Estudo de diferentes meios de cultivo celular para expressão de glicoproteína recombinante humana, em células de ovário de hamster chinês (cho)Estudo de diferentes meios de cultivo celular para expressão de glicoproteína recombinante humana, em células de ovário de hamster chinês (cho)

Processando o Saber nº 4, 2012 26 ESTUDO DE DIFERENTES MEIOS DE CULTIVO CELULAR PARA EXPRESSÃO DE GLICOPROTEÍNA RECOMBINANTE HUMANA, EM CÉLULAS DE OVÁRIO DE HAMSTER CHINÊS (CHO) MACEDO, Fernanda de Mendonça, Mestra* * Faculdade de Tecnologia de Praia Grande Departamento de Processos Químicos Pça. 19 de Janeiro, 144, Boqueirão, Praia Grande / SP, CEP: 11700-100 Fone (13) 3591-1303 [email protected] RESUMO Um cultivo de células eucariota refere-se à manutenção de células removidas a partir de tecido animal ou órgãos, as quais continuam a crescer com adição de fatores de crescimento e nutrientes. As células CHO (Células de Ovário de Hamster Chinês) são muito populares quanto à expressão de glicoproteína recombinante humana. Estas células possuem enzimas de glicosilação que se assemelham àquelas encontradas em linhagens de células humanas. A CHO é uma linhagem aderente passível de adaptação ao crescimento em suspensão e requer meio de cultivo líquido quimicamente complexo e adequado para o seu crescimento. No presente estudo, foi realizado um comparativo de quatro meios de cultivo para células CHO e a expressão da glicoproteína recombinante TSH (Hormônio Estimulante da Tireóide) em dois processos de cultivo, foi analisada. PALAVRAS-CHAVE: Cultivo celular, CHO, Meio de cultivo, TSH, glicoproteínas. https://doi.org/10.5281/zenodo.15566565 Processando o Saber nº 4, 2012 27 ABSTRACT A cell culture refers to the maintenance of eukaryotic cells removed from DQLPDOWLVVXHRURUJDQV7KH\FRQWLQXHWRJURZZLWKWKHDGGLWLRQRI growth factors and nutrients. CHO cells (Chinese Hamster Ovary Cells) are very popular for the expression of human recombinant glycoproteins. 7KHVHFHOOVKDYHWKHJO\FRV\ODWLRQHQ]\PHVZKLFKUHVHPEOHWKRVHIRXQG LQKXPDQFHOOOLQHV7KH&+2OLQHDUHDGKHUHQWDQGFDQJURZDVFHOO suspensions and require liquid medium chemically complex and suitable for their growth. In this case, we made a comparison of four culture media for CHO cells and the expression of glycoprotein recombinant 76+7K\URLG6WLPXODWLQJ+RUPRQHZDVDQDO\]HG KEYWORDS:&HOOFXOWXUH&+2&XOWXUHPHGLXP76+JO\FRSURWHLQ INTRODUÇÃO O cultivo de célula de organismos eucariotos é o sistema majoritário para a produção em grande escala de glicoproteínas biologicamente ativas, especialmente para produção de biofármacos. As JOLFRSURWHtQDVUHFRPELQDQWHVGHVHPSHQKDPXPSDSHOVLJQL¿FDWLYRQD terapia de diversas patologias, como por exemplo: câncer de tireóide, DQHPLDKHPR¿OLDHVFOHURVHP~OWLSODHQWUHRXWURV8PFXOWLYRGHFpOXOD eucariota refere-se à manutenção de células removidas a partir de tecido animal ou órgãos, as quais continuam a crescer com adição de fatores de crescimento e nutrientes. Estas células se dividem por mitose de maneira similar as bactérias e fungos, e continuam a crescer, limitando-se apenas pela depleção de nutrientes, acumulação de subprodutos tóxicos ou inibição de densidade. &RPEDVHQRHVWXGRGH+D\ÀLFNH0RRUKHDG 621), sobre o potencial de crescimento de células embrionárias humanas, as células podem ser cultivadas continuamente por 50 gerações e SDVVDPSRUPXGDQoDVUHODFLRQDGDVDLGDGHDWpDWLQJLUHPDIDVH¿QDO TXDQGRWRUQDPVHLQFDSD]HVGHVHGLYLGLUHP$¿JXUD%XWOHU0 DSUHVHQWDRWHPSRGHYLGD¿QLWRGHXPFXOWLYRFHOXODUGHFpOXODV HPEULRQiULDVVHJXQGR+D\ÀLFNH0RRKHDG3RGHVHREVHUYDUTXH durante a fase 1, as células estão se adaptando ao cultivo celular e o Processando o Saber nº 4, 2012 28 crescimento é relativamente lento. Na fase 2, as células estão crescendo exponencialmente e a taxa de duplicação está entre 18 e 24 horas. O ponto de crise ocorre quando a célula reconhece a limitação da capacidade na divisão celular e a velocidade do crescimento diminui. Na fase 3 o crescimento é retardado, e eventualmente é inibido. O cultivo celular pode ser geneticamente homogêneo, quando submetido à clonagem, ou mostrar uma variação genética conhecida como população heterogênea. O presente trabalho irá evidenciar a expressão da glicoproteína recombinante Hormônio Estimulante da Tireóide (TSH), em um cultivo celular geneticamente homogêneo. O TSH é uma glicoproteína com estrutura dimérica contendo duas subunidades glicosiladas (P e E), não covalentemente ligadas. Cole (1993, p. 1014-1023) descreve: “A subunidade P, contém duas cadeias de oligossacarídeos de ligação-N na asparagina 52 e 78 e a subunidade E apenas uma na asparagina 23”. É bem documentado na literatura que as cadeias de carboidratos do TSH são importantes na biosíntese, associação das subunidades, secreção e expressão da atividade hormonal (THOTAKURA, 1991; PERSANI, 1998; SHAAF, 1997). A contribuição devida às cadeias de cada uma das subunidades na ação do hormônio não é perfeitamente conhecida. Os oligossacarídeos da subunidade P são particularmente importantes na ação do TSH durante a transdução de sinal pós-receptor (THOTAKURA, 1991;), enquanto a glicosilação da subunidade E é essencial para a estabilidade e secreção (TAKATA, 1989). Análises estruturais têm mostrado que a tireotrofina é sintetizada e secretada como uma série de isoformas que diferem na glicosilação, bioatividade e meia vida circulatória. Diferenças QRFRQWH~GRGHVLDOLODomRGDVYiULDVLVRIRUPDVGH76+PRGL¿FDP as propriedades biológicas, um menor grau de sialilação resultando em menor bioatividade in vivo e meia vida circulatória mais curta (THOTAKURA, 1991; WEINTRAUB, 1999; ZEFANOUNI, 1996; SZKUDLINSKI, 1993). A diferente estrutura glicídica pode também LQÀXHQFLDUDVSURSULHGDGHVLPXQROyJLFDVGRVKRUP{QLRVJOLFRSURWpLFRV relacionada com o tipo de célula hospedeira e com as diferentes condições de cultivo e produção em biorreator (THOTAKURA, 1991; ZEFANOUNI, 1996; SZKUDLINSKI, 1993; KASHWAI, 1991). A expressão de glicoproteínas recombinantes tem sido realizada Processando o Saber nº 4, 2012 29 mediante construções que utilizam vetores plasmídicos ou virais, transfecções transientes ou estáveis e diversos marcadores gênicos de VHOHomRHDPSOL¿FDomR276+UHFRPELQDQWHIRLREWLGRDWUDYpVGHFR WUDQVIHFomRGHFpOXODV&+2GH¿FLHQWHVQRJHQHGDHQ]LPDGLKLGURIRODWR redutase (DHRF-) com dois plasmídeos, um dos quais contendo o gene da DHFRligado ao gene da subunidade P (WATANABE, 1987). Foi também expresso transitoriamente em células de rim humano e rim de macaco pela co-transfecção destas células com dois vetores idênticos, cada um contendo uma subunidade (WONDISFORD, 1988). Nestes trabalhos, o rendimento obtido foi muito baixo, entretanto este não foi o objetivo principal do trabalho. Níveis maiores GH76+XWLOL]DQGRXPPHFDQLVPRGHFRDPSOL¿FDomRJrQLFDLQGX]LGD por metotrexato (MTX) e utilizando um sistema de cultivo celular em biorreator, foram conseguidos por Hussain e colaboradores (HUSSAIN, 1996) e Cole e colaboradores (COLE, 1993). O TSH foi obtido utilizando dois vetores dicistrônicos (pEDdc e pEAdc) que contém os marcadores JrQLFRVGHVHOHomRHDPSOL¿FDomRGHKLGURIRODWRUHGXWDVH'+)5H adenosina deaminase (ADA), cada um ligado ao gene da subunidade P ou E (PERONI, 2002). Após cotransfecção das células CHO (DHFR-) FRPHVWHVYHWRUHVGHH[SUHVVmRHVXEPHWLGDVjDPSOL¿FDomRJrQLFDHP meio de cultivo contendo quantidades crescentes de MTX, foi possível isolar clones com nível de secreção em frascos (cultivo celular em monocamadas) de até 7,2 ± 1,3μg TSH.10-6células.dia-1, o mais alto já relatado para a expressão deste hormônio (PERONI, 2002). Processando o Saber nº 4, 2012 30 Figura 1 - Crescimento de células embrionárias normais e transformadas ao longo do número de passagens Fonte: Butler (2004) Um segundo tratamento, envolvendo deoxiconformacinma, GLUHFLRQDGRSDUDDPSOL¿FDURPDUFDGRUJrQLFR$'$IRUQHFHXXP clone com secreção de TSH 2-3 vezes maior que na estratégia anterior, chegando a uma secreção de 17,8 ± 7,6μg TSH.10-6 células.dia-1. O clone utilizado no desenvolvimento do presente trabalho foi aquele TXHUHVXOWRXGDHVWUDWpJLDGHDPSOL¿FDomRLQFRPSOHWDVyFRP07; Poucos grupos de pesquisas realizaram a síntese de TSH recombinante em células CHO. Apenas o grupo da Genzyme, Cambridge, MA, USA, obteve, mediante utilização de vetores convencionais, uma expressão Processando o Saber nº 4, 2012 31 semelhante: 4,5μg TSH.10-6 células.dia-1(COLE, 1993). A importância e o objetivo desse trabalho é o estudo comparativo de quatro meios de cultivo para células CHO e a expressão da glicoproteína recombinante TSH (Hormônio Estimulante da Tireóide) em dois processos de cultivo. 1 DESENVOLVIMENTO A linhagem celular utilizada para a expressão da glicoproteína 76+IRLDGHFpOXODVGHRYiULRGHKDPVWHUFKLQrV&+2GH¿FLHQWHV no gene da enzima diidrofolato redutase (DHFR), (linhagem mutante DXB-11) co-transfectadas com vetores dicistrônicos (pEDdc-P e pEAdc-E76+HVXEPHWLGDVjDPSOL¿FDomRJrQLFDFRPPHWRWUH[DWR (MTX) (PERONI,2002). Foram utilizados dois sistemas de expressão: biorreator tipo ³KROORZ¿EHU´HIUDVFRVGHFXOWLYRFHOXODU2VLVWHPD³KROORZ¿EHU´VH EDVHLDQRFXOWLYRGHFpOXODVHPFDUWXFKRVFRPFDSLODUHVDUWL¿FLDLVSRU onde é bombeado continuamente o meio de cultivo apropriado (meio intracapilar). As células CHO transfectadas foram semeadas no espaço extracapilar, de onde se extraiu periodicamente o meio contendo a proteína de interesse. Os meios de cultivo intracapilar utilizados foram: a) &'TXHpXPPHLRTXLPLFDPHQWHGH¿QLGRTXHQmRFRQWpP nucleosídeos, proteínas de origem animal, de plantas ou de origem sintética; b) CHO-S-SFM II, com e sem nucleosídeos, que é um meio completo, sem soro e de baixo teor protéico (<100μg/mL); c) CHO-S-SFM II, com nucleosídeos, que é um meio completo, sem soro e de baixo teor protéico (<100μg/ mL) suplementado com 100nM de metotrexato (MTX). Todos os meios de cultivo foram suplementados com penicilina/estreptomicina (50μg/mL), gentamicina (40μg/ mL), anfotericina B (0,25μg/mL). Os meios extracapilares utilizados foram os mesmos citados anteriormente com ou sem 10% de soro fetal bovino dialisado (dFBS). Processando o Saber nº 4, 2012 32 Durante cinco dias as células foram mantidas em meio de cultivo com 10% de dFBS para aderirem aos capilares. Após esse período, o meio foi substituído para remover as células que se soltaram. O meio de perfusão foi periodicamente substituído quando a concentração de glicose era inferior a 2mg/mL. Após cerca de 20 dias o meio extracapilar foi substituído por meio sem soro e então foram coletadas amostras e armazenadas a temperatura de-80ºC. Todo o processo foi realizado a 37ºC em atmosfera com 5% de CO2. As células CHO transfectadas também foram cultivadas pelo sistema de frascos de cultivo de 75cm2 de dimensão, com aproximadamente 106 células em 10mL de meio de cultivo, a 37ºC e atmosfera de 5% de CO2. Os meios utilizados para o cultivo em frascos foram os mesmos utilizados no cultivo intracapilar. Durante cinco dias as células foram mantidas no meio de cultivo com 10% de soro fetal ERYLQRGLDOLVDGRG)%6DWpDWLQJLUHPGHFRQÀXrQFLD$SyVD FRQÀXrQFLDDVFpOXODVIRUDPWULSVLQL]DGDVFROKLGDVHGLYLGLGDVHP frascos de 162cm2, com aproximadamente 106 células em 20mL de meio de cultivo. O cultivo permaneceu nas mesmas condições descritas DFLPDDWpDWLQJLUHPDFRQÀXrQFLDFLWDGD$SyVHVVHSHUtRGRRPHLR foi substituído por meio sem soro. O meio de cultivo (sem soro), de diferentes frascos, foi coletado diariamente e centrifugado a 979 x g por 5 minutos, sendo as células removidas e o sobrenadante coletado e armazenado a temperatura de -80ºC. Foi utilizado um biorreator escala piloto do tipo “+ROORZ ¿EHU”, que consiste em um sistema de cultivo celular em cartuchos FRPFDSLODUHVDUWL¿FLDLVSRURQGHpERPEHDGRFRQWLQXDPHQWHRPHLR de cultivo apropriado (meio intracapilar). As células CHO transfectadas foram semeadas no espaço extracapilar, onde foi extraído periodicamente o meio contendo a proteína de interesse. O meio intracapilar utilizado foi o CHO-S-SFM II suplementado com penicilina/estreptomicina (50μg/ mL), gentamicina (40 μg/mL), anfotericina B (0,25 μg/mL) e 100 nM de MTX. O meio extracapilar utilizado foi o mesmo citado anteriormente com ou sem 10% de soro fetal bovino dialisado (dFBS). Durante cinco dias as células foram deixadas em meio CHOS-SFM II com 10% de dFBS para aderirem aos capilares. Após este SHUtRGRRPHLRIRLVXEVWLWXtGRSDUDUHPRYHUDVFpOXODVTXHQmR¿FDUDP Processando o Saber nº 4, 2012 33 aderidas. O meio de perfusão foi periodicamente substituído quando a concentração de glicose era inferior a 2mg/mL. Após cerca de 20 dias o meio extracapilar foi substituído por meio sem soro e então foram coletadas amostras e armazenadas a temperatura de -80ºC. Todo processo foi realizado a 37ºC e atmosfera com 5% de CO2. A avaliação qualitativa e quantitativa do TSH no meio FRQGLFLRQDGRIRLUHDOL]DGDSRUWpFQLFDGHFURPDWRJUD¿DOtTXLGDGHDOWD H¿FLrQFLDGHIDVHUHYHUVD53+3/&'$/025$2/,9(,5$ 2003; RIGGIN, 1988). A coluna foi mantida a 25ºC e foram usados na fase móvel dois tampões A e B (tampão A: fosfato de sódio 0,05M pH7,0 e tampão B: 50% de A + 50% de acetonitrila). Um gradiente linear de 25 a 100% de tampão B foi estabelecido durante 40 minutos, FRPÀX[RGHWUDEDOKRGHP/PLQ A determinação do tempo de retenção se fez sempre comparativamente à preparação Thyrogen (amostra de referência GLVSRQtYHOQRPHUFDGR±*HQ]\PHEHPFRPRDTXDQWL¿FDomRVHIH] VHPSUHFRPSDUDWLYDPHQWHjSUHSDUDomRKLSR¿ViULDGHUHIHUrQFLDGR NIDDK (National Hormone and Pituitary Program, Torrance, CA, EUA). A determinação da concentração de proteína total foi estimada usando o método colorimétrico do ácido bicinconínico (BCA) que FRQVLVWHQDGHWHFomRFRORULPpWULFDHTXDQWL¿FDomRGHSURWHtQDWRWDO em solução diluída após reação com ácido bicinconínico. Utilizou-se uma curva padrão de calibração que relaciona diferentes concentrações de albumina de soro bovino pura (BSA; 0,5 – 200 μg/mL) com a absorbância correspondente, no comprimento de onda de 540nm. A Tabela 1 apresenta os níveis de TSH e conteúdo protéico obtidos com diferentes meios de cultivo em frascos de 100mm. Observase que tanto a concentração de TSH quanto a de proteína total é bem menor quando se utiliza o meio CD sem nucleosídeos, o que acarreta XPDDWLYLGDGHHVSHFt¿FDJ76+JGHSURWHtQDWRWDOFHUFDGH 50% menor com relação ao meio CHO-S-SFM II com nucleosídeos suplementado com MTX. Quando se considera a atividade por célula, determinada mediante teste de Mônaco (MONACO, 1996, p. 197-203), realizado em placas e 24 poços, obtém-se, conforme mostra a Tabela 2, uma produção de TSH 50% menor no meio CD do que no meio CHO-S-SFM II com Processando o Saber nº 4, 2012 34 nucleosídeos suplementado com MTX, enquanto essa produção é cerca de 20% menor com o meio CHO-S-SFM II sem nucleosídeos e cerca de 5% menor quando é usado o meio CHO-S-SFM II com nucleosídeos. Tabela 1: Níveis de TSH e conteúdo proteico obtidos com diferentes meios de cultivo em frascos de 100mm Meio TSHa (μg/mL) Proteína totalb (μg/mL) Atividade HVSHFt¿FD (%) CD sem nucleosídeos 0,70 62,5 1,12 CHO-S-SFM sem nucleosídeos 2,04 123,8 1,65 CHO-S-SFM sem nucleosídeos + MTX 2,74 121,2 2,26 CHO-S-SFM II SFM com nucleosídeos 2,40 115,8 2,07 a determinado por RP-HPLC b determinado por BCA Tabela 2: Níveis de TSH obtidos com diferentes meios de cultivo, em placas de 24 poços Meio TSHa (μg/mL) TSH (μg.10-6 células. dia-1) CD sem nucleosídeos 0,42 62,5 CHO-S-SFM II sem nucleosídeos 1,0 123,8 CHO-S-SFM II sem nucleosídeos + MTX 1,6 121,2 CHO-S-SFM II com nucleosídeos 1,2 115,8 Com base nos resultados expostos nas tabelas 1 e 2, o meio de cultivo CHO-S-SFM II, suplementado com MTX obteve o melhor desempenho, este meio de cultivo foi escolhido para iniciar uma produção em biorreator e em frascos de cultivo celular. Processando o Saber nº 4, 2012 41 TAKATA, K; WATANABE, S.; HIRONO, M.; TANAKO, M.; TERAOKA, H.; HAYASHIZAKI, Y. The role of the carboxyl-terminal aminoacid extension of human TSH b subunit. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 165, p.1035-1042, 1989. THOTAKURA, N.R.; DESAI, R.K.; BATES, L.G., COLE, E.S.; PRATT, B.M.; WEINTRAUB, B.D. Biological-activity and metabolicclearance of a recombinant human thyrotropin produced in chinese hamster ovary cells. Endocrinology, v. 128, p. 341-348, 1991. THOTAKURA, N.R.; SZKUDLINSKI, M.W.; WEINTRAUB, B.D. Structure-function studies of oligosaccharides of recombinant human thyrotropin by sequential deglycosylation. Glycobiology, v. 4(4), p. 525-533, 1994. WATANABE, S.; HAYASHIZAKI, Y.; ENDO, Y.; HIRONO, M.; TAKIMOTO, N.; TAMAKI, M.; TERAOKA, H.; MIYAI, K.; MATSUBARA, K. Production of human thyroid-stimulating hormone in chinese hamster ovary cells. Biochem. Bioph. Res. Co., v. 149, p. 1149-1155, 1987. WEINTRAUB, B.D.; SKUDLINSKI, M.W. 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