Grain Size and Electrochemical Surface Modification Effects on Corrosion, Biological, and Technological Properties of CP Titanium Implants

U NIVERZITA K ARLOVA L ÉKAŘSKÁ F AKULTA V P LZNI Ú STAV L ÉKAŘSKÉ C HEMIE A B IOCHEMIE Ú STAV L ÉKAŘSKÉ C HEMIE A B IOCHEMIE TEL . +420 377 593 280 L ÉKAŘSKÁ F AKULTA V P LZNI FAX +420 377 593 289 K ARLOVARSKÁ 48 CHEMIE @ LFP . CUNI . CZ CZ – 301 66 P LZEŇ WWW . LFP . CUNI . CZ / BIOCHEMIE Protokol č. 19Bb01 PROTOKOL O ZKOUŠCE Číslo protokolu: 19Bb01 ADHEZE A PROLIFERACE N ÁZEV PROJEKTU : „Testování proliferace osteoblastů na povrchu titanu (SV100)“ Z KUŠEBNÍ METODA : „Adheze a proliferace osteoblastů na povrchu pevného materiálu“ Z KOUŠENÝ MATERIÁL : Dodán zadavatelem, vzorky popsané znaky A = V4 … oxidace při 40V B = V4t … oxidace při 40V term. C = V6 … oxidace při 60V D = V6t … oxidace při 60V term. E = Ti60… Timplant oxidace při 60V F = Ti0 … Timplant leptané kontrola Č ÍSLO ZAKÁZKY : SV100/2018 Z ADAVATEL : TIMPLANT s.r.o. V ÝSLEDEK ZKOUŠKY : Mezi jednotlivými vzorky existují rozdíly i shody uvedené v protokolu. H ODNOCENÍ VÝSLEDKŮ : Provádí se srovnáním jednotlivých vzorků. Interpretace výsledků provádí zadavatel. Výsledky zkoušek se týkají pouze předmětu zkoušky. Tento protokol o zkoušce nenahrazuje schválení zdravotnického prostředku. Protokol je možno reprodukovat jen jako celek. P OČET STRAN PROTOKOLU : 4 Z KOUŠKU PROVEDLI : Mgr. Jana Kolaja Dobrá, Ph.D., Mgr. Jana Dvořáková, Bc. Jan Javůrek D ATUM : 16. 1. 2019 S CHVÁLIL : Ing. Václav Babuška, Ph.D. U NIVERZITA K ARLOVA L ÉKAŘSKÁ F AKULTA V P LZNI Ú STAV L ÉKAŘSKÉ C HEMIE A B IOCHEMIE Ú STAV L ÉKAŘSKÉ C HEMIE A B IOCHEMIE TEL . +420 377 593 280 L ÉKAŘSKÁ F AKULTA V P LZNI FAX +420 377 593 289 K ARLOVARSKÁ 48 CHEMIE @ LFP . CUNI . CZ CZ – 301 66 P LZEŇ WWW . LFP . CUNI . CZ / BIOCHEMIE D ATUM PŘIJETÍ VZORKŮ : 10.10.2018 D ATUM ZAHÁJENÍ ZKOUŠKY : 3.12.2018 D ATUM UKONČENÍ ZKOUŠKY : 14.12.2018 P OPIS VZORKŮ : Vzorky válcovité o průměru 5,0 mm a výšce 5,0 mm se závitem na zadní straně. P ODSTATA METODY : Stanovení buněčné adheze a proliferace na zkoumaném vzorku při definovaných kultivačních podmínkách pomocí CCK-8 testu. Tento kolorimetrický test je založen na schopnosti živých buněk redukovat prostřednictvím elektronového mediátoru vysoce rozpustnou tetrazolovou sůl WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrofenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-(2,4-disulfofenyl)-2H-tetrazol sodný] na oranžově zbarvený formazan rozpustný v kultivačním médiu. Výsledné zabarvení se vyhodnocuje spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm. Naměřená absorbance je přímo úměrná množství živých buněk. 1,2 B UNĚČNÁ LINIE : linie lidských osteoblastů MG-63 (Sigma Aldrich) P OUŽITÉ MATERIÁLY A CHEMIKÁLIE : Dulbecco's Modified Eagle Medium - DMEM (Diagnovum) Penicillin/Streptomycin 100× (Biosera) L-Glutamine 200 mM (Diagnovum) Fetal Bovine Serum - FBS (Diagnovum) Trypsin EDTA 10× 0.5% / 0.2% in DPBS (Diagnovum) WST-8 [2-(2-methoxy-4-nitrofenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-(2,4-disulfofenyl)-2H-tetrazol sodný] (Biotool) 96jamkové kultivační destičky (TPP) P OPIS METODY : Na sterilizovaný povrch vzorku je nanesena buněčná suspenze a vzorek s buňkami je kultivován v inkubátoru při teplotě 37°C v atmosféře s 5% CO 2 . Po 2 hodinách je proveden opatrný oplach vzorku zajišťující další růst pouze adherovaných buněk. Adheze je stanovena testem CCK-8 a změřením absorbance. Hodnota absorbance odpovídá relativnímu počtu buněk na materiálu. Po 48 1 M. Ishiyama, Y. Miyazono, K. Sasamoto, Y. Ohkura and K. Ueno, Talanta, 1997, 44, 1299. 2 H. Tominaga, M. Ishiyama, F. Ohseto, K. Sasamoto, T. Hamamoto, K. Suzuki and M. Watanabe, Anal. Commun.,1999, 36, 47. U NIVERZITA K ARLOVA L ÉKAŘSKÁ F AKULTA V P LZNI Ú STAV L ÉKAŘSKÉ C HEMIE A B IOCHEMIE Ú STAV L ÉKAŘSKÉ C HEMIE A B IOCHEMIE TEL . +420 377 593 280 L ÉKAŘSKÁ F AKULTA V P LZNI FAX +420 377 593 289 K ARLOVARSKÁ 48 CHEMIE @ LFP . CUNI . CZ CZ – 301 66 P LZEŇ WWW . LFP . CUNI . CZ / BIOCHEMIE hodinách je proveden druhý CCK-8 test a změřena absorbance. Rozdíl mezi zjištěnými hodnotami absorbance vyjadřuje proliferaci buněk. N EGATIVNÍ KONTROLA : CCK-8 test provedený pro kultivační médium bez buněk. P OZITIVNÍ KONTROLA : CCK-8 test provedený pro nanášenou suspenzi buněk kultivovanou na běžné polystyrenové kultivační misce za stejných podmínek jako na studovaných vzorcích. Z PRACOVÁNÍ VÝSLEDKŮ : Výsledky jsou zpracovány na základě porovnání počtu buněk na povrchu zkoušeného materiálu a na běžné polystyrenové kultivační misce za stejných podmínek kultivace. V ÝSLEDKY ZKOUŠKY : Srovnání adheze a proliferace linie lidských osteoblastů MG-63 kultivovaných na testovaných materiálech jako monobiologický test se vzorky v pentaplikátu. Výsledky jsou vyjádřeny jako arbitrární jednotky vycházející ze změřené absorbance. Chybové úsečky v grafu odpovídají směrodatné odchylce. Tabulkově Číslo vzorku V4 V4t V6 V6t Ti60 Ti0 plast Adheze [arb. j.] (průměr) 0,1854 0,2054 0,2474 0,2298 0,3020 0,2312 0,2218 Proliferace [arb. j.] (průměr) 0,5600 0,6226 0,7376 0,7222 0,6426 0,6964 0,8410 Rozdíl [arb. j.] (průměr) 0,3746 0,4172 0,4902 0,4924 0,3406 0,4652 0,6192 Adheze [arb. j.] (medián) 0,185 0,222 0,244 0,227 0,318 0,239 0,230 Proliferace [arb. j.] (medián) 0,634 0,678 0,807 0,726 0,639 0,749 0,875 Rozdíl [arb. j.] (medián) 0,449 0,456 0,563 0,499 0,321 0,510 0,645 Drsnost Ra [µm] 0,142 0,144 0,158 0,151 0,343 0,362 --- Smáčitelnost [°] (průměr) 60,5 72,2 91,0 94,4 101,3 94,3 --- Smáčitelnost [°] (median) 58,5 72,5 91,0 93,0 95,0 92,0 --- U NIVERZITA K ARLOVA L ÉKAŘSKÁ F AKULTA V P LZNI Ú STAV L ÉKAŘSKÉ C HEMIE A B IOCHEMIE Ú STAV L ÉKAŘSKÉ C HEMIE A B IOCHEMIE TEL . +420 377 593 280 L ÉKAŘSKÁ F AKULTA V P LZNI FAX +420 377 593 289 K ARLOVARSKÁ 48 CHEMIE @ LFP . CUNI . CZ CZ – 301 66 P LZEŇ WWW . LFP . CUNI . CZ / BIOCHEMIE Graficky K ONEC PROTOKOLU V4 V4t V6 V6t Ti60 Ti0 Buňky na titanovém materiálu po 48 hodinách kultivace. Barveno krystalovou violetí, zvětšení 30x. De monstrační fot ografie .