СТОХАСТИЧНО–ДИНАМИЧНА МАССПЕКТРОМЕТРИЯ ― ТЕОРИЯ И ПРИЛОЖЕНИЕ ЗА КОЛИЧЕСТВЕН И СТРУКТУРЕН МОЛЕКУЛЕН АНАЛИЗ

СОФИЙСКИ УНИВЕРСИТЕТ “СВЕТИ КЛИМЕНТ ОХРИДСКИ“ ФАКУЛТЕТ ПО ХИМИЯ И ФАРМАЦИЯ КАТЕДРА “АНАЛИТИЧНА ХИМИЯ” Божидарка Борисова Иванова СТОХАСТИЧНО–ДИНАМИЧНА МАССПЕКТРОМЕТРИЯ ― ТЕОРИЯ И ПРИЛОЖЕНИЕ ЗА КОЛИЧЕСТВЕН И СТРУКТУРЕН МОЛЕКУЛЕН АНАЛИЗ АВТОРЕФЕРАТ на Дисертационен труд за присъждане на научната степен „доктор на науките“ Област 4. Природни науки, математика и информатика Професионално направление 4.2. Химически науки (Аналитична химия) София 2025/6 г. (?!) 1 Научно жури: (?!) 2 Дисертационният труд съдържа 318 страници, онагледен е с 224 фигури, и 28 таблици. Библиографската справка обхваща 543 литературни източници. Дисертационният труд е обсъден, приет и насочен за защита пред научно жури от Катедрения съвет на Катедра „Аналитична химия”, Факултет по химия и фармация при Софийския университет „Св. Климент Охридски“, проведен на (?!) г. Масспектрометричният, електронно абсорбционният и атомно абсорбционният експериментът, включен в дисертационния труд, е направен в Института по опазване на Околната Среда към Университета в Дортмунд (Германия) в рамките на изследователски проект и временна изследователска позиция на дисертанта. Експериментът по монокристална рентгенова дифракция, електронно абсорбционна и вибрационна спектроскопия е проведен във Факултета по Химия и Фармация на Софийски Университет „Св. Климент Охридски“ в рамките на заемана от дисертанта академична длъжност доцент по аналитична химия . Представените резултати не са използвани от друго лице за получаване на каквато и да е научна степен или академична длъжност. Дисертацията не съдържа материали, публикувани от други лица, освен в случаите, когато е направен съответният цитат в текста. 3 Публичната защита на дисертационния труд ще се състои на (?!) г. от (?!) ч. в Заседателната зала на Факултета по химия и фармация, СУ „Св. Климент Охридски“, гр. София,бул. „Дж. Баучър” № 1. Материалите по защитата са на разположение на интересуващите се в канцеларията на Факултета по химия и фармация при СУ „Св. Климент Охридски“, бул. „Дж. Баучер“ № 1, стая 107, и на Интернет страницата на Факултета по химия и фармация при СУ „Св. Климент Охридски“. 4 Съдържание* 1. Въведение 2. Цел на дисертационния труд 3. Стохастично-динамична масспектрометрия – теоретични основи 3.1. Приложение на стохастично-динамичния масспектрометричен метод за количествен анализ 3.2. Приложение на стохастично-динамичния масспектрометричен метод за структурен анализ 3.2.1. Структурен анализ на циклодекстрини 3.2.2. Структурен анализ на конфигурационно блокирани полиени 3.2.3. Структурен анализ на алифатни амини 3.2.4. Структурен анализ на стероиди 3.2.5. Структурен анализ на CuII-комплекс на глицин 3.2.6. Структурен анализ на дипептиди 3.2.7. Структурен анализ на CuII-, AgI-, и ZnII-комплекси на глицилхомолигопептиди 3.2.8. Структурен анализ на AgI-, и ZnII-комплекси с органични и неорганични малки молекули и йони 3.2.9. Структурен анализ на солватни клъстери 3.2.10. Масспекрометричен структурен анализ на флавоноиди 3.2.11. Структурен анализ на фармацевтични продукти в проби от околната среда 3.2.12. Структурен анализ на нуклеозиди посредством матрично подпомагана лазерно-индуцирана десорбциoнно/йонизациoнна масспектрометрия 3.2.13. Структурен анализ на кофеинови метаболити 3.2.14. Структурен анализ на изотопомери 3.2.15. Структурен анализ на продукти на каталитични реакции водещи до формиране на C–C ковалентна връзка 3.2.16. Структурен анализ на синтетични и биоразградими полимери 4. Изводи 5. Приноси 6. Публикации включени в дисертационния труд и библиометрични показатели *С цел да се избегне двусмислено интерпретиране на данни поради нееднозначно използване на специализирана терминология, някои термини от специфични методи и техники, а така също и наименования на лекарствени препарати или природни смеси използвани в медицината са представени, както посредством техния превод на Български език, така и с традиционното им използване в Англоезичната литература. 5 1. Въведение Ученият, независимо дали е теоретик или експериментатор, излага твърдения или системи от твърдения и ги проверява стъпка по стъпка. В областта на емпиричната наука, по-специално, той изгражда хипотези или системи от теории и ги проверява спрямо опита чрез наблюдение и експеримент. Според мен задача на логиката на научното откритие или логиката на познанието е да даде логически анализ на тази процедура; тоест да анализира метода на емпиричната наука. Но какви са тези „методи на емпиричната наука“? И какво наричаме „емпирична наука“? Карл Попър, 1935 Масспектрометрията (МС) е сред най-широко прилаганите инструментални методи в съвременната аналитична химия. Той е незаменим метод в редица области на науката и индустрията. Наречен е “златен стандарт” в аналитичната практика поради превъзходните си апаратурни показатели и характеристики според критериите за ефективност на аналитичната апаратура, които са регулирани, систематизирани, и стандартизирани съобразно световните и европейски аналитични практики (виж Директива на Европейската Комисия 96/23/EО/14.08.2002). Сред основните показатели за ефективност на масспектрометрията като аналитичен метод могат да се посочат високата му специфичност и повторяемост на получените в хода на анализ данни за химичните съединения (т.н. аналити), висока точност и прецизност; висока възпроизводимост и чувствителност; способност за откриване на следи от аналити в многокомпонентни проби от околната среда, хранителни продукти, биологични тъкани и течности. Границата на откриване на метода достига до фемто (10-15) и атто (10-18) молнитe концентрационни нива на аналити. Масспектрометричните протоколи са задължителни за голям брой контролни органи и референтни центрове. Редица въпроси на медицината, правото и публичната администрация са свързани с теоретични обобщения и интерпретация на масспектри. Приложението на масспектрометрията за количествен анализ се характеризира с драстично увеличаване на броя експерименти, като само в САЩ, например, той е над 50 милиона експерименти годишно. В тази връзка, т.н. маргиналност (или двусмислие) на аналитичните протоколи е проблем не само за изследвания свързани с развитие на фундаменталната наука, но и за много области на икономиката, социалния живот и културата. От гледна точка на двусмислието на данни от МС анализ трябва да се спомене, че доколкото МС методите използват измерими променливи от масспектъра на определяемото съединение, както и всеки друг аналитичен метод, то методологичното развитие на МС методи са неразривно свързани с методичното и методологично развитие на аналитичната химия. Аналитичната химия използва измерими величини от химичния анализ като по този начин определя количеството на аналита, неговите молекулни свойства, триизмерна (3Д) молекулна и електронна структури чрез инструментални методи. В методологично 6 отношение аналитичната химия разработва не само апаратура и техники за анализ, но също така и методи за обработка на данните от измерваните величини. В контекста на целите на настоящата дисертация ще бъде обърнато внимание на определен брой аналитични методи разработвани досега ― главно тези, прилагащи се в масспектрометричния анализ. Сред съвременните разработки основно се използват т.н. -омикс методи. Те са решаващи при анализа на биологични системи и pазлични области на биоинформатиката. Сред инструментариума на аналитичната практика, масспектрометрията с т.н. мека йонизация на аналита се превърна в основата на омикстехнологиите за охарактеризиране на биологично активни съединения, както в лабораторни условия, така и в живата материя и човека. Подобно на повечето йонизационни методи, апаратурата, използваща мека йонизация на аналита се характеризира с превъзходни показатели за ефективност като: (а) ултра-висока точност, прецизност, възпроизводимост, чувствителност, надеждност, селективност и специфичност; (б) способност за анализ, както на нискомолекулни съединения така и (био)полимери (10–100 kDa); (в) концентрационни граници на количествено определяне на аналити достигащи до 10-18–10-15 мола; и (г) свръх висока разделителна способност. Тази ефективност се постига чрез анализатори на маса на химични частици имащи ултра-висока разделителна способност като, например т.н. орбитрап анализатор или анализатор на маса при йоннатa циклотронна резонансна масспектрометрия с трансформация на Фурие. Първият тип анализатор е разработен от Макаров (2000), а вторият тип е разработка на Комисаров и Маршал (1974). Основно в разработката на орбитрап анализатора е явлението орбитално улавяне на йони изследвано, което за пръв път е изучено от Кингдън (1923). Споменатите решаващи методологични разработки внедрени в съвременната MС апаратура наред с други иновации са основа на мащабното прилагане на метода в редица мултидисциплинарни изследователски области. Иновативните МС технологии са свързани и с внедряването на т.н. динамично хармонизирана измервателна клетка проектирана от Николаев и Болдин (2011). Тя позволява анализ на изотопомери, което е ключова стъпка в недвусмисленото определяне на пептиди и протеини. Прецизните измервания на изотопомери не допринасят само за същественото развитие на области като медицина и клиничната диагностика, но също така и екология, геология, историята, съдебна антропология и др. МС методите се характеризират така също с възможност за (v) автоматизация на анализа и анализ без предварителната обработка на пробите; (vi) гъвкав (и преносим) инструментариум съвместим и с други методи за анализ като хроматография, йонномобилна спектроскопия, електрохимия и др., а и (vii) миниатюризирани инструментални устройства и техники. Методът съвместява и (viii) техники за н-мерно изображение. Той, също така позволява (x) анализ на химични реакции в непрекъснат поток; (xi) изследване на сложни аналитични смеси в биологични тъкани и течности, проби от околната среда и 7 хранителни продукти; (xii) диагностика в живата клетка; както и (xiii) експериментално определяне на кинетични, термодинамични, и дифузионни параметри на йони и техните процеси в околната среда, тъкани, органи и цели организми. Сред методичните приноси с голямо значение за съвременната аналитична масспектрометрия би могъл да се посочи т.н. кинетичният метод, разработен от Кукс (1998) и съавтори, наред с други методи за МС анализ. Неговите предимства са довели до рутинното му използване в практиката за целите на кинетичния експеримент. Същото се отнася и за корелационните статистически методи установяващи линейна зависимост между енергията на МС реакциите въз основа на свободната енергия на Хамет и кинетичните параметри установени от Маклафърти още в раните години на развитие на аналитичната масспектрометрия през 60-те години на миналия век. Данни за интензитета на пиковете в масспектъра на молекулния йон и продуктите на фрагментирането на йони на аналитите, изследващи кинетиката на реакцията, показват линейна връзка между пиковото съотношение на интензитета и време на химична реакция (r2=0.99). Функционалната зависимост между интензитета на пикa и енергията на частиците е предположена за пръв път от Маклафърти през 1959. Разработен от дисертанта кинетичен модел потвърждава тази зависимост. Моделът е тестван върху ограничен брой молекули. Независимо от отличната ефективност, получените хемометрични параметри от съпоставяне на теория и експеримент не са еднозначни в голямата си част. Тези авторски кинетични моделни уравнения са само споменати в хода на изложението като приложимостта им е илюстрирана с няколко примера. Експерименталните MС параметри на подвижността на йони и дифузионните параметри определят потенциала на взаимодействието йон-молекула, като по този начин позволяват изчисляването на коефициенти на йон-йон рекомбинация, средна йонна енергия, скорост на дисперсия на йони, електрически разряди, и др. Систематичен анализ на зависимостта между MС променливи параметри и термодинамични параметри на химичните реакции е проведен от Арментраут и съавтори. Тези параметри служат за анализ и мониторинг на химичните съединения и техните превръщания директно в околната среда и живата клетка, което е основно преимущество на аналитичната масспектрометрия спрямо другите основни методи на количествения и структурен химичен анализ използвани в съвременната аналитична наука и практика. Едно основно методологично направление в съвременната масспектрометрия разработва корелационни зависимости между експериментални MС, йонно-мобилно спектроскопски и дифузионни параметри като се определя т.н. параметър напречно сечение на сблъсък (НСС) на аналита. Основно преимущество на този тип изследвания е, че параметърът НСС може да се получи и чрез теоретични пресмятания чрез прецизни методи на квантовата химия опериращи с т.н. химична прецизност използваща статични подходи и методи на молекулната динамика. Следователно, НСС-данните от теоретичния 8 анализ, експерименталните МС резултати и тези от йонно-мобилната спектроскопия позволяват определяне на молекулните структури и свойствата на материята като се съпоставят данни от химичния експеримент и такива от квантово-химични пресмятания. Сред МС методите с мека йонизация на аналити, тези основани на електроспрей йонизация (ЕСЙ); химична йонизация при атмосферно налягане (ХЙАН), и матрично подпомагана лазерно-индуцирана десорбция/йонизация (МПЛДЙ) са сред най-широко използваните подходи за анализ в съвременната химия, биохимия и биология. ЕСЙметодът е разработка на Ямашита и Фен (1984), докато МПЛДЙ-метода ― на Карас и Хиленкамп (1985). ЕСЙ-МС методът стабилизира молекулния радикал-катион или протомер на аналита от разтвора без да нарушава специфичността нa 3Д-структурата му и нековалентните междумолекулни взаимодействия като водородни връзки, близки контакти, и координационни връзки при комплексните съединения. Той е един от най-използваните методи за 3Д молекулен структурен анализ на биологично активни молекули в живата клетка. В хода на МС-анализa се запазват, както елементния състав така и стехиометрия на аналитите и техните молекулни комплекси, като се определя експериментално и енергията на взаимодействие на молекулите. При анализ на биологични проби енергията на взаимодействие на молекулите е от основно значение. Тя е директно свързана с биологичната активност на молекулите. Така, масспекрометрията позволява директен анализ на корелационната зависимост между 3Д молекулна структура и биологична активност на химичните съединения. ЕСЙ-МС се характеризира със значителна възпроизводимост на аналитичните данни и ефективност на йонизация на аналитите ~ 100% при изследване на биомакромолекули. Като средна ефективност се посочва 96% йонизация на аналитите в зависимост от конкретния клас съединения. Количественото определяне на пептидите, например, показва r2=0.98991–0.98747. Енергията на междумолекулните взаимодействия може да бъде получена и в рамките на МПЛДЙ-МС експеримент. За разлика от ЕСЙ-МС метода, който анализира химичните съединения в разтвор, МПЛДЙ-МС анализира веществата в твърдо състояние. Областите на приложение на аналитичната масспектрометрия в съвременната наука обхващат аналитичната химия и екохимията, радиохимията, клиничната диагностика, нефтохимията, лабораторната медицина, биохимията, медицинската химия, дизайн на лекарства и разработване на нови ефикасни медикаменти, съдебна химия и медицина, криминалистиката и съдебно медицински експертизи изготвяни с правни цели, фармация, токсикология, ядрена криминалистика, хранителни технологии, селскостопански науки, геология, археология, химия на природни съединения, и др. МС методи за молекулно определяне, отнасяне и количествен анализ се прилагат в т.н. метаболомикс (m/z 50– 1500), протоемикс, липидомикс; хранителен-омикс, стероиден-омикс, гликомикс, омикс9 единственият в момента разработен метод за получаване, на както еднозначна количествена така и 3Д структурна информация за изследваните химични съединения, като еднозначността на анализа обхваща, както изолирани аналити в лабораторни проби, така и аналити в сложни многокомпонентни системи от проби от околната среда, търговски материали, хранителни проби и биологични течности. Така, основата цел на дисертационния труд е да покаже, че новият метод е високо прецизен, еднозначен, благонадежден, и емпирично тестван, което го прави перспективен новаторски подход в съвременната аналитична наука с широко потенциално приложение, както в гореспоменатите области на науката и технологиите включително и индустрията, a така и в много сфeри на социалния живот и културата. 3. Стохастично-динамична масспектрометрия - теоретични основи Стохастично-динамичната масспектрометрия се основава на моделни уравнения (1) и (2) като уравнение (2) е производно на уравнение (1). Емпирично бе доказано, че те са валидни за данни от йонизационни методи базирани на електроспрей; химична йонизация при атмосферно налягане; фото йонизация]; матрично подпомагана лазерна десорбция и йонизация; тандемен масспектрометричен анализ, както при положителна, така и при отрицателна полярност на средата. Показаната схема е валидна, както при обработка на данни от хибридни методи включващи както газова (ГХ), така и течна (ТХ) хроматография. Приложима е и към данни от директен MС анализ. Параметърът ‚D‘ обозначава стохастично-динамичен дифузионен коефициент, а ‚I‘ - експериментален интензитет на MС пик от молекулен йон, йон-радикал, или йон-продукт на ферментиране на i-тия йон или йон-радикал на аналита в хода на MС експеримент. Аi е статистически параметър. Eдна от основните цели на дисертацията е да подчертае новостта на метода в областта на аналитичната масспектрометрия и онези негови предимства, които са важни в дебатите свързани с ефективността на методи за определяне на количествените и структурни данни от химичния анализ. Ефективността определя и достоверността на аналитичната информация. Логическата схема на дисертацията съпоставя данни от новия метод с тези, получаващи се от конвенционалните MС методи за обработка на данни от измервани величини и приложимостта им при изследвания определящи 3Д молекулна структура на аналити. Представени са и основните концепции довели до написването на уравнения (1) и (2). Подчертава се факта, че се представя напълно нова методология, която значително се отличава от налични методи за количествен и структурен анализ, базирани на MС измервания. Концептуално, стохастичнодинамичната масспектрометрия е напълно нов подход за количествен и структурен анализ на веществата, както за аналитичната химия, така и за аналитичната 1 масспектрометрия. Mетодът е не само напълно новаторски, но прилагането му досега показва, че той е и единствения еднозначен метод за обработка на данни от масспектри. Основната концепция на метода е, че третира параметрите от MС експеримент m/z и интензитет на наблюдаван пик като случайни величини (Фигури 2 и 3.) Фигура 1. Схематично представяне на изследователските задачи (I–VII) и формули за изчисляване на DSD стойности съгласно стохастично-динамичната концепция; измерен спектър (горна фигура), съдържaщ информация за общия интензитет на йони (Itot, [условни единици]), който се сумира в случая за цялото време на сканиране (t =  = 17–30 минути); задачи I и II: определяне 1 на времевото разпределение на абсолютния интензитет Ii за i-ти кратък интервал от времето на сканиране t [минути]; задача III: определяне на средния интензитет за i-тия йон измерен в рамките на i-тия отрязък от време; определяне на параметър на дисперсията 2 и lnP1; задача IV: получаване на функционална зависимост (I–<I>)2=f(t)); задача V: апроксимиране на зависимостта (I–<I>)2=f(t) със SineSqr функция и хемометрична оценка на степента на достоверност; определяне на параметър “Ai”; задача VI: определяне на параметъра на дисперсията ’2; задача VII: определяне на параметъра DiSD [cm2.s-1] за i-тия интервал от време на измерване съобразно уравнение (1); данните по уравнение (2) се получават в рамките на задача III; данните по уравнения (3)–(5) се получават от квантово xимични пресмятания на йони; данните по уравнение (5) се получават отново при изпълнение на задача III, обработвайки масспектри при различни експериментални условия. (Използването на експериментални файлове -CD.raw и rb01.raw следват резултатите от показаните реализирани изчислителните задачи). Фигура 2. Общ йонен поток спрямо времето на сканиране [минути]; интензитет на пик спрямо времето на сканиране [минути] и масспектри на алфа-циклодекстрин (-ЦД) и нуклеозиди получени от ЕСЙи МПЛДЙ-МС измервания. 1 Фигура 3. Времево разпределение на m/z-стойности от йони на резерпин при m/z 608, 609 и 626 при съответни концентрации на аналита в изследваните разтвори 03–05; sd(yEr) – стандартно отклонение; и se(yEr) – стандартна грешка на измерените параметри [165][p13]. Представените на Фигура 1 спектри са класически начин за изобразяване на данни от MС анализ в координати m/z като функция от интензитета на наблюдаваните пикове. Посочените параметри са усредени за йоните на аналита в хода на измерването. Те могат да бъдат представяни и в тяхната времева поява в хода измерването като тримерна функция от m/z, интензитет и време на сканиране (Фигури 2 и 3). Стохастично-динамичният подход третира времевото разпределение или еволюцията на експериментални параметри от МС експеримент като случайни променливи. В рамките на теорията на случайните променливи и нейното приложение в области на физичните науки, законите включващи се в теорията на вероятностите се разбират в контекста на т.н. честотна интерпретация. Тя се прилага за определен тип експерименти, при които са възпроизводими при привидно еднакви експериментални условия. Например, експерименталните данни за -ЦД показват интензитети на пиковете на йони при m/z 252, 274, 279, 280, и 313 измерени при четири виртуално еднакви условия на експеримент E1, F1, C1, и D1, които са взаимно линейно асоциирани и показват r=0.99446 и 0.99584. С цел да се изведе модално уравнение, което да има капацитет да предсказва и описва еднозначно времевото разпределение на тези МС наблюдавани феномени е използвано модифицирано уравнение основано на метода на Бокс и Мюлер (1959) (уравнение (A1); 1 Фигура 4). Уравнението (A2) може да се изрази чрез уравнение (A3), където ‘x’ обозначава случайна величина и нейната средна стойност <x> за даден интервал от време (t). Параметрите Р1 и Р2 са случайни числа, а 2 e статистическа дисперсия или вариационен коефициент. Използвайки уравненията за трансформация на случайни величини, статистическата дисперсия може да бъде представена, както посредством равенство 2=<x2>–<x>2 така и чрез уравнение 2=<(x–<x>)2>. Фигура 4. Използвани уравнения. Следователно, ако измерваната величина (интензитет на пик) е описана като случайна променлива, тогава x=I. Експерименталните MС данни могат да се представят като функционална зависимост (I–<I>)2=f(t) (Фигура 5), а уравнение (A2) се запише като уравнение (A3). В рамките на системни изследвания се доказа, че lnP1 =–17.0533(7), т.е. lnP1 е константа за MС величина интензитет на пик на йон на химично съединение за всеки интервал от време t в рамките на измервания на масспектри от различни йонизационни методи и класове химични съединения. Представените в дисертацията данни са само част от общия брой емпирични доказателства на последното твърдение, които могат да бъдат проследени в литературата. Посочените данни илюстрират валидността на твърдението като разглеждат примери от наши измервания (98 %) и примеpи от измервания от други автори (2 %). Така, константната стойност lnP1 = –17.0533(7) е потвърдена и в контекста на между лабораторно валидиране на данни от МС измервания (Таблица 1). Независимо, от факта, че както и включените данни в дисертацията така и тези, посочени като допълнителна литература обхващат предимно обработка на данни от вътрешно лабораторни измервания, в рамките на няколко работи прилагащи уравнение (2) за анализ на масспектри измервани от други автори, отново се потвърждава дискутирания факт. Поради ограничения обем на дисертацията не могат да бъдат разглеждани всички 2 емпирични факти, но може убедено да се твърди, че уравнение (1) е универсален масспектрометричен закон с подчертан методологичен принос. Теоретичното приближение, че функционалната зависимост (I–<I>)2=f(t) може да бъде описана със SineSqr функция дава възможност да напишем A=–2’2.lnP1 като параметрите 2 и 2’ са независими. Фигура 5. Функционална зависимост (I–<I>)2=f(t) на интензитет (I [условни единици]) спрямо даден интервал от време за сканиране (t [s]) (a); крива, апроксимирана посредством функцията SineSqr (b) и описваща функционална зависимост от МС данни за йони при m/z 217 и 433 на поли(млечна киселина) (ПМК) от проба PLA_01; хемометрия. Таблица 1 Данни за експериментални масспектрометрични измервания на m/z и интензитет (I) на пиковете [условни единици] нa проба PLA_01 от чаша за еднократна употреба от ПМК от ферментирало царевично нишесте в рамките на номерa на сканиране 1000–1003 (RT=13.75–13.78 мин.); статистика; параметри на уравнения (1) и (2). Скан m/z I m/z I m/z I 1000 145.05089 482.91734 217.07353 894.8547 289.09665 608.79206 1001 145.05089 446.91734 217.07353 977.8547 289.08923 469.79207 1002 145.05089 544.91734 217.07353 646.8547 289.10406 373.79205 1003 145.05089 485.91734 217.07353 1098.8547 289.09665 484.79206 Mean 145.05089 - 217.07353 - 289.09665 - sd(yEr±) 0 - 0 - 0.00605 - sd(yEr±) 0 - 0 - 0.00303 - <I> - 490.16734 - 904.6047 - 484.29206 <I>2240264.021 - 818309.663 - 234538.799 <I2> - 241498.712 - 845716.855 - 241519.05 <I2>–<I>21234.6907 - 27407.1913 - 6980.25078 <(I–<I>)2> - - - 27407.1875 - - lnP1- - - 17.053204- - D"SD - 3.26.10-14 - 7.23.10-13 - 1.84.10-13 В рамките на теорията на случайните променливи, под променлива “х” се разбира всяка величина, която може да бъде измерена. Вариацията на величината не може да бъде предсказана еднозначно. Tова важи и за промяната в интензитета на н-тия пик на аналита в хода на измерването. Такава променлива се нарича случайна такава. 2 Невъзможността да се определи еднозначно стойността на измерваната величина във всеки момент от време “t”, налага използване на вероятностна функция на плътността описваща “х” във всеки един момент “t” от измерването, като времевият интервал (t) може да бъде произволен. В този случай, теоретичното моделиране на времевото разпределение на измерваната величина включва моделна функция, която генерира случайни числа. Една такава функция е именно посоченият по-горе метод на Бокс и Мюлер (1959), който е точен стохастично-динамичен модел. Тоест, моделът предсказващ MС експеримент трябва да описва еднозначно както наблюдаваната зависимост (I– <I>)2=f(t) или времевото разпределение на величината, така и нейната динамика за всеки йон на всеки аналит измерен във всеки интервал от време (t). Доколкото стойността на измерения интензитет на пика в момент t не може да бъде определен въз основа на данни от стойността в предходен момент от време t, то функционалната зависимост (I– <I>)2=f(t) от МС параметри може да бъде причислена към т.н. стохастични процеси имащ свойство на Марков. Методологични разработки в областта на математическотo моделиране и описване на комплексни системи с пренос на маса основани на т.н. еволюционни уравнения са показали, че независимо от факта, че повечето природни процеси могат да бъдат описани с нормално или Гаусово разпределение на вероятностна функция на плътността, то това описание е в повечето случаи приблизително. За голям брой реални системи е установено, че се наблюдават аномалии в динамиката на системата. Средната стойност на квадрата на случайната величина (<x2>) е пропорционалнa на a, като коефициентът на пропорционалност K е наречен обобщен дифузионен коефициент. Доколкото, параметърът <x2> определя флуктуацията на частиците във всеки интервал от време t, то дифузионният параметър е количествена мярка за времево-пространствените колебания на случайната величина. Коефициентът “” е наречен аномален дифузионен експонент. Размерността на този коефициент е [cm2.s-]. Много природни явления се характеризират с коефициенти 0<<1. Сред най-опростените линейни стохастични еволюционни уравнения от Марков тип е това на Орнщайн-Уленбек, описващо функционалната зависимост на случайната величина и флуктуацията или шумът като функция от времето. В рамките на този модел 2’ = 22.D. Използвайки приближението на Айнщайн за параметъра = 3.10-8 за случай на =1, то уравнение (A3) може да се запише като уравнение (A4). Доколкото lnP1 е константа, то последното уравнение води до уравнение (1). Kогато се отчита и динамичната грешка от измерването, то <x2> придобива вида: <x2>=2Dnt + 22–4DRt, където R отчита динамиката на грешката от измерването (0<R< ¼). Необходимо е още и да се отбележи и зависимостта на отношението сигнал-към-шум като функция от коефициента на дифузия и статистическа дисперсия. Квадратът на съотношението сигнал-към-шум се дефинира като <D2>/D2. 2 Kомплексността на функцията (I–<I>)2=f(t) често поражда отклонение от |r|=1 при напасването на експерименталната зависимост с данни от приложената SineSqr функция. Решение на този проблем е получено чрез опростяване на уравнение (1) като е предположено, че A2.<(I–<I>)2 >. Така, уравнение (1) е записано като уравнение (2), което е експериментално доказано еднозначно уравнение валидно при количествено и структурно MС определяне на аналити. Еднозначното определяне на 3Д структурата на молекулите посредством уравнение (2) се извършва като се оценява хемометричнo степента на асоциация между параметрите от уравнения (2) и (3) (зависимост D”SD=f(DQC)). Прилагането на метода за определяне на 3Д структура на нискомолекулни съединения показва |r|=0.99994 (Таблица 2). Параметърът DQC може да бъде получен посредством прецизни квантово-химични пресмятания и отчита енергията на молекули и изотопомери. Какви предимства спрямо другите методи предлага уравнение (3) в структурния масспектрометричен анализ? При т.н. изоенергетични системи разработвани модели не могат да бъдат прилагани. Уравнение (3), обаче, включва данни за трептенията на молекулите в основно и преходно състояние (i0, is). Параметърът H отчита изменение на енталпиятa на процеса; R e универсална газова константа, а Т отчита температурата. Получаващата се информация е уникална по отношение на дадена молекулна и електронна структура на аналитите. Tя може да бъдe потвърдена чрез независими както теоретични, така и експериментални методи и техники за анализ като фотоелектронна спектроскопия, инфрачервена или Раманова спектроскопия, спектроскопия основана на вибрационен кръгов дихроизъм и т.н. Структурните данни от MС експеримент получени в рамките на статистическата зависимост D”SD=f(DQC) могат да бъдат потвърдени чрез независим експеримент основан на различен физични феномени. Уравнение (4) използва приближения <I2> > <I>2 и D”SDDQC. Оскъдните приложения досега на уравнение (4) дават |r|=0.99922–0.99 при корелация между теория и експеримент или между ITheorSD и ITOTav данни за аналитите. Неговата надеждност за определяне на синтетичен полимер показва |r|=0.99998. В рамките на концепцията на стохастично-динамичната масспектрометрия бяха моделирани няколко функции, отчитащи ефект на експериментални параметри върху MС интензитет на йони на аналита. Нека разгледаме първо модели отчитащи влияние на енергия на сблъсък (ЕС) [eV] и обем, влят със спринцовкатa в апарата [μL]. Използвайки отново трансформация на случайни величини уравнение (2) за две стойности (m и l) на експериментални параметри може да бъде записано като ураванениe (5) като сумирането на дифузионните параметри изразено като DSDl,m e по интензитетите на йони на продуктите на MС реакция. 2 Таблица 2 Показатели на ефективност постигнати при прилагане на уравнения (1) и (2) за целите на количествения и структурен масспектрометричен анализ Аналит m/z Метод Функционална зависимост Проба D”SD=f(CPA#) ITOT=f(CPA) D”SD=f(c) ITOT=f(c) CPA=f(c) |r| Стероиди (1)** ХЙАН Лаб. 0.983820.9922–0.9774 0.999510.99985–0.9919 345 0.96987 0.9838 0.95962 (2)** 0.99994–0.9945 0.9998–0.992 109 0.990380.97208 0.996920.96616 171 0.975160.90741 0.955740.93287 313 0.998550.99756 0.998450.99769 (3)** 0.945830.99798 (4)** 0.99999–0.9758 Флавоноиди ЕСЙ Лаб. 0.999 0.998750.999640.875020.99961 Никлеозиди МПЛДЙ Лаб. 1–0.99978 Резерпин ЕСЙ 0.99994–0.9315 0.999–0.8215 Метронидазол ЕСЙ Урина 1–0.9984 0.9947–0.9811 d3-Парацетамол ЕСЙ Ок.ср. 0.99991 BAC-C12 ЕСЙ Ок.ср. 0.99991 0.98745 BAC-C14 ЕСЙ Ок.ср. 0.99188 0.99223 Карбамазепин ЕСЙ Ок.ср. 0.99962 Аналит m/z Метод Функционална зависимост Проба D”SD=f(ITOT) D”SD=f(tirr) ITOT=f(tirr) D”SD=f(DiSD) D”SD=f(DQC) |r| Стероиди ХЙАН Лаб. (1)** 0.9977–0.7444 0.99967–0.94987 345 0.91986 (2)** 0.9047 109 0.97737 171 0.74262 313 0.99237 (3)** 0.99998–0.981 0.989 (4)** 0.7551–0.6352 0.942910.9955–0.9906 Метронидазол ЕСЙ Урина 0.99843 1 Флавоноиди ЕСЙ 1–0.7008 0.9878 Никлеозиди МПЛДЙ 0.99971–0.9902 1 1–0.99988 2 Резерпин ЕСЙ 0.99978 Амитриптилин ЕСЙ Ок.ср. 0.99999 Триадименол Фот.йон. Ок.ср. 0.999130.9961–0.9701 0.99996–0.9903 d3-Парацетамол ЕСЙ Ок.ср. 1 Лабеталол ЕСЙ, ХЙАН Лаб. 0.99978 Пропранолол ЕСЙ Ок.ср. 0.99165 Бензалдех. Бенз. киселини ЕСЙ, ХЙАН Лаб. 0.99673* ПЕА ЕСЙ Лаб. 0.97527 КБП ЕСЙ, ХЙАН Лаб. 1–0.99978 Пиперазини ЕСЙ, ХЙАН Лаб. 0.96049* H-Trp-Trp-OH ЕСЙ Лаб. 0.95575* [CuII(Gly)2]0ЕСЙ Лаб. 0.96672 0.9833* [AgI(Бад.кис.)]nЕСЙ Лаб. 0.99367* [CuIIG5] ЕСЙ Лаб. 0.98068* [AgIG5], [AgIG6] ЕСЙ Лаб. 0.99332* Флавоноиди ЕСЙ Лаб. 1–0.99981 ZnII-solvates ЕСЙ Лаб. 0.93589* ZnII-solvates ЕСЙ Лаб. 0.96767–0.89839 Синт. полимер ГХ–МС Лаб. 1 Биоразградим полимери ГХ–МС Ок.ср. 1 ГХ–МС Ок.ср. 1 *Използван модел: уравнение (1) **Обозначението на аналитите е съобразно публикуваните работи #Интегрирана площ под хроматографски пик 2 Фигура 11. Функционална зависимост D”SD=f(DQC) на D”SD параметри на уравнение (2) на пикове на CLP_58 в зависимост от ХЙАН-МС данни за T=450oC и DQC стойности, получени посредством молекуло-динамичния метод на Борн-Опенхаймер на катиони в зависимост от позицията на протониране (протомери CLP_58_312 и CLP_58_312_a); химични диаграми на протомери; хемометрия. 3.1. Приложение на стохастично-динамичния масспектрометричен метод за количествен анализ Основната тема на този подраздел е прилагането на уравнение (2) за еднозначно количествено определяне на аналити в кондензирани състояния посредством масспектрометрия. Класическата концепция за количествен анализ почива на съпоставянето на усреднени данни за интензитета на МС пик на йон на аналит в рамките на времето на измерване на съединението в присъствието на вътрешен стандарт (ВС) и концентрацията (с) на аналита в разтвора. Хемометричната оценка на зависимостта ITOT=f(c) определя и степента на асоциация между съпоставяните параметри. Двусмислеността на аналитичните данни или грешката от анализа са съгласувани с критериите за достоверност на аналитични резултати съгласно Решение 2002/657/ЕО на Европейската Комисия. Научната обосновка и моделни линейни уравнения са рутинно използвани в аналитичната химия. Линейният калибровъчен модел е емпирично доказан. За да се подчертаят съществените отлики между класическият метод на калибровъчна графика в координати ITOT=f(c) и уравнение (2), което приложено към количествения анализ включва хемометрична оценка на функцията D”SD=f(c) дискусията е фокусирана върху обсъждане ефективността на двата подхода в рамките на общо прилаганите хемометрични параметри като количествени критерии за оценка на съпоставимост на бази данни от химичния анализ. Подбраният набор от представени изследвания от други автори използват линеен калибровъчен модел в присъствието на ВС и количествено определяне на главно нискомолекулни съединения в смеси от храни, проби от околната среда или биологични течности. Дискусията предлага оценка на ефективността на класическия линеен калибровъчен модел за количествени цели при определяне на лекарствени препарати. В тази връзка, количествената концепция базирана на уравнение (2) или функционална зависимост D”SD=f(c) не включва като задължителна стъпка от анализа 32 използване на вътрешен стандарт. Това е едно основно преимущество на метода наред с другите такива, които ще бъдат последователно подчертани и илюстрирани в хода на представянето му по-долу. Методът генерира еднозначни данни без или посредством използване на вътрешен стандарт. Един съществен проблем при използване на класическия подход за количествено определяне на веществата е, че често липсва подходящ вътрешен стандарт. В идеалния случай, ВС трябва да отговаря точно на анализираното съединение. Реално, обаче се използват структурно сходни съединения, чийто времена на задържане не се припокриват с тези на аналитите. Разликата в молекулните структури на изследваното съединение и ВС, обаче, определят и различното поведение на веществата по време на етапите на подготовка на пробата за анализ, което повлиява на техните измервани параметри и съответно на съотношението между интензитета на йона на аналита и този на ВС. Определянето на филирин и негови метаболити в биологични течности посредством ЕСЙ-МС/МС в рамките на ЛДДК на определяемото вещество 1.250–1250 ng.(mL)-1 и 1.250–1250 ng.g-1 показва r=0.9990– 0.9997. Анализът на нискомолекулни съединения (НМС) в гранули от Yiqi Jiangzhi показва r=0.9990–0.9999 в рамките на ЛДДК 15.92–159.20 ng.(mL)-1. Количественото определяне на мелатонин в клетъчна култура води до r=0.9984–0.9985 (ЛДДК 0–2.7 g.g-1). Анализът на 64 нуклеозиди в биологични проби показва r=0.9954–0.9997 (ЛДДК 4.88–2500 nmol.L-1). Данните за рицин в напитки води до r=0.994–0.999 (ЛДДК 0.5–300 ng.(mL)-1). Изследването на канабиноидни алкалоиди в масло показва r2=0.9931–0.9982, сумирайки съотношението на площта на пиковете на йони m/z 316, 348 и 361 и m/z 313, 345 и 358 на (-)-Δ9-транс-тетрахидроканабинол в присъствието на канабидиол и канабинол. Отлични резултати от прилагане на линейно калибровъчия модел са получени и при количествено определяне на аминогликозиди във фармацевтината практика (r2=0.9968–0.9997). Доколкото, обаче, тези резултати показват отклонение от r=1, а и са получени значителни стойности на стандартното отклонение за действителната стойност на измерената величина (sd(yEr)), то анализите не биха могли да се класифицират като еднозначи. Количественият анализ на смеси от таблетките от Hu Gan  традиционна медицинска смес в Китай  чрез високоефективна течна хроматография–MС/MС показва еднозначен коефициент на определяне на компонентите, т.е. r2=1, но само в 16.7 % от анализираните проби. Към недостатъците на така разработения протокол трябва да се отнесе ниската му ефективност показваща r=0.9642. Докато, данните от количественото определяне на метронидазол (Фигура 12) в урина посредством уравнение (2) и то, обработвайки резултати от директен ЕСЙ-МС/МС анализ (Фигура 13) на клинични проби без допълнителни етапи на предварителна обработка на пробата и използване на ВС показват r=1 и sd(yEr)=0 от хемометрична оценка на зависимостта D”SD=f(с) в рамките на ЛДДК 1–50 g.(mL)-1. Този еднозначен резултат е получен в хода на анализ на интензитета на пика на аналита при m/z 172.04081. Данните в 33 работата включват и анализи на пикове при m/z 171.0998, 172.0718, 172.04081, 213.1463, 181.072, и 151.1114 от аналитa. В рамките на класическия подход, оценяващ зависимостта ITOT=f(c) се получава заниженa ефективност (|r|=0.99395–0.99404). Фигура 12. Химични диаграми на молекулни йони, и продукти на фрагментиране на метронидазол в зависимост от протолитните взаимодействия на аналита. Фигура 13. Масспектър на метронидазол. Имайки предвид факта, че е използвана точна МС апаратура за клиничен анализ, полученото понижаване на хемометрични параметри като точност, чувствителност и ефективно разделяне на определяемото вещество от останалите компоненти в пробата, както при анализа на метронидазол, така и при други количествени определяния на медикаменти и техни метаболити в биологични проби посредством класическите методи 34 за количествен анализ се обясняват с т.н. ефект на масата на пробата или матричен ефект на пробата, който води до флуктуация на екстензивното свойство интензитет на пик на йон на аналитa. Този ефект е наблюдаван и в МС спектрите на метронидазол, показващи вариация в хемометричните параметри на аналита в урина при многократни измервания на всяка проба в рамките на серия от разтвори с различни концентрации на веществото. Най-ниско съответствие между данни от МС параметри от измерване на метронидазол в урина са получени в проба съдържаща 25 mg.(mL)-1 от аналита при три измервания на пробата. Тези колебания на измерваните параметри са в основа на сравнително ниската ефективност на класическия количествен подход за анализ основан на измерване на общия интензитет на йон в рамките на цялото време на измерване. Измерените масспектри се характеризират със значителен шум. Независимо от измерения шум в масспектъра на определяното вещество данните получени посредством прилагането на уравнение (2) за обработка на данни показват, че точността на количественото определяне не е свързана с точността на МС измерване, която е много висока такава, а се определя до голяма степен от теоретичния модел по, който се извършват пресмятанията свързващи стойността на екстензивното свойство, което се измерва (МС интензитет на пик) и концентрацията на веществото в разтвор или твърдо състояние в зависимост от използвания метод за йонизация на химическите съединения. Следователно, еднозначното определяне на количеството и структурата на аналита налага използването на метод, който обработва и данните от шума и флуктуацията на измерваните пикове. Tози метод почива на прилагане на уравнение (2) при обработка на данни от MС анализ. Уравнение (2) е първият разработван модел за интерпретиране и предсказване на масспектри на аналити третиращ количествено флуктуациите на измерваните екстензивни свойства, при това при произволно избрани времена на измерване. Уравнение (2) е валидно за всеки произволно избран интервал от времена на измерване на масспектрите. Както, например, показват данните от анализа на йони на - ЦД при m/z 279, 274, 252, 259, и 313, отношението на интензитетите им в рамките на различни времена на измерване е взаимно свързано в линейна зависимост, показваща r=0.99403. Флуктуациите в експериментално измерените параметри, обаче, много често предоставят аналитична информация за различните химични форми на аналита. Контекстът на понятието химична форма тук включва, както тавтомерни форми свързани с електронни ефекти на локализация, респективно, делокализация, така и продукти на протолитни взаимодействия, които дори в случая на малка молекула като метронидазол може да стабилизират серия от катиони или катион-радикали. Mогат да се посочат още продукти на вътрешномолекулни превръщания или форми стабилизирани в резултат на ефекти на пренос на заряд. Тези химични форми на аналита притежават серия от характеристични пикове, чийто интензитет може да варира в граници съизмерими с флуктуациите на 35 измерваните екстензивни свойства особено обработвайки данни от следи от аналити. Така, основното преимущество на уравнение (2) е, че не само предотвратява загубата от аналитична информация като обработва данни от флуктуацията на параметри, но съвместното прилагане на уравнения (2) и (3) води до еднозначното идентифициране и 3D структурен анализ на тези различни форми. Съгласно хемометричните критерии за оценка на ефективността на даден аналитичен метод, посочените по-горе преимущества на уравнение (2) определят и способността му за еднозначно количествено и структурно определяне на аналита като повишава както селективността, така и специфичността на масспектрометрията. Още повече, както показват данните от приложението на уравнение (2) за анализ вещества посредством различни йонизационни методи, то е валидно в рамките на серия от досега тествани методи и то, тези, сред най-често използваните в аналитичната практика. Последният факт дава възможност за верифициране на данни за аналити измерени при различни условия на йонизация на изследваното вещество в рамките не само на вътрешнолабораторен, но и на междулабораторен анализ. Постигнатите еднозначни и достоверни хемометрични параметри посредством прилагането на уравнение (2) при обработка на данни от количествения анализа на метронидазол в биологичнa течност (Фигура 14) от клиничната практика, както и тези от други анализи (Таблица 2) са, може би, най-добрата оценка за преимуществата и ефективността на метода сравнявайки получените резултати с тези на други автори използващи класически количествени подходи за обработка на данни от MС измервания. Акцентът върху резултатите от анализ на метронидазол в урина, обаче, е основен не само поради наличие на съществен матричен ефект на пробата, но и поради факта, че молекулата се характеризира с набор от протомери, разични цвитерйони, и тавтомерни форми. Hезависимо от простотата на молекулата тя е нетривиален изследователски обект от гледна точка на електрони електронни ефекти и тавтомеризъм. Bсяка от тези форми се характеризира със специфична стойност на енергията, а последният параметър, както стана ясно в хода на изложението е директно свързан с интензитета на MС пикa на йонa на аналита. Интерпретацията на MС данни и отнасянето на отделните молекулни форми към наблюдаваните статистически различни пикове е нетривиална изследователска задача  задача, която, обаче, е решена еднозначно посредством прилагането на уравнение (2). 36 Фигура 14. Корелативен анализ между данните от D”SD [cm2.s-1] за йон при m/z 172.072 и 172.041 по отношение на общия интензитет (ITOT [условни единици]) на пика при m/z 172.042, взет за всяка аналитична концентрация [41][P8]. Тук, би могло да се добави и факта, че при прилагане на формула (2) при определяне на смеси от стероиди отново бе постигнат еднозначен анализ в контекста на хемометрични количествени критерии за оценка на ефективност на метод показващ |r|=1–0.99994 (D”SD=f(с)). Независимо от това, че анализът на стероиди включва количествени определяния на лабораторни смеси, поради общият им молекулен структурен фрагмент, а именно 10,13-диметил-1,2,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекахидроциклопента[a]фенантрен-3-он (Фигури 15–17) се характеризират често с виртуално идентични масспектри и сходни продукти на фрагментиране, което затруднява тяхното еднозначно определяне, както в лабораторни смеси така и в биологични проби или проби от околната среда. 37 Фигура 15. Химична диаграма на общия структурен фрагмент на стероиди и характеристични йони. Също така, в зависимост от експерименталните условия много често спектрите на стероиди се характеризират със значителен шум. Както в случая на метронидазола, шумът възпрепятства достоверното интерпретирането на данни особено на пикове характеризиращи се с нисък интензитет посредством конвенционалните методи за анализ на масспектри, които включват методът на базовата линия. Така се губи аналитична информация от флуктуации на измервани величини от различни форми на аналитите, както беше споменато в предишните параграфи. В контекста на анализ на стероиди, като това важи и за анализа на въглехидрати, както ще видим по-долу, трябва да се отбележи, че поради виртуалната идентичност на спектрите, които допълнително се характеризират с нисък интензитет на пика на съответния протомер от аналита, който, де факто е определящ при селективното определяне на смеси. За случаите на стероиди (1)–(4) това са пиковете при m/z 363, 331, 315, и 303. 38 Фигура 16. Хроматографски данни и масспектри на смес от стероиди (проба Д): хидрокортизон (1), дезоксикортикостерон (2), прогестерон (3) и метилтестостерон (4). 39 Фигуре 17. Масспектър на метилтестостерон (4); химични диаграми на фрагментационни реакции на аналита. Валидността и еднозначността на количествените и 3D структурни определяния на стероиди в смеси получени посредством уравнение (2) са потвърдени и от паралелен хроматографски анализ показващ |r|=0.99999 при оценка на съпоставимост на коефициентите от уравнение (2) с площта под хроматографския пик на аналита в зависимост от неговата концентрация (D”SD=f(CPA)). 40 Дискутирайки отличните коефициенти (r=0.99999–0.99994) на ефективност постигнати при количествено определяне на смеси на стероиди посредством уравнение (2) (Фигура 18) при нива на ЛДДК [ng.(mL)-1] трябва да се подчертае, че получените резултати са забележителен прогрес за количествената масспектрометрия. Данните от хроматографския анализ показват r=0.9757. Фигурa 18. Корелативна зависимост между данните от масспектрометричния коефициент от уравнение (2) D”SD [cm2.s-1] от йони на прогестерон (3) при m/z 279, 171 и 109 в разтвор спрямо концентрацията [ng.(mL)-1]; хемометрия. Отлични резултати (|r|=0.99994) са получени и при анализ на резерпин, отново при оценка на съпоставимост на параметрите от уравнение (2) и тези от площта под 41 Фигура 25. Корелационен анализ между усреднени данни за общият интензитет (IAv.Sum. [условни единици]) на йона на карбамазепиновия протомер [M+H]+ при m/z 237 в проби от отпадни води в зависимост от концентрацията на аналита [ng.mL-1] (A); функционална зависимост D’’SD=f(c) на параметъра на уравнение (2) спрямо концентрацията на аналита [ng.mL-1], разглеждайки променливите на пика [M+H]+ при m/z 237.18599±0 (B); или сумираните данни за интензитета на пиковете при m/z 237.18599±0 и 237.05598±0, като по този начин се определя количествено йонът при m/z 237.16432±0.05307 (C); хемометрия. Акцентът върху дискутираната работа, обаче, не се състои само върху отличните хемометрични параметри получени при прилагането на уравнение (2), каквито са постигнати в значителния брой от показаните в Таблица 2 анализи. Преимуществото при използване на уравнение (2) е свързано с факта, че параметритe са получени при анализ на системи, характеризиращи се със значителен матричен ефект на пробата, каквито, както е посочено по-горе, са всички проби от околната среда. Той се състои в повишаване или понижаване на интензитета на пиковете на изследваните съединения под влияние на ефекта на матрицата на пробата, като е установено, че това влияние може да е различно върху пиковете на аналитите и тези на ВС. Доколкото, интензитетът на пиковете на изследваните съединения и този на ВС се използват за количествен анализ, ефектът на матрицата на пробата оказва директно влияние на хемометричните параметри от количествените определяния, защото се променят значително ефективността на 48 йонизация на аналитите при разработването на съответните MС протоколи. Грешката в измерванията поради матричните ефекти на средата, следователно е задължително да бъде определена при всяка изследвана проба с цел да се постигне достоверно определяне на аналитите. Поради наличие на матричен ефект би могло да се получи значителна грешка при оценка на селективността и възпроизводимостта на метода. Основният проблем е, че механистичните аспекти на матричните ефекти на молекулно ниво все още не са напълно изяснени. Доколкото йонът на аналита взаимодейства с компоненти на матрицата на пробата и това взаимодействие е свързано с комплексна серия от реакции на пренос на заpяд и протониране, то скоростта на тези процеси зависи от йонизационната енергия и протон-акцепторната способност на аналитите, която както е известно е тясно свързана с молекулната и електронни структури на аналитите. В контекста на целите на настоящата дисертация е очевидно, че матричният ефект ще е различен върху аналитите и химичните съединения използвани за ВС, а така също и в зависимост от компонентите на матрицата на пробата, които също варират драстично при проби от околната среда. Независимо от този факт, с цел минимизиране на матричните ефекти аналитичната практика прилага режим на работа на МС с мониторинг на избрани реакции (МИР) като по този начин се позволява откриването само на даден от интересуващите ни аналити. Когато, обаче, анализираните съединения претърпяват химични промени в молекулната си структура, какъвто е случаят с карбамазепин и други производни от същия клас медикаменти се на наблюдават драстично променящи се стойности на измерваните MС параметри. В такива случаи, режимът на работа МИР често не може да открие и интерферира аналитите. Необходимо е да се отбележи, че неинтерферирани аналити могат да бъдат откривани и при стандартни разтвори в зависимост от концентрацията и ефекта на матрицата на пробата. Поради това, анализът често включва не само режимът на работа МИР, но и паралелен анализ с данни от MС с пълно сканиране, като определянето на изомерни съединения често се извърша и мануално. За да бъде илюстрирана достоверността на твърденията, че именно прилагането на уравнение (2) дава възможност за еднозначно определяне на посочените аналити в проби от околната среда е полезно да се дискутират и резултатите от анализ на матричния ефект в зависимост от съществуващите моделни уравнения. В тази връзка, е уместно да се отбележи, че аналитичната практика използва главно два метода за определяне на матричен ефект при MС базирани протоколи. Съгласно т.н. метод на Тислер се определя параметър MEO (%), отнасящ се до наблюдавания матричен ефект. Както може да се очаква, в изследванията на дисертанта, откликът (R) се определя не посредством тоталният интензитет на пика на аналита или абсолютни площи на пиковете, а посредством параметъра D”SD от уравнение (2) подобно на линейния модел 49 D”SD=f(c), защото, както вече беше подчертано, той отчита точно флуктуациите на измеримите променливи. Използван е и методът на Матушевски, който се прилага рутинно в аналитичната практика. Тъй като съществена част от иновативните разработки на нови теории и моделни уравнения изисква тяхното приложение към различни видове молекулни системи, както е посочено по-горе, Таблица 2 обобщава получените данни от приложение на дискутираните уравнения до този момент. Таблицата показва и данни от ITOT според концепцията на класическия подход за линейно калибриране и зависимости определени от независим хроматографски анализ използващ интегриране на площта на пиковете на аналитите като се прилагат няколко алгоритми. Както се вижда от данните в 90.9 % от случаите прилагането на уравнение (2) за количествено определяне на аналити води до драстично подобряване на ефективността на МС метода като се подобряват значително не само корелационните коефициенти, но и селективността и специфичността на аналитичния протокол. Драстични подобрения на хемометричните показатели са постигнати при анализ на биоциди в проби от околната среда показващи |r|=0.99991 при определяне на аналити посредством уравнение (2) и |r|=0.98745 използвайки класическия подход за обработка на данни. Същото се отнася и за анализа на флавоноиди показващ | r|=0.99964 в резултат от използване на уравнение (2) и |r|=0.87502 — при прилагане на класическия подход. По-нататък в този подраздел ще бъде обърнато внимание на приложението на МПЛДЙМС за целите на количествения анализ на химични съединения. Методът почива на различни йонизационни феномени. Той е твърдотелен метод за анализ, прилагащ главно техники на пространствено-времево изобразяване на разпределение на веществата в изследваните проби (Фигура 26). В тази връзка, количествен анализ на показаното изображение на разпределение на аналити в твърдата фаза все още представлява голямо предизвикателство пред аналитичната наука главно поради ниската възпроизводимост на данни от изследвания на биологични проби, където методът намира централно приложение. 50 Фигура 26. 3Д данни от МПЛДЙ-МС на аналита в присъствие на матричен компонент –циано-4хидроксиканелена киселина при показаните положения на лазерния лъч върху повърхността на пробата с позиции x,y [m]; химична диаграма на матричния компонент; фотографско изображение на поликристалната проба от смес от аналит и матричен компонент (ляво); и фотографско изображение на монокристали на аналита без и при облъчване с лъчение с дължина на вълната max=365 nm (дясно). Предварително би било добре да се подчертае, че включените в дисертацията работи нямат методологичен принос към разработване на количествени подходи за определяне на пространствено-времевото разпределение на аналити в твърда фаза, което по същество е отделена подобласт на количествената масспектрометрия. Дискутираните резултати от приложение на уравнение (2) за количествено определяне на аналити от МПЛДЙ-МС измервания и получените еднозначни резултати като хемометрични показатели, обаче, показват, че стохастично-динамичния метод може да бъде прилаган успешно за целите на количествената масспектрометрия, обработвайки и данни от МПЛДЙ-МС анализи. Така се предоставя ключова информация за съединенията, както в разтвор, така и в твърдо състояние, използвайки набор от МС методи и то в рамките на прилагане на едно и също моделно уравнение (2). Това е негово допълнително преимущество за целите на аналитичната химия и аналитичната масспектрометрия. Фактът, че са постигнати еднозначни определяния на аналити посредством МПЛДЙ-МС метод и уравнение (2) е отличителен методичен принос към количествената МПЛДЙ-МС, защото като цяло се подчертава, че МПЛДЙ-МС често се характеризира с по-скоро не 51 количествен характер на измервани променливи. Това обяснява и ниската възпроизводимост на данните от многократни анализи на проби, а така също и данни от различни точки от повърхността и обема на изследваната проба. Данните за интензитета на пика зависят от ориентацията на (съ)-кристалите на матрицата и на аналита. Още повече, специфичните за МПЛДЙ-МС явления на йонизация и десорбция все още не са напълно изяснени и подлежат на дискусия. Също така, често се наблюдава драстично отклонение от линейните отношения между относителните интензитети на пиковете и концентрациите на аналита в зависимост от хомогенността на пробите съдържащи матрица-аналит. Като цяло се използват ВС, за да се преодолее недостатъка на количествената МПЛДЙ-МС в твърдо състояние. Използването на ВС, обаче, увеличава сложността на измерванията и експерименталния дизайн, който при анализ на биологични проби би могъл да е значително усложнен. В този контекст е разработена концепция за рациометрично откриване на аналити в проби, осигуряваща вградено самокалибриране. Методът, обаче, е съпроводен със значително стандартно отклонение sd(yEr)=3.35 % от съотношението на пиковия интензитет, използвано за количествено определяне на аналитите чрез МПЛДЙ-МС. Както може да се предположи при анализ на съединения с ниска концентрация в биологични проби получената стойност намалява значително ефективността на метода. Използването на маркирани с изотопи ВС води до постигане на главно полуколичествено определяне на аналити r2>0.99. Отделно, методът за маркиране на изотопи не изглежда приложим за изследване, например, на изомери на въглехидрати смеси, тъй като реакцията на маркиране на изотопи не е специфична за изомерни процес. Също така, МПЛДЙ-МС често се характеризира с ограничен ЛДДК на аналити в резултат на т.н. насищане на детектора. Постигнато е известно подобрение на възпроизводимостта на сигнала чрез оптимизиране на компонентите матрица-аналит на пробата или използване на течни матрици от йонни-течности. Aнализът е съпроводен със значителни стойности на стандартното отклонение на интензитета (ITOT) на пиковете показващи sd(yEr)=4.41, 5.11 и 10.36 %. Понастоящем, теоретичните основи на МПЛДЙ-МС явленията и свързаните с тях функционални зависимости се считат за недостатъчно добре изучени. Методологичният количествен МПЛДЙ-МС анализ в твърдо състояние е много сложна, не тривиална и трудна изследователска задача, въпреки, че самият метод се характеризира с показаните по-горе превъзходни инструментални характеристики и ефективност. Създаването на точен количествен МПЛДЙ-МС протокол за директен анализ в кондензирани фази е изправен пред набор от проблеми, някои, от които вече са „скицирани“. Представени са количествени данни за измервания при три различни експериментални условия на производни на пуринови и пиримидинови бази като аналити спрямо типа на матрицата на пробата, за да предоставим емпирични доказателства отговарящи на 52 въпроса: Влияе ли типът на матрицата върху 3D конфигурации и електронни структури на йони на аналита? Подробно MС експериментално и теоретично изследване на асоциати на пуринови и пиримидинови бази в лабораторни смеси и биологични проби, основно принос на дисертанта може да бъде намерено в литературата. Работата не e включена в настоящата дисертация поради ограничения ѝ обем. Приносите представят отново факти и аргументи в подкрепа на валидността и приложимостта на уравнения (1) и (2) за количествени и структурни MС анализи. В дисертационния труд се разглеждат основно емпирични доказателства обосноваващи 3D структурен анализ на смес от нуклеозиди (Фигура 27), използвайки матрици на проби –циано-4-хидроксиканелена киселина или 2,5-дихидроксибензоена киселина, както и данни за проби без наличие на матричен компонент. Теоретичните и експериментални резултати обхващат и изучаване на сложния механизъм на тавтомерни превръщания на нуклеозиди, тяхната способност за отдаване и приемане на протони, а така също и фини електронни ефекти, ефекти свързани с пренос на заряд, междуи вътрешно молекулни водородни връзки, молекулно прегрупиране, и др. Направен е и сравнителен анализ на MС характеристики на дискутираните аналити получени посредством ЕСЙи ХЙAН-MС методи. Този анализ, отново не е включен в настоящата дисертация, но може да бъде намерен от заинтересования читател. Изучавайки оптично-микроскопско изображение на пробите, използвани за целите на това изследване, заедно с пространствено-времевите 2Д и 3Д изображения на МПЛДЙ-MС данни е важно е да се отбележи, че при подготовката на пробата за анализ посредством смесването ѝ с матрично съединение като, например използваните –циано-4хидроксиканелена киселина или 2,5-дихидроксибензоена киселина липсва процес на съкристализация на матричния елемент и аналита. Последното твърдение е подкрепено и с резултати от рентгено-структурен анализ от монокристали, а така също и данни от инфрачервена спектроскопия. Компонентите на матрицата-аналит, обаче могат да образуват фина поликристална фаза с размер на кристала от около 10 до 15 μm. Кристалното състояние на изследваното съединение може и да не съответства на равновесното състояние на аналита в разтвор. Освен това, различни 3D конформации и тавтомерни форми на молекули и йони имат различни експериментални променливи m/z и интензитет на характеристичните им пикове в масспектрите. Въпреки, че първоначалният разтвор на аналита се характеризира с негови равновесни молекулни и електронни структури, измеримият резултат отразява косвено наблюдение на 3D молекулна конформация на съответното кристално състояние, получено поради бързото изпаряване на разтворителя от пробата. За да разберем естеството на връзките между стохастично-динамичните параметри на уравнение (2) и т.н. квантово-химичната дифузия съгласно уравнение (3) трябва да задълбочим знанието си и разбирането си за прехода 53 течна фаза  твърдо състояние на аналитите по време на техниките за подготовка на пробата за МПЛДЙ-МС измервания, заедно със съответните явления на йонизация и десорбция в хода на един МПЛДЙ-МС експеримент. Разликата в 3D структурата на аналита в твърдата фаза повлиява възпроизводимостта на аналитичните данни поради лоша възпроизводимост на пробата. Резултатите от пикове при m/z 109 и 110 са обобщени в . Съответните фрагментационни схеми генериращи йони при m/z=0–300 са показани на Фигури 28 и 29. С оглед прилагане на t-тест оценяващ степента на идентичност на наборите с данни от измерванията е направена предварителна оценка на нормално разпределение на променливите, защото използването на t-тест предполага, че масивите с данни са нормално разпределени. Нормалното разпределение на измерените променливи е тествано посредством теста на Шапиро-Уилк. Така получените резултати от W-статистиката се приемат за благонадежден критерий за оценка на нормалното разпределение на променливи параметри. Както може да се види от данните поместени в измерените променливи в точки от пробата с координати x,y=1200 и x,y=1100 m са нормално разпределени, тъй като са получени големи Wстойности. Тъй като тестът не е стабилен, той се използва съвместно и с анализ на вероятностните диаграми от набори от данни от променливи. Когато точките от графиката лежат на една права, то тогава съответните променливи се приемат за нормално разпределени. Аналогичен анализ е направен и за експерименталните стойности на пика при m/z 283. Следващ етап в анализа включва оценка на разликите между средните стойности на MС променливи, както и стандартните им отклонения. Тя е направена посредством прилагане на хемометрични тестове. Много е важно да се прави разлика между хемометричните показатели в рамките на различните тестовете. Една част тестове отчитат приноса на грешката, поради фиксирания фактор на ефекта и измерването. Te отговаря на въпросa: Дали показаните разлики в m/z данни за пространствените разпределения по отношение на три показани набора от y-стойности (x;y=1200, x;y=1100 и x;y=1000) могат да бъдат обяснени със случайни грешки при измерванията? Както може да се види, липсват значителни разлики между наборите от данни от променливи или липсва случайна грешка на измерванията, засягаща прецизността или възпроизводимостта на експерименталните резултати. Сравнителният анализ между експерименталните средни стойности на m/z е извършен и с помощта на t-тест. Така, установена липса на случайни грешки при измерванията, поради разлика в използваните методи за подготовка на пробите или матричния компонент на пробата. Хемометричните данни от последния тест отговарят на въпроса: Дали анализираните набори от данни от променливи за пространствени y-точки по повърхността на пробата (x;y=1200, x;y=1100 и x;y=1000) се различават една от друга? Показано е, че стойностите са различни поради значителните стойности на стандартните отклонения на пикове при m/z 110.46045, sd(yEr)=0.24285; 110.2651, sd(yEr)=0.25344 и 54 110.43174, sd(yEr)=0.18539. Точността на МПЛДЙ-МС метода от значителна част от получените параметри за йони на аналита отчитат точност варираща от четири до първия знак след десетичната запетайка при анализ на m/z данните от измерванията. Наборите от данни от променливи определят, какво наблюдаваме като резултат от измерванията. Това, обаче не определя, какво наблюдаваме като 3Д конфигурации и електронни структури на аналитите отговарящи на измерените стойности на m/z. Доколкото резултатите от теста показват, че наборите от променливи са значително различни помежду си, то това може да означава, че тези набори от данни принадлежат към различни 3D молекулни и електронни структури на катионите на аналита наблюдавани при m/z 110. В рамките на стохастично-динамичната концепция разработена за обработка на данни масспектри показахме, че уравнения (1) и (2) използвани съвместно с уравнение (3) и така приложени към експериментални данни от ЕСЙи ХЙАН-методи имат капацитет да определят еднозначно не само 3Д молекулната конфигурация на аналита, но и фини електронни ефекти, тавтомерни форми и промяна на електронната структура, свързана с процеса с пренос на заряд. Показано е, че когато даден експеримент позволява разграничаване между m/z-стойности до петия десетичен знак, то тогава се постига абсолютно количествено определяне при sd(yEr)=0. Корелационен анализ между D”SD и DQC данни за тавтомери на апигенин, изследвайки неговите MС пикове при m/z 271.0, 271.066665, 271.1333, а 271.19998 показва |r|=0.95938. В този контекст, когато говорим за вариабилност от точка на повърхността на пробата до друга точка от същата повърхност, то тогава не може да се пренебрегне влиянието на промяната и дори смущението на 3D молекулната и електронна структури върху данните за m/z и МС интензитета, поради D”SD параметрите съгласно уравнение (2) количествено определят точно МС интензитета на пика на йона. Успоредно с това, се отразява енергията на молекулярната система чрез G-параметъра. Въпреки това, той определя уникалната 3Д молекулярна и електронна структура само на конкретна молекула. Освен това: Енергията е функционално свързана с молекулната маса чрез добре известното уравнение на Айнщайн. Последното твърдение сме доказали чрез функционална връзка между температурата, DiSD коефициента и аналитичнaтa маса, отново в рамките на стохастично-динамичната теория. Трябва да се отбележи, че получените хемометрчни данни от МПЛДЙ-МС изместват фокуса на нашето разбиране на метода като подход, използван главно за квалифициране и относително количествено определяне на анализи към стабилен инструментален метод за структурен анализ. Разбира се, може да се възрази срещу последното твърдение въз основа на факта, че променливата m/z може да бъде променена, поради експериментални грешки от използване в различни аналитични инструменти МС, тъй като променливите m/z зависят от т.н. функция за калибриране на масата, отчитаща 55 движението на йони и други параметри, зависещи от аналитичните инструменти. Трябва да се отбележи, че досега са разработени много методи за повторно калибриране. Фигура 27. МПЛДЙ-МС спектър на смес от показаните на фигурата аналити в интервал от стойности на m/z 100–270. Фигура 28. Химични диаграми на продукти на фрагментиране на катион-радикал (m/z 284). 56 Фигура 29. Химични диаграми на продукти на фрагментиране на аналита при m/z 283. Количествените МПЛДЙ-МС данни съобразно уравнение (2) касаят определяне на аналити на повърхността на пробата като разглежда хемометрични ITOT-данни за пикове на нуклеозиди при m/z 282, 283, 284, 285 и 286 по отношение на компонентите на матрицата на пробата и измервания без присъствие на матричен компонент. Получени са следните стойности: m/z 283.13601, sd(yEr)=1.71561.10-4, se(yEr)=9.905.10-5; 284.13914, sd(yEr) =1.7616.10-4, se(yEr)=1.017.10-4; 285.15066, sd(yEr)=6.8369.10-4, se(yEr)=3.947.10-4; 282.18884, sd(yEr)=3.4385.10-4, se(yEr)=1.9852.10-4; и 286.15439, sd(yEr)=2.8618.10-4, se(yEr)=1.6523.10-4. Систематизирани са и ITOT-данни за йони по отношение на различни интервали от време на сканиране и компоненти на матрицата на пробата. Изследваните интервали от време на сканиране са какво следва: t=0.009–0.203 (–циано-4-хидроксиканелена киселина); 0.534–1.066 (2,5-дихидроксибензоена киселина) и 0.182–0.523 минути (проба без матричен компонент). В таблична форма са дадени и данни за DiSDи D”SD-параметри от уравнения (1) и (2). Получените линейни корелации между посочените параметри в зависимост от типа на матричния компонент на пробата предоставят недвусмислено експериментално доказателство за твърдението, че съотношенията на интензитета на MС на двойки пикове на аналити не зависят от типа компонент на матрицата на пробата. Този резултат е от особено значение, защото дава възможност да се D”SD параметри на йони независимо от типа на матрични компонент. 57 Фигура 32. Корелационни зависимости на параметрите от уравнение (1) получени за серия от йони на циклодекстрини в рамките на девет измервания при различни експериментални условия; хемометрични параметри. 64 Фигура 33. ЕСЙ(+)-ДИС-МС спектри на амониев адукт на -ЦД при различни времена на задържане [мин]. Експерименталните DSD резултати от -ЦД обобщаващи времевото разпределение на абсолютния интензитет на йони по отношение на набор от интервали от време на сканиране обхващат йони при m/z 141, 158, 171 и 198. Стойностите m/z на пиковете при m/z 141 и 171 са идентични в – и –ЦД от гледна точка на хемометричната оценка (средна стойност: 141.1136, sd (yEr±) = se(yEr±) = 0; и 171.1017, sd (yEr±) = se(yEr±) = 0). DSD параметрите на тези пикове на -ЦД, подобно на –ЦД, при независими експериментални условия A1 и B1 са идентични. Получен е абсолютен коефициент на корелация r=1. Въпреки това, анализът на DSD данни от уравнение (1) на интензитета на същите пикове на - и -ЦД показва, че тези параметри не корелират значително линейно (r=0.65626). Както беше посочено по-горе, новият подход за количествено определяне на интензитета на пикове в масспектри съгласно уравнение (1) и параметър DSD показва висока чувствителност към всяка пертурбация на 3Д молекулните и електронни структури 65 на йони, защото досега разработваните количествени методи за анализ на MС интензитета и m/z–параметрите определят пиковете при m/z 171 и 141 показват sd (yEr±)=se(yEr±)=0 като селективно неразличими. Анализът на DSD данни, обаче, осигурява високо селективно определяне на - и -ЦД в смеси. Съответните корелации се изразяват количествено чрез статистически линейни уравнения, разглеждащи разпределението на абсолютния интензитет на пикове за набори от интервали от времена на сканиране. Статистически значимите параметри недвусмислено определящи и -ЦД при условия A1 и B1 въз основа на анализа на DSD данните за същите йони на - и -ЦД също бяха постигнати. Анализът на –ЦД включва също така и корелации DSD данни от ЕСЙи ХЙАН-MС измервания, като са обобщени данни от шест независими измервания (01–06). Отново, експериментално е доказана не само висока точност на ЕСЙи ХЙАН-MС данните, но и висока селективност на метода в рамките на ниски m/z–стойности. В опит да бъде моделирана температурната зависимост на дифузионните коефициенти са изведени и моделни уравнения (А5) и (А6) показващи r=0.9827. Независимо от високата стойност на r-параметъра, настоящата дисертация не акцентува на тези модели предвид факта, че впоследствие е изведена еднозначна функционална зависимост. Доколкото, обемът на настоящата дисертация не е в състояние да обхване всички аспекти на конформационния анализ и електронните ефекти на циклодектрини и техни продукти на фрагментиране, поради гъвкавостта на молекулните им структури и почти идентична способност за приемане на протони при О-центрове на ОН-групи, а така също и способността им за формиране на голямо разнообразие от вътрешнои междумолекулни водородни връзки на мономери, олигомери и полимери, този подраздел фокусира накратко върху молекулната структура на МС йони в ниска m/z–област на спектрите, целящи корелация между 3Д конформации, фини електронни ефекти и DQC параметри (Фигура 34). Основната мотивация в случая е да се подчертае селективността на DQC параметъра при отнасяна на пикове в масспектри към 3Д молекулни структури на аналити. Въпросът, който трябва да бъде адресиран, е дали можем да очакваме DQC стойностите да съответстват отлично на DSD параметрите, като се има предвид, че ЦДи се характеризират с гъвкави и сходни молекулни структури, а така също и сходна химична реактивоспособност, защото както е добре известно те стабилизират близко разположени като енергии молекулни конформации. С цел, твърденията да бъдат правдоподобни в оригиналните работи са описани енергиите на значителен набор от различни молекулни конформации принадлежащи на всеки йон, като е отчетена и склонността на дискутираните аналити да образуват умерени до слаби вътрешно молекулни OH…O(H) водородни връзки. 66 Фигура 34. ЕСЙ(+)-MС спектри на циклодекстрини; молекулна динамична енергия: обща енергия (ETOT) [kcal.mol-1] спрямо времето [fs]; 3Д молекулярна конформация на амониеви адукти на аналити; междумолекулни/йонни водородни връзки (дължини на връзките [Å]). В случая на йон при m/z 198 е отчетена и способността му да образува NH4+-адукт посредством междумолекулни NH4+…O(H) водородни връзки (r(N…O)= 2.591 и 2.637 Å). Доказано е, че DQC параметъра е много чувствителен към всяка конформационна промяна или фини електронни ефекти, като разликата в енергиите на форми е малка (E=| 0.00174015| a.u.) Независимо от този факт, обаче, йоните се характеризират със значителна разлика в параметрите от уравнение (3), като например DQC=187.95067 и 348.328, коя позволява еднозначно разграничаване на индивидуални структури сред набор от 3Д конформации посредством сравняване на DQC с DSD данни от уравнения (1)– 67 (3). Постигнати са отлични коефициенти на корелация |r|=0.99981 и 0.99951 при структурното охарактеризиране на циклодекстрини. Паралелен анализ на търговски продукти от случайно заместени ацетилирани производни на ЦДи е също показан като е следвана аналогичната схема на експериментален дизайн, включваща съвместен ЕСЙи ХЙАН-MС анализ (Фигура 35). Както и в случая на не заместените производни използването на стохастично-динамични данни за количествени цели е довело до точна възпроизводимост на резултатите, показваща r=1. Отново е доказано, експериментално, че уравнение (1) е универсален MС закон, който е валиден и при заместени производни на ЦДи, като доказателството включва анализ, както на йони при ниски m/z-стойности, така и при олигомерни фрагменти на циклодекстрини. Фигура 35. ХЙАН-MС спектър на Ац--ЦД в различни области на стойности на m/z=200–350; ХЙАН-MС спектри на -ЦД в рамките на m/z=200–350; обобщени са общите пикове на йони и характерните пикове на ацетилирани производни. 68 3.2.2. Анализ на конфигурационно блокирани полиени Този подраздел дискутира стохастично-динамичен МС анализ на конфигурационно блокирани полиени (КЗПи). Той обхваща багрила и техни продукти на циклична кондензация. Представените аналити са моделирани, синтезирани, изолирани и изучавани посредством набор от инструментални и теоретични методи за анализ с цел внедряването им в нелинейно оптичните технологии. Tеоретичните данни фокусират главно върху оптични им свойства или молекулно-структурни параметри. Изхождайки от факта, че целта на дисертацията е да представи новаторски разработки към MС методология за целите на количествения и структурен анализ, тук ще бъдат разгледани само тези примери от общо 140 синтезирани и охарактеризирани багрила използвани за тестване на иновативни функционални зависимости сред измервани техни MС параметри. Кондензационните продукти са резултат от конкурентни реакции при синтеза им. Те принадлежат към т.н. халкони, които от гледна точка на структурния анализ са сложен клас химични съединения поради комплексният им стереоизомеризъм. Това, обаче, дават възможност да бъдат тествани иновативни MС зависимости с цел да бъде илюстриран капацитета на съответната функционална зависимост за еднозначно определяне на молекулната структура на стереоизомери. Наред с MС данните, структурното охарактеризиране включва и хроматографски методи за анализ и електронно-абсорбционна спектроскопия. Теоретичният анализ включва детайлно разглеждане на конформационната предпочетеност и енергиите на различни конфигурации на молекулите, а така също и теоретично описване на техните електронниабсорбционни и вибрационни свойства, както в основно, така и във възбудено състояние. Оптичните свойства са изучени в зависимост от ефекта на средата. Изучени са и теоретичните им нелинейно-оптични свойства. Eксперименталният MС дизайн отново включва паралелни измервания използващи ЕСЙи ХАЙН-МС методи като са анализирани количествено връзките между интензитетите на пиковете на молекулите йони и тези на продуктите на фрагментация. Както е установено при всички изучени досега класове съединения, така и при тези съединения, уравнение (1) е универсален MС закон емпирично доказан предвид факта, че отново lnP1=–17.05334. Доколкото, читателят вероятно вече е убеден в достоверността на последното твърдение, този подраздел няма да третира детайлно приложението на уравнение (1) към структурно охарактеризиране на КЗП. Тук, само ще бъде споменато, че е постигнато еднозначно определяне на молекулните структури на аналитите (r=1) прилагайки уравнения (1) и (3). В този подраздел ще бъде представено сбито емпирично доказване на количествени зависимости на интензитети на пикове в масспектри на КЗП в зависимост от използвания йонизационен метод прилагайки авторско уравнение (А7). 69 То е изведено като моделно уравнение свързващо експериментални MС данни на аналити с кинетични параметри. Кинетични моделни уравнения са едни от основополагащите концепции на съвременната масспектрометрия. Тук, ще бъдат споменати и тези авторски разработки на дисертанта, които убедително доказват, че йонно-молекулните взаимодействия и продуктите от техните реакции на фрагметиране при тандемен масспектрометричен анализ могат да бъдат количествено определени чрез квазиравновесното състояние на системата от молекули и йони в рамките на фундаменталната теорията разработена от Ирибърн и Томсън. Доколкото, това е основополагаща MС концепция, както би могло да се предположи уравнение (А7) макар и иновативни не предостава фундаментална новост към знанията за MС феномени за разлика от стохастично-динамичните уравнения (1) и (2). Независимо от това, обаче то показва достоверни функционални зависимости установени при ЕСЙ-ДИСи ХЙАН-ДИСMС спектри, което позволява тяхното удобно съпоставяне с цел изучаване на кинетика на MС реакции при тези условия на йонизация. Количественото представяне на скоростната константа на MС фрагментиране на йони на аналити „k“ използва фундаменталното и добре известно уравнение на Айринг. Интензитетите на пиковете на йони на аналити при условия на мека йонизация, и скоростната константа на реакцията на фрагментиране по отношение на времето () е експоненциална функция. Тя е наречена остатъчен добив (?!) (survival yield; SY). Доколкото стана ясно от теоретичните разработки на други автори положили основите на масспектрометричния количествен анализ, функционалната зависимост между интензитета на пиковете и енергиите на молекулите е била предположена още в зората на развитие на метода, като тази зависимост е използвана при разработване на серия от моделни уравнения свързващи измервани параметри от експеримента с молекулни свойства на аналитите. Функционалната зависимост между “k” и енергията на молекулите може да бъде проследена както при извеждане на моделното уравнение на SY, а така също и при една от най-често използваните теории описващи MС кинетика наред с кинетичния модел на Кукс, а именно т.н. теория на Райс–Рамспергер– Касел–Маркус. Последната теория се основава на използване на приближението, че MС реакции на фрагментиране могат да се разглеждат като реакции на мономолекулна дисоциация. Тъй като различният път на фрагментиране на йон „М“ се характеризира с различни k-стойности, то интензитетът на изходния йон M (IM) по отношение на общия интензитет (Itot) се представя като се отчита сумарния ефект на ki скоростни константи на i-брой реакции на фрагментиране на i-тия йон. Времевата скала на реакциите на фрагментиране на йон „М“ зависи от апаратурата. Функционалната зависимост между скоростната константа “k” и T се изразява чрез добре известното уравнение на Арениус, като по този начин двете теории на Арениус и SY се определят като количествено взаимно свързани. 70 Според основното предположение, че йони, притежаващи стойности на вътрешна енергия под т.н. критична стойност на дисоциация „E0“ не произвеждат фрагменти йони или k=0. Йони, имащи E>E0 произвеждат фрагментационни видове в условия на MС фрагментация. Този класически подход за описване на процесите на фрагментиране води до получаване на сравнително по-ниски стойности на вътрешна енергия на йоните в сравнение с реалните такива, поради факта, че не се отчита кинетичната промяна в хода на процесите на фрагментиране. Модифицирана разработка основана на SY метода, която отчита кинетичното изместване и определя действителните вътрешни енергийни стойности на фрагментационните йони е представена от де Пау и съавтори. Методът на SY модифициран от де Пау и съавтори претърпява и следващо развитие подобрявайки ефективността си при определяне на свойства на йони на аналити чрез въвеждане на т.н. характеристична температура на йона. Разглеждайки основната теория на SY, а така също и нейните модификации става ясно, че масспектрите могат да бъдат изчислени теоретично, когато са известни: (i) всички реакции на фрагментация на йони, (ii) скоростните константи на мономолекулните реакции на фрагментиране, (iii) реакционно време и (iv) вероятностната функция на енергията на разпределение на йонизираните молекули. Директното прилагане на теориите основани на основната теория на SY е трудно, защото е необходимо да се знаят параметри на всички конкурентни реакции на фрагментиране. С цел ефективното ѝ прилагане е разработена и теория основана на т.н. йони-термометри, която свежда MС явленията на фрагментиране до няколко йона, чийто основен път на фрагментиране се състои от няколко последователни реакции, всяка с известна активираща енергия и ентропия. Методът е разработен отново от Кукс и съавтори. Независимо от ефективността си, е установено, че методът е приложим само в случаи, когато реакциите на фрагменти не предизвикват между-йонни електронни ефекти или процеси на вътрешно молекулни прегрупировки. За целите на изследване на валидността на уравнение (А7) е избрана една серия от реакции на фрагментиране на дискутираните багрила като е оценено количествено отношенията между скоростите на реакцията (k) на процесите при ЕСЙ-ДИСи ХЙАНДИС-МС условия на йонизация, водещи до образуването на един и същи фрагмент(и) на реакциите (Фигура 36). Съгласно дискутираното уравнение свързващо интензитетите IM,t=t0, IMt=t и ki,j са получени следните скоростни константи на изучените реакции в рамките на проведените ЕСЙ-ДИСи ХЙАН-ДИС-МС експерименти. Съединение (3), ДИС-МС (m/z 360): kESI291=0.001338649; kESI310=7.213944.10-4; kESI325=–8.87217.10-5 s-1; Съединение (3), ДИС-МС (m/z 397): kESI247=0.00166178 s-1; Съединение (3), ДИС-МС (m/z 360): kAPCI296=–9.117934.10-5; kESI310=– 2.029763.10-5; kESI325=–7.00962.10-4 s-1; Съединение (3), ДИС-МС (m/z 397): kESI246=8.35887.10-4 s-1; Съединение (2), ДИС-МС (m/z 360): kESI263=4.13167.10-4; Съединение (3), ДИС-МС (m/z 360): kAPCI263=0.00123659 s-1; Съединение (2), ДИС-МС (m/z 487): kESI442=– 71 8.64658.10-5 s-1; Съединение (2), ДИС-МС (m/z 487): kAPCI442=–3.467491.10-4 s-1; Съединение (1), ДИС-МС (m/z 360): kESI257=9.1691.10-4; kAPCI254=–2.5582.10-4 s-1; Съединение (1), ДИС-МС (m/z 495): kESI427=–0.00175504; kAPCI428=–3.932.10-4 s-1; Съединение (1), ДИС-МС (m/z 433): kESI200=0.0015647 и kAPCI200=–2.25223.10-4 s-1. Следвайки логиката на извеждане на тези уравнения се приема, че независимо дали се използват ЕСЙ-ДИСили ХЙАН-ДИС-MС условия, в рамките на реакции на фрагменти, които дават един и същ йонен продукт трябва да е валидно уравнение (А7). . Фигура 36. Експериментален дизайн съпоставящ кинетични параметри от реакции на ЕСЙ-MС и ХЙАН-МС фрагментиране при халкони. Корелационният анализ включва процеси MESIt=t0MESIt=t и M(*)APCIt=t0M(*)APCIt=t, където (*) обозначава, че изходните йони на аналита при ЕСЙ-ДИСили ХЙАН-ДИС-МС условия на измерване могат и да не могат да бъдат от един и същи вид. Крайният йон на продукта, обаче, е един и същ, т.е. Mt=tM(*)t=t. Въз основа на това приближение възниква въпроса как да изследваме валидността на показаната връзка между kESI и kAPCI посредством уравнение (А7)?. От гледна точка на хемометричен подход за оценка на валидност, би могло да се отбележи, че прилагането на модела на SY посредством уравнения (А7) постига ефективност r=0.86106–0.93313 от изучени 12 независими MС реакции, което е забележително висока стойност, като се има предвид, че сравняваме скоростите на реакциите на два различни като феноменология метода (ЕСЙ и ХЙАН) за анализ. Получените хемометрични параметри, обаче, сравнени с резултати постигнати при прилагане на уравнения (1) и (3) показват значително отклонение от еднозначното интерпретиране и предсказване на молекулна структура и свойства на аналити използвайки същия набор от измерени променливи на дискутираните xимични съединения. Експериментално и теоретично е изследвана и реакцията на [2+2] циклоприсъединяване на заместени -ненаситени изофоронови багрила (Фигура 37), включващи отново ЕСЙи ХЙАН-МС йонизация с тандемен MС анализ на заместени 3-[2-(X-заместен-фенил)- винил]-5,5-диметил-циклохекс-2-енон и КЗП. Анализирани са молекулната геометрия, термодинамиката, кинетиката и йонизационните потенциали на 66 изомери на димерни багрила, включително съответните цис-анти-цис и цис-син-цис форми глава-опашка и 72 глава-глава. Сравнителната индуцирана от сблъсък дисоциация или активирана от сблъсък MС и проведените теоретични анализи внасят светлина в механизмите на конкурентна димеризация в рамките на 3-[2-(X-заместен-фенил)-винил]-5,5-диметилциклохекс-2-енон; молекулни и експериментални фактори, определящи региоселективността на процесите. Анализите включват, както качествена, така и количествена MС кинетика и термодинамика, заедно със съответното теоретично изследване на КЗП-димери. Доколкото 3-[2-(X-заместен-фенил)-винил]-5,5-диметилциклохекс-2-енон и КЗП-багрилата вече са намерили приложение в промишлен мащаб като нелинейни оптични материали за генериране и откриване на THz вълни, както и във фармацевтиката за лечение и профилактика на невродегенеративни заболявания, това изследване има голямо значение зa много изследователски области, както и решаващо значение за областите на органичния синтез и катализа. Фигурa 37. Химични диаграми и пътища на фрагментация на димерно багрило D2a. 3.2.3. Структурен анализ на алифатни амини Получени и изучени са експериментални и теоретични данни за молекулната, респективно, кристалните структура и MС процеси на фраментиране на алифатни амини и техни (комплексни) соли, включващи както органични, така и неорганични противойони (Фигура 38). Част от кристалните структури са дизайнирани, синтезирани, и охарактеризирани с цел да бъдат изследвани процесите на йонизация при МПЛДЙ-МС, а така също да бъдат изучени и корелационните зависимости между експериментално наблюдаваните променливи измервани в хода на MС експеримент с термодинамични и кинетични параметри на химичните реакции съобразно кинетичните и стохастичнодинамични уравнения, като за целите на настоящата дисертация се включват главно системи тестващи уравнение (1) и (2). Независимо от простотата на молекулните структури на аналитите, те се характеризират със значителна реактивоспособност, което наложи детайлно охарактеризиране на механизмите на процесите водещи до неочаквани 73 Фигура 45. Кристални структури, xимични диаграми и фотографски изображения на посочените кристали без и с ултравиолетово облъчване при ex = 365 nm. В тази връзка, общоприето е разбирането за молекулните взаимодействия в кондензираната фаза като електростатични в контекста на квантово-химичната теория, като се включват и ван дер Ваалсовите и дисперсен тип взаимодействия. По отношение на ковалентно свързаните атоми, взаимодействия са описани като електростатични по природа. Когато неутрални молекули се зареждат в кристалите на соли, то структурите са описани като ансамбъл от йони в равновесие, свързани с дадена термодинамична точка на състояние, дефинирана от налягането и температурата. Преходът на йони от кристално състояние в газова фаза чрез йонизационния или чрез преход кристална фазакиселинна течна-газова фаза не е тривиално свързан със свойствата на изолиран йон. Установено е, че почти всички процеси се извършват при условия на висок вакуум, където йоните не са в термично равновесие. Тъй като общоприетото тълкуване на данни в положителна полярна MС среда е свързано с катионните видове и техни мономолекулни реакции е изучено и електростатичната способност на катионите в кристалите на солите, които са приемани като по-сложни от тези, съществуващи в газова фаза. Тъй като молекулните системи бяха подбрани така, че да съдържат само един най-вероятен център на протониране, колебанията на протонираните форми свързан с образуване полипротонни видове при прехода от кристална към течна фаза бяха пренебрегнати. Въпреки това, получените MС данни разкриха сложна картина на разнообразие от наблюдавани катиони, включително комплекси с водородни връзки, които бяха допълнително изучени теоретично като опит да се обясни тяхната природа в резултат на най-вероятния трансфер на протони и заряд, както и ефектите на Ян-Телер в газова фаза. Дискутираните ефекти в литературата се свързват предимно с координационни съединения на йони на преходни метали с електронна конфигурация d10 и d8, където зарядът е описан като локализиран върху металния йон, а явленията на пренос на заряд са отнесени към координативно свързаните лиганди във вътрешната координационна сфера. Така, че е интересно да се сравни и оцени природата на съответните процеси, стабилизиращи сложните катиони на органични видове в газова фаза. Молекулните структури на изследваните системи се характеризират с N-протонирани видове на цикличните алифатни хлор-съдържащи катиони и съответните аниони, определящи електростатичните взаимодействия в кристалите. Различните видове водородни връзки образуват 3Д мрежите. Така, кристалната структура на 1-(2-хлороетил) пиролидиниев 5-сулфосалицилилат се състои от дискретни в кристалографски термин катиони и Cl- -аниони, свързани с N+HCl връзки (3.064, 3.091 и 3.038 Å). Анионите в солите 1-(2-хлороетил)-пиперидиниев 5-сулфосалицилилат, 1-(3-хлоропропил) пиперидиниев 5-сулфосалицилилат и 4-(2хлороетил) морфолиниев хидрохлорид образуват сложна безкрайна мрежа в резултат на взаимодействия от типа OHOS (r(O… 80 O)=2.635–2.696 Å) и OHOCO (r(O…O)=2.614–2.626 Å) връзки, като по този начин допълнително взаимодействат с катионите чрез N+HOS (r(N…O)=2.726 Å) връзки. Допълнителни катионно-анионни N+HOS водородни връзки са наблюдавани при съединение 1-(2-хлороетил)-пиперидиниев 5-сулфосалицилилат (r(N…O)=2.823 Å). Масспектрите на дискутираните кристали се характеризират с пиковете при m/z на протонираните циклични алифатни йони, както и с пиковете на съответните адукти на NH4+-йон. Тъй като първоначално йонизираните съединения, както е показано по-горе, се характеризират с N-протонирани форми, то стабилизирането на амониеви адукти трябва да се свържат с ефект на пренос на протон в газовата фаза от катионите на органичните видове в кристално състояние към NH4+-йон. С цел потвърждаване на това твърдение една серия от сложни взаимодействия на йони е изследвана теоретично, където като най-стабилни бяха определени взаимодействащите форми на неутралните молекули аналити свързани с NH4+-йона посредством Cl...HN взаимодействие. Най-стабилната конформация на взаимодействащите ансамбли от частици е различна от тази, наблюдавана в съответните кристали. Данните за NH4+-адуктите показаха, че доминиращият фактор за тяхното стабилизиране в газова фаза е вътрешно-йонен пренос на задяд и ефект на Ян-Телер водещи до C3v→Td* симетричен преход в конфигурацията на NH4+-адукти. Максимално постигнатата по уравнение (1) ефективност при MС структурен анализ на кристални системи на соли на алифатни амини е r=0.96049. Сравнителнo ниските показатели на ефективност на уравнение (1) при този клас съединения, не би могло да се обясни само с грешка породена при апроксимация на експерименталната зависимост (I– <I>)2=f(t) със SineSqr функция, целяща получаване на статистическия параметър Ai. Поскоро е породена от голямата гъвкавост на молекулната структура на тези производни, които стабилизират голям набор от конформационни предпочетености. Доколкото не е правена системна корелация между хемометричните показатели по D”SD=f(DQC) като функция от точността на теоретичния метод използван при пресмятане на DQC-параметри на йони, то отклонението от еднозначното определяне по уравнение (1) при тези съединения би могло да е резултат и от ефект на теоретичния квантово-химичен метод, особено отнасяйки йони на асоциати характеризиращи се с далечни не ковалентни взаимодействия. 3.2.4. Структурен анализ на стероиди Този подраздел разглежда приложението на стохастично-динамичните моделни уравнения за MС структурен анализ на стероиди като са тествани данни за хидрокортизон (1), дезоксикортикостерон (2), прогестерон (3) и метилтестостерон (4). Показани са и резултати от структурния анализ на тестостерон (5). Въпреки решаващия принос на масспектрометрията за количествено определяне на стероиди (Фигури 46–49), 81 липсват надеждни протоколи, изследващи молекулните структури на смеси от стероиди, както и техните метаболити или конюгати поради (а) значителното структурно сходство на стероидите; (б) ниските им концентрации в тъкани; (в) значителен брой практически идентични пътища на MС фрагменти; (г) липса на задълбочени познания за влиянието на заместителите върху пътищата на фрагментите на стероиди, които са сложни като молекулна структура; (д) неизвестна конфигурация на асиметричения център по отношение на метаболитни реакции в живата клетка; (е) ефекти от анормална стереохимия на молекулния скелет на стероида и др. В тази връзка, както количественият, така и структурният анализ на стероиди е сложен и не представлява тривиална изследователска задача. Независисмо от добре описаните предизвикателства при структурния анализ на дискутираните аналити приложението на уравнение (2) доведе до отлични параметри оценяващи зависимостта D”SD=f(DQC) показващи |r|=0.99961–0,99962 (Фигура 50.) Фигура 46. Хроматографски и масспектрометрични данни за стероиди при различни концентрации (02–16); химични диаграми на дискутираните аналити. 82 Фигура 47. Mасспектрометрични данни за стероиди при различни концентрации. Фигура 48. Химични диаграми на енантиомери на хидрокортизон оптимизирани и кристалографски 3D молекулни конформации на стероидни видове при избрани стойности на диедричне ъгъл (C3–C4–C5–C10) [o]. 83 Фигура 49. Химични диаграми на енантиомери на стероиди (1)–(4), в зависимост от вида на R1 и R2-заместителите, с (R) и (S) стереохимия на C14-атом (A); молекулна оптимизация на ниво на теорията M062X на йони m(4)303_a и m(4)303_b на стероид (4): Обща енергия (ETOT) [a.u.] спрямо номера на стъпката на оптимизация; разлика в общата енергия (ETOT) [a.u.]; оптимизирани 3D молекулни конформации (B); и данни от молекулна динамика използваща метода на Борн–Опенхаймер на енантиомери на зареден стероид (3) (m(3)315_b и m(3)315_b_st) и продукт на вътрешномолекулно прегрупиране в рамките на A-пръстена на производното на стероидния скелет (m(3)315_c и m(3)315_c_st): Потенциална енергия [a.u,] спрямо времето в траекторията [fs]; оптимизирани 3D молекулни конформации (C). Фигура 50. Функционални зависимости между масспектрометрични D’’SD параметри [cm2.s-1] съгласно уравнение (2) и DQC данни за йони на стероид (1), използвайки експериментален набор от данни от променливи на проба D; хемометрия; химическа диаграма на аналит (5). 84 3.2.5. Структурен анализ на Cu(II)-комплекс of глицин Подразделът третира кристалографски и стохастично-динамични MС структурни данни за комплекса на CuII-йон с глицин. Докладвани са и вибрационно-спектралните характеристики на аналита. Кристалната структура е показана на Фигура 51. Цис-изомерът на комплекса кристализира в нецентросиметрична орторомбична пространствена група P212121. Геометрията на хромофора CuIIN2O4 е деформиран oктаедър (Oh*) като дължините на връзките варират както следва: r(Cu–O) и r(Cu–N) 2.030, 1.952–1.969Å. Големините на ъглите (O–Cu–O) и (N–Cu–O) са в диапазон 83.8(6)– 95.7(8)°. Масспектрометричният анализ показва квазимолекулен йон с елементен състав [C4H9O4Cu]+, което предполага ковалентентно свързан меден йон към органичната част. Анализът включва изотопни пикове от 63,65Cu-съдържащи фрагменти (Фигура 52). Фигура 51. Кристална структура на CuII-комплекс на глицин цис–{[CuII(Gly)2].H2O} (КБДК 795568 [ДРО: 10.5517/ccvpvhv]) (цис-бис(глицинато)-аква-мед(ii)). Дискутирана е корелацията на 3Д молекулните и електронни структури на аналита и негови йони, а така също и енергиите на системите, както в газовата, така и в кондензираната фаза. Подробно е разгледан ефектът а циси транс-{[CuIII(Gly)2]+} изомерите върху енергията на системата и MС измервани параметри отчитайки факта, че кристалографските данни показват, че цис-{[CuIII(Gly)2]+} комплексът е получен експериментално в кристално състояние. Прецизни теоретични анализи, обаче, показват, че цис-{[CuIII(Gly)2]+} конфигурацията е по-малко стабилна, като разликата в енергиите на циси транс–формите е E = |0.01873537| a.u. Същото важи и за циси транс- {[CuII(Gly)2+H]+} протонирана катионна форма на комплекса, показваща E = |0.022021| a.u. Най-стабилната геометрия на металоорганичните и/или органичните вещества от гледна точка на теоретичната квантова химия често не съответства на най-стабилната 3D молекулна конформация на аналитите в кристално състояние. Следователно е изучено подробно, каква е геометрията на комплекса при условия на MС експеримент, което означава да се изясни геометрията на катиона при m/z 212/214 в MС спектъра. За целта е проведен структурен анализ на серия от йони на аналита отчитайки изомерните форми. 85 Съобразно уравнение (1) е постигнато структурно отнасяне с ниво на надеждност |r| =0.9833 (Фигурa 53). Фигурa 52. Масспектрометрични данни за комплекса цис–{[CuII(Gly)2].H2O} в разтвор. Фигурa 53. Корелация между експерименталните MС стохастичнo-динамични параметри съгласно уравнение (1) и квантово-химичните дифузии съгласно уравнение (3) на MС йони; хемометрия; стойности на DQC параметрите, изобразени на фигурата са: m(1)212/214_a (68.9722383), m(1)212/214_c (9.436757), m(1)212/214_d (252.751823), m(1)212/214_e (752.801786), m(1)212/214_f (390.15325), m(1)212/214_c (65Cu, 9.3493893), 86 3.2.6. Структурен анализ на дипептиди Разделът обсъжда MС фрагментационните реакции на дипептида H–Trp–Trp–OH според наблюдаваните експериментално спектри (Фигурa 54) и 3Д структурният му анализ съобразно уравнение (1). Независимо от факта, че аналитът е хомодипептид, той се характеризира със сложна схема на фрагментация при меки йонизационни MС условия като се наблюдават, както моно-, така и поли заредени йони (Фигура 55). Протомерният [M+H]+ йон се наблюдава като ниско интензивен пик при m/z 391. Tипичният набор от фрагментационни реакции, водещи до т.н. y5, y2 и z2 йони на олигопептиди, не са характерни за H–Trp–Trp–OH в условия на ЕСЙ-MС. Една от причините е високата реактивоспособност на дипептида. Наблюдаваната молекулна циклизация води до оксазолониев йон, който е основният път на фрагментиране. Хемометричният анализ между параметри на уравнение (1) и (3) показва r=0.95575 изследвайки MС йони при m/z 131, 158, 271, 279 и 391. Корелационният анализ между експерименталните дифузионни параметри, базиран на уравнение (1) и тези основани на метода за мониторинг на потока води също до забележителен статистически коефициент r=0.99944 при изследване на MС йони при m/z 131, 158, 245, 271, 279 и 391, като по този начин показва пряко съответствие между експерименталните параметри, получени на базата на два концептуално различни като методология теоретични подхода. Валидността на стохастичния динамичен подход е потвърдена посредством друг независим теоретичен модел описващ MС феномени. 87 Фигура 54. ЕСЙ-MС спектри на H–Trp–Trp–OH; xимични диаграми на MС йони на аналита. 88 Фигура 55. Фрагментационни реакции на H–Trp–Trp–OH в разтвор при EСЙ(+)-MС условия. 3.2.7. Структурен анализ на CuII-, AgI-, и ZnII-комплекси на глицилхомолигопептиди Разделът обхваща, де факто, най-големият по обем изследвани от дисертанта съединения  олигопептиди. Серия от систематични разработки с участие на дисертанта са основани на използване на линейно-поляризирана инфрачервена спектроскопия за структурен анализ на дискутираните аналити, които отново не са включени в настоящата дисертация. Както стана ясно, тя почива на методологичния принос на дисертанта към развитие на методи на масспектрометричния количествен и структурен анализ, където изведените иновативни моделни уравнения отново са тествани на серия от глицилсъдържащи хомолигопептиди, техни протонирани форми и комплексни съединения с посочените по-горе метални йони. От работите на дисертанта по MС структурен анализ на олигопептиди тук са включени резултати от работи с изключителното значение на 89 В съгласие с основната цел е приложен стохастично-динамичния подход, включващ определяне на D”SD параметри от ДИС-MС данни на ZnII-G5 комплекса, описвайки MС йони при m/z 304 и 326 произвеждащи идентични фрагментационни продукти на взаимодействие във всички системи ZnII-G5, CuII-G5 и AgI-G5 като е отчетено и съотношението метал-към-лиганд. Направените заключения за селективното определяне на се основава на пикове показващи стандартното отклонение Sd(yEr)=0 при всички изследвани йони, разглеждайки статистически стойностите на m/z. Количественият анализ на D”SD параметрите съгласно уравнение (1) по отношение на различни периоди от време. Параметърът lnP1=–17.0534 е постоянен. Доколкото уравнение (1) може да бъде описано като универсално приложим модел за количествено определяне на експериментално измерената величина интензитет на MС пик валиден и при тези изследвани молекулни системи, то тази методология е директно приложима за селективно откриване на ZnII–йон, базирана на моделиране на специфичните междумолекулни/междуйонни взаимодействия в метало-органични системи. Така, определените D”SD параметри на йони могат да се използват като универсално приложим и надежден подход, който освен това е емпирично тестван метод за селективен мониторинг на йони на тежки метали в разтвор, обхващащ широка гама от видове аналити, йонизационни MС методи и експериментални условия. Корелационният анализ между D”SD параметри на идентични йони наблюдавани в ЕСЙили ДИС-MС спектри на системата ZnII/G5 при различни молни съотношения M:L=1:1 и 1:4 фокусира върху йоните при m/z 304, 326 и 236. Получен е абсолютен коефициент на корелация r=1. Същото важи и за анализа на йони в системата CuII-G5 отново по отношение на различни молни съотношения M:L=1:1 и 1:4. Дискутираните йони могат да се разглеждат като напълно идентични. Анализът на съответните D”SD параметри на йони при m/z 387, 441 и 450, обаче не успява да доведе до статистически значима линейна корелация. Следователно, твърдението е, че най-критичният тест за идентичността на фрагментационните MС йони на комплексни съединения е анализът на D”SD параметъра съгласно уравнения (1) и (2), които отчита много чувствително промяната на интензитета на MС пиковете на йоните в зависимост от експерименталните условия. Както показват хемометричните параметри на общите MС йони, когато има получени напълно идентични йонни фрагменти, тогава коефициентът на корелация между параметрите на D”SD по отношение на различните експериментални условия има абсолютна стойност r=1. Разглеждайки данните за ZnII-G5 при M:L=1:1 и 1:4 се наблюдава серия от пикове с нисък интензитет и високи m/z–стойности, принадлежащи на не ковалентни взаимодействащи ансамбли от асоциирани на G5 и неговите фрагментационни йони. Дори в случаите, когато такива продукти на взаимодействие изглеждат сравними с шума на MС измервания, анализът на D”SD параметрите показва повече от ясно, че въпросът дали два 96 MС модела изглеждат идентични или не, може да бъде разгледан недвусмислено с помощта на моделни уравнения (1) или (2). Правейки крачка напред спрямо основната линия на изследване на селективно откриване на ZnII–йон и други йони на преходни метали чрез взаимодействие с хидрофобен пептид G5 е проведен сравнителен анализ на ДИС-MС спектри на системите ZnII–G5, AgI–G5 и ZnII–G5, фокусирани само върху онези реакции на фрагменти, които произвеждат характеристични за всяка от системите от фрагментационни йони (Фигура 60). Анализът обхваща и идентичност на фрагментационни продукти на взаимодействие в масспектри на G5 и G6. Когато се наблюдават идентични заредени молекулни фрагменти то корелационният анализ на дифузионните параметри показва абсолютна или близка до абсолютната стойност “единица”. Както показват данните на Фигура 61, корелацията между параметрите D”SD на MС йоните при m/z 419, 391 и 441 при комплексите AgI-G6 и AgI-G5 се характеризира с r=0.99995. Както комплексите на ZnIIи CuII-йон с G5 и G6, така и тези на AgI-йон с дискутираните лиганди са структурно охарактеризирани посредством масспектрометрия (Фигура 62) като корелационният анализ между параметрите от уравнения (1) и (3) показва r=0.99332. Данните за DQC са: 105.2509 (m319_e), 22.9529 (m336_d_d) и 15.1949 (m363_c). Фигура 60. ДИС-MС2 спектри на системите ZnII-G5, AgI-G5, CuII-G5 при различни съотношения M:L = 1:1–1:4 и свободния лиганд G5 на MС йони при m/z 298.35. 97 Фигура 61. Корелация между дифузионни параметри DSD от уравнение (1) на йони при m/z 419, 391 и 441 на комплексите AgI-G6 и AgI-G5; хемометрия. Фигура 62. ЕСЙ-MС спектри в рамките на m/z=515–522 на AgI-G5; теоретични и експериментални изотопни форми на координационни видове при m/z 517/519/521 и 516/518/520; химични диаграми на комплексите сребърни йони в различни степени на окисление; подчертават се най-стабилните видове от гледна точка на химичната термодинамика. 3.2.8. Структурен анализ на AgIи ZnII-комплекси с органични и неорганични малки молекули и йони 98 Този подраздел включва резултати от работи, при които отново основната концепция в разработките почива на корелационен структурен анализ между резултати от монокристална рентгенова дифракция и стохастично-динамична масспектрометрия на посочените координационни съединения. Основната цел на това изследване изяснява разликата в тримерните структури на комплексите в кристално състояние и разтвор като са разгледани и конкурентни реакции на образуване на солватни комплекси на йони на преходни метали, каквито са наблюдавани и описани и при комплексите на CuII-йона с олигопептиди разгледани в предишни подраздели от дисертационния труд. Първоначално ще бъдат разгледаи резултатите от структурния анализ на катена-[бис(μ-3карбокси-4-хидроксибензенсулфонато)-три-аква-ди-сребро(I) монохидрат]) (КБДК 1541001) и (μ-(DL)-манделато)-сребро(I)) (КБДК 1918624), показани на Фигури 63 и 64. Както и при комплексите на CuII-йона, анализът на комплекси на AgIи ZnII-йони включва изследване на електроните спектри на свободните лиганди и съответните координационни съединени. Йоните AgIи ZnIIсе характеризират с електронна конфигурация d10. Координационните им съединения с органични и неорганични лиганди се показват ивици с пренос на заряд в електронните спектри, като положението на абсорбционните максимуми и интензитет зависят от структурата на комплекса. Доколкото, електронните спектри могат да бъдат предсказани точно с помощта на теоретични методи на квантовата химия, резултатите от 3Д структурния анализ основан на уравнения (1) и (2) в разтвор могат да бъдат съпоставени с теоретични и експериментални данни от електронните спектри на изучените системи. Кристалната структура на AgI–комплекса на 2-хидрокси-5-сулфо-бензоена киселина (КБДК 1541001) е описана като координационен полимер ([Ag2(HL)2(H2O)3]H2O)), където два AgI–центъра са свързани чрез мостов лиганд посредством –SO3функционална група. Повторното ѝ определяне допълнително показва, че тя се състои от координационен димер {[Ag2(HL)2(H2O)3]H2O)}n с n=2. Определени са силни до умерени връзки метал– лиганд r(Ag–O)=2.506, 2.515 Å, а така също и разстоянието между металните йони, което е Ag1I…Ag1I r(Ag…Ag)=3.877 Å. Второ контактно взаимодействие Ag2I…Ag2I се характеризира с разстояние r(Ag…Ag)=3.864 Å. AgI–йонът е координиран чрез депротонирана карбоксилна (–COO-) група от лиганда, която участва монодентатно във взаимодействие с металния йон. Структурните данни също показват наличие на диядрени Ag2O12 и Ag2O10 нееквивалентни хромофори с дължини на връзките: Ag1: r(Ag1–O): 2.634(3), 2.403(2), 2.369(3), 2.647(2), 2.515(2), 2,695(3); и към Ag2: r(Ag2–O): 2.473(2), 2.415(2), 2.366(3), 2.506(3), и 2.509(2) Å. Кристалната структура на (μ-(DL)-манделато)-сребро) (KBDK 1918624) съдържа AgI-йон свързан с четири O-атома характеризиращи се с разстояния между връзките Ag–O в рамките на r(Ag…O)=2.215–2.492 Å. Междуйонното взаимодействие AgI–AgI показва r(Ag… Ag)=2.820 Å. Йонът на бадемовата киселина участва в координационния процес като 99 тридентатен лиганд посредством депротонирани COOи OHгрупи. Карбоксилатният анион (COO-) е свързан с два AgI-йона в диядрена подструктура. OH-групата участва като мостов лиганд координиращ всеки от металните йони. Геометрията на металния хромофор AgIO5 е деформирана тригонално-пирамидална структура. МС данните и на двата комплекса показват сходни конкурентни реакции на образуване на солватни комплекси на AgI-йона (Фигура 65). Структурното 3Д определяне на йоните е извършено посредством хемометричен анализ за зависимостта между параметрите на уравнения (1) и (3), който показва показва |r|=0.99367 (Фигура 66). Стохастично-динамичните уравнения (1) и (2) са приложение и при 3Д структурно определяне на неорганични комплекси на ZnII-йон, наблюдавани при условия на EСЙ-MС на комплексни съединения на ZnII-йон с органични лиганди като 5-сулфосалицилова киселина, 3,4-дихидрокси бензоената киселина, хинолин-8-ол; 1,4-бис(2хидроксиетил)пиперазиндиев тетрахлороцинкат(II); цикличен кватернерен Nетилморфолин тетрахлороцинкат(II) монохидрат; тетрахлороцинкатни(II) соли на 4-(2аминоетил)морфолин дължащи се на реакции на обмен на лиганди. Така, структурни фрагменти от типа {[ZnII(H2O)6]2+)} или {[ZnIICl4]2-} са стабилизирани в кристално състояние на комплексите соли. Фигура 63. Химична диаграма на нееквивалентните диядрени (Ag1)2O12 и (Ag2)2O10 хромофори в кристалната структура на катена- [бис(μ3-карбокси-4-хидроксибензенсулфонато)- три-аква-ди-сребро(I) монохидрат (КБДК 1541001). Фигура 64. 2Д карта на Лапласиана на електронната плътност 2(r) [електрон.Å-5] на (μ-(DL)-манделато)-сребро(I); кристална структура на комплекса (КБДК 1918624) [ДРО: 10.5517/ccdc.csd.cc22dh33] 100 Фигура 65. ЕСЙ(+)-MС данни за дискутираните комплексни съединения в разтвор; теоретични MС данни (абсолютни съотношения на интензитета); качествено определяне на MС пикове. Фигура 66. Корелационен анализ между параметрите на DSD и DQC на йони на AgI–комплекси при m/z 148, 150, 189 и 191; хемометрия. 101 Изучаването на координационната химия на ZnII-йона в кондензирани фази представлява значително аналитично предизвикателство по отношение, както на количествения така и на 3Д структурния анализ, въпреки, че йонът се характеризира със завършена d10 електронна конфигурация. Електростатичните взаимодействия при комплексите на ZnIIйон са доминиращи в сравнение с тези на AgI-йон съдържащи съединения. Наред с показаните по-горе неорганични съединения на ZnII-йон, той стабилизира и комплекси от типа Zn(NO2).(OH)n.(H2O)m (m=0 или 1; и n=1 или 2,) и Zn(NO2).(H2O)k (k=2). Съществуващият набор от стабилни изотопи на цинк — 64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn и 70Zn — определя и сложната изотопна форма на комплексите на ZnII-йон като координационните съединения на изотопите са в различни количества. Цинковият йон показва стабилна степен на окисление (2+), но са описани и съединения, при които са стабилизирани степени на окисление (1+) и (3+). В живите клетки, металният йон е инертен по отношение на окислително-редукционни процеси и проявява главно степен на окисление (+2). Както в разтвор, така и в твърдо състояние ZnII-йон стабилизира дизаредени комплекси и с други разтворители, а не само аква-комплекс от типа {[ZnII(H2O)6]2+)}, какъвто е стабилизиран при изучените в дисертационния труд кристални структури на комплексни соли на ZnII-йон с органични лиганди, взаимодействащи като противойони. В тази връзка би могло да се обобщи, че йонът стабилизира заредени съединения от общ вид {[ZnII(разтворител)6]2+}. При фазов преход, процесите на солватация водят до конкурентни реакции на обмен на лиганди като ZnII-йон лесно стабилизира координационни съединения от типа {[ZnOH(H2O)n-1]+} (n=1–8), а не йони от тип {[Zn(H2O)n]2+}. Разтвори на ZnII-комплекси в условия на мека MС йонизация показват, както едно-, така и дизаредени съединения с неорганични лиганди. Йонът, също така, образува и органометални съединения, независимо от предимно електростатичния характер на взаимодействие с лигандите. Един такъв рядък пример е дискутиран и в настоящата дисертация, където отново кристалографските данни за структурата на комплекса са съпоставени с тези от стохастично-динамичния MС подход (виж по-долу). В допълнение, ZnII-йон стабилизира и смесено метални комплекси като {[(CuIIL)3MII]2+}, {[(CuIIL).MII(ClO4).(CuIIL)]+}, {[(CuIIL).MII(CuIIL)]2+} и {[(CuIIL)MII(ClO4)]+} (L-органичен лиганд; M = ZnII-йон). Независимо от факта, че комплексите на ZnII-йон се характеризират предимно с координационни числа 6 или 4, геометрията на металните хромофори се отличават с голямо разнообразие, включващо квадратно-пирамидални, тригонално-бипирамидални, октаедрични или тетраедрични струтури, а така също и набор от деформирани координационни полиедри. Йонът (ZnII) образува и полиядрени комплекси и метални клъстери с размер < 10 nm като комплекси {[Zn5(OH)8Cl2.2H2O]}, {[Zn4(L1)10][Me4N]2} и {[E4Zn10(L1)16].[Me4N]4}, където L1 е органичен лиганд; E=S атом. Съществуват, също така и нестехиометрични елементни състави при комплекси на ZnII-йон. 102 Към разнообразието от координационни съединения на ZnII-йон могат да се добавят и смесено-лигандни солватационни комплекси от типа {[ZnII(H2O)n.(CH3OH)m]2+}. Скицираните примери от координационната химия на ZnII-йон, и то главно споменавайки комплекси с относително малки органични лиганди, ясно показват, че цинковият йон в кондензирани състояния се характеризира с голямо разнообразие от химични форми, някои от които и се намират и в равновесие в разтвор, така че, както количественият анализ, така и този на 3Д структури на съединенията не е тривиална изследователска област. Известно е, че много фундаментални въпроси свързани с координационната химия и химичната реактивоспособност на ZnII-йон са все още недобре изучени. В тази връзка, изследователски усилия съсредоточени в 3D структурен анализ на комплекси на ZnII-йон в кондензирани състояния посредством съвместно прилагане на хроматография, масспектрометрия, и рентгеноструктурен анализ допринасят изключително много за цялостното разбиране на координационната химия на дискутирания йон, защото дават възможност да се изучи цялостно наборът от съединения, които се стабилизират в зависимост от условията на средата. Фокусът е върху реакции на ZnII-йон с молекули на разтворителя, наблюдавани масспектрометрично наред с комплексната му форма в кpистално състояние (Фигури 67 и 68). Наред с монои диядрените комплекси на ZnII-йон, в разтвор са определени и солватационни клъстерни йони от тип [(H2O)(O2)+]n. Взаимодействието на ZnII-йон в разтвор с тези йони води до моноядрен комплекс от тип {[ZnII(H2O)3O2]+}. Използването на MС методи за анализ е от голямо значение за задълбоченото изучаване на структурата и химичното взаимодействие на ZnII-съдържащи съедиенния, защото ZnII-йонът се характеризира с набор от характеристични пикове на изотопи, чието изотопно съотнишение е информативно за състава и съответната структура на комплекса. Така, {[ZnII(H2O)3O2]+} йонът е предположено, че е стабилизиран наблюдавайки пикове при m/z 149.95/151.95/153.95. От изключително значение е точното определяне на интензитета на пиковете на изотопомерите, защото дава възможност за директен структурен анализ. В тази връзка, теоретичното съотношение на интензитета на изотопомерните пикове при m/z 150 и 152 в експериментално наблюдаваните масспектри трябва да бъде 54.7 %. Той обаче, показва отношение 32.0 %. С оглед да отнесем достоверно пиковете на изотопомерите към съответните комплексни съединения са представени набор от теоретични MС данни и данни за енергетиката на моделни комплекси на ZnII-йон с цел да изучим подробно проблема за конкурентната координационна способност на ZnII-йон в разтвор в присъствието на различни молекули на разтворителя и EСЙ-MС наблюдавани клъстери от йони на разтворителя. Анализиран е и комплекс със степен на окисление +1 на металния йон и елементен състав [ZnI(H2O)3(CH3OH)+]. 103 Фигура 67. Кристалографски и теоретични MM2/MД данни за металния хромофор {[ZnII(H2O)6]2+} в комплекса хекса-аква цинк(II) 5-сулфосалицилат монохидрат (КБДК 864677). Процесите на комплексообразуване в разтвор и твърдо състояние на ZnII-йон, съпоставяйки кристалографски и MС данни в кондензирани състояния, са изучени посредством монокристална рентгенова дифракция и стохастично-динамична масспектрометрия на примера на следните координационни съединения: трихлоро(1-(2хидроксиетил)пиперазиний)цинк(II), 1-[2-(2-хидроксиетокси)-етил]-пиперазиниев тетрахлороцинкат(II), тетрахлороцинкатна(II) сол на 4-(2-аминоетил)морфолин, 1,4-бис(2хидроксиетил)пиперазиниев тетрахлороцинкат(II), 5-сулфосалицилатен координационен полимер на AgI-йон, манделатeн координационен полимер на AgI-йон, хекса-аква цинк(II) 5-сулфосалицилат монохидрат, цикличен кватернерен N-етилморфолин тетрахлороцинкат(II) монохидрат, 2,2‘:6‘,2‘‘-терпиридиниев тетрахлороцинкат(II), бис(гуаниниев) тетрахлороцинкат(II) дихидрат, бис(8-хидроксихинолиниев) тетрахлороцинкат(II). Металният комплекс трихлоро(1-(2-хидроксиетил)пиперазиний)цинк(II) кристализира в моноклинната P21/c пространствена група. ZnII-йонът се координира с лиганда посредством вторичния N-център (r(N–Zn)=2.051 Å). Лигандът участва монодентатно в координационния процес. Металният хромофор се характеризира с псевдо Td симетрия. 104 Съединението 1,4-бис(2-хидроксиетил)пиперазиниев тетрахлороцинкат(II) кристализира в нецентросиметрична орторомбична пространствена група Pca21. Единичната структурна единица от елементарната клетка съдържа 1,4-бис(2-хидроксиетил)пиперазиниеви катион и ZnCl42анион. Катионите образуват безкрайни вериги чрез водородните връзки N+HO (r(N…O)=2.854, 2.813, 2.776 Å) и стабилизирани допълнително от взаимодействията катиони-аниони, характеризиращи се с OHCl (r(O…Cl)=3.146 Å). Цикличният кватернерен N-етилморфолин тетрахлороцинкат(II) монохидрат се състои от дискретни дикати и аниони, свързани с водна молекула на разтворителя (OHCl, r(O… Cl)=3.262 Å). Стеричните ефекти в катионите затрудняват участието им в мрежата на водородните връзки. Тетрахлороцинкатна(II) сол на 4-(2-аминоетил)морфолин кристализира в моноклинната пространствена група P21/c. Катионите образуват зигзагообразни вериги чрез взаимодействие от типа N+H3…O (r(N…O)=2.850 Å), стабилизирано допълнително от връзкa от типа N+H3Cl (r(N…Cl)=3.143, 3.216, 3.224, 3.252 Å) с ZnCl42анион. Pазглеждайки кристалографските данни за хекса-аква цинк(II) комплекса с 5сулфосалицилатен анион стабилизиран като монохидрат в кристално състояние (КБДК 864677), солватният комплекс {[ZnII(H2O)6]2+} е определен експериментално в твърдо състояние. Фигура 68. Кристалографски, хроматографски, електронно абсорбционни и масспектрометрични данни за комплекс xекса-аква-цинк(II) бис(хидроген 5-сулфосалицилат) монохидрат (КБДК 864677 105 Фигура 74. Хемометричен анализ между DSD [cm2.s-1] и DQC данни на MС йони; стойностите са получени в равновесие и стационарни състояние. 3.2.10. Масспектрометричен структурен анализ на флавоноиди Отговорът на въпроса “Как 3Д молекулни и електронни структури; молекулната енергия; термодинамични и дифузионните параметри на МС йони в зависимост от техните взаимни взаимодействия са съпоставени количествено в рамките на стохастичнодинамичната концепция?” е даден и при анализ на флавоноид-О-глюкозиди. Подробно е разгледан апигенин-О-глюкозида, защото аналитът се характеризира с фини електронни ефекти (Фигура 75), които се проявяват не само набор от тавтомерни форми и протомери, но също така и ефекти на пренос на протон и заряд водещи до комплексни реакции на молекулни прегрупировки. Тези процеси обуславят и комплексни експериментално наблюдавани масспектри (Фигурa 76), чието отнасяне често води до двусмисленост на аналитичните резултати използвайки конвенционални методи за анализ. Емпирично фoкусът е върху ЕСЙ(+)-ДИС-MСn данни (n = 1–4) от анализа на апигенин-Оглюкозида; квантово-химични резултати от йонни/молекулни взаимодействия на фрагментационни йони от аналита чрез моделно уравнение (2). 112 Фигурa 75. Масспектрометрични фрагментационни продукти на апигенин. Фигурa 76. Експериментални ДИС-MС2 данни за йони при m/z 579 (A) и 271 (B); определяне на фрагментационни продукти според номенклатурата на Домон и Костело. Xарактеристичнитe йони на аналита включват общи реакции на йони при m/z 269 ([apiH]-), 241 ([api-H-CO]-), 227 ([api-H-C2H4O]-), 225 ([api-H-CO2]-), 201 269 ([api-H-C3O2]-), 183 ([api-HC2H2O-CO2]-), 181 ([api-H-2.CO2]-), 159 ([api-H-C3O2-C2H2O]-), 151 (1,3A-), 149 (1,4B-), 107 ([(1,3A-)- CO2]-) и 117 (1,3B-). Доколкото показаните данни отговарят на продукти на фрагментиране 113 при отрицателна полярност на средата, трябва да се отбележи още, че аналогични процеси са характерни и при положителна полярност на средата. Незначителните разлики в пътищата на фрагментиране в зависимост от полярността на средата посочващи главно интензивни пикове на продукти на реакциите затруднява и съвместното използване на двата режима на работа на метода на EСЙс цел комплексното структурно охарактеризиране на изследваното съединение. В тази връзка, разглеждайки участието в ретро-реакцията на Дилс-Алдер на 1,3Aйона при ЕСИ(-)-ДИСMСn условия на измерване (m/z 151), която допълнително произвежда йон при m/z 107 ([(1,3A-)-CO2]-), то може да се подчертае, че при режим на положителна полярност на средата, аналитът се характеризиращи дори с относително високо-интензивен пик при m/z 153 от 1,3A+ катион. Към [(1,3A+)-CO2]+ катион е отнесен пик при m/z 109.06. Kакто може да се очаква, структурите на двойките от йони 1,3A+/1,3Aи [(1,3A-)-CO2]-/[(1,3A+)-CO2]+ йони получени при различна полярност на средата са различни. 3Д молекулярните конформации и електронните структури, както и способността за приемане на протони на 1,3A+ и [(1,3A+)-CO2]+ катиони са подробно описани. В рамките на уравнения (1) и (3) са изследвани количествено данни за абсолютния интензитет и общия йонен поток на йони на апигенин-О-глюкозида. Експериментални променливи на осемдесет и пет фрагментационни йони на аналита са количествено определени. Абсолютните стойности на интензитета на MС пикове по отношение на различни интервали от времето на сканиране на измерванията при единичен и MСn режим на работа са представени в таблична форма. Чрез нелинейното приближение на зависимостта (I–˂I˃)2=f(t) с помощта на функцията SineSqr са получени стойности на параметър Ai и DSD данни съгласно уравнение (1). Получава се стойност на lnP1 съгласно общата концепция ǀlnP1ǀ=17.053. Анализирани са и хемометрични параметри на дифузия DSD и D”SD съгласно уравнения (1) и (2). Подробно са анализирани зависимости от експерименталните спектри на MС йони при m/z 119, 121, 163 и 579. Линейната корелация между DSD и D”SD данни съгласно уравнения (1) и (2) е ǀrǀ=1. Изследвани са количествено резултати от дифузия на йони при m/z 271, 271.1333 и 271.19998, получени при ДИС-MС3 експеримент, приложим към Y1+-йон. Същото важи и при разгледана корелация между обсъжданите параметри на дифузия, получени в рамките на различни режими на работа на ДИС-MС3 и ДИС-MС4, приложени към йон при m/z 271. Получени са следните хемометрични параметри: ǀrǀ=0.9997–0.99929. Pазглеждайки данни за MС йон от (1) при m/z 336, 366, 378 и 396, допълнително се твърди, че данни от DSD и D”SD от основното уравнение (1) и тези, получени в рамките на моделна формула (2) корелират статистически показвайки ǀrǀ=0.99961. Дори използването на най-ниската стойност на интензитета I=66 условни единици при m/z 378 не влияе върху отличната ефективност на метода, който се характеризира с отличен коефициент на линейна корелация ǀrǀ. Важен резултат илюстрира Фигура 77, показваща корелативно 114 анализ между данни от D”SD за йони при m/z 271 и 579. Линейната корелация води до параметър ǀrǀ=0.99185. Фигурa 77. Корелационен анализ между параметри на уравнения (1) и (3) за йони на аналита; хемометрия. 3.2.11. Структурен анализ на фармацевтични продукти в проби от околната среда Приложени са уравнения (1) и (2) и за целите структурната масспектрометрия на фармацевтични препарати като парацетамол и негово деутерирано производно, а така също и на пропранолол в проби от околната среда като отпадни води и биота. 3Д структурният анализ на дискутираните аналити е извършен съобразно схемите на фрагментиране показани на Фигури 78 и 79. Както при представените анализи по-горе  било количествени или структурни такива  са получени отлични коефициенти на корелация между параметрите от уравнения (2) и (3). Резултатите показват ǀrǀ=0.99938– 0.99165 (Фигура 80). Получен е еднозначен параметър (|r|=1) при определяне на 3Д молекулни структури на парацетамол и негови йони при m/z 152, 158, 174, 301 и 325 чрез хемометрична оценка на връзката D”SD=f(DQC) свързваща параметрите на уравнения (2) и (3) и изследване на аналита в биота при ЕС=25V. Данните за d3-(метил)-парацетамол показват отлична стойност |r|=0.99931. 115 Фигурa 78. Схема на фрагментиране на парацетамол и негово d3-производно; тавтомерни равновесия на катиони и катион-радикали при m/z 169, 152, 111/110, 93, 45 и 43; точна маса и теоретични m/z данни за изотопомерни пикове на аналита; съотношение на интензитета на пиковете на изотопомери [%]. Фигура 79. Схема на фрагментиране на пропранолол. 116 Фигурa 80. Функционална зависимост между параметри D”SD [cm2.s-1] и DQC на йони получени посредством ДИС-MС/MС фрагментиране на [M+H]+ протомер на пропранолол при m/z 260 и ЕС 25 V; хемометрични данни. Приложено е уравнение (2) и за структурен анализ на нискомолекулни съединения (НМС) в проби от околната среда като са определени структурите на карбамазепин и скандозид. Фигура 81 показва, че отново е постигнато еднозначно определяне на аналитите. Фигурa 81. Функционална зависимост между параметрите на уравнения (2) и (3) на скандозид, оценяващи експериментални и теоретични данни от уравнения (2) и (3) (A); зависимост между експерименталните данни за относителния интензитет (r.i. %) (2D_Frac_1a) и DQC параметрите на амитриптилин (B); хемометрия. 117 3.2.12. Структурен анализ на нуклеозиди посредством матрично изолирани лазерно десорбиранна/йонизационна масспектрометрия Посочените аналити са структурно охарактеризирани посредством МПЛДЙ-MС метода в твърдо състояние. Ефектът на компонента на матрицата върху интензитета на MС пиковете на изследвани съединения е показан на Фигурa 82. Постигнати са отлични параметри ǀrǀ=0.99997–0.9995. Хемометричните параметри получени при оценка на функционалната зависимост D”SD=f(DQC) на параметри от уравнения (2) и (3) за йони на дискутираните аналитите показват еднозначно определяне на молекулните им структури, доколкото ǀrǀ=1–0.99982 (Фигурa 83 и 84). Фигурa 82. Хемометричен анализ между данни за D”SD [cm2.s-1] на уравнение (2) на йони при m/z 283, 284 и 286 в зависимост от компонента на матрицата на проба (виж стойностите на абсолютния интензитет на пиковете за интервал от време на сканиране и статистически параметри според стохастично-динамичната теория. 118 Фигурa 83. Корелативен анализ между D”SD [cm2.s-1] и DQC данни за уравнения (2) и (3) на анализираните йони при m/z 109, 151, 152, 265, 283 и 284 според данни и обхвата на времето за сканиране. Фигурa 84. Корелативен анализ между D”SD [cm2.s-1] и DQC данни за уравнения (2) и (3) на анализираните йони при m/z 152, 283 и 284 според данните и обхвата на времето за сканиране. 3.2.13.Структурен анализ на кофеинови метаболити Уравнения (1)–(3) са приложени и за целите на 3Д молекулния структурен анализ на метаболити на кофеина и теоретично предсказване на техните масспектри. Изследвани са кофеин; пикочна киселина, 1-метил-, 1,2-, 1,7и 3,7-диметил-пикочна киселина; ксантин; 1-, 3и 7-метил-ксантин; параи хидроксиксантини; теакрин; теобромин; гуанин; тимин; и теофилин (Фигура 85). Работата определя структурно и молекулните изотопомери като са анализирани серия от характеристични пикове на представените аналити (Фигура 86). Независимо от простотата на молекулните им структури те се характеризират с голям набор тавтомери, протомери и ротамери в зависимост от експерименталните условия на анализ, като в допълнение се характеризират и с фини 119 електронни ефекти; явления на пренос на един или повече протона, а така също и процеси на пренос на заряд. Поради тази им значителна реактивоспособност, структурният им анализ е сложна изследователска задача от гледна точка дори на съвременното развитие и значителен напредък, както в теоретичните методи за молекулно охарактеризиране, така и иновациите в областта на инструменталните методи за структурен анализ. Фигурa 85. Химични диаграми на неутрален кофеин и негови цвитериони, както и протонирани тавтомери на [M+H]+ катион на кофеин при m/z 195; точна маса на йоните, теоретични m/z данни и съотношения на интензитета на изотопни форми на йоните. Основен резултат от прилагането на уравнение (2) за определяне на 3Д структури на кофеина, неговите тавтомери и изотопомери са получените отлични стойности на |r| =0.99989–0.9893, оценявайки параметрите на D’’SD на уравнение (2) и протомери на тавтомери на кофеин, отнесени структурно към наблюдавани MС променливи при m/z 195.08745, 195.08748, 195.08749 и 195.08751, както и DQC данни за уравнение (3) на йони CAFF_195_b, CAFF_195_g, CAFF_195_e и CAFF_195_a (Фигури 87 и 88). 120 Фигурa 86. Характеристични йони на фрагментационни процеси на дискутираните в този подраздел аналити. Постигнати са благонадеждни данни (|r|=0.99899) при оценка на зависимостта D’’SD=f(DQC) на йони при m/z 89.05976, 110.07127, 138.06613, 138.06615 и 195.07849 от кофеин, а така също и йон при m/z 166. Корелационният анализ на D‘‘SD и DQC стойностите на кофеиновите протомери, изомери и изотопомери води до отличен параметър |r|=0.99957. Пикът при m/z 196 е отнесен към изотопомер CAFF_196e_5. Независимо от значителна флуктуация на измерваните величини и малкия брой точки за интервал от време на сканиране, влияещи върху sd(yEr±) и D‘‘SD стойностите са получени отлични |r|-стойности оценявайки параметри за изотопомери CAFF_196e_2 и CAFF_196e_4 по уравнения (1) и (2) (|r|=0.99913–0.9982). Най-интензивният пик при m/z 195.08771±4.91.10-4 се приписва на най-стабилната 3Д структура на конформер CAFF_195e. Най-значимият |r|-параметър е получен при анализ на йон при m/z 195.11803±0 на CAFF_195a. 121 за валидността му, а по-скоро да се проучи неговата приложимост към 3Д молекулен структурен анализ са изследвани ЕСИ–MС спектри на заместени 2,5– (1) и 2,4– (2) бензалдехиди и съответните бензоени киселини (3) и (4) заедно с техни производни, съдържащи антрахинон (A), 1-фенил-1,3-дихидро-изобензофуран (B), 6-(2-оксо-2-фенилетилиден)-циклохекса-2,4-диенон (C) и 1,2-дифенил-етан-1,2-дион (D) заместени молекули, отчитащи фините електронни ефекти на изомери и тавтомери (Фигура 95). Корелационният анализ на зависимостта D”SD=f(DQC) при тези съединения показа отново отлични параметри (|r|=0.99673–0.99066) (Фигури 96 и 97). Независимо, че посочените стойности не са еднозначни те за значителни поради голямата вариация на анализирани производни и силно припокриващи се хроматографски пикове на аналити. Фигура 94. Химични диаграми на аналитите (1)–(4), техните тавтомерни, депротонирани и протонирани форми. Фигура 95. Хроматографски данни и електронни абсорбционни спектри на аналитите (1), (2) и (4) при различни време на задържане [минути]. 128 Фигура 96. Връзки между DSD и DQC параметрите на йони от (1); хемометрия. 129 Фигура 97. Връзки между DSD и DQC параметрите на йони (2) и (3); хемометрия. Подробно са анализирани и масспектрите на значителна серия от продукти на взаимодействие на три заместени бензоени киселини, а както и значителна серия от каталитични реакции на образуване на C–C и C–N ковалентни връзки отново при заместени бензалдехиди и бензоени киселини (Фигури 98 и 99). Независимо от перспективното потенциалното практическо приложение на подобни производни главно в областта на фармацията, получените ниски добиви както показват хроматографските данни от посочените фигури изискват посистемни усилия за оптимизиране на синтетичните условия даващи възможност за съвместно прилагане на стохастичнодинамичната масспектрометрия с други методи за структурен анализ както беше показано при анализа на алифатни амини, за да може да се направи достоверно и еднозначно отнасяне на продуктите на взаимодействие при тези класове от съединения. Поради това тук няма да бъде отделено голямо внимание на анализа включващ, както теоретичното, така и експериментално охарактеризиране на показания в публикациите значителен набор от аналити. 130 Фигура 98. Хроматограма и електронни преходи на получени феназини. Фигура 99. Хроматограма и електронно-абсорбционни спектри на реакционните продукти, получени чрез AgIиндуциран каталитичен процес. 3.2.16. Структурен анализ на синтетични и биоразградими полимери Този подраздел третира изключително успешното и новаторско приложение на стохастично-динамичната масспектрометрия и уравнение (2) за структурен анализ на полимери, като са изследвани както синтетични, така и биоразградими материали. Анализът обхваща, както лабораторни проби, така и търговски полимерни продукти. Втората група аналити представляват изключително комплексни обекти на анализ, но са тясно свързана с опазване на околната среда от замърсяване с полимерни материали и разработване на ефективни методи за мониторинг на полимерни замърсители; внедряване на нови технологии за производство на екологични биоразградими биополимери; създаване на нови технологии за по-успешно рециклиране на синтетични полимери; и др. Получените резултати от дискутираните работи, следователно са неразривно свързани с развитието на модерната аналитична масспектрометрия и разширяване на нейната приложимост във фундаменталната наука; много индустриални 131 браншове; различни области от социалната сфера и културата, и т.н., защото синтетичните полимерни се използват като опаковъчни материали в широк спектър от промишлени отрасли и ежедневието на хората, главно поради ниската си цена, отличната водоустойчивост, лекото тегло и отличната им бариерна способност срещу влага и окислителни процеси. Досега са произведени приблизително 8.3 млрд. тона материали на пластмасова основа, които са генерирали около 6.3 хиляди тона отпадъци. Обаче, общо от пластмасовите отпадъци са рециклирани само 9 %. До 2050 г. ще бъдат натрупани около 12 хиляди тона пластмаси, което както може да се предположи е основа за очаквана екологична катастрофа поради глобалното замърсяване на околната среда с полимерни отпадъци. Увеличеното производство на синтетични опаковъчни пластмаси води до сериозно застрашаване на околната среда от замърсители на полимерна основа. Разработването и внедряването в индустриален мащаб на нови биоразградими и възобновяеми полимери е от жизненоважно значение. Био-разградимите полимерни материали могат да бъдат получени от селскостопански източници; да бъдат синтезирани от мономери или микроорганизми; биоматериали; изкопаеми петролни източници и др. Например, нишестето и целулозата принадлежат към групата на полизахаридите на основа на селскостопански източници; полимлечната киселина се отнася към био-базираните полизахариди, докато полиетилен гликолът — към биоразградимите полимери от изкопаеми петролни източници. Подчертават се две основни предимства на такива биоразградими пластмаси в сравнение с конвенционалните полимери: (а) Те могат да спестяват изкопаеми ресурси чрез използване на биомаса, която се възобновява и (б) предлагат и средства за резиклиране чрез биоразградимост. През последните десетилетия се наблюдава нарастващо приложение на биоразградими полимери в редица индустриални браншове и бита като това е обусловено от съответни законодателни актове като директиви. Важно е, да се отбележи, че биоразградимите пластмаси не могат да се разграждат в естествена или промишлена среда. Поради това изследвания свързани с изучаване нa процесите на стареене на пластмасите с цел повишаване на разградимостта им в околната среда са от фундаментално значение, както за развитие на полимерната науката така и практиката. Те са тясно свързани и с екологията и опазване на околната среда, защото процесите на стареене на пластмаси променят повърхността им и техните химични свойства главно чрез увеличаване O-съдържащите функционални групи. В резултат на това се увеличава и афинитета на материалите към сорбционни реакции на НМС и метални йони от околната среда, като по този начин се повлияват редица биогеохимични процеси във въздуха, почвата, и водата. Основната мотивация за замяната на конвенционалните (синтетични) пластмаси с биоразградими материали е свързана не само с въпроса за опазването на околната 132 среда от пластмасови отпадъци, но и с полимеризационните реакции, произвеждащи олигомерни композитни включвания в полимерния материал. В случаите, когато синтетичните полимери се използват за опаковане на храни, тези включвания и олигомери могат да мигрират от полимерната опаковка в храната като по този начин застрашават и безопасността на потребителите. Същото важи и за голям брой добавки към пластмасите, повечето от които не са ковалентно свързани с полимерната молекулна верига. Например, прекурсори на Nнитрозамина се използват за подобряване на здравината и еластичността на пластмасите, но самият аналит е мощен канцероген и мутаген за човека. По този начин, такива НМС могат да се освобождават на всички етапи от потребителския цикъл на полимерните материали чрез миграция или чрез изпаряване. Така се осъществява пренос на химични съединения от пластмасови опаковки към храни, хора и природна среда. Биополимерите се регулират от Директива на Европейския съюз (1935/2004/ЕИО). Прилага се и Европейската Директива за регламент на пластмасите (10/2011), съдържаща списък с разрешени химикали с техните специфични граници на миграция. Максимално допустимите граници на миграция за химични съединения, които не са изрично посочени, трябва да бъдат по-ниски от 0.01 mg.kg-1 в хранителната добавка или храната. Следователно, аналитичното определяне на както ниско-, така и високо молекулни съединения в полимерни материали трябва да се извършва задължително съгласно установените законодателни актове. Въпреки факта, че много биоразградими полимери, като целулоза, например се прилагат широко в индустриален мащаб за широк спектър от материали, включващи дисперсанти, сгъстители, лепила, емулгатори, пълнители, нефтохимични продукти, керамика, текстил, синтетични смоли, храни, фармацевтични препарати и др., поради липсата им на токсичност, много малко се знае за ‘‘химичната‘‘ безопасност на биопластмасите, дори на тези, които включват целулоза и нейните производни. Тези пропуски в знанията са, обаче проблематични поради нарастващото приложение на биопластмасите в бита. Наличните, макар и оскъдни изследвания в последния контекст досега показват, че по-голямата част от пластмасовите продукти за потребителите съдържат и токсични вещества. Както конвенционалните, така и биоразградимите пластмаси представляват сложна химична смес от известни и неизвестни аналити, вариращи от самите полимери, пълнители и много добавки, като например пластификатори, стабилизатори, забавители на горенето, пигменти, и др. Някои от тези аналити могат да бъдат и токсични. Следователно, независимо, че биопластмасите са признати за екологично чисти материали, включително такива без доказана токсичност, химичният състав на опаковъчните материали и крайни търговски продукти на базата на биопластмаса е еднакво сложна, 133 както и тази на синтетичните полимери. Така, тя е и потенциално токсична, както за човека, така и за околната среда. Внедряването на безопасни за човека и околната среда биоразградими полимери изисква изследователски усилия за разработване на нови научни методи и регулаторни подходи, включително директиви, за да се подобри тяхното безопасно производство и приложения за хората и околната среда. В последния контекст, т.н. биомаса се откроява като екологично чист и възобновяем източник, включително източник изключващ генериране на въглероден двуокис в атмосферата. Тя е и един от най-перспективните източници на енергия, съставен от целулоза, лигнин и хемицелулоза. Структурният анализ на междинните продукти на взаимодействие на компонентите на биомасата е от решаващо значение за аспекти от механизмите на нейната химична реактивност. Биопластмасите се считат за поекологично устойчиви, тъй като са базирани или на био-основа, или на основата на биоразградими компоненти. Те ограничават добива и използването на изкопаеми ресурси чрез използване на биомаса, като по този начин намаляват изчерпването на природните ресурси. Освен това, биоразградимостта е допълнително свойство на някои видове биопластмаси, което предлага допълнителни средства за оползотворяване в края на потребителския им цикъл като търговски продукти и насърчаване на разработване на система за ефективна кръгова икономика. На пазара се предлагат няколко биобазирани и биоразградими полимера, като например биопластмаси на основата на нишесте, полимлечна киселина, полихидроксибутират, полихидроксиалканоати, полибутилен адипат терефталат и др. Целулозата е също важен биополимер. Тя има широк спектър от приложения в много промишлени отрасли и се използва за производство на хартиени изделия, биогорива, текстилни влакна, платформени химикали и др. Нишестето е обещаващ биополимер за производство на биопластмаси в индустриален мащаб. То е възобновяем, естествено разпространен, биоразградим и евтин материал, приеман за перспективен материал за разработване на нови екологични биопластмаси. Наред с предимствата му, обаче, са налице и недостатъци свързани с подобряване на механичните и физикохимичните му свойства, като здравина, водоустойчивост, и др. Подобряването на механичната якост и водоустойчивост на нишестето се осъществява чрез включване на хидрофобни полимери като полимлечна киселина, полиетилен, полиестери, полигликоли, полибутилен сукцинат и др. Целулозата и нишестето също са подходящите хранителни моделни полимерни системи. В контекста на целите на дисертационния труд става ясно, че структурният анализ е основната изследователска задача на полимерната наука. Поради сложността на полимерните композитни материали отново масспектрометричните методи използващи мека йонизация се считат за крайъгълен камък в областта на полимеромиката. 134 Прилагането на методите на масспектрометрия за молекулно-структурно охарактеризиране на пластмаси доказва не само успешен анализ на високомолекулните компоненти на полимерите композити материали, но и следови анализ на неочаквани продукти от полимерни реакции със странична верига на полимера, включително следи от включвания в основния полимерен материал, и др., които имат или биха могли да имат критични последици за човешкото здраве. Така МС методите приложими към полимерната химия са свързани не само с количествено или структурно определяне и охарактеризиране на материалите, но и с обезпечаване на гаранцията за тяхната безопасност, ефикасност и качество. Следователно, приложимостта на методите на масспектрометрия в химичния анализ на полимери е също толкова значимо в областта на полимерните изследвания, колкото и това в биологията и медицината. Въпреки това, сложността на полимерните материали, обуславя някои ограничения за широкото приложение на MС методи в полимеромиката. Например, (а) полимерът трябва да е способен да стабилизира йони в газова фаза; (б) често конвенционалните MС техники не предоставят специфични данни за функционалните групи на полимерите или за първичната и надмолекулна структура на аналита; и (в) полимерните смеси често не могат да бъдат определени правилно поради разлики в йонизацията, съответно, ефективността на откриване на съставките на полимерния материал. Измерената чрез масспектрометрия m/z величина на n-мерите на полимер се използва за получаване на информация за молекулното тегло, хетерогенността на състава и разпределението на функционалността на аналита. Тъй като композитните материали могат да бъдат сложни смеси от аналити, имащи изобарни аналити или смес от техните изомерни 3Д структурни архитектури, може да бъде трудно или дори невъзможно да се определят полимери или олигомери в смеси чрез едноетапни MС измервания само на m/z стойности. По този начин, за целите на структурния молекулен анализ, методите на масспектрометрията използват главно тандемна масспектрометрия. Независимо от решаващото значение на тандемната масспектрометрия за целите на структурния химичен анализ, често традиционните MС/MС методи за фрагментация не успяват да генерират изобилие от фрагменти на високо молекулния аналит, което отново възпрепятства неговото еднозначно определяне. Прилагнето на стохастично-динамичния MС подход и към структурен анализ на полимери еднозначно показа, че методът разширява значително капацитета на структурната масспектрометрия за благонадеждно, селективно, специфично, точно, прецизно и еднозначното определяне на химичните съединения в дори търговски полимерни продукти. Прилагането на разработения от дисертанта метод към композитни търговки полимерни материали от целулоза и нишесте включващи прибори за хранене за еднократна и многократна употреба, торби за храни, хранителни опаковки и опаковки за смет, 135 шоколадови опаковки, филтри от цигари, пелети и др., с цел 3Д структурно охарактеризирани както на макрокомпонентите на полимерните материали, така и дискутираните по-горе добавки, включително налични синтетични полимери е илюстрирано на примера на MС спектри на проби Cell_5 и Cell_7 от целулоза и нишесте като макрокомпоненти на полимери се характеризират с набор от включващи се хидрофобни полимери като полиизопрен, полиетиленгликол и полипропилен (Фигури 100–102). Показаното фрагментиране е съгласно общите схеми на МС фрагментиране на синтетични полимери, предложени от Джаксън и колеги; както и от Латимър и Уесдемиотис и колеги. Фигура 100. Масспектрометрични данни за олигомерни видове в проба Cell_5 по отношение на различни кратки интервали от време на сканиране; химични диаграми на катиони. 136 Фигура 101. Масспектър на проба Cell_5 за кратък период от време на сканиране 4.76–5.96 минути и номера на сканиране 188–300; характерни масспектрометрични пикове на полиетиленгликол и полипропилен гликол; химични диаграми на наблюдаваните йони на полиетиленгликол при m/z 221, 177, 133 и 89, съответно. 137 и (био)полумери е постигнато изследвайки експерименталните масспектри от методи базирани на мека йонизация и почиващи на електроспрей йонизация, йонизация при атмосферно налягане, и лазерно подпомагана десорбция/йонизация на аналита, на над 200 химични съединения от различни класове. Количествено и структурно охарактеризирани посредством иновативния масспектрометричен метод са над 200 химични съединения, като валидността на уравнения (1) и (2) като универсален закон в масспектрометрията e доказана при обработка на над 2000 индивидуални масспектъра включвайки различни техники за анализ. 2. От методологична масспектрометрична гледна точка, приложението на уравнения (1) и (2) е досега доказана при органични, неорганични, и комплексни и органометални съединения. Болшинството от изучените съединения са нискомолекулни аналити като флавоноиди; нуклеозиди; стероиди; медикаменти като метронидазол, резерпин, лабеталол, пропранолол, атенолол, парацетамол, и триадименол; нискомолекулни въглехидрати; амино-киселини и олигопептиди; алифатни амини; производни на бензоената киселина и бензалдехиди; халкони; конфигурационно блокирани полиени и др. Анализите включват, органични, неоргаични и комплексни съединения на CuII-, ZnII-, и AgI-йони на преходни метали. При анализ на макромолекули, методът е доказал еднозначна (r=1) ефективност при полимери на въглехидрати, протеини, синтетични, и биоразградими полимери използвани в хранителната и опаковъчните индустриални браншове. Aнализ на изотопомери на аналити е показан в серия от работи третиращи изотопи, както на йони на преходни метали или халогениди, а така и на 13Cи 14C-изотопа при органични съединения, отново достигайки еднозначна ефективност на охарактеризирането на аналитите както количествено, така и структурно. 3. При 80 % от изследваните молекулни системи при, които е приложено уравнение (2) за количествен анализ на аналити е постигнато еднозначно определяне на химичните съединения (r=1), което прави моделно уравнение (2) единствен разработен досега еднозначен метод за количествен масспектрометричен анализ, показващ превъзходни показатели на ефективност в сравнение с известни методи за масспектрометричен анализ. Количествените определяния въз основа на уравнение (2) и хемометричен анализ на функционалната зависимост D‘‘SD=f(c) са съпроводени, както с повишаване на ефективността на количествените данни при много ниски нива на концентрация на аналита достигащи до ng.mL-1, така и с повишаване на селективността и специфичността на анализа. Еднозначни количествени определяния на аналити са постигнати, както при анализ на смеси в лабораторни проби, така и на главно нискомолекулни съединения в проби от околната среда като морска органична материя, биота, (отпадна) вода, и др., така и биологични течности като урина. 4. Отлични хемометрични показатели (r=1–0.999) за постигнати и при приложение на уравнение (2) за 3Д структурен анализ на химичните съединения, който почива на 144 хемометрична оценка на функционалната зависимост D‘‘SD=f(DQC). (Параметърът DQC се определя в рамките на уравнение (3) ( )). 5. При 40% процента от количествено и структурно охарактеризираните химични съединения (80 съединения) масспектрометричните данни са корелирани със структурни данни от монокристална рентгенова дифракция и инфрачервена спектроскопия с преобразование на Фурие, a при 100 % от анализите масспектрометричните данни са корелирани и с данни от електронно абсорбционна спектроскопия и хроматография. В тази връзка друг основен извод от резултатите включени в дисертационния труд наред с този за универсалната и емпирично доказана валидност на уравнения (1) и (2) като масспектрометрични закони описващи и предсказващи йонизационните феномени при условия на мека йонизация е и, че тяхната валидност е емпирично доказана посредством използване на количествени и структурни аналитични данни на изследваните химични съединения от други независими методи за инструментален анализ. 5. Приноси 1. В хода на изработване на дисертационенния труд за пръв път са изведени напълно новаторски, както като формулировка, така и като теоретична концепция и собствен индивидуален принос на дисертанта моделни уравнение (1) ( ) и уравнение (2) ( ) за еднозначно количествено и 3Д молекулно структурно охарактеризиране на аналити в лабораторни проби и комплексни системи като проби от околна среда, храни, биологични течности и тъкани, почиващи на масспектрометрични методи, използващи условия на мека йонизация на аналитите. Емпирично е доказанa тяхната валидност за методи базирани на електроспрей йонизация; химична йонизация при атмосферно налягане; фотойонизация; матрично подпомагана лазерна десорбция и йонизация; тандемна масспектрометрия, както при положителна, съответно, отрицателна полярност на средата; данни от хибридни методи, включващи както газова, така и течна хроматография, а така също и данни от директен анализ. Уравненията са показали еднозначност при количествените и структурни определения на химичните съединения, а така също и висока селективност и специфичност на анализа. Постигнатите хемометрични показатели на ефективност на химичния анализ посредством уравнения (1) и (2) ги класифицират от гледна точка на 145 методологията на аналитичната масспектрометрия като най-ефективния подход разработван досега за целите на количествената и структирна масспектрометрия. Предвид факта, че методите на масспектрометрия играят ключова роля в модерния химичен анализ като незаменим инструментариум в много области на аналитичната наука, методологичните индивидуални приноси на дисертанта имат не само фундаментален характер, като допринасящи за развитие на съвременната аналитична наука, и в частност аналитична химия с основен принос в разбирането на свойствата и структурата на материята и някои масспектрометрични феномени, но и потенциално практическо приложение в редица други области на науката и технологиите включително на индустриално ниво. 2. Като собствен индивидуален принос на дисертанта наред с методологичните разработки в областта на аналитичната масспектрометрия и практически масспектрометричен анализ на експерименталните данни по точка 1 са дизайн, синтез, изолиране и структурно охарактеризиране на 80 кристални съеднинения на органични соли, комплексни соли и координационни съединения с преходни метали типа на CuII-, AgI-, и ZnII-йон, които са използвани не само като моделни системи за масспектрометричен анализ доказващ валидността на уравнение (1) и (2), но и за корелационен анализ между кристалографски данни за 3Д молекулната структура и структурен анализ в разтвор, където данните от монокристална рентгенова дифракция са корелирани и с тези от електронно абсорбционна спектроскопия, хроматография, и инфрачервена спектроскопия, отново индивидуален принос на дисертанта. Приносите по точка 2 имат подчертано фундаментален за науката характер като дават възможност да се изучи задълбочено ефекта на кондензираната фаза върху 3Д структуратa на молекулите в кристално състояние и разтвор. 3. Следващ индивидуален принос на дисертанта включва и дизайн, синтез, изолиране и охарактеризиране на над 150 органични багрила, които са охарактеризирани експериментално отново масспектрометрично, електронно абсорбционно, хроматографски, и теоретично посредством прецизни методи на съвременната квантова химия. Приносът по точка 3 би могъл отново да се прочисли към имащ по-скоро фундаменталена характер в разбирането на свойствата, химичната реактивоспособност и структурата на материята, a така също и някои масспектрометрични феномени, защото са изучени дейтаилно механизмите на реакции на циклизиране, кондензационни процеси, вътрешномолекулна прегрупировка, протониране, и тавтомерни равновесия в разтвир и газова фаза, каквито са типични за изследванитe химични класове от багрила главно фокусирайки вниманието върху Шифови бази, и конфигурационно блокирани полиени, но и продукти на кондензация на полизаместени бензоени киселини и бензалдехиди. Независимо от фундаменталното значение на тези нови знания зa области като катализа и органичния синтез, а така също и области като фармация и нелинейна оптика, на този 146 етап от изследване на тези класове съединения е трудно да се дефинира принос от получените данни по точка 3 към областта на приложните науки и технологии. 147 6. Публикации включени в дисертационния труд За участие в процедурата са представени 41 научни съобщения в пълен текст (P1–P41), от които 41 публикации (100 %) в реферирани и индексирани издания (51.2 % са поместени в списания имащи квартил Q1; 24.4 % в списания с квартил Q2; и 19.5 % в списания с квартил Q3; 5 % от работите са публикувани в списание с фактор влияние (ФВ) > 15; 5 % от работите са в списание с ФВ > 8; 7.5 % - в списания с ФВ > 6; 45 % от работите са в списание с ФВ между 2–5); 6 глави от колективни монографии (B1–B6), 6 представяния на електронни конференции с предоставенo дигитално разпознаване на обекта (C1–C6); и 2 не реферирани предпечатни публикации с предоставенo дигитално разпознаване на обекта (PP1 и PP2). Предпечатнотo издание [PP2] (2024) e вече получило един цитат от независими автори. В 20 % от публикациите дисертантът е самостоятелен автор; в 77.5 % дисертантът е в съавторство с втори автор; и в 2.5 % от работите дисертантът е в съавторство с до трима съавтори. Не са включени публикации с повече от четирима съавтори. В 100 % от всичките включени работи, дисертантът е и автор за кореспонденция. Трудовете не са използвани за придобиване на ОНС „доктор“. Забелазани са 93 цитати от чужди автори върху включените в дисертационния труд работи. Посочените кратки библиометрични показатели са в съответствие със Заключителни разпоредби КЪМ ПОСТАНОВЛЕНИЕ № 122 ОТ 29 ЮНИ 2018 Г. ЗА ИЗМЕНЕНИЕ И ДОПЪЛНЕНИЕ НА ПРАВИЛНИКА ЗА ПРИЛАГАНЕ НА ЗАКОНА ЗА РАЗВИТИЕТО НА АКАДЕМИЧНИЯ СЪСТАВ В РЕПУБЛИКА БЪЛГАРИЯ и посочените минимални национални изисквания към научната, преподавателската и/или художественотворческата или спортната дейност на академичния персонал в област 4 (Природни науки, математика и информатика) и професионално направление 4.2. Химически науки. Публикации в специализирани научни издания ФВ Кв. Точ. P1 Ivanova, B. Stochastic dynamic mass spectrometric quantitative and structural analyses of pharmaceutics and biocides in biota and sewage sludge - - - (2023) International Journal of Molecular Sciences 24:6306. 5.6 Q1 25 [ДРО: 10.3390/ijms24076306] - - - 1. Yang H. et al. Enhancing acetaminophen removal through persulfate activation with ZnCl2-SPI biochar: A study on reactive oxygen species contribution according to acetaminophen concentration Chemical Engineering Journal 496 (2024) 154065 [10.1016/j.cej.2024.154065] 2. Zhao F., Yu Q., Zhang X. A mini-review of antibiotic resistance drivers in urban wastewater treatment plants: Environmental concentrations, mechanism and perspectives. Water (Switzerland), 15 (2023) 3165 [10.3390/w15173165] 3. Singh N. et al. Analytical mass spectrometry as a versatile tool in omics, diagnostics, and environmental monitoring. International Journal of Medical, Pharmaceutical and Health Sciences 2 (2025) 275–285 [10.62946/IJMPHS/2.2.275-285] - - - P2 Ivanova, B. - - - Stochastic dynamics mass spectrometric structural analysis of poly(methyl methacrylate) - - - (2024) Universal Journal of Carbon Research 2:60–88. - - 6 [ДРО:10.37256/ujcr.2120244425] - - - - - - P3 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Stochastic dynamic ultraviolet photofragmentation and high collision energy dissociation mass spectrometric kinetics of triadimenol and sucralose - - - (2023) Environmental Science and Pollution Research 30: 32348–32370. 5.19 Q1 25 [10.1007/s11356-022-24259-z] - - - - - - P4 Ivanova, B. - - - Special Issue with Research Topics on “Recent Analysis and Applications of - - - 148 Mass Spectra on Biochemistry” (2024) International Journal of Molecular Sciences 25:1995. 5.6 Q1 25 [ДРО: 10.3390/ijms25041995]. - - - - - - 1. Mo K. et al. Fresh meat classification using laser-induced breakdown spectroscopy assisted by LightGBM and optuna foods 13 (2024) 2028 [10.3390/foods13132028] P5 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Stochastic dynamic quantitative and 3D structural matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analyses of mixture of nucleosides - - - (2022) Journal of Molecular Structure, 1260:132701. 3.8 Q1** 25 [ДРО: 10.1016/j.molstruc.2022.132701] - - - 1. Yang R. et al. Intelligent 3D visual defect detection for industrial applications. Journal of Physics 2365 (2022) 012050 [10.1088/1742-6596/2365/1/012050] 2. Wang C. Condensed matter structure evolution and mathematical probability mechanisms based on high-dimensional data. Journal of Computational Methods in Sciences and Engineering (2025) [https://doi.org/10.1177/14727978251352149] - - - P6 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Mass spectrometric stochastic dynamic 3D structural analysis of mixture of steroids in solution — Experimental and theoretical study - - - (2022) Steroids, 181:109001. 2.7 Q2 20 [ДРО: 10.1016/j.steroids.2022.109001] - - - - - - P7 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Exact quantifying of mass spectrometric variable intensity of analyte peaks with respect to experimental conditions of measurements — a stochastic dynamic approach - - - (2022) Analytical Chemistry Letters 12:542–561. - Q3** 15 [ДРО: 10.1080/22297928.2022.2142844] - - - - - - P8 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Stochastic dynamic electrospray ionization mass spectrometric quantitative analysis of metronidazole in human urine - - - (2022) Analytical Chemistry Letters 12:322–348. - Q3** 15 [ДРО: 10.1080/22297928.2022.2086822] - - - 1. Singh N. et al. Analytical mass spectrometry as a versatile tool in omics, diagnostics, and environmental monitoring. International Journal of Medical, Pharmaceutical and Health Sciences 2(2) (2025) 275–285 [10.62946/IJMPHS/2.2.275-285] - - - P9 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Electrospray ionization stochastic dynamic mass spectrometric 3D structural analysis of ZnII–ion containing complexes in solution - - - (2022) Inorganic and Nano-Metal Chemistry 52:1407–1429. 1.7 Q3 15 [ДРО: 10.1080/24701556.2021.1956963] - - - 1. Li Y. et al. Leaching kinetics of hemimorphite with 5-sulfosalicylic acid. Metals 13 (2023) 1249 [10.3390/met13071249] 2. Xu B. et al. Suitable stereoscopic configuration of electrolyte additive enabling highly reversible and high-rate Zn anodes. Molecules 29 (2024) 3416 [10.3390/molecules29143416] - - - P10 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Stochastic dynamic mass spectrometric quantification of steroids in mixture — Part II - - - (2020) Steroids 164: 108750. 2.7 Q2 20 [ДРО: 10.1016/j.steroids.2020.108750] - - - 1. Zhu L. et al. An adaptively filtered precise integration method considering perturbation for stochastic dynamics problems. Acta Mechanica Solida Sinica 36 (2023) 317–326 [10.1007/s10338-023-00381-4]. - - - P11 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Electrospray ionization mass spectrometric solvate cluster and multiply charged - - - 149 ions: a stochastic dynamic approach to 3D structural analysis (2020) SN Applied Sciences 2:731. 2.6 Q2 20 [ДРО: 10.1007/s42452-020-2555-0] - - - 1. Janjić G. et al. Degradation of tartrazine by Oxone® in the presence of cobalt based catalyst supported on pillared montmorillonite - Efficient technology even in extreme conditions. Environmental Pollution 331 (2023) 121863 [10.1016/j.envpol.2023.121863]. 2. Xing Y. et al. Recent advances in metal–organic frameworks for the surface modification of the zinc metal anode: A review. Coatings 13 (2023) 1457 [10.3390/coatings13081457]. - - - P12 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - 3D structural analysis of isomers of benzaldehydes and benzoic acids and their base catalysed C-C coupled derivatives under electrospray ionization conditions – mass spectrometric stochastic dynamic and quantum chemical approaches - - - (2020) Journal of Molecular Structure, 1199:127022. 3.8 Q1** 25 [ДРО: 10.1016/j.molstruc.2019.127022] - - - - - - P13 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Stochastic Dynamic Mass Spectrometric Approach to Quantify Reserpine in Solution - - - (2020) Analytical Chemistry Letters 10: 703–721. - Q3** 15 [ДРО: 10.1080/22297928.2020.1865834] 1. Fang L. et al. Research on unsteady flow measurement standard device based on active piston. Flow Measurement and Instrumentation 91 (2023) 102340 [10.1016/j.flowmeasinst.2023.102340]. - - - P14 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - A mass spectrometric stochastic dynamic diffusion approach to selective quantitative and 3D structural analyses of native cyclodextrins by electrospray ionization and atmospheric pressure chemical ionization methods - - - (2019) Bioorganic Chemistry 93: 103308. 5.1 Q1 25 [ДРО: 10.1016/j.bioorg.2019.103308] - - - - - - P15 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Stochastic dynamic electrospray ionization mass spectrometric diffusion parameters and 3D structural determination of complexes of AgI–ion – Experimental and theoretical treatment - - - (2019) Journal of Molecular Liquids, 292:111307. 6 Q1 25 [ДРО: 10.1016/j.molliq.2019.111307] - - - 1. Badilla-Murillo F. et al. Reduction of the cycle time in the biopsies diagnosis through a simulation based on the Box Müller algorithm. Frontiers in Public Health 10 (2022) 809534 [10.3389/fpubh.2022.809534]. - - - P16 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Stochastic dynamic electrospray ionization mass spectrometric diffusion parameters and 3D structural analysis of coordination species of copper(II) ion with glycylhomopentapeptide and its dimeric associates - - - (2019) Journal of Molecular Liquids 282:70–87. 6 Q1 25 [ДРО: 10.1016/j.molliq.2019.02.116] - - - 1. Barati Rashvanlou R. et al. Effect of micro-aerobic process on improvement of anaerobic digestion sewage sludge treatment: Flow cytometry and ATP assessment. RSC Advances 10 (2020) 35718 – 35728 [10.1039/d0ra05540a]. - - - P17 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - 3D structural analysis of copper(II) complex of glycine – Experimental mass spectrometric and theoretical quantum chemical approach - - - (2019) Journal of Molecular Structure 117:192–204. 3.8 Q1** 25 [ДРО: 10.1016/j.molstruc.2018.10.088] - - - 1. Wang S. et al. Rapidly quantitative analysis of γ-glutamyltranspeptidase activity in the lysate and blood via a rational design of the molecular probe by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry. Talanta 205 (2019) 120141 [10.1016/j.talanta.2019.120141] 2. Da-yang T. et al. Structures, temperature effect, binding and clustering - - - 150 energies of Cu2+(MeOH)n=1-8 clusters and extrapolations. Journal of Molecular Liquids 360 (2022) 119439 [10.1016/j.molliq.2022.119439] 3. Qureshi N. et al. Dansyl based selective fluorescence sensor for Hg in aqueous environment: An experimental and computational studies. Zeitschrift fur Physikalische Chemie 237 (2023) 1311–1323 [10.1515/zpch-2022-0172] 4. Da-yang T. et al. Theoretical study of the Cu2+-glycine interaction in ammonia and temperature effects. Journal of Molecular Liquids 393 (2023) 123606 [10.1016/j.molliq.2023.123606]. 5. Hou L. et al. An electrochemical study of the dissolution behavior of gold in a novel glycine-thiosulfate system. Minerals Engineering 202 (2023) 108273, [10.1016/j.mineng.2023.108273] 6. Da-yang T. et al. Structures, spectroscopy, binding and clustering energies of the hydrated copper dication clusters. Computational and Theoretical Chemistry 1236 (2024) 114609 [10.1016/j.comptc.2024.114609] P18 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - A stochastic dynamic mass spectrometric diffusion method and its application to 3D structural analysis of the analytes (2019) Reviews in Analytical Chemistry 1:20190003. 4.3 Q1** 25 [ДРО: 10.1515/revac-2019-0003] - - - - - - P19 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Experimental and theoretical mass spectrometric quantification of diffusion parameters and 3D structural determination of ions of L-tryptophyl-L-tryptophan in electrospray ionization conditions in positive operation mode - - - (2018) Journal of Molecular Structure 1173:848–864. 3.8 Q1** 25 [ДРО: 10.1016/j.molstruc.2018.07.055] - - - 1. Yu Z. et al. Determination of oroxin A, oroxin B, oroxylin A, oroxyloside, chrysin, chrysin 7O-beta-gentiobioside, and guaijaverin in mouse blood by UPLC-MS/MS and its application to pharmacokinetics. Acta Chromatographica 34 (2022) 394–402 [10.1556/1326.2021.00963]. - - - P20 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - On the [2+2] cycloaddition reaction of configurationally locked polyenes – An experimental and theoretical study - - - (2018) Journal of Molecular Structure 1170: 90–104. 3.8 Q1** 20 [ДРО: 10.1016/j.molstruc.2018.05.064] - - - 1. Sun H. Verbenone-based push–pull chromophores with giant first hyperpolarizabilities: A new structure–property correlation study. International Journal of Quantum Chemistry 124 (2024) e27244 [10.1002/qua.27244]. - - - P21 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Quantitative correlations between collision induced dissociation mass spectrometry coupled with electrospray ionization or atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry – Experiment and theory - - - (2018) Journal of Molecular Structure 1157:492–512. 3.8 Q1** 20 [ДРО: 10.1016/j.molstruc.2017.12.098] - - - 1. Prókai L. et al. Mass spectrometry of natural and synthetic chalcones. Chalcones and their Synthetic Analogs (2020) 39–55. 2. Wu F. et al. Alkali metal ion-induced conformation changes of methionineand leucine enkephalin investigated by gas-phase hydrogen/deuterium exchange combined with theoretical calculations. Journal of Molecular Structure 1233 (2021) 130113, [10.1016/j.molstruc.2021.130113] 3. Lee S. et al. Solvent composition dependent signal reduction of molecular ions generated from aromatic compounds in (+) atmospheric pressure photoionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry 32 (2018) 973–980, [10.1002/rcm.A127] 4. Zhang Y. et al. Phenylboronic acid functionalized C3N4 facultative hydrophilic materials for enhanced enrichment of glycopeptides. Talanta 191 (2019) 509–518, [10.1016/j.talanta.2018.09.016] 5. Weaver G. Electrophilic aromatic substitution (2021) Organic Reaction Mechanisms 2018: An annual survey covering the literature dated January to December 2018, 191–226 [10.1002/9781119531975.ch5b] - - - P22 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Quantitative collision induced mass spectrometry of substituted piperazines – A 151 correlative analysis between theory and experiment (2017) Journal of Molecular Structure 1149:243–256. 3.8 Q1** 20 [ДРО: 10.1016/j.molstruc.2017.07.107] - - - 1. Le M. et al. Fragmentation of polyfunctional compounds recorded using automated high-throughput desorption electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (2021) 2261–2273 [10.1021/jasms.1c00176] 2. Lee S. et al. Solvent composition dependent signal reduction of molecular ions generated from aromatic compounds in (+) atmospheric pressure photoionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 32 (2018) 973–980 [10.1002/rcm.8127]. - - - P23 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Collision-induced thermochemistry of reactions of dissociation of glycyl– homopeptides — An experimental and theoretical analysis - - - (2017) Biopolymers 107: 80–89. 2.9 Q2 20 [ДРО: 10.1002/bip.22996] - - - 1. Hamaneh M. et al. Systematic assessment of deep learning-based predictors of fragmentation intensity profiles. Journal of Proteome Research. 23 (2024) 1983–1999 [10.1021/acs.jproteome.3c00857] 2. Martínez-Flores C. et al. Rotational and vibrational effects on the energy loss of hydrogen colliding on glycine at low irradiation energies, Radiation Physics and Chemistry. 166 (2021) 108513 [10.1016/j.radphyschem.2019.108513] - - - P24 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Molecular and environmental factors governing non-covalent bonding interactions and conformations of phosphorous functionalized γ-cyclodextrin hydrate systems - - - (2016) International Journal of Biological Macromolecules 87:263–272. 8.2 Q1 25 [ДРО: 10.1016/j.ijbiomac.2016.02.078] - - - 1. Feng Y. et al. Cellular deoxyribonucleic-acid probes of two-photon-excited fluorescent quinolinium-substituted carbazole. Analyst 144 (2019) 1245–1252 [10.1039/c8an01597j] 2. Ferino-Pérez A. et al. Evaluation of the molecular inclusion process of βhexachlorocyclohexane in cyclodextrins. RSC Advances. 9 (2019) 27484– 27499 [10.1039/c9ra04431k] 3. Lv P. et al. Structural analysis and cytotoxicity of host-guest inclusion complexes of cannabidiol with three native cyclodextrins. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 51 (2019) 337–344 [10.1016/j.jddst.2019.03.015]. - - - P25 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Macromolecular ensembles of cyclodextrin crystallohydrates and clathrates - experimental and theoretical gas - and condense phase study - - - (2014) International Journal of Biological Macromolecules 64:383–391. 8.2 Q1 25 [ДРО: 10.1016/j.ijbiomac.2013.12.026] - - - 1. Khuntawee W. et al. A molecular dynamics study of conformations of betacyclodextrin and its eight derivatives in four different solvents, Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (2017) 24219–24229 [10.1039/c7cp04009a] 2. Ryzhakov A. et al. Self-Assembly of Cyclodextrins and Their Complexes in Aqueous Solutions. Journal of Pharmaceutical Sciences 105 (2016) 2556–2569 [10.1016/j.xphs.2016.01.019]. 3. Wu T. et al. Recognition of Oligosaccharides by Chirality Induced in Europium (III) Compounds. Chemistry - An Asian Journal 13 (2018) 3865–3870 [10.1002/asia.201801157] 4. Bouzitouna A. et al. A hybrid MP2/DFT scheme for N-Nitroso-N-(2chloroethyl)-N'-sulfamoylprolinate/β-cyclodextrin supramolecular structure: AIM, NBO analysis. Computational and Theoretical Chemistry. 1100 (2017) 18–27 [10.1016/j.comptc.2016.12.004] 5. Ghorpade V. et al. Sreparation and evaluation of domperidone/βcyclodextrin/Citric acid/mannitol quaternary inclusion complex: An in vitro study. Asian Journal of Pharmaceutics. 10 (2016) S375–S385 6. Lv P. et al. Structural analysis and cytotoxicity of host-guest inclusion complexes of cannabidiol with three native cyclodextrins. Journal of Drug Delivery Science and Technology 51 (2019) 337–344 - - - 152 [10.1016/j.jddst.2019.03.015] 7. Chatziefthimiou S. et al. Molecular recognition of N-acetyltryptophan enantiomers by β-cyclodextrin. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 13 (2017) 1572–1582 [10.3762/bjoc.13.157]. 8. Clercq S. et al. In-depth study of cyclodextrin complexation with carotenoids toward the formation of enhanced delivery systems. Molecular Pharmaceutics. 18 (2021) 1720–1729 9. Diska L. et al. Interactions of lycopene with β-cyclodextrins: Raman spectroscopy and theoretical investigation. Physical Chemistry Chemical Physics 27 (2025) 7874–7881 [10.1039/d5cp00034c] P26 Ivanova, B., - - - Organosilver(I/II) catalyzed C-N coupling reactions - phenazines - - - (2013) Catalysis Science and Technology 3: 1129–1135. 5 Q2 20 [ДРО:10.1039/C3CY20798F] - - - 1. Zheng Q., Jiao N. Coupling reactions and C-H functionalization. Silver Catalysis in Organic Synthesis. (2018) 331–406 2. Sun H. et al. Gas phase chemistry of N-benzylbenzamides with silver(i) cations: Characterization of benzylsilver cation. Organic and Biomolecular Chemistry 13 (2015) 2561–2565 3. Aksenov A. et al. Direct metal-free synthesis of diarylamines from 2nitropropane via the twofold C-H functionalization of arenes. RSC Advances. 5 (2015) 84849–84855 [10.1039/c5ra17668a] - - - P27 Ivanova, B. - - - Molecular design and physical properties of highly functionalized configurationally locked polyenes-an experimental and theoretical study - - - (2013) Journal of Materials Chemistry C 1:6278–6298. 6.4 Q1 25 [ДРО: 10.1039/c3tc30568f] - - - 1. Zhai Y. et al. Structural design and characterization of a new type of organic nonlinear optical flavanone crystal. Journal of Molecular Structure. 1322 (2025) 140305 [10.1016/j.molstruc.2024.140305]. 2. Erande Y. et al. Spectroscopic, DFT and Z-scan supported investigation of dicyanoisophorone based push-pull NLOphoric styryl dyes. Optical Materials. 66 (2017) 494–511 [10.1016/j.optmat.2017.03.005] - - - P28 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Silver(I) and zinc(II) organometallic intermediates, catalysing coupling reactions of polysubstituted benzoic acids – Experimental and theoretical study (2013) Chemical Engineering Journal 232:118–127. 15.0 Q1 25 [ДРО: 10.1016/j.cej.2013.07.089] - - - 1. Hu Y. et al. DFT investigation on the decarboxylation mechanism of ortho hydroxy benzoic acids with acid catalysis. Journal of Molecular Modeling 22, 56 (2016) 1–11 [10.1007/s00894-016-2923-2]. 2. Gao L. et al. DFT computational study on decarboxylation mechanism of salicylic acid and its derivatives in the anionic state. Journal of Molecular Structure 1116 (2016) 56–61 [10.1016/j.molstruc.2016.03.005] - - - P29 Ivanova, B.; Spiteller, M. - - - Organometallic Sn(II) catalyzing adducts of substituted benzaldehydes 15.0 Q1 25 (2013) Chemical Engineering Journal 226:113–122. - - - [https://doi.org/10.1016/j.cej.2013.04.034] - - - 1. Cheng Y. et al. Fermentation of highly toxic reed hydrolysate using Candida glycerinogenes to produce platform compound glycerol. International Biodeterioration and Biodegradation 201 (2025) 106069 [10.1016/j.ibiod.2025.106069] - - - P30 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Factors stabilizing the gas-phase ionic species of crystals of organic saltsExperimental and theoretical study - - - (2013) Journal of Molecular Structure 1036:226–234. 3.8 Q1** 20 [ДРО: 10.1016/j.molstruc.2012.11.018] - - - - - - P31 Ivanova, B., Spiteller, M. - - - Matrixes in UV-MALDI mass spectrometry – Crystals of organic salts versus cocrystals of neutral polyfunctional carboxylic acids - - - (2012) Analytical Methods 4:2247–2253. 3.1 Q2 20 153