciprofloxacin in nanofibers for enhanced wound healing and infection control against MDR wound pathogens. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 2023;90:105166. 33) Hossain S, Rafi RH, Ripa FA, ve ark. Modulating the antibacterial effect of the existing antibiotics along with repurposing drug metformin. Arch Microbiol. 2024;206(6):274. ANTİMİKROBİYAL DİRENÇLE MÜCADELEDE İLAÇ YENİDEN . . .   125 34) Chadha J, Khullar L, Gulati P, Chhibber S, Harjai K. Anti-virulence prospects of metformin against Pseudomonas aeruginosa: A new dimension to a multifaceted drug. Microb Pathog. 2023;183:106281. 35) Liu Y, Lu Y, Xu Z, Ma X, Chen X, Liu W. Repurposing of the gold drug auranofin and a review of its derivatives as antibacterial therapeutics. Drug Discov Today. 2022;22(7):1961-1973. 36) Lajarin-Reinares M, Pena-Rodríguez E, Cañellas-Santos M, ve ark. Repurposing disulfiram as an antimicrobial agent in topical infections. Antibiotics (Basel). 2022;11(12):1752. 127 BÖLÜM IX ANTİMİKROBİYAL PEPTİTLER AntimicrobialPeptides Gonca ŞİMŞEK1 & Zeynep SÜMER2 1(Bio. Gonca ŞİMŞEK), Sivas Cumhuriyet Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Temel Tıp Bilimleri Bölümü, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Sivas/TÜRKİYE E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0001-6165-1614 2(Prof. Dr. Zeynep SÜMER), Sivas Cumhuriyet Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Temel Tıp Bilimleri Bölümü, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Sivas/TÜRKİYE E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0002-1520-3359 1. Giriş Bütün canlılar, mikroorganizmalara karşı kendilerini korumak amacıyla, doğal bağışıklık sistemlerinin bir parçası olarak çeşitli antimikrobiyal peptitler (AMP) üretmekte, bu peptitler yardımıyla meydana gelecek olan enfeksiyonlara karşı özel bir immün yanıt oluşturarak mikroorganizmaları etkisiz hale getirmektedirler. AMP’ler, ökaryotlarda, bakterilerde ve arkelerde yaygın olarak bulunan ve ribozomal translasyonel mRNA veya ribozomal olmayan peptit sentezi ile üretilen bir antimikrobiyal molekül sınıfıdır. AMP’ler, farklı etki mekanizmaları yoluyla hem Gram negatif hem de Gram pozitif bakteriler, mantarlar ve virüsler dahil olmak üzere çok çeşitli mikroorganizmalara karşı doğrudan ve güçlü antimikrobiyal aktivite gösterir. Vücutta enfeksiyonlara karşı savunmanın bir parçası olarak doğal bir şekilde ortaya çıktıklarından, genellikle konak savunma peptitleri (Host Defense Peptites, HDP) olarak adlandırılmaktadırlar. HDP’ler, hayvanlarda bağışıklık tepkilerini ve diğer hücresel süreçleri düzenleyerek 128   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III önemli bir rol oynarlar. Ayrıca, desen tanıma reseptörü (PRR) aracılı sinyalleme yoluyla bitkileri patojenlere karşı savunurlar.(1) AMP’ler, bakterilerden bitkilere, omurgalılara ve omurgasızlara kadar neredeyse tüm yaşam formlarında bulunur.(2) Tipik olarak 12-80 amino asitten oluşan bu peptitler doğada yaygın olarak bulunur ve bakteri, bitki, böcek, balık, kuş ve diğer hayvanlardan elde edilir.(3,4) Bugüne kadar, AMP veritabanı [Antimikrobiyal Peptitler Veri Deposu (DRAMP)], altı alemden 3791 AMP bildirmiştir; bunların arasında 431 bakteri, 4 arke, 7 protozoal, 6 mantar, 824 bitki ve 2519 hayvan bulunmaktadır.(5) Doğal AMP’ler, bağışıklık sistemi tarafından üretilir ve çeşitli patojenlere karşı bağışıklık sisteminin düzenlenmesine katkıda bulunur.(3) Yüksek oranda korunmuş sekansları yoktur, ancak çoğu kısa, amfifilik ve çoğunlukla katyonik moleküllerdir. Geniş spektrumlu bakterisidal etkileri nedeniyle antibiyotiklerin yerini alma potansiyeline sahip oldukları düşünülmektedir. Bununla birlikte, son yıllarda antimikrobiyal etkinliklerinin yanı sıra immünomodülatör, antikanser ve yara iyileştirme aktiviteleri gibi biyolojik fonksiyonları olduğu tespit edilmiştir.(3) AMP’ler çoğu organizmada, patojenlere sürekli maruz kalan yüzeylerde yüksek konsantrasyonlarda salgılanmaktadır. Örneğin, omurgalıların mukozal astarı ve derisi geniş spektrumlu antimikrobiyal aktiviteler gösterir.(6) Genel olarak, AMP’ler ya sürekli üretilir ya da bir tehdide maruz kaldıktan sonra ekspresyonu artar.(7) Örneğin stratum corneum’da bulunan AMP’den oluşan yapısal bir AMP bariyeri yer almakta, bu bariyer cilt yüzeyinde bol miktarda bulunan S100 proteinleri psoriazis ve kalprotektin ile RNaz 7 gibi AMP’lerden oluşmaktadır. Ayrıca, ter bezleri ise insan deri yüzeyinde biriken AMP’ler dermcidin ve laktoferrisini salgılamaktadır.(8) Patojenik enfeksiyonlara karşı hızlı ve etkili bir bağışıklık tepkisi, tüm canlıların hayatta kalması için olmazsa olmazdır. AMP’ler, neredeyse tüm canlı organizmalarda doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde önemli rol oynayan küçük, doğal olarak oluşan ve evrimsel olarak korunmuş moleküllerdir.(4) AMP’ler öncelikle iki ana aileye ayrılır: defensinler ve katelisidinler. Defensinler, β-tabaka yapılarını stabilize eden molekül içi disülfür bağları oluşturan korunmuş sistein açısından zengin yapılarıyla karakterize edilirler. Yapılarına ve disülfür bağı düzenlemelerine göre ayrıca α-defensinler, β-defensinler ve θ-defensinler olarak ayrılırlar. Defensinler, vücuttaki çeşitli dokularda bulunur. α-defensinler, nötrofillerde, makrofajlarda ve gastrointestinal sistem, üreme sistemi ve solunum yolu dahil olmak üzere çeşitli mukozal ve epitel yüzeylerde bulunur. β-defensinler ise epitel hücreleri, deri ve solunum dokularında yaygın olarak dağılmıştır.(9) ANTİMİKROBİYAL PEPTİTLER   135 peptidiltransferaz merkezine bağlanmasını bloke etmekte veya protein sentezine transkripsiyonun sonlandırılması sırasında müdahale etmektedir.(51) Örneğin, Tursiops truncatus’tan keşfedilen sığır PrAMP Bac7’nin bir AMP’si olan Tur1A, ribozomlara bağlanarak protein sentezinin başlangıç fazından uzama fazına geçişi engeller.(52,53) 3.3.2.TriptoanveArgininZenginiAntimikrobiyalPeptitler Triptofan, polar olmayan bir amino asit olarak, lipit çift tabakasının arayüz bölgesinde dikkate değer bir etkiye sahiptir. Arginin ise bazik bir amino asit olarak, bakteri zarının bol miktarda bulunan anyonik bileşeniyle bağ kurmak için gerekli özellikler olan peptit yükü ve hidrojen bağı etkileşimlerini sağlamaktadır. Ayrıca, Trp kalıntılarının iyon çifti-π etkileşimleri ile Arg açısından zengin AMP’lerin doğal aromatik aktivatörleri rolünü oynadığı ve böylece gelişmiş peptit-membran etkileşimlerini teşvik ettiği görülmektedir.(4,54,55) 3.3.3.HistidinZenginiPeptitler Histidin yaygın bir bazik amino asittir ve histidin açısından zengin AMP’ler iyi membran geçirgenlik aktivitesi göstermektedir. HV2, histidin açısından zengin bir AMP’tir. Bu peptit, hücre membranının yırtılmasına ve ölümüne neden olmak için bakteri hücre membranlarının geçirgenliğini artırmaktadır. HV2 konsantrasyona bağlı bir şekilde bakteri hareketini inhibe etmekte ayrıca tümör nekroz faktörü α (TNF-α) üretimini inhibe ederek güçlü bir anti-inflamatuar etki göstermektedir.(56) 3.3.4.GlisinZenginiAntimikrobiyalPeptitler Glisinin genellikle polar olmayan bir amino asit olarak sınıflandırılır. Attakinler ve dipterisinler gibi glisin açısından zengin AMP’ler doğada yaygın olarak bulunur.(57) Bu peptitler, peptit zincirinin üçüncül yapısı üzerinde önemli bir etkiye sahip olan %14 ila %22 oranında glisin kalıntısı içerir. Salmonid katelisidinlerden türetilen glisin açısından zengin bir AMP’nin, geleneksel AMP’lerin mekanizmasından farklı olarak fagosit aracılı mikrobisidal mekanizmaları aktive ettiği bildirilmiştir.(58) 3.4.PeptitselÖzelliklerAçısındanSınıflandırma Bu sınıflamalardan farklı olarak AMP’lerin yük, hidrofobiklik ve uzunluk gibi özellikleri de göz önüne alınmaktadır. Yüklerine göre; katyonik, anyonik 136   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III ve nötr peptitler, sulu ortamla etkileşimlerine göre de; hidrofobik, amfipatik ve hidrofilik peptitler ve peptit boyutlarına göre de; çok küçük (2-10 aa), küçük (10-24 aa), orta (25-50 aa), büyük (50-100 aa) peptitler olarak sınıflandırılmaktadır.(59) 3.5.AntimikrobiyalPeptitYapılarınaDayalıSınıflandırma Katyonik AMP’ler üç boyutlu özelliklerine göre lineer α-helikal peptitler, β-tabaka peptitler, genişletilmiş /rastgele sarmal peptitler ve hem α-helikal hem de β-tabaka peptitler olmak üzere gruplara ayrılmaktadır.(59) 3.5.1.α-helikalpeptitler Bu peptitler arasında α-helikal peptitler patojenler üzerinde en çok etki alanına sahip peptitlerdir. α-helikal peptitler bakteriyel membranlarda bariyer benzeri yapılar ve amfipatik porlar oluşturmaktadır.(59) Bu grupta en çok çalışılan peptitlerden ikisi LL-37 ve laktoferrisindir. LL-37; insan katelisidin antimikrobiyal proteininde inaktif bir öncü olarak üretilmektedir.(60) Laktoferrisin ise süt ve ekzokrin sekresyonlarda bulunan laktoferrinin proteolitik bölünmesiyle türetilmektedir.(61) 3.5.2.β-yaprakpeptitler Disülfid bağları ile stabilize edilen amfipatik bir moleküldür. Sert yapılarından dolayı, β-yaprak peptitleri sulu çözeltide daha düzenlidir ve membran etkileşimi üzerine sarmal peptitler kadar büyük konformasyonel değişime uğramazlar.(62) En iyi çalışılan β-tabaka peptitleri defensinlerdir. Defensinler nötrofiller, makrofajlar ve epitel hücrelerinde inaktif öncüler olarak üretilen büyük bir AMP grubudur.(63) 3.5.3.Genişletilmiş/rastgelesarmalpeptitler Doğal AMP’lerin küçük bir kısmı, ikincil yapıdan yoksun ve genellikle yüksek oranda arginin, prolin, triptofan ve/veya histidin kalıntıları içeren üçüncü sınıf genişletilmiş/rastgele sarmal peptitlere aittir. Diğer AMP’lere benzer şekilde, genişletilmiş peptitlerin çoğu bir zarla temas ettikten sonra amfipatik yapılara katlanır.(64) Bu gruptaki en iyi çalışılmış peptitlerden biri, sığır lökositleri tarafından üretilen indolisidindir.(65) Ayrıca, daha karmaşık topolojilere sahip (kement peptitleri ve tiyoester köprülü yapılar dahil) siklik peptitler ve AMP’ler rapor edilmiştir.(30) ANTİMİKROBİYAL PEPTİTLER   137 3.6.AMP’lerinEtkiMekanizmaları 3.6.1.MembranHedeflemeMekanizması AMP’lerin membran hedefleme mekanizmaları Kilim (Carpet) Modeli, Fıçı Tahtası (Barrel Stave) Modeli, Toroidal gözenek modeli olmak üzere üç şekilde görülmektedir.(30) 3.6.1.1.Kilim(Carpet)Modeli AMP’ler, hücre zarına paralel olarak düzenlenir. Hidrofilik uçları çözeltiye ve hidrofobik uçları fosfolipid çift tabakasına bakan AMP’ler zar yüzeyini kilim gibi kaplar ve hücre zarını deterjan benzeri bir etki ile yok etmektedir.(66) Bu gözenek oluşturma mekanizması, belirli bir konsantrasyon eşiği gerektirir ve gerekli AMP konsantrasyonu yüksektir. İnsan katelisidin LL-37, aktivitesini bu mekanizma aracılığıyla sergiler ve β-tabaka yapısına sahip AMP’ler de bu şekilde etki göstermektedir.(67) Şekil 3. Hücre dışı AMP aktivitesinin etki modelleri. (A) Halı modeli (B) Fıçı tahtası modeli (C) Toroidal gözenek modeli(30) 3.6.1.2.FıçıTahtası(BarrelStave)Modeli AMP molekülleri, peptitlerin hidrofilik bölgelerinin etkileşimi ile membran yüzeyinde adsorbe olur ve kendi kendine birleşir. Yanal olarak biriken peptit monomerleri, zar üzerinde belirli bir yoğunluğa ulaştığında, peptit yığınları şeklinde plazma zarına dik olarak dönmektedir. Peptit yığınları, çift tabakanın 138   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III hidrofobik bölgesi boyunca yer alır ve hidrofilik yüzeyi içe doğru yönlendirilmiş bir kanal oluşturmaktadır.(30, 68) 3.6.1.3.ToroidalGözenekModeli Toroidal modelin etki mekanizmasına göre, peptitler, fıçı-çıta modeline benzer şekilde çift katmana dik olarak yerleştirilir, ancak peptit-peptit etkileşimleri yerine bir peptit-lipit kompleksi oluşturur. Peptitlerin bu konformasyonu, kısmen peptitler ve kısmen de fosfolipit baş gruplarıyla çevrili yerel bir zar eğriliğini teşvik ederek bir “toroidal gözenek” oluşumuna yol açmaktadır.(69) 3.6.2.BakteriyelMembranileEtkileşim Birçok AMP, mikrobiyal membranın fiziksel bütünlüğünün bozulmasına neden olarak ve/veya hücre içi hedeflere etki etmek için membrandan bakteri sitoplazmasına geçerek doğrudan ve hızlı bir antimikrobiyal aktivite gösterir. (70) Membran etkileşiminin hem membranın kendisi hedeflendiğinde hem de hücre içi bir hedefe ulaşılması gerektiğinde AMP’lerin doğrudan antimikrobiyal aktivitesi için anahtar bir faktör olduğu yaygın olarak kabul edilmektedir.(62) Katyonik AMP’ler ile negatif yüklü bakteri yüzeyi arasındaki elektrostatik kuvvetler, peptitler ile mikrobiyal zar arasındaki etkileşim için kritik belirleyicilerdir.(71) Bakteriler, hücre zarfı yapısındaki farklılıklara dayanarak genellikle Gram pozitif ve Gram negatif olmak üzere iki aileye ayrılır. Gram pozitif bakterilerde sitoplazmik zar, kalın bir peptidoglikan tabakasıyla çevrilidir, oysa Gram negatif bakterilerin sitoplazmik zarı, ince bir peptidoglikan tabakası ve bir dış zarla çevrilidir.(72) Hem Gram pozitif hem de Gram negatif bakterilerin sitoplazmik zarları, negatif yüklü baş grupları bulunan ve pozitif yüklü AMP’ler için oldukça çekici olan fosfatidilgliserol, kardiyolipin ve fosfatidilserin fosfolipidleri açısından zengindir. Gram pozitif bakterilerin hücre duvarındaki teikoik asitlerin ve Gram negatif bakterilerin dış zarındaki lipopolisakkaritlerin (LPS) varlığı, bakteri yüzeyine ek elektronegatif yük sağlamaktadır.(71) Mikrobiyal ve memeli zarları arasındaki temel farklar memeli hücrelerini AMP’lere karşı korur ve bu peptitlerin seçici etkisini mümkün kılmaktadır. (71) Memeli zarlarında ayrıca fosfolipidlerin asimetrik bir dağılımı vardır; zwitteriyonik fosfolipidler dış yaprakçıkta bulunurken, negatif yüklü baş grupları olan fosfolipidler, sitoplazmaya bakan iç yaprakçıkta yerleşmiştir. Bu nedenle, AMP’ler ile memeli hücre zarı arasındaki etkileşimler esas olarak hidrofobik etkileşimler yoluyla meydana gelir ki bu etkileşimler, AMP’ler ile bakteri ANTİMİKROBİYAL PEPTİTLER   139 zarları arasında gerçekleşen elektrostatik etkileşimlere kıyasla nispeten zayıftır. Dahası, mikropların aksine, memeli hücre zarları yüksek kolesterol içeriğine sahiptir. Kolesterolün fosfolipid çift katmanlarının yoğunlaşmasına neden olduğu bilindiğinden, AMP’lerin ökaryotik hücrelerin sitoplazmik membranına nüfuz etmesini engellediği düşünülmektedir. Kolesterolün yanı sıra, ökaryotik hücrelerin sitoplazmik zarındaki fosfolipitlerin asimetrik dağılımı da ökaryotik hücrelerin AMP’lere duyarsızlığına katkıda bulunmaktadır.(60) 3.6.3.MembranDışıAktifMekanizmalar AMP’lerin bakterisidal etkileri başlangıçta membran-aktif mekanizmalarla tanımlanmış olsa da son zamanlarda birçok AMP’nin temel hücre bileşenlerini ve hücresel fonksiyonları hedef alarak bakteriyel ölüme yol açtığı anlaşılmıştır. Bu AMP’ler önce hücre zarını bozmadan hücre içine taşınır ve ardından hücre içi hedeflerle etkileşime girerek kritik hücresel süreçleri engeller. Bugüne kadar, protein ve nükleik asit sentezinin inhibisyonu ve enzim ve proteinin parçalanması gibi birçok mekanizma tanımlanmıştır.(68) 3.6.3.1.ProteinBiyosentezininİnhibisyonu Çalışmalar, sığır ve şişe burunlu yunustan (Tursiops truncatus) elde edilen PrAMP’ler, bakterisin 7 (Bac7) ve Tur1A’nın hücre zarlarına zarar vermeden E. coli içerisine girebildiğini ve hücre içerisinde ribozomla etkileşime girerek başlangıç fazından uzama fazına geçişi bloke etmek yoluyla translasyonu engellediğini göstermiştir.(52) Buna ek olarak yeni sentezlenen proteinlerin uygun şekilde katlanmasını ve birleşmesini sağlayan şaperon proteinleri, hücre içi aktivite gösteren AMP’lerin diğer hedefleridir. Bir dizi AMP’nin E. coli şaperon yollarındaki önemli bileşenleri bloke ettiği gösterilmiştir. Böcek kaynaklı PrAMP’ler olan pirokorisin, apidaesin ve drososinin, 70 kDa’lık bir ısı şoku proteini olan DnaK’ya spesifik bir şekilde ve 60 kDa’lık bir bakteriyel şaperon olan GroEL’ye spesifik olmayan bir şekilde bağlanarak protein katlama yolunu bloke ettiği kanıtlanmıştır.(73) 3.6.3.2.NükleikAsitBiyosentezininİnhibisyonu Bazı transmembran AMP’ler, nükleik asitlerle etkileşerek antimikrobiyal etki gösterir. Örneğin, kurbağalardan elde edilen bir histon türevi olan buforin II’nin bakteri zarından geçerek E. coli’nin DNA ve RNA’sına bağlandığı bulunmuştur. (74) Antimikrobiyal peptitler, nükleik asit biyosentezini engellemek için temel 140   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III enzimleri etkileyebilmekte veya nükleik asit moleküllerinin bozunmasını tetikleyebilmektedir. Katyonik özellikte ve triptofan açısından zengin bir AMP olan indolisidin, negatif yükü nedeniyle çift sarmallı DNA’ya bağlanarak DNA replikasyonunu ve transkripsiyonunu, ayrıca DNA topoizomeraz I’i inhibe edebilmektedir.(75) 3.6.3.3.ProteazAktivitesininİnhibisyonu Birçok AMP, proteaz aktivitesini inhibe ederek çeşitli metabolik aktiviteleri önleyebilmektedir. Örneğin, histatin 5, konak ve bakteri tarafından salgılanan proteazlar üzerinde güçlü bir inhibitör etkiye sahiptir. eNAP-2 ve indolisidin AMP’lerinin, mikrobiyal serin proteazları, elastazı ve kimotripsini inhibe ettiği gözlemlenmiştir.(76) 3.6.3.4.Hücreduvarsenteziinhibisyonu Gri tüylü mantar olarak bilinen Coprinopsis cinerea’dan elde edilen bir defensin olan copsin, mantar kökenli bir peptit olan plektasin ve bir bakteriyosin olan nisin gibi çeşitli AMP’lerin, peptidoglikan sentezinde temel bir bileşen olan öncül lipit II’ye bağlanarak bakteriyel hücre duvarı biyosentezini engellediği bildirilmiştir.(77) 3.6.3.5.HücreBölünmesininEngellenmesi Antimikrobiyal peptitler, DNA replikasyonunu ve DNA hasar onarımını inhibe ederek, hücre döngüsünü bloke ederek veya kromozom ayrımının başarısız olmasına neden olarak hücre bölünmesini engeller.(78) Örneğin, 20 amino asit kalıntısına sahip bir AMP olan APP, hücreye nüfuz etme etkinliği, güçlü DNA bağlanma afinitesi ve hücre içi ortamın S fazında kalmasını indükleyerek C. albicans’ı etkili bir şekilde öldürebilmektedir.(79) 3.7.AMP’lerinİmmünomodülatörAktiviteleri AMP’lerin terapötik kullanımına ilişkin mevcut patent bilgilerinin yakın zamanda yayınlanan analizi, iddia edilen AMP’lerin çoğunun yalnızca güçlü antibiyotikler olarak değil, aynı zamanda etkili inflamasyon düzenleyicileri veya patojenik toksinlerin nötralizatörleri olarak da nitelendirildiği sonucuna varmıştır.(80) AMP’lerin sergilediği geniş yelpazedeki immünomodülatör aktiviteler arasında kemotaksi uyarımı, bağışıklık hücresi farklılaşmasının modülasyonu ve adaptif bağışıklığın başlatılması yer alır ve birlikte konağın ANTİMİKROBİYAL PEPTİTLER   141 bakteriyel temizlenmesine katkıda bulunurlar. İmmünomodülatör aktiviteler ayrıca toll benzeri reseptörlerin (TLR) ve/veya sitokin aracılı proinflamatuar sitokin üretiminin ve anti-endotoksin aktivitesinin baskılanmasını içerir. Ayrıca sepsis dahil aşırı ve zararlı proinflamatuar yanıtları önler.(62) Örnek olarak insan katelisidin peptiti olan LL-37’nin hayvanları endotoksemi/sepsis’e karşı koruduğu gösterilmiştir. Düşük fizyolojik LL-37 konsantrasyonları, LPS ile uyarılmış insan monosit hücrelerinde proinflamatuar sitokin TNF-alfa salınımını inhibe ederek inflamatuar yanıtları modüle edebilmektedir.(81) AMP’ler doğrudan mikrobiyal öldürmeye ek olarak diğer immünomodülatör işlevler için de gereklidir. Fagositler, nötrofiller ve makrofajlar dahil olmak üzere çok çeşitli bağışıklık hücreleri tarafından salgılanırlar ve sitokin fırtınasını ve doku hasarını önlemek için proinflamatuar sitokinlerin kontrollü salgılanması, bağışıklık hücrelerinin toplanması ve aktivasyonu, anjiyogenezin teşvik edilmesi ve aşırı reaktif oksijen türlerinin salınımının baskılanması gibi enfeksiyonların modülasyonunda rol oynamaktadırlar.(82) Örneğin, insan katelisidin LL-37, monositler, nötrofiller ve mast hücreleri gibi çeşitli bağışıklık hücrelerinin kemoatraksiyonu ve aktivasyonu gibi immünomodülasyon özellikleri sergilemektedirler.(83) AMP’lerin antimikrobiyal ve immünomodülatör özelliklerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, bakteriyel enfeksiyonun yanı sıra ateroskleroz ve tromboz gibi enflamatuar ve kardiyovasküler hastalıkları için yeni tedavilerin keşfi ve tasarımı için mükemmel fırsatlar sağlayacağını düşündürmektedir.(14) 3.8.AMP’lerinAnti-biyofilmAktiviteleri Bakteriyel biyofilmler, hastane ve implantla ilişkili enfeksiyonlardaki önemli rolleri nedeniyle küresel sağlık hizmetleri açısından büyük klinik öneme sahiptir. Çoğu hastane patojeni, hastalık patojenitesini ve direncini tamamlayan biyofilmler üretmektedir.(14) Biyofilm, mikroorganizmaların ürettiği hücre dışı polimerik bir madde matrisi içinde oluşturdukları mimari bir kolonidir. Biyofilm, birbirine ve canlı veya cansız statik bir yüzeye yapışmış mikrobiyal hücreler içerir. Bakteriyel biyofilmler genellikle patojenik yapıdadır ve hastane enfeksiyonlarına neden olabilir. Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), tüm mikrobiyal ve kronik enfeksiyonların sırasıyla %65 ve %80’inin biyofilm oluşumuyla ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. Biyofilm oluşum süreci, canlı veya cansız bir yüzeye tutunarak mikro koloni oluşumuna yol açan ve üç boyutlu yapılar oluşturan ve olgunlaştıktan sonra kopma ile sonlanan birçok aşamadan oluşur.(84) 142   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III Patojenik biyofilmler, kendi kendine üretilen hücre dışı polimerik bir matrisle kaplı mikrobiyal hücrelerden oluşur ve geleneksel antimikrobiyal ajanlara karşı korunur. Planktonik bakteri hücreleriyle karşılaştırıldığında antibiyotiklere ve diğer antimikrobiyal ajanlara karşı gelişmiş direnç veya tolerans, biyofilmlerin ortaya çıkan özelliklerinin tipik örnekleridir. Hem direnç hem de tolerans, bir organizmanın duyarlı organizmalar için öldürücü olan bileşiklere maruz kaldıktan sonra hayatta kalma yeteneğinin artmasını ifade etmek için kullanılan terimlerdir.(85) Son yıllarda, AMP’lerin antibiyofilm etkileri araştırılmış ve bir grup AMP’nin biyofilmle ilişkili enfeksiyonların önlenmesinde antibiyofilm ajanları olarak yeterliliği kanıtlanmıştır.(86) AMP’lerin antibiyofilm aktivitesini açıklamak için klasik ve klasik olmayan mekanizmalar olmak üzere iki etki modu önerilmiştir. Klasik etki mekanizması, esas olarak planktonik bakteriler üzerindeki bilinen bakterisidal etkilerle biyofilm oluşumunun önlenmesine dayanır. Klasik olmayan mekanizma, biyofilm yaşam biçiminin temel özelliklerini hedef alan bir AMP eylemiyle ilişkilidir. Bu modele göre, AMP’ler bakteri yüzeyine bağlanarak hücre-hücre etkileşimini engelleyebilir, biyomalzeme yüzeyine yapışarak bakteri yapışmasını önleyebilir, hücre iletişim sinyallerini engelleyebilir veya biyofilm oluşumu için gerekli genlerin aşağı regülasyonuna neden olabilir.(87) Örneğin, LL-37’ye dayalı olarak sentezlenen SAAP-148’in, S. aureus ve A. baumannii bakterilerinin biyofilm oluşturmasını önlediği gösterilmiştir.(68) 4. Antimikrobiyal Direnç ve AMP’ler Dünya Sağlık Örgütü (WHO) büyük ölçüde ayrım gözetmeyen antibiyotik kullanımına bağlı olarak 2050 yılına kadar, ilaca dirençli enfeksiyonların artarak yılda 10 milyon insanı öldüreceğini, bir mali felaketi ateşleyeceğini ve milyonlarca insanı aşırı yoksulluğa sürükleyeceğini tahmin etmektedir.(14) Hastane kaynaklı bakteriyel patojenler arasında antibiyotik direncinin görülme sıklığındaki artması nedeniyle direnç genlerinin çevrede hızla yayılması, ilişkili olarak morbidite ve mortalitedeki artış ve ekonomi üzerindeki büyük yük oluşturması küresel sağlık hizmetleri için önemli tehditlerdir.(88) Bakteri patojenleri, günümüzde mevcut olan geleneksel antibiyotiklerin çoğuna karşı direnç geliştirmiştir. Bakteriyel genomik analiz çalışmaları dirençle ilişkili 20.000’den fazla genin varlığını ortaya çıkarmıştır. Bu sayının önümüzdeki yıllarda artması beklenmektedir.(89) ANTİMİKROBİYAL PEPTİTLER   143 Klinik ortamlarda ÇİD patojenlerden kaynaklanan enfeksiyonların artan sıklığı, alternatif tedavilere olan talebi artırmıştır. Güçlü antimikrobiyal aktivitelere ve çeşitli etki mekanizmalarına sahip AMP’ler, çoklu ilaç direnci sorunlarının çözümünde önemli alternatifler olarak kabul edilmektedir.(14) Standart antibiyotiklerin aksine, AMP’ler ÇİD patojenlerinin yaygın direnç mekanizmalarını aşma yeteneği kazandıran bir dizi özelliğe sahiptir. AMP’ler genellikle antimikrobiyal aktivite için metabolik süreçlere ihtiyaç duymazlar bu nedenle hem durgun hem de aktif olarak büyüyen bakterilere karşı etkilidirler. Saniyeler veya dakikalar içerisinde hızlı öldürme kinetiği gösterirler, bu da kapsamlı büyüme ve mutasyonların meydana gelmesi için sınırlı bir zamana izin verir. Geleneksel antibiyotiklerin tam aksine, AMP’ler bakteriyel direnç geliştirme konusunda düşük bir eğilim gösterir.(90) Tek veya spesifik bakteriyel süreçleri hedef alan ampirik antibiyotiklerin aksine, AMP’ler plazma zarının parçalanması da dahil olmak üzere çok işlevli bakteriyel öldürme etkileri gösterir ve ayrıca transkripsiyon ve translasyonun, protein sentezinin ve bakteriyel hücre duvarı oluşumunun inhibisyonu da dahil olmak üzere mikrobiyal hücre içi süreçleri hedefler.(14) Bakteriyel büyüme ve replikasyonda genellikle belirli adımları hedefleyen çoğu antibiyotiğin aksine, AMP’lerin antimikrobiyal aktivitesi, membran bozulması ve mikropların ozmotik lizisiyle ve/veya mikropların hücre içi hedefleri üzerinde etki ederek proteinlerin, nükleik asitlerin ve hücre duvarının sentezini inhibe etmesiyle ilişkilidir. AMP’lerin belirli bakterileri öldürmek için kullandıkları mekanizma, peptitten peptite ve belirli AMP-bakteri eşleşmesi için özgüllüğe göre önemli farklılıklar göstermektedir; dahası, AMP yapıları ve öldürme mekanizmaları arasında henüz net bir ilişki ortaya çıkmamıştır. Ayrıca, membran çift katmanını bozabilen AMP moleküllerinin, yavaş veya hiç büyümeyen dormant bakterilere karşı aktif olması gibi avantaj sunmaları da umut verici bir alternatif olarak kabul görmüştür. Çünkü, dormant bakteriler yüksek antibiyotik konsantrasyonlarında hayatta kalabilir ve etkililik için kapsamlı tedaviye ihtiyaç duymaktadır.(91) 5. SONUÇ Günümüzde, patojenik mikroorganizmalara karşı geniş spektrumlu aktiviteye sahip yeni antimikrobiyal ajanlar elde etmek için büyük çaba sarf edilmektedir. Doğal olarak oluşan AMP’lerin, daha yüksek potansiyele sahip, üretimi daha kolay ve proteolitik bozunmaya daha az duyarlı sentetik AMP’lerin 144   MİKROBİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR III tasarımı ve sentezi için paha biçilmez şablonlar olduğu kanıtlanmıştır.(14) AMP’lerin yapı ve aktivite ilişkisini anlamanın, yeni nesil antimikrobiyal ajanların tasarımı ve geliştirilmesi, farmasötik uygulama için peptit tasarımı ve modifikasyonu gibi ilaç geliştirme süreçlerinin tüm aşamalarında bilgi sağlayacağı öngörülmektedir.(68) KAYNAKLAR 1. Oliveira Júnior NG, Souza CM, Buccini DF, Cardoso MH, Franco OL. Antimicrobial peptides: structure, functions and translational applications. Nat Rev Microbiol. Published online July 11, 2025. doi:10.1038/s41579-02501200-y 2. Kumar P, Kizhakkedathu JN, Straus SK. Antimicrobial peptides: diversity, mechanism of action and strategies to improve the activity and biocompatibility in vivo. Biomolecules. 2018;8(1):4. doi:10.3390/ biom8010004. 3. Luo Y, Song Y. Mechanism of antimicrobial peptides: antimicrobial, anti-inflammatory and antibiofilm activities. Int J Mol Sci. 2021;22(21):11401. doi:10.3390/ijms222111401 4. Parsad R, Ahlawat S, Bagiyal M, et al. Cathelicidins in farm animals: structural diversity, mechanisms of action, and therapeutic potential in the face of antimicrobial resistance. Vet Immunol Immunopathol. 2025;279:110866. doi:10.1016/j.vetimm.2025.110866 5. Zhang QY, Yan ZB, Meng YM, et al. Antimicrobial peptides: mechanism of action, activity and clinical potential. Mil Med Res. 2021;8(1):48. doi:10.1186/ s40779-021-00347-6 6. Wiesner J, Vilcinskas A. Antimicrobial peptides: the ancient arm of the human immune system. Virulence. 2010;1(5):440-464. doi:10.4161/ viru.1.5.12983 7. Ganz T. The role of antimicrobial peptides in innate immunity. Integr Comp Biol. 2003;43(2):300-304. doi:10.1093/icb/43.2.300. 8. Harder J, Schröder JM, Gläser R. The skin surface as antimicrobial barrier: present concepts and future outlooks. Exp Dermatol. 2013;22(1):1-5. doi:10.1111/exd.12016 9. Iksanova AM, Arzumanian VG, Konanykhina SY, Samoylikov PV. Antimicrobial peptides and proteins in human biological fluids. J Microbiol Indep Res. 2022;9(1):37-55.