Detección del coronavirus SARS-CoV-2 mediante ensayo de PCR múltiplex. Protocolo sencillo (Práctica en laboratorio virtual Cibertorio)
Herráez, Angel; Diez, José C.
- Publisher
- Zenodo
- Language
- en
Abstract
Guión de trabajo simplificado para el laboratorio virtual «Cibertorio» en Biomodel.UAH.es La identidad de una infección vírica se puede verificar detectando la presencia del material genético del virus en muestras tomadas al paciente. En concreto, este ensayo se centra en la detección de secuencias propias del RNA genómico de SARS-CoV-2, el coronavirus causante de la pandemia COVID-19 que apareció a finales de 2019 y se extendió por todo el mundo en 2020. La identidad del virus se confirma en comparación con secuencias genómicas del influenzavirus A H1N1, causante de la gripe común que tiene síntomas iniciales similares. Como control para verificar la amplificación por PCR se utiliza un gen humano constitutivo, el de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa Como material de partida disponemos de muestras de cDNA (virtuales) preparado a partir del RNA contenido en muestras tomadas de la mucosa de seis pacientes con síntomas de gripe. Objetivo: identificar, en su caso, la infección empleando varios cebadores para PCR dirigidos a regiones del genoma humano, del virus A de la gripe y del coronavirus.
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de “PCR mix”: de PCR700 de PCR711 de PCR713 de PCR715 de PCR721 de PCR723 de PCR725 Detección del coronavirus SARS-CoV-2 mediante ensayo de PCR múltiplex (Práctica en laboratorio virtual Cibertorio) Protocolo de trabajo 1. En el catálogo de Cibertorio (Reactivos y equipo virtuales CygnusLab Certified™) localiza: Grupo de muestras para diagnóstico genético de coronavirus. Nº de catálogo: NA45 Parejas de cebadores para la amplificación de marcadores de coronavirus y virus de la gripe común. Anota los n os de catálogo de los 8 pares de cebadores, cuyos nombres comienzan por CoV o por InV (PCR700, PCR711, etc.) 2. Ve a realizar un pedido y elige Muestras para coronavirus. Y entre los cebadores (parejas directo+inverso) elige o PCR700 o Tres de los que comienzan por PCR71 o Tres de los que comienzan por PCR72 o (7 en total) 3. Introduce nombre y apellido, centro ( ) y contraseña ( ). Confirma el pedido. 4. Pasa al laboratorio de reacciones. Primero prepararemos dos “mezclas maestras” para reducir el número de veces que será necesario pipetear. Para ello usaremos los tubos 6 y 12 (a la derecha). Mezcla estos volúmenes: de agua: En el tubo 6 40 µL 15 µL 5 µL 5 µL 5 µL 5 µL En el tubo 12 40 µL 15 µL 5 µL 5 µL 5 µL 5 µL Nota: observa que en estas mezclas la concentración final del PCR Master Mix ya no es 10x, sino 2x. 5. Haremos el ensayo de las muestras Pt1 a Pt4, preparando estas mezclas: de DNA Pt1 de DNA Pt2 de DNA Pt3 de DNA Pt4 de la mezcla maestra tubo 6 de la mezcla maestra tubo 12 En el tubo 1 15 µL 15 µL En el tubo 2 15 µL 15 µL En el tubo 3 15 µL 15 µL En el tubo 4 15 µL 15 µL En el tubo 7 15 µL 15 µL En el tubo 8 15 µL 15 µL En el tubo 9 15 µL 15 µL En el tubo 10 15 µL 15 µL Angel Herráez doi:10.5281/zenodo.17572926
