Estrategias computacionales para el descubrimiento de enzimas en la síntesis sostenible de bioplásticos

LIBRO DE RESÚMENES 3130 LIBRO DE RESÚMENES CMIBM’24 O2 DESARROLLO DE UN MÉTODO COLORIMÉTRICO DE SCREENING PARA LA DETECCIÓN DE LA INSERCIÓN SIMULTÁNEA DE MÚLTIPLES COPIAS GÉNICAS EN BACILLUS SUBTILIS MEDIANTE CRISPR-CAS9 Ferrando, Jordi*; Filluelo, Oriana; Picart, Pere Universitat de Barcelona, Barcelona, España *[email protected] Bacillus subtilis destaca por ser un excelente productor de enzimas industriales, en parte debido a su rápido crecimiento, elevada capacidad para secretar proteínas al medio extracelular y su reconocido estatus GRAS (Generalmente Reconocido como Seguro). No obstante, pese a los notables avances en el campo de la ingeniería genética para la regulación y manipulación de genes, aún persiste un desafío crucial: la eficiente inserción de múltiples copias de un gen en B. subtilis. Para abordar esta necesidad, presentamos una estrategia innovadora basada en el sistema CRISPR-Cas9. Por primera vez, hemos desarrollado y demostrado conceptualmente un método de screening eficaz que permite detectar la inserción simultánea de hasta tres copias génicas en el cromosoma de B. subtilis según el color de las colonias (amarillas/blancas). Para ello, se integraron hasta tres copias del operón crtMN de Staphylococcus aureus, cuya expresión produce un pigmento amarillo, en tres puntos diferentes dentro del cromosoma de B. subtilis, resultando en la obtención de cepas formadoras de colonias amarillas. A continuación, desarrollamos un sistema CRISPR-Cas9 basado en un único plásmido portador de un ARN guía específico, dirigido al operón crtMN, y un molde de reparación editable para permitir la sustitución simultánea de los múltiples operones crtMN por el gen de interés mediante recombinación homóloga. De este modo, es posible diferenciar las colonias recombinantes blancas, que sólo aparecen si se sustituyen los múltiples operones crtMN por el gen deseado, de las colonias amarillas con ediciones genéticas defectivas, manteniendo al menos una copia intacta del operón crtMN. Este novedoso sistema facilita la construcción de cepas de B. subtilis con una elevada expresión del gen de interés de manera sencilla y eficiente, sin necesidad de marcadores de resistencia ni plásmidos, y en un tiempo de siete días, demostrando el potencial que la implementación de esta tecnología alberga en fines biotecnológicos. Financiación: Este trabajo ha sido subvencionado por el Pla de Doctorats Industrials del Departament de Recerca i Universitats de la Generalitat de Catalunya con el apoyo de Gestió d’ Ajuts Universitaris de Recerca con la beca número 2021 DI 77 concedida a Jordi Ferrando Núñez. Referencias: Ferrando J, Filluelo O, Zeigler DR, Picart P. Barriers to simultaneous multilocus integration in Bacillus subtilis tumble down: development of a straightforward screening method for the colorimetric detection of one-step multiple gene insertion using the CRISPR-Cas9 system. Microb Cell Fact 22, 21 (2023). O1 ESTRATEGIAS COMPUTACIONALES PARA EL DESCUBRIMIENTO DE ENZIMAS EN LA SÍNTESIS SOSTENIBLE DE BIOPLÁSTICOS Floor, Martin1*; Muñoz, Rubén1; Martínez, Mireia1; Rodà, Sergi2; Carro, Juan3; Martínez, Ángel T3; Ruiz-Dueñas, Francisco Javier3; Guallar, Victor1 1 Barcelona SuperComputing Center - Centro Nacional de Supercomputación, Barcelona, España; 2Nostrum Biodiscovery S.L., Barcelona, Spain; 3Centro de Investigaciones Biológicas Margarita Salas, CSIC, Madrid, España *[email protected] Los bioplásticos ofrecen una alternativa ecológica a los polímeros convencionales derivados de petroquímicos. Sin embargo, su uso generalizado se ha visto limitado por el desafío de generar eficientemente los sustratos monoméricos necesarios para su síntesis. El polietileno furanoato (PEF), un actor crucial en este ámbito, depende de la síntesis de furano-2,5-dicarboxilato (FDCA) a partir de la oxidación de hidroximetilfurfural (HMF), un compuesto orgánico derivado de la deshidratación de azúcares reductores (Esquema 1). Las enzimas HMF oxidasas (HMFO) (EC: 1.1.3.47), dentro de la familia de las flavoproteínas oxidantes tipo glucosa-metanol-colina, son centrales en esta síntesis. A pesar de su importancia, el paso oxidativo final para producir FDCA (i.e., FFCA a FDCA) constituye la principal limitante debido a la acotada cantidad de enzimas conocidas capaces de catalizar esta reacción eficientemente. Dada la necesidad apremiante de encontrar mejores soluciones enzimáticas para agilizar el desarrollo comercial de bioplásticos, diseñamos un nuevo protocolo de bioprospección computacional, con el cual, empleando búsquedas masivas de similitud de secuencias, simulaciones Monte Carlo, cálculos de ingeniería de proteínas y aprendizaje supervisado, exploramos decenas de miles de nuevas HMFO en búsqueda de mejores catalizadores para la producción de FDCA. Con el objetivo principal de identificar nuevas enzimas que exhibieran una mejora en el paso final de oxidación, caracterizamos nuevas HMFO con buena actividad catalítica y con un gran potencial para su medra. Estos hallazgos representan un avance significativo hacia la optimización de la producción de bioplásticos. No obstante, además de ofrecer soluciones potenciales en la síntesis de PEF, también definen la frontera y las complejidades inherentes al campo de la bioprospección in silico para la concreción de nuevos descubrimientos biocatalíticos. Esquema 1. Cascada de oxidaciones para la conversión de HMF a FDCA. Financiación: Proyecto PLEC2021-007690 financiado por MICIU/AEI/10.13039/501100011033 y por la Unión Europea NextGenerationEU/PRTR; Proyecto ROBUSTOO, financiado por la Unión Europea bajo el Acuerdo de Subvención No 101135119; y Plataforma Temática Interdisciplinar Susplast, CSIC