Nuova incertezza per processi multifase e risultati qualitativi nei laboratori medici - Il dubbio per valori quantitativi e qualitativi

NUOVA DEFINIZIONE D’INCERTEZZA La metrologia vuole distinguere il concetto d’incertezza dagli abiti confezionati per stimarla. Napoleone Bonaparte (dice Antonio Possolo, Chief Statistician di NIST) non può essere descritto dagli abiti che indossa nel ritratto in cui attraversa le Alpi o da quelli differenti raffigurati nell’esilio a Sant’Elena, mol - to più semplici con un atteggiamento cupo. Il 2 luglio 2025, il Joint Committee for Guides in Metrology (JCGM) ha organizzato un seminario internet molto partecipato per presentare e discutere una nuova definizione d’incertezza di misura: quella che troviamo in JCGM GUM-1:2023 (ISO/IEC Guide 981:2024) punto 3.4. Con l’avallo ufficiale di Unione Internazionale di Chimica Pura e Applicata (IUPAC, Possolo 2024). Già nel 2015 veniva usata dal National Institute of Standards and Technology (NIST) degli Stati Uniti: “... il dubbio sul valore reale del misurando che rimane dopo aver effettuato IL CONCETTO D’INCERTEZZA IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) (Possolo, Pure and Applied Chemistry 2024) ereditava dal manuale NIST del 2019 il concetto che la misurazione produce una stima quantitativa o qualitativa del valore reale di una proprietà di un materiale, di un oggetto virtuale, di un insieme di oggetti, di un processo, di un evento o di una serie di eventi. Il tema della definizione di GUM-1 2023 è stato già affrontato da Luca Mari su queste colonne (T_M N.1/25 pagine 105-107). Le obiezioni teoriche di Mari (pluralità di significati, entità psicologica, anziché matematica, e relazione con il valore vero) vanno oltre lo scopo di questa breve nota, in cui si guarda invece alle possibili implicazioni pratiche. Possolo (Metrologia 2025) riporta le motivazioni per la nuova definizione da due punti di vista: concettuale e pratico. La vecchia definizione (ISO/IEC Guide 98-1:2009; JCGM 100:2008, VIM3), definendo incertezza un “parametro”, commetterebbe un ”errore di categoria”, ossia quando entità di una categoria logica vengono presentate come se appartenessero a una categoria diversa. Per Vocabolario Treccani come per Enciclopedia Britannica, in matematica e nel linguaggio tecnico e scientifico, “parametro” è usato con il significato di variabile indipendente. Mentre per l’Oxford English Dictionary (OED), “incertezza” è “lo stato di non essere NEW UNCERTAINTY FOR MULTI-PHASE PROCESSES AND QUALITY RESULTS IN MEDICAL LABORATORIES JCGM presents a definition of measurement uncertainty that corrects the previous one and improves handling of scenarios other than scalar (quantitative) measurements, such as classificatory or qualitative (nominal and ordinal) properties. NIST shows situations in biology and medicine with nominal results. Accreditation of medical laboratories and testing laboratories is asked to handle these situations. ISO produces detailed guides. Laboratories today have all the necessary tools. RIASSUNTO JCGM presenta una definizione d’incertezza di misura che corregge la precedente e migliora la gestione di scenari diversi dalle misure scalari (quantitative), come le proprietà classificatorie o qualitative (nominali e ordinali). NIST racconta situazioni in biologia e medicina con risultati nominali. Per l’accreditamento di laboratori medici e laboratori di prova si chiede la gestione di queste situazioni. ISO produce guide dettagliate. I laboratori hanno oggi tutti gli strumenti necessari. una misurazione. L’incertezza di misura è descritta in modo completo e quantitativo da una distribuzione di probabilità sull’insieme dei valori del misurando”. JCGM e NIST fanno due sostituzioni: tolgono “parametro” e “valori quantitativi”, mettono “dubbio” e “probabilità”. Così rientra nell’incertezza una gam - ma molto più ampia di risultati, compresi quelli di classificazioni, identificazioni, esami e altro. Molti esempi vengono proprio da biologia, anche forense, e medicina. Su queste colonne abbiamo già evidenziato come processi di esame (me - dico o forense) articolati in più passaggi portino a definire metriche multiple per la qualità. Come nel caso dei sequenziamenti NGS. (T_M N. 1/24 pagine 43-46). Ma abbiamo anche sollevato il problema del riconoscimento dell’incertezza quando il risultato è nominale, dandone il rilievo necessario per i laboratori medici (T_M N. 2/22 pagine 23-25) (T_M N. 4/21 pagine 51-53). T_M N. 4/25 23 L’INCERTEZZA NEI LABORATORI MEDICI Nuova incertezza per processi multifase e risultati qualitativi nei laboratori medici Marco Pradella Il dubbio per valori quantitativi e qualitativi GLI ALTRI TEMI s Società Italiana di Patologia Clinica e Medicina di Laboratorio, Commissione Nazionale Qualità e Accreditamento, Castelfranco Veneto (TV) [email protected] N. 04 ;2025 T_M 25 GLI ALTRI TEMI s sicuramente conosciuto o perfettamente chiaro; dubbio o vaghezza”. Possolo nota che la caratterizzazione dell’incertezza di misura come “parametro” ostacola l’applicazione dei metodi odierni, come i Monte Carlo e i bayesiani. Forse parole come “dubbio” e “incertezza” possono gettare una luce negativa sulla scienza e sulla tecnologia, particolarmente sentita in medicina di laboratorio, dove i due termini non vengono dati ai pazienti. Però i risultati possono essere accompagnati da “intervalli di normalità” o “intervalli di riferimento”, quindi in un certo senso da vincoli di certezza. Ma così non si danno informazioni sull’affidabilità del valore misurato. Inoltre, gli intervalli “normali” o “di riferimento” possono variare sensibilmente tra i la - bo ratori. Alcuni autori ritengono, in - vece, che si debba spiegare pedagogicamente ai pazienti il significato e le fonti dell’incertezza. Il vero problema, quindi, non è tanto la percezione negativa associata a termini come “dubbio” o “incertezza”, ma la familiarità con i concetti di base sulla qualità delle misurazioni, in particolare in medicina di laboratorio. Secondo Possolo, gli stessi pazienti trarrebbero vantaggio dalla conoscenza del grado di dubbio delle misurazioni che riguardano la loro salute. Le interessanti questioni se l’incertezza sia o meno essa stessa quantitativa e se corrisponda o no all’ ”errore”, sono trat tate da Possolo ma vanno oltre lo scopo di questa nota. INCERTEZZE NELLA PRATICA DI BIOLOGIA E MEDICINA Biologia e medicina forniscono molti esempi d’incertezza a cui la vecchia definizione VIM mal si adatta. Ad e - sempio, il salmone Coho (Oncorhynchus kisutch) viene classificato con incertezza descritta non da varianza e scarto tipo, ma dalle probabilità di specie alternative (Ellisor e Possolo 2025). NIST afferma di essere “molto fiducioso” nell’identificazione del materiale di riferimento 8256 come tessuto di salmone Coho, ottenuto con il profilo del DNA forense, usato ad esempio anche guanina e timina. La distribuzione di probabilità di questa variabile casuale è discreta e la sua unità di probabilità è assegnata ai quattro possibili valori: per esempio, 30% è la probabilità di trovare l’adenina in un particolare locus. RISULTATI QUALITATIVI NEL MONDO REALE Pressata dalle necessità pratiche, NIST ha trovato la soluzione per le proprietà qualitative nel caso di materiali di riferimento, come nel caso del materiale di riferimento 8256 (Possolo 2024). Altri casi esemplari possono essere l’identità di un policlorobifenile (PCB) e la specie di un acero (genere Acer) (Possolo A and Meija J 2022). La prima ha più di 200 valori possibili, la seconda più di 160. Oppure, un animale del genere Panthera, da confrontare con cinque specie di questo genere: tigre, leopardo, giaguaro, leone o leopardo delle nevi. Riconoscendo il limitato stato dell’arte, ISO risponde con la norma ISO 33406:2024 (materiali di riferimento con valori qualitativi), applicazione dei requisiti generali di ISO 17034:2016 (guida assegnazione dei valori, valutazione di omogeneità e stabilità, riferibilitò metrologica e valutazione dell’incertezza). ISO 33406 utilizza il termine “confidenza” per il dubbio assegnato a una proprietà qualitativa, in luogo di “in - certezza”. Forse ISO sorvola sulla possibile ambiguità con “confidenza” in statistica. ISO 33406 consente an che di esprimere la confidenza in mo do qualitativo, utilizzando una sca la ordinale (ad esempio: molto confidente, confidente, moderatamente confidente), purché comprensibile al l’utente. ISO 33406 prevede dichiarazioni quantitative di confidenza sui valori qualitativi assegnati. Ad esempio, un rapporto di verosimiglianza o una distribuzione di probabilità dei valori della proprietà qualitativa. Può anche utilizzare misure di confidenza derivate da tassi di risposta falsa, come la sensibilità e la specificità. per determinare l’autenticità dei frutti di mare. Quindi una distribuzione di - screta di probabilità su un insieme di specie di pesci può essere utilizzata per l’incertezza che circonda la classificazione. Tale distribuzione non ha scarto tipo (perché è su un insieme di valori di una proprietà nominale) né è specificata dal valore di un parametro, ma solo dall’insieme delle probabilità che assegna alle diverse specie considerate. Le espressioni dell’incertezza associate ai valori qualitativi e quantitativi possono essere esse stesse qualitative o quantitative. Se, ad esempio, NIST è solo “molto fiducioso” nell’identificazione del materiale di riferimento 8256, altri (Ellisor 2025) diversamente stimano del 97,7% la fiducia per escludere qualche altra specie di salmonide. Il valore reale di questa sensibilità è compreso tra il 94,7 e il 99,7%, sulla base della statistica non parametrica bootstrap. Il profilo del DNA forense è comunemente utilizzato anche nella determinazione degli organismi geneticamente modificati (OGM), di solito senza incertezza. Un altro caso è quello del numero di riproduzione R di COVID-19, ovvero il numero medio di infezioni secondarie prodotte da una singola persona infetta. Ogni gruppo di ricerca riporta diversi quantili della distribuzione di probabilità che esprime l’incertezza che circonda R (ad esempio 5°, 25°, 50°, 75° e 95° percentile), mentre la maggior parte delle procedure utilizzate per la meta-analisi prevedono come ingresso media e scarto tipo della distribuzione di R (Possolo 2023). Possolo e Meija (2022) sono assertivi: un valore misurato, stima del valore reale di una proprietà, può essere quantitativo o qualitativo. L’incertezza di misura può essere rappresentata da una distribuzione di probabilità, che va ugualmente bene alla misurazione di proprietà qualitative e quantitative. L’identità del nucleotide in un particolare locus di un filamento di DNA è una variabile casuale (qualitativa) i cui valori possibili sono adenina, citosina, N. 04 ;2025 misura, dev’essere fatta una stima basata sulla conoscenza dei principi teorici o sull’esperienza pratica circa le prestazioni del metodo”. ISO 15189, invece, prescinde da conoscenza ed esperienza del laboratorio, prescrive categoricamente che (punto 7.3.4 lettera f), per i risultati qualitativi da soglia, l’incertezza deve essere stimata utilizzando campioni rappresentativi positivi e negativi. Inoltre (lettera g) l’incertezza nelle fasi di misurazione intermedie o nei risultati del controllo di qualità che producono dati quantitativi dev’essere considerata anche per le parti chiave (ad alto rischio) del processo. Infine, richiama ISO/TS 20914, che fornisce dettagli ed esempi su queste attività. Non si esprime sui risultati qualitativi ottenuti direttamente, senza misurazioni quantitative. GUM del 2008 (ISO/IEC Guide 981:2009) conteneva già una parte della soluzione, confermata identica da GUM 2023 (ISO/IEC Guide 981:2024), dove afferma che “(4.1.1) Nella maggior parte dei casi, un misurando Y non viene misurato direttamente, ma è determinato da N altre quantità X1, X2, ..., XN.”. Come nel principio generale “(3.4.8 del 2008, punto 4.1 del 2023) La valutazione dell’incertezza di misura non è un compito di routine né un compito puramente matematico. Dipende dalla conoscenza dettagliata della natura del misurando e della misura.” Inoltre, “(4.1.2) Le grandezze d’ingresso X1, X2, ..., XN ... possono essere considerate a loro volta come misurandi e possono dipendere da altre grandezze, comprese le correzioni e i fattori di correzione per gli effetti sistematici, ...”. GUM quindi non è per nulla rigida. Le grandezze d’ingresso possono essere indifferentemente (punto 4.1.3) singola osservazione, osservazioni ripetute o giudizi basati sull’esperienza, in - fluenze come temperatura ambiente, pressione barometrica e umidità, fonti esterne, come calibranti, materiali di riferimento certificati e dati di riferimento ottenuti da manuali. ISO 15189 e ISO 20914 raccolgono l’indicazione di GUM 2008, dando ai laboratori medici l’obbligo di stiT_M 27 GLI ALTRI TEMI s Per ISO 33406, se la proprietà qualitativa dipende dalla misurazione di uno o più valori quantitativi, la fiducia nei valori qualitativi assegnati dipende dal controllo delle incertezze relative alle misure intermedie. Si trova lo stesso approccio in ISO 17822:2020, alla definizione 3.8 (materiale di riferimento certificato, CRM), dove se il valore include una proprietà nominale o un attributo qualitativo, come l’identità o la sequenza, le incertezze possono essere espresse come probabilità o livelli di fiducia. EURACHEM ha fornito un suo tentativo per gestire con le probabilità l’incertezza dei risultati qualitativi (Bettencourt da Silva 2021), benché forse affetto da qualche debolezza (Pradella 2023). Anche altri (Meija 2023) adottano la probabilità bayesiana di informazioni storiche, statistiche, analitiche e soggettive per produrre una stima per il caso della posizione di un relitto subacqueo. Il modello di misurazione è bayesiano quando i valori degli ingressi e delle uscite sono modellati come variabili casuali non osservabili e la produzione di una stima del misurando e della sua incertezza comporta l’uso della Regola di Bayes. Nella maggior parte delle applicazioni, sia ingressi sia uscite sono quantità, cioè confrontabili mediante rapporti o differenze. Tuttavia, i metodi bayesiani possono facilmente gestire situazioni in cui l’uscita o alcuni ingressi sono proprietà qualitative (ordinali o nominali). INCERTEZZA E ACCREDITAMENTO ISO Dobbiamo riconoscere che la definizione 2008 dell’incertezza (JCGM 2008 2.2.3), presa isolatamente e alla lettera, ha causato imbarazzo e difficoltà ai laboratori impegnati con i requisiti di accreditamento e agli enti responsabili delle verifiche. Già i redattori di ISO 17025 hanno percepito questo imbarazzo, aggiungendo al punto 7.6.3 (incertezza di misura nelle prove) la chiosa “Quando il metodo di prova preclude una valutazione rigorosa dell’incertezza di mare le incertezze delle misure d’ingresso anche se il risultato finale è nominale. Possolo (2022) descrive l’esempio del gap anionico in modo identico a ISO 20914. Il gap anionico plasmatico, DcAG, è utilizzato in biochimica clinica per determinare se esiste uno squilibrio di elettroliti nel sangue. È definito come una combinazione lineare della concentrazione di due cationi e due anioni: Na+, K+, Cl−, HCO3−. L’incertezza associata al valore di DcAG è composta dalle incertezze delle concentrazioni dei singoli ioni. EVIDENZE DA FORNIRE IN LABORATORIO Le prescrizioni precise di ISO 17025 e ISO 15189 non sono sempre rispettate dai laboratori, nonostante i concetti fondamentali non siano affatto nuovi. I requisiti per l’accreditamento ISO 17025 e ISO 15189 sono affiancati da strumenti normativi ormai indispensabili. ISO/TR 27877:2021 raccoglie soluzioni per risultati binari. ISO 20397-2:2021 e ISO/TS 22692:2020 per processi multifasici (come NGS), dandone le metriche di qualità, alla base della costruzione dell’incertezza. NIST e ISO 33406 lavorano nel mondo reale dei materiali di riferimento, non vengono frenati dai formalismi, devono fornire soluzioni concrete per l’“incertezza” o “confidenza”. Abbiamo perciò sia le basi teoriche sia le guide alla pratica. Il vocabolario metrologico aggiorna le definizioni e ISO fornisce istruzioni sempre più dettagliate. Gli strumenti forniti dalla normazione e dalla metrologia, oggi, ci offrono validi approcci generali alla stima dell’incertezza delle misure nei laboratori medici e forensi. Nessuno può più rifugiarsi in un laconico “non applicabile”. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI Possolo A., Measurement uncertainty redefined. Metrologia 2025;62:042101. N. 04 2025 T_M 28 GLI ALTRI TEMI s Possolo A., Hibbert D.B., Stohner J., Bodnar O., Meija J. ,A brief guide to measurement uncertainty (IUPAC Technical Report). Pure and Applied Chemistry, 2024;96:113-134. Possolo A., Hibbert D.B., Stohner J., Bodnar O. and Meija J., A brief guide to measurement uncertainty (IUPAC Technical Report). Pure Appl Chem 2023;96:113-34. Possolo A., Tracking truth through measurement and the spyglass of statistics. Stat Sci 2023; 38; 655-71. 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Componente delle Commissioni tecniche UNI/CT 527 “U - NINFO Informatica medica” e UNI/CT 044 “Tecnologie biomediche e diagnostiche”. Già Direttore del Servizio Qualità e prima del Laboratorio ospedaliero nell’Azienda sanitaria di Treviso e Docente di Automazione e Informatica per la Biochimica Clinica e Statistica applicata per la Patologia Clinica nell'Università di Padova.