Estudio de Antioxidantes Presentes en el Noni (Morinda citrifolia L.) como Inhibidores de la Polimerización Radical Libre del Estireno

PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA C CO OM MC CA AP PL LA A 2 20 01 10 0 9 al 12 de Noviembre, Granada, Nicaragua Estudio de antioxidantes presentes en el Noni (Morinda citrifolia L.) como inhibidores de la polimerización radical libre del estireno Alonso, J.1, Guerrero, R.2 1 Universidad Nacional de Ingeniería, Facultad de Ingeniería Química 2 Centro de Investigación en Química Aplicada, CIQA. Saltillo, México [email protected], [email protected] 1. Resumen En este trabajo se estudiaron las propiedades inhibidoras de antioxidantes presentes en extractos de fruto y raíz de noni (Morinda citrifolia L.) en la polimerización radical libre del estireno. Para extraer los principales antioxidantes, se utilizó el método propuesto por Singh y colaboradores, donde se logra caracterizar la antraquinona damnacantal[1]. Se realizaron polimerizaciones de estireno a temperatura constante, en presencia de un iniciador (AIBN) y en presencia de extractos de noni, ambos al 1% en peso y se comparó la capacidad inhibidora de estos extractos con hidroquinona, un inhibidor común. El extracto clorofórmico de raíz (R-02) fue el que demostró la mejor capacidad inhibidora, con un período de inhibición entre 15 y 30 minutos en las condiciones dadas, superando a la hidroquinona. Los demás extractos no tuvieron la misma eficiencia de inhibición, por contener menor concentración de antioxidantes. Palabras clave: Morinda citrifolia, antraquinonas, inhibidor, polimerización, estireno. 2. Introducción El Noni es una planta que ha alcanzado bastante popularidad en los últimos años por las propiedades terapéuticas que se le adjudican. Igualmente ha tenido un creciente interés científico y se han llevado a cabo diversos estudios para demostrar su eficacia para tratar múltiples enfermedades[2]. Diversas investigaciones [2-6] aportaron evidencia de que el Noni posee muchos compuestos que actúan como “atrapadores de radicales” a nivel biológico. Esta cualidad nos motivó a desarrollar este estudio para encontrar nuevas aplicaciones biotecnológicas del noni en el área de los polímeros y expandir las aplicaciones de esta planta en campos fuera de lo tradicional como lo han sido los tratamientos naturales terapéuticos. El objetivo de este trabajo fue realizar un estudio con los principales antioxidantes presentes en el fruto y raíz de Noni como son las antraquinonas[4], para probar su eficacia como inhibidores de la polimerización radicálica libre del estireno. Los resultados de este trabajo pueden dar lugar a la obtención de nuevos antioxidantes de esta fuente natural más eficientes que los utilizados comercialmente y probablemente más económicos. PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA C CO OM MC CA AP PL LA A 2 20 01 10 0 9 al 12 de Noviembre, Granada, Nicaragua 3. Condiciones Experimentales 3.1 Material de la planta Las plantas de Morinda citrifolia utilizadas en este estudio fueron cultivadas a 400 metros de altitud en Santa Teresa, departamento de Carazo y en Managua, en la zona del Pacífico sur de Nicaragua y se recolectaron en agosto de 2008. Frutos en su estado óptimo de madurez fueron seleccionados y lavados para someterlos a un prensado y posterior filtración para la extracción del jugo, este extracto fue proporcionado por la empresa Prodenoni, ubicada en Managua. Las raíces de estas plantas fueron cosechadas, lavadas y secadas al sol durante 8 horas para luego ser pulverizadas y nuevamente secadas al sol un día más. Estas muestras se enviaron al Centro de Investigación en Química Aplicada, en Saltillo, México, donde se realizó el estudio. 3.2 Procedimientos de extracción A una muestra 190 g de extracto de fruto de Noni se le realizaron 3 extracciones sucesivas con 50 ml de cloroformo al 99.9% cada una en un embudo de separación. Se obtuvieron 160 ml de fase clorofórmica, la cual se filtró para separar los residuos proteínicos y se secó en un evaporador rotatorio al vacío para obtener finalmente 109 mg de cristales aciculares de color naranja (F-01). Se realizaron 3 extracciones soxhlet sucesivas a una muestra de 100 g de raíces secas molidas añadiendo en total 1L de etanol al 99%, a una temperatura de 80 °C. El solvente fue removido al vacío en un evaporador rotatorio, obteniéndose 5.68 g de sólidos (R-01). Una muestra de 4.09 g de este extracto (R-01) se mezcló con 100 ml de hexano al 99.9% y se filtró para separar los sólidos insolubles. Estos se secaron en un horno a 60 °C para eliminar el solvente remanente y se mezclaron con 100 ml de cloroformo al 99.9% y 100 ml de agua desionizada para formar una mezcla de dos fases. Ambas fases se separaron por decantación y se secaron en un evaporador rotatorio al vacío. Se obtuvieron 560 mg de sólidos aciculares de color amarillo-naranja (R-02) de la fase clorofórmica, la cual contiene las antraquinonas[1]. 3.3 Aislamiento y caracterización de antraquinonas El extracto clorofórmico de raíz (R-02) fue sometido a cromatografía en columna de sílica gel, eluída con cloroformo para obtener varias fracciones. Las principales fracciones fueron nuevamente sometidas a cromatografía de sílica gel en placa preparatoria, con elución de 60% éter de petróleo, 38% cloroformo y 2% etanol. Las fracciones separadas se analizaron en Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de protón, en un Espectrofotómetro de Transformada de Fourier (FTIR) y en Cromatografía de Permeación en Gel (GPC) para identificar la estructura de los PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA C CO OM MC CA AP PL LA A 2 20 01 10 0 9 al 12 de Noviembre, Granada, Nicaragua compuestos que se habían aislado. Las fracciones con espectros mejor definidos fueron purificadas por re-cristalización y se volvieron a analizar en RMN de protón y en FTIR. Las señales de absorción de los espectros obtenidos por RMN de protón de los antioxidantes extraídos fueron comparadas con las señales de absorción de antraquinonas reportadas en distintos trabajos [1,7,8], con el fin de demostrar la presencia de antraquinonas en el extracto clorofórmico de la raíz de Noni (R-02). 3.4 Polimerizaciones de estireno y extractos Se realizaron polimerizaciones con estireno a 60°C a tiempos de 15 y 30 min y 1, 2, 5, 10 y 15 horas para estudiar el comportamiento cinético. Una serie de experimentos (B-01) se llevó a cabo con 99% en peso de estireno y 1% de iniciador (AIBN), la cual se consideró como blanco. Las demás polimerizaciones se realizaron con 98% de estireno, 1% de iniciador (AIBN) y 1% de extracto de Noni o hidroquinona (HQ) como inhibidores (todos los porcentajes en peso). Se utilizaron los sólidos obtenidos del extracto de fruto (F-01), sólidos del extracto crudo etanólico de la raíz (R-01) y sólidos del extracto clorofórmico de la raíz (R-02) como posibles inhibidores naturales en la polimerización. Los polímeros obtenidos fueron analizados en GPC para obtener su distribución de pesos moleculares. También se calculó la conversión total de monómero para cada experimento. 4. Resultados y Discusión. 4.1 Efecto de los extractos en la conversión del polímero La Tabla 1 muestra que el extracto clorofórmico de raíz (R-02) produjo bajas conversiones a tiempos cortos. Fue el único que presentó un periodo de inhibición entre 15 y 30 minutos, superando como inhibidor a la hidroquinona (HQ) y mostrando el comportamiento de un inhibidor/retardante. El extracto de fruto de Noni (F-01) no presentó un período de inhibición estimable, pero provocó bajas conversiones de monómero a tiempos mayores, con un comportamiento retardante. Tabla 1. Conversión de los Polímeros en el Tiempo. Tiempo (horas) Conversión (%) B-01 F-01 R-01 R-02 HQ 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.25 2.7 − 2.0 0.0 2.1 0.50 3.4 3.0 3.1 2.4 2.9 1.0 6.6 7.2 7.0 3.1 4.9 2.0 12.7 − 13.4 11.3 11.7 5.0 29.6 7.9 25.9 25.8 18.3 10.0 62.7 46.8 55.0 51.1 − PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA C CO OM MC CA AP PL LA A 2 20 01 10 0 9 al 12 de Noviembre, Granada, Nicaragua 15.0 91.3 57.2 82.6 87.7 − 4.2 Efecto de los extractos en la distribución de pesos moleculares del polímero La figura 1 muestra la distribución normalizada de pesos moleculares de los polímeros a un tiempo de 5 horas. Figura 1. Cromatograma en GPC de los polímeros obtenidos a un tiempo de 5 horas. B-01: 99% estireno, 1% AIBN; F-01: 98% estireno, 1% AIBN, 1% extracto de fruto; R-02: 98% estireno, 1% AIBN, 1% extracto clorofórmico de raíz; HQ: 98% estireno, 1% AIBN, 1% hidroquinona. Las curvas muestran que el poliestireno formado en presencia de extracto de raíz, R-02, posee una distribución de pesos moleculares desplazada a la derecha (tiempos mayores de elución) lo que equivale a pesos moleculares menores que los demás polímeros. La hidroquinona (HQ) también provocó un desplazamiento hacia pesos moleculares menores con eficiencia cercana al extracto de raíz R-02, pero con índice de polidispersidad más alto (distribución más amplia). El extracto de fruto (F-01) no fue muy efectivo en este aspecto, generando polímeros con pesos moleculares cercanos o mayores que el polímero de referencia (B-01). A tiempos de 10 y 15 horas se mantuvo la misma tendencia, el extracto de raíz fue más efectivo en la reducción del peso molecular promedio que el extracto de fruto y su índice de polidispersidad fue el más bajo. 4.3 Caracterización de antraquinonas en extractos de Noni PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA C CO OM MC CA AP PL LA A 2 20 01 10 0 9 al 12 de Noviembre, Granada, Nicaragua La caracterización en 1H RMN de distintas fracciones obtenidas a partir de cromatografía en columna de sílica gel, reveló la existencia predominante de antraquinonas en los extractos de Noni, especialmente en el extracto clorofórmico de raíz, R-02. Las señales que muestra el espectro de la figura 2 fueron comparadas con las reportadas por Faltynek[5] para el compuesto químico damnacantal, lográndose identificar este compuesto. Figura 2. Espectro de RMN de 1H (400 MHz) en CDCl3 obtenido del compuesto damnacantal (antraquinona) luego de ser aislado del extracto clorofórmico de raíz (R-02) por cromatografía en sílica gel. Los espectros de RMN y FTIR confirmaron la estructura de anillos bencénicos fusionados y los grupos cetónicos en los carbonos 9 y 10, propios de las antraquinonas, así como algunos grupos funcionales OCH3, CHO y OH característicos de antraquinonas con importante actividad biológica como el damnacantal, alizarina, nordamnacantal, pustulina y escopolamina[5,7,8]. PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA C CO OM MC CA AP PL LA A 2 20 01 10 0 9 al 12 de Noviembre, Granada, Nicaragua El cromatograma de GPC del extracto indicó una distribución de pesos moleculares entre 268 y 353 gr/mol, con un peso molecular promedio molar de 289 gr/mol, ubicando los compuestos en el rango de peso molecular de las antraquinonas. 5. Conclusiones Los valores de conversión versus tiempo indicaron que el extracto clorofórmico de raíz de noni fue más efectivo como inhibidor que el extracto de fruto e incluso mejor que la hidroquinona, presentando un periodo de inhibición entre 15 y 30 minutos según las condiciones experimentales. En este periodo, las antraquinonas presentes en la raíz de Noni lograron detener los radicales libres formados por el iniciador (AIBN), evitando de este modo la formación de polímero, incluso aunque la concentración molar de iniciador fue probablemente mayor que la de antraquinonas en la polimerización. Los cromatogramas obtenidos mediante GPC a tiempos de polimerización de 5, 10 y 15 horas indicaron que el poliestireno formado en presencia del extracto clorofórmico de raíz (R-02) presentó una distribución de pesos moleculares menor que los demás polímeros. El extracto de fruto causó una disminución menos significativa en el peso molecular del poliestireno. La presencia de hidroquinona como inhibidor en la polimerización provocó la formación de poliestireno con una distribución de peso molecular muy cercana a la que produjo el extracto de raíz, pero con índice de polidispersidad mayor. Es importante notar que la eficiencia de inhibición hubiese sido mayor si en lugar de usar los extractos de Noni se hubieran usado antraquinonas purificadas de modo que se tendría mayor concentración molar de inhibidor como en el caso de la hidroquinona. Las técnicas de caracterización en RMN, FT-IR y GPC evidenciaron la presencia de antraquinonas en el extracto de raíz y se identificó el compuesto damnacantal. 6. Agradecimientos Los autores agradecen a la empresa Resirene S.A de C.V. por el apoyo financiero brindado para la realización de este trabajo y al Centro de Investigación en Química Aplicada (CIQA). J. Alonso también agradece a la Agencia Sueca de Cooperación Internacional para el Desarrollo (Asdi) por el estipendio de viaje para la conferencia y al Dr. Ramiro Guerrero del CIQA por el apoyo brindado en la realización de este estudio. 7. Bibliografía 1. Singh, D. N., et al., “Antifungal anthraquinones from Saprosma fragans”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. V. 16, 4512–4514 (2006). 2. Chan-Blanco, Y., et al., “The noni fruit (Morinda citrifolia L.): A review of agricultural research, nutritional and therapeutic properties”. Journal of Food Composition and Analysis. V. 19, 645–654 (2006). PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA C CO OM MC CA AP PL LA A 2 20 01 10 0 9 al 12 de Noviembre, Granada, Nicaragua PRIMER CONGRESO MULTIDISCIPLINARIO DE CIENCIAS APLICADAS EN LATINOAMÉRICA 3. Anekpankul, T. Et al., “Extraction of anti-cancer damnacanthal from roots of Morinda citrifolia by subcritical water”, Separation and Purification Technology. V. 55, 343-349 (2007). 4. Pongnaravane, B., et al., “Extraction of anthraquinones from roots of Morinda citrifolia by pressurized hot water: Antioxidant activity of extracts”, Journal of Supercritical Fluids. V. 37, 390– 396 (2006). 5. Faltynek, C.R. et al., “Damnacanthal is a highly potent, selective inhibitor of p56lck tyrosine kinase activity”, Biochemistry. V. 34, 12404–12410 (1995). 6. Mohd Zin, Z., et al., “Isolation and identification of antioxidative compound from fruit of mengkudu (Morinda citrifolia L.)”, International Journal of Food Properties. V. 10, 363-373 (2007). 7. Kanokmedhakul, K., et al, “Biological activity of anthraquinones and triterpenoids from Prismatomeris fragans”, Journal of Ethnopharmacology. V. 100, 284–288 (2005). 8. Núñez, S. et al., “Anthraquinone derivates from Heterophyllaea pustulata”, Journal of Natural Products. V. 69, 801–803 (2006).