Tıbbi Biyolojide Güncel Çalışmalar I

TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Editör Kübra Çiğdem PEKKOÇ UYANIK Lyon 2025 TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Editör Kübra Çiğdem PEKKOÇ UYANIK Lyon 2025 Tıbbi Biyolojide Güncel Çalışmalar I Editor • Asst. Prof. Dr. Kübra Çiğdem PEKKOÇ UYANIK • Orcid: 0000-0002-1056-960X Cover Design • Motion Graphics Book Layout • Motion Graphics First Published • November 2025, Lyon e-ISBN: 978-2-38236-954-8 DOI: 10.5281/zenodo.17505402 copyright © 2025 by Livre de Lyon All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without prior written permission from the Publisher. The author or authors of the relevant section are responsible for any copyright infringement that may occur due to the images and graphics used in the book. The editor or publisher does not assume responsibility in this regard. Publisher • Livre de Lyon Address • 37 rue marietton, 69009, Lyon France website • http://www.livredelyon.com e-mail • [email protected] I ÖNSÖZ Değerli okuyucular, Elinizde bulunan “Tıbbi Biyolojide Güncel Çalışmalar I” adlı kitabımızı sizlere sunmaktan büyük memnuniyet duyarım. Bu eser, alanlarında uzman akademisyenler tarafından bilimsel titizlikle kaleme alınmış hem temel mekanizmaları hem de klinik uygulamalara uzanan bağlantıları derinlemesine inceleyen dokuz bölümden oluşmaktadır. Kitap, en güncel bilimsel araştırmalar ve bulgular ışığında şekillenen çağdaş konuları ele almakta; kuramsal bilgiyi kapsamlı literatür desteği ve yazarların akademik deneyimleriyle birleştirerek her konuyu bütüncül bir bakış açısıyla sunmaktadır. Bu kitabın, tıbbi biyoloji alanında çalışan akademisyenler, araştırmacılar ve lisansüstü öğrenciler için değerli bir kaynak olacağına inanıyorum. Eserde, güncel gelişmelerin derinlemesine incelenmesiyle hem bilimsel yeniliklere ilham vermesi hem de alandaki ilerlemelere katkı sağlaması amaçlanmaktadır. Bu kitabın hazırlanma sürecinde emeği geçen tüm yazarlara ve katkı sağlayan herkese en içten teşekkürlerimi sunarım. Tüm okurlarımıza aydınlatıcı ve verimli bir okuma deneyimi dilerim. Saygılarımla, Editör Dr. Öğr. Üyesi Kübra Çiğdem PEKKOÇ UYANIK Haliç Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye III İÇİNDEKİLER ÖNSÖZ I BÖLÜM I. HIF-1, HİPOKSİ VE TÜMÖR İLERLEMESİ: METABOLİZMADAKİ SİHİRLİ DOMİNO ETKİSİ 1 Elif ERCAN & Özen ÖZENSOY GÜLER & Ahmet ÇARHAN BÖLÜM II. EKSOZOMLAR VE KANSER: BİYOLOJİK İÇERİKLERİ, PAKETLENME MEKANİZMALARI VE SİNYAL YOLAKLARININ DÜZENLENMESİNDEKİ İŞLEVLERİ 23   TuğbaKevserUYSAL&EnderŞİMŞEK& Özen ÖZENSOY GÜLER BÖLÜM III. EKSOZOMLAR: BİYOLOJİK FONKSİYONLARI VE KLİNİK ÖNEMİ 43   TuğçeKARADAĞ&SacidePEHLİVAN BÖLÜM IV. KANSER TEDAVİSİNDE mRNA AŞI TEKNOLOJİLERİ: MEKANİZMALAR, UYGULAMALAR VE GELECEK PERSPEKTİFİ 61   FurkanOzanÇÖVEN&AyşegülİNAM&TülayÖNCÜÖNER BÖLÜM V. CISH’İN TANISAL VE TERAPÖTİK BOYUTLARI: KROMOJENİK in situ HİBRİDİZASYON İLE HÜCRE İÇİ İMMÜN KONTROL NOKTASI OLARAK CISH PROTEİNİ 71   GÜNEŞÖZENEROĞLU BÖLÜM VI. FERROPTOZ VE HASTALIKLARLA İLİŞKİSİ 81   MerveAKIŞYILMAZ&CanerYILDIRIM BÖLÜM VII. NÖRODEJENERATİF HASTALIKLARDA MİTOKONDRİ TRANSFERİ VE TEDAVİ YAKLAŞIMLARI 99   FeyzaBENGÜL BÖLÜM VIII. NÖROLOJİK HASTALIKLARIN TEDAVİSİNDE CRISPR-CAS9 UYGULAMALARI VE TERAPOTİK POTANSİYELLERİ 107   SevcanMERCAN BÖLÜM IX. EPİLEPSİ ETİYOLOJİSİNDE VE FARMAKOGENETİĞİNDE HLA GENLERİNİN KLİNİK ÖNEMİ 121   KÜBRAÇİĞDEMPEKKOÇUYANIK HIF-1, HİPOKSİ VE TÜMÖR İLERLEMESİ: METABOLİZMADAKİ . . .   7 Tablo 1: HIF-1 hedef genleri ve bunların kanser metabolizması üzerindeki etkileri. (14) Kanser metabolizması üzerindeki etki HIF-1 tarafından aktive edilen genler Anjiyogenez ANGPT2, C-MET, ID2, LEP, NOS, PDGF, SCF, SDF-1, VEGF İlaç direnci MDR1 Eritropoez EPO Genetik kararsızlık DEC1, DEC2, MSH2, MSH6 Glukoz metabolizması GLUT1, GPI, HK1, HK2, LDH, MCT1, PGK1, PKM2 Ölümsüzlük TERT Bağışıklıktan kaçış NT5E İnvazyon C-MET, EDN-1, FN-1, MMP-2, MMP-14, SDF-1 Metastaz C-MET, CXCR4, LOX, TWIST1, ZEB1 pH düzenlenmesi CA-9, CA-12 Proliferasyon C-MYC, ID2, IFG-2, NOS Tümörlerdeki hipoksik ortam, radyoterapinin ve birçok sitotoksik ilacın etkinliğini sınırlamaktadır. Çünkü kanser progresyonu oksijen varlığını sevmez. (10) Bu nedenle, HIF-1α’nın nükleer translokasyonuna ve bağlanma aktivitesine müdahale ederek inhibisyonunu sağlamak, kanser hücrelerinin metabolik adaptasyonunu bozabilmektedir. 2.1.AnjiyogenezveHücreÖlümündenKaçıştaHIF-1’lerinRolü Hipoksi; kanserin başlaması, invazyonu ve metastazı için anjiyogenezi indüklemektedir. (23) VEGF; anjiyogenezi uyararak, tümörün ilerlemesini ve metastazını manipüle etmek için HIF’ler tarafından güçlü bir şekilde indüklenmektedir. (29,30) Hipoksik koşullar altında HIF-1α ve HIF-2α; tümörlerde aktive edilerek tümör büyümesini ve metastazı tetiklemektedir. Hipoksi aynı zamanda GLUT1, VEGF gibi hedef genlerin ekspresyonunu da düzenleyerek metabolik enerji gereksinim üzerindeki yolakların değişmesine sebep olmaktadır. (19) Anjiyogenezin uyarılması, vasküler yoğunluk artışına neden olur ve bu durum oksijene olan ilgiyi azaltarak tümör mikroçevresindeki kan akışını tetikler. Artan hipoksik ortam, VEGF ve PDGF-B gibi çeşitli proanjiyojenik genleri tetikleyerek HIF-1α aracılığı ile vasküler tonus modülasyonuna neden olmaktadır. (31) 2017 yılında Soni ve ark. yaptığı bir çalışmada in vivo 8   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I çalışmaların, HIF-1 fonksiyonunun baskılanarak tümör vaskülarizasyonunun ilerlemesini önemli ölçüde engelleyebileceğini göstermiştir. (32) Hipoksik koşullar altında HIF-1, kanser hücresinin hayatta kalmasına yol açan adaptif yanıtları kolaylaştırmaktadır. Yapılan araştırmalar, hipoksinin hücre proliferasyonunu artırdığını ve kanser hücrelerinin apoptozdan kaçmasını desteklediğini ortaya koymuştur, çünkü hipoksi, kanser hücrelerinin proliferasyonu, sessizliği ve apoptozu ile ilgili çoklu genlerin ekspresyonuna aracılık etmektedir. (33,34) Hipoksi, glioblastoma hücrelerinde protein fosfataz 2A’nın upregülasyonunu uyararak, hücre döngüsünü G1/S noktasında tutuklayarak kanser hücresinin hayatta kalmasına olanak sağlamaktadır. (33) Tüm bunlar göstermektedir ki, HIF-1 inhibisyonu, anjiyogenezi ve tümör ilerlemesini baskılamak için iyi bir stratejidir. 2.2.MetastazdaHIF-1’inRolü HIF’ler kanser hücrelerinin metastatik potansiyelini artırmaktadır. Tümör metastazının birçok aşamasında yer alan sayısız gen, farklı moleküler seviyelerde HIF’ler tarafından doğrudan veya dolaylı olarak düzenlenebilmektedir. Wen ve ark. yaptığı çalışmada; HIF-1α’nın mRNA ifadesinin, uzun kodlamayan RNA (lncRNA) DANCR’nin NF90/NF45 kompleksi ile etkileşimleri yoluyla stabilize edilebileceğini, dolayısıyla da nazofaringeal karsinomda kanser proliferasyonunun ve metastazının arttığı göstermiştir. (35) Diğer bir lncRNA, MTA2TR ise promotör olarak işlev görür ve deasetilasyona bağımlı HIF-1α birikimini indükleyerek pankreas kanseri hücrelerinin proliferasyonunu ve metastazını artırmaktadır. (36) Tümör oksijenasyonu, kanserin ilerlemesinde kritik bir faktördür. Tümörlerde ve metastazlarında HIF-α alt birimlerinin aşırı ekspresyonu, insan kanserlerinin çoğunun agresifliği ile ilişkilidir ve genel sağkalımı düşürmektedir. Hipoksik koşullarda yapılan deneylerde, farelere enjekte edilen multipl miyelom kanseri hücrelerinin, normoksik koşullardaki hücrelerden kemik iliğine daha hızlı yayıldığı gösterilmiştir. Akut hipoksiye maruz kalan farelerde de akciğer metastazlarının arttığı gözlemlenmiştir. (37) Yalnızca hipoksik ortamda aktive olan bir inhibitörle HIF’i hedeflemek, metastazı azaltmak için umut verici stratejilerden biridir; multipl miyelomda faz I/II klinik deneyleri devam etmektedir. (37) CO2 hidratasyonu ve dehidratasyonunu katalizleyene hücre içi ve hücre dışı pH’ın düzenlenmesinde görev alan CA-IX tümör ilişkili ve hipoksi ile indüklenebilir bir enzimdir. CA-IX tümör mikroçevresindeki HIF-1, HİPOKSİ VE TÜMÖR İLERLEMESİ: METABOLİZMADAKİ . . .   9 asidifikasyonu indükleyerek kanser hücrelerinin hayatta kalmasını sağlar ve metastazı uyarır. (38) Dolayısıyla asidifikasyonun inflamasyon ve metastaz ile ilişkilendirilmesi klinik öncesi meme tümörü modellerinde CA-IX inhibisyonunun da tümör büyümesini ve metastazı azalttığını gösteren çalışmalar bulunmaktadır. (37) 3. Hipoksi, İnflamasyon ve İmmunsistem Kansere neden olan faktörlerin yaklaşık %25’inin kronik inflamasyon olduğu bilinmektedir. Enflamatuar süreç kanserin başlamasını tetikleyebildiği gibi bazen tümör büyümesini engelleyebilmektedir. (39) Hipoksik tümör mikroçevresi, invazyonu ve metastazı tetikleyerek immün supresyon ve direnci indüklemede önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle hipoksiyi hedeflemek, immünoterapinin etkinliğini arttırmanın bir diğer yoludur. Hipoksi ayrıca immün baskılayıcı stromal hücre farklılaşmasını teşvik edebilir ve kontrol noktası molekülleri dahil immün baskılayıcı faktörleri artırabilir. Hipoksi, immün baskılayıcı TME oluşumuna katkıda bulunabilecek immün kontrol noktalarını düzenleme yeteneğine sahiptir. (40) HIF-1, yüksek oranda hücresel oksijen seviyeleri tarafından düzenlenmesine rağmen, HIF-1 aktivitesinin normal oksijen konsantrasyonu altında bile inflamasyondan ve tümör mikroçevresinden etkilendiği gösterilmiştir. Enflamatuvar ortam şartlarında HIF-1 proteozomal degradasyona uğrayamaz ve anjiyogenez, hücre invazyonu, kemotaksis, hücre büyümesi ve hayatta kalmasında yer alan genleri uyararak inflamasyonu ve/veya tümör ilerlemesini tetikler (Şekil 4). (41) Tümör ilerlemesi esnasında ortama birçok pro-tümorijenik molekül salınır. Bunlardan biri olan dönüştürücü büyüme faktörü beta 1 (TGFβ1, Transforming Growth Factor-β1) tümör hücreleri tarafından aşırı eksprese edilerek, tümör büyümesi, anjiyogenez ve metastaza katkıda bulunan inflamatuvar sistemin ana bileşeni olan lökositler tarafından (tümör ilişkili makrofajlar gibi) doğrudan salınır. Bu büyüme faktörü hipoksik koşullarda PHD2 ekspresyonunu inhibe ederek HIF-1 proteinin degradasyonunu engeller. (41) 10   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Şekil 4: İnflamasyonun HIF-1 proteini üzerine etkisi. Hipoksiye maruziyetin artması ile birlikte normoksik ortam koşullarına göre proenflamatuvar sitokinlerin (Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α ve Interferronγ, INF-γ gibi) ekspresyonlarında da artış görülmektedir. (42) Bu sitokinlerin artmasıyla birlikte bağışıklık sistemi ile iş birliği içerisinde olan ve tümör sitotoksisitesine yol açan reaktif oksijen türleri (ROS) de artmaktadır. (43) 4. HIF-1’i Hedefleyen Bileşikler Tümörlerin düşük oksijen seviyelerindeki tepkilerini yöneten HIF, hücrelerin metabolik süreçlerini de yönetir. Dolayısıyla, HIF-1α’yı baskılayan ancak HIF-2α’yı baskılamayan birçok doğal ve sentetik bileşik belirlenmiştir. (21) Bu nedenle, kanser tedavisinde HIF-1α’yı hedef alan ilaç geliştirme çalışmaları hız kazanmıştır. (44) HIF-1 transkripsiyonunu doğrudan inhibe edebilen bileşikler akriflavin, ekinomisin, kardenolitler, herboksidien ve gliotoksindir. HIF-1 transkripsiyonunu ve translasyonunu inhibe eden üç bileşik; sülforafan, gambogik asit ve voakangindir. HIF-1α birikimi ile ilişkili sinyal yolaklarını engelleyen diğer bileşikler ise; gliseolinler, dihidrotanshinon I (DHTS), dictamnine, fraxinellone, DT-13, imperatorin, selastrol ve salternamit A’dır. HIF-1α degradasyonunu artıran bileşikler ise; diallil trisülfid (DATS), timokinon, andrographolid (AGL), izoliquiritigenin (ILTG), bavachinin, acacetin ve honokiol olarak tanımlanmıştır. (8) Bu bileşiklerin tespiti ve türevlerinin organik sentezi kanser mekanizmasının aydınlatılmasında son derece önemlidir. Bu bölümde, HIF-1’i hedefleyen bazı doğal bileşiklerden en sık kullanılanlar aşağıdaki alt başlıklarda özetlenmiştir. 4.1.Akriflavin Akriflavin; ilk olarak 1912’de Nobel ödüllü Paul Ehrlich tarafından keşfedilerek yara iyileşmesinde topikal bir antiseptik olarak kullanılmıştır. (45) HIF-1, HİPOKSİ VE TÜMÖR İLERLEMESİ: METABOLİZMADAKİ . . .   11 Daha sonra akriflavin, birkaç preklinik çalışmada güçlü bir HIF-1α inhibitörü olarak tanımlanmıştır. (46) Akriflavin; 3,6-diamino-10-metilakridinyum klorür (Trypaflavin) ve 3,6-diaminoakridin (Proflavine) karışımı FDA onaylı bir moleküldür. Antiseptik, tripanosidal, anti-viral, anti-bakteriyel ve antikanser etkileri tanımlanmıştır. (47) HIF alt birimlerinin dimerizasyonunu önlemektedir. (48) PGK1, VEGF ve HIF1A gibi HIF-1 genlerinin ifadelerini azalttığı literatürde gösterilmiştir. (8) Katı ve hematopoietik tümör hücrelerinin büyümesini engellemektedir. (47) Akriflavin; DNA’ya bağımlı protein kinazlar C (DNA-PKcs), topoizomeraz I ve II, HIF-1α ve sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü (STAT) dahil olmak üzere çeşitli proteinlerin inhibitörü olarak işlev görmektedir. (47) Semenza ve ark.nın yaptığı çalışmada; akriflavinin prostat kanseri modeli olan farelerde tümör büyümesini engellediği, intratumoral sitokin seviyelerini önemli ölçüde azalttığı ve tümör vaskülarizasyonunu engellediği bildirilmiştir. (49) Ayrıca, akriflavinin etkin kullanımının kolorektal, hepatoselüler, yumurtalık ve kronik lenfositik lösemi kanseri gibi birçok kanser türünde antitümör aktivitesi olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, akriflavinin sorafenib-dirençli hepatoblastom ve gemsitabin-dirençli pankreatik hücre hatlarında in vitro olarak ilaç duyarlılığını artırdığı da gösterilmiştir. (46) 4.2.Ekinomisin İlk olarak 1957’de Streptomyces echinatus’tan keşfedilen, kinoksalin antibiyotik ailesine ait doğal bir siklik peptit olan Ekinomisin, doğrudan HIF-1 inhibitörüdür. (48,50) Doğrudan HIF inhibitörleri, mRNA ekspresyonunun inhibisyonu, HIF proteininin sentezi, HIF alt birimlerinin dimerizasyonu, DNA’nın bağlanması ve HIF’in transkripsiyonel aktivitesi ile HIF ekspresyonunu düzenlerler. (15,48) HIF-1α’nın farmakolojik modülasyonunu içeren deneysel tedaviler umut verici yeni bir strateji haline gelmiştir. HIF-1α’nın DNA bağlanma aktivitesini inhibe eden bir bileşik olan ekinomisin inhibe edici etkisini, HIF-1 yolağında HIF-1α ve HIF-1β proteinlerinin HRE dizisine bağlanmasıyla göstermektedir. (48) Spesifik bir HIF-1α inhibitörü olan ekinomisin potansiyel bir antikanser ilaç olarak tanınmaktadır. Ekinomisin yapısında kinoksalin kromoforları içerir ve bis-interkalatör görevi görmektedir. (50) Ekinomisin, HIF-1’in bağlanması için gerekli olan kor dizileri (5’-ACGTG-30 veya 5’-GCGTG-30) ile kısmen örtüşen 5’-ACGT-30 ve 5’-TCGT-30 dizilerine bağlanır. Bu bağlanma, DNA’nın yapısını değiştirerek veya bağlanma bölgesini fiziksel olarak bloke ederek 12   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I HIF-1 transkripsiyon faktörünün hedef dizilerine ulaşmasını ve bağlanmasını engeller. (51) Ekinomisin ile yapılan çalışmalarda; antimikrobiyal ve antitümör etki göstererek hücre apoptozuna ve hücre sinyal inhibisyonuna neden olduğu bildirilmiştir. Ekinomisin, preklinik ve faz I deneylerinde antitümör aktivite ve tolere edilebilir toksisite gösterdiği kanıtlanmıştır. Ayrıca, kolon kanseri ve yumurtalık kanseri gibi katı tümörlerin tedavisi için faz II klinik çalışmaların devam ettiği bilinmektedir. (50) Ponnurangam ve ark. yapmış olduğu çalışmada, ekinomisin’in, Notch sinyal proteinlerini inhibe ederek kök hücreleri hedefleyen güçlü bir pankreas kanseri inhibitörü olduğunu ileri sürülmüştür. (52) Nanolipozomal ekinomisin preparatları geliştirmek için klinik çalışmalar biyofarmasötik şirketler tarafından devam etmektedir. (50) 4.3.Gliotoksin Esas olarak deniz kaynaklı elde edilen epiditiyodioksopiperazin tipi mantar toksinlerinin en belirgin üyesi olan gliotoksin, başlangıçta patojenik bitki mantarlarının biyolojik kontrolünde kullanılan antibiyotik bir madde olarak Trichoderma türlerinden izole edilmiştir. (53) Gliotoksinin HIF-1α/ p300 kompleksinin dimerizasyonunu engellediği gösterilmiştir. Prostat kanseri ksenogreftleri olan sıçanlarda yapılan bir çalışmada; Gliotoksin’in aortik halka anjiyogenez testi kullanılarak mikrodamar büyümesini önemli ölçüde inhibe ettiği ve tümör büyümesini etkili bir şekilde baskıladığı da ortaya konmuştur. Yapılan bu çalışmayla, tedavi edilen farelerde önemli bir kilo kaybı da gözlenmemiştir. Bu ümit verici sonuçlar, gliotoksinin anjiyogenezi etkili bir şekilde inhibe edebildiğini ve tümör büyümesini baskılayabildiğini göstermektedir. (54) Gliotoksin kullanımında, HIF-1 sinyal yolaklarının hedef genleri olan VEGF-A, LDHA, GLUT1 ve ENO1’in aşağı yönlü regüle olduğu PCR ile doğrulanmıştır. (54,55) Anti-kanser ilaçları ile kombinasyon halinde daha düşük gliotoksin dozu kullanılabilmektedir. Sağlıklı hücrelerde toksisitesini azaltmak için Comas ve ark. gliotoksini kanser hücrelerine iletmek için manyetik nanopartiküller geliştirmiştir. (56) Bu tür çalışmaların son yıllarda artması hedefli taşıyıcılar olarak yakın gelecekte eksozomların kullanılabileceğini de mümkün kılabileceğini göstermektedir. 4.4.DihidrotanshinonI Dihidrotanshinon I (DHTS), geleneksel Çin Tıbbı’nda kırmızı adaçayı veya Danshen olarak da bilinen Salvia miltiorrhiza bunge’den izole edilen HIF-1, HİPOKSİ VE TÜMÖR İLERLEMESİ: METABOLİZMADAKİ . . .   13 bir fenantrenkinondur. Kardiyovasküler ve serebrovasküler hastalıkları tedavi etmek için kullanılmaktadır. Etkileri arasında kan dolaşımını teşvik etmek ve zihni sakinleştirmek yer almaktadır. (57) HIF-1α, DHTS’nin potansiyel moleküler hedeflerinden biri olarak tanımlanmıştır. DHTS, HIF-1α’yı mRNA ifadesine ve protein yıkımına yol açmadan mTOR/p70S6K/4E-BP1 ve MEK/ERK sinyal yolaklarının inhibisyonuna neden olmaktadır. (58) Ayrıca, VEGF ve EPO’da, DHTS tarafından baskılanarak tümör hücresinin proliferasyonunu, anjiyogenezi, invazyonu, metastazı ve ferroptosisi inhibe etmektedir. (8,59) 4.5.Selastrol Selastrol, Tripterygium wilfordii (Thunder God Sarmaşığı) ve Celastrus regelii’nin kök özlerinden izole edilen bir triterpenoiddir. Çin’de otoimmün bozuklukları tedavi etmek için kullanılmıştır. (60) Kanser hücrelerinin apoptozunu etkili bir şekilde artırdığı, anjiyogenezi ve tümör metastazını inhibe ettiği bildirilmiştir. (61) Aynı zamanda anti-oksidatif ve anti-inflamatuvar özellik gösterdiği için otoimmun ve nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde de kullanılmaktadır. Ancak bazı kemoterapötik ajanların ve radyoterapinin sitotoksisitesini artırdığı bilinmektedir. (62) Tümör hücrelerindeki HIF-1α mRNA seviyeleri ve hipoksi kaynaklı nükleer HIF-1α proteini birikimi hem normoksik hem de hipoksik koşullar altında selastrol tarafından önemli ölçüde inhibe edilmiştir. Bunun sonucunda VEGF dahil olmak üzere HIF-1 hedef genlerinin transkripsiyonel aktivitelerinde azalma gözlemlenmiştir. Böylece, Selastrol’ün farklı mekanizmalar yoluyla hipoksi kaynaklı anjiyogenezi ve metastazı inhibe ettiği ve anti-kanser etkileri bulunduğu gösterilmiştir. (63) Selastrol’ün toksik etkilerini en aza indirmek için çalışmalar devam etmelidir. 4.6.Dialliltrisülfit Dialliltrisülfit (DATS), anti-fungal, anti-oksidatif, kardiyoprotektif, antihiperkolesterolemik ve anti-kanser aktiviteleri olan çoklu farmakolojik etkileri ile iyi bilinen sarımsaktan türetilen bir organosülfür bileşiğidir. (64) Wei ve ark.larının yapmış olduğu çalışmada, DATS’nin HIF-1α sentezini baskılayarak meme kanserinde metastazı inhibe ettiği gösterilmiştir. Hipoksik koşullar altında DATS, MDA-MB-231 hücrelerinde HIF-1 hedef genlerinden ANGPTL4, LOXL4 ve LOX’in mRNA ifadelerini inhibe etmiştir. Hücre kültürü deneyleri dahil olmak üzere çeşitli in vitro deneylerden elde edilen veriler, DATS’nin MDA-MB-231 hücrelerinin göçünü ve anjiyogenezini 14   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I konsantrasyona bağlı bir şekilde baskılayabildiğini ortaya çıkarmıştır. Ek olarak, anjiyogenez ile ilgili olarak L1CAM ile VEGF-A, EMT ile ilgili Slug, Snail ve MMP-2 proteinlerin ifadeleri, DATS tarafından etkili bir şekilde inhibe edildiği de gösterilmiştir. (65) 4.7.Andrographolide Suda düşük çözünürlüğe sahip olan andrographolide (AGL), çeşitli kronik enfeksiyöz hastalıklar için Çin Tıbbı’nda kullanılan geleneksel iyileştirici bir ilaçtır. Andrographis panikulata Nees (Acanthaceae) bitkisinden izole edilen önemli bir biyoaktif bileşendir. (66) Yapılan araştırmalarda AGL’nin antiinflamatuar, anti-oksidatif ve anti-kanser aktiviteye sahip olduğunu gösterilmiştir. (67) Anti-kanser ve anti-anjiyojenik özellikleri şimdiye kadar; meme, prostat, hepatom ve akciğer kanserlerinde gösterilmiştir. (68) AGL’nin karaciğer kanserinin proliferasyonunu ve metastazını inhibe ettiği hem in vitro hem de in vivo olarak bildirilmiştir. (68) AGL’nin, Hep3B ve HepG2 hücrelerinde VEGF-A’nın mRNA ifadesini baskıladığı ve HIF1α’nın nükleer translokasyonunu inhibe ettiği de gösterilmiştir. (67) Liu ve ark. yapmış olduğu çalışmada AGL’nin, TNF-α’yı, interlökin (IL)-1β’yı ve nükleer faktör-κB’yi inhibe etmesi nedeniyle kronik inflamatuar bağırsak hastalığının tedavisinde kullanılabileceğini göstermiştir. (69) Meme kanseri hücrelerinde ve küçük hücreli olmayan akciğer kanseri hücrelerinde AGL’nin HIF-lα aracılı VEGFA ekspresyonunu azalttığı da bilinmektedir. (68) 5. Sonuç Kanser tedavisinde standart kemoterapinin yaptığı gibi hedef hücreleri öldürmek yerine son yıllarda, belirli proteinleri veya genleri inhibe etmeyi amaçlayan hedefli tedaviler geliştirilmeye başlanmıştır. (8) Tümör mikroçevresindeki asidifikasyon karsinogenez sürecinde oldukça önemlidir. Karbonik anhidraz-IX (CA-IX) rolü gereği CO2 hidratasyonu ve hidratasyon mekanizmalarını devreye sokarak bu asidifikasyonda görev almaktadır. (70) Bu nedenle, tümörle ilişkili CA-IX enziminin inhibisyonu, tümörün asidik mikro ortamını önlemek için kanser tedavisinin ana hedeflerinden biri haline gelmiştir. (71) Dekervel ve ark.nın yaptığı çalışmada, Akriflavin’in CA-IX seviyeleri üzerindeki inhibitör etkileri ortaya konulmuştur. (72) Bir başka çalışmada, normoksik/hipoksik koşullarda hem primer hem de metastatik melanom hücre hatlarında Akriflavin ve Ekinomisin inhibitörlerinin HIF-1, HİPOKSİ VE TÜMÖR İLERLEMESİ: METABOLİZMADAKİ . . .   15 CA-IX üzerindeki etkileri gösterilmiştir. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda HIF-1α’nın CA-IX düzenlenmesi ve VEGF üzerine de potansiyel bir etkiye sahip olduğunu doğrulanmıştır. Bu inhibitörler ile CA-IX enzim düzeylerinin düşürülmesi ve melanomda yeni bir alternatif tedavi yaklaşımı elde edilmesi amaçlanmıştır. (38) Tümör mikroçevresindeki hipoksik ortam kemoterapi, radyoterapi, moleküler hedefleme terapileri ile immünoterapi de dahil olmak üzere kanser terapilerine karşı dirence neden olmaktadır. HIF-1 ve HIF-2 tarafından düzenlenen aktive edilmiş HIF yolağının, agresif kanser davranışlarından ve kötü prognozdan sorumlu olduğu düşünülmektedir. (10) Hipoksik koşullar altındaki HIF-1 aktivasyonu, kanserin birçok ayırt edici özelliği ile güçlü bir şekilde güçlü bir şekilde ilişkili olduğu literatür de desteklenmektedir. (73,74) HIF-1 inhibisyonunun, HIF-1α ile yüksek oranda bağlantılı olan kanser türlerini tedavi etmek için etkili bir yaklaşım olduğu yapılan çalışmalarda gösterilmiştir. (75) İmmün sistemi hücrelerinin enfeksiyonlarla başarılı bir şekilde mücadele etmeleri için düşük oksijen ve glukoz koşullarına uyum sağlaması gerekir. Özellikle erken bağışıklık tepkisinde önemli rolü olan miyeloid hücrelerinin HIF-1 aktivasyonundan doğrudan etkilendiği bilinmektedir. (76) Hem inflamatuvar hücreler hem de hipoksik mikroçevredeki tümör hücreleri tarafından bol miktarda eksprese edilen büyüme faktörlerinin, tümör ilerlemesini ve inflamasyonu teşvik ettiklerinden dolayı, inhibisyonları terapötik avantaj sağlayabilir. Spesifik olarak HIF-1’i inhibe eden ilaçlar, tümörogenezi, anjiyogenezi ve tümör metastazını bloke etme konusunda büyük umut vaat eden yeni bir terapötik ajan sınıfını temsil etmektedir. Ancak HIF-1 inhibitörleri kanser tedavisinde kullanılmadan önce hastaların kardiyovasküler hastalık öyküsü dikkate alınmalıdır. (77) Yapılan çalışmalar, HIF-1 sinyal yolaklarının birçok doğal bileşik tarafından inhibe edilebileceğini göstermektedir. Ancak, bu sonuçların çoğu in vitro deneyler ile elde edilmiştir. HIF inhibitörlerinden kanser önleyici etkisi in vivo olarak belirlenmiş çok az sayıda bileşik bulunmaktadır. Bu bileşiklerden yalnızca AGL klinik araştırmalara dahil edilmiştir. (68) 68. Bazı inhibitörler, HIF-1 ve/veya HIF-2’nin mRNA’sına veya proteinine, a ve β alt birimlerinin dimerizasyonuna ya da HIF’in ko-aktivatörleri ile etkileşimine doğrudan müdahale eder; ancak çoğu dolaylı inhibitördür veya birden fazla aktiviteye sahiptir. (10) Daha spesifik HIF inhibitörlerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Ancak şu ana kadar HIF’leri doğrudan inhibe eden hiçbir 16   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I ilaç, kanser hastalarını tedavi etmek için onaylanmamıştır. HIF inhibitörleri ile ilgili klinik çalışmalar devam etmektedir. İnhibitör bileşiklerinin klinik kullanımlarında karşılaşılan yaygın sorunlar; inhibisyonun gerçekleşmemesi, düşük özgüllük, zayıf farmakokinetik, toksisite ve klinik deney tasarımlarındaki eksikliklerdir. (8) Kanser tedavisi için kullanılabilecek, yeni HIF-1 inhibitörlerinin keşfi için daha etkin ve iyi tolere edilebilen türevler geliştirilmelidir. Ayrıca, HIF-1 inhibitörlerinin geliştirilmesi için çözünürlüğü daha yüksek, etkinliği güçlü yeni bileşiklerin keşfi için araştırmaların devamı gerekmektedir. Hipoksik mikroçevredeki tümör hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki ilişkiyi daha net ortaya koymak adına yeni ilaç adaylarının sentez çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Kaynakça 1) Ozensoy Guler O, Supuran Claudiu T., Capasso C. Carbonic anhydrase IX as a novel candidate in liquid biopsy. J Enzyme Inhib Med Chem. 2020;35(1):255-260. 2) Vaupel P, Piazena H, Notter M, et al. From Localized Mild Hyperthermia to Improved Tumor Oxygenation: Physiological Mechanisms Critically Involved in Oncologic Thermo-Radio-Immunotherapy. Cancers (Basel). 2023;15(5):1394. 3) Chen G, Wu K, Li H, Xia D, He T. Role of hypoxia in the tumor microenvironment and targeted therapy. Front Oncol. 2022;12(September):1-13. 4) Supuran CT. Targeting carbonic anhydrases for the management of hypoxic metastatic tumors. Expert Opin Ther Pat. 2023;33(11):701-720. 5) Ban HS, Kim BK, Lee H, et al. The novel hypoxia-inducible factor-1α inhibitor IDF-11774 regulates cancer metabolism, thereby suppressing tumor growth. Cell Death Dis. 2017;8(6):e2843-8. 6) Choudhry H, Harris AL. Advances in Hypoxia-Inducible Factor Biology. Cell Metab. 2018;27(2):281-298. 7) Singleton DC, Rouhi P, Zois CE, et al. Hypoxic regulation of RIOK3 is a major mechanism for cancer cell invasion and metastasis. Oncogene. 2015;34(36):4713-4722. 8) Ma Z, Xiang X, Li S, et al. Targeting hypoxia-inducible factor-1, for cancer treatment: Recent advances in developing small-molecule inhibitors from natural compounds. Semin Cancer Biol. 2022;80:379-390. 9) Dengler VL, Galbraith MD, Espinosa JM. Transcriptional regulation by hypoxia inducible factors. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2014;49(1):1-15. 23 BÖLÜM II EKSOZOMLAR VE KANSER: BİYOLOJİK İÇERİKLERİ, PAKETLENME MEKANİZMALARI VE SİNYAL YOLAKLARININ DÜZENLENMESİNDEKİ İŞLEVLERİ* ExosomesandCancer:BiologicalContent,Packaging Dynamics,andRegulatoryRolesinSignalingPathways Tuğba Kevser UYSAL1 & Ender ŞİMŞEK2 & Özen ÖZENSOY GÜLER3* 1(Dr.) Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, Ankara, TÜRKİYE. Yıldırım Beyazıt Üniversitesi Yenimahalle Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Ankara, TÜRKİYE. E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0002-5684-6641 2(Prof. Dr.) Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, Ankara, TÜRKİYE. Yıldırım Beyazıt Üniversitesi Yenimahalle Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Ankara, TÜRKİYE. E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0001-6635-4125 3*(Prof. Dr.) Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, Ankara, TÜRKİYE. Yıldırım Beyazıt Üniversitesi Yenimahalle Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Ankara, TÜRKİYE. E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0003-0389-9624 *Bu çalışma Ankara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından TSA-2022-2327 numaralı proje kapsamında desteklenmiştir. 24   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 1. Giriş Bir organizmada birçok hücre tipinin bir arada bulunup işlev görebilmesi yüksek düzeyde koordinasyon gerektirmektedir. Bu koordinasyon, moleküler mekanizmaların da dahil olduğu hücreler arası iletişim ile sağlanmaktadır. Hücreler arası iletişim, dolaylı ve doğrudan hücresel haberleşme yolları ile meydana gelmektedir. Hücre-hücre temasını gerektirmeyen dolaylı haberleşme sürecinin ana oyuncuları çözünebilir faktörlerdir. Çözünebilir faktör olarak plazma membran reseptörlerine bağlanabilen ve böylece hedef hücrelerdeki sinyalleşme basamaklarını aktive edebilen, salgılanan ekstrasellüler kimyasallar olan ligandlar görev almaktadır. Hormonların, sitokinlerin veya nörotransmitterlerin hücreler arası iletişim sağladığı bu sistemde, hedef ve kaynak hücre bulunmaktadır. Hücreler arası iletişim, kaynak hücre ve hedef hücre arasındaki mesafeye bağlı olarak üç şekilde görülebilmektedir: (1) hedef hücre ile salgılayan hücrenin aynı olduğu otokrin, (2) hedef hücrenin salgılayan hücreye yakın olduğu parakrin ve (3) hedefin uzak olduğu ve salgılanan faktörlerin kanda büyük mesafeler kat ettiği endokrin. Ayrıca hücre iletişimi, jukstakrin etkileşimlerinde olduğu gibi, hücre-hücre temaslarıyla da doğrudan sağlanabilmektedir. Bu klasik iletişime ek olarak son yıllarda, daha karmaşık, evrimsel olarak korunmuş bir iletişim sistemi ortaya çıkmıştır. Artık hücrelerin, ekstrasellüler veziküller (EV’ler) adı verilen zarla kaplı parçacıkların salınması yoluyla bilgi alışverişinde bulunduğu bilinmektedir. EV’ler, klasik çözünür/ çözünmeyen sinyal faktörlerine ek olarak içeriğinde birçok protein, lipid ve nükleik asit bulundurmaktadır. Aynı zamanda EV’ler, hücreler arasında madde taşınımına ve sinyal iletimine aracılık etmektedir. Ek olarak, vücut sıvıları boyunca seyahat edebilmekte, böylece işlevsel bilgileri uzak bölgelere in vivo iletebilmektedir. Bu konudaki bulgular, hücreler arası iletişimin doğası kavramını tamamen değiştirmiştir. (1-4) Heterojen kargoları ileterek sinyal yolaklarını etkileyen EV’lerden biri de eksozomlardır. (5) Eksozomların hastalık patogenezinde ve tümör biyolojisinde önemli rollerinin olduğu belirtilmiştir. (2,3,5-7) Karsinogenez sürecinde kanser hücresinin elde ettiği ve kanserin karakteristik özellikleri olarak adlandırılan durumların tümünde, eksozomların etkisi vurgulanmıştır. (8) Tüm bunlar göz önüne alınarak özellikle tümör kaynaklı eksozomlar, son zamanlarda sıvı biyopsi tümör belirteçleri olarak kabul edilmektedir. Noninvaziv yöntemlerle elde edilen eksozom içeriklerinin; erken tarama, erken tanı, terapötik etkilerin izlenmesi ve ilaç direncinin saptanmasında kullanılabilirliği dikkat çekmektedir. (9-11) EKSOZOMLAR VE KANSER: BİYOLOJİK İÇERİKLERİ, PAKETLENME . . .   25 2. Sıvı Biyopsi Dünya çapında önde gelen ölüm nedeni olarak karşımıza çıkan kanserin tedavisinde, son yıllarda hassas/kişiselleştirilmiş tıp umut verici bir perspektif sunmaktadır. Geleneksel biyobelirteçler ve görüntüleme teknikleri tümör tanısında önemli rol oynamaktadır; ancak geleneksel serum biyobelirteçlerinin özgüllüğü terapötik rehberlik açısından yetersizdir. Ek olarak, radyasyona maruz kalma ve ekonomik kaygılar nedeniyle görüntüleme teknikleri gerçek zamanlı tespit için kullanışlı değildir. (12) Geleneksel ‘katı biyopsi’ye noninvaziv bir alternatif sağlayan sıvı biyopsilerin kullanılması kanser teşhisi ve takibi için birçok avantaj sağlamaktadır. Tümörlerin erken tespiti ve moleküler karakterizasyonu, terapötik rehberlik ve nüksün izlenmesi için giderek daha fazla dikkate değer görülmekte ve çalışmalar bu alanda yoğunlaştırılmaktadır. (12-14) Sıvı biyopsilerin hastanın tedavi sırasında ve sonrasında birden fazla zaman noktasında değerlendirmeye olanak sağlaması, teorik olarak zamanında müdahalelerin önünü açabilecektir. Aynı zamanda cerrahi biyopsinin yükünü de ortadan kaldırarak ameliyat edilemeyen/erişilemez bir tümör tanısı konulduğu veya yüksek kanama ya da sinir hasarı riski nedeniyle birincil doku biyopsisinin mümkün olmadığı durumlarda, sıvı biyopsi çalışmaları son derece değerlidir. (14) Kanserin türüne ve evresine bağlı olarak kan (plazma, serum), idrar, tükürük, plevral efüzyon, amniyotik sıvısı, burun sekresyonları, bronkoalveolar lavajlar, lenfatik ve periton sıvıları, kemik iliği aspiratları, beyin omurilik sıvısı (BOS), prostat sıvısı, periton lavajı, balgam, mide suyu, anne sütü, safra ve hatta dışkı örnekleri gibi birçok numune, sıvı biyopsi olarak hizmet etme potansiyelleri açısından değerlendirilmiştir. (14) Tümörler, çeşitli hücresel bileşenleri sıvı biyopsi yoluyla dolaşıma salmaktadır. Dolaşıma aktarılan bu sıvı biyopsi biyobelirteçleri; dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC), cell free DNA’lar (cfDNA’lar), mikroRNA›lar (miRNA›lar), diğer kodlamayan RNA›lar (ncRNA›lar) ve son yıllarda EV’ler (özellikle de eksozomlar) olarak karşımıza çıkmaktadır. Eksozomların yeni nesil hastalık tanı yöntemi olarak kullanılmalarında bütün vücut sıvılarından elde edilebilmeleri önem arz etmektedir. (15,16) 3. Ekstrasellüler Veziküller EV’ler, endozomlardan veya plazma membranının tomurcuklanmasından köken alan küçük zar kesecikleridir. Hem mikroçevre hem de uzak dokular 26   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I üzerinde etki etmektedirler. EV’ler transmembran ve sitozolik proteinler, genomik ve mitokondriyal DNA’lar, lipidler, mRNA’lar, miRNA’lar ve uzun kodlamayan RNA’lar içermektedir. (17) İdrar, tükürük, sinoviyal sıvı, beyin omurilik sıvısı, bronkoalveolar sıvı, burun sıvısı, rahim sıvısı, amniyotik sıvı, anne sütü, safra, seminal plazma ve kan dahil olmak üzere her vücut sıvısından izole edilerek çeşitli fizyolojik süreçlerde görev almaktadırlar. (18) İlk olarak, 1983’te Pan ve Johnstone koyun retikülositlerinin gelişimi sırasında küçük veziküllerin hücreler arası boşluğa salındığını keşfetmiştir. (19) Ardından günümüze kadar birçok çalışma, EV’ler üzerine yoğunlaşmıştır. EV’lerin sınıflandırılması ve isimlendirilmesi konusunda bazı belirsizlikler olsa da, şu anda EV’ler; biyolojik işlevlerine veya biyogenez mekanizmalarına göre üç türe ayrılmaktadır: (1,17,20-22) 1) Mikroveziküller: Plazma membranından üretilen ve sitoplazmik kargo içeren, tomurcuklanarak salınan veziküller olarak bilinen mikroveziküllerin çapı, 100-1000 nm arasında değişmektedir. Ancak kanser hücrelerinden salındığında onkozom adı verilen mikroveziküllerin 10 μm boyuta kadar ulaşabildiği bildirilmiştir. 2) Apoptotik cisimler: Diğer EV türleri sağlıklı hücrelerden salınırken, apoptotik hücrelerden veya ölmekte olan hücrelerden salınan apoptotik cisimlerin çapı, 50 nm-5 μm arasında değişmektedir. Apoptoz durumunda, belirli koşullar altında ölmekte olan hücrelerden salınmalarının ardından makrofajlar tarafından ortadan kaldırılmaktadırlar. 3) Eksozomlar: Tüm hücre tipleri tarafından salınan ve çoğu biyolojik sıvıda bulunan 30-150 nm çapındaki, endozomal kökenli ve lipit çift katmanıyla çevrili küresel yapıları ile EV ailesinin en çok araştırılan grubudur. Eksozomların zenginleştirilmiş biyobelirteçler içermeleri ve içeriklerini koruyarak vücut sıvılarında dolaşmaları, onları yenilikçi teşhis/tedavi araçları olarak klinik uygulama için çekici adaylar haline getirmektedir. Tüm bu çarpıcı özellikleri, eksozomların ümit verici tümör belirteçleri arasında yer almasını sağlamıştır. (12) 4. Eksozomlar Eksozomlar, endositik kökenli küçük ekstrasellüler nanoparçacıklardır. Yüzey etkileşimleri yoluyla ya da içeriğini bir hücreden diğerine taşınması yoluyla hücreler arasındaki farklı sinyallere aracılık ederek hücresel iletişimde EKSOZOMLAR VE KANSER: BİYOLOJİK İÇERİKLERİ, PAKETLENME . . .   27 önemli roller üstlenmektedirler. Eksozomlar epitel hücreleri, dendritik hücreler, makrofajlar, mast hücreleri ve hatta tümör hücreleri dahil olmak üzere birçok hücre tarafından salınmaktadır. Eksozomlar, donör hücrelerine kıyasla yalnızca büyüklük açısından değil aynı zamanda RNA, protein, lipit bileşimleri ve içerikleri açısından da farklılık göstermektedir. Kökeni ne olursa olsun, eksozomlarda şaperonlar, hücre iskeleti proteinleri ve tetraspaninler dahil olmak üzere birçok ortak protein bulunmaktadır. (23) İlk kez 1980›lerde Johnstone ve ark., EV ailesinin en küçük üyesi olan eksozomları tanımlamıştır. (24) Keşiflerinden bu yana eksozomlar, EV ailesinin en çok ve en kapsamlı incelenen grubu olmuş, birçok hastalığın tanı ve tedavisine yönelik yapılacak araştırmalarda popüler hale gelmiştir. Bu durum, eksozomların benzersiz özelliklerinin sağladığı avantajlardan kaynaklanmaktadır. Avantajlı hale gelmesini sağlayan başlıca özellikler şunlardır: · Yarı ömürlerinin uzun olması, · Kan-beyin bariyerini geçebilmeleri, · Non-immünojenik ve non-toksik olmaları, · Plazma/serum gibi non-invaziv elde edilebilir numunelerden kolaylıkla elde edilebilmeleri, · İstenen terapötik ajanı yükleme yeteneği, · Stabilitelerinin yüksek olması nedeniyle laboratuvar koşullarına uygun olmaları. (25-28) Eksozomların, alıcı hücrelerin fenotipini ve davranışını etkileyebilecek biyolojik olarak işlevsel veziküller olduğu doğrulanmıştır. (29) Hücrelerin mikroçevresi ve biyolojisi, eksozomların içeriğini ve biyobelirteçlerini etkileyerek değiştirmektedir. Ancak genel olarak eksozomlar; sitozolik ve nükleer proteinler, zar proteinleri, hücre dışı matris proteinleri, metabolitler ve nükleik asitler (DNA, mRNA ve kodlamayan RNA türleri) gibi birçok kargo ürünü taşımaktadır. (8) Eksozom veritabanından alınan güncel bilgilere göre şu anda, 13 476 adet protein, 10 755 adet miRNA ve 3 408 adet mRNA eksozom içeriğinde tespit edilmiştir. (30) Eksozomları tanımlamak için bir dizi eksozom işaretleyici protein bulunmaktadır. Bunlar, eksozomun salgılanması sırasında yüksek oranda eksprese edilen taşıma, füzyon molekülleri ve Rab (Ras ilişkili bağlayıcı protein) protein ailesini içermektedir. Ayrıca eksozom biyobelirteç proteinleri olarak; GTPazlar, anneksinler, Flotillin-1, ESCRT (taşıma için gerekli olan endozomal 28   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I sıralama kompleksi), Alix (apoptoz bağlantılı gen 2-etkileşimli protein X), tümör duyarlılık geni 101 (TSG101), ısı şok proteinleri (HSP90a, HSP70), integrinler ve tetraspanin ailesi (CD9, CD63, CD81 ve CD82) gösterilmektedir (Şekil 1). (8) Ek olarak, kolesterolün, sfingomiyelinin ve seramidin de eksozom yapısında yüksek oranda bulunması nedeniyle biyobelirteç olarak kullanılabileceği ileri sürülmektedir (Şekil 1). (8) Şekil 1: Eksozom İçeriği, Biyogenezi ve Salınması. (8) 4.1.EksozomBiyogeneziveSalınması Hücre zarından doğrudan tomurcuklanan mikroveziküllerin aksine eksozomlar, olgunlaşan endozomların içinde endositik yollarla üretilmektedir (Şekil 1). Bu nedenle eksozomlar, endozomal kaynaklı EV’ler olarak da tanımlanmaktadır. (31) Eksozom biyogenezi sürecinde i) Multiveziküler cisimciklerin (MVB) oluşumu, ii) MVB’lerin plazma membranına taşınması ve iii) MVB’lerin plazma membranı ile füzyonu sonucu eksozomların salınması gibi birkaç hücresel adımın tamamlanması gerekmektedir. (8) EKSOZOMLAR VE KANSER: BİYOLOJİK İÇERİKLERİ, PAKETLENME . . .   29 Eksozomların biyogenezinde ilk basamak, hücre zarının bir kısmının içe doğru tomurcuklanması ve bu zar yapısının kıvrılarak intralüminal veziküller (ILV) olarak adlandırılan ilk kesecik yapısını oluşturmasıdır. Proteinler, lipidler, metabolitler, küçük moleküller ve iyonlar gibi hücre dışı bileşenler, endositoz ve plazma zarının içe katlanması yoluyla hücre yüzeyi proteinleri ile birlikte hücreye alınmaktadır. Hücrenin lümen tarafında ortaya çıkan plazma membran tomurcuğu oluşumu, dıştan içe plazma membran oryantasyonu ile meydana gelmektedir. Bu tomurcuklanma süreci, early-sorting endozomların (ESE’lerin) oluşumuna olanak sağlamaktadır. Endoplazmik retikulum (ER), trans-Golgi ağı (TGN) ve mitokondri bileşenleri ile oluşturulmuş ESE’ler arasında etkileşim meydana gelmektedir. Ayrıca ESE’ler, geç sorting endozomlara (LSE’ler) olgunlaşarak bu iletişim ağında yer almaktadır. Sonuç olarak, plazma zarının içe doğru tomurcuklanması ile oluşan küçük veziküllerin birleşmesiyle de bu erken endozomların olgunlaşma süreci sırasında ILV’ler meydana gelmektedir. (8,32-34) ILV’lerin oluşturulmasının ardından, lipidler, proteinler ve RNA’lar gibi sitoplazmik moleküller lümen içine kapsüllenerek geç endozom içinde biriktirilir. Böylece içerisinde çok sayıda vezikül taşıyan ve MVB’ler olarak adlandırılan bir yapı oluşmaktadır. MVB’ler; degradasyon ve eksozom salınımı olmak üzere iki farklı metabolik yol izleyebilmektedir. Eğer bir MVB degradasyonu söz konusu ise, MVB otofagozomlarla kaynaşarak içeriğini lizozomlarda bozulmaya yönlendirmektedir. MVB’ler degradasyon için lizozomlarla doğrudan da kaynaşabilmektedir. Degradasyon sonucunda açığa çıkan ürünler ise sitoplazmaya salınarak hücreler tarafından geri dönüştürülmektedir. Degrade edilmeyecek MVB’ler ise, hücre iskeleti ve mikrotübül ağı aracılığıyla plazma zarına taşınmaktadır. Burada MVB-docking proteinleri yardımıyla plazma zarının lümen tarafına kenetlenmektedir. Ardından eksositoz oluşmakta ve plazma membranı ile benzer bir lipid çift tabakalı oryantasyona sahip bu zarlı yapı eksozom adını alarak ekstrasellüler bölgeye serbest bırakılmaktadır. (8,32,33) Eksozom salınımının ardından hedef hücreye alımı, eksozomların yüzeyindeki proteinler ile hedef hücreler arasındaki etkileşimlere bağlıdır ve bu süreç rastgele değildir. Tetraspanin grubuna ait olan proteinler, integrinler, immünomodülatör proteinler gibi eksozom yüzey proteinleri; eksozomun hücreye penetrasyonu, invazyonu ve füzyonunda etkili olmaktadır. HSP70 ve HSP90 gibi HSP’ler de antijen bağlanmasında rol oynamaktadır. (8,35) Bir hücreden salınan eksozomlar, hedef hücreyi reseptör-ligand etkileşimi, endositoz veya 30   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I hücre zarı ile füzyon yoluyla etkileyebilmektedir. Eksozomların yalnızca hücre zarı reseptörlerine bağlanarak ligand görevi üstlendiği ilk mekanizmada, olası aşağı akış sinyalleri yönetilmektedir. İkinci etki mekanizması ise, eksozomların doğrudan membran füzyonu yoluyla hücreye alınmasıdır. Hücreye giren eksozom, adeta doğal bir nanotaşıyıcı gibi işlev görerek taşıdığı kargo içeriğini sitozole bırakmakta ve hücre içindeki bir dizi sinyal yolunu aktive veya inhibe etmektedir. (8,32,33,36) 4.2.EksozomveKanserİlişkisi İnsan vücudundaki hemen hemen her tür hücre, eksozomları hücre dışı ortama salma yeteneğine sahiptir. Ancak son yıllarda özellikle eksozomların nörodejeneratif bozukluklar, AIDS gibi birçok hastalığın patogenezinde ve özellikle tümör biyolojisinde önemli rollerinin belirlenmesi dikkat çekmektedir. (37,38) Kanserin gelişimi, kanser hücreleri ile mikroçevre bileşenleri arasındaki etkileşimlere dayanmaktadır. Son çalışmalar, kanser hücresi tarafından salgılanan eksozomların, tümör hücreleri arasında ve tümör hücresi ile komşu hücreler arasında bilgi ileterek hücre-hücre iletişiminde önemli roller oynadığını göstermektedir. Eksozomların hücreler arasında çapraz konuşma yapmak için çözünür faktörleri serbest bırakıp kanser ve sağlıklı hücreler arasında iletişim kurdukları gösterilmiştir. (22,39,40) Eksozomlar, yüzeylerinde veya içeriklerinde taşıdıkları enzimler, ligandlar, onkojenik sinyal proteinleri ve miRNA’lar aracılığıyla kanserin ilerlemesine ve metastazına da katkıda bulunmaktadır. (41) Ayrıca hücre proliferasyonunu indükleyebilir, anjiyogenezi teşvik edebilir, hücre dışı matriksi yeniden şekillendirebilir ve T hücre aktivitesini modüle ederek bağışıklık kaçışını tetikleyebilirler. (42,43) Hatta yapılan dikkat çekici bir çalışma ile, tümörden türetilen eksozomların integrin profilinin, tümörün hangi organa metastaz yapacağını belirlediği ve salınan eksozomların, organa özgü hücreler tarafından alındıklarında pre-metastatik niş oluşturmaya yardımcı olduğu vurgulanmıştır. (44) Eksozomlar, özellikle kanserin karakteristik özellikleri olarak adlandırılan karsinogenez sürecindeki durumlarda dikkat çekici roller üstlenmektedirler (Şekil 2). (8) EKSOZOMLAR VE KANSER: BİYOLOJİK İÇERİKLERİ, PAKETLENME . . .   31 Şekil 2: Eksozomların Karakteristik Özellikleri. (8) Tümör mikroçevresinde meydana gelen hipoksi, asidite, artan protein yanlış katlanması, ER stresi ve kalsiyum sinyal sisteminde meydana gelen değişimler eksozom salınımında artışlara neden olmaktadır. (21) Hipoksi altında kanser hücreleri tarafından salgılanan eksozomlar, tümör mikroçevresinin yeniden modellenmesinde ve hastalığın ilerlemesinde anahtar rol oynamaktadır. Kronik hipoksinin eksozom salgılanmasını teşvik ettiği ve muhtemelen metabolik atıkların uzaklaştırılması yoluyla hücrelere hayatta kalma avantajı sağladığı bildirilmiştir. (45) Tümör hücresinden salınan eksozomlar, özellikle hipoksik koşullarda endotel hücre özelliklerini de düzenleyerek anjiyogenezi teşvik etmektedir. (22) Hipoksik bir mikroçevrede, normoksik koşullara göre eksozom salınımının arttığı yapılan çalışmalarla kanıtlanmıştır. (46-48) Normoksik koşullarda eksozom salınımında ön elemanlar olan geç endozomlar, lizozomlarla birleşme eğilimindedir. Ancak hipoksik koşullarda lizozom ile birleşmeyerek salınım yolunu tercih etmektedir. Böylece eksozomlar, hipoksi altında tümör hücresinden daha fazla salınmaktadır. (47) Tümörlü hastalardan alınan eksozomlarda karbonik anhidraz-IX (CA IX) gibi hipoksi ve kanserle ilişkili proteinlerin de varlığı önem arz etmektedir. (49) Hipoksinin tümör ilerlemesi ve metastaz ile yakın ilişkisi göz önünde bulundurulduğunda, eksozomların da bu süreçlerde etkili olması dikkat çekicidir. Ayrıca, hipoksik tümör hücrelerinden anjiyojenik ve metastatik özelliklere sahip eksozomlar salınmaktadır. Böylece tümör büyümesini ve invazyonunu teşvik etmek için mikroçevreyi etkilemektedirler. (50) 32   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 4.3.EksozomveKanserTedavisi Kanser tedavisinde en çok kullanılan kemoterapötik ilaçlar, tümör hücrelerinin hayatta kalmak, çoğalmak veya göç etmek için kullandığı mekanizmaların bozulması yoluyla kanser hücrelerini öldürmeyi amaçlamaktadır. Bu amaçla, kanserin ilerlemesine katkıda bulunan mekanizmalarda yer alan proteinlerin veya nükleik asitlerin sentezini ve/veya işlevini hedef alırlar. Kemoterapi genellikle cerrahi, radyasyon tedavisi ve hatta diğer kemoterapötik ilaçlarla birlikte adjuvan olarak kullanılabilmektedir. Kanser tedavisi için kemoterapinin birçok faydasına rağmen, ilişkili toksisite de halen dikkat çeken dezavantaj olarak karşımıza çıkmaktadır. Toksisitenin nedeni, kemoterapötik ilaçların hızla bölünen hücreleri hedef alması ve bu nedenle saç folikülleri, kemik iliği, gastrointestinal sistem hücreleri gibi sürekli bölünen diğer birçok hücreyi de etkileyebilmesidir. Kemoterapi kullanımıyla ilgili bir diğer önemli zorluk da kazanılmış ilaç direnci olgusudur. Kemoterapinin uygulanması sonucunda gelişen ilaç direnci, kanser hastalarının klinik sonuçları üzerinde önemli bir dezavantaja sahiptir. (51) Taşıdıkları kargoları sayesinde, eksozomlar potansiyel kanser teşhis ve/ veya prognostik biyobelirteçler olarak önerilmektedir. (51) Kanser hücreleri, eksozomları salgılayarak, lokal ve sistemik mikroçevreyi değiştirmektedir. Bu nedenle kanser hücrelerinde eksozom biyogenezinin hedeflenmesi yeni bir kanser terapisi olarak dikkat çekmektedir. (45) Özellikle son yıllarda tümörojenik eksozom çalışmaları hız kazanmakta ve mekanizmanın aydınlatılması için büyük çaba sarf edilmektedir. (8) Kanser hücreleri, hücre dışı matriks içine gömülü fibroblastlar, endotel hücreleri ve bağışıklık hücrelerinden oluşan karmaşık bir tümör mikroçevresi ile desteklenmektedir. Tümör genişledikçe hücreler besinler, oksijen ve büyüme faktörleri için rekabet etmektedir. Sonuç olarak tümör hücreleri bu stresli koşullar altında hayatta kalabilmek için yeni mekanizmalar geliştirmektedir. Tümör hücrelerinin stres altında hayatta kalmasının önemli bir yolunun eksozom salınımı olabileceği ileri sürülmektedir. (21) Tümör hücreleri, hem besin ve oksijen eksikliği durumunda hem de radyasyon ve kemoterapi tedavisinden sonra uyum geliştirerek hayatta kalma yeteneği kazanabilmektedir. Radyasyon ve kemoterapi yoluyla oluşan DNA hasarı, çevredeki hücreler üzerinde etkileri olan kanser hücresi eksozomlarının salınmasına neden olmakta ve bu eksozomlar ile tedaviye direnç kazanılabilmektedir. (21) Ayrıca, eksozomların biyolojik özellikleri sayesinde non-toksik terapötik araçlar olarak kullanılması adına son yıllarda araştırmalar yoğunlaşmıştır. Eksozomlar ilaçlarla yüklenebilmekte ve taşıyıcı görevi görebilmektedir. Çünkü EKSOZOMLAR VE KANSER: BİYOLOJİK İÇERİKLERİ, PAKETLENME . . .   39 29) Kosaka N, Iguchi H, Yoshioka Y, Takeshita F, Matsuki Y, Ochiya T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J Biol Chem. 2010;285(23):17442-17452. 30) ExoCarta, Small extracellular vesicle (sEV) protein, RNA and lipid database. http://www.exocarta.org Erişim tarihi: 27 Eylül, 2025. 31) Abels ER, Breakefield XO. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 2016;36(3):301-312. 32) McGough IJ, Vincent J-P. Exosomes in developmental signalling. Development. 2016;143(14):2482-2493. 33) Stahl PD, Raposo G. Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles, Integrators of Homeostasis. Physiology. 2019;34(3):169-177. 34) Zhang S, Yang Y, Lv X, et al. Unraveling the Intricate Roles of Exosomes in Cardiovascular Diseases: A Comprehensive Review of Physiological Significance and Pathological Implications. Int J Mol Sci. 2023;24(21):15677. 35) Vlassov A V., Magdaleno S, Setterquist R, Conrad R. Exosomes: Current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 2012;1820(7):940948. 36) French KC, Antonyak MA, Cerione RA. Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake. Semin Cell Dev Biol. 2017;67:48-55. 37) Nakamoto H, Vígh L. The small heat shock proteins and their clients. Cell Mol Life Sci. 2007;64(3):294-306. 38) Peinado H, Alečković M, Lavotshkin S, et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 2012;18(6):883-891. 39) Charles NA, Holland EC, Gilbertson R, Glass R, Kettenmann H. The brain tumor microenvironment. Glia. 2011;59(8):1169-1180. 40) He M, Qin H, Poon TCW, et al. Hepatocellular carcinoma-derived exosomes promote motility of immortalized hepatocyte through transfer of oncogenic proteins and RNAs. Carcinogenesis. 2015;36(9):1008-1018. 41) Rak J, Guha A. Extracellular vesicles - vehicles that spread cancer genes. BioEssays. 2012;34(6):489-497. 42) Higginbotham JN, Demory Beckler M, Gephart JD, et al. Amphiregulin Exosomes Increase Cancer Cell Invasion. Curr Biol. 2011;21(9):779-786. 40   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 43) Skog J, Würdinger T, van Rijn S, et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 2008;10(12):1470-1476. 44) Hoshino A, Costa-Silva B, Shen T-L, et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 2015;527(7578):329-335. 45) Panigrahi GK, Praharaj PP, Peak TC, et al. Hypoxia-induced exosome secretion promotes survival of African-American and Caucasian prostate cancer cells. Sci Rep. 2018;8(1):3853. 46) King HW, Michael MZ, Gleadle JM. Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells. BMC Cancer. 2012;12(1):421. 47) Neviani P, Fabbri M. Exosomic microRNAs in the Tumor Microenvironment. Front Med. 2015;2. 48) Villarroya-Beltri C, Baixauli F, Gutiérrez-Vázquez C, Sánchez-Madrid F, Mittelbrunn M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 2014;28:3-13. 49) Supuran CT. Targeting carbonic anhydrases for the management of hypoxic metastatic tumors. Expert Opin Ther Pat. 2023;33(11):701-720. 50) Park JE, Tan H Sen, Datta A, et al. Hypoxic Tumor Cell Modulates Its Microenvironment to Enhance Angiogenic and Metastatic Potential by Secretion of Proteins and Exosomes. Mol Cell Proteomics. 2010;9(6):1085-1099. 51) Khan MI, Alsayed RKME, Choudhry H, Ahmad A. Exosome-Mediated Response to Cancer Therapy: Modulation of Epigenetic Machinery. Int J Mol Sci. 2022;23(11):6222. 52) Moon B, Chang S. Exosome as a Delivery Vehicle for Cancer Therapy. Cells. 2022;11(3). 53) Hall J, Prabhakar S, Balaj L, Lai CP, Cerione RA, Breakefield XO. Delivery of Therapeutic Proteins via Extracellular Vesicles: Review and Potential Treatments for Parkinson’s Disease, Glioma, and Schwannoma. Cell Mol Neurobiol. 2016;36(3):417-427. 54) Hung ME, Leonard JN. Stabilization of Exosome-targeting Peptides via Engineered Glycosylation. J Biol Chem. 2015;290(13):8166-8172. 55) Han Q-F, Li W-J, Hu K-S, et al. Exosome biogenesis: machinery, regulation, and therapeutic implications in cancer. Mol Cancer. 2022;21(1):207. 56) Bodega G, Alique M, Puebla L, Carracedo J, Ramírez RM. Microvesicles: ROS scavengers and ROS producers. J Extracell Vesicles. 2019;8(1). EKSOZOMLAR VE KANSER: BİYOLOJİK İÇERİKLERİ, PAKETLENME . . .   41 57) Sena CM, Leandro A, Azul L, Seiça R, Perry G. Vascular oxidative stress: Impact and therapeutic approaches. Front Physiol. 2018;9(December):1-11. 58) Santilli F, D’Ardes D, Davì G. Oxidative stress in chronic vascular disease: From prediction to prevention. Vascul Pharmacol. 2015;74:23-37. 59) Saeed-Zidane M, Linden L, Salilew-Wondim D, et al. Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress. Ahmad A, ed. PLoS One. 2017;12(11):e0187569. 60) Colombo M, Raposo G, Théry C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 2014;30(1):255-289. 61) Ezquer F, Quintanilla ME, Morales P, et al. Intranasal delivery of mesenchymal stem cell-derived exosomes reduces oxidative stress and markedly inhibits ethanol consumption and post-deprivation relapse drinking. Addict Biol. 2019;24(5):994-1007. 62) Patel GK, Khan MA, Bhardwaj A, et al. Exosomes confer chemoresistance to pancreatic cancer cells by promoting ROS detoxification and miR-155-mediated suppression of key gemcitabine-metabolising enzyme, DCK. Br J Cancer. 2017;116(5):609-619. 63) Shi B, Wang Y, Zhao R, Long X, Deng W, Wang Z. Bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomal miR-21 protects C-kit+ cardiac stem cells from oxidative injury through the PTEN/PI3K/Akt axis. Fan G-C, ed. PLoS One. 2018;13(2):e0191616. 43 BÖLÜM III EKSOZOMLAR: BİYOLOJİK FONKSİYONLARI VE KLİNİK ÖNEMİ Exosomes:BiologicalFunctionsandClinicalImportance Tuğçe KARADAĞ1 & Sacide PEHLİVAN2 1İstanbul Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, İstanbul/Türkiye E mail: tugcer[email protected] ORCID ID: 0009-0004-3472-4506 2 (Prof.Dr.) İstanbul Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, İstanbul/Türkiye E mail: [email protected] ORCID ID: 0000-0003-1272-5845 1. Giriş Hücre dışı veziküller (EV’ler) ilk kez 50 yıl önce Wolf tarafından plazmada gözlemlenmiş ve Wolf bunlara “trombosit tozu” adını vermiştir. O zamandan beri, test edilen biyolojik sıvıların çoğunun veziküller içerdiği ve in vitro yetiştirilen hücre hatlarının farklı derecelerde veziküller saldığı gösterilmiştir (1). Eksozomlar, çoğu hücre tipi tarafından hücre dışı boşluğa salgılanan bir tür zar vezikülleridir. Özellikle hücre-hücre iletişiminde birçok biyolojik işlevi yerine getirmenin yanı sıra, kümülatif kanıtlar, proteinler ve mikroRNA’lar gibi eksozomlardaki çeşitli biyolojik materyallerin çoğu insan malignitesinin patogenezi ile yakından ilişkili olduğunu ve hastalık teşhisi, prognozu ve tedavisi için paha biçilmez biyobelirteçler olarak hizmet edebileceğini öne sürmüştür (2). Son zamanlarda EV’lere olan ilginin çoğu, eksozomların hücre dışı miRNA ve mRNA taşınması da dahil olmak üzere salgılanan hücre dışı RNA’nın (exRNA) taşınmasında işlev gördüğünün keşfedilmesiyle tetiklenmiştir (3-4). Eksozom kargolarının kalitesi ve miktarına 44   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I ilişkin çalışmalar “sıvı biyopsi” kavramının temelini oluşturur; bu, potansiyel olarak yararlı bir tanı aracı ve hastalık ilerlemesinin, tedaviye yanıtın ve genel sağkalımın bir öngörücüsü olarak ortaya çıkmaktadır (5). 2. Eksozomların Tanımı ve Genel Özellikleri Eksozomlar ilk olarak 1983 yılında Pan ve Johnstone tarafından koyun retikülositleri üzerinde yapılan çalışmalar sırasında tanımlanmış ve burada transferrin reseptörlerinin küçük veziküller aracılığıyla salındığı gözlemlenmiştir. Johnstone 1989 yılında bu vezikülleri resmi olarak eksozom olarak adlandırmıştır. O zamandan beri çeşitli EV’ler tanımlanmış olsa da eksozomlar, mikroveziküller ve mikropartiküller gibi terimlerin sıklıkla birbirinin yerine kullanılmasıyla tutarlı bir terminolojisi eksik kalmıştır. Şu anda, EV’ler genel olarak kökenlerine göre kategorize edilmektedir: mikroveziküller doğrudan plazma zarından tomurcuklanırken, eksozomlar multiveziküler cisimlerin (MVB’ler) içinde oluşur ve ekzositoz yoluyla salınırlar (6). Eksozomlar, ökaryotik hücrelerin endozomlarında üretilen ve 30 ila 150 nm arasında değişen boyutlarıyla vücut sıvılarının çoğunda bulunan en küçük ekstraselüler veziküllerdir (7-8). Plazma zarıyla füzyondan sonra çoğu hücre tipinden hücre dışı boşluğa salınırlar (6). Bunlar, normal fizyolojinin bir parçası olarak ve anormalliklere yanıt olarak tüm hücreler tarafından salınır (9). Yüksek verimli eksozom çalışmalarına göre, eksozomlar proteinler, lipitler, metabolitler, mRNA, mitokondriyal DNA, mikroRNA (miRNA) ve birçok diğer kodlamayan RNA dahil olmak üzere çok sayıda molekül içerir (10). Eksozomlar kan hücreleri, bağışıklık hücreleri, endotel hücreleri, trombositler ve düz kas hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri tarafından salınır (6). Özellikle düşük immünojenisiteye ve yüksek taşıma verimliliğine sahip olmaları sayesinde inflamasyonu düzenleyebilir ve kanbeyin bariyerini geçebilirler. Eksozomlar, hücre sinyalleşmesi, bağışıklık yanıtları, tümör metastazı ve diğer biyolojik faaliyetler dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri yönlendiren sinyal moleküllerini taşırlar (8). Örneğin, T hücresi-DC etkileşimleri, bağışıklık tepkilerini baskılayan MHC sınıf II içeren eksozomları içerir ve trombosit türevli eksozomlar tümör hücresi çoğalmasını ve istilasını artırır (6). EKSOZOMLAR: BİYOLOJİK FONKSİYONLARI VE KLİNİK ÖNEMİ   45 Şekil 1. Eksozomlar, boyut ve içerik bakımından değişkenlik gösteren ve zarlarında yüksek dereceli oligoprotein kompleksleri içeren yapılar olarak tanımlanmaktadır ( 11). 3. Biyogenezi Genellikle, MVB’ler, plazma membranının içe doğru tomurcuklanmasını ve erken endozomların oluşumunu sağlayan birden fazla mekanizmanın aracılık ettiği endositoz yoluyla türetilir. Erken endozomlar, bazı proteinleri plazma zarına geri taşırken, aynı zamanda farklı kargoları (yükleri) intralüminal veziküller (ILV) içine alarak MVB’leri oluştururlar. Olgunlaşmalarının ardından, MVB’ler trans-Golgi ağından (TGN) vezikülleri serbest bırakıp almak ve endoplazmik retikulum (ER), mitokondri veya fagozom ile doğrudan temas kurmak gibi çeşitli yollarla diğer organellerle dinamik olarak iletişim kurabilir. Tüm bu iletişimler MVB’lerin oluşumunu ve ILV’lerin moleküler bileşimini düzenler. Sonunda, olgun MVB’ler ya parçalanmak üzere ya lizozomlarla birleşir ya da eksozomlar adı verilen ILV’leri serbest bırakmak için plazma membranıyla birleşir (7). Eksozom biyogenezinin her adımı, kargo, hücre tipi ve mikro ortama bağlı olarak oldukça değişken olan ve eksozomların heterojenliğine yol açan birden fazla mekanizma tarafından aracılık edilir. Özellikle, farklı mekanizmalar birbirini dışlamaz, ancak aynı MVB tarafından kullanılabilir. Aynı tip kargo, eksozom ayırmayı aracılık etmek için farklı mekanizmalar benimseyebilir (7). Eksozom salınımı çeşitli hücre içi moleküller tarafından düzenlenir; Ostrowski ve meslektaşları Rab27a ve Rab27b’nin eksozom salgılanmasında rol oynadığını ve bu proteinlerin veya efektörleri olan SYTL4 ve EXPH5’in susturulmasının HeLa hücrelerinde eksozom salınımını engellediğini göstermiştir. Yu ve meslektaşları, tümör baskılayıcı protein p53 ve onun aşağı akış efektörü TSAP6’nın eksozom üretimini artırdığını keşfetmiştir. Ek olarak, 46   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Baietti ve çalışma arkadaşları, sindekan-sintenin kompleksinin, eksozom oluşumunda çok önemli bir adım olan endozomal membranların içe doğru tomurcuklanmasını teşvik etmek için ALIX proteini ile doğrudan etkileşime girdiğini bulmuşlardır. Bu çalışmalar, eksozom biyogenezinin ve salgılanmasının hücre içindeki karmaşık ve koordineli bir molekül ağı tarafından sıkı bir şekilde düzenlendiğini göstermektedir (6). Şekil 2 Eksozom biyogenezi sürecine genel bakış. MVB›ler eksozom biyogenezinin merkezinde yer alır. Genel olarak MVB›ler, farklı mekanizmaların plazma zarının içe doğru tomurcuklanmasına ve erken endozomların oluşumuna aracılık ettiği endositozdan türetilir. MVB›ler trans-Golgi ağı (TGN), endoplazmik retikulum (ER), mitokondriyon, fagozom, RNA granülü ve mikronükleus gibi diğer organeller veya kompartımanlarla dinamik olarak iletişim kurabilir ve bu nedenle proteinler, RNA›lar, DNA›lar veya lipidler gibi farklı kargo repertuarları MVB›lere ayrılır. MVB›lerin olgunlaşmasından sonra, ya parçalanmak üzere lizozom ile kaynaşabilir ya da eksozom olarak adlandırılan ILV›leri serbest bırakmak için plazma membranı ile kaynaşabilirler (7). 4. Membran Yapısı ve Kargo İçeriği Yapılan çalışmalar sonucunda, eksozomların 3800’den fazla lipit, 50.000 nükleik asit ve 566.000’e yakın protein içerebileceği saptanmıştır (12). Ayrıca EKSOZOMLAR: BİYOLOJİK FONKSİYONLARI VE KLİNİK ÖNEMİ   47 proteomik çalışmalar, eksozomların hem hücre tipine özgü proteinleri hem de hücre yapışması, membran füzyonu, metabolizma ve sinyal iletimi gibi temel süreçlerde yer alan bir dizi çekirdek protein taşıdığını göstermektedir. Eksozomlara protein ayırma işlemi esas olarak iki yolla gerçekleşir: Ubikitinlenmiş transmembran proteinleri tanıyan ESCRT bağımlı ve ESCRT’den bağımsız mekanizmalar. Bazı proteinler, ubikitin veya ESCRT mekanizmasının katılımı olmadan eksozomlara yüklenebilir ve SIRT6’nın bu proteinlerin sıralanmasında rol oynadığı gösterilmiştir. Eksozomlar ayrıca, SYNCRIP gibi spesifik diziler ve RNA bağlayıcı proteinler aracılığıyla aktif ve seçici bir şekilde paketlenen mRNA ve mikroRNA dahil olmak üzere çeşitli RNA’lar içerir. Eksozomlardaki mikroRNA’lar, özellikle kanserde gen ifadesini düzenlemek için alıcı hücrelere aktarılabilir. İlginç bir şekilde, eksozomlarda anahtar miRNA işleme enzimleri olan Dicer ve Ago2 bulunmuştur ve bu da eksozomların sadece miRNA’ları taşımakla kalmayıp aynı zamanda işleyebileceğini düşündürmektedir (10). 5. Eksozom İzolasyon Yöntemleri Eksozomlar farklı vücut sıvılarında bulunan küçük veziküllerdir, boyutları nedeniyle izolasyonları zordur (13). Eksozom çalışmaları ve klinik uygulamaları açısından standardize edilmiş ayırma ve kantitatif yöntemler oldukça önemlidir. Ayırma yöntemlerinin doğru ve iyi anlaşılması, klinik kullanım için daha verimli ve kullanıma elverişli eksozomların geliştirilmesi için gereklidir (12). Eksozom izolasyonu için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bunlar; ultrasantrifüjleme (altın standart eksozom ekstraksiyon yöntemi olarak), boyut dışlama kromatografisi (SEC), polimer çökeltme, immünoafinite yakalama, ultrafiltrasyon ve mikroakışkan teknolojisi şeklinde sıralanabilir (12). Her bir tekniğin kendine göre avantajları ve dezavantajları bulunur. Örneğin, eksozom ayrımı için en yaygın kullanılan ve güvenilir yöntemlerden biri olan ultrasantrifüjleme, büyük numune hacimlerini işlemesi, düşük maliyeti ve yüksek eksozom konsantrasyonu eldesi açısından tercih edilirken, proteinler ve lipoproteinler gibi kirleticileri uzaklaştırma yeteneğinin düşük olması nedeniyle analizleri ve fonksiyonel araştırmaları etkileyebilme dezavantajına sahiptir. Bu nedenle izolasyon yöntemi seçimi eksozomların toplandığı kaynağa, boyutlarına, miktarına ve sonraki analizin amacına bağlı olarak değişkenlik gösterir (13). 48   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Eksozom İzolasyon Yöntemleri Ultrasantrifüjleme Teknikleri (UT) Diferansiyel santrifüjleme Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme Boyut Bazlı Teknikler Ultrafiltrasyon Sıralı filtrasyon Boyut Dışlama Kromotografisi İmmünoafinite Yakalama Tabanlı İzolasyon Çökeltme Teknikleri Mikroakışkan Temelli Teknikler Şekil 3 Eksozom izolasyonu için kullanılan yöntemlere genel bakış (14). 6. Karakterizasyonu Eksozomlar izole edildikten ve tanımlandıktan sonra yoğunluk, boyut, yüzey yükü, morfoloji, verim, saflık ve biyobelirteç ifadesi açısından ölçülerek karakterize edilmelidir (14). Eksozom karakterizasyonu genel olarak biyokimyasal analizler ve fiziksel analizler olmak üzere iki sınıfta incelendir (11). Eksozom karakterizasyonu için uygulanan çeşitli yöntemler mevcuttur. Bunlar arasında; antikor antijenlerinin spesifik bağlanmasının etkiyi kalitatif veya kantitatif olarak belirlediği western blotlar, immüno-histokimyasal testler ve enzime bağlı immünosorbent deneyi ELISA’lar gibi çeşitli immünolojik teknikler veya TSG101, Rab5, Alix ve farklı tetraspaninler 44 gibi çeşitli eksozom spesifik belirteçleri bulunur (12-11). Eksozom Karakterizasyon Yöntemleri Elektron mikroskobisi analizleri (SEM, TEM, CryoEM ve AFM vb. ) Nanopartikül izleme analizi (NTA) Alan akışlı fraksiyonlama (AF4) Dirençli darbe algılama (RPS) Ayarlanabilir dirençli darbe algılama (TRPS) Akış sitometrisi (FCM) Floresan tabanlı analiz (FBA) Yüzey plazmon rezonansı (SPR) İnterferometrik yansıma görüntüleme (IRI) Elektrokimyasal algılama Western Blotlama Tablo 1: Eksozom karakterizasyonunda kullanılan yöntemler (14). EKSOZOMLAR: BİYOLOJİK FONKSİYONLARI VE KLİNİK ÖNEMİ   55 gibi anahtar enzimleri ve genleri aşağı düzenleyerek Aβ ve p-tau seviyelerini azaltmıştır. Ayrıca, NF-κB/ERK/JNK sinyallemesini inhibe ederek ve proinflamatuar sitokinleri düşürerek glial hücrelerdeki nöroinflamatuar yanıtları bastırmıştır. Genel olarak, NSC-ekzos nöronal hücre canlılığını artırmış ve güçlü nöroprotektif etkiler göstererek Alzheimer hastalığındaki terapötik potansiyellerini vurgulamıştır (46). 9. Genel Değerlendirme ve Sonuç Eksozomlar, hemen hemen tüm hücre tipleri tarafından salgılanan nano boyutlu veziküller olup hücre-hücre iletişiminde önemli bir rol oynarlar. İçerikleri ve özellikleri, köken aldıkları hücrenin ve çevresindeki mikroçevrenin durumunu yansıtır. Spesifik oluşum süreçleri ve koruyucu çift membranları sayesinde eksozomlar, vücut sıvıları aracılığıyla hücreye özgü belirteçleri ve biyomolekülleri istikrarlı bir şekilde taşıyabilirler. Bu, özellikleri eksozomları, değerli klinik biyobelirteçler haline getirir. Bu sayede, çeşitli hastalıkların doğası, ciddiyeti ve prognozu hakkında bilgiler sunabilir ve mevcut tanı ve prognoz araçlarını geliştirme fırsatı sağlar. Günümüzde yapılan birçok çalışma, halihazırda var olan ilaçların etkinliklerini arttırmaya veya hastalıklı dokuları hedeflemek için kullanılacak yeni terapiler geliştirmeye odaklanmıştır. Bu bağlamda eksozomlar, düşük toksisiteleri ve yüksek verimlilikleri sayesinde umut verici bir yaklaşım sunar. Gen terapisi için umut vadeden bir araç olarak kullanılabileceği gibi, alıcı hücreler üzerindeki gen ekspresyonunu düzenleme yetenekleri sayesinde etkili gen iletim araçları olarak da hizmet edebilirler. Son yıllarda Eksozomlar ile ilgili yapılan çalışmalar artmakla birlikte bu veziküllerin teröpatik ve tanıda kullanımının yaygınlaşması için disiplinlerarası iş birliklerine ve kapsamlı araştırmalara ihtiyaç duyulmaktadır. KAYNAKÇA 1. Hessvik NPaL, A. Current knowledge on exosome biogenesis and release. Cellular and Molecular Life Sciences. 2018;75:193-208. 2. Li P, Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., & Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 2017;7(3):789. 3. Valadi H, Ekström, K., Bossios, A., Sjöstrand, M., Lee, J. J., & Lötvall, J. O. . Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature cell biology. 2007;9(6):654-659. 56   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 4. Skog J, Würdinger, T., Van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Curry Jr, W. T., ... & Breakefield, X. O. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature cell biology, . 2008;10(12):1470-1476. 5. Ludwig N, Whiteside, T. L., & Reichert, T. E. . Challenges in exosome isolation and analysis in health and disease. . International journal of molecular sciences. 2019;20(19):4684. 6. Zhang J, Li, S., Li, L., Li, M., Guo, C., Yao, J., & Mi, S. Exosome and exosomal microRNA: trafficking, sorting, and function. Genomics, proteomics & bioinformatics. 2015;13(1):17-24. 7. Han QF, Li, W. J., Hu, K. S., Gao, J., Zhai, W. L., Yang, J. H., & Zhang, S. J. . Exosome biogenesis: machinery, regulation, and therapeutic implications in cancer. . Molecular cancer. 2022;21(1):207. 8. Miron RJ, Estrin, N. E., Sculean, A., & Zhang, Y. . Understanding exosomes: Part 2—Emerging leaders in regenerative medicine. Periodontology 2000. 2024;94(1):257-414. 9. Li W, Pang, Y., He, Q., Song, Z., Xie, X., Zeng, J., & Guo, J. Exosomederived microRNAs: emerging players in vitiligo. Frontiers in immunology. 2024;15:1419660. 10. He C, Zheng, S., Luo, Y., & Wang, B. Exosome theranostics: biology and translational medicine. Theranostics. 2018;8(1):237. 11. Pegtel DM, & Gould, S. J. . Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 2019;88(1):487–514. 12. Rahnama M, Heidari, M., Poursalehi, Z., & Golchin, A. Global trends of exosomes application in clinical trials: a scoping review. Stem Cell Reviews and Reports. 2024;20(8):2165-2193. 13. Mukerjee N, Bhattacharya, A., Maitra, S., Kaur, M., Ganesan, S., Mishra, S., ... & Thorat, N. D. . Exosome isolation and characterization for advanced diagnostic and therapeutic applications. Materials Today Bio. 2025;31:101613. 14. Dilsiz N. A comprehensive review on recent advances in exosome isolation and characterization: Toward clinical applications. . Translational oncology. 2024;50:102121. 15. Fayazi N, Sheykhhasan, M., Soleimani Asl, S., & Najafi, R. . Stem cell-derived exosomes: a new strategy of neurodegenerative disease treatment. Molecular neurobiology. 2021;58:3494-3514. EKSOZOMLAR: BİYOLOJİK FONKSİYONLARI VE KLİNİK ÖNEMİ   57 16. Fiandaca MS KD, Mapstone M et al. Identification of preclinical Alzheimer’s disease by a profile of pathogenic proteins in neurally derived blood exosomes: a case-control study. Alzheimers Dement. 2015;11:600–607. 17. Mattsson N, Zetterberg, H., Janelidze, S., Insel, P. S., Andreasson, U., Stomrud, E., ... & Blennow, K. . Plasma tau in Alzheimer disease. Neurology. 2016;87(17): 1827-1835. 18. Mavroudis I, Balmus, I. M., Ciobica, A., Nicoara, M. N., Luca, A. C., & Palade, D. O. The role of microglial exosomes and miR-124-3p in neuroinflammation and neuronal repair after traumatic brain injury. Life. 2023;13(9):1924. 19. Chen Y, Gao, C., Sun, Q., Pan, H., Huang, P., Ding, J., & Chen, S. MicroRNA-4639 is a regulator of DJ-1 expression and a potential early diagnostic marker for Parkinson’s disease. . Front Aging Neurosci. 2017;2017(9):232. 20. Lee HK, Finniss, S., Cazacu, S., Xiang, C., & Brodie, C. Mesenchymal stem cells deliver exogenous miRNAs to neural cells and induce their differentiation and glutamate transporter expression. . Stem cells and development. 2014;23(23):2851-2861. 21. Xin H, Li, Y. I., Buller, B., Katakowski, M., Zhang, Y., Wang, X., ... & Chopp, M. Exosome-mediated transfer of miR-133b from multipotent mesenchymal stromal cells to neural cells contributes to neurite outgrowth. Stem cells. 2012;30(7):1556-1564. 22. Lee M, Liu, T., Im, W., & Kim, M. . Exosomes from adipose‐derived stem cells ameliorate phenotype of Huntington’s disease in vitro model. . European Journal of Neuroscience. 2016;44(4):2114-2119. 23. Lee ST, Im, W., Ban, J. J., Lee, M., Jung, K. H., Lee, S. K., ... & Kim, M. . Exosome-based delivery of miR-124 in a Huntington’s disease model. . Journal of movement disorders. 2017;10(1):45. 24. Zarà M, Amadio, P., Campodonico, J., Sandrini, L., & Barbieri, S. S. Exosomes in cardiovascular diseases. Diagnostics. 2020;10(11):943. 25. Li B, Zang, G., Zhong, W., Chen, R., Zhang, Y., Yang, P., & Yan, J. . Activation of Cd137 Signaling Promotes Neointimal Formation by Attenuating Tet2 and Transferrring from Endothelial Cell-Derived Exosomes to Vascular Smooth Muscle Cells. . Biomedicine & Pharmacotherapy. 2020;121:109593. 26. Wang Z, Zhang, J., Zhang, S., Yan, S., Wang, Z., Wang, C., & Zhang, X. MiR-30e and miR-92a are related to atherosclerosis by targeting ABCA1. Molecular medicine reports. 2019;19(4):3298-3304. 58   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 27. Emanueli C, Shearn, A. I., Laftah, A., Fiorentino, F., Reeves, B. C., Beltrami, C., ... & Angelini, G. D. Coronary artery-bypass-graft surgery increases the plasma concentration of exosomes carrying a cargo of cardiac microRNAs: an example of exosome trafficking out of the human heart with potential for cardiac biomarker discovery. . PLoS one, . 2016;11(4):e0154274. 28. Yu X, Deng, L., Wang, D., Li, N., Chen, X., Cheng, X., ... & Liao, Y. Mechanism of TNF-α autocrine effects in hypoxic cardiomyocytes: initiated by hypoxia inducible factor 1α, presented by exosomes. . Journal of molecular and cellular cardiology. 2012;53(6):848-857. 29. Gupta S, & Knowlton, A. A. . HSP60 trafficking in adult cardiac myocytes: role of the exosomal pathway. . American Journal of PhysiologyHeart and Circulatory Physiology. 2007;292(6):H3052-H3056. 30. Kuwabara Y, Ono, K., Horie, T., Nishi, H., Nagao, K., Kinoshita, M., ... & Kimura, T. . Increased microRNA-1 and microRNA-133a levels in serum of patients with cardiovascular disease indicate myocardial damage. Circulation: Cardiovascular Genetics. 2011;4(4):446-454. 31. Waldenström A, & Ronquist, G. . Role of exosomes in myocardial remodeling. . Circulation research. 2014;114(2):315-324. 32. Matsumoto S, Sakata, Y., Suna, S., Nakatani, D., Usami, M., Hara, M., ... & Komuro, I. . Circulating p53-responsive microRNAs are predictive indicators of heart failure after acute myocardial infarction. . Circulation research. 2013;113(3):322-326. 33. Wang L, Liu, J., Xu, B., Liu, Y. L., & Liu, Z. . Reduced exosome miR425 and miR-744 in the plasma represents the progression of fibrosis and heart failure. . The Kaohsiung journal of medical sciences,. 2018;34(11):626-633. 34. Ji Q, Ji, Y., Peng, J., Zhou, X., Chen, X., Zhao, H., ... & Xu, Y. Increased brain-specific MiR-9 and MiR-124 in the serum exosomes of acute ischemic stroke patients. PloS one. 2016;11(9):e0163645. 35. Chen Y, Song, Y., Huang, J., Qu, M., Zhang, Y., Geng, J., ... & Yang, G. Y. Increased circulating exosomal miRNA-223 is associated with acute ischemic stroke. Frontiers in neurology. 2017;8:57. Front Neurol. 2017; 8: 57. 36. Goetzl L, Merabova, N., Darbinian, N., Martirosyan, D., Poletto, E., Fugarolas, K., & Menkiti, O. Diagnostic potential of neural exosome cargo as biomarkers for acute brain injury. . Annals of clinical and translational neurology. 2018;5(1):4-10. 37. Mohan PB, Rajpurohit, S., Musunuri, B., Bhat, G., Lochan, R., & Shetty, S. . Exosomes in chronic liver disease. . Clinica Chimica Acta. 2023;540:117215. EKSOZOMLAR: BİYOLOJİK FONKSİYONLARI VE KLİNİK ÖNEMİ   59 38. Li Y, Luan, Y., Li, J., Song, H., Li, Y., Qi, H., ... & Yang, Y. . Exosomal miR-199a-5p promotes hepatic lipid accumulation by modulating MST1 expression and fatty acid metabolism. . Hepatology International. 2020;14:10571074. 39. Liu CH, Ampuero, J., Gil-Gómez, A., Montero-Vallejo, R., Rojas, Á., Muñoz-Hernández, R., ... & Romero-Gómez, M. . miRNAs in patients with nonalcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. . Journal of hepatology. 2018;69(6):1335-1348. 40. Wang C, Liu, J., Yan, Y., & Tan, Y. . Role of exosomes in chronic liver disease development and their potential clinical applications. . Journal of Immunology Research. 2022;2022(1):1695802. 41. Zhu C, Su, Y., Liu, L., Wang, S., Liu, Y., & Wu, J. Circular RNA hsa_circ_0004277 stimulates malignant phenotype of hepatocellular carcinoma and epithelial-mesenchymal transition of peripheral cells. Frontiers in cell and developmental biology. 2021;8:585565. 42. Lin Q, Zhou, C. R., Bai, M. J., Zhu, D., Chen, J. W., Wang, H. F., ... & Huang, M. S. Exosome-mediated miRNA delivery promotes liver cancer EMT and metastasis. . American journal of translational research. 2020;12(3):1080. 43. Bellin G, Gardin, C., Ferroni, L., Chachques, J. C., Rogante, M., Mitrečić, D., ... & Zavan, B. Exosome in cardiovascular diseases: a complex world full of hope. Cells 2019;8(2):166. 44. Li T, Li, X., Han, G., Liang, M., Yang, Z., Zhang, C., ... & Yu, S. The therapeutic potential and clinical significance of exosomes as carriers of drug delivery system. Pharmaceutics. 2022;15(1):21. 45. Zhang X, Sai, B., Wang, F., Wang, L., Wang, Y., Zheng, L., ... & Xiang, J. . Hypoxic BMSC-derived exosomal miRNAs promote metastasis of lung cancer cells via STAT3-induced EMT. . Molecular cancer. 2019;18(1):40. 46. Khan MI, Jeong, E. S., Khan, M. Z., Shin, J. H., & Kim, J. D. Stem cellsderived exosomes alleviate neurodegeneration and Alzheimer’s pathogenesis by ameliorating neuroinflamation, and regulating the associated molecular pathways. . Scientific Reports. 2023;13(1):15731. 61 BÖLÜM IV KANSER TEDAVİSİNDE mRNA AŞI TEKNOLOJİLERİ: MEKANİZMALAR, UYGULAMALAR VE GELECEK PERSPEKTİFİ mRNAVaccineTechnologiesinCancerTreatment: Mechanisms,Applications,andFuturePerspectives Furkan Ozan ÇÖVEN1 & Ayşegül İNAM2 & Tülay ÖNCÜ ÖNER3* 1(Arş. Gör. Dr.), Manisa Celal Bayar Üniversitesi, Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü, Manisa, Türkiye E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0001-7696-3418 2(Arş. Gör. Dr.), Manisa Celal Bayar Üniversitesi, Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü, Manisa, Türkiye E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0002-9411-1232 3*(Dr. Öğr. Üyesi), Manisa Celal Bayar Üniversitesi, Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü, Manisa, Türkiye E-mail: tulay[email protected] ORCID: 0000-0001-6180-5409 1. Giriş Kanser, dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir ve her yıl milyonlarca kişinin yaşamını yitirmesine sebep olmaktadır (1). Bu hastalığın tedavisinde cerrahi, kemoterapi, radyoterapi ve hormonal tedaviler gibi stratejiler tek başına veya kombinasyon halinde uygulanmaktadır. Son zamanlarda, hedefe yönelik ilaçlar ve immünoterapi, araştırmacıların ilgisini çekmektedir. Bununla birlikte, yenilikçi kanser tedavileri de giderek 62   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I artmaktadır (2). İmmünoterapi, bağışıklık sisteminin gücünü kullanarak kanser hücrelerini hedef alan ve ortadan kaldıran, kanser tedavisinde çığır açan bir yaklaşımdır. İmmünoterapi yaklaşımlarından biri olan kanser aşıları ile preklinik çalışmalarda umut verici sonuçlar elde edilmiştir (1). Kanser aşılarının geliştirilmesinde, tümör antijenlerine özgü ve uzun süreli bağışıklık yanıtı tetiklemede rol oynayan immünoterapi stratejisi önemlidir. Tümör antijenlerine karşı bağışıklık tepkisinin modüle edilmesi, kansere karşı geliştirilen aşıların temelini oluşturmaktadır (3). Kanser aşı platformları arasında peptid bazlı aşılar, hücre bazlı aşılar, viral bazlı aşılar ve nükleik asit bazlı aşılar bulunmaktadır. Tüm bu aşılar, tümör hücrelerinde az ya da çok spesifik olarak ifade edilen antijenlere karşı bağışıklık tepkisini tetiklemek veya güçlendirmek amacıyla tasarlanmaktadır (2). Nükleik asit aşıları, DNA veya RNA tarafından kodlanan antijenler içeren aşılardır. Nükleik asit aşıları, tek bir aşılama ile birden fazla antijenin kolayca uygulanmasına olanak tanıması ve güçlü majör histouyumluluk kompleksi (MHC) I aracılı CD8+ T hücre yanıtlarını indükleme kabiliyeti nedeniyle önemli bir potansiyele sahip aşı platformudur. Geleneksel aşılara kıyasla, nükleik asit aşıları güvenlik, ilgilenilen antijen için bağışıklık yanıtını indükleme özgüllüğü, hem humoral hem de hücresel bağışıklık yanıtlarını indükleme, nispeten düşük üretim maliyeti ve üretim kolaylığı gibi avantajlar sergilemektedir (1,3,4). Sahip olduğu avantajlar sayesinde nükleik asit aşı platformunda bulunan mRNA aşıları, çeşitli bulaşıcı hastalıkların ve farklı kanserlerin immünoterapisinde büyük umut vadetmektedir. Bu konuda en önemli örnek Yeni Koronavirüs Hastalığı (COVID-19) sırasında Şiddetli Akut Solunum Yolu Sendromu Koronavirüsü 2’ye (SARS-CoV-2) karşı geliştirilen mRNA aşıları olmuştur. Böylece kanser aşıları arasında mRNA tabanlı platformlar üzerinde yapılan araştırmaların tekrar ivme kazanmasına yol açmıştır (4). mRNA aşıları, yapısal ve işlevsel özelliklerine göre klasik (hücre içinde çoğalmayan) mRNA aşıları, kendi kendini çoğaltan mRNA aşıları ve dairesel RNA (circRNA) aşıları olarak üç farklı sınıfa ayrılabilir (5). Bu aşılar, tümörün gerilemesini sağlamak, kalıcı anti-tümör hafızası oluşturmak ve yan etkileri azaltmak için tasarlanmaktadır. Ancak, tümörün neden olduğu immünosupresyon ve immün direnç gibi zorluklar, uygulamaları kısıtlamaktadır (6). Bunun yanında en yaygın yan etkileri ise enjeksiyon bölgesi reaksiyonları ve geçici ateş olarak görülmektedir (5). Ayrıca, yapılan in vivo çalışmalarda mRNA aşılarının stabilitesi ve immün yanıt oluşturmada eksiklikleri tespit edilmekte, bu da kullanım alanlarını sınırlayabilmektedir. Bu sorunların aşılmasında kodon optimizasyonu, nükleotid modifikasyonu, kendi kendini KANSER TEDAVİSİNDE MRNA AŞI TEKNOLOJİLERİ: MEKANİZMALAR . . .   63 amplifiye eden mRNA vb. gibi uygun mRNA yapı modifikasyonlarına yönelik çeşitli araştırmalar yapılmaktadır. mRNA aşılarının etkinliğini artırmak için lipit nanopartiküllerin, polimerlerin, peptitlerin dahil edildiği formülasyon yöntemleri de incelenmektedir (1). mRNA ile kodlanan tümör baskılayıcılar, kanser hücresi çoğalmasını engelleyebilirken; tümör hücreleri veya tümör mikroçevresi içinde üretilen mRNA ile kodlanan tümör antijenleri veya sitokinler, konakta bağışıklık tepkilerini tetikleyebilir. Ayrıca, hedefe yönelik gen düzenlemesi için mRNA ile kodlanan genom düzenleme proteinleri, tümörün hayatta kalmasını sağlayan genlerin değişimine neden olarak, geleneksel kanser tedavilerine kıyasla daha az tekrarlı tedavi ile etkinliğin artmasını sağlayabilmektedir (7). 1990 yılında Wolfe ve ark., mRNA’yı ilk kez farelere başarıyla enjekte etmiş ve protein sentezinin gerçekleşmesiyle mRNA aşılarının uygulanabilirliğini göstermişlerdir (8). Ancak mRNA instabilitesi, uygun bir iletim sisteminin bulunmaması ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtının aktive olması konusundaki endişeler nedeniyle mRNA aşısı üzerindeki araştırmalarda ilerleme katedilememiştir (9). Karikó ve ark. modifiye edilmiş nükleotidlerin (örneğin, psödouridin, 5-metilsitozin, N6-metiladenozin ve 2-tiyoüridin) kullanımının, Toll-like reseptör (TLR) aktivasyonunu ve doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin aktive olmasını önlediğini 2005 yılında keşfetmiş ve bu da mRNA aşıları üzerine birçok çalışma yapılmasının önünü açmıştır (10). Erken aşamadaki klinik deneylerden elde edilen ve geleceğe ışık tutan sonuçlar, mRNA aşılarının melanom, meme ve prostat kanseri gibi farklı kanser türlerine yönelik potansiyelini doğrulamıştır (11). 2. mRNA Aşılarının Yapısı, Bileşenleri ve Üretimi mRNA, DNA’dan kopyalanan genetik bilgiyi taşıyan ve ribozomlar tarafından okunarak belirli biyolojik işlevleri yerine getirecek proteinlerin sentezlenmesini sağlayan, negatif yüklü, tek iplikli bir makromoleküldür (5). mRNA aşılarının üretimi için, T7 gibi bir DNA bağımlı RNA polimeraz promotörü ile mRNA yapı dizisinden oluşan plazmit DNA (pDNA) gerekmektedir. Lineerleştirilen pDNA, DNA bağımlı RNA polimeraz ile in vitro transkripsiyon yoluyla mRNA’ya çevrilmekte ve reaksiyon sonrası kalan DNA, DNAz ile uzaklaştırılmaktadır. Gen ifadesinin etkinliği, düzenleyici faktörler içeren 5’ ve 3’ UTR’lerdeki spesifik nükleotit dizisi ve modifikasyonlar tarafından belirlenmektedir. Ayrıca mRNA molekülü için 5’ 7-metilguanozin (m7G) başlığı ekzonükleazlar tarafından bozunmayı önlediği için verimli bir translasyon süreci için önemlidir. Bunların yanında kodon optimizasyonu, 64   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I guanin-sitozin (GC) içeriğinin optimizasyonu protein ekspresyonunu artırarak bağışıklık yanıtının en etkili şekilde uyarılması açısından önemlidir (12). 3. mRNA Aşılarının Mekanizması mRNA aşılarının mekanizması, viral proteinleri veya neoantijenleri kodlayan tek iplikli bir molekülün enjekte edilmesi sonucu immün sistemin tetiklenmesi temeline dayanmaktadır (1). Naked veya yüklü mRNA aşıları, antijen sunan hücrelerde (APC) tümör antijenlerini en uygun şekilde eksprese etmekte, APC aktivasyonunu ve doğuştan gelen veya kazanılmış bağışıklık yanıtın uyarılmasını kolaylaştırmaktadır (13). Bu aşı platformunun etki mekanizması, bir veya daha fazla tümörle ilişkili antijenleri (TAA) veya tümöre özgü antijenleri (TSA) kodlayan mRNA transkriptinin, APC’ler tarafından sitoplazmaya alınması, burada işlenmesi ve APC yüzeyinde eksprese edilen TAA’lar ve TSA’ların, MHC’ler aracılığıyla immün sistem hücrelerine sunulmasını içermektedir. Böylece, malign hücrelerin etkin bir şekilde yok edilmesi için hem antikor aracılı humoral yanıtları hem de CD4+ T yardımcı hücresi ve CD8+ sitotoksik T hücresi aracılı hücresel yanıtları indükleyebilmektedir (13). Enjeksiyon sonrasında, mRNA’lar, dendritik hücreler (DC) gibi APC’lerin sitoplazmasına ulaşmakta ve burada neoantijen proteinlerine dönüştürülmektedir. Bu adımda, TLR ailesinden olan TRL-7 ve TRL-8 aracılığıyla DC’ler uyarılmaktadır. Ardından, olgun DC’ler lenf düğümlerine taşınarak humoral ve hücresel bağışıklık yanıtn oluşumunu başlatmaktadır. Geleneksel aşılarla karşılaştırıldığında, mRNA aşıları güçlü bir tip I interferon yanıtını indüklemekte ve CD8+ T hücre yanıtlını tetiklemektedir. Hücresel yanıtın etkin olması, tümörlerin yok edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır (1). mRNA aşılarının etkinliğinin artmasında taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi de oldukça önemlidir. Diğer küçük moleküller (4-14 kDa) ile karşılaştırıldığında, daha büyük boyutu (300-1500 kDa) nedeniyle mRNA’nın hedef hücrenin zarından geçmesi daha zordur. Son zamanlarda, lipit bazlı nanopartiküller, polimerler, naked mRNA ve protein türevlerinin doğrudan enjeksiyonu dahil olmak üzere çok sayıda mRNA taşıyıcı sistemler geliştirilmiştir. Lipid nanopartiküller, mRNA aşıları için en gelişmiş ve yaygın olarak kullanılan in vivo taşıyıcı sistemlerdir (6). Hücre temelli aşıların karmaşıklığını aşmak, üretim süresini kısaltmak, ürün özellikleri ve maliyetlerdeki farklılıkları azaltmak amacıyla, alternatif vektör sistemleri olarak nanopartiküller geliştirilmektedir. Bu sistemler, nükleik asit alımını en üst düzeye çıkarmayı, RNA’nın bozulmadan korunmasını ve ilgili 71 BÖLÜM V CISH’İN TANISAL VE TERAPÖTİK BOYUTLARI: KROMOJENİK INSITU HİBRİDİZASYON İLE HÜCRE İÇİ İMMÜN KONTROL NOKTASI OLARAK CISH PROTEİNİ DiagnosticandTherapeuticDimensionsofCISH:Chromogenic insituHybridizationandtheCISHProteinasanIntracellular ImmuneCheckpoint GÜNEŞ ÖZEN EROĞLU 1,2 (Dr.,PhD.), 1 Department of Molecular Medicine,, Institute of Health Sciences; Aziz Sancar Institute of Experimental Medicine, Istanbul University, Istanbul, Türkiye 2 Department of Nursing, Faculty of Health Sciences, Haliç University, Istanbul, Türkiye E-mail: g.ozener[email protected] ORCID: 0000-0003-3681-9336 1. Giriş Moleküler biyoloji ve tıbbi biyoteknoloji alanlarında son yirmi yılda “CISH” kısaltması iki farklı anlamda kullanılmaya başlanmış, bu durum bilimsel literatürde özellikle disiplinler arası çalışmalarda, anlam kaymasına ve kavramsal farklılıklara yol açmıştır (1). Birinci anlamıyla CISH (Chromogenic in situ Hybridization), nükleik asit hibridizasyonunun kromojenik belirteçlerle görünür hale getirildiği, onkogen amplifikasyonları, gen füzyonları ve viral nükleik asitlerin varlığının belirlenmesinde yaygın olarak kullanılan güncel moleküler tekniklerden biridir (2, 3). İkinci anlamıyla CISH (Cytokine-Inducible SH2-Containing Protein) ise, SOCS (Suppressor of Cytokine Signaling) ailesine ait, hücresel düzeyde sitokin 72   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I aracılı sinyal yollarını düzenleyen bir proteini ifade eder (4). Bu molekül, T hücrelerinde ve doğal öldürücü (NK) hücrelerde, aşırı immün aktivasyonu sınırlayarak hücre içi immün kontrol noktası işlevi görmektedir (5). CISH kısaltmasının söz konusu iki kullanımı, köken ve uygulama bakımından ayrışsa da, ortak bir bilimsel zemini paylaşır: moleküler düzeyde özgüllük ve seçicilik. Moleküler biyoloji laboratuvarlarında kullanılan CISH yöntemi, genetik değişikliklerin doku veya hücre düzeyinde doğrudan görüntülenmesine olanak tanırken; immün hücre biyolojisinde tanımlanan CISH proteini, hücre içi sinyal dengesini ve immün yanıtın yoğunluğunu düzenler (2, 5). Günümüzde biri tanı, diğeri tedavi hedefi olarak değerlendirilmektedir (6). Bu nedenle, “CISH” kavramının iki yönlü doğasını anlamak yalnızca terminolojik netlik sağlamakla kalmayacak, aynı zamanda modern biyomedikal araştırmalarda tanısal yöntemlerle hücresel mekanizmalar arasındaki etkileşimi açıklamaya da katkı sunacaktır. Bu bölümde, CISH’in her iki anlamı farklı boyutlarda incelenecek; önce CISH yönteminin tanısal ve araştırma amaçlı kullanım alanları ve bu yöntemin ilkelerini temel alan ya da ona alternatif güncel yeni nesil yaklaşımlar ele alınacaktır. Ardından CISH’in hücresel düzenleme ve immünoterapi alanındaki rolü değerlendirilecektir. 1. ISH tekniği olarak CISH In situ hibridizasyon (ISH) tekniği, ilk kez 1969 yılında tanımlanan ve 1980’li yılların başlarında RNA moleküllerine uygulanmasıyla birlikte moleküler genetikte önemli bir dönüm noktası oluşturmuştur (7). Bu yöntem, belirli bir nükleik asit dizisinin hücre veya doku içindeki konumunu tespit etmek amacıyla geliştirilmiş bir hibridizasyon tekniğidir (8). Temelinde, hedef DNA veya RNA dizisine tamamlayıcı nükleik asit problarının işaretlenerek, bu probların uygun koşullar altında hedef diziye bağlanması yer almaktadır. Böylece hedef genin ya da transkriptin bulunduğu hücresel ortamda doğrudan görselleştirilmesi sağlanmaktadır (9). ISH, histolojik doku kesitlerine, sitolojik preparatlara veya metafaz kromozomlarına uygulanabilmektedir. Yöntem, belirli bir DNA dizisinin hücre içinde bulunup bulunmadığını, gen ekspresyonunun hangi hücre tiplerinde gerçekleştiğini veya bir genin kromozomal yerleşimini belirlemeye olanak sağlamaktadır. Bu sayede genetik hastalıkların tanısında, tümör biyolojisinde ve gelişimsel süreçlerin incelenmesinde yüksek özgüllükle bilgi elde edilebilmektedir (10). Tekniğin esası, tek iplikli nükleik asit zincirlerinin uygun sıcaklık ve iyonik koşullar altında tamamlayıcı dizileriyle eşleşerek stabil hibrit yapılar CISH’İN TANISAL VE TERAPÖTİK BOYUTLARI: KROMOJENİK . . .   73 oluşturmasıdır. Bu hibritlerin konumu, kullanılan işaretleme sistemine bağlı olarak farklı şekillerde görüntülenmektedir. Klasik uygulamalarda işaretleme genellikle radyoaktif izotoplarla yapılırken, günümüzde floresan veya kromojenik belirteçler tercih edilmektedir (11). Bu gelişmeler sonucunda ISH tekniği zaman içinde çeşitli alt türlere ayrılmıştır (8, 9). Floresan in situ hibridizasyon (FISH), floresan boyalarla işaretlenmiş probların kullanılmasını sağlarken; CISH yöntemi, floresan yerine enzimatik kromojen reaksiyonuna dayalı kalıcı bir boyama yaklaşımıdır (12). CISH’te hedef nükleik asit dizisine bağlanan prob, genellikle peroksidaz veya alkalin fosfataz gibi enzimlerle işaretlenmektedir (13). Bu enzimlerin substratıyla reaksiyonu sonucu oluşan kromojenik ürün, ışık mikroskobu altında kahverengi veya mavi tonlarda izlenebilmektedir (2). Böylece özel bir floresan mikroskop gereksinimi olmaksızın, geleneksel ışık mikroskobu ile sonuçlar değerlendirilebilmektedir (12). CISH tekniği, özellikle HER2, EBER, HPV, ALK, ROS1 ve MYC gibi gen amplifikasyonlarının veya viral DNA/RNA varlığının saptanmasında klinik tanıda yaygın biçimde kullanılmaktadır (2, 12). FISH’e kıyasla daha düşük maliyet, kalıcı-arşivlenebilir preparatlar ve doku morfolojisinin eşzamanlı incelenmesi gibi avantajları nedeniyle birçok laboratuvarda tercih edilmektedir; bu şekilde histopatolojik yapı ile genetik sinyalin birlikte yorumlanmasına olanak tanımaktadır (3). Kromojenik ISH’in en yaygın kullanım alanlarından biri, meme ve mide kanserlerinde HER2 gen amplifikasyonunun değerlendirilmesidir (6, 12). Türkiye’de hem üniversite hem özel laboratuvarlarda HER2 tanı testleri rutin olarak CISH veya SISH (Silver in situ Hybridization) teknikleriyle gerçekleştirilmektedir (14). CISH, yalnızca tanısal doğruluk sunmakla kalmamakta; genetik materyalin dokudaki uzamsal dağılımını kalıcı olarak ortaya koyarak tümör heterojenitesinin ve konuma bağlı değişimlerin yorumlanmasında önemli bir avantaj sağlamaktadır (15-17). Dijital patoloji ve yapay zekâ tabanlı görüntü analizindeki ilerlemeler, CISH verilerinin nicel analizini ve standardizasyonunu da kolaylaştırmıştır (18). Bu özellikler, CISH’yi klinik uygulanabilirliği yüksek ve morfolojik bütünlüğü koruyan bir in situ hibridizasyon yaklaşımı olarak konumlandırarak tanısal moleküler analizlerde vazgeçilmez bir araç haline getirmiştir. Son on yılda, daha yüksek duyarlılık, otomasyona uygunluk ve çoklu hedef analizine olanak tanıma özelliklerine sahip yeni tekniklerin geliştirilmesiyle birlikte, CISH’in yerini kısmen devralan yöntemler gündeme gelmiştir. Bu kapsamda RNAscope ve BaseScope gibi gelişmiş kromojenik RNA in situ hybridization (RNA-ISH) platformları öne çıkmaktadır. Bu teknolojiler, klasik CISH’e kıyasla çok daha kısa problar ve sinyal güçlendirme kaskadlarıyla, 74   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I tek hücre düzeyinde gen ekspresyonunun saptanmasına olanak tanımaktadır (19). Ayrıca, multiplex RNAscope uygulamaları sayesinde, birden fazla genin aynı doku kesiti üzerinde eşzamanlı olarak değerlendirilmesi mümkün hale gelmiştir (20). Bunlara ek olarak, SISH yöntemi, CISH’in temel prensiplerini koruyup kromojen yerine gümüş bazlı sinyal üretimi kullanarak tam otomatik sistemlerde çalıştırılabilmektedir. Bu teknik, özellikle HER2 testlerinde dijital görüntü analiziyle entegre edilerek standardizasyonu artırmıştır (2, 21). RNAscope HiPlex, DNAscope ve ViewRNA gibi yeni platformlar, hedef nükleik asitlerin doku bağlamında üç boyutlu haritalanmasına büyük katkı sağlayarak, CISH’in morfolojik özgüllüğünü yüksek çözünürlüklü moleküler verilerle birleştirmektedir (22). Tüm yönleriyle değerlendirildiğinde CISH, arşivlenebilir ve pratik bir tanı aracı olarak değerini korurken; RNAscope ve SISH gibi sistemler, translasyonel araştırmalarda ileri düzey ve çok hedefli hibrit çözümler olarak tercih edilen yaklaşımları oluşturmaktadır. 2. İmmünoterapötik Hedef Olarak CISH Cytokine-Inducible SH2-Containing Protein (CISH), SOCS ailesine ait bir proteindir ve başta immün hücrelerden olmak üzere birçok hücreden salgılanan sitokinlerin uyarımı ile sitokin aracılı JAK/STAT (Janus Kinase/ Signal Transducer and Activator of Transcription) sinyal yolağının negatif düzenleyicisi olarak görev yapmaktadır (1, 23, 24). SOCS ailesi (SOCS1–7 ve CIS/CISH), sitokin uyarımıyla hızla indüklenmekte ve hücresel sinyal iletimini SH2-aracılı bağlanma, JAK inhibisyonu ve ubikuitin-proteazom yıkımı gibi mekanizmalarla düzenleyerek gerçekleştirmekte; böylece bağışıklık, hematopoez ve endokrin işlevlerde yanıtın gücü ve süresi ayarlanmaktadır (1). CISH, genellikle interlökin (IL-2, IL-3, IL-15) veya interferon (IFN-γ) gibi immün uyarıcıların etkisiyle hızla indüklenmektedir (25, 26). CISH, hedef hücrede fosforile edilmiş JAK kinazları veya STAT proteinlerini bağlayarak sinyal iletimini sınırlamakta; böylece immün yanıtın aşırı aktivasyonunu engellemekte ve homeostatik dengeyi korumaktadır (5). Özellikle NK hücreleri ve CD8⁺ T lenfositlerinde CISH, hücre içi immün kontrol noktası işlevi görmektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, CISH geninin baskılanmasının bu hücrelerde sitotoksik kapasiteyi artırdığını, böylece antitümör immünitenin güçlenebileceğini göstermiştir (23, 27). Bu nedenle CISH, klasik immün kontrol noktaları olan PD-1 (Programmed cell death protein 1), CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte–Associated protein 4) ve LAG-3 (Lymphocyte-Activation Gene 3)’e ek olarak “hücre içi immün inhibitör” CISH’İN TANISAL VE TERAPÖTİK BOYUTLARI: KROMOJENİK . . .   75 sınıfında yeni bir immünoterapi hedefi olarak değerlendirilmektedir. Nitekim CISH ekspresyonunun azalması, T-hücre tükenmişliğinin azalması ve sitokin üretiminin artması ile ilişkilendirilmektedir (23). CISH geninin terapötik potansiyeli üzerine yürütülen preklinik çalışmalar ile özellikle CRISPR-Cas9 aracılığıyla CISH geninin inaktive edilmesi sonucunda, NK hücrelerinin tümör hücrelerine karşı etkinliğinin belirgin bir biçimde arttığı gösterilmektedir (2528). Bu yaklaşım, “CISH knock-out NK hücre terapileri” olarak adlandırılan deneysel tedavi stratejilerinin temelini oluşturmaktadır. CISH’in JAK2/STAT5 yolunu doğrudan modüle etmesi nedeniyle, bu proteinin hedeflenmesinin hematolojik malignitelerde, solid tümörlerde ve kronik inflamasyon modellerinde terapötik değer taşıyabileceği öngörülmektedir (29). CISH geninin CRISPR/Cas9 ile inaktive edildiği (CISH-KO) tümör-infiltre T hücrelerinin (TIL), immün kontrol noktası inhibitörleri ile birlikte kullanımında tedavi etkinliğini artırdığı gösterilmektedir (30). Tek başına neoantijene spesifik TIL’lerin adoptif transferi çoğu olguda sınırlı kalmakta; CD39, TOX (Thymocyte oselection-associated high mobility group box) ve PD-1 ekspresyonundaki artış, tümör mikroçevresinde CD8⁺ T hücrelerinin efektör işlev bozukluğuna işaret etmektedir. Buna karşılık, CISH inaktivasyonu TIL’lerde neoantijen tanıma kapasitesini, TCR (T-cell receptor) aracılı sinyal gücünü, T hücresi aktivasyonu/ proliferasyonunu ve tümör hücresi lizisini anlamlı olarak artırdığı; sonuçta tümör büyümesinin daha hızlı kontrol altına alındığı bildirilmektedir. İnsan T hücrelerinde CISH geninin, ekzon 3’ü hedefleyen iki sentetik single guide RNA (sgRNA) ile RNP-CRISPR/Cas9 kullanılarak silinmesi; delesyonun Sanger ve western blot yöntemleri ile doğrulanması gerçekleştirilerek, hedef dışı bir düzenlemenin saptanmadığı çalışmada bu etkinin hücre içi regülasyonu birçok yolak üzerinden değerlendirilmektedir. Çalışma kapsamında, CISH-KO T hücrelerinin anti-CD3/anti-CD28 ile uyarımının sağlanmasının ardından, PLC-γ1 (Phospholipase C-gamma 1) fosforilasyonu, Erk1/2-PKCδ/θ-NF-κB (Extracellular signal-regulated kinase 1/2Protein kinase C delta/thetaNuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) aktivasyonu ve Ca²⁺ sinyalinde artış, STAT5 fosforilasyonunda da artış bildirilmektedir. CISH’in TCR sinyalini baskılayan bir düzenleyici olduğunu desteklediği vurgulanmaktadır. Aynı süreçte PD-1 ekspresyonunda da artış görüldüğünden, CISH-KO TIL + anti-PD-1 kombinasyonu rasyonel ve etkili bir yaklaşım olarak öne çıkmaktadır. Bulgular, CISH’in T hücresi efektör fonksiyonlarını negatif düzenlediğini bildiren önceki çalışmalarla uyumluluk göstermektedir (31, 32). 76   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Ayrıca bu kapsamda, CISH’in hedeflenmesi ile immün kontrol noktası blokajının birlikte uygulanmasının, blokaja özgü antikorların etkinliğini ve CD8⁺ T hücresi yanıtını güçlendirerek tümör progresyonunun kontrolüne katkı sağlayabileceği öngörülmektedir. Bu yaklaşıma ilişkin erken faz klinik denemeler (örnek olarak NCT04426669, NCT03538613) gastrointestinal kanserler dâhil farklı tümör tipleri için önerilmiş/başlatılmıştır (33). Geniş perspektifte CISH’in hücresel fonksiyonları dikkate alındığında, bu protein immün sistemin “içsel fren” mekanizması olarak tanımlanabilmektedir. Hücre içi düzeyde sitokin sinyalini baskılayarak fizyolojik dengeyi sağlarken, aynı zamanda kanser immünoterapilerinde yeni nesil kontrol noktası hedeflerinden biri olarak dikkat çekmektedir. Bu çift yönlü rolü nedeniyle CISH, gen düzenleme temelli hücre terapilerinde (özellikle CAR-T ve NK hücre temelli yaklaşımlarda) kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımı ile yüksek translasyonel potansiyele sahip bir terapötik hedef olarak değerlendirilmektedir. 3. Sonuç CISH’i iki farklı yaklaşımla incelediğimiz bu çalışma ile hem tanısal nitelikteki in situ hibridizasyon tekniği hem de immünoterapötik bir hedef olarak bilimsel literatüre katkılarını değerlendirdik. Bu kısaltma iki farklı anlamda olsa da temelde seçicilik ve özgüllük kavramlarıyla aynı bilimsel zeminde birleşmektedir. CISH yöntemi tıbbi biyoloji temelinde onkoloji alanında yaygın olarak kullanılan klinik uygulanabilirlik ve morfolojik bütünlük avantajlarını koruyan ve aynı zamanda uzun süre arşivlenebilme gibi önemli yönleriyle güncel olarak kullanılan temel tanısal moleküler analiz yöntemidir. CISH proteini önemli sinyal ileti yolaklarıyla etkileşerek immün hücresel süreçlerin düzenlenmesinde büyük rol oynamaktadır. CISH bu düzenleyici rolüyle immünoterapi alanında güçlü bir tedavi stratejisi adayı olarak görülmektedir. Bununla birlikte, kontrol noktası inhibitörleriyle (örn. anti-PD-1) kombinasyon tedavisi klinik faydayı artırma potansiyeli göstermekte ve bu yaklaşım gelecek vadeden bir strateji olarak öne çıkmaktadır. Kaynakça 1. Yoshimura A, Naka T, Kubo M. SOCS proteins, cytokine signalling and immune regulation. Nature Reviews Immunology. 2007;7(6):454-465. 2. Dietel M, Ellis IO, Höfler H, ve ark. Comparison of automated silver enhanced in situ hybridisation (SISH) and fluorescence ISH (FISH) for the validation of HER2 gene status in breast carcinoma according to the guidelines CISH’İN TANISAL VE TERAPÖTİK BOYUTLARI: KROMOJENİK . . .   77 of the American Society of Clinical Oncology and the College of American Pathologists. Virchows Archiv. 2007;451(1):19-25. 3. Dandachi N, Dietze O, Hauser-Kronberger C. Chromogenic in situ hybridization: a novel approach to a practical and sensitive method for the detection of HER2 oncogene in archival human breast carcinoma. Laboratory Investigation. 2002;82(8):1007-1014. 4. Palmer DC, Restifo NP. Suppression of cytokine signaling proteins (SOCS) in T cells: implications for cancer immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 2009;32(5):371-380. 5. Delconte RB, Kolesnik TB, Dagley LF, ve ark. CIS is a potent checkpoint in NK cell–mediated tumor immunity. Nature Immunology. 2016;17(7):816824. 6. Wolff AC, Hammond MEH, Allison KH, ve ark. Human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline focused update. Arch Pathol Lab Med. 2018;142(11):1364-1382. 7. Gall JG, Pardue ML. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1969;63(2):378-383. 8. Levsky JM, Singer RH. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. Journal of Cell Science. 2003;116(14):2833-2838. 9. Veselinyová D, Mašlanková J, Kalinová K, Mičková H, Mareková M, Rabajdová M. Selected in situ hybridization methods: principles and application. Molecules. 2021;26(13):3874. 10. Nouri-Aria KT. In situ hybridization. In: Allergy Methods and Protocols. Totowa, NJ: Humana Press; 2008:331-347. 11. Ehtisham M, Wani F, Wani I, Kaur P, Nissar S. Fundamentals of in situ hybridization: A review. International Research Journal of Clinical Medicine. 2016;1:23-29. 12. Tanner M, Gancberg D, Di Leo A, ve ark. Chromogenic in situ hybridization: a practical alternative for fluorescence in situ hybridization to detect HER-2/neu oncogene amplification in archival breast cancer samples. The American Journal of Pathology. 2000;157(5):1467-1472. 13. Todorović-Raković N. Chromogenic in situ hybridization (CISH) as a method for detection of C-Myc amplification in formalin-fixed paraffinembedded tumor tissue: an update. In: The Myc Gene: Methods and Protocols. New York, NY: Springer US; 2021:313-320. 78   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 14. T.C. Sağlık Bakanlığı, Sağlık Hizmetleri Genel Müdürlüğü. Meme kanseri korunma, tarama, tanı, tedavi ve izlem klinik rehberi. Yayın No. 1170. Ankara: T.C. Sağlık Bakanlığı Yayınları; 2020. Revizyon: Kasım 2024. ISBN: 978-975-590-771-0 15. Rosa FE, Santos RM, Rogatto SR, Domingues MAC. Chromogenic in situ hybridization compared with other approaches to evaluate HER2/neu status in breast carcinomas. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2013;46(3):207-216. 16. Voith von Voithenberg L, Fomitcheva Khartchenko A, Huber D, Schraml P, Kaigala GV. Spatially multiplexed RNA in situ hybridization to reveal tumor heterogeneity. Nucleic Acids Research. 2020;48(3):e17. 17. Heaphy CM, Patel S, Smith K, ve ark. Detection of alternative lengthening of telomeres via chromogenic in situ hybridization for the prognostication of panNETs and other neoplasms. Modern Pathology. 2025;38(3):100651. 18. Bakoglu Malinowski N, Ohnishi T, Cesmecioglu E, Ross DS, Tsukamoto T, Yagi Y. Optimization of scanning protocol for AI-integrated assessment of HER2 dual bright-field in-situ hybridization application in breast cancer. Bioengineering. 2025;12(6):569. 19. Wang Z, Portier BP, Gruver AM, ve ark. Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma. The Journal of Molecular Diagnostics. 2013;15(2):210-219. 20. Erben L, Buonanno A. Detection and quantification of multiple RNA sequences using emerging ultrasensitive fluorescent in situ hybridization techniques. Current Protocols in Neuroscience. 2019;87(1):e63. 21. Rehman ZU, Ahmad Fauzi MF, Wan Ahmad WSHM ve ark. Review of in situ hybridization (ISH) stain images using computational techniques. Diagnostics. 2024;14(18):2089. 22. Rademacher A, Huseynov A, Bortolomeazzi M, ve ark. Comparison of spatial transcriptomics technologies using tumor cryosections. Genome Biology. 2025;26(1):176. 23. Palmer DC, Webber BR, Patel Y, ve ark. Internal checkpoint regulates T cell neoantigen reactivity and susceptibility to PD1 blockade. Med. 2022;3(10):682-704. 24. Hu X, Li J, Fu M, Zhao X, Wang W. The JAK/STAT signaling pathway: from bench to clinic. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2021;6(1):402. CISH’İN TANISAL VE TERAPÖTİK BOYUTLARI: KROMOJENİK . . .   79 25. Bernard PL, Delconte R, Pastor S, ve ark. Targeting CISH enhances natural cytotoxicity receptor signaling and reduces NK cell exhaustion to improve solid tumor immunity. Journal for Immunotherapy of Cancer. 2022;10(5):e004244. 26. Zhu H, Blum RH, Bernareggi D, ve ark. Metabolic reprograming via deletion of CISH in human iPSC-derived NK cells promotes in vivo persistence and enhances anti-tumor activity. Cell Stem Cell. 2020;27(2):224-237. 27. Delconte RB, Guittard G, Goh W, ve ark. NK cell priming from endogenous homeostatic signals is modulated by CIS. Frontiers in Immunology. 2020;11:75. 28. Nakazawa T, Morimoto T, Maeoka R, ve ark. CIS deletion by CRISPR/Cas9 enhances human primary natural killer cell functions against allogeneic glioblastoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 2023;42(1):205. 29. Daher M, Basar R, Gokdemir E, ve ark. Targeting a cytokine checkpoint enhances the fitness of armored cord blood CAR-NK cells. Blood. 2021;137(5):624-636. 30. Palmer D, Webber B, Patel Y, ve ark. 333 Targeting the apical intracellular checkpoint CISH unleashes T cell neoantigen reactivity and effector program. 2020. [Özet]. 31. Palmer DC, Guittard GC, Franco Z, ve ark. Cish actively silences TCR signaling in CD8+ T cells to maintain tumor tolerance. Journal of Experimental Medicine. 2015;212(12):2095-2113. 32. Periasamy S, Dhiman R, Barnes PF, ve ark. Programmed death 1 and cytokine inducible SH2-containing protein dependent expansion of regulatory T cells upon stimulation with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Infectious Diseases. 2011;203(9):1256-1263. 33. Kumar S, Sarthi P, Mani I, ve ark. Epitranscriptomic approach: To improve the efficacy of ICB therapy by co-targeting intracellular checkpoint CISH. Cells. 2021;10(9):2250. FERROPTOZ VE HASTALIKLARLA İLİŞKİSİ   87 Yukarıda bahsedildiği gibi, lipid peroksidasyonu enzimatik ya da otooksidasyon şeklinde gerçekleşebilir. Lipoksigenaz (LOX) enzimleri hem-olmayan demir içeren ve PUFA’ları perokside edebilen dehidrogenaz enzimleridir (33). Yapılan bir çalışmada tüm LOX’lardan yoksun hücrede, erastin ile indüklenmiş (Sistem Xcinhibisyonu ve arkasından GSH yetersizliği) ferroptoz önlenmiş olsa da aynı hücrede RSL3 ile indüklenen (doğrudan GPX4 inhibisyonu) ferroptozu durduramadığı da bildirilmiştir (34). 3. Ferroptozun Hastalıklarla İlişkisi 3.1.KardiyovaskülerHastalıklar Kardiyovasküler hastalıklar insan ölümlerinin önde gelen sebeplerindendir. Yüksek LDL-kolesterol, sigara kullanımı, hipertansiyon, diyabet, obezite, aşırı alkol kullanımı ve düşük fiziksel aktivite kardiyovasküler hastalıklara yatkınlık açısından yüksek risk faktörleridir (35). Kalp ve damar hücrelerinde yapılan in vitro ferroptoz çalışmaları kardiyovasküler hastalıklardaki ferroptoz mekanizmalarını derinlemesine araştırmayı yönlendiren bir etken olmuştur (36). Ateroskleroz Ateroskleroz, kardiyovasküler hastalıklar arasında en sık görülenlerden biri olup, diğer kardiyovasküler patolojiler için de temel bir zemin oluşturmaktadır. Ateroskleroz damarlarda oluşan fibröz plaklar sebebiyle damar çeperinin sertleşmesi, lümenin daralması, damarın elastikiyetinin azalmasıyla karakterizedir. Bu durum damarların beslediği organlarda iskemik değişikliklere yol açabilmektedir (36,37). Aterosklerozda damar duvarında okside lipidlerin birikimi ve artan demir düzeyleri, ferroptoz açısından önemli bir rol oynamaktadır (38,39). Ayrıca, hücrelerde artan GPX4 düzeyi ile ateroskleroza karşı direnç gelişebildiği bildirilmiştir (40). Yapılan bir deneysel hayvan çalışmasında, yüksek yağlı diyetle beslenen farelerde ferroptoz inhibitörü olan ferrostatin-1 (Fer-1) kullanımının aterosklerotik lezyonları hafiflettiği bildirilmiştir. Ayrıca, okside-LDL ile indüklenmiş aort endotelyal hücrelerinde Fer-1 uygulamasının hücre ölümünü azalttığı gösterilmiştir (41). Aterosklerozun farklı evrelerinde ACSL4 ve GPX4 düzeylerinin incelendiği başka bir çalışmada ise, ilerlemiş aterosklerotik plaklarda ACSL4 ekspresyonunun arttığı, GPX4 ekspresyonunun ise azaldığı gözlemlenmiştir. Bu bulgular, ferroptozun aterosklerotik plaklarda instabiliteye neden olabileceğini düşündürmektedir (42). 88   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I İskemi/ReperfüzyonHasarı İskemi/reperfüzyon hasarı (IRH); iskemik dokuya yeniden kan akışının sağlanması sonrası dramatik bir şekilde dokuda hücre ölümü ve fonksiyon bozukluğunda artışın görülmesi olarak tanımlanmaktadır (43). IRH durumunda reperfüzyona bağlı olarak gerçekleşen oksidatif yükü takip eden lipid peroksidasyonu (44) ve hücre içi demir artışı (45) araştırmacıları ferroptozun bir etkisinin olup olmadığını araştırmaya yönlendirmiştir. Çalışmalarda ferroptozun çoğunlukla reperfüzyon sonrasında gerçekleştiğini; iskemi durumlarında ferroptozu baskılayıcı elemanların gözle görülür bir etkisi olmadığı belirtilmiştir (46). Fer-1, deksrazoksan (DXZ), liprokstatin-1 gibi ferroptoz inhibitörü olarak kullanılan bileşiklerin miyokardiyal IRH’a bağlı hasarı azalttığı görülmüştür (47,48). Deneysel fare modelinde yapılan bir çalışmada ise, Fer-1 ile renal IRH’a karşı koruma sağlanabildiği gösterilmiştir (49). Karaciğer transplantasyonunda problem olarak karşımıza çıkan IRH, deneysel hayvan çalışmalarında Fer-1, vitamin E ve deferoksamin (bir demir bağlayıcı) gibi ferroptozun önleyen ajanlar karaciğer hasarını engelleyebilmektedir. Bununla birlikte, donördeki yüksek ferritin seviyeleri transplantasyondan sonra karaciğer hasarı olasılığını tahmin etmede önem taşımaktadır (50). 3.2.AkciğerHastalıkları AkutAkciğerHasarı Akut akciğer hasarı; artmış vasküler permeabilitenin eşlik ettiği akut ve persistan akciğer inflamasyonu olarak tanımlanır (51). Akut akciğer hasarı oluşturulan fare modelinde yapılan bir çalışmada, Tip 2 alveol epitellerinde demir birikimi, GSH tüketimi ve GPX4 işlevinde azalma gözlemlenmiştir (52). Bir başka çalışmada ise, lipopolisakkarit ile (LPS) hasar oluşturulan hücrelerde demir düzeyleri önemli ölçüde yükselirken, SLC7A11 ve GPX4 ekspresyonları önemli ölçüde düşmüştür. Bu hücreler Fer-1 ile müdahale edildiğinde, LPS ile indüklenen akut akciğer hasarının etkilerinde azalma görülmüş ve ferroptozun etkili olduğunu gösterilmiştir (53). KronikObstrüktifAkciğerHastalığı(KOAH) Kronik obstrüktif akciğer hastalığı yaygın olarak görülen, artan nefes darlığı ve doku hasarıyla karakterize olan bir hastalıktır. KOAH’ın en yaygın sebebi sigara kullanımıdır (54). Sigara dumanındaki ROS’lara bağlı oksidatif FERROPTOZ VE HASTALIKLARLA İLİŞKİSİ   89 stresin inflamasyon ve hücre ölümüne yol açtığı ve sigara dumanına maruz kalındığında akciğer epitel hücreleri ve alveolar makrofajlarda demir artışı olduğunun bilinmesi ile yakın zamanda KOAH araştırmalarında ferroptoz ilgi odağı haline gelmiştir (55,56). Deneysel fare modelleri ve hücre kültürü çalışmalarından elde edilen veriler, sigara dumanına maruziyetinin bronş epitel hücreleri ve akciğer epitel hücrelerinde ferroptoza yol açtığını ve ferroptoz inhibitörlerinin KOAH için bir tedavi stratejisi olabileceğini göstermektedir (57–59). 3.3.NörodejeneratifHastalıklar Nörodejeneratif hastalıkların demir metabolizması ve yüksek ROS düzeyleri ile ilişkisi bilinmekle birlikte, ferroptoz tanımı sözlüğe girmeden önce bu hastalıkların apoptoz yoluyla ortaya çıktığı düşünülmüştür (60). Ancak ferroptozun tanımlanması ile bu alanda yapılan çalışmalar ferroptozun nörodejeneratif hastalıklarla bağlantısı olduğunu ortaya koymuştur. AlzheimerHastalığı Alzheimer hastalığı, belirli nöron popülasyonlarının yüksek oranda kaybıyla karakterize olan, zamanla ilerleyen ve öğrenme ile hafıza gibi bilişsel fonksiyonları etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır. Aynı zamanda demansın en sık görülen tiplerinden biridir (61). Alzheimer hastalarının beyinlerinde ve deneysel fare modellerinde aşırı demir birikimi, artmış lipid peroksidasyonu ve ROS oluşumu uzun süredir gözlemlenmektedir (62–64). Alzheimer modeli oluşturulan farelerde yapılan bir çalışmada, memelilerde hem içermeyen demiri hücre dışına taşıyabilen tek transmembran proteini olan ferroportin 1 (Fpn) ekspresyonunun azaldığı, bununla ilişkili olarak hafıza bozukluklarının ortaya çıktığı bildirilmiştir. Aynı çalışmada, çeşitli ferroptoz inhibitörlerinin uygulanması ve Fpn düzeylerinin düzeltilmesiyle nöron ölümü ve hafıza hasarının önüne geçildiği saptanmıştır (65). GPX4 yapısında bulunan selenyumun, Alzheimer modeli oluşturulan farelere organik formda (selenyum açısından zengin maya ile) takviye edilmesinin bilişsel fonksiyonlarda iyileşme sağladığı gösterilmiştir (66). ParkinsonHastalığı Parkinson hastalığı, farklı patogenezlerle gelişen nöronal kayıplara bağlı olarak ortaya çıkan, klinik açıdan titreme, hareketlerde yavaşlama ve denge problemleriyle karakterize, milyonlarca insanı etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır (67). Oksidatif stresin uzun yıllardır Parkinson hastalığında 90   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I dopaminerjik nöron kayıplarıyla ilişkili olduğu düşünülmektedir. Ferroptozun temel mekanizmalarından biri olan lipid peroksidasyonu, çeşitli hücre ve hayvan modellerinde gözlemlenmiştir (68). Ferroptoz kavramı tanımlanmadan önce yapılan çalışmalarda bile, postmortem Parkinson hastalarının substantia nigra (SN) bölgesinde artmış demir düzeyleri ve yükselmiş lipid peroksidasyon ürünleri tespit edilmiştir (69). Benzer şekilde, Parkinson hastalarının beyinlerinde yapılan başka bir postmortem çalışmada SN bölgesinde GPX4 düzeylerinin anlamlı derecede azaldığı bildirilmiştir (70). Daha sonra yapılan deneysel hayvan modeli çalışmalarında, demir şelatörlerinin nöron hasarına karşı koruyucu etkiler gösterebildiği belirlenmiştir (71,72). Ayrıca klinik bir çalışmada deferipron (DFP; demir şelatörü) uygulamasının erken evre Parkinson hastalarında motor hareket semptomlarını azaltabildiği saptanmıştır (73). Tüm bu bulgular birlikte değerlendirildiğinde, ferroptozun Parkinson hastalığının patogenezinde önemli bir rol oynayabileceği ve özellikle erken-orta evre hastalarda terapötik bir hedef olarak değerlendirilebileceği düşünülmektedir. 3.4.Kanser Kanserin anlaşılmasında yıllar içerisinde önemli ilerlemeler kaydedilmiş olsa da günümüzde kanser hâlâ dünya genelinde insan ölümlerinin en önemli nedenlerinden biri olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, mevcut kanser tedavilerinin yüksek toksisite profili ve kanser hücrelerinin ilaçlara karşı geliştirdiği güçlü direnç mekanizmaları, araştırmacıları yeni tedavi stratejileri arayışına yöneltmektedir (74). Bu kapsamda ferroptoz kavramı, son yıllarda yapılan çalışmalarda hem kanser yanlısı hem de kanser karşıtı etkileriyle dikkat çekmektedir. Ferroptozun antikanser etkilerine yönelik yapılan çalışmalarda, bu hücre ölüm mekanizmasının çeşitli kanser türlerinde terapötik potansiyel taşıdığı gösterilmiştir. Meme kanseri (75), kolorektal kanser (76), hepatoselüler karsinom (77), over kanseri (78), pankreas kanseri (79) ve prostat kanseri (80) gibi pek çok tümör tipinde ferroptozun antitümör etkileri rapor edilmiştir. Küçük hücreli akciğer kanseri modelinde SLC7A11 inaktivasyonuyla indüklenen ferroptozun belirgin antikanser etkiler gösterdiği bildirilmiştir (81). Benzer şekilde, hepatoselüler karsinomda SLC7A11’in aşırı ekspresyonunun tümör dokularında daha agresif farklılaşma, yüksek nodül-metastaz derecesi ve kötü prognoz ile doğrudan ilişkili olduğu saptanmıştır (82). FERROPTOZ VE HASTALIKLARLA İLİŞKİSİ   91 Kanser–ferroptoz ilişkisini inceleyen birçok çalışmanın temel amacı, kanser hücresinin ferroptoza karşı geliştirdiği direnci anlamak ve bu direnci azaltarak ferroptotik hücre ölümünü indükleyip tümör progresyonunu engellemektir. Bu bağlamda yapılan bir çalışmada sisplatinin ferroptoza yol açabileceği gösterilmişken (83), başka bir çalışmada ise kanser dokularında GPX4 ekspresyonunun arttığı; GPX4’ün RSL3 ile inhibe edilmesi durumunda sisplatinin antikanser etkisinin belirgin şekilde güçlendiği ortaya konmuştur (84). Bununla birlikte, bazı araştırmalarda ferroptozun kanser gelişimini destekleyici özellikleri de vurgulanmıştır. Örneğin, pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC) fare modelinde yüksek demir içerikli diyetlerin veya GPX4’ün susturulmasının PDAC gelişimini hızlandırdığı gösterilmiştir (85). Ayrıca, tümör karşıtı CD8⁺ T lenfositlerinin tümör mikroçevresinde fonksiyon kayıpları araştırılırken, CD36 reseptörünün blokajı ile yağ asidi alımının engellenmesi veya ferroptoz inhibitörlerinin uygulanması sonucunda bu hücrelerin antitümör fonksiyonlarının önemli ölçüde geri kazanıldığı rapor edilmiştir (86). Tüm bu çalışma bulguları, ferroptozun kanser biyolojisinde çift yönlü bir role sahip olduğunu hem tümör baskılayıcı hem de bazı koşullarda tümör destekleyici etkiler gösterebileceğini ortaya koymaktadır. 4. Sonuç Oksidatif stresin hücre üzerindeki biyolojik etkileri uzun yıllardır detaylı biçimde araştırılmış olsa da ferroptoz kavramı bu alana yeni bir bakış açısı kazandırmıştır. Görece yeni bir kavram olması nedeniyle etkilerinin anlaşılması zaman alsa da günümüzde birçok hastalıkla ilişkili mekanizmaları giderek daha fazla ilgi çekmektedir. Yine de ferroptozun etkilerine ilişkin bazı mekanizmalar hâlâ tam olarak açıklığa kavuşmamıştır. Bugüne kadar yapılan çalışmaların büyük kısmını hayvan modelleri ve hücre kültürü deneyleri oluşturmaktadır. Ancak insan temelli araştırmaların artmasıyla birlikte, ferroptozun çeşitli hastalıkların tedavisinde önemi giderek artacaktır. Bununla birlikte, mevcut literatürde hâlâ bazı araştırma boşlukları bulunmaktadır. Bunlar arasında; ferroptozun diğer kontrollü hücre ölümü mekanizmalarıyla ilişkisi, ölüm sinyallerinin tetiklenme yollarının tam olarak aydınlatılamaması ve farklı hücre tiplerinde gözlenen ferroptoz direnci farklılıklarının nedenlerinin belirlenmesi gibi konular yer almaktadır. Bu eksikliklerin giderilmesi ve hücre türlerine özgü ferroptoz indükleyici veya 92   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I inhibitör mekanizmalarının netleştirilmesiyle birlikte, günümüzde yaygın görülen iskemi-reperfüzyon hasarı, kanser ve diyabet gibi hastalıkların tedavisinde önemli ilerlemeler kaydedileceği öngörülmektedir (87–89). Kaynakça 1. Berndt C, Alborzinia H, Amen VS, ve ark. Ferroptosis in health and disease. Redox Biol. 2024;75:103211. 2. Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, ve ark. Ferroptosis: An irondependent form of non-apoptotic cell death. Cell. 2012;149(5):1060. 3. Li J, Cao F, Yin H liang, ve ark. Ferroptosis: past, present and future. Cell Death Dis. 2020;11(2):88. 4. Dolma S, Lessnick SL, Hahn WC, Stockwell BR. Identification of genotype-selective antitumor agents using synthetic lethal chemical screening in engineered human tumor cells. Cancer Cell. 2003;3(3):285-296. 5. Foley JF. Selective Killing. Science’s STKE. 2007;2007(391). 6. Yang WS, Stockwell BR. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenicRAS-harboring cancer cells. Chem Biol. 2008;15(3):234-245. 7. Conrad M, Pratt DA. The chemical basis of ferroptosis. Nat Chem Biol. 2019;15(12):1137-1147. 8. Bannai S, Kitamura E. Transport interaction of L-cystine and L-glutamate in human diploid fibroblasts in culture. J Biol Chem. 1980;255(6):2372-2376. 9. Mandal PK, Seiler A, Perisic T, ve ark. System xc− and thioredoxin reductase 1 cooperatively rescue glutathione deficiency. J Biol Chem. 2010;285(29):22244-22253. 10. Dixon SJ, Patel DN, Welsch M, ve ark. Pharmacological inhibition of cystine–glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis. Elife. 2014;3. 11. Brigelius-Flohé R, Maiorino M. Glutathione peroxidases. Biochim Biophys Acta. 2013;1830(5):3289-3303. 12. Yant LJ, Ran Q, Rao L, ve ark. The selenoprotein GPX4 is essential for mouse development and protects from radiation and oxidative damage insults. Free Radic Biol Med. 2003;34(4):496-502. 13. Xie Y, Kang R, Klionsky DJ, Tang D. GPX4 in cell death, autophagy, and disease. Autophagy. 2023;19(10):2621-2638. 14. Liang H, Yoo SE, Na R, Walter CA, Richardson A, Ran Q. Short form glutathione peroxidase 4 is the essential isoform required for survival and somatic mitochondrial functions. J Biol Chem. 2009;284(45):30836-30844. FERROPTOZ VE HASTALIKLARLA İLİŞKİSİ   93 15. Anderson GJ, Wang F. Essential but toxic: controlling the flux of iron in the body. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2012;39(8):719-724. 16. Pantopoulos K, Porwal SK, Tartakoff A, Devireddy L. Mechanisms of mammalian iron homeostasis. Biochemistry. 2012;51(29):5705-5724. 17. Chen J, Wang Y, Wu J, Yang J, Li M, Chen Q. The potential value of targeting ferroptosis in early brain ınjury after acute CNS disease. Front Mol Neurosci. 2020;13:110. 18. Santana-Codina N, Gikandi A, Mancias JD. The role of NCOA4mediated ferritinophagy in ferroptosis. Adv Exp Med Biol. 2021;1301:41-57. 19. Gao M, Monian P, Pan Q, Zhang W, Xiang J, Jiang X. Ferroptosis is an autophagic cell death process. Cell Res. 2016;26(9):1021-1032. 20. Du Y, Guo Z. Correction: Recent progress in ferroptosis: inducers and inhibitors. Cell Death Discov. 2023;9(1):130. 21. Pignatello JJ, Oliveros E, MacKay A. Advanced oxidation processes for organic contaminant destruction based on the fenton reaction and related chemistry. Crit Rev Environ Sci Technol. 2006;36(1):1-84. 22. Shah R, Shchepinov MS, Pratt DA. Resolving the role of lipoxygenases in the initiation and execution of ferroptosis. ACS Cent Sci. 2018;4(3):387-396. 23. Mishima E, Conrad M. Nutritional and metabolic control of ferroptosis. Annu Rev Nutr. 2022;42:275-309. 24. Liang D, Minikes AM, Jiang X. Ferroptosis at the intersection of lipid metabolism and cellular signaling. Mol Cell. 2022;82(12):2215-2227. 25. Rochette L, Dogon G, Rigal E, Zeller M, Cottin Y, Vergely C. Lipid peroxidation and iron metabolism: Two corner stones in the homeostasis control of ferroptosis. Int J Mol Sci. 2022;24(1):449. 26. Catalá A, Díaz M. Editorial: Impact of lipid peroxidation on the physiology and pathophysiology of cell membranes. Front Physiol. 2016;7:423. 27. Kagan VE, Mao G, Qu F, ve ark. Oxidized arachidonic and adrenic PEs navigate cells to ferroptosis. Nat Chem Biol. 2017;13(1):81-90. 28. Küch EM, Vellaramkalayil R, Zhang I, ve ark. Differentially localized acyl-CoA synthetase 4 isoenzymes mediate the metabolic channeling of fatty acids towards phosphatidylinositol. Biochim Biophys Acta. 2014;1841(2):227239. 29. Hishikawa D, Shindou H, Kobayashi S, Nakanishi H, Taguchi R, Shimizu T. Discovery of a lysophospholipid acyltransferase family essential for membrane asymmetry and diversity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(8):2830-2835. 94   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 30. Dixon SJ, Winter GE, Musavi LS, ve ark. Human haploid cell genetics reveals roles for lipid metabolism genes in nonapoptotic cell death. ACS Chem Biol. 2015;10(7):1604-1609. 31. Hirata Y, Cai R, Volchuk A, ve ark. Lipid peroxidation increases membrane tension, Piezo1 gating, and cation permeability to execute ferroptosis. Curr Biol. 2023;33(7):1282-1294.e5. 32. Agmon E, Solon J, Bassereau P, Stockwell BR. Modeling the effects of lipid peroxidation during ferroptosis on membrane properties. Sci Rep. 2018;8(1):5155. 33. Kuhn H, Saam J, Eibach S, Holzhütter HG, Ivanov I, Walther M. Structural biology of mammalian lipoxygenases: enzymatic consequences of targeted alterations of the protein structure. Biochem Biophys Res Commun. 2005;338(1):93-101. 34. Yang WS, Kim KJ, Gaschler MM, Patel M, Shchepinov MS, Stockwell BR. Peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenases drives ferroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(34):E4966-E4975. 35. Walden R, Tomlinson B. Cardiovascular Disease. In: Benzie IFF, Wachtel-Galor S, eds. Herbal medicine: Biomolecular and clinical aspects. 2nd ed. Boca Raton (FL): CRC Press/Taylor & Francis; 2011. 36. Fratta Pasini AM, Stranieri C, Busti F, Di Leo EG, Girelli D, Cominacini L. New insights into the role of ferroptosis in cardiovascular diseases. Cells. 2023;12(6). 37. Liu G, Xie X, Liao W, ve ark. Ferroptosis in cardiovascular disease. Biomed Pharmacother. 2024;170:116057. 38. Jin JL, Zhang HW, Cao YX, ve ark. Association of small dense lowdensity lipoprotein with cardiovascular outcome in patients with coronary artery disease and diabetes: a prospective, observational cohort study. Cardiovasc Diabetol. 2020;19(1):45. 39. Sullivan JL. Iron in arterial plaque: modifiable risk factor for atherosclerosis. Biochim Biophys Acta. 2009;1790(7):718-723. 40. Guo Z, Ran Q, Roberts LJ, ve ark. Suppression of atherogenesis by overexpression of glutathione peroxidase-4 in apolipoprotein E-deficient mice. Free Radic Biol Med. 2008;44(3):343-352. 41. Bai T, Li M, Liu Y, Qiao Z, Wang Z. Inhibition of ferroptosis alleviates atherosclerosis through attenuating lipid peroxidation and endothelial dysfunction in mouse aortic endothelial cell. Free Radic Biol Med. 2020;160:92102. FERROPTOZ VE HASTALIKLARLA İLİŞKİSİ   95 42. Zhou Y, Zhou H, Hua L, ve ark. Verification of ferroptosis and pyroptosis and identification of PTGS2 as the hub gene in human coronary artery atherosclerosis. Free Radic Biol Med. 2021;171:55-68. 43. Cowled P, Fitridge R. Pathophysiology of reperfusion injury. In: Fitridge R, Thompson M, eds. mechanisms of vascular disease: a reference book for vascular specialists. adelaide (AU): University of Adelaide Press; 2011. 44. Farmer EE, Mueller MJ. ROS-mediated lipid peroxidation and RESactivated signaling. Annu Rev Plant Biol. 2013;64:429-450. 45. Scindia PhD Y, Leeds Md J, Swaminathan Md S. Iron homeostasis in healthy kidney and its role in acute kidney injury. Semin Nephrol. 2019;39(1):7684. 46. Tang LJ, Luo XJ, Tu H, ve ark. Ferroptosis occurs in phase of reperfusion but not ischemia in rat heart following ischemia or ischemia/reperfusion. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2021;394(2):401-410. 47. Feng Y, Madungwe NB, Imam Aliagan AD, Tombo N, Bopassa JC. Liproxstatin-1 protects the mouse myocardium against ischemia/reperfusion injury by decreasing VDAC1 levels and restoring GPX4 levels. Biochem Biophys Res Commun. 2019;520(3):606-611. 48. Fang X, Wang H, Han D, ve ark. Ferroptosis as a target for protection against cardiomyopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019;116(7):2672-2680. 49. Linkermann A, Skouta R, Himmerkus N, ve ark. Synchronized renal tubular cell death involves ferroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(47):16836-16841. 50. Yamada N, Karasawa T, Wakiya T, ve ark. Iron overload as a risk factor for hepatic ischemia-reperfusion injury in liver transplantation: Potential role of ferroptosis. Am J Transplant. 2020;20(6):1606-1618. 51. Erdoğan Kunter, Turgut Işıtmangil. Akut solunum sıkıntısı sendromu. Turk Gogus Kalp Damar Cerrahisi Derg. 2010;18(3):238-246. 52. Zhou H, Li F, Niu JY, ve ark. Ferroptosis was involved in the oleic acid-induced acute lung injury in mice. Sheng Li Xue Bao. 2019;71(5):689697. 53. Liu P, Feng Y, Li H, ve ark. Ferrostatin-1 alleviates lipopolysaccharideinduced acute lung injury via inhibiting ferroptosis. Cell Mol Biol Lett. 2020;25(1):10. 54. Singh D, Agusti A, Anzueto A, ve ark. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease: the GOLD science committee report 2019. Eur Respir J. 2019;53(5). 96   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 55. Wesselius LJ, Nelson ME, Skikne BS. Increased release of ferritin and iron by iron-loaded alveolar macrophages in cigarette smokers. Am J Respir Crit Care Med. 1994;150(3):690-695. 56. Ghio AJ, Hilborn ED, Stonehuerner JG, ve ark. Particulate matter in cigarette smoke alters iron homeostasis to produce a biological effect. Am J Respir Crit Care Med. 2008;178(11):1130-1138. 57. Yoshida M, Minagawa S, Araya J, ve ark. Involvement of cigarette smoke-induced epithelial cell ferroptosis in COPD pathogenesis. Nat Commun. 2019;10(1):3145. 58. Zhang Z, Fu C, Liu J, ve ark. Hypermethylation of the Nrf2 promoter induces ferroptosis by inhibiting the Nrf2-GPX4 axis in COPD. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2021;16:3347-3362. 59. Liu X, Ma Y, Luo L, ve ark. Dihydroquercetin suppresses cigarette smoke induced ferroptosis in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease by activating Nrf2-mediated pathway. Phytomedicine. 2022;96:153894. 60. Ward RJ, Zucca FA, Duyn JH, Crichton RR, Zecca L. The role of iron in brain ageing and neurodegenerative disorders. Lancet Neurol. 2014;13(10):1045-1060. 61. Scheltens P, De Strooper B, Kivipelto M, ve ark. Alzheimer’s disease. The Lancet. 2021;397(10284):1577-1590. 62. Ayton S, Wang Y, Diouf I, ve ark. Brain iron is associated with accelerated cognitive decline in people with Alzheimer pathology. Mol Psychiatry. 2020;25(11):2932-2941. 63. Hambright WS, Fonseca RS, Chen L, Na R, Ran Q. Ablation of ferroptosis regulator glutathione peroxidase 4 in forebrain neurons promotes cognitive impairment and neurodegeneration. Redox Biol. 2017;12:8-17. 64. Zhang C, Rodriguez C, Spaulding J, Aw TY, Feng J. Age-dependent and tissue-related glutathione redox status in a mouse model of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 2012;28(3):655-666. 65. Bao WD, Pang P, Zhou XT, ve ark. Loss of ferroportin induces memory impairment by promoting ferroptosis in Alzheimer’s disease. Cell Death Differ. 2021;28(5):1548-1562. 66. Zhang ZH, Wu QY, Chen C, ve ark. Comparison of the effects of selenomethionine and selenium-enriched yeast in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Food Funct. 2018;9(7):3965-3973. 67. Poewe W, Seppi K, Tanner CM, ve ark. Parkinson disease. Nat Rev Dis Primers. 2017;3:17013. NÖRODEJENERATİF HASTALIKLARDA MİTOKONDRİ TRANSFERİ . . .   103 6. Nörodejeneratif Hastalıklarda Mitokondri Transferinin Terapötik Potansiyeli Mitokondri transferi, nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde tek bir protein birikimini hedef alan geleneksel yaklaşımların aksine, hücresel metabolizmayı bir bütün olarak değerlendirmektedir (19). Mitokondri transferinin koruyucu etkilerinin temel mekanizması, hasarlı konak hücredeki mitokondriyal aktivitenin düzenlenmesi ve oksidatif stres ile inflamatuar yanıtın önemli ölçüde azaltılmasıdır (26). Transfer edilen sağlıklı mitokondriler, hasarlı hücredeki işlevsiz mitokondri havuzunu yenileyebilir. Ancak mitokondrilerin nöronlar tarafından tam olarak nasıl alındığı ve işlev gördüğü konularındaki belirsizlik devam etmektedir. Bu belirsizlik, klinik uygulamalar için kritik olan optimal dozajın, zamanlamanın ve etkinliğin uzun vadeli stabilitesinin belirlenmesini zorlaştırmaktadır (10). Preklinik veriler, mitokondri transferinin nöron hücrelerini koruma yeteneğini, büyük ölçüde oksidatif stresi ve nöroinflamasyonu azaltma kapasitesine borçlu olduğunu göstermektedir. Ancak, nörodejeneratif hastalıkların tedavisinin kronik ve uzun süreci göz önüne alındığında, kronik immün yanıt, doku uyumu, mitokondri transfer yollarının optimizasyonu, mitokondrinin canlılığını koruma hala çözülmesi gereken temel zorluklardır ve daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır (22). Mitokondriyal kusurları hedef alan çok sayıda klinik öncesi çalışma bulunmasına rağmen, insanlarda yapılan klinik çalışmalar hâlâ yetersizdir ve büyük bir potansiyel taşımaktadır (10). 7. Sonuç Mitokondri transferi, nörodejeneratif hastalıklardaki enerji krizini doğrudan ele alan, potansiyel olarak çığır açıcı bir terapötik seçenektir. Preklinik AH ve PH modellerinden elde edilen kanıtlar, mitokondri transferinin hücrenin enerji ihtiyacını karşılayarak, oksidatif stresi azaltarak ve nöroinflamasyonu modüle ederek nöron korumasını sağladığını göstermektedir. Gelecekteki araştırmaların, kan-beyin bariyerini aşan hedefli mitokondri transfer yöntemlerinin verimliliğini artırmaya ve uzun vadeli güvenliğe odaklanması gerekmektedir. Referanslar 1. Kühlbrandt W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biol. 2015;13:89. 2. Liao J, He W, Li L, Wang J, Gong L, Zhang Q, Lin Z. Mitochondria in brain diseases: Bridging structural-mechanistic insights into precision-targeted therapies. Cell Biomater. 2025. 104   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 3. Liu D, Gao Y, Liu J, et al. Intercellular mitochondrial transfer as a means of tissue revitalization. Signal Transduct Target Ther. 2021;6(1):65. 4. Rogers RS, Bhattacharya J. When cells become organelle donors. Physiology (Bethesda). 2013;28(6):414-422. 5. Reinhardt K, Dowling DK, Morrow EH. Mitochondrial replacement, evolution, and the clinic. Science. 2013;341(6152):1345-1346. 6. Taylor RW, Turnbull DM. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 2005;6(5):389-402. 7. Liu H, Mao H, Ouyang X, Lu R, Li L. Intercellular mitochondrial transfer: The novel therapeutic mechanism for diseases. Traffic. 2024;25(9):e12951. 8. Yang L, Wei X, Liao Z, Chen B, Zeng G, Mei Z. Role of mitochondria transmission in ischemic stroke: Friend or foe? Redox Biol. Published online September 20, 2025. doi:10.1016/j.redox.2025.103868 9. Liu Y, Dissanayaka WL, Yiu C. Therapeutic implications of mitochondrial transfer on stem cell fate in regenerative medicine. J Transl Med. 2025;23(1):568. 10. Zong Y, Li H, Liao P, et al. Mitochondrial dysfunction: Mechanisms and advances in therapy. Signal Transduct Target Ther. 2024;9:124. 11. Eo H, Yu SH, Choi Y, et al. Mitochondrial transplantation exhibits neuroprotective effects and improves behavioral deficits in an animal model of Parkinson’s disease. Neurotherapeutics. 2024;21(4):e00355. 12. Yang C, Endoh M, Tan DQ, et al. Mitochondria transfer from early stages of erythroblasts to their macrophage niche via tunnelling nanotubes. Br J Haematol. 2021;193(6):1260-1274. 13. Chen R, Chen J. Mitochondrial transfer: A novel promising approach for the treatment of metabolic diseases. Front Endocrinol (Lausanne). 2024;14:1346441. 14. Brestoff JR, Singh KK, Aquilano K, et al. Recommendations for mitochondria transfer and transplantation nomenclature and characterization. Nat Metab. 2025;7:53-67. 15. Baldwin JG, Heuser-Loy C, Saha T, et al. Intercellular nanotubemediated mitochondrial transfer enhances T cell metabolic fitness and antitumor efficacy. Cell. 2024;187(23):6614-6630.e21. 16. Li B, Li B, Qiao X, Meng W, Xie Y, Gong J, Fan Y, Zhao Z, Li L. Targeting mitochondrial transfer as a promising therapeutic strategy. Trends Mol Med. 2025. 17. Zhou X, Liu S, Lu Y, Wan M, Cheng J, Liu J. MitoEVs: A new player in multiple disease pathology and treatment. J Extracell Vesicles. 2023;12(4):12320. NÖRODEJENERATİF HASTALIKLARDA MİTOKONDRİ TRANSFERİ . . .   105 18. Borcherding N, Brestoff JR. The power and potential of mitochondria transfer. Nature. 2023;623:283-291. 19. Di Carlo M, Giacomazza D, Picone P, Nuzzo D, San Biagio PL. Are oxidative stress and mitochondrial dysfunction the key players in neurodegenerative diseases? Free Radic Res. 2012;46(11):1327-1338. 20. Espino De la Fuente-Muñoz C, Arias C. The therapeutic potential of mitochondrial transplantation for the treatment of neurodegenerative disorders. Rev Neurosci. 2021;32(2):203-217. 21. Clemente-Suárez VJ, Martín-Rodríguez A, Yáñez-Sepúlveda R, Tornero-Aguilera JF. Mitochondrial transfer as a novel therapeutic approach in disease diagnosis and treatment. Int J Mol Sci. 2023;24(10):8848. 22. Klemmensen MM, Borrowman SH, Pearce C, Pyles B, Chandra B. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative disorders. Neurotherapeutics. 2024;21(1):e00292. 23. Tábara LC, Segawa M, Prudent J. Molecular mechanisms of mitochondrial dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26(2):123-146. 24. Macheiner T, Fengler VH, Agreiter M, et al. Magnetomitotransfer: An efficient way for direct mitochondria transfer into cultured human cells. Sci Rep. 2016;6:35571. 25. Smijin KS, Woodruff MRJ, Dagda RK. The mitochondrial foundations of Parkinson’s disease: Therapeutic implications. Aging Dis. 2025;16(5):26952720. 26. Alqahtani T, Deore SL, Kide AA, et al. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Huntington’s disease, and amyotrophic lateral sclerosis: An updated review. Mitochondrion. 2023;71:83-92. 107 BÖLÜM VIII NÖROLOJİK HASTALIKLARIN TEDAVİSİNDE CRISPR-CAS9 UYGULAMALARI VE TERAPOTİK POTANSİYELLERİ CRISPR-Cas9ApplicationsandTherapeuticPotentialsinthe TreatmentofNeurologicalDisorders Sevcan MERCAN (Asst. Prof. Dr.), Kafkas University, Faculty of Medicine, Department of Medical Genetics E-mail: sevcanmer[email protected] ORCID: 0000-0003-1500-6854 1. Giriş İnsan genetiği alanında bugüne kadar yapılan en büyük iki buluştan biri hiç şüphesiz insan genom haritasının 2000’li yılların başında ortaya çıkarılması iken (1), bir diğeri ise 2020 yılında Emmanuelle Charpentier ve Jennifer Doudna adlı bilim insanlarına 2020 Nobel Kimya ödülünü getiren CRISPRCas9 tekniğinin keşfedilmesi olmuştur (2). Her ne kadar bilim dünyasında insan genomundaki gen sayısının beklenenden daha düşük keşfi (yaklaşık kabul edilen 20.000 gen) hayal kırıklığı yaratmış olsa da, diğer yandan insan genomunun haritalanabilmesi tıp dünyası için çığır açıcı bilgilere ulaşmayı sağlamıştır (3). Yapılan çalışmalar açıkça göstermektedir ki; son derece prestijli bir ödüle layık görülen CRISPR teknolojisinin keşfi bu tekniğin günden güne bilim dünyasında genetik hastalıkların tedavisi için umut vaat eden sonuçları ortaya çıkarmaktadır (4-7). Bu bağlamda; insan genomunda erken nesil gen düzenleme araçları olarak bilinen TALENs (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) ve ZFNs (Zinc Finger Nucleases)’ ler ile yapılan genetik modifikasyonlar yerini daha güncel gen düzenleme teknolojisi olan CRISPR’a bırakabilir (4). Orak hücreli 108   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I anemi, hücre bazlı gen tedavi ilacı ‘Casgevy’ için 2023 yılında CRISPR temelli ilk FDA onayı alan genetik hastalıktır (5). Günümüzde artan bir ivmeyle, kalıtsal transtiretin amiloidozu (hATTR), kalıtsal anjiyoödem (HAE), kronik idrar yolu enfeksiyonları, çeşitli kanser türleri (özellikle CRISPR ile modifiye edilmiş immünoterapiler), yüksek kolesterol ve kardiyovasküler hastalıklar (örneğin PCSK9 hedefli), HIV enfeksiyonu, tip 1 diyabet, otoimmün hastalıklar (örneğin sistemik lupus eritematozus) ve kalıtsal görme bozukluklarının (örneğin Leber konjenital amaurozu) CRISPR-temelli terapötikler ile tedavisi için yoğun klinik araştırmalar sürdürülmektedir (5-7). 2. CRISPR-Cas9 Tekniği CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) arke ve bakterilerde tanımlanmış olup, Cas (CRISPR-associated; CRISPRilişkili) proteinlerin varlığında virüs enfeksiyonlarına karşı geliştirilmiş doğal bir savunmadır (4). Bu Cas proteinlerinden genetik düzenlemelerde sıkça kullanılan Cas9 endonükleaz enzimidir. Bu enzim CRISPR varlığında rehber RNA (gRNA) adı verilen kısa bir RNA eşliğinde (20-25baz), PAM (Protospacer Adjacent Motif) dizisi bulunduran hedef DNA dizisini tanır ve bu diziye özgül olarak DNA’da kesikler oluşturur (4). Ardından, DNA tamir mekanizmalarından Non-Homologous End Joining (NHEJ) (Homolog Olmayan Uç Birleştirme) veya Homology Directed Repair (HDR) (Homolog Yönlendirmeli Onarım) devreye girer ve DNA dizisinde baz eklenmeleri, baz silinmeleri veya baz değişimleri gibi çeşitli genetik değişikliklerin yapılmasını sağlar (8) (Şekil-1). CRISPR-Cas9 teknolojisi, yalnızca genetik hastalıklar ve kanser tedavisinde değil, zirai alanda verimli ve hastalıklardan ari bitki gelişimi için de uygulanmaktadır (9). Ancak, burada odak noktamız tümüyle; Nobelli bir tekniğin özellikle nörolojik hastalıkların tedavisi için bugüne kadar gerçekleştirilmiş olan pre-klinik ve klinik uygulamaları üzerine olacaktır. NÖROLOJİK HASTALIKLARIN TEDAVİSİNDE CRISPR-CAS9 . . .   109 Şekil 1: Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homoloji yönlendirmeli onarım (HDR) mekanizmaları varlığında CRISPR/Cas9 Temelli Genom Düzenlenmesi Kaynakça (8): Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. (2021). Approaches to enhance precise CRISPR/Cas9-mediated genome editing. International Journal of Molecular Sciences, 22(16), 8571. https://doi.org/10.3390/ijms22168571 3. Nörolojik Hastalıklar Nörolojik hastalıklar prenatal, çocukluk, erken veya geç erişkinlik dönemlerinde başlayan ve son derece heterojen klinik bulgularla seyreden genetik bozukluklardır (10-40). Başlıca bulguları arasında denge kaybı, kas zayıflıkları, motor beceri kaybı, nöbet, epilepsi, konuşma bozuklukları, zeka geriliği gibi çeşitli bulgular yer alabilir (10-40). Günümüzde halen gelişmeye devam eden yeni nesil dizileme teknolojileri sayesinde ortaya çıkarılabilen patojen mutasyonlarla hastalıkların kesin tanısı mümkün olabilmektedir. Sadece bireyi değil, aileyi, sağlık sektörünü ve toplumu psikolojik ve ekonomik yönden etkileyen genetik temelli bu hastalık gruplarının kesin bir tedavi şekli yoktur. 110   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Nörolojik hastalıklar, son yıllarda bazı alt tiplerine uygulanabilen genetik tedavi olasılığı açısından dikkat çeken Spinal Musküler Atrofi (SMA) hastalığı başta olmak üzere Alzhimer hastalığından ve Metakromatik Lökodistrofi hastalığına kadar oldukça geniş bir sınıflandırma yelpazesine sahiptir (14,24,39). Nörogelişimsel bozukluklar (Tablo-1) (10-23), nörodejeneratif hastalıklar (Tablo-2) (24-35) ve metabolik nörolojik hastalıklar (Tablo-3) (36-40) bilinen sorumlu genleri ve başlıca bulguları açısından Tablo 1, 2 ve 3’te özetlenmiştir (10-40). Nörolojik hastalıklarda semptomların yönetimine odaklı tedaviler yerini; son yıllarda gelişmeye devaam eden CRISPR teknolojisi ve sayesinde bugüne kadar uygulanması son derece zor olan ancak bu teknoloji sayesinde uygulanabilir hale gelen yeni nesil gen tedavi yöntemlerine bırakabilecek durumdadır (41). Orak hücreli anemi FDA onaylı ilk CRISPR terapotiğe sahip genetik hastalık iken nörolojik hastalıklar için henüz tedavide uygulanabilecek CRISPR terapileri klinik araştırma ve keşif çalışmaları aşamasındadır (5,41). NÖROLOJİK HASTALIKLARIN TEDAVİSİNDE CRISPR-CAS9 . . .   111 Tablo 1: Nörogelişimsel Bozukluklar Nörogelişimsel Bozukluklar Hastalık / Sendrom İlgili Genler Klinik Özellikler Kaynakça (10-23) Fragile X Sendromu FMR1 Zihinsel yetmezlik, otizm spektrum bozukluğu Hagerman ve ark., 2016 Rett Sendromu MECP2 Gelişim geriliği, epilepsi, davranış bozuklukları Neul ve ark., 2019 Angelman Sendromu UBE3A Zihinsel gerilik, nöbetler, denge sorunları Williams ve ark., 2006 Prader-Willi Sendromu 15q11-q13 Hipotonik, hiperfaji, davranış sorunları Cassidy ve ark., 2012 Spinal Musküler Atrofi (SMA) SMN1 Motor nöron kaybı, kas güçsüzlüğü Mercuri & Finkel, 2017 SCN2A İlişkili Epilepsi ve Otizm SCN2A Epilepsi, otizm, gelişimsel gerilik Sanders ve ark., 2018 Tüberoskleroz TSC1, TSC2 Epilepsi, nörogelişimsel gerilik, tümör benzeri oluşumlar Curatolo ve ark., 2015 Smith-Magenis Sendromu RAI1 Zihinsel gerilik, uyku bozuklukları, davranış sorunları Elsea & Girirajan, 2008 Zihinsel Gerilik (ID) FMR1, MECP2, UBE3A, vs. Geniş genetik heterojenite, öğrenme ve adaptasyon güçlüğü Batshaw & Roach, 2019 Mikrosefali MCPH1, ASPM, WDR62 Küçük beyin hacmi, ciddi zihinsel gerilik Thornton & Woods, 2009 Makrosefali PTEN, AKT3, MTOR Anormal beyin büyümesi, gelişimsel bozukluklar Williams ve ark., 2006 Lissensefali DCX, LIS1 Az sayıda girus, epilepsi, zihinsel gerilik Poduri & Walsh, 2011 Pachygyria LIS1, DCX, RELN Geniş girus, epilepsi, nörogelişimsel bozukluklar Poduri & Walsh, 2011 Holoprozensefali SHH, ZIC2 Beyin yarım kürelerinin birleşmemesi, ciddi gelişimsel bozukluk TekendoNgongang ve ark., 2017 Agenesis Korpus Kallosum Çeşitli (örn., L1CAM, ZIC2, ARX ve diğerleri) Korpus kallosum yokluğu, nörogelişimsel gerilik Paul ve ark., 2007 112   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Tablo 2: Nörodejeneratif Hastalıklar Nörodejeneratif Hastalıklar Hastalık / Sendrom İlgili Genler Klinik Özellikler Kaynakça (24-35) Alzheimer Hastalığı APP, PSEN1, PSEN2, APOE İlerleyici demans, hafıza ve bilişsel işlev kaybı Scheltens ve ark., 2021 Huntington Hastalığı HTT Koreatik hareketler, davranış değişiklikleri Ross & Tabrizi, 2011 Spinocerebellar Ataksiler (SCA) SCA1, SCA2, SCA3, vb. Koordinasyon ve denge sorunları Seidel ve ark., 2012 Parkinson Hastalığı (Genetik Tipleri) PARK2, LRRK2, PINK1 Tremor, yavaş hareket, postural instabilite Kalia & Lang, 2015 NBIA (Beyin Demir Birikimi Hastalıkları) PANK2, PLA2G6, C19orf12 Demir birikimi, hareket bozuklukları, nörolojik gerileme Kruer, 2013 Wilson Hastalığı ATP7B Karaciğer ve nörolojik bulgular Roberts & Schilsky, 2008 Menkes Hastalığı ATP7A Bakır metabolizması bozukluğu, gelişimsel gerilik Kaler, 2011 Friedreich Ataksisi FXN Ataksi, kardiyomiyopati, kas güçsüzlüğü Delatycki & Corben, 2012 Batten Hastalığı (NCL) CLN genleri Lizozomal depolama, nörodejenerasyon Mole ve ark., 2011 Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) SOD1, C9orf72, TARDBP Motor nöron hastalığı, kas güçsüzlüğü Brown & Al-Chalabi, 2017 Ataksi-Telanjiektazi ATM Koordinasyon kaybı, bağışıklık bozukluğu Gatti ve ark., 2018 Lafora Hastalığı EPM2A, EPM2B İlerlemiş epilepsi, nörodejenerasyon Turnbull & Tarpey, 2017 NÖROLOJİK HASTALIKLARIN TEDAVİSİNDE CRISPR-CAS9 . . .   119 41. Jiang, H., Tang, M., Xu, Z., Wang, Y., Li, M., Zheng, S., Zhu, J., Lin, Z., Zhang, M. (2024). CRISPR/Cas9 system and its applications in nervous system diseases. Genes & Diseases, 11(2), 675–686. https://doi.org/10.1016/j. gendis.2023.03.017 42. Huang, Y.-W. A., Zhou, B., Wernig, M., Südhof, T. C. (2019). Neuronal apolipoprotein E4 increases cell death and phosphorylated tau release in Alzheimer disease. Neuron, 101(6), 1140–1153.e4. https://doi.org/10.1016/j. neuron.2019.02.036 43. Zhang, K., Donnelly, C. J., Haeusler, A. R., Grima, J. C., Machamer, J. B., Steinwald, ve ark. (2022). CRISPR/Cas9-mediated excision of ALS/FTDcausing hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 rescues major disease mechanisms in vivo and in vitro. Nature Communications, 13, Article 6284. https://doi.org/10.1038/s41467-022-34268-w 44. Mohrin, M., Shin, J. Y., Liu, Y., Brown, K., Luo, Y., Ji, Y., ve ark. (2020). Correction of amyotrophic lateral sclerosis related phenotypes in iPSC-derived motor neurons carrying a hexanucleotide expansion mutation in C9orf72 by CRISPR/Cas9 genome editing using homology-directed repair. Molecular Therapy – Nucleic Acids, 21, 890–902. https://doi.org/10.1016/j. omtn.2020.06.017 45. Yang, S., Chang, R., Yang, H., Zhao, T., Hong, Y., Kong, H. E., ve ark. (2017). CRISPR/Cas9-mediated gene editing ameliorates neurotoxicity in mouse model of Huntington’s disease. The Journal of Clinical Investigation, 127(7), 2719–2724. https://doi.org/10.1172/JCI92087 46. Monteys, A. M., Ebanks, S. A., Keiser, M. S., Davidson, B. L. (2019). CRISPR/Cas9 editing of the mutant huntingtin allele in vitro and in vivo. Molecular Therapy, 27(4), 694–704. https://doi.org/10.1016/j. ymthe.2020.07.015 47. Pavel-Dinu, M., Dejene, B. T., Wallen, T. J., Chiou, B., Voit, R. A., Mitchell, A. J., ve ark. (2022). A mutation-agnostic hematopoietic stem cell gene therapy for metachromatic leukodystrophy. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development, 24, 380–394. https://doi.org/10.1016/j. omtm.2021.11.007 48. Langbehn D.R., Brinkman R.R., Falush D., Paulsen J.S., Hayden M.R. A new model for prediction of the age of onset and penetrance for Huntington’s disease based on CAG length. Clin. Genet. 2004;65:267–277. doi: 10.1111/j.1399-0004.2004.00241.x. 120   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 49. Kolli N, Lu M, Maiti P, Rossignol J, Dunbar GL. CRISPR-Cas9 Mediated Gene-Silencing of the Mutant Huntingtin Gene in an In Vitro Model of Huntington’s Disease. Int J Mol Sci. 2017 Apr 2;18(4):754. doi: 10.3390/ ijms18040754. PMID: 28368337; PMCID: PMC5412339. 50. Seo JH, Shin JH, Lee J, Kim D, Hwang HY, Nam BG, ve ark. DNA double-strand break-free CRISPR interference delays Huntington’s disease progression in mice. Commun Biol. 2023 Apr 28;6(1):466. doi: 10.1038/ s42003-023-04829-8. PMID: 37117485; PMCID: PMC10147674. 51. Nijs M, Van Damme P. The genetics of amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 2024 Oct 1;37(5):560-569. doi: 10.1097/ WCO.0000000000001294. Epub 2024 Aug 22. PMID: 38967083; PMCID: PMC11377058. 52. Gaj T, Ojala DS, Ekman FK, Byrne LC, Limsirichai P, Schaffer DV. In vivo genome editing improves motor function and extends survival in a mouse model of ALS. Sci Adv. 2017 Dec 20;3(12):eaar3952. doi: 10.1126/sciadv. aar3952. PMID: 29279867; PMCID: PMC5738228. 53. Wang L, Yi F, Fu L, Yang J, Wang S, Wang Z, ve ark. CRISPR/Cas9mediated targeted gene correction in amyotrophic lateral sclerosis patient iPSCs. Protein Cell. 2017 May;8(5):365-378. doi: 10.1007/s13238-017-0397-3. 54. Sadleir KR, Popovic J, Vassar R. ER stress is not elevated in the 5XFAD mouse model of Alzheimer’s disease. J Biol Chem. 2018 Nov 30;293(48):1843418443. doi: 10.1074/jbc.RA118.005769. 55. European Medicines Agency. (2020, October 16). New gene therapy to treat rare genetic disorder metachromatic leukodystrophy. https:// www.ema.europa.eu/en/news/new-gene-therapy-treat-rare-genetic-disordermetachromatic-leukodystrophy (Erişim Tarihi:16.10.2025). 56. Antony JS, Daniel-Moreno A, Lamsfus-Calle A, Raju J, Kaftancioglu M, Ureña-Bailén G, ve ark. (2022). A Mutation-Agnostic Hematopoietic Stem Cell Gene Therapy for Metachromatic Leukodystrophy. CRISPR J. 2022 Feb;5(1):66-79. doi: 10.1089/crispr.2021.0075. Epub 2021 Dec 8. PMID: 34882002. 57. Ning, H., Wu, Y. (2024). The application of CRISPR/Cas9 technology in neurological diseases. Highlights in Science, Engineering and Technology, 91, 299–303. https://doi.org/10.54097/m3mqzp05. 121 BÖLÜM IX EPİLEPSİ ETİYOLOJİSİNDE VE FARMAKOGENETİĞİNDE HLA GENLERİNİN KLİNİK ÖNEMİ ClinicalSignificanceofHLAGenesintheEtiologyand PharmacogeneticsofEpilepsy KÜBRA ÇİĞDEM PEKKOÇ UYANIK1 1(Dr. Öğr. Üyesi), Haliç Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı E-mail: [email protected] ORCID: 0000-0002-1056-960X 1. Giriş Epilepsi, beyin nöronlarının anormal ve senkronize elektriksel deşarjları sonucu ortaya çıkan, yineleyici nöbetlerle seyreden kronik bir nörolojik hastalıktır. Klinik olarak bilinç değişiklikleri, motor veya duyusal belirtiler ve davranışsal bozukluklarla karakterizedir (1). Günümüzde epilepsi yalnızca nörolojik bir bozukluk olarak değil, aynı zamanda genetik yatkınlık ve immünolojik mekanizmaların etkileşimiyle şekillenen multifaktöriyel bir hastalık olarak değerlendirilmektedir (2, 3). Genetik varyasyonlar; iyon kanalları, nörotransmitter reseptörleri ve sinaptik iletimde görevli proteinleri etkileyerek nöbet eşiğini düşürebilmekte, ayrıca immün sistemdeki düzensizlikler nöroinflamasyonu tetikleyerek epileptogenez sürecine katkıda bulunabilmektedir (4). İnsan Lökosit Antijenleri (Human Leukocyte Antigen, HLA), bağışıklık sisteminin temel düzenleyici unsurlarından biri olarak Majör Histouyumluluk Kompleksi (Major Histocompatibility Complex, MHC) gen bölgesinde bulunur. HLA molekülleri, antijen sunumu yoluyla bağışıklık yanıtının başlatılmasında merkezi bir rol oynar. Hücre yüzeyinde yer alan bu glikoproteinler, kendine ve yabancıya ait antijenik peptidleri T lenfositlere sunarak, immün sistemin özgül tanıma ve tolerans mekanizmalarının düzenlenmesini sağlar (5-7). 122   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I Son yıllarda yapılan çalışmalar, nöroinflamasyonun epileptogenezde anahtar rol oynadığını göstermektedir (4). Epileptik odaklarda proinflamatuvar sitokinlerin (IL-1β, TNF-α, IL-6) artışı, mikroglia aktivasyonu ve T hücre infiltrasyonu gözlemlenmiştir (8). HLA moleküllerinin bu süreçlerde immün hücreler ile nöron/glia etkileşiminde aracılık edebileceği düşünülmektedir. Bu nedenle HLA gen varyantları yalnızca sistemik immün yanıtı değil, santral sinir sistemi (SSS) immün yanıtını da etkileyerek epileptik nöbetlerin oluşumuna katkıda bulunabilir. Dirençli epilepsilerden temporal lob epilepsisinde, HLA sınıf I polimorfizmlerinin daha sık görüldüğü rapor edilmiştir (9, 10). Bu bulgular, epilepsi yönetiminde HLA genotiplemenin yalnızca farmakogenetik değil, aynı zamanda patogenez temelli tanı ve tedavi yaklaşımlarında da kullanılabileceğini düşündürmektedir. Yapılan çalışmalarda dirençli epileptik atakların görüldüğü, anti-LGI1 ensefaliti ve Rasmussen ensefaliti gibi immün aracılı hastalıkların ve bazı antiepileptik ilaçlara bağlı istenmeyen ilaç yan etkilerinin HLA genleri ile ilişkili olduğu görülmüştür (11, 12). HLA genleri, adaptif immün yanıtın düzenlenmesinde kritik görevler üstlenir ve yüksek düzeyde polimorfizmleri sayesinde bireyler arası farklı immün yanıtların temelini oluşturur. Bu nedenle, HLA gen varyantlarının epilepsi etiyolojisi, nöroinflamasyon ve farmakogenetik açısından değerlendirilmesi hem hastalık mekanizmalarının anlaşılması hem de kişiselleştirilmiş tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesi açısından büyük önem taşımaktadır. 2. HLA Genlerinin Temel Özellikleri 2.1.HLAGenleri Anthony Nolan Araştırma Enstitüsü’nün HLA Bilişim grubu 1998 yılında IMGT/HLA Veritabanı’nı yayınladı (13). Bu çevrimiçi kaynak, Dünya Sağlık Örgütü HLA Sistemi Faktörleri Adlandırma Komitesi (The WHO Nomenclature Committee for Factors of the HLA System) tarafından adlandırılan çok sayıda HLA allel varyant dizisinin deposu olarak işlev gören bir veritabanıdır. Adlandırma komitesi, MHC’de bulunan HLA genlerini ve allelik varyantlarını adlandırmaktan sorumludur (14). IPD-IMGT/HLA Veritabanında (15) yer alan genler, insan MHC ve genişletilmiş MHC bölgesinde yer alır. MHC, omurgalı genomunda bağışıklık sisteminin temel bileşenlerini kodlayan bir bölgedir ve insanlarda HLA olarak bilinen çeşitli antijen sunan molekülleri kodlayan oldukça polimorfik genleri EPİLEPSİ ETİYOLOJİSİNDE VE FARMAKOGENETİĞİNDE HLA GENLERİNİN . . .   123 içerir. İlk kez lökositlerde gösterilmiş olmalarından dolayı HLA olarak adlandırılan antijenlerin oluşması, organizmada MHC adı verilen bir gen bölgesinin kontrolü altındadır. Bu moleküller, enfekte edici patojenlerden türetilen peptitlere bağlanma ve bunları bağışıklık sistemi hücrelerine sunma işlevi görür. HLA genleri yapı ve organizasyon açısından stabildir ve daha da önemlisi, ifadede eş baskındır. İnsan MHC bölgesi, 6. kromozom p21.3’ün kısa kolunda yer alır ve yaklaşık 4 milyon baz uzunluğundadır (16). Bu bölgedeki HLA genlerinin oldukça değişken olduğu bilinmektedir. MHC bölgesi, insan genomunun en polimorfik bölgesidir ve polimorfik olmaktan ziyade “hiperpolimorfik” olarak tanımlanmıştır (17). HLA genlerindeki varyantların özelliklerinin belirlenmesi, birçok temel faktör tarafından etkilenir. Bu hiperpolimorfik genlerin varyantlarını toplamak ve sınıflandırmak zor olmasına rağmen, HLA’nın klinik nakillerde kullanılması, bu dizilerin sürekli olarak analiz edilmesini ve tanımlanmasını zorunlu kılmıştır. 2.2.HLAGenlerininGenetikOrganizasyonu Güncel verilere göre toplamda 42.996 HLA alleli tanımlanmıştır. HLA sınıf I genleri arasında HLA-B en polimorfik gen olarak öne çıkmakta olup, 10.680 allele sahiptir. Bunu HLA-A ve HLA-C izlemekte olup, sırasıyla 8.949 ve 8.944 allel sayısına sahiptir. HLA-E, HLA-F ve HLA-G ise daha az sayıda allel taşımaktadır. HLA sınıf I’de bazı alleller “işlevsiz allel” olarak sınıflandırılmıştır; yani protein üretmezler ve bazı genler pseudogenler olarak protein üretmez. HLA sınıf II genleri arasında en polimorfik gen DRB1’dir ve 3.892 allel ile 2.523 farklı protein üretmektedir. Diğer DRB alt grupları (DRB3, DRB4, DRB5) daha az polimorfiktir ve bazı alleller protein üretmez. Ayrıca DQA, DQB, D PA ve DPB genleri de sınıf II’nin önemli bileşenlerini oluşturur ve geniş allel çeşitliliğine sahiptir. Sınıf II’de de işlevsiz alleller ve protein üretmeyen alleller gözlenmektedir. Genel olarak HLA sistemi, yüksek allel ve protein çeşitliliği sayesinde bağışıklık yanıtını esnek ve etkili bir şekilde yönlendirebilmektedir (15). Üç ana gruba ayrılan MHC gen bölgesinde, MHC Sınıf-I (HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G), MHC Sınıf-II (HLA-DR, -DP, -DQ, -DO, -DN) ve MHC Sınıf-III (C2, C4A, C4B, PF, TNFa, b) antijenleri yer almaktadır. MHC gen bölgesinin her lokusunda her biri farklı HLA antijenlerinden sorumlu allel genler bulunur. HLA allelleri ve ürünleri HLA antijeni olarak ifade edilirler. HLA antijenleri mobildirler. Sınıf I genlerinden olan HLA-A, -B ve -C, tüm çekirdekli hücrelerde eksprese edilir. Endojen peptidleri sitotoksik T lenfositlere (CD8+ T hücrelerine) 124   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I sunar. Sınıf II genleri olan HLA-DR, -DQ ve -DP, profesyonel antijen sunucu hücrelerde eksprese edilir. Ekzojen peptidleri yardımcı T hücrelerine (CD4+ T hücrelerine) sunar. Sınıf III bölgesi, kompleman sistemine ait proteinler ile TNF-α gibi immün yanıtın düzenlenmesinde rol oynayan genleri barındırır. Bu sistemin genetik çeşitliliği, bireyler arasında antijen tanıma kapasitesinde büyük farklılıklara yol açar ve bu farklılık, otoimmün hastalıklar, enfeksiyonlara duyarlılık, ilaç hipersensitivitesi ve nöroinflamatuvar süreçler gibi birçok immünopatolojik durumda belirleyici rol oynar (18). 2.3.HLAGenleriVaryasyonlarınınFonksiyonelÖnemi Oldukça polimorfik olan HLA genlerindeki bu çeşitlilik, bireylerin farklı patojenlere karşı immün yanıt kapasitesini artırırken, aynı zamanda otoimmünite ve ilaç hipersensitivitesi riskine de katkıda bulunabilir. Örneğin, bazı HLA allelleri belirli otoimmün hastalıklarla güçlü ilişkilere sahiptir. HLA-B27 ile ankilozan spondilit, HLA-DRB115:01 ile multipl skleroz ve HLA-DRB1*03 ile otoimmün hepatit arasında ilişki vardır (19-21). Benzer şekilde, epilepside de HLA genlerinin hem immün aracılı patogenezde hem de ilaç reaksiyonlarında kritik rol oynadığı gösterilmiştir. Epilepsi tedavisinde kullanılan antiepileptik ilaçlara (AED) bağlı immün aracılı yan etkiler, HLA genleri ile güçlü bir genetik ilişkiye sahiptir (22-24). 3. HLA Gen Varyantlarının Epilepsi Etiyolojisindeki Rolü Epilepsi vakalarının %70-80’inin genetik bir nedene bağlı olduğu tespit edildiğinden, artık hedefli gen panelleri, tüm ekzom dizilemesi (Whole Exome Sequencing, WES) ve tüm genom dizilemesi (Whole Genome Sequencing, WGS) gibi yeni nesil dizileme (Next-Generation Sequencing, NGS) gibi dizileme teknikleri kullanılarak analiz edilebilen epilepsi sendromlarıyla ilişkili olduğu belirlenen yüzlerce gen bulunmaktadır (25). Kapsamlı bir tanı değerlendirmesinden sonra bile, hastaların büyük bir kısmında etiyolojisi bilinmeyen epilepsi vardır (26). Bununla birlikte, başlangıçta etiyolojisi bilinmeyen seçilmiş hastaların %4 ila %78’inde muhtemel veya kesin etiyolojik öneme sahip genetik varyantlar bulunur (27). Epilepsi genlerinin tanımlanması, etkilenen bireylerdeki patojenik varyantların analiziyle ortaya koyulmuştur. Şu anda, OMIM gibi veritabanları yaklaşık 177 epilepsi geni listelemekte olup ticari test panelleri daha fazla geni kapsamaktadırlar (24). Bu genlerin fenotipik çeşitliliği ve pleiotropisi, EPİLEPSİ ETİYOLOJİSİNDE VE FARMAKOGENETİĞİNDE HLA GENLERİNİN . . .   125 belirli epilepsi genleri grubunun tanımlanmasını zorlaştırmaktadır. Sonuç olarak, her bir ilgili genin bir risk faktörü olarak katkıda bulunduğu tam penetrans, monogenik ya da poligenik modele kadar çeşitli kalıtım modelleri önerilmektedir. Epileptogenezde genlerin katkısını keşfetmek ve değerlendirmek için çeşitli konsorsiyumlar (Epi25K Consortium, the Epilepsy Phenome/Genome Project, Epicure, EuroEPINOMICS, CoGIE, EpiPGX, and ILAE Consortium) başlatılmıştır. Bu sayede genom çapında ilişki çalışmaları (Genome-Wide Association Studies, GWAS), daha fazla genin keşfedilmesini sağlamıştır. Genetik kökenlerin ötesinde, bağışıklık sisteminin epilepsideki rolü, kabul edilmiş olmasına rağmen, henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Güncel Uluslararası Epilepsi Federasyonu (International League Against Epilepsy, ILAE) sınıflandırmasına göre, otoimmün epilepsiler ayrı bir grup olarak belirlenmektedir. Kanıtlar, nöroinflamasyonun hem epileptogenezi tetikleyen hem de epileptik aktiviteye yanıt veren bir faktör olduğunu göstermektedir (2830) ve HLA dahil olmak üzere bağışıklık genlerindeki varyantlarla ilişkileri tespit edilmiştir (31, 32). Epilepsi etiyolojisine katkı sağlamak için yapılan bir çalışmada, 67 pediatrik epilepsi hastası ve ailelerinden oluşan bir kohortta tüm ekzom dizilimi kullanarak patojenik varyantlar analiz edilmiştir. HLA genotiplemesinde, DRB1*07:01:01G ve DRB4*01:01:01G grup allelleri için epilepsi ile pozitif bir ilişki ortaya koyulurken, DRB3*01:01:02G negatif bir ilişki gösterilmiştir (24). Genetik kökeni belirlenmiş olgularda HLA risk allellerinin bulunması, genetik ve immün epilepsiler arasında olası bir etkileşim olduğunu düşündürmekte ve bu iki epilepsi türü arasındaki geleneksel ayrımı sorgulatmaktadır. Temporal lob epilepsisi hastalarına ait beyin dokularında yapılan çalışmalar, inflamasyonun epileptogenezdeki rolünü destekleyen artmış HLA-DR pozitif mikroglia varlığını göstermiştir (33, 34). Özellikle DRB1*07:01›in juvenil miyoklonik epilepsi için bir risk olduğu öne sürülmüştür (32) ve hem DRB4 hem de DRB1*07, anti-LGI1 ensefaliti ile ilişkilendirilmiştir (11, 35-37). Epilepside belirli HLA allellerinin risk arttırıcı etkisinin başka bir olası açıklaması ise, bağırsak mikrobiyom bileşimini düzenlemedeki rolü olabilir. Önceki çalışmalar, belirli HLA allellerinin belirli hastalıklarda bağırsak mikrobiyotasıyla ilişkili olduğunu, bağışıklık toleransını etkilediğini veya inflamasyonu teşvik ettiğini ileri sürmüştür (38, 39). Kalıcı inflamasyon, kanbeyin bariyerinin bütünlüğünü tehlikeye atabilir, periferik bağışıklık aracılarının 126   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I beyne erişmesine ve potansiyel olarak epileptogeneze katkıda bulunmasına neden olabilir. 4. HLA Genotipleme ve Antiepileptik İlaçlarda Farmakogenetik İlişkiler Antiepileptik ilaçlar epilepsi tedavisinde temel rol oynasa da bazı bireylerde ciddi kutanöz (Severe Cutaneous Adverse Reactions, SCARs) gibi yaşamı tehdit eden istenmeyen ilaç reaksiyonlarına yol açabilmektedir. Bu reaksiyonlar arasında Stevens–Johnson Sendromu (SJS), toksik epidermal nekroliz (Toxic Epidermal Necrolysis, TEN) ve ilaç hipersensitivite sendromu (Drug-Induced Hypersensitivity Syndrome/ Drug Reaction with Eosinophilia and Systemic Symptoms, DIHS/DRESS) yer alır. HLA genotipleri, bu istenmeyen ilaç reaksiyonları için güçlü genetik belirteçler olarak tanımlanmıştır ve farmakogenetiğin klinikteki en başarılı örneklerinden birini oluşturmaktadır (40, 41). HLA-B*15:02 varyantı Asya kökenli popülasyonlarda karbamazepin kaynaklı SJS/TEN ile güçlü bir şekilde ilişkilidir (41-43). Bu alleli taşıyan bireylerde karbamazepin başlanması ciddi mortalite riskine yol açabilir. HLA-A*31:01 varyantı ise Avrupa ve Japon popülasyonlarında karbamazepin hipersensitivitesi ile ilişkilendirilmiştir (41, 44) Bu varyant hem kutanöz hem de sistemik hipersensitivite reaksiyonlarında rol oynamaktadır. Bu bulgular sonucunda, ABD Gıda ve İlaç Dairesi (U.S. Food and Drug Administration, FDA) ve Avrupa İlaç Ajansı (European Medicines Agency, EMA), asya kökenli hastalarda karbamazepin tedavisi öncesi HLA-B*15:02 testini önermektedir (45). Karbamazepine yapısal olarak benzeyen okskarbazepin, benzer şekilde HLA-B*15:02 taşıyıcılarında SJS/TEN riskini artırmaktadır (46). Fenitoin ile ilişkili SJS/TEN de HLA-B*15:02 alleli ile güçlü bağlantı göstermektedir. Lamotrijine bağlı kutanöz reaksiyonlarda da HLA-B*15:02 ve HLA-B*13:01 allellerinin rol oynadığı bildirilmiştir (47). Ancak bu ilişki karbamazepin kadar güçlü değildir. HLA genotiplemenin klinik uygulamaya girmesi, epilepsi tedavisinde kişiselleştirilmiş tıbbın önünü açmıştır. Örneğin, asya ülkelerinde karbamazepin reçetesi öncesi HLA-B*15:02 varyant taraması rutin hale gelmiştir. Bu uygulama, SJS/TEN insidansını dramatik şekilde azaltmıştır (42). Avrupa’da HLA-A*31:01 taraması, özellikle karbamazepin tedavisi planlanan yüksek riskli bireylerde önerilmektedir, ancak henüz rutin uygulama düzeyine ulaşmamıştır (44). HLA genleri, antiepileptik ilaçlara bağlı istenmeyen reaksiyonların EPİLEPSİ ETİYOLOJİSİNDE VE FARMAKOGENETİĞİNDE HLA GENLERİNİN . . .   127 öngörülmesinde en güçlü genetik belirteçlerdir. Özellikle HLA-B*15:02 ve HLA-A*31:01 varyantlarının klinik pratikte test edilmesi, hasta güvenliği ve kişiselleştirilmiş tedavi için kritik öneme sahiptir. Bu örnekler, farmakogenetik testlerin epilepsi yönetiminde uygulanabilirliğini göstermektedir. Ancak halen birçok ülkede maliyet, altyapı ve sağlık politikaları bu testlerin rutinleşmesinin önünde engel oluşturmaktadır. HLA genotiplemenin rutin klinik uygulamalara entegrasyonu, epilepside kişiselleştirilmiş tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde anahtar rol oynayacaktır. Geniş hasta kohortlarından elde edilen klinik, genetik ve farmakogenetik verilerin işlenmesi, epilepside prediktif modellerin geliştirilmesine katkı sağlayabilir. 5. Sonuç Yeni nesil dizileme teknolojilerindeki gelişmeler, genlerin yüksek çözünürlüklü analizini mümkün kılmaktadır (48, 49). Bu sayede epilepside de popülasyon bazlı HLA varyant dağılımları daha doğru şekilde belirlenebilecek ve risk öngörüsü güçlenebilecektir. Genetik, transkriptomik, proteomik ve immünolojik verilerin bütünleştirilmesi, epilepsi patogenezinde çok boyutlu bir anlayış sağlayacaktır. Özellikle HLA ekspresyonunun nöroinflamasyon süreçlerindeki rolü, gelecek araştırmalarda da odak noktası olacaktır. HLA genleri, epilepsi etiyolojisinde ve antiepileptik ilaçlara karşı farmakogenetik yanıtta merkezi bir role sahiptir. Otoimmün ensefalitler, Rasmussen ensefaliti ve dirençli epilepsi gibi tablolar, belirli HLA varyantları ile ilişkilidir. Epilepsi tedavisinde kullanılan Karbamazepin, fenitoin ve lamotrijin gibi AEİ’lere bağlı ciddi istenmeyen reaksiyonlar da HLA varyantları ile ilişkilidir. Klinik uygulamalarda HLA genotiplemenin kullanımı, hasta güvenliğini arttırmakta ve kişiselleştirilmiş tedaviye geçişin önünü açmaktadır. Referanslar 1. Fisher RS, Cross JH, French JA, Higurashi N, Hirsch E, Jansen FE, et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 2017;58(4):522-30. 2. Helbig I, Lowenstein DH. Genetics of the epilepsies: where are we and where are we going? Curr Opin Neurol. 2013;26(2):179-85. 3. Löscher W, Klitgaard H, Twyman RE, Schmidt D. New avenues for anti-epileptic drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2013;12(10):757-76. 128   TIBBİ BİYOLOJİDE GÜNCEL ÇALIŞMALAR I 4. Vezzani A, Balosso S, Ravizza T. Neuroinflammatory pathways as treatment targets and biomarkers in epilepsy. Nat Rev Neurol. 2019;15(8):45972. 5. Klein J, Sato A. The HLA system. First of two parts. N Engl J Med. 2000;343(10):702-9. 6. Shiina T, Hosomichi K, Inoko H, Kulski JK. The HLA genomic loci map: expression, interaction, diversity and disease. J Hum Genet. 2009;54(1):15-39. 7. Trowsdale J, Knight JC. Major histocompatibility complex genomics and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2013;14:301-23. 8. Youn Y, Sung IK, Lee IG. The role of cytokines in seizures: interleukin (IL)-1β, IL-1Ra, IL-8, and IL-10. Korean J Pediatr. 2013;56(7):271-4. 9. Altintaş A, Özkara Ç, Sohtaoğlu Sevindik M, Uzan M, Kekik Çinar Ç, Uysal Ö, et al. Cytokine Polymorphism and HLA Genotyping in Patients with Temporal Lobe Epilepsy Related to Hippocampal Sclerosis. Noro Psikiyatr Ars. 2017;54(4):350-3. 10. Fadda A AM, Vasudeva D, Saeed A, Aglan Tarek S, Hubrack SZ, Benini R, Zamel K, Lo B. . The Complex Etiology of Epilepsy: Genetic Analysis and HLA Association in Patients in the Middle East. Int J Mol Sci. 2025;26(12):5815. 11. Peris Sempere V, Muñiz-Castrillo S, Ambati A, Binks S, Pinto AL, Rogemond V, et al. Human Leukocyte Antigen Association Study Reveals DRB1*04:02 Effects Additional to DRB1*07:01 in Anti-LGI1 Encephalitis. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 2022;9(2). 12. Varadkar S, Bien CG, Kruse CA, Jensen FE, Bauer J, Pardo CA, et al. Rasmussen’s encephalitis: clinical features, pathobiology, and treatment advances. Lancet Neurol. 2014;13(2):195-205. 13. Robinson J, Malik A, Parham P, Bodmer JG, Marsh SG. IMGT/HLA database--a sequence database for the human major histocompatibility complex. Tissue Antigens. 2000;55(3):280-7. 14. Robinson J, Barker DJ, Marsh SGE. 25 years of the IPD-IMGT/HLA Database. Hla. 2024;103(6):e15549. 15. IPD-IMGT/HLA [Internet]. 2025. Available from: https://www.ebi. ac.uk/ipd/imgt/hla/. 16. Horton R, Wilming L, Rand V, Lovering RC, Bruford EA, Khodiyar VK, et al. Gene map of the extended human MHC. Nat Rev Genet. 2004;5(12):88999. 17. Robinson J, Guethlein LA, Cereb N, Yang SY, Norman PJ, Marsh SGE, et al. Distinguishing functional polymorphism from random variation