ПЛЕНОЧНЫЕ ПОКРЫТИЯ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА

Наукосфера. №10 (2), 2025 Биологические науки ISSN 2542-0402 9 http://nauko-sfera.ru/ УДК 57.577.3 DOI 10.5281/zenodo.17491312 Научная статья ПЛЕНОЧНЫЕ ПОКРЫТИЯ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА CHITOSAN-BASED FILM COATINGS ГРИЦАЕВА АННА ВИКТОРОВНА, инженер, Институт общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук. GRITSAEVA ANNA VIKTOROVNA, engineer, Prokhorov General Physics Institute of the Russian Academy of Sciences. Хитозан является природным биополимером, интерес к которому обусловлен его биосовместимостью, биоразлагаемостью и широким спектром функциональной активности, что делает его перспективным материалом для создания пленочных покрытий в различных отраслях. Несмотря на высокую востребованность данного биополимера, главным препятствием остается достижение контролируемой комбинации свойств пленок на основе хитозана. В данной статье приведен краткий литературный обзор современных достижений и ключевых направлений применения хитозановых покрытий. Представлены результаты экспериментального исследования, направленного на создание биосовместимого пленочного покрытия на основе хитозана, а также модификация этого материала наночастицами с целью улучшения функциональных свойств. Chitosan is a natural biopolymer, which is of interest due to its biocompatibility, biodegradability and a wide range of functional activity, which makes it a promising material for creating film coatings in various industries. Despite the high demand for this biopolymer, the main obstacle remains the achievement of a controlled combination of the specified properties of chitosan-based films. This article provides a brief literary overview of modern achievements and key applications of chitosan coatings. The results of an experimental study aimed at creating a biocompatible chitosan-based film coating, as well as the modification of this material with nanoparticles in order to improve its functional properties, are presented. Ключевые слова: пленки, хитозан, пленочные покрытия, покрытия на основе хитозана, биосовместимость, природный биополимер, наночастицы. Key words: films, chitosan, film coatings, chitosan-based coatings, biocompatibility, natural biopolymer, nanoparticles. ктуальность исследования. В настоящее время одной из ключевых задач в мировой промышленности является создание биосовместимых покрытий широкого спектра действия, отвечающих необходимым биологическим и гигиеническо-санитарным нормам. Возникает необходимость в разработке многофункционального материала, обладающего высокой биосовместимостью, антибактериальной активностью, способностью к биодеградации и нетоксичностью. Среди перспективных материалов природного происхождения, обладающих вышеперечисленными характеристиками, наиболее известным является хитозан — биополимер, получаемый деацетилированием хитина. В 2005 году управление по санитарному надзору за качеством пищеА Наукосфера. №10 (2), 2025 Биологические науки ISSN 2542-0402 10 http://nauko-sfera.ru/ вых продуктов и медикаментов США (USFDA) признало хитозан безопасным сырьем (GRAS, generally recognized as safe) [25]. Таким образом, данный природный биополимер выступает в качестве экологичного продукта для создания на его основе пленок с требуемыми свойствами. Хитозан занимает второе место после целлюлозы по распространенности среди природных биополимеров, используемых в качестве материала для пленочных покрытий и наполнителя композитов [2]. К сферам, которые активно применяют данный полисахарид, относят сельское хозяйство [28, c. 1837], нутрицевтическую отрасль [19, с. 416], биотехнологии [5, c. 42], биомедицинскую область [4, c. 772], экологическую промышленность [23, c. 53], энергетику [18, c. 71] и т. д. В последнее время было разработано множество технологий на основе хитозана, таких как пищевые покрытия для поддержания и улучшения качества продуктов и их вкусовых характеристик [15, c. 8586; 21, c. 394], перевязочные материалы для заживления раневых травм [3, c. 25], гемостатические пленки с целью остановки кровотечений [8, c. 230; 16, c. 2402], системы доставки лекарств [22, c. 60] и многое другое. По данным базы PubMed число публикаций, связанных с разработкой и созданием покрытий на основе хитозана, превысило более тысячи работ (рис. 1a). За последний год лидирующими отраслями в исследовании хитозановых материалов являются фармацевтическая промышленность, медицина, сельскохозяйственное производство, пищевой сектор (рис. 1б). Рис. 1. Статистика публикаций по теме «Покрытия на основе хитозана» по данным научной литературной базы PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ дата обращения 29 сентября 2025 года): (а) Динамика изменения числа публикаций на основании поиска по ключевым словам «Chitosan coatings»; (б) доли публикаций по отдельным направлениям «Chitosan coatings + [«pharmaceuticals» или «medicine» или «agriculture» или «food industry» или «paper industry» или «biotechnologies» или «industrial sustainability» или «cosmetics»]» за 2025 год Применение покрытий на основе хитозана обусловлено его антимикробными свойствами, биосовместимостью, высокой биологической активностью и способностью к связы- Наукосфера. №10 (2), 2025 Биологические науки ISSN 2542-0402 11 http://nauko-sfera.ru/ ванию с наночастицами, биологическими объектами и другими полимерами. Являясь по своей природе нетоксичным и экологичным полимером, хитозан выступает отличным кандидатом для создания многофункциональных покрытий. Он представляет собой катионный полисахарид, получаемый деацетилированием хитина, который, в свою очередь, выделяют преимущественно из панцирей ракообразных [20, c. 4777]. Степень деацетилирования определяет растворимость биополимера в кислой среде и его биологическую активность. Было установлено, что пленки на основе хитозана со степенью деацетилирования 85 % способствует увеличению пролиферации и митохондриальной активности клеток обонятельной оболочки (OECs), в то время как пленки со степенью деацетилирования 75 % оказались цитотоксичны [13, c. e0135153]. К не менее важным характеристикам хитозана относят его молекулярную массу. Для создания пленочных покрытий низкомолекулярный хитозан интересен ввиду лучшей растворимости в слабокислых водных растворах и наиболее эффективного включения в компоненты клеточных структур. В работе [11, c. 5915] показано, что хитозановые мембраны с более высокой молекулярной массой обладают меньшей проницаемостью, затрудняя прохождение через нее молекул любого размера. Стоит отметить, что хитозан обладает широкой совместимостью с синтетическими полимерами, что делает его востребованным и часто используемым природным биополимером в области репаративной и тканевой медицины [1; 14, c. 1076; 17, c. 159]. Важным преимуществом хитозана является наличие его собственной антимикробной активности [12, c. 6076]. Протонированные положительно заряженные аминогруппы биополимера способны притягиваться к отрицательно заряженной клеточной стенке бактериальных клеток, разрушая мембрану и вызывая утечку внутриклеточных компонентов, после чего следует гибель клетки (рис. 2). Рис. 2. Механизм антибактериальной активности хитозана Несмотря на очевидные преимущества хитозана для создания функциональных покрытий, главной задачей при разработке таких материалов остается достижение баланса между высокой биосовместимостью, контролируемой антибактериальной активностью и пригодно- Наукосфера. №10 (2), 2025 Биологические науки ISSN 2542-0402 12 http://nauko-sfera.ru/ стью для использования пленок в месте оказания помощи. Для улучшения механикопрочностных, биологических, антибактериальных и антиоксидантных свойств пленок применяют различные способы их модификации [26, c. 5216]. К химическим методам относят введение «сшивающих» агентов и функциональных групп для улучшения прочности и стабильности пленки благодаря образованию прочных ковалентных связей и присоединению новых молекул [24, c. 40]. Также добавление наночастиц, растительных экстрактов, эфирных масел и других биополимеров значительно улучшает механические, антиоксидантные и антимикробные свойства плёнок [9, c. 100365; 10, c. 511; 27, c. 830]. Данный подход открывает перспективы для создания многофункциональных материалов, отвечающих растущим требованиям биосовместимости и экологичности. Целью данного исследования является подбор оптимальных условий для создания биоактивных пленок на основе хитозана и модификация их наночастицами оксидов металлов с целью улучшения характеристик без применения токсичных химических реагентов. Материалы и методы. Получение пленочных покрытий. Экспериментальные исследования проводились с использованием следующих реактивов: хитозан — биологически активная пищевая добавка (85 %, ФАРМОУШЕН ЛАБ, Россия), 4 %-ная лимонная кислота в качестве экологически безопасного растворителя, деионизированная вода. Получены слабокислые водные растворы при соотношении процентного содержания хитозан:лимонная 1:4 путем смешивания составляющих компонентов при комнатной температуре до их полного растворения. В дальнейшем по тексту используются обозначения хитозановых композиций — CS1CA4. Очистка растворов от нежелательных крупных частиц — остатков панцирей ракообразных — проводилась методом центрифугирования на лабораторной центрифуге с охлаждением Sigma 3-16KL (Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Germany). Для получения пленочного покрытия методом литья из раствора «solvent casting» готовую полимерную основу распределяли при помощи дозатора на покровные стекла и оставляли высушиваться в течение суток при комнатной температуре (рис. 3). Рис. 3. Схематическая иллюстрация метода получения пленочных покрытий Наукосфера. №10 (2), 2025 Биологические науки ISSN 2542-0402 13 http://nauko-sfera.ru/ Дополнительно использовали высушивание в сушильном шкафу UT-4686 (ULAB, КНР) в течение 5–7 минут при 50°С. Серия экспериментов включала получение полимерных пленок с включением неорганических наночастиц ZnO и Ag2O, полученных методом лазерной абляции в растворе хитозана. Физический синтез наночастиц осуществлялся при помощи импульсного волоконного иттербиевого лазера P-Mark TT 100 (Pokkels, Москва, Россия) со следующими оптимально подобранными характеристиками: длина волны лазерного излучения составляла 1064 нм, ширина импульса — 200 нс, энергия в импульсе — 1,5 мДж, частота повторения — 35 кГц. Гальваномеханический сканатор LScanH (Атеко-ТМ, Москва, Россия) и объектив FTheta (F = 90 мм) осуществляли позиционирование светового пучка и его перемещение вдоль материала со скоростью 6000 мм/с. Размер лазерного пятна в перетяжке составлял 30 мкм. Металлическую мишень в полимерном растворе хитозан/лимонная кислота облучали высокоинтенсивным лазерным лучом, испаряя с поверхности частицы нанометрового размера в течение 40 минут. Если частицы проявляли склонность к образованию агрегатов и агломерации, их подвергали ультразвуковой обработке в ультразвуковой ванне PS-20A (Digital Pro, Китай). Характеризация растворов хитозана и пленок на его основе. Размеры структурных единиц, присутствующих в коллоидных растворах, были исследованы методом динамического светорассеяния с помощью анализатора Zetasizer (Malvern Panalytical B.V.). Коллоиды в объеме 1 мл помещались в кювету для просвета лазерного луча под углами 173°, 90°, 13°. Спектры поглощения полимерных плёнок были измерены в диапазоне длин волн 200– 900 нм на спектрометре УФ-видимой области Persee T6U (PG Instrument, Китай). Дисперсии в объёме 1,7 мл добавляли в кварцевые кюветы, в качестве референсных образцов использовали лимонную кислоту и раствор хитозана. Цитотоксичность. Было изучено влияние полученных образцов на жизнеспособность культур фибробластов селезенки человека (HSF) «in vitro». Активность клеток на исследуемых полимерных пленках анализировалась при помощи «классических» способов оценки выживаемости: МТТ-теста для выявления метаболической активности культур и метода флуоресцентной микроскопии. В основе колориметрического МТТ-теста заложена способность ферментов НАД(Ф)Нзависимых клеточных оксидоредуктаз восстанавливать желтый бромид 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия до нерастворимого формазана, отражая количество присутствующих жизнеспособных клеток и позволяя тем самым исследовать цитотоксичность материалов. Для измерения оптической плотности планшет помещался в мультимодальный планшетный ридер Feyond-A300/A400 (Hangzhou Allsheng Instruments Co., Китай) при 560– 570 нм. Для каждого образца были выполнены три технических повтора. Выживаемость и численность клеток оценивались методом флуоресцентной микроскопии. Клетки кожи человека использовались в качестве объекта для проверки цитотоксичности исследуемых композитов. Для оценки жизнеспособности использовали флуоресцентные зонды Hoechst 33342 и йодид пропидия (PI). Клетки окрашивали 2 мкг/мл Hoechst 33342 (Lumiprobe, USA) в течение 20 мин при 37 ℃ в инкубаторе. Стекло с нанесенным на него покрытием и клетками помещали в специальную камеру для покровных стёкол (RC-40LP, Warner Instruments, USA), проводили отмывку фосфатно-буферный солевым раствором (PBS) и окрашивали 2 мкМ PI (Lumiprobe, USA) в течение 1 мин. Камера со стеклом помещались в специальную подставку во флуоресцентном микроскопе DMI4000 B (Leica, Germany). Клетки, окрашенные Hoechst 33342 считались живыми, а PI — мертвыми. Каждая лунка планшета была заполнена покровным стеклом, на котором размещалось пленочное покрытие с клеточной суспензией, и в каждую лунку было добавлено 2 мл культуральной сре- Наукосфера. №10 (2), 2025 Биологические науки ISSN 2542-0402 14 http://nauko-sfera.ru/ ды для обеспечения нормального функционирования фибробластов человека (рис. 4). Клетки были посажены методом иммобилизации в трехмерный матрикс, в качестве которого использовался композит на основе полисахарида и наночастиц оксидов металлов. Для каждого исследуемого образца было снято 3–6 повторов. Снимки, полученные в ходе экспериментов, были обработаны с помощью программы ImageJ. Для сегментации областей клеток использовали пороговую бинаризацию по яркости. Жизнеспособность клеток рассчитывалась следующим образом: Выживаемость (%) = 100 – (кол-во клеток, окрашенных 𝑷𝑰 ÷ кол-во клеток, окрашенных 𝑯𝒐𝒆𝒄𝒉𝒔𝒕) × 100. Рис. 4. Схематическая иллюстрация проведения биологического эксперимента: схема планшета с описанием составляющих его компонентов Результаты. Анализ распределения коллоидных частиц по размерам. Методами динамического рассеяния света получены данные распределения присутствующих в растворе хитозана частиц (рис. 5) и наночастиц ZnO и Ag2O по размерам в растворах хитозан/лимонная кислота и деионизированной воде (рис. 6). Рис. 5. График распределения частиц, присутствующих в растворе хитозана Наукосфера. №10 (2), 2025 Биологические науки ISSN 2542-0402 15 http://nauko-sfera.ru/ Присутствующие в растворе хитозана частицы размером около 50–500 нм соответствует гидродинамическому радиусу макромолекул хитозана, а наличие более крупных частиц в области 2470 нм можно объяснить присутствием агрегатов, состоящих из молекул хитозана и частиц панцирей ракообразных, оставшихся после фильтрации раствора (рис. 5). Рис. 6. График распределения наночастиц оксида цинка ZnO (а, б) и Ag2O (в, г) по размерам в хитозановом растворе и деионизированной воде соответственно Для наночастиц цинка в растворах хитозана характер распределения коллоидов — бимодальный. Средние размеры варьируются в диапазоне 610-654 нм и 3759-5717 нм для ZnO, синтезированных при помощи лазерной абляции в хитозановом растворе (рис. 6а). Пик в области 5 717 нм обусловлен присутствием агрегатов и коагулятов молекул хитозана, способных образовывать комплексы с металлами за счет протонированных аминогрупп, и наночастиц оксида, а также долей оставшихся после центрифугирования частиц ракообразных. НЧ ZnO, полученные путем лазерного облучения мишени в деионизированной воде, более стабильны, и размеры коллоидов колеблются в следующих интервалах значений: 60–702 нм Наукосфера. №10 (2), 2025 Биологические науки ISSN 2542-0402 16 http://nauko-sfera.ru/ (рис. 6б). Ag2O, синтезированные в растворе хитозан/лимонная кислота методом лазерной абляции, также склонны к агломерации (рис. 6в). Разброс размеров наночастиц оксида серебра составил 325–374 нм, 1228–2842 нм. Однако полученные при помощи импульсной лазерной абляции в деионизированной воде, НЧ Ag2O демонстрируют достаточно маленькие размеры в диапазоне 16–32 нм, хотя область со значениями 80–186 нм говорит о наличии агрегатов (рис. 6г). Представленные экспериментальные результаты выявляют различия в абляции оксидов металлов в деионизированной воде и полимерном растворе по полученным размерным характеристикам. Так, наночастицы оксидов металлов в хитозановой матрице выделяются бόльшими скоплениями коагулятов. Можно предположить, что такая склонность коллоидов к агрегации связана со взаимодействием наночастиц оксидов металлов с протонированными аминогруппами молекул хитозана, а также из-за присутствия частиц панцирей ракообразных, оставшихся после фильтрации раствора. Спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях. В ходе работы были выполнены спектральные измерения поглощательных характеристик биополимера и коллоидных растворов наночастиц ZnO и Ag2O, синтезированных в растворе хитозан/лимонная кислота. Из рис. 7 видно, что полимерный раствор хитозан/лимонная кислота проявляет незначительное поглощение в ультрафиолетовом диапазоне в области 300 нм, что обусловлено присутствием карбонильных групп, образующихся вследствие превращений концевых гликозидных центров молекул хитозан [6, c. 584]. Уменьшение молекулярной массы полимера приводит к росту оптической плотности при 300 нм в результате увеличения количества таких центров. Рис. 7. Спектры поглощения хитозановых растворов CS1CA4, ZnO и Ag2O, синтезированные методом лазерной абляции в растворе хитозан/лимонная кислота, относительно лимонной кислоты (а) и спектры поглощения ZnO и Ag2O относительно раствора CS1CA4 (б) Оптическое поглощение наночастиц Ag2O представлено на спектрах как в ультрафиолетовом диапазоне 294–310 нм, так и видимом — более характерный пик около 398 нм. Наночастицы оксида цинка демонстрируют небольшое поглощение в области ультрафиолетового излучения 290–292 нм. Полученные результаты указывают на способность фотокаталитической активности представленных наночастиц оксидов металлов, что подтверждается ли- Наукосфера. №10 (2), 2025 Биологические науки ISSN 2542-0402 17 http://nauko-sfera.ru/ тературными источниками [7, c. 17]. Способные генерировать активные формы кислорода под действием УФ-излучения, НЧ представляют особую опасность для патогенных микроорганизмов. Результаты исследования цитотоксичности пленок на основе хитозана. Проведены биологические исследования цитотоксичности исследуемых полимерных пленок, нанесенных на покровные стекла, при помощи двух методов — МТТ-анализа и флуоресцентной оптической микроскопии. Результаты МТТ-теста. После проведения МТТ-анализа содержимое в лунках микротитрационного планшета имеет разную окраску (рис. 8). Рис. 8. Микротитрационный планшет после проведения МТТ-анализа Степень пурпурного окрашивания свидетельствует об образовавшемся формазане – конечном продукте метаболизма клеточных культур. Оптическая плотность раствора формазана измерялась на планшетном ридере при длине волны 570 нм. Были построены зависимости жизнеспособности клеток от концентрации исследуемых образцов (рис. 9). Рис. 9. График зависимости показателя выживаемости клеток от концентрации наночастиц в композите образцов