Regulación de la expresión génica en un modelo de insuficiencia renal crónica

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS MÉDICAS Y QUIRÚRGICAS “REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN UN MODELO DE INSUFICIENCIA RENAL CRÓNICA” MEMORIA PRESENTADA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR POR ALEJANDRO ÁLVAREZ PRATS Bajo la dirección de los Doctores: Octavio Hernández Perera. José Carlos Rodríguez Pérez. Los directores El doctorando Las Palmas de Gran Canaria, 2010 D. OCTAVIO HERNÁNDEZ PERERA, INVESTIGADOR DE LA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO DE GRAN CANARIA DR. NEGRÍN. CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN UN MODELO DE INSUFICIENCIA RENAL CRÓNICA.”, ha sido realizado por D. Alejandro Álvarez Prats, en la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, bajo su dirección y asesoramiento técnico, y que una vez revisada la presente Memoria la encuentra apta para su defensa como Tesis Doctoral. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiende el presente certificado en Las Palmas de Gran Canaria a 10 de Diciembre de 2010. Fdo: Dr. Octavio Hernández Perera. D. JOSÉ CARLOS RODRÍGUEZ PÉREZ, INVESTIGADOR DE LA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO DE GRAN CANARIA DR. NEGRÍN Y PROFESOR TITULAR DE LA UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA. CERTIFICA: Que el trabajo de investigación titulado “REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN UN MODELO DE INSUFICIENCIA RENAL CRÓNICA.”, ha sido realizado por D. Alejandro Álvarez Prats, en la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín, bajo su dirección y asesoramiento técnico, y que una vez revisada la presente Memoria la encuentra apta para su defensa como Tesis Doctoral. Y para que así conste y surta los efectos oportunos, extiende el presente certificado en Las Palmas de Gran Canaria a 10 de Diciembre de 2010. Fdo: Dr. José Carlos Rodríguez Pérez. “Un científico debe tomarse la libertad de plantear cualquier cuestión, de dudar de cualquier afirmación, de corregir errores”. Julius Robert Oppenheimer. AGRADECIMIENTOS Quiero expresar mi agradecimiento a los Drs. Octavio Hernández Perera y José Carlos Rodríguez Pérez por su dirección, ayuda y continuo estímulo en la elaboración del presente proyecto de tesis doctoral. También me gustaría agradecer a todos los compañeros de la Unidad de Investigación del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín la ayuda prestada durante estos años, especialmente a Aránzazu Anabitarte Prieto, cariñosamente Aranxa, por haber compartido desinteresadamente sus conocimientos de cirugía experimental conmigo con tanto humor y disposición. A la Dra. Pilar Díaz Herrera por su ayuda y entrega en los análisis histológicos. Al Dr. Gregorio Carretero Hernández por haberme contagiado su entusiasmo y haber influido de forma muy positiva en mi formación como investigador. A toda mi familia por su apoyo y su capacidad para soportar estos años de trabajo y sacrificio. RESUMEN La inflamación y la fibrosis son características fundamentales de las enfermedades renales. Nuestro objetivo fue evaluar las ventajas de diferentes tratamientos farmacológicos y su relación con la activación de NFκB y AP-1. Las ratas sometidas a 5/6 de nefrectomía fueron utilizadas como controles o tratadas con losartán, cerivastatina, losartán más cerivastatina, carvedilol, o el antagonista no selectivo de los receptores ETA/ETB , Ro 485695, desde el día 7 hasta el día 42 de la nefrectomía. En contraste con el grupo Sham, a los 7 días las ratas nefrectomizadas no mostraron lesiones renales pero sí albuminuria y aumento de la presión arterial sistólica (PAS). Por otra parte, no se detectaron cambios en la expresión génica de TGF-β pero sí reducción de BMP7 y de KCP. Estos resultados contrastaron con los niveles de tránscrito de diferentes colágenos, fibronectina 1, laminina B1 y MCP-1, que experimentaron un claro incremento, lo que sugiere que la reducción de los niveles de BMP7 y KCP podría jugar un papel importante en la génesis de la enfermedad renal crónica (ERC). A las 6 semanas, las ratas nefrectomizadas sin tratamiento mostraron albuminuria, incremento de la PAS y lesiones renales. Los extractos nucleares aislados de la corteza renal de las ratas sometidas a ablación renal, presentaron niveles aumentados de la subunidad NF-κB p65 y de c-Fos, miembro principal de la familia AP-1. También, se observó aumento de expresión génica de TGFβ1, varios tipos de colágeno, fibronectina 1, pre-proendotelina-1 y MCP-1. Cuando las ratas recibieron la terapia combinada de losartán y cerivastatina, la expresión de los mediadores moleculares de la fibrosis renal, así como las actividades de AP-1 y NFκB, fueron muy parecidas a las del grupo Sham; sin embargo, la eficacia del resto de tratamientos fue claramente más limitada. Tanto la actividad de NF-κB como de AP-1 mostraron asociación con las tasas de daño renal y con la expresión del RNAm de fibronectina 1, pre-proendotelina-1 y MCP-1. Sin embargo, la falta de correlación entre las actividades de AP-1 y NF-κB sugiriere que ambos factores de transcripción podrían contribuir independientemente al desarrollo de la fibrosis renal en el modelo de 5/6 de nefrectomía, y que la combinación farmacológica de un ARAII y una estatina podría ofrecer mayor renoprotección por su capacidad para normalizar las actividades de NF-κB y AP-1 simultáneamente. SUMMARY Inflammation and fibrosis are the main characteristics of renal diseases. Our aim was to evaluate the advantages of different pharmacological approaches and their relation with the activation of NF-κB and AP-1. Subtotally nephrectomized (Nx) rats were used as controls or were treated with losartan, cerivastatin, losartan plus cerivastatin, carvedilol, or the ETA/ETB receptor antagonist Ro 48-5695 from day 7 to day 42 after nephrectomy. In contrast to the Sham group, at seven days Nx rats showed no kidney damage, but albuminuria and increases in systolic blood pressure (SBP) were observed. BMP7 and KCP genes were downregulated, whereas no change in the expression of TGF-β was detected. Furthermore, transcript levels of several collagen molecules, fibronectin 1, laminin B1 and MCP-1 were increased suggesting that downregulation of BMP7 and KCP could be playing an important role in the genesis of chronic kidney disease (CKD). At 6 weeks, untreated Nx rats displayed albuminuria, increases in SBP and renal lesions. Nuclear extracts from renal cortex of Nx rats given vehicle exhibited increased levels of NF-κB p65 subunit and c-Fos, a main AP-1 family member. Transcript levels of TGF-β1, several collagen molecules, fibronectin 1, pre-proendothelin-1 and MCP-1 were also raised. When rats received adjunctive therapy with losartan plus cerivastatin, expression of the molecular mediators of renal fibrosis and the activity of AP-1 and NF-κB closely resembled that of the sham group, whereas the effectiveness of other treatments was much more limited. Activity of both NF-κB and AP-1 was associated with renal injury scores and with mRNA expression of fibronectin 1, pre-proendothelin-1 and MCP-1. However, values of NF-κB activity were not correlated with those of AP-1, suggesting that both nuclear factors could contribute independently to the renal disease progression and that combination therapy with an angiotensin II receptor antagonist and a statin could confer advantages on kidney protection through simultaneous normalization of NF-κB and AP-1 activity.  ÍNDICE Índice  ÍNDICE ABREVIATURAS…………………………………………………………………… 2 INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………… 8 1. Panorámica general…………………………………………………………… 8 2. Mecanismos moleculares de la enfermedad renal…………………………… 9 2.1 TGF-β y BMP7…………………………………………………… 10 2.2 MCP-1………..…………………………………………………… 16 2.3 ET-1………….…………………………………………………… 17 3. Sistema Renina-Angiotensina y la regulación transcripcional en la ERC….... 18 4. NF-κB y AP-1: Factores de transcripción implicados en la ERC…………… 19 5. Modelo de 5/6 de nefrectomía: características moleculares………………...... 25 6. Estrategias renoprotectoras…………………………………………………… 25 6.1 Bloqueadores de los canales de calcio.……..……………………... 27 6.2 Bloqueo del SRA………………………………………………… 27 6.3 Betabloqueantes….………………………………………………. 29 6.4 Estatinas….……………………………………………………….. 30 6.5 Inhibidores de NF-κB……………………………………………. 32 6.6 Antagonistas de los receptores de la ET….……………………... 34 6.7 Tratamiento combinado…..……………………………….......... 35 OBJETIVOS…….…………………………………………………………………… 40 MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………… 44 1. Modelo experimental y seguimiento de la enfermedad………………………. 44  INTRODUCCIÓN  Introducción INTRODUCCIÓN 1. Panorámica general. La insuficiencia renal crónica (IRC) es una de las enfermedades con más prevalencia en occidente. Sólo en España la cifra de pacientes en diálisis supera los 30.000; un valor similar de otros tantos ha sido sometido a trasplante renal. El envejecimiento de la población general, así como el incremento de la incidencia de la diabetes mellitus (DM) y de la enfermedad vascular renal (EVR), han influido en el aumento tan espectacular del número de pacientes sometidos a diálisis en los últimos veinte años. Entre el 6.2 y el 7.8% de la población mundial presenta algún grado de enfermedad renal crónica (ERC). Los costes anuales estimados para el tratamiento sustitutivo con diálisis son aproximadamente de unos 600 millones de euros, mientras que para el trasplante renal son de unos 150 millones. El síndrome de hiperfiltración glomerular o de la nefrona remanente es el mecanismo patogénico común del desarrollo final de la ERC terminal, independientemente de la etiología que tenga lugar. Su desarrollo comienza a partir de una pérdida de nefronas por parte del riñón, de manera que las nefronas remanentes se ven obligadas a compensar el trabajo de las lesionadas. Seguidamente, tiene lugar un proceso de hipertrofia compensatoria con un aumento de la presión en el capilar glomerular y de la fracción de filtración glomerular. Este proceso se ve fielmente reproducido en el modelo experimental de 5/6 de nefrectomía utilizado en este trabajo, y en el que profundizaremos más adelante. Existen dos conceptos bien definidos en la actualidad enfocados sobre todo a la clínica, que deben quedar aclarados en este apartado: enfermedad renal crónica (ERC) e insuficiencia renal crónica (IRC). Si bien el primero se viene definiendo como la existencia de lesión renal o filtrado glomerular (FG) < 60 ml/min/1,73 m2 durante un período ≥ 3 meses, el segundo se define como la existencia de lesión renal o filtrado glomerular (FG) < 60 ml/min/1,73 m2 correspondientes a las fases 3, 4 y 5 de la ERC publicadas por la National Kidney Foundation, en sus correspondientes guías clínicas (ver Tabla1), actualmente en revisión. 8  Introducción  Tabla 1. Estratificación de la enfermedad renal crónica NKFK/DOQI Fase Descripción FG Actuación (ml/min/1,73m 2 ) 1 Lesión renal con FG > 90 Diagnóstico y tratamiento normal o aumentado Tratamiento de la comorbilidad Ralentizar la progresión Reducir el riesgo cardiovascular 2 Lesión renal con 60-89 Estimar la progresión ↓ FG leve 3 ↓FG moderada 30-59 Evaluar y tratar complicaciones 4↓FG severa 15-29 Preparación para el tratamiento sustitutivo 5 Insuficiencia o < 15 Tratamiento sustitutivo fallo renal (si uremia) 2. Mecanismos moleculares de la enfermedad renal. Desde un punto de vista molecular, la ERC es una patología compleja. En la evolución de la misma se van a cumplir de forma genérica, toda una serie de acontecimientos, independientemente de que el proceso desencadenante pueda ser de origen diverso. Brevemente, la expresión de moléculas de adhesión y de factores quimiotácticos y activadores específicos de monocitos en el lugar de origen del daño renal, conducirá a la infiltración de monocitos y a su activación a macrófagos. Las propias células renales (mesangiales, endoteliales, intersticiales o tubulares) y los macrófagos residentes e infiltrados, actuarán de forma concertada en la generación de diversos factores de crecimiento, mediadores de inflamación y citocinas, provocando proliferación celular y expansión de matriz. El resultado final de estos procesos es la aparición de glomerulosclerosis y fibrosis intersticial. Aunque aún no se conocen con exactitud los mecanismos de progresión de la enfermedad renal, ha quedado demostrada la participación de ciertas moléculas mediadoras como la endotelina-1 (ET-1), el Factor de Crecimiento Transformante-β1 (TGF-β1), la proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1) y el Factor de Necrosis Tumoral-α (TNFα). Este último puede ser secretado en el riñón por las propias células renales y por los 9  Introducción fagocitos infiltrados. Sus acciones proinflamatorias incluyen muerte celular, quimiotaxis y modulación de la secreción de otros mediadores de inflamación y componentes de matriz extracelular (Ortiz, A. y col., 1995). La expresión de su RNAm se encuentra aumentada en los glomérulos y la médula durante el estadio nefrótico del daño renal agudo provocado por aminonucleósidos en ratas. En la obstrucción unilateral de uréter también se ha observado una expresión elevada de TNF-α, concretamente en los túbulos de la porción cortical del riñón obstruido, pero no en los glomérulos. Sin embargo, la inducción de la síntesis de TNF-α no parece constituir un mecanismo general de activación de las vías que conducen al daño renal. Mediante análisis de Northern no ha podido detectarse expresión de TNF-α en el modelo de reducción de masa renal, mientras que el TGF-β1 y el MCP-1 sí parecen desempeñar un papel preponderante en la resolución de la enfermedad en este modelo experimental (Lee, L.K. y col., 1995; Schiller, B. y Moran, J., 1997). Es por ello, que los esfuerzos de este trabajo se han centrado en el análisis de los mecanismos y mediadores moleculares que se exponen a continuación. 2.1 TGF-β y BMP7. La superfamilia del TGFβ engloba un gran grupo de polipéptidos extracelulares con grandes similitudes estructurales, que participan en procesos de crecimiento, desarrollo, diferenciación y homeostasis a través de su interacción con receptores de la membrana celular (Massagué, J., 1990; Sporn, M.B. y Roberts, A.B., 1990). Dentro de esta superfamilia existen cuatro subfamilias claramente definidas: i) la del TGF-β, ii) la de las proteínas morfogénicas óseas (BMPs), iii) la de la proteína Nodal y sus derivados, y iv) la de las activinas. En este trabajo nos centraremos en las dos primeras, y específicamente, en dos isoformas concretas: TGFβ1 y BMP7. De forma general, el TGF-β es una citocina con propiedades antiinflamatorias e inmunoreguladoras que a niveles fisiológicos está implicado en el correcto desarrollo y funcionamiento de algunos órganos como el riñón, así como en la reparación tisular; sin embargo, cuando tienen lugar procesos de fibrosis se sobreexpresa de manera significativa. De las cinco isoformas conocidas pertenecientes a la subfamilia del TGF-β, las tres primeras, TGF-β1, TGF-β2 y TGF-β3, están presentes en mamíferos y presentan una alta homología entre sí, mientras que el TGF-β4 se ha aislado en pollo y el TGF-β5 en Xenopus. 10  Introducción  Se ha observado que, in vitro, las tres primeras isoformas tienen funciones muy parecidas; sin embargo, in vivo, la primera de ellas ha destacado sobre el resto por su mayor implicación en los procesos de fibrosis renal (Ketteler, M. y col., 1995; MacKay, K. y col., 1990; Ando, T. y col., 1995; Wilson, H.M. y col., 2000). El TGF-β lleva a cabo sus acciones a nivel renal al interactuar con sus correspondientes receptores (TGF-β RI, TGF-β RII y TGF-β RIII). Estos son proteínas integrales con un único dominio transmembrana con actividad serina-treonina kinasa, que al unirse a sus correspondientes ligandos desencadenan una cascada de señalización en la que la participación de proteínas Smad es fundamental. Estas proteínas actúan como factores de transcripción que regulan la expresión de ciertos genes, principalmente de TGF-β, de manera que en los procesos de fibrosis, algunas como Smad2 y Smad3 forman un complejo con Smad4, que se transloca al núcleo e interactúa con diferentes factores de transcripción, regulando la actividad del promotor de distintos genes profibróticos (Blobe, G.C. y col., 2000). El TGF-β1 regula la composición y arquitectura de la matriz extracelular en glomérulo e intersticio gracias a su habilidad para modificar la expresión de gran número de genes. Éste estimula la síntesis de proteínas de matriz (laminina, colágenos y fibronectina) y bloquea la degradación de las mismas disminuyendo la expresión de proteasas y aumentando los niveles de algunos de sus inhibidores, como por ejemplo, el Inhibidor de Activador de Plasminógeno-1 (PAI-1) y los Inhibidores Tisulares de Metaloproteinasas (TIMPs) (Laiho, M. y col., 1987; Tomooka, S. y col., 1992; Ziyadeh, F.N. y Sharma, K., 1995). A nivel experimental numerosos trabajos han puesto de manifiesto la existencia de aumento de expresión de TGF-β en varios modelos animales que recrean distintas patologías renales: modelo de glomerulonefritis proliferativa por inyección de suero antitimocito (antiThy-1) en rata, glomerulonefritis de la membrana basal glomerular en conejos, glomerulonefritis de Habu-venom y nefropatía asociada con obstrucción ureteral (Border, W.A. y Noble, N.A., 1994; Bitzer, M. y col., 1998; Miyajima, A. y col., 2000; Ma, L.J. y col., 2000; Kaneto, H. y col., 1993). En el caso concreto del modelo utilizado en este trabajo se ha encontrado un incremento paulatino de expresión de TGF-β1 y de proteínas de matriz como fibronectina y laminina en los riñones de las ratas nefrectomizadas, inicialmente en el endotelio y posteriormente también en células mesangiales, particularmente en las regiones con mayor grado de esclerosis (Lee, L.K. y col., 1995). Asimismo, se ha demostrado 11  Introducción sobreexpresión de TGF-β en estadios tempranos (14 días), y de forma más clara una vez establecida la proteinuria en los animales nefrectomizados (Abbate, M. y col., 2002a). Se han realizado transfecciones in vivo del gen que codifica para TGF-β1 en riñones de ratas normales con el consiguiente aumento de la producción de TGF-β en glomérulo que se acompañó de una glomeruloesclerosis “galopante” (Isaka, Y. y col., 1993). Diferentes trabajos en cultivo de células tubulares expuestas a sobrecarga proteica han experimentado aumento en la producción de diferentes moléculas proinflamatorias como endotelina-1, MCP-1, RANTES (Zoja, C. y col., 1995; Zoja, C. y col., 1998; Wang, Y. y col., 1997) y TGF-β (Yard, B.A. y col., 2001). Por otra parte, se ha observado en cultivos de podocitos expuestos a albúmina, caída de la expresión de sinaptopodina, una proteína de diferenciación celular presente en podocitos, y aumento de TGF-β1 (Abbate, M. y col., 2002b). Numerosos trabajos en distintos modelos experimentales tanto de diabetes tipo 1 como tipo 2 han demostrado una clara sobreexpresión de esta citocina a nivel renal (Bollineni, J.S. y Reddi, A.S., 1993; Erman, A. y col., 2004; Riser, B.L. y col., 2000; González-Albarrán, O. y col., 2003; Shinomiya, K. y col., 2002). En el proceso de fibrogénesis relacionado con la nefropatía diabética se sabe que el TGF-β juega un papel fundamental. Igualmente, se ha demostrado la estrecha y directa relación existente entre la glucemia y la expresión de TGF-β en ensayos tanto in vitro (Ziyadeh, F.N. y col., 1998) como in vivo (Yang, C.W. y col., 1994; Zhou, G. y col., 2004; Yamamoto, T. y col., 1993). Por otro lado, en pacientes diabéticos y con nefropatía membranosa se han encontrado niveles aumentados de TGF-β en orina, asν como correlaciσn de los mismos con los valores obtenidos de proteinuria (Rivarola, E.W. y col., 1999; Honkanen, E. y col., 1997). El bloqueo de TGF-β, y por tanto, su establecimiento como diana terapéutica, es algo que se viene investigando desde hace algún tiempo, y los resultados que se han obtenido son bastante esperanzadores. La acumulación de proteínas de matriz extracelular a nivel renal así como las manifestaciones histológicas de la patología provocada en un modelo de glomerulonefritis proliferativa por inyección de suero antitimocito en rata se han visto atenuadas al hacer uso de anticuerpos específicos contra TGF-β (Border, W.A. y col., 1992). Algo similar se ha observado en el modelo murino de diabetes db/db (Ziyadeh, F.N. y col., 2000; Chen, S. y col., 2003). Sin embargo, la comunidad científica está de acuerdo en que este abordaje terapéutico todavía necesitará de mucho trabajo de investigación para lograr efectos beneficiosos sin comprometer las funciones básicas de esta citocina. 12  Introducción  BMP7 pertenece a la subfamilia de las Proteínas Morfogénicas Óseas (BMPs), cuyos miembros están implicados de forma muy importante en el desarrollo a nivel embrionario de diferentes órganos. Así, BMP7 está involucrada en el desarrollo de huesos, ojos y riñones, entre otros órganos, y desde un punto de vista molecular se encuentra en la naturaleza en forma dimérica. Cuando tiene lugar el nacimiento del individuo, los niveles de ésta BMP disminuyen en la mayoría de los órganos y tejidos, sin embargo, en el riñón se mantienen, sobre todo, en podocitos, túbulos distales y en los túbulos colectores (Wang, S.N. y col., 2001; Wetzel, P. y col., 2006; De Petris, L. y col., 2007). Esta proteína ha suscitado un alto interés por sus propiedades antifibróticas y su capacidad para neutralizar la fibrogénesis renal (Hruska, K. A y col., 2000; Klahr, S. y col., 2002; Mitu, G. y Hirschberg, R., 2008). En diferentes modelos animales que provocan daño renal se ha comprobado que la expresión de esta proteína decae considerablemente (Wang, S.N. y col., 2001; Wang, S. y col., 2003; Morrissey, J. y col., 2002). Por último, trabajos recientes sugieren que los efectos antiapoptóticos de BMP7 podrían proteger frente a la podocituria (Mitu, G.M. y col., 2007). Un concepto que cada día va adquiriendo mayor importancia en el estudio de los procesos de fibrosis, y en especial del riñón, es la llamada Transición Epitelio-Mesénquima (TEM) (Iwano M. y col., 2002). Este concepto, como su nombre indica, contempla la transición de células epiteliales a mesenquimatosas que se transforman en miofibroblastos productores de matriz en condiciones patológicas (Yang, J. y Liu, Y., 2001). Existen evidencias que demuestran que el eje TGF-β/BMP7 juega un papel modulador fundamental en este proceso (Lin, J. y col., 2005). En términos generales, la activación de los receptores de TGF-β en la célula epitelial induce la fosforilación de Smad2 y Smad3, y su translocación al núcleo junto con Smad4. Una vez dentro, estas proteínas Smad operan concertadamente con varios factores de transcripción promoviendo la TEM. Por otra parte, la activación de ciertos receptores de BMP7 induce la fosforilación de Smad1, Smad5 y Smad8, que al formar sus respectivos complejos con Smad4 se transloncan al núcleo teniendo lugar el proceso inverso. Así, mientras TGF-β favorece la formación de fibroblastos y por tanto la fibrosis, BMP7 tiende a preservar el fenotipo epitelial (figura 1). En todo este proceso participan una serie de proteínas capaces de unirse a ligandos específicos que denominaremos en este documento como Proteínas Trampa de Ligando (PTL). Éstas pueden actuar como moduladores positivos o negativos de cada uno de los componentes del binomio TGF-β/BMP7, favoreciendo o dificultando la unión de los mismos a sus correspondientes receptores (Lin, J. y col., 2005; Tanaka, M. y col., 2008). En la siguiente tabla (Tabla 2) exponemos las más estudiadas: 13  Introducción Tabla 2. Proteínas Trampa de Ligando implicadas en el binomio TGF-β/BMP7. Ligando PTL negativas PTL positivas TGF-β Decorina, LAP, α-2 Macroglobulina, Endoglina, KCP. CTGF. KCP. BMP7 Nogina, Cordina, Folistatina, CTGF, USAG-1, Esclerostina. TGF-β: Factor de Crecimiento Transformante; BMP7: Proteína Morfogénica Ósea-7; LAP: Polipéptido Asociado de Latencia; KCP: Proteína análoga a Kielina/Cordina; USAG-1: Gen Asociado a Sensibilización Uterina-1; CTGF: Factor de Crecimiento de Tejido Conectivo. Dentro de éstas PTL, una de reciente descubrimiento, KCP, llama poderosamente la atención. Los últimos trabajos en torno a ella apuntan a que podría jugar un papel muy importante en la modulación de la TEM por su capacidad para favorecer la vía de señalización de BMP7 (Lin, J. y col., 2005) así como para antagonizar la de TGF-β (Lin, J. y col., 2006) (figura 1). Una cuestión de suma importancia es que BMP7 juega un papel esencial en el desarrollo embrionario del riñón (Dudley, A. T. y col., 1995; Karsenty, G. y col., 1996) mientras que KCP no parece afectarlo en lo absoluto; sin embargo, ratones knock-out para este gen han mostrado ser más susceptibles al daño renal y tener mayor índice de mortalidad y fibrosis que los ratones normales (Lin, J. y col., 2005). Esto podría situar a KCP como mejor candidata que BMP7 tanto como diana diagnóstica como terapéutica. 14  Introducción   CélulaEpitelial Núcleo Decorina LAP α‐2macroglobulina CTGF Nogina Cordina Folistatina CTGF USAG‐1 Esclerostina Proteínas Trampa deLigando Transición Epitelio‐Mesénquima Transición Mesénquima‐Epitelio Receptorde TGF‐β Receptorde BMP 7 Fibroblastos Epitelio Figura 1. Panorámica de la Transición Epitelio-Mesénquima controlada por TGF-β y BMP7. Tanto TGF-β como BMP7 son modulados de forma bidireccional por sus correspondientes Proteínas Trampa de Ligando (PTL) en el medio extracelular. Las PTL positivas favorecen la unión del ligando a su receptor y las negativas la dificultan. La vía de señalización de TFG-β favorece la formación de fibroblastos mediante la transición epitelio-mesénquima mientras que la de BMP7 tiende a preservar el fenotipo epitelial. (Adaptado de Neilson E.G., 2005). 15  Introducción 2.2 MCP-1. Es frecuente encontrar monocitos y macrófagos presentes en las glomerulonefritis clínicas y experimentales. Se cree que éstos participan en la patogénesis de la enfermedad produciendo mediadores de inflamación. Las quimiocinas, un grupo de citocinas con actividad quimioatrayente de neutrófilos y monocitos, podrían estar implicadas en la localización de estas células infiltradas durante la inflamación glomerular. Los monocitos se extravasan y migran siguiendo el gradiente químico de MCP-1, que es sintetizado por los propios monocitos residentes y por las células endoteliales y mesangiales del riñón. Los datos recogidos en diferentes modelos experimentales como la nefropatía difusa por estreptozotocina en ratón (Chow, F.Y. y col., 2006), glomerulonefritis proliferativa por inyección de suero antitimocito en rata (Schneider, A. y col., 1999) o nefritis lúpica en ratones MLR/lpr (Shimizu, S. y col., 2004) sugieren un papel funcional de esta quimiocina en el daño renal, así como la utilidad de diversas estrategias moleculares y farmacológicas que atenúen sus acciones (Shimizu, S. y col., 2004; Sánchez-López, E. y col., 2009). En ratas con reducción de masa renal se ha encontrado un aumento de MCP-1 en las zonas que presentan glomerulosclerosis focal y en la región apical de las células tubulares distales, a la vez que un mayor número de macrófagos en glomérulo e intersticio (Schiller, B. y Moran J., 1997). MCP-1 juega un papel fundamental en la activación tanto de NF-κB como de AP-1 en células humanas del epitelio tubular del riñón (Viedt, C. y col., 2002). A su vez, se ha observado que ambos factores de transcripción están involucrados en la expresión de MCP-1 en células proximales tubulares de rata (Wang, Y. y col., 2000). Todo parece indicar que MCP-1 es un factor clave en la inflamación, la fibrosis y el daño renal en la nefropatía diabética, ya que sus niveles en orina están estrechamente relacionados con la producción de dicha molécula a nivel renal y correlacionan significativamente con niveles de albuminuria, albúmina glicosilada en suero, NAcetilglucosaminidasa (NAG) en orina y macrófagos CD68+, tanto en humanos como a nivel experimental en modelos animales (Banba, N. y col., 2000; Wada, T. y col., 2000; Morii, T. y col., 2003; Chow, F.Y. y col., 2006; Chow, F.Y. y col.; 2007). Por último, en humanos, la presencia del alelo de MCP-1 A (-2518) se ha asociado con la diabetes tipo 1 (Yang, B. y col., 2004) y con la nefritis lúpica (Kim, H.L. y col., 2002). 16  Introducción  diferentes proteínas implicadas y otros factores de transcripción y/o cofactores. En este sentido, se ha demostrado en un modelo de nefritis por nefrotoxicidad en rata, que c-Jun y cFos son las isoformas que mayor aumento de expresión experimentan, y que existe una estrecha correlación entre la activación de AP-1 y el aumento de expresión de MCP-1 (Zhang, A.H. y col., 2004). Asimismo, en células túbulo-epiteliales humanas se ha observado que un inhibidor selectivo de Jun kinasa, el SP600125, es capaz de reducir la fosforilación de c-Jun, atenuando de esta forma la sobreexpresión de colágeno I y de MCP-1 mediada por TGF-β (de Borst, M.H. y col., 2007). Por otra parte, se ha observado que la proteína nuclear JunD es un determinante de suma importancia en la actividad de macrófagos y está asociado con la susceptibilidad a glomerulonefritis en ratas Wistar Kyoto (Behmoaras, J. y col., 2008). AP-1 regula la expresión de varios genes implicados en la patogénesis del daño glomerular, como la endotelina, el TGF-β1, la interleucina-6, el MCP-1 y el colágeno I. De hecho, las vías de activación del TGF-β actúan coordinadamente con AP-1 en la activación transcripcional de la pre-proET-1 (Rodríguez-Pascual, F. y col., 2003), y el colágeno I (Tharaux, P.L. y col., 2000; de Borst, M.H. y col., 2007), y se ha demostrado que se requiere la inducción de AP-1 para el aumento de expresión de fibronectina mediada por TGF-β1 (Hocevar, B.A. y col., 1999). La actividad de AP-1 puede ser modulada por diferentes efectores: citocinas, factores de crecimiento, señales de estrés, estímulos oncogénicos entre otros, que provocan la activación de diversos mecanismos de transducción de señales (Young, M.R. y Colburn, N.H., 2006; Karin, M., 1995). Asimismo, la activación del factor de transcripción AP-1 parece ser responsable parcial de las acciones profibrogénicas de la angiotensina II (Hamaguchi, A. y col., 1999). Este proceso parece estar ligado, a su vez, a la capacidad de la angiotensina II para estimular la producción de ROS (Mervaala, E. y col., 2003). Como ya se ha comentado, la angiotensina II induce fibrosis mediante la activación de la vía de señalización del TGF-β (Border, W. y Noble, N.A., 1998) y la subsiguiente inducción de factores nucleares Smad (Massagué, J. y Chen, Y.G., 2000). La activación simultánea de AP1 y de factores nucleares Smad inducida por angiotensina II podría favorecer las acciones coordinadas de estos factores nucleares en la regulación de la expresión de otros genes profibrogénicos. Por otra parte, las posibles conexiones entre las acciones de NFkB y AP-1 es algo que desde hace tiempo inquieta a la comunidad científica dedicada a estudiar la fisiología y 23  Introducción fisiopatología renales. En este sentido, los antagonistas del receptor AT1 de la angiotensina II (ARAII) reducen el incremento de endotelina (Lariviere, R. y col., 1998), de TGF-β1 y de proteínas de matriz extracelular (Lee, L.K. y col., 1995) en el riñón de ratas nefrectomizadas. Se ha demostrado que la endotelina 1 y el TGF-β1 actúan de forma sinérgica en la potenciación de la síntesis de colágeno I tras administración intravenosa de angiotesina II (Fakhouri, F. y col., 2001). Un efecto similar se ha observado en piezas de corteza renal expuestas a angiotensina II ex vivo (Tharaux, P. L. y col., 2000). En este modelo, es necesaria la activación de las vías de señalización del TGF-β1 y de la proteína kinasa activada por mitógenos-kinasa regulada por estímulos extracelulares (MAPK/ERK), que parecen cooperar en la formación del complejo transcripcional AP-1 y en la consiguiente activación de la expresión génica del colágeno I. Resulta llamativo que la activación de NF-κB por angiotensina II no parece guardar relación con la fibrogénesis en este estudio. Esto sugiere que las acciones de los factores nucleares AP-1 y NF-κB en el daño renal podrían transcurrir por vías independientes. Figura 3. Factor de transcripción proteína activadora 1 (AP-1). Es un factor de transcripción dimérico compuesto por proteínas Jun y Fos. Las proteínas Jun forman homo o heterodímeros con las proteínas Fos mediante dominios cremallera de leucina. Las distintas combinaciones diméricas reconocen secuencias pertenecientes a promotores o activadores de diferentes genes diana; estos últimos son regulados positivamente (+), negativamente (-) o positiva y negativamente (+/-) según el tipo de dímero de AP-1. Se muestra el elemento de respuesta clásico a ésteres de forbol (TRE) y la secuencia consenso correspondiente (TGACTCA). 24  Introducción  5. Modelo de 5/6 de nefrectomía: características moleculares. La reducción quirúrgica severa de masa renal (5/6 de nefrectomía) en animales de experimentación progresa inevitablemente hacia el fallo renal. La hiperperfusión de las nefronas remanentes constituye la respuesta renal adaptativa a la reducción de la masa renal. Los procesos de adaptación hemodinámicos dan lugar a la aparición de hipertensión sistémica y glomerular, que previsiblemente terminará afectando a la permeabilidad selectiva de la barrera de filtrado glomerular. Esta precede al desarrollo de glomerulosclerosis, que se acompaña de proteinuria creciente, insuficiencia renal progresiva y de hipertrofia renal y cardíaca. La importancia del SRA en la patogénesis del daño renal ha sido descrita en este modelo experimental (Lafayette, R. A. y cols., 1992). Sin embargo, los efectos renoprotectores de los IECA y de los antagonistas de los receptores AT1 de la angiotensina II no parecen estar canalizados exclusivamente por una reducción en los valores de la presión arterial. Este modelo presenta diferencias importantes en la expresión de citocinas y factores de crecimiento, y en el tiempo de evolución de la patología renal respecto a otros modelos experimentales. Así, como se ha comentado anteriormente en el apartado 2, se ha observado que en el modelo de 5/6 de nefrectomía no hay aumento de expresión de TNF-α (Schiller, B. y Moran, J., 1997), mientras que en modelos experimentales como la nefritis lúpica en ratón o la nefritis por aminonucleósidos en rata (Neale, T.J. y col., 1995) sí parece jugar un papel destacado en la progresión de la enfermedad. Estas diferencias están relacionadas previsiblemente con los mecanismos particulares que entran en juego en los primeros estadios de la enfermedad en cada modelo experimental. El modelo de 5/6 de nefrectomía es uno de los más aceptados de insuficiencia renal crónica. Es extrapolable al humano, como se ha podido observar en diferentes procesos patológicos (esclerosis focal y segmentaria, agenesia renal, etc.) y es de los pocos modelos que ofrece todo el espectro de evolución de la enfermedad renal: proteinuria, hipertensión arterial y pérdida de función renal. En éste coexisten el daño glomerular, tubulointersticial y vascular. 6. Estrategias renoprotectoras. Muchas son las estrategias renoprotectoras utilizadas hasta la fecha. Gran parte de ellas se basan en terapias antihipertensivas y antiproteinúricas; de hecho, diferentes estudios han demostrado que el control de la hipertensión en sí mismo, es capaz de incidir en la disminución de la proteinuria (Peterson, J.C. y col., 1995; Schrier, R.W. y col., 2002; Wright, J.T., Jr. y Douglas, J., 2003). Si bien alcanzar una presión arterial relativamente baja (< 125 25  Introducción mmHg) debería ser el objetivo de cualquier tratamiento antihipertensivo enfocado a la renoprotección (Peterson, J.C. y col., 1995; Schrier, R.W. y col., 2002) en el caso de un tratamiento antiproteinúrico lo ideal sería alcanzar valores de proteinuria inferiores a 300 mg/m2/día, debido a que se han asociado con claros efectos renoprotectores (Jafar, T.H. y col., 2001; Ruggenenti, P. y col., 2001). En nuestro estudio hemos empleado fármacos con capacidad renoprotectora o bien aquellos en los que se ha hipotetizado que pueden proteger el riñón. En primer lugar, utilizamos un agente antihipertensivo bloqueante del SRA, específicamente, un ARAII (losartán). Nos decantamos por este fármaco en lugar de por un IECA debido a que consideramos que las vías alternativas para producir angiotensina II a nivel tisular, independientes del enzima conversor de angiotensina, pueden escapar al abordaje terapéutico de este tipo de agente farmacológico, mientras que el ARAII, que actúa sobre los receptores AT1, sería capaz de neutralizar los efectos de la angiotensina II independientemente de la vía por la que ésta última se hubiera generado. En segundo lugar, utilizamos el carvedilol, un betabloqueante y vasodilatador con capacidad renoprotectora previamente documentada en 5/6 de nefrectomía por nuestro grupo (Rodríguez-Pérez, J.C. y col., 1997). Como ya habíamos elegido dos fármacos con capacidades antihipertensivas y renoprotectoras bien documentadas en 5/6 de nefrectomía (Lariviere, R. y col., 1998; Rodríguez-Pérez, J.C. y col., 1997), decidimos utilizar otros que nos permitieran analizar la renoprotección independientemente del control de la presión arterial. Las estatinas son capaces de reducir la producción de MCP-1 (Kim, S.Y. y col., 1995) y NF-κB en células mesangiales humanas (Guijarro, C. y col., 1996). Asimismo, se ha postulado que las estatinas podrían disminuir el avance de la progresión de la ERC como consecuencia de sus acciones pleiotrópicas (Epstein, M. y Campese, V.M., 2005; Campese, V.M. y col., 2005), por lo que decidimos utilizar una de ellas, específicamente, la cerivastatina. Por otra parte, debido al protagonismo que estaba adquiriendo la endotelina-1 en la progresión de la ERC en el 5/6 de nefrectomía (Remuzzi, G. y col., 1997) utilizamos un antagonista no selectivo de los receptores ETA y ETB (Ro 48-5695). A continuación se comentan las diversas estrategias que han sido utilizadas o podrían llegar a ser de utilidad en la clínica para el tratamiento de la ERC, aunque no todas ellas han sido analizadas en el presente estudio. 26  Introducción  6.1 Bloqueadores de los canales de calcio. Aunque el potencial renoprotector de estos fármacos no está del todo claro, todo apunta a que sus acciones pleiotrópicas podrían contribuir a proteger el riñón del daño provocado por la hipertensión, ya que son capaces de normalizar los valores de presión arterial (PA) en pacientes con ERC. Si bien se ha documentado que algunos bloqueadores de los canales de calcio (BCC) dihidropiridínicos, como el nifedipino o el amlodipino pueden ser ineficaces o incluso contraproducentes, otros BCC no-dihidropiridínicos como el verapamil o el diltiazem pueden tener cierto efecto antiproteinúrico y, en consecuencia, podrían ser buenos candidatos a la renoprotección (Remuzzi, G. y col., 1997). Actualmente se sabe que los BCC dihidropiridínicos de tercera generación como el manidipino, el nilvadipino o el benidipino ofrecen beneficios en la función renal por su capacidad para ejercer vasodilatación tanto de las arteriolas eferentes como aferentes (Hayashi, M. y col., 2000; Hayashi, K. y col., 2003). Sin embargo, es necesario realizar ensayos clínicos suficientes que aclaren el potencial de estos fármacos en la ERC. 6.2 Bloqueo del SRA. Existen diferentes alternativas terapéuticas relacionadas con el sistema reninaangiotensina-aldosterona. La generación anormal de angiotensina II está claramente implicada en el desarrollo de la enfermedad renal progresiva, como se comentó en el apartado 3. Por ello, entre las estrategias terapéuticas más utilizadas se encuentran las destinadas al bloqueo del SRA mediante el uso de fármacos como los antagonistas de la renina, los IECA y los ARAII. Los antagonistas de la renina inhiben selectivamente los receptores prorenina implicados en la síntesis de angiotensina I a partir de angiotensinógeno. Los IECA obstaculizan la conversión de angiotensina I en angiotensina II, inhibiendo la enzima que cataliza dicha reacción, mientras que los ARAII bloquean los receptores tipo 1 de la angiotensina II, y por tanto, las acciones de esta última mediadas por dicho receptor. Los antagonistas de la renina se postulan como posibles candidatos para el tratamiento de la enfermedad renal por su capacidad para el bloqueo parcial de este sistema. El caso del aliskiren es una prueba de ello, pues se ha demostrado que es capaz de normalizar los valores de PA en pacientes hipertensos (Oparil, S. y col., 2007), y contribuye a la reducción de la albuminuria en pacientes con nefropatía diabética en tratamiento con ARAII (Parving, H.H. y cols., 2008). Sin embargo, aún no hay estudios suficientes sobre su capacidad renoprotectora. 27  Introducción Los IECA y los ARAII son capaces de reducir la presión intraglomerular y la proteinuria, de disminuir la liberación local de citocinas y de quimiocinas, así como de controlar los mecanismos de inflamación implicados, de manera que la esclerosis e hipertrofia glomerular, la inflamación túbulointersticial y la fibrosis se ven considerablemente atenuados, retrasando la aparición del daño renal (Lewis, E.J. y col., 1993; Maschio, G. y col., 1996; Izuhara, Y. y col., 2005). En el caso particular que nos interesa, los ARAII, como el losartán, actúan bloqueando competitiva y selectivamente los receptores AT1, inhibiendo así los efectos hipertensivos de la angiotensina II, especialmente los relacionados con la vasoconstricción y la liberación de aldosterona. Los ARAII se dividen en dos subgrupos químicos: los bifeniltetrazoles y no bifeniltetrazoles. El losartán pertenece al primero de los subgupos y no se une ni bloquea otros receptores hormonales o canales de iones importantes en la regulación cardiovascular. Estos fármacos han demostrado una alta seguridad y eficacia, además de ejercer efectos beneficiosos independientes de su acción antihipertensiva en pacientes con insuficiencia cardíaca, diabetes mellitus tipo 1 y nefropatías. Asimismo, los ARAII disminuyen la proteinuria y la glomeruloesclerosis en modelos animales de insuficiencia renal asociada o no a diabetes, debido, en parte, a una disminución de la fibrosis intersticial y de la expresión glomerular de TGFβ-1, colágenos tipo I, III y IV, y FN-1 (Timmermans, P.B. y col., 1993; Burnier, M., 2001; Goa, K.L. y Wagstaff, A.J., 1996; Croom, K.F. y col., 2004; Sharpe, M. y col., 2001; Easthope, S.E. y Jarvis, B., 2002; Wellington, K. y Faulds, D.M., 2002; Unger, T. y col., 2004; Horiuchi, M. y col., 1999). Diferentes ensayos clínicos han arrojado resultados positivos sobre este fármaco. El estudio LIFE (Losartan Intervention For Endpoint reduction in hypertension), que se llevó a cabo en pacientes hipertensos constató la capacidad del losartán para reducir las cifras de presión arterial. Aunque la capacidad antihipertensiva del losartán fue similar a la del atenolol con el que estaban tratados los pacientes del grupo control, el losartán redujo el riesgo de sufrir infarto de miocardio, accidente cerebrovascular y muerte por enfermedad cardiovascular en relación al atenolol. El losartán parece conferir, por tanto, beneficios más allá de la reducción de la presión arterial (Dahlöf, B. y col., 2002; Egan, B. y col., 2004). Por otra parte, el estudio RENAAL (Reduction of End points in NIDDM with the Angiotensin II Receptor Antagonist Losartan), demostró que el losartán es capaz de reducir la proteinuria y el riesgo de progresión hacia insuficiencia renal terminal en un grupo de pacientes con diabetes tipo 2 y nefropatía (Brenner, B.M. y col., 2001; Egan, B. y col., 2004). Asimismo, en 28  Introducción  pacientes normotensos con nefropatía IgA, el losartán redujo la proteinuria y la excreción de N-acetilglucosaminidasa en orina y, por tanto, la magnitud de las lesiones tubulares, con independencia de la PA (Shimizu, A. y col., 2008). Los antagonistas de la aldosterona, por sus propiedades diuréticas, se han utilizado en el tratamiento de la hipertensión y de la ERC en asociación con otros fármacos como ARAII o IECA. Estos fármacos llevan implícito el riesgo de provocar hiperpotasemia, así como la aparición de posibles efectos secundarios relacionados con el sistema endocrino; no obstante, el desarrollo de nuevos principios activos ha ido superando este último escollo. Un ejemplo de ello es la eplerenona, que al contrario que la espirinolactona, tiene menos afinidad por los receptores de progesterona y androgénicos, y se ha demostrado que sus efectos secundarios apenas difieren de los correspondientes al placebo (White, W.B. y col., 2003). 6.3 Betabloqueantes. El bloqueo de los receptores postsinápticos beta conlleva, entre otros efectos, una disminución de los valores de PA en pacientes con ERC. Se ha demostrado que el metoprolol y el atenolol tienen capacidad renoprotectora (Parving, H.H. y col., 1983; Marchi, F. y Ciriello, G., 1995) si bien betabloqueantes más novedosos como el carvedilol resultan más eficaces en la protección renal (Marchi, F. y Ciriello, G., 1995; Fassbinder, W. y col., 1999). Este fármaco es un antihipertensivo con acción beta-bloqueante no cardioselectiva sin actividad simpaticomimética intrínseca, alfa1-bloqueante a nivel postsináptico y vasodilatadora. Tiene la capacidad de no modificar los niveles de glucosa, ni el perfil lipídico, ni la función renal. Produce una rápida caída de la resistencia vascular periférica así como de la presión arterial sin modificar la frecuencia cardíaca ni el volumen minuto. Son bien conocidas las propiedades cardioprotectoras de los betabloqueantes, sin embargo, los efectos negativos sobre el metabolismo de carbohidratos y lípidos ha hecho que su utilización sea controvertida en pacientes diabéticos, cuya predisposición a padecer ERC es elevada. Así, los efectos secundarios de este tipo de fármacos en pacientes diabéticos contemplan disminución de los niveles de LDLs, aumento de los niveles de triglicéridos y aumento de insulino-resistencia. El estudio GEMINI compara los efectos del carvedilol y del tartrato de metoprolol sobre el control de la glucemia. Los autores observaron que los valores de microalbuminuria más bajos correspondieron a los pacientes que fueron tratados con carvedilol (Bakris, G. L. y col., 2004; Phillips, R. A. y col., 2008). Estos mismos pacientes 29  Introducción presentaron un aumento de la sensibilidad a la insulina, no observada en aquellos tratados con metoprolol, y no se apreciaron diferencias significativas en la variación promedio de hemoglobina glicosilada respecto del ingreso mientras que en el grupo tratado con metoprolol sí hubo aumento de proteína glicosilada. Algunos estudios aportan información que ponen de manifiesto las propiedades antiproliferativas y antioxidantes del carvedilol (Sung, C.P. y col., 1993; Sung, C.P. y col., 1997; Yue, T.L. y col., 1992a; Yue, T.L. y col., 1992b; Yue, T.L. y col., 1992c; Yue, T.L. y col., 1993; Yue, T.L. y col., 1994a; Yue, T.L. y col., 1994b; Van den Branden, C. y col. , 1997; Arumanayagam, M. y col., 2001). En un modelo de nefrotoxicidad inducida por cisplatino en ratas, el carvedilol redujo los niveles de malonildialdehído (MDA) renal incrementados por el cisplatino, y normalizó los correspondientes a enzimas antioxidantes como la glutatión peroxidasa y la catalasa, disminuidos también por la acción del mismo quimioterápico (Gamal el-Din, A. M. y Al-Bekairi, A. M., 2006). Igualmente, en ratas sometidas a daño renal por isquemia/reperfusión, el carvedilol fue capaz de reducir considerablemente los niveles de creatinina sérica respecto al grupo control y a otro tratado con metoprolol (Hayashi, T. y col., 2008). Por otro lado, nuestro grupo ha encontrado mejora en la tasa de filtrado glomerular, reducción de la actividad de la renina plasmática y del daño renal en ratas sometidas a 5/6 de nefrectomía tratadas con distintas dosis de carvedilol. Este efecto estuvo presente incluso a dosis no antihipertensivas (Rodríguez-Pérez, J.C. y col., 1997). 6.4 Estatinas. La introducción de los inhibidores de la HMG-CoA reductasa, comúnmente denominados estatinas, ha revolucionado el tratamiento farmacológico de las dislipidemias debido a su elevada eficacia y tolerancia. La inhibición de la biosíntesis del colesterol se acompaña de una mayor presencia de receptores hepáticos de LDL, que promueven la captación y el aclaramiento de colesterol del torrente sanguíneo (Knopp, R.H., 1999). El mecanismo de acción de estos fármacos se basa en la inhibición competitiva y reversible de la transformación del HMG-CoA a mevalonato, que es el precursor de los esteroles celulares, incluidos el colesterol y los lípidos isoprenoides (Goldstein, J.L. y Brown, M.S., 1990; Grunler, J. y col., 1994). Entre estos últimos se encuentra el dolicol, necesario para la glicosilación de proteínas, las ubiquinonas de la cadena respiratoria mitocondrial, la 30  Introducción  isopentenil adenina, que interviene en la modificación de ciertas formas de RNAt, y los isoprenoides farnesil pirofosfato (FPP) y geranilgeranil pirofosfato (GGPP) que participan en la modificación postraduccional de gran variedad de proteínas que están involucradas en mecanismos de señalización celular. La modificación proteica por farnesilación o geranilgeranilación va a condicionar la localización subcelular y la actividad de estas proteínas. Los miembros de la superfamilia Ras, constituida por proteínas monoméricas capaces de unir GTP, también conocidas como proteínas G de bajo peso molecular, como Ras, Rac y Rho, son los sustratos principales de modificación postraduccional por isoprenilación y pueden ser dianas de interés para la inhibición por estatinas. No debe resultar extraño, por tanto, que las estatinas, además de su capacidad para inhibir la síntesis hepática de colesterol, también sean capaces de modificar otras funciones celulares, como las relativas al control del ciclo celular, la migración celular y el estado redox. Respecto a la utilidad de estos fármacos como agentes renoprotectores, diversos estudios han demostrado que tienen la capacidad de retrasar la pérdida de la función renal en pacientes con IRC moderada, diabetes o problemas cardíacos (Tonelli, M. y col., 2003, 2005a y 2005b). Las estatinas pueden frenar la progresión de la enfermedad renal a través de sus conocidas acciones pleiotrópicas (Epstein, M. y Campese, V.M., 2005), entre las que se incluyen la reversión de la disfunción endotelial, la regulación del SRA, y sus acciones antiinflamatorias, antiproliferativas y antihipertensivas. Trabajos recientes evidencian que son capaces de reducir el estrés oxidativo, así como la expresión génica de laminina, CTGF, TGFβ y fibronectina, a la vez que pueden aumentar la biodisponibilidad de óxido nítrico (NO) (Koepke, M.L. y col., 2007; Zhou, M.S. y col., 2008). Por otra parte, en los últimos años se ha atribuído un papel relevante a la vía RhoA/Rho-quinasa en la progresión de la enfermedad renal en general y en la podocituria en particular, de modo que el efecto renoprotector de algunas estatinas podría residir en su capacidad para modular esta vía de señalización (Shibata, S. y col., 2006; Peng, F. y col., 2008). Sin embargo, todo parece indicar que a pesar de tener efectos beneficiosos en la proteinuria y la protección renal, las estatinas por sí solas son incapaces de lograr una renoprotección eficaz (Sandhu, S. y col., 2006). La cerivastatina, el inhibidor de la HMG-CoA reductasa utilizado en este trabajo, es un derivado piridínico sintético, enantioméricamente puro. Tiene una alta selectividad hepática, no atraviesa la barrera hematoencefálica y se ha demostrado que, tanto in vitro como in vivo, su afinidad enzimática es superior a la de otras estatinas como lovastatina, simvastatina y pravasatatina. Posee una semivida de eliminación relativamente corta (2 a 3 31  Introducción horas para una dosis única de 0,2mg), aunque se trasforma en los metabolitos M1, M23 y M24 que retienen las capacidadades inhibidoras del fármaco original. Además de su capacidad para inhibir la síntesis de colesterol, se ha demostrado que la cerivastatina puede reducir la proteinuria y retrasar la aparición de uremia, atenuar la fibrosis renal e inhibir la infiltración de células inflamatorias en un modelo de fibrosis renal progresiva (Koepke, M.L. y col., 2007). 6.5 Inhibidores de NF-κB. Trabajos recientes mantienen a NF-κB en el punto de mira como futura diana terapéutica por su importante papel en el progreso del daño renal en diferentes modelos animales, así como por las evidencias de reversión del daño al utilizar inhibidores específicos de este factor nuclear (Fujihara, C.K. y col., 2007; Wang, H. y col., 2008; Kosaka, T. y col., 2008). Algunos fármacos mencionados anteriormente en esta sección introductoria son capaces, al menos parcialmente, de modular la activación de NF-κB. Entre ellos podemos citar los IECA y los ARAII, cuyo uso clínico en la protección renal está ampliamente contrastado, y las estatinas, a las cuales se les han atribuído capacidades renoprotectoras (Abbate, M. y col., 2006; Gilmore, T.D., 2006). Aunque estos fármacos pueden interferir con el mecanismo de activación de NF-κB, no hay que olvidar que además pueden actuar en otras vías de señalización. Probablemente, el beneficio del uso de estos fármacos esté relacionado con el conjunto de efectos que pueden desencadenar y no sólo con su capacidad para inhibir NF-κB. No está del todo claro si la modulación específica de la actividad de NF-κB podría resultar aún más beneficiosa para el tratamiento de la ERC. Con el objetivo de dar respuesta a ésta incógnita se están llevando a cabo numerosos estudios y se está investigando en el desarrollo de inhibidores específicos de este factor de transcripción para su uso en la clínica (Gilmore, T.D. y Herscovitch, M., 2006). Se piensa que los inhibidores de las IkappaB quinasas (IKKs) podrían ser candidatos a aparecer muy pronto en el escenario clínico debido a que actualmente se encuentran en fase preclínica, y los resultados que se han obtenido son bastante alentadores (Heckmann, A. y col., 2004). Los datos recogidos en diversos modelos experimentales de enfermedad renal también parecen evidenciar la utilidad de la inhibición específica de la activación de NF-κB. En este sentido, Sánchez-López, E. y col. sometieron a tratamiento con partenolida, un inhibidor de NF-κB, a ratones a los que se les había administrado CTGF durante 24h y que como 32   MATERIALESYMÉTODOS  Materiales y Métodos  1. Modelo experimental y seguimiento de la enfermedad Se utilizaron ratas Sprague-Dawley con un peso comprendido entre 250-300 g de peso de la colonia criada en nuestra Unidad de Investigación. Los animales se mantuvieron según condiciones establecidas en el RD 1201/2005; Ley 32/2007. Todos los estudios se realizaron acorde a la “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”. El riñón derecho se extrajo bajo anestesia ligera con éter. Nueve días más tarde, los animales se anestesiaron con tiopental sódico (Pentotal: 50 mg/kg i.p.; Lab. Abbott, Chicago IL) y se llevaron a la mesa quirúrgica donde se realizó una laparotomía media con ampliación a incisión subcostal izquierda, visualizando el hilio y riñón izquierdo. Una vez ligadas dos de las tres ramas arteriales, el riñón sufrió un infarto de sus 2/3 partes, que incluyó polo superior, inferior y cara posterior. La temperatura del animal se mantuvo entre 37-38 ºC hasta recuperación de la anestesia. Se realizaron dos series de experimentos. La primera estuvo compuesta por animales a los que se les realizó la técnica quirúrgica de 5/6 de nefrectomía y que serían sacrificados 7 días después de la cirugía (Ct5/6Nx-7d; n=12). En esta misma serie se añadió un grupo de ratas a las que se sometió al mismo estrés quirúrgico, realizándoles una laparotomía media con ampliación a incisión subcostal izquierda, con visualización del hilio y riñón izquierdo, pero sin llevar a cabo la ablación renal (Sham-7d; n=8). La segunda serie de experimentos estuvo compuesta por un grupo sham (n=11) y animales con nefrectomía parcial que serían sacrificados a los 42 días de la cirugía. Como se muestra en la figura 4, las ratas nefrectomizadas fueron aleatorizadas para ser utilizadas como controles (Ct5/6Nx-42d; n=8), o bien recibir los correspondientes tratamientos farmacológicos: i) losartán (n=8; 200 mg/L en agua de bebida; Merck Sharp & Dohme, España); ii) cerivastatina (n=7; 0,1 mg/kg/día mediante sonda oral; Bayer AG, Wuppertal, Alemania); iii) losartán con cerivastatina (n=9) a las mismas dosis y mediante la misma vía de administración que los tratamientos individuales, y iv) carvedilol (n=8; 20 mg/L en agua de bebida; Hoffmann-La Roche, Grenzach, Alemania). Dentro de esta misma serie de experimentos se añadieron, a posteriori, dos grupos adicionales que recibieron tratamiento con un antagonista no selectivo de los receptores de endotelina ETA/ETB (Ro 48-5695; n=6; 30 mg/kg/día mediante sonda oral; Hoffmann-La Roche, Grenzach, Alemania) y con el inhibidor selectivo de NF-κB, PDTC (n=6; 200 mg/kg/día, inyección subcutánea; Sigma-Aldrich, San Louis, MO, USA). 44  Materiales y Métodos  Con el objetivo de observar qué efectos ejercían los fármacos desde los momentos iniciales de la ablación renal provocada por el modelo empleado, los tratamientos comenzaron una semana después de la cirugía y continuaron hasta el final del estudio. Las dosis de los diferentes fármacos se escogieron en base a diferentes trabajos revisados en la literatura científica (Lafayette, R.A. y col., 1992; Rodríguez-Pérez, J.C. y col., 1997; Bischoff, H. y col., 1997; Clozel, M. y col., 1999). Los animales fueron entrenados en sus correspondientes cepos durante 14 días antes del comienzo de los experimentos para asegurar unas medidas de tensión arterial fiables. El día de la uninefrectomía se determinó la presión arterial basal de forma incruenta en la cola de la rata (Letica Scientific Instruments: LE-5007; Barcelona). Justo antes del inicio del tratamiento, a los 24 días y al final del experimento se realizaron nuevas medidas electrónicas de la presión arterial (figura 4). Se tomaron cinco medidas por animal, descartando siempre la más elevada y la más baja de las obtenidas, de manera que el valor final fue la media de las tres medidas restantes. Igualmente se registraron los pesos de cada animal y se recolectaron las correspondientes orinas, para lo que se les dejó 24 horas en jaula metabólica. El día del sacrificio se realizó perfusión cardíaca con suero fisiológico a 37ºC y se recogieron sangre y muestras de corteza renal para los estudios histológicos y las determinaciones moleculares. Se tuvo especial cuidado en la recogida de corteza renal para lo que se dejó un margen amplio de separación con la médula. 45  Materiales y Métodos   5/6Nx 1d 3d 7d ‐9d07d24d42d Uninefrectomía derecha 2/3infarto renal izquierdo Iniciode tratamientos PAS PAS PAS PAS Eutanasia Control(Ct5/6Nx‐42d) Losartán Cerivastatina Losartán +Cerivastatina Carvedilol AntagonistaETR A /ETR B (Ro48‐5695) PDTC Ct5/6Nx‐7d Sham‐7d Eutanasia Figura 4. Modelo experimental y seguimiento de la enfermedad. En la parte superior se muestra el diseño experimental, que incluye los días a los cuales se efectúa la cirugía, cuando se realizan las tomas de PAS y se sacrifican las ratas de los experimentos a 7 y 42 d, y el momento de la aleatorización para el inicio de los tratamientos del experimento a 42 días. Abajo se muestran fotografías del momento de la ligadura de una de las ramas de la arteria renal izquierda y del aspecto del riñón izquierdo extraído 1, 3 ó 7 días después de completar la nefrectomía parcial (5/6 Nx), donde se aprecia como 1/3 de la masa renal presenta un aspecto normal. 5/6Nx 1d 3d 7d5/6Nx 1d 3d 7d ‐9d07d24d42d Uninefrectomía derecha 2/3infarto renal izquierdo Iniciode tratamientos PAS PAS PAS PAS Eutanasia Control(Ct5/6Nx‐42d) Losartán Cerivastatina Losartán +Cerivastatina Carvedilol AntagonistaETR A /ETR B (Ro48‐5695) PDTC Ct5/6Nx‐7d Sham‐7d Eutanasia Figura 4. Modelo experimental y seguimiento de la enfermedad. En la parte superior se muestra el diseño experimental, que incluye los días a los cuales se efectúa la cirugía, cuando se realizan las tomas de PAS y se sacrifican las ratas de los experimentos a 7 y 42 d, y el momento de la aleatorización para el inicio de los tratamientos del experimento a 42 días. Abajo se muestran fotografías del momento de la ligadura de una de las ramas de la arteria renal izquierda y del aspecto del riñón izquierdo extraído 1, 3 ó 7 días después de completar la nefrectomía parcial (5/6 Nx), donde se aprecia como 1/3 de la masa renal presenta un aspecto normal. 46  Materiales y Métodos  2. Aislamiento de RNA y determinación de la expresión génica. Las muestras de tejido renal se disgregaron en solución de isotiocianato de guanidinio y el aislamiento del RNA total se realizó por el método de Chomczynski (Chomczynski, P. y col., 1987). El RNA total (2 µg en un volumen total de 20 µl) fue retrotranscrito a cDNA a 37ºC durante 60 min en presencia de 200 unidades de MMLV-RT (Promega, Madison, WI), 20 unidades de inhibidor de ribonucleasas RNasin (Promega) y 100 pmol de hexanucleótidos randomizados (Amersham Biosciences, Buckinghamshare, England). El nivel de expresión de los genes de interés se determinó de forma semicuantitativa mediante RT-PCR en Tiempo Real (LightCycler Instrument, Roche Applied Science), utilizando el kit comercial FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Applied Science, Mannheim, Germany). Este método es claramente más ventajoso que la PCR convencional debido a que es más sensible, más preciso, y menos laborioso. Como se puede observar en la figura 5, permite trabajar con valores de concentración correspondientes a la zona de la curva en que su segunda derivada toma un valor máximo (crossing point), donde la homogeneidad de los datos contrasta con la variabilidad existente en la fase plateau, a la que se suele llegar en el proceso de cuantificación mediante PCR convencional. Se diseñaron parejas de primers específicos para la amplificación de MCP-1, TGF-β1, colágenos (I, II, III, IV, V y VI), fibronectina 1, laminina B1, pre-proendotelina-1, BMP7, KCP, RNA-pol2a y GAPDH. Las condiciones de las PCRs se exponen en la Tabla 3. El número de ciclos de PCR requeridos para alcanzar la fase logarítmica del proceso de amplificación o crossing point se determinó automáticamente con el software del LightCycler mediante el cálculo del Máximo de la Segunda Derivada. Para la construcción de las curvas estándar se utilizaron diluciones seriadas de una mezcla de cDNA de los animales del grupo Sham. Cada muestra se analizó en tres experimentos de PCR independientes. Como medida de la variabilidad en la reacción de PCR se calculó el coeficiente de variación (CV) de las tres determinaciones de cada muestra y se obtuvo la media de los CV para el conjunto de las muestras analizadas (Tabla 3). Los valores de expresión génica fueron normalizados por los niveles de expresión de GAPDH, que fue utilizado como gen control o housekeeping gene. Alternativamente, se realizaron normalizaciones de la expresión génica haciendo uso de RNA-pol2a como gen control, obteniendo resultados muy similares a los obtenidos con GAPDH. La especificidad de los productos se verificó mediante el análisis de las curvas de fusión inmediatamente después de la finalización de la reacción de PCR y mediante electroforesis en geles de agarosa. Se 47  Materiales y Métodos  confirmó la secuencia de cDNA utilizando secuenciador automático ABI PRISM® 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA). 48  Materiales y Métodos  RNAm Número de acceso (GenBank) Secuencias/primers (Forward and Reverse) MgCl 2 (mM) Programa CV (%) MCP-1 M57441 GTGCTGACCCCAATAAGGAA GCTTGAGGTGGTTGTGGAAA 3.0 45 x (95ºC, 10 seg; 63ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 18.2 TGF-β1X52498 TGAGTGGCTGTCTTTTGACG TGGGACTGATCCCATTGATT 3.0 50 x (95ºC, 10 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 6 seg) 9.5 Bmp7 NM_001191856 AGGAGGGCTGGTTGGTATTT TGAAGGGTTGCTTGTTCTGG 2.25 40 x (95ºC, 5 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 14.5 Kcp XM_001064164 ACCCTGCCAACATCCTACC ACACCTCACAGTCCCATCCT 3.5 43 x (95ºC, 5 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 24.7 Colágeno I NM_053304 GTGCTCCTGGTATTGCTGGT GGGCTCCTCGTTTTCCTTC 3.0 50 x (95ºC, 5 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 17.3 Tabla 3. Secuencia de los primers y condiciones de las PCR realizadas en el Termociclador Lightcycler 49  Materiales y Métodos  RNAm Número de acceso (GenBank) Secuencias/primers (Forward and Reverse) MgCl 2 (mM) Programa CV (%) Colágeno II NM_012929 CTCACGCCTTCCCATTGTT TCAGGTCAGGTCAGCCATTC 3.5 50 x (95ºC, 5 seg; 60ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) n.d. Colágeno III NM_032085 ATCCCATTTGGAGAATGTTGTGC GGACATGATTCACAGATTCCAGG 3.0 50 x (95ºC, 5 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 19.1 Colágeno IV NM_001135009 GCCAAGTGTGCATGAGAAGA AGCGGGGTGTGTTAGTTACG 2.0 40 x (95ºC, 10 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 9 seg) 11.3 Colágeno V NM_134452 CCCAGCAGAACATCACCTACA CAATCTCCAGCACCGTCTTC 3.0 50 x (95ºC, 5 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 15.4 Colágeno VI XM_215375 AAAAGGGAAGCCGTGGAG CCATCAAATCCTGGCGAAC 3.0 50 x (95ºC, 5 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 12.9 Tabla 3 (continuación) 50  Materiales y Métodos   RNAm Número de acceso (GenBank) Secuencias/primers (Forward and Reverse) MgCl 2 (mM) Programa CV (%) Fibronectina 1 NM_019143 2.5 40 x (95ºC, 10 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 10 seg) 10.0 Laminina-B1 M15525 3.0 45 x (95ºC, 10 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 6 seg) 5.5 Endotelina-1 NM_012548 2.5 42 x (95ºC, 10 seg; 65ºC, 1 seg; 72ºC, 27 seg) 19.2 GAPDH BC059110 2.5 35 x (95ºC, 10 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 13 seg) 6.9 RNA-pol2a XM_343922 2.25 40 x (95ºC, 10 seg; 58ºC, 5 seg; 72ºC, 8 seg) 8.5 CV: Valor medio de los coeficientes de variación de los genes analizados; n.d.: no determinado. Tabla 3 (continuación) GTGGCTGCCTTCAACTTCTC AGTCCTTTAGGGCGGTCAAT CGCTTGTTCTCATGCCCTAC CACACTCCTGCTGTTCTCCA GTTGCTCCTGCTCCTCCTTG GCATGGAGAGCGCAGAGTTG TCCCTCAAGATTGTCAGCAA AGATCCACAACGGATACATT CAGGCAAGCAAATCTTCTCC ACCAGAGAGCCTGCTGATGT 51  Materiales y Métodos   ppET-1 GAPDH 5/6 Nx Sham 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Número de ciclo Fluorescencia de ppET-1 ShamPool Sham 1:1 5/6 NxPool Sham 4:1 A B                   Figura 5. Determinación de la expresión génica mediante PCR convencional y PCR en Tiempo Real. A) Productos de amplificación de pre-proET-1 y GAPDH mediante PCR convencional, que permiten estimar de forma semicuantitativa la diferencia de expresión entre ratas nefrectomizadas (5/6Nx) y no nefrectomizadas (Sham). Para que las señales de bromuro de etidio de los productos separados en geles de agarosa fueran detectables y cuantificables, las reacciones de PCR se alargaron aproximadamente hasta el final de la fase logarítmica e inicio de la fase plateau de la PCR, donde el error en la estimación de la expresión del RNAm se incrementa de forma considerable. B) Gráfico correspondiente a la evolución de una PCR en Tiempo Real para el tránscrito pre-proET-1. Se ha señalado la zona de la curva donde se encuentra el crossing point, cuyo valor se utiliza para determinar la tasa de expresión del tránscrito en las muestras indicadas. Por tanto, este método permite calcular la expresión de un RNAm concreto en la región de la reacción de la PCR donde la variabilidad es mínima. Se muestran las curvas de amplificación de pre-proET-1 en tres ratas nefrectomizadas (5/6Nx) y tres no nefrectomizadas (Sham) y dos curvas correspondientes a muestras sham de concentración relativa conocida en una proporción 4:1 (líneas discontínuas). Crossing Points ppET-1 GAPDH 5/6 Nx Sham ppET-1 GAPDH A B 5/6 Nx Sham 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Número de ciclo Fluorescencia de ppET-1 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Número de ciclo Fluorescencia de ppET-1 Crossing Points ShamPool Sham 1:1 ShamPool Sham 1:1 5/6 NxPool Sham 4:1 5/6 NxPool Sham 4:1 52  Materiales y Métodos  AP-1 fueron muy similares en los cuartiles 1, 2 y 3 y diferían claramente de los del cuartil 4, en algunos análisis los cuartiles 1, 2 y 3 se agruparon en una sola categoría. La asociación entre variables continuas se realizó mediante el cálculo del coeficiente de correlación de Pearson, salvo cuando alguna de las variables no se ajustaba a la normalidad, en cuyo caso se calculó la Rho de Spearman. Con objeto de averiguar si NF-κB y AP-1 contribuían independientemente a la varianza de la expresión del RNAm de colágeno IV, fibronectina 1, pre-proET-1 y MCP-1 se realizaron análisis de regresión lineal múltiple. El nivel de significación estadística se estableció para una P < 0,05. El análisis de los datos se llevó a cabo utilizando el Paquete Estadístico SPSS 15.0.     59   RESULTADOS   Resultados  Resulta lógico pensar que para encontrar el tratamiento más adecuado de cualquier patología, pueda ser de gran ayuda tener un conocimiento profundo de los mecanismos que la originan, de igual forma que es necesario disponer de herramientas farmacológicas apropiadas para hacerle frente. En el modelo de insuficiencia renal crónica utilizado en nuestro estudio, consideramos que aunque a los 7 días de la ablación renal aún es temprano para apreciar cambios histopatológicos en el riñón, se podrían estar desencadenando los mecanismos moleculares responsables de la génesis y progresión de la enfermedad. Debido a que la mayoría de modelos experimentales reúnen grandes analogías en etapas avanzadas de la enfermedad renal, nosotros preferimos centrarnos en fases relativamente tempranas. Por ello se seleccionaron tiempos de seguimiento a 7 y 42 días. En la figura 8 se muestra el estado de los riñones a los tiempos indicados, evaluado inicialmente en base a la deposición de proteínas de matriz extracelular. Éstas se visualizan en azul mediante la tinción Tricrómica de Masson. 7días 42días Sham Ct 5/6Nx 7días 42días Sham Ct 5/6Nx Figura 8. Determinación de deposición de matriz extracelular a los 7 y 42 días de la ablación renal. Secciones de 5µm de corteza renal de las ratas tras 7 y 42 días de realizada la nefrectomía y sus correspondientes controles fueron visualizadas mediante tinción tricrómica de Masson y evaluadas con microscopio Olympus BX50 y BX-FLA. El color azul corresponde a fibras de matriz extracelular y pone de relieve el engrosamiento de las membranas basales en los glomérulos y la expansión del espacio tubulointersticial. Aumento original entre 200x y 400x. 62  Resultados  En los apartados sucesivos, se muestran los resultados obtenidos a los 7 y 42 días de la nefrectomía, así como los correspondientes a las diferentes estrategias farmacológicas utilizadas. Los experimentos realizados estuvieron encaminados a dilucidar la relación existente entre los resultados del estudio histológico y los indicadores moleculares de daño a los respectivos tiempos de evolución en el modelo de 5/6 de nefrectomía.  1.NEFRECTOMÍA:7DÍAS 1.1. Parámetros sistémicos Se valoró si los animales nefrectomizados experimentaban cambios de presión arterial y se analizó si había indicios de daño microvascular mediante la determinación de la albuminuria. Como se muestra en la figura 9, desde los 7 días los animales nefrectomizados presentaron un incremento acusado de la PA sistólica (P < 0,0001, vs. Sham). La hipertensión se acompañó de un aumento muy marcado de excreción urinaria de albúmina (P < 0,0001, vs. Sham). 5/6 NxSham PA Sistólica (mmHg) 200 180 160 140 120 100 **** Basal 7 días 5/6 NxSham Albuminuria (mg/L) 60 50 40 30 20 10 0 -10 **** Basal 7 días Figura 9. Efecto de la ablación renal en la PA sistólica y la albuminuria a los 7 días. Las medidas de la PAS se realizaron de forma incruenta en la cola de los animales con un analizador automático de presión arterial (LE-5007 Letica Scientific Instruments). La albuminuria se determinó en muestras de orina (recogidas durante 24 horas) mediante test inmunoturbidimétrico (Roche Diagnostics). La PA sistólica y la albuminuria basales fueron medidas antes de practicar la uninefrectomía derecha. Las barras representan un intervalo de confianza del 95%. ****P < 0,0001 vs. Sham. 63  Resultados  1.2. Análisis Histológico y Morfológico La apariencia histológica de los riñones del grupo Sham-7d y del grupo Ct5/6Nx-7d fue totalmente normal sin diferencias entre ellos (figura 8). Sólo se aprecia tinción de proteínas de matriz extracelular en la adventicia de los capilares y en las delgadas láminas basales de túbulos y glomérulos. 1.3. Expresión génica Aunque a los 7 días no se apreciaron cambios morfológicos en las ratas nefrectomizadas, nos preguntamos si podrían detectarse cambios de expresión en diversos genes que codifican para proteínas de matriz, así como en aquellos capaces de regular la síntesis de estas proteínas. Estas alteraciones a nivel molecular podrían ser una manifestación temprana de los cambios morfológicos que se observan a los 42 días y de los procesos fisiopatológicos involucrados en la progresión de la enfermedad renal crónica. Como se muestra en la figura 10, el grupo de ratas al que se le realizó el procedimiento quirúrgico (Ct5/6Nx-7d) presentaron un incremento significativo de expresión del RNAm de las proteínas de matriz extracelular indicadas: colágenos tipo I, III, IV, V y VI (P < 0,05 vs. Sham), fibronectina 1 (P < 0,001 vs. Sham) y laminina B1 (P < 0,05 vs. Sham). El aumento de expresión de las proteínas de matriz extracelular, no se acompañó de una modificación de la expresión del RNAm de TGF-β1 (figura 11A). Sin embargo, BMP7 y KCP, dos proteínas que promueven acciones opuestas a TGF-β1 en células epiteliales renales, presentaron una reducción significativa de expresión en los animales con ablación renal (15%, P < 0,05 y 50%, P < 0,0001 de inhibición vs. Sham, respectivamente). Como se muestra en la figura 11B, la tasa de expresión de BMP7 guardó una estrecha correlación con la de su agonista KCP (r = 0,66; P < 0,01). 64  Resultados  0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 RNAm de Colágenos Sham 5/6 Nx Tipo I Tipo III Tipo IV Tipo V TipoVI * * * **  Sham 5/6 Nx 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 RNAm de Fibronectina 1 *** RNAm de Laminina B1 0 0,5 1,0 1,5 2,0 * Sham 5/6 Nx Figura 10. Expresión del RNAm de proteínas de matriz extracelular a los 7 días de la nefrectomía. El nivel de expresión de los genes analizados se determinó de forma semicuantitativa mediante RT-PCR en tiempo real (LightCycler Instrument) como se indica en la sección de Material y Métodos. Las muestras fueron analizadas al menos en tres experimentos de PCR independientes y el promedio se utilizó para el análisis estadístico posterior. Los valores de expresión génica fueron normalizados utilizando GAPDH como gen control. Los datos corresponden a la media ± el error típico. ***P < 0,001 vs. Sham, *P < 0,05 vs. Sham. 65  Resultados  A Sham 5/6 Nx RNAm de KCP 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 ****P < 0,0001 Sham 5/6 Nx RNAm de BMP7 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 * *P < 0,05 Sham 5/6 Nx RNAm de TGF-β1 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 Sham 5/6 Nx **** BMP7 r = 0,66 P < 0,01 0,6 0,8 1,0 1,2 5/6 Nx Sham KCP 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 B Figura 11. Expresión del RNAm de TGF-β1, BMP7 y KCP a los 7 días de la ablación renal. A) El nivel de expresión de TGF-β1, BMP7 y KCP se determinó de forma semicuantitativa mediante RT-PCR en tiempo real (LightCycler Instrument) como se indica en la sección de Material y Métodos. Las muestras fueron analizadas en tres experimentos de PCR independientes. Los valores de expresión génica fueron normalizados utilizando GAPDH como gen control. Las columnas representan la media ± el error típico. ****P < 0,0001 vs. Sham, *P < 0,05 vs. Sham B) Gráfico de correlación entre la expresión génica de BMP7 y KCP. r: coeficiente de correlación de Pearson. 66  Resultados  Por otra parte, la tasa de expresión del RNAm de la citocina quimiotáctica MCP-1, que participa en el reclutamiento de monocitos en las zonas de lesión renal, presentó un incremento de dos veces en los animales nefrectomizados respecto a los del grupo Sham-7d (figura 12). Sin embargo, esta diferencia no llegó a alcanzar significación estadística (P = 0,098).  Sham 5/6 Nx 0 RNAm de MCP-1 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0   Figura 12. Expresión del RNAm de MCP-1 en los grupos Sham-7d y Ct5/6Nx-7d a los 7 días. El nivel de expresión de MCP-1 se determinó de forma semicuantitativa mediante RT-PCR en tiempo real (LightCycler Instrument) como se indica en la sección de Material y Métodos. Las muestras fueron analizadas en tres experimentos de PCR independientes y el promedio se utilizó para el análisis estadístico posterior. Los valores de expresión génica fueron normalizados utilizando GAPDH como gen control. Los datos corresponden a la media ± el error típico. 67  Resultados  2.NEFRECTOMÍA:42DÍAS 2.1. Parámetros sistémicos Para valorar el estado de los animales tras 42 días de nefrectomía se midió la PA inmediatamente antes de la eutanasia y se determinaron los valores de albuminuria y creatinina en plasma. Como se observa en la figura 13, la PAS estaba claramente incrementada respecto al grupo Sham (Ct5/6Nx-42d: 204±4, Sham-42d: 129±3 mmHg, P < 0,0001). Estas cifras fueron incluso superiores a las observadas a los 7 días (Ct5/6Nx-7d: 179±2 mmHg; ver apartado 1.1. de esta sección). Igualmente, la albuminuria y la creatinina presentaron niveles considerablemente elevados en las ratas nefrectomizadas (figura 13). 68  Resultados  Sham 5/6 Nx 200 150 50 0 100 GIS Sham 5/6 Nx 3 2 0 1 DTI PAS (mmHg) Sham 5/6 Nx 220 200 180 140 120 160 Sham 5/6 Nx 40 30 10 0 20 Albuminuria (mg/día) Sham 5/6 Nx 1,5 0,5 1,0 Creatinina (mg/dL) **** *** **** ** ****   Figura 13. Presión arterial, albuminuria, creatinina en plasma y parámetros morfológicos en los animales operados sin tratamiento (Ct5/6Nx-42d) frente a los no operados (Sham-42d) a los 42 días. Las medidas de la PAS se realizaron de forma incruenta en la cola de los animales con un analizador automático de presión arterial (LE-5007 Letica Scientific Instruments). La albuminuria se determinó en muestras de orina (recogidas durante 24 horas) mediante test inmunoturbidimétrico (Roche Diagnostics GmbH). La creatinina sérica fue medida mediante un test enzimático colorimétrico (Boehringer-Mannheim) en auto-analizador (Hitachi 717; Boehringer-Mannheim Biochemical). Los índices de daño renal GIS y DTI se determinaron por el método de Komatsu y mediante escala semicuantitativa según Cao, Z. y col., 2002, respectivamente. Las barras representan un intervalo de confianza del 95%. ****P < 0,0001, ***P < 0,001 y **P < 0,01 vs. Sham. 69  Resultados  A continuación, analizamos si los valores de c-Fos estaban relacionados con los parámetros morfológicos de daño glomerular (GIS) y túbulointersticial (DTI). Para ello, tomando en cuenta el tamaño de nuestra muestra, categorizamos c-Fos en cuartiles. Como los valores de cFos eran muy similares en los cuartiles 1, 2 y 3 y diferían claramente de los del cuartil 4, establecimos dos categorías: cuartiles 1 a 3 y cuartil 4 (figura 17B). En los animales con niveles de c-Fos en el cuartil 4, los valores de GIS y DTI fueron de dos a tres veces superiores a las tasas de daño correspondientes a los cuartiles 1 a 3 de c-Fos (figura 17B). 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 c-Fos FosB c-Jun JunD Sham 5/6 Nx AP-1 A 0 50 100 150 GIS 0,0 1,0 2,0 3,0 DTI 1 a 3 4 Cuartiles de c-Fos 1 a 3 4 * B  Figura 17. AP-1 en modelo de 5/6 de nefrectomía. A) Valores relativos de las diferentes proteínas de la familia AP-1 (c-Fos, FosB, c-Jun y JunD) en los grupos Sham-42d y Ct5/6Nx-42d. La actividad de AP-1 fue medida usando el kit Trans-AMTM AP-1 Family (Active Motif). Con el fin de determinar la cantidad de AP-1 unido al DNA, se utilizaron anticuerpos primarios específicos para las proteínas c-Fos, FosB, c-Jun y JunD. B) Análisis de los parámetros morfológicos de daño glomerular (GIS) y tubulointersticial (DTI) en el conjunto de animales de los grupos Sham-42d y Ct5/6Nx-42d para las dos categorías de c-Fos establecidas (cuartiles 1 a 3 y cuartil 4). Los parámetros GIS y DTI se determinaron mediante método de Komatsu y mediante escala semicuantitativa según Cao, Z. y col., 2002 respectivamente, como se describe en la sección de Materiales y Métodos. *P < 0,05 vs. cuartiles 1 a 3. 76  Resultados  También analizamos si la actividad de AP-1 en el modelo de 5/6Nx estaba asociada a la expresión génica de proteínas involucradas en la progresión del daño renal como fibronectina 1, MCP-1, pre-proET-1 y colágeno IV. Para ello, realizamos un análisis de correlación tomando los datos de expresión génica obtenidos de los animales de los grupos Ct5/6Nx-42d y Sham-42d y los correspondientes valores de actividad del factor nuclear AP-1. Los resultados mostraron la existencia de correlación entre la actividad de AP-1 y la expresión de fibronectina 1, MCP-1 y colágeno IV (Tabla 6). Aunque no se encontró una correlación significativa entre la expresión de la pre-proET-1 y la actividad de AP-1, pudimos apreciar cierta tendencia a la asociación de ambas variables (P = 0,07). rP Tabla 6. Correlación entre la actividad de AP-1 y la expresión de diferentes genes involucrados en el daño renal en los animales de los grupos Sham-42d y Ct5/6Nx-42d. Correlación de Pearson Fibronectina 1 MCP-1 Pre-proET-1 Colágeno IV 0,61 0,70 0,42 0,59 <0,01 < 0,01 = 0,07 < 0,01 77  Resultados  Como ya hemos comentado, AP-1 es capaz de actuar de forma coordinada con el TGF-β para regular la expresión de diferentes genes profibróticos (Rodríguez-Pascual, F. y col., 2003; Tharaux, P. L. y col., 2000; de Borst, M. H. y col., 2007; Hocevar, B. A. y col., 1999). Igualmente, se ha hecho referencia a diferentes trabajos que ponen de manifiesto la capacidad del TGF-β1 para regular la composición y arquitectura de la matriz extracelular en glomérulo e intersticio gracias a su habilidad para modificar la expresión de proteínas de matriz como laminina, colágenos y fibronectina 1 (ver apartado 2.1 de la sección Introducción). Por ello, realizamos un análisis de correlación entre la expresión del RNAm del TGF-β1 y de los genes profibróticos que se muestran en la Tabla 7. Las muestras utilizadas correspondieron al conjunto de animales de los grupos Ct5/6Nx-42d y Sham-42d. Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto la estrecha correlación existente entre la tasa de expresión génica del TGF-β1 y la correspondiente a los genes fibronectina 1, pre-proET-1, colágeno I y colágenos III a VI (Tabla 7) en el modelo de 5/6Nx.   Correlación de Pearson Fibronectina 1 Colágeno I Pre-proET-1 Colágeno III Colágeno IV Colágeno V Colágeno VI rP 0,83 0,85 0,72 0,88 0,84 0,91 0,72 <0,0001 < 0,0001 <0,001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,001 Tabla 7. Correlación entre los niveles de expresión de TGF-βyla expresión de diferentes genes involucrados en el daño renal en los animales de los grupos Sham-42d y Ct5/6Nx-42d.  78  Resultados   3.EFECTOSDELOSTRATAMIENTOSFARMACOLÓGICOSALOS42 DÍAS 3.1. Parámetros sistémicos Las curvas de ganancia de peso fueron similares en todos los grupos experimentales. Con vistas a determinar qué efectos tuvieron los diferentes fármacos sobre la presión arterial, se hicieron determinaciones de PAS a diferentes tiempos (figuras 18 y 19). Los tratamientos con losartán, losartán + cerivastatina y carvedilol redujeron la PAS a niveles similares a los del grupo Sham-42d, siendo el grupo Losartán + Cerivastatina el que alcanzó los valores más bajos (131±1 mmHg) (figura 18). En los dos grupos que recibieron tratamiento con losartán, la PAS experimentó una reducción parcial desde el día 24 del experimento, pero no se alcanzó una normalización completa hasta el día 42 (figura 19). Sin embargo, el carvedilol alcanzó un efecto antihipertensivo máximo desde los 24 días. Aunque ni la cerivastatina ni el antagonista de los receptores ETA y ETB (Ro 48-5695) fueron capaces de normalizar las cifras de PAS, sí que detuvieron su aumento a partir del día 7 del experimento (figura 19); de hecho, la cerivastatina provocó una reducción de la PAS de 10 mmHg, que se apreció desde el día 24 y se mantuvo hasta el final del experimento. 79  Resultados      100 120 140 160 180 200 220 240 PAS (mmHg) * *† *† ‡ ‡ ‡  Figura 18. Efecto de los tratamientos con losartán, cerivastatina, losartán + cerivastatina, carvedilol y Ro 48-5695 sobre los valores de la PAS al final del estudio. Las medidas de la PAS se realizaron de forma incruenta en la cola de los animales con un analizador automático de presión arterial (LE-5007 Letica Scientific Instruments). Las barras representan intervalos de confianza de un 95%. *P < 0,0001 vs. Sham, ‡P < 0,0001, †P < 0,001 vs. Ct5/6Nx. 80  Resultados  100 120 140 160 180 200 220 b 7 24 42 Cerivastatina ** *† 100 120 140 160 180 200 220 b72442 Ro 48-5695 ** * PAS (mmHg) 100 120 140 160 180 200 220 b724 42 Carvedilol * ‡‡ 100 120 140 160 180 200 220 b72442 Losartán * ‡ *‡ 100 120 140 160 180 200 Losartán + Cerivastatina b72442 * ‡ *† PAS (mmHg) Figura 19. Evolución de la PAS en los animales tratados con losartán, cerivastatina, losartán + cerivastatina, carvedilol y Ro 48-5695 a lo largo del estudio. Las medidas de la PAS se realizaron de forma incruenta en la cola de las ratas con un analizador automático de presión arterial (LE-5007 Letica Scientific Instruments) en los momentos indicados: el día de la uninefrectomía derecha (basal:b) y los días 7 (inicio de los tratamientos), 24 y 42 tras la nefrectomía. Las barras representan intervalos de confianza de un 95%. El análisis estadístico se realizó mediante el test de la t de Student para datos apareados. *P < 0,001 vs. basal, ‡P < 0,001 vs. 7 días, †P < 0,05 vs. 7 días. 81  Resultados  A continuación se evaluó el efecto de los tratamientos farmacológicos sobre el estado de la barrera de filtrado glomerular. La albuminuria se mantuvo elevada hasta el final del estudio en las ratas nefrectomizadas que no recibieron tratamiento. Ni el carvedilol, ni la cerivastatina pudieron prevenir la excreción urinaria de albúmina (Tabla 8). Por el contrario, los animales pertenecientes al grupo Losartán + Cerivastatina experimentaron una reversión completa de la albuminuria, mientras que el grupo en tratamiento con losartán presentó valores de excreción de albúmina cercanos a los del grupo Sham. El grupo Ro 48-5695 mostró valores de albuminuria reducidos respecto al grupo Ct5/6Nx-42d, aunque continuaron siendo moderadamente elevados respecto al grupo Sham (P < 0,05). La disminución de la función renal, evaluada según los niveles de creatinina sérica, fue revertida parcialmente en los animales del grupo Losartán (50% de reversión, P < 0,01) y de forma aún más clara en los grupos tratados con cerivastatina o con losartán más cerivastatina (60% de reversión, P < 0,001). Por otra parte, el tratamiento con el antagonista de los receptores de endotelina, Ro 48-5695, fue incapaz de reducir el incremento de creatinina sérica provocado por la pérdida de masa renal (Tabla 8). Tabla 8. Albuminuria, creatinina sérica y parámetros morfológicos de todos los grupos al final del estudio. Los valores representan las medias ± SEM. aP < 0,05, bP < 0,01, cP < 0,001 y dP < 0,0001 vs. Sham-42d; vP < 0,05, xP < 0,01, yP < 0,001 y zP < 0,0001 vs. Ct5/6Nx-42d; GIS, índice de daño glomerular; DTI, índice de daño tubulointersticial; n. d., no determinado. 82  Resultados  3.2. Análisis Histológico y Morfológico Para averiguar si los distintos tratamientos tuvieron alguna influencia en la morfología del riñón remanente con 2/3 de nefrectomía, se realizaron valoraciones histológicas con ayuda de las tinciones tricrómica de Masson y del ácido peryódico de Schiff, y se determinaron las tasas de daño renal GIS y DTI. Cuando los animales fueron tratados con losartán (figuras 20g y 20h) o con la combinación de losartán más cerivastatina (figuras 20i y 20j), las alteraciones morfológicas en glomérulos y en el espacio tubulointersticial mejoraron considerablemente, si bien esta mejora fue más clara en el grupo que recibió la terapia combinada. En este sentido, la acumulación de proteínas de matriz, determinada mediante tinción con APS, estuvo parcialmente incrementada en las láminas basales de las ratas del grupo Losartán (figura 20h). También se contabilizaron algunos glomérulos retraídos en áreas focales del tejido renal de los animales de este grupo, mientras que no se observaron diferencias morfológicas entre los grupos Losartán + Cerivastatina y Sham-42d. En consonancia con estos datos, el tratamiento combinado (losartán + cerivastatina) previno el incremento de GIS que siguió a la ablación renal (P < 0,0001, Tabla 8). Aunque con menor intensidad, un efecto similar se observó tras el tratamiento con losartán usado individualmente (P < 0,001) o con carvedilol (P < 0,01). Por el contrario, la estatina usada como monoterapia no redujo significativamente el daño glomerular (Tabla 8). En comparación con las ratas nefrectomizadas sin tratamiento farmacológico, la tasa de lesiones tubulointersticiales estuvo claramente atenuada en la ratas que recibieron tratamiento con losartán, losartán + cerivastatina o carvedilol (P < 0,01 para los tres grupos vs. Ct5/6Nx-42d), mientras que el inhibidor de la HMG-CoA reductasa fue menos eficaz en este sentido (P < 0,05 vs. Ct5/6Nx-42d). Por otra parte, el antagonista de los receptores de ET (Ro 48-5695) fue incapaz de prevenir el daño tanto a nivel glomerular como tubulointersticial. 83  Resultados   ShamControl 5/6 NxControl 5/6 Nx Losartán + Cerivastatina Losartán hg fe ij ab cd  Figura 20. Efecto de los tratamientos con losartán y losartán más cerivastatina a nivel glomerular y tubulointersticial. Las alteraciones histológicas observadas en glomérulo y tubulointersticio de las ratas sometidas a 5/6 de nefrectomía experimentaron una considerable mejoría al utilizar el ARAII (losartán) en combinación con la estatina (cerivastatina). El losartán, por sí solo, también demostró tener capacidad para mejorar dichas alteraciones, si bien se detectó un incremento parcial en la deposición de proteínas de matriz extracelular no observado en el grupo que recibió la terapia combinada. Tinción tricrómica de Masson (figuras a la izquierda) y tinción de APS (figuras a la derecha). 84  Resultados  3.3. Efectos de los fármacos en la regulación de la expresión génica A continuación, con la intención de evaluar qué efectos provocaron los diferentes tratamientos en la expresión de genes de conocida implicación en el daño renal, analizamos, en primer lugar, la activación de NF-κB y AP-1 en los distintos grupos experimentales, y seguidamente determinamos la expresión génica de TGF-β1, BMP7, KCP, colágenos (I, III, IV, V y VI), fibronectina 1, laminina B1, pre-proET-1 y MCP-1. Los resultados del antagonista no selectivo de los receptores ETA y ETB de la endotelina-1 se presentan en un subapartado diferente, debido a que fue un grupo que se añadió a posteriori. 3.3.1. Actividad de NF-κB y AP-1. El grupo Losartán experimentó disminución de la actividad de NF-κB, aunque las diferencias observadas no llegaron a alcanzar significación estadística respecto al grupo Ct5/6Nx-42d. Si bien la cerivastatina por sí sola no ejerció ningún efecto en la modulación de la actividad de este factor nuclear, su administración combinada con el losartán fue capaz de reducirla de manera significativa. El grupo Carvedilol mostró una disminución parcial de la actividad de NF-κB (figura 21A). El estudio de localización de p65 mediante inmunohistoquímica en las ratas nefrectomizadas puso de manifiesto la presencia de lesiones focales en el núcleo de células mesangiales y epiteliales de la cápsula de Bowman (figura 21Ba), en células tubulares (figura 21Bb) y pertenecientes al intersticio (figura 21Bc). En consonancia con los ensayos de actividad, los animales del grupo Losartán alcanzaron una reversión parcial de la actividad de NF-κB (figura 21Be) mientras que en el grupo que recibió el tratamiento simultáneo (losartán + cerivastatina) la reversión de la actividad de NF-κB fue prácticamente total (figura 21Bf).  85  Resultados  Colágeno IV: La combinación del ARAII (losartán) con el antagonista de la HMGCoA reductasa (cerivastatina) demostró ser el tratamiento más eficaz para controlar la expresión del colágeno IV. En este sentido, el losartán, aunque también fue capaz de reducirla, no logró la eficacia alcanzada con el tratamiento combinado. Por otra parte, ni la cerivastatina por sí sola, ni el carvedilol, fueron capaces de disminuir de forma clara la expresión génica de este colágeno. Los resultados correspondientes a los grupos Losartán y Losartán + Cerivastatina fueron corroborados con el análisis inmunohistoquímico, ya que la sobreexpresión observada, especialmente en espacio intersticial y en lámina basal tubular de los animales nefrectomizados no tratados farmacológicamente (figura 27Bb) se redujo claramente con ambos tratamientos, si bien la terapia combinada fue más eficaz que la monoterapia en este sentido (figuras 27Bc y 27Bd). ab cd 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 RNAm de Colágeno IV *** *** ** †† ** ‡ # B A Figura 27. Efecto del losartán, cerivastatina y carvedilol en la expresión del RNAm de colágeno IV. A) El nivel de expresión génica del colágeno IV se determinó mediante RT-PCR en tiempo real (LightCycler Instrument) como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Cada muestra se analizó por triplicado en experimentos de PCR independientes. La normalización de la expresión se realizó utilizando GAPDH como housekeeping gene. Los datos corresponden a la media ± el error típico. Los + Ceriv: losartán + cerivastatina. ***P < 0,001 vs. Sham, **P < 0,01 vs. Sham, †† P < 0,01 vs. Ct5/6Nx, ‡P < 0,001 vs. Ct5/6Nx, #P < 0,01 vs. Losartán. B) La inmunohistoquímica se realizó tratando las muestras con anticuerpo monoclonal de ratón anticolágeno IV (C-1926), tal y como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Sham(a), Ct5/6Nx (b), Losartán (c) y Losartán + Cerivastatina (d). 92  Resultados  Colágeno V: Tanto el losartán como la cerivastatina, utilizados individualmente, fueron capaces de disminuir parcialmente la expresión del colágeno V. No obstante, el uso combinado de ambos fármacos revirtió por completo el aumento de expresión observado en los animales con ablación renal que no recibieron tratamiento (P < 0,01). Resulta destacable el hecho de que el grupo que recibió la terapia combinada (losartán más cerivastatina), presentase cifras de expresión significativamente más bajas que el grupo que sólo fue tratado con losartán (P < 0,05; figura 28). El carvedilol no ejerció efecto alguno en la expresión génica del colágeno V. 0 2,5 2,0 0,5 1,0 RNAm de Colágeno V 1,5 Sham Ct 5/6 Nx Losartán Carvedilol Cerivastatina Los + Ceriv ** ** †† # 0 2,5 2,0 0,5 1,0 RNAm de Colágeno V 1,5 Sham Ct 5/6 Nx Losartán Carvedilol Cerivastatina Los + Ceriv 0 2,5 2,0 0,5 1,0 RNAm de Colágeno V 1,5 Sham Ct 5/6 Nx Losartán Carvedilol Cerivastatina Los + Ceriv Sham Ct 5/6 Nx Losartán Carvedilol Cerivastatina Los + Ceriv ** ** †† # Figura 28. Efecto del losartán, cerivastatina y carvedilol en la expresión del RNAm de colágeno V. La expresión de RNAm se determinó mediante PCR en tiempo real (LightCycler Instrument) como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Cada muestra se analizó en tres experimentos de PCR independientes. Los datos de expresión obtenidos se normalizaron utilizando GAPDH como gen control. El histograma corresponde a la media ± el error típico. Los+Ceriv: losartán + cerivastatina. **P < 0,01 vs. Sham, †† P < 0,01 vs. Ct5/6Nx, #P < 0,01 vs. Losartán. 93  Resultados  Colágeno VI: El tratamiento combinado (losartán más cerivastatina) fue capaz de revertir casi por completo el aumento de expresión de colágeno VI experimentado por los animales nefrectomizados que no recibieron tratamiento farmacológico (figura 29). Sin embargo, los grupos tratados con carvedilol, losartán o cerivastatina experimentaron disminución parcial de dicha expresión. 4,0 3,0 2,0 1,0 0 RNAm de Colágeno VI Sham Ct 5/6 Nx Losartán Carvedilol Cerivastatina Los + Ceriv 4,0 3,0 2,0 1,0 0 RNAm de Colágeno VI Sham Ct 5/6 Nx Losartán Carvedilol Cerivastatina Los + Ceriv 4,0 3,0 2,0 1,0 0 RNAm de Colágeno VI Sham Ct 5/6 Nx Losartán Carvedilol Cerivastatina Los + Ceriv Sham Ct 5/6 Nx Losartán Carvedilol Cerivastatina Los + Ceriv ** ** * † Figura 29. Efecto del losartán, cerivastatina y carvedilol en la expresión del RNAm de colágeno VI. El nivel de expresión del colágeno VI se determinó de forma semicuantitativa mediante RT-PCR en tiempo real en un equipo LightCycler como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Cada muestra fue analizada por triplicado en experimentos de PCR independientes. La normalización de la expresión se realizó utilizando GAPDH como housekeeping gene. Las barras corresponden a la media ± el error típico. Los+Ceriv: losartán + cerivastatina. **P < 0,01 vs. Sham, *P < 0,05 vs. Sham, † P < 0,05 vs. Ct5/6Nx. 94  Resultados  Fibronectina 1: Los grupos de animales tratados con carvedilol, losartán o cerivastatina experimentaron una reducción parcial de la expresión génica de fibronectina 1, mientras que el grupo Losartán + Cerivastatina experimentó una reversión prácticamente total (figura 30A). En consonancia con estos resultados, los análisis inmunohistoquímicos pusieron de manifiesto que el tratamiento consistente en la combinación del losartán más la cerivastatina fue capaz de revertir casi completamente la expresión de esta proteína (figura 30Bd), principalmente incrementada en láminas basales engrosadas de glomérulos y túbulos, así como en la matriz mesangial de los glomérulos esclerosados de los animales nefrectomizados sin tratamiento (figura 30Bb). 0 1 2 3 4 5 6 RNAm de Fibronectina 1 **** * † * A a b c B d Figura 30. Efecto del losartán, cerivastatina y carvedilol en la expresión del RNAm de fibronectina 1. A) La expresión de RNAm se determinó mediante PCR en tiempo real (LightCycler Instrument) como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Cada muestra se analizó por triplicado en experimentos de PCR independientes. Los datos de expresión obtenidos se normalizaron utilizando GAPDH como gen control. Las columnas corresponden a la media ± el error típico. Los + Ceriv: losartán + cerivastatina. ****P < 0,0001 vs. Sham, *P < 0,05 vs. Sham, †P < 0,01 vs. Ct5/6Nx. B) La inmunohistoquímica se realizó tratando las muestras con anticuerpo policlonal de conejo anti-fibronectina (F-3648) de Sigma, como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Sham(a), Ct5/6Nx (b), Losartán (c) y Losartán + Cerivastatina (d). 95  Resultados  Laminina B1: No se detectaron diferencias significativas en la expresión génica de la laminina B1 entre los grupos analizados (figura 31).    0 0,5 1,0 1,5 2,0 RNAm de Laminina B1  Figura 31. Efecto del losartán, cerivastatina y carvedilol en la expresión de RNAm de Laminina B1. El nivel de expresión génica de la laminina B1 se determinó mediante RT-PCR en tiempo real (LightCycler Instrument) como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Cada muestra se analizó en tres experimentos de PCR independientes. La normalización de la expresión se realizó utilizando GAPDH como housekeeping gene. El histograma corresponde a la media ± el error típico. Los + Ceriv: losartán + cerivastatina. 96  Resultados  Pre-proET-1: Todos los tratamientos redujeron de forma significativa la expresión génica de esta sustancia vasoactiva llegando a valores muy próximos a los del grupo Sham (figura 32A). Los resultados correspondientes a los grupos Losartán y Losartán + Cerivastatina fueron corroborados con el análisis inmunohistoquímico, ya que el aumento de expresión observado en los animales nefrectomizados que no recibieron tratamiento (figuras 32Bc y 32Bd) se redujo considerablemente en ambos grupos (figuras 32Be y 32Bf). 0 1 2 3 4 RNAm de Pre-proET-1 ‡ † * †† c db a f e BA Figura 32. Efecto del losartán, cerivastatina y carvedilol en la expresión del RNAm de pre-proET-1. A) La expresión de RNAm se determinó mediante PCR en tiempo real (LightCycler Instrument) como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Cada muestra se analizó por triplicado en experimentos de PCR independientes. Los datos de expresión obtenidos se normalizaron utilizando GAPDH como gen control. Las barras corresponden a la media ± el error típico. Los+Ceriv: losartán + cerivastatina. *P < 0,01 vs. Sham, †P < 0,01 vs. Ct5/6Nx., ‡P < 0,001 vs. Ct5/6Nx. B) La inmunohistoquímica se realizó tratando las muestras con anticuerpo policlonal de conejo anti-endotelina-1 (6901, 1:100) de Península Lab., como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Sham (a y b), Ct5/6Nx (c y d), Losartán (e) y Losartán + Cerivastatina (f). 97  Resultados  MCP-1: De todos los tratamientos utilizados sólo el correspondiente al grupo Losartán + Cerivastatina fue capaz de revertir la expresión de RNAm a niveles cercanos a los del grupo Sham-42d. El resto de grupos presentaron valores muy cercanos a los del grupo Ct5/6Nx-42d (figura 33). 0 1 2 3 4 5 6 RNAm de MCP-1 ** ** ** * †# Figura 33. Efecto del losartán, cerivastatina y carvedilol en la expresión del RNAm de MCP-1. El nivel de expresión del MCP-1 se determinó de forma semicuantitativa mediante RT-PCR en tiempo real en un equipo LightCycler como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Cada muestra se analizó en tres experimentos de PCR independientes. Los valores de expresión génica se normalizaron de forma relativa a los niveles de expresión de GAPDH. Las columnas representan la media ± el error típico. Los+Ceriv: losartán + cerivastatina. **P < 0,01 vs. Sham, *P < 0,05 vs. Sham, †P < 0,05 vs. Ct5/6Nx, #P < 0,05 vs. Losartán. 98  Resultados  3.3.3. Efectos de un antagonista no selectivo de ETA/ETB en la regulación de la expresión génica. La activación de los factores nucleares NF-κB y AP-1 observada en el grupo de animales tratados con el antagonista no selectivo de los receptores de ET-1, Ro 48-5695, fue muy similar a la que experimentó el grupo de ratas nefrectomizadas sin tratamiento (figura 34A). En este mismo sentido, el Ro 48-5695, a pesar de poder atenuar el grado de expresión génica de la pre-proET-1 en un 55% (P < 0,05), se mostró incapaz de revertir los niveles de expresión de genes como TGF-β1, colágeno-IV, fibronectina 1 y MCP-1 (figura 34B). 3.4. NF-κB y AP-1 en el perfil de expresión génica de los animales con ablación renal A continuación, para investigar la influencia de la actividad de los factores nucleares de interés en la progresión de la enfermedad renal y tomando en cuenta el tamaño muestral del que disponíamos, categorizamos los valores de actividad de NF-κB y de c-Fos (AP-1) de todos los grupos de ratas objeto de estudio en cuartiles, y los comparamos con sus respectivos niveles de expresión génica de colágeno IV, fibronectina 1, pre-proET-1 y MCP-1, y con sus correspondientes parámetros morfológicos de daño glomerular (GIS) y tubulointersticial (DTI) (figura 35). Al analizar todos los grupos experimentales en su conjunto, no se encontró correlación entre las actividades de c-Fos y de NF-κB (Tabla 9), pero se detectó asociación entre los niveles de actividad de NF-κB y la expresión del RNAm de colágeno IV, fibronectina 1, preproET-1 y MCP-1 (figura 35A y correlaciones de Pearson en Tabla 9) así como entre los niveles de actividad de NF-κB y el índice de daño glomerular y túbulointersticial (figura 35B). Igualmente, las tasas de expresión de los genes mencionados y los índices de daño glomerular y túbulointersticial se vieron incrementados de forma significativa en el cuartil 4 de c-Fos respecto a los cuartiles 1 a 3, donde se observaron valores muy similares de expresión génica y de las tasas de daño renal GIS y DTI (figuras 36A y 36B). 99  Resultados  Ct 5/6 Nx Sham Ro 48-5695 ** Fibr-1 TGF-β1 ppET-1 * † * * * * MCP-1 * * 80 60 40 20 0 120 140 160 180 Expresión de RNAm 200 B Col-IV 100 (% de 5/6 nefrectomizados) (% de 5/6 nefrectomizados) NF-κBc-Fos 100 80 60 40 20 0 120 140 160 180 * * 200 A Actividad de unión al DNA  Figura 34. Efectos del antagonista no selectivo de los receptores de ET-1 (ETA/ETB), Ro 48-5695, en ratas 5/6 nefrectomizadas. Una semana después de completar la cirugía los animales fueron seleccionados aleatoriamente para recibir tratamiento con vehículo o Ro 48-5695 (30 mg/kg/día mediante sonda oral) durante cinco semanas. A) Las actividades de NF-κB (p65) y AP-1 (c-Fos) se midieron usando los kits Trans-AMTM NFκB p65 y Trans-AMTM AP-1 Family (Active Motif, Carlsbad, CA) respectivamente, como se describe en la sección de Materiales y Métodos. B) La expresión de RNAm se determinó mediante PCR en Tiempo Real como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Cada muestra se analizó en tres experimentos de PCR independientes. Los valores de expresión génica fueron normalizados utilizando GAPDH como gen control. El histograma representa la media ± el error típico. Los datos se presentan como porcentajes respecto al grupo Ct5/6Nx-42d debido a que la ablación renal provocó cambios heterogéneos tanto de actividad de unión al DNA (A) como de expresión de RNAm (B) dependiendo del gen analizado. Col-IV: colágeno IV, Fibr-1: fibronectina 1. *P < 0,05 vs. Sham; †P < 0,05 vs. Ct5/6Nx. 100  Resultados  1234 Cuartiles de NF-κB 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 DTI 1234 Cuartiles de NF-κB 0 25 50 75 100 125 150 GIS 1234 Cuartiles de NF-κB 0 1 2 3 4 5 6 7 123 4 Cuartiles de NF-κB 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 1234 Cuartiles de NF-κB 0 1 2 3 4 5 6 AB Cuartiles de NF-κB 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 1 2 3 4 **P < 0,0001 *P < 0,01 vs. cuartil 4 ** * **P < 0,01 *P < 0,05 vs. cuartil 4 ** * *P < 0,05 vs. cuartil 4 * * *P < 0,001 vs. cuartil 4 **P < 0,0001 *P < 0,001 vs. cuartil 4 ‡ P < 0,001 † P < 0,01 vs. cuartil 3 **‡ *† ** *P < 0,01 vs. cuartil 4 RNAm de Colágeno IV RNAm de Fibronectina 1 RNAm de Pre-proET-1 RNAm de MCP-1 Figura 35. Influencia de la activación de NF-κB en la expresión de genes involucrados en la progresión de la enfermedad renal, y en el daño glomerular y tubulointersticial. A) Actividad de NF-κB (p65) categorizada en cuartiles y expresión génica de colágeno IV, fibronectina 1, pre-proET-1 y MCP-1. La actividad de NF-κB (p65) se midió usando el kit Trans-AMTM NF-κB p65 Family (Active Motif, Carlsbad, CA). La expresión de RNAm se determinó mediante PCR en tiempo real como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Cada muestra se analizó en tres experimentos de PCR independientes. Los valores de expresión génica fueron normalizados utilizando GAPDH como housekeeping gene. El histograma representa la media ± el error típico. B) Actividad de NF-κB (p65) categorizada en cuartiles y tasas de daño glomerular (GIS) y tubulointersticial (DTI). Los parámetros GIS y DTI se determinaron mediante método de Komatsu y mediante escala semicuantitativa según Cao, Z. y col., 2002 respectivamente, como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Los datos mostrados se corresponden con las medias ± error típico. 101  Discusión 1.Laablaciónrenal.7y42días. A los 7 días del experimento, se observó una clara hipertensión acompañada de albuminuria en las ratas nefrectomizadas a pesar de no encontrarse diferencias a nivel morfológico entre sus riñones y los pertenecientes a las del grupo Sham. Este hallazgo podría deberse a la puesta en marcha de mecanismos moleculares específicos en respuesta a la pérdida de masa renal, que comenzarían a ejercer efectos en el endotelio y en la barrera de filtrado glomerular. Esta explicación se confirma al observar los niveles de expresión génica de proteínas de MEC como los colágenos tipo I, III, IV, V y VI, fibronectina 1 y laminina B1, claramente incrementados. Debido a que el TGF-β es capaz de inducir la síntesis de estas proteínas en diferentes modelos animales de enfermedad renal (Border, W.A. y Noble, N.A., 1994; Bitzer, M. y col., 1998; Miyajima, A. y col., 2000; Ma, L.J. y col., 2000) incluido el 5/6Nx (Lee, L.K. y col., 1995; Abbate, M. y col., 2002a) sería lógico pensar que esta citocina pudiera estar implicada en este fenómeno; sin embargo, nosotros no encontramos aumento de expresión temprana de TGF-β1, algo que se corresponde con otros trabajos, donde los investigadores detectaron un débil incremento de expresión de este factor de crecimiento a los 7 días de la nefrectomía (Abbate, M. y col., 2002a) o no encontraron modificación de la expresión en absoluto (Lee L.K. y col., 1995). No obstante, sí que observamos caída de la expresión del RNAm de BMP7, que antagoniza la vía de señalización del TGF-β, y de KCP, que favorece la unión de BMP7 a su receptor. Los resultados de BMP7 obtenidos se corresponden con los observados en un estudio donde, entre otros análisis, los autores determinaron la expresión génica de esta BMP en el modelo de 5/6Nx a dos, diez y doce semanas de evolución del daño renal (Dube, P. H. y col., 2004). Estos autores observaron caída de la expresión a las dos semanas, restablecimiento a las diez y caída nuevamente a las doce. En nuestro caso encontramos disminución de la expresión a la semana y restablecimiento a las seis semanas. Estos resultados podrían explicar parcialmente, pero de forma plausible, el aumento de expresión génica de proteínas de MEC: la vía de señalización de BMP7 podría haberse visto afectada, y por tanto la expresión de los genes que promueven la transición mesénquima-epitelio o que obstaculizan el proceso inverso, como ocurre con Smad6, que es capaz de antagonizar la vía de señalización del TGF-β (figura 39). Los niveles reducidos de BMP7 y KCP podrían provocar disminución de la tasa de transcripción de Smad6 y a su vez del antagonismo de la vía del TGF-β. Así, sin necesidad de que tenga lugar aumento de expresión del TGF-β, su vía de señalización podría verse 110  Discusión activada. Por otra parte, llamó la atención que a los 42 días no se apreciaran diferencias en los niveles de expresión génica de BMP7 ni de KCP, y sí un aumento claro de TGF-β, acompañado de un incremento de expresión de la mayoría de las proteínas de matriz (colágenos tipo I, III, IV, V y VI, y fibronectina 1) ligeramente superior al encontrado a los 7 días. Estas observaciones sugieren que con la ayuda de KCP, la vía de BMP7 podría haberse restablecido en un intento de regenerar tejido sano y ayudar en la recuperación del riñón; sin embargo, el TGF-β, que no presentó cambios de expresión a los 7 días, habría tomado las riendas del proceso, influyendo en la hipertrofia, hiperplasia y fibrosis encontradas en el tejido remanente al final del estudio. Que los niveles de expresión génica de las diferentes proteínas de MEC a los 42 días fueran sólo ligeramente superiores a los observados a 7 días, nos hace pensar que BMP7 y KCP podrían jugar un papel importante en la génesis de la enfermedad renal en el modelo de 5/6Nx. Resultó curioso que la laminina B1 no presentara el mismo comportamiento que el resto de proteínas de matriz a los 42 días de la ablación renal, pues su expresión génica se vio disminuida a niveles similares a los obtenidos en el grupo Sham; este resultado podría estar relacionado con el restablecimiento de la vía de señalización de BMP7 sugerida anteriormente, que podría ejercer un control mayor sobre la expresión de laminina B1 que el propio TGF-β. Por otra parte, se apreció un aumento de expresión de MCP-1 desde los 7 días que llegó a ser de mayor magnitud a los 42 días, alcanzando significación estadística. Debido a que se ha demostrado que el TGF-β puede estimular la expresión de MCP-1 en células mesangiales sin que medie activación de la vía del NF-κB (Cheng, J. y col., 2005), así como que BMP7 puede inhibirla (Lee, M.J. y col., 2003), pensamos que la caída de la vía de BMP7 podría ser responsable del incremento de MCP-1 observado a los 7 días, independientemente de que se hubieran puesto en marcha otros mecanismos, como la activación de NF-κB, no analizada por nuestro grupo en esta etapa del estudio. Los resultados hasta aquí discutidos nos llevan a pensar en posibles hipótesis de trabajo futuras. Sería interesante investigar si la caída de expresión de BMP7 y KCP está involucrada en la activación de la vía del TGF-β y por tanto en la sobreexpresión de proteínas de MEC, tal y como hemos sugerido con anterioridad, o si, por el contrario, las acciones beneficiosas de activar la vía del BMP7 discurren por mecanismos no relacionados con la inhibición de los mecanismos de transducción de señales del TGF-β. Cabría preguntarse, 111  Discusión además, si NF-κB y/o c-Fos podrían jugar algún papel en dicho fenómeno a tiempos tan cortos. Sería de interés llevar a cabo estudios enfocados a esclarecer si estas proteínas, o posibles metabolitos de las mismas, podrían actuar como marcadores precoces y/o futuras dianas terapéuticas en la ERC. En este sentido, en la última década han aparecido múltiples trabajos en los que se ha utilizado BMP7 recombinante humana como tratamiento en diferentes modelos de daño renal con resultados bastante prometedores (Hruska, K.A. y col., 2000; Hruska, K.A. y col., 2005; Zeisberg, M. y col., 2003; Zeisberg, M. y col., 2008; Wang, S. y col., 2006; Sugimoto, H. y col., 2007). Kcp Figura 39. Modelo simplificado del mecanismo de inhibición de las señales de TGF-β por BMP7. Muchos de los efectos profibrogénicos del TGF-β son transducidos por smad3 tras formar un heterodímero con smad4 y traslocarse al núcleo, actuando en elementos de respuesta específicos en el promotor de diversos genes. BMP7 activa smad5 que induce transcripcionalmente la síntesis de smad6. Esta smad inhibidora interacciona con smad3, posiblemente a través de la formación de heterodímeros smad3/smad6, previniendo la translocación al núcleo de los complejos smad3/smad4 y, por tanto, las acciones sobre sus genes diana. 112  Discusión Esta tesis doctoral pone de manifiesto una notable asociación entre la actividad de NF-κB y la progresión de la enfermedad renal en el modelo experimental de 5/6 de nefrectomía. Nuestros datos muestran que la activación de este factor nuclear correlaciona estrechamente con la expresión de fibronectina 1, MCP-1 y pre-proET-1, así como con las tasas de daño glomerular y tubulointersticial GIS y DTI. Asimismo, en los animales nefrectomizados tratados con el inhibidor selectivo de NF-κB, PDTC, observamos una clarísima disminución de la expresión de fibronectina 1, MCP-1, pre-proET-1 y TGF-β1, lo que pone de relieve la implicación directa de NF-κB en la progresión de la enfermedad renal en este modelo experimental de ERC. Estos resultados están en consonancia con los obtenidos en trabajos previos (Donadelli y col., 2000; Takase, O. y col., 2003; Fujihara y col., 2007). El control de la actividad de NF-κB mediante PDTC, gliotoxina o partenolida (Rangan G.K. y col., 1999; Muller D.N. y col., 2000; López-Franco y col., 2002) o la transfección génica de IκBα truncada (Takase, O. y col., 2003) ha puesto de manifiesto la importancia de este factor nuclear en la progresión de la enfermedad renal y su posible utilización como diana terapéutica en el futuro. En estos trabajos, NF-κB se determinó por su capacidad de unión a una secuencia de DNA consenso mediante ensayos de retardo en gel, o mediante inmunohistoquímica. Sin embargo, la participación de las subunidades p50 y p65 sólo fue estimada de forma cualitativa. Por el contrario, en nuestro trabajo la actividad de NF-κB se determinó cuantificando la subunidad p65, que contiene un dominio de activación de la transcripción carente en la subnidad p50 (Guijarro, C. y Egido, J., 2001), de manera que nuestros datos reflejan el grado de activación de NF-κB y no sólo su capacidad de unión al DNA. Por otra parte, el papel central de p65 en la progresión de la enfermedad renal contrasta con el comportamiento ambiguo de la subunidad p50, aunque estudios realizados en los últimos años parecen empezar a esclarecer su papel. En este sentido, recientemente se ha demostrado que la protección que ofrece el precondicionamiento isquémico frente al daño provocado por isquemia-reperfusión, está asociado con la activación del homodímero p50/p50 (Cao, C. y col., 2010). Por otra parte, dos modelos experimentales de nefritis aguda, anti-Thy1 y nefritis inducida por LPS, presentan una activación bifásica de NF-κB, con predominio del heterodímero NF-κB p65/p50 durante la fase de inducción del daño, mientras que en la 113  Discusión fase de resolución predomina el homodímero NF-κB p50/p50 (Panzer, U. y col., 2009). La posible participación del homodímero p50/p50 en la protección del daño renal nos induce a pensar, por tanto, que la cuantificación de la subunidad p65 permite determinar de una forma más precisa el grado de participación de NF-κB en la progresión del daño renal, comparado con la estimación de NF-κB sin determinar de forma cuantitativa las subunidades involucradas. Los niveles de actividad de c-Fos determinados en las muestras de corteza renal del grupo Ct5/6Nx-42d se vieron incrementados frente al grupo Sham-42d, aunque este efecto no fue homogéneo en todos los animales del grupo. Estos niveles elevados correlacionaron con los niveles de expresión de diferentes mediadores de inflamación y fibrosis renal, por tanto, no podemos descartar que la activación de AP-1, a través del incremento de los niveles nucleares de c-Fos, también pueda estar involucrada en el desarrollo de la ERC. 2.Efectosdelostratamientosfarmacológicosalos42díasde laablaciónrenal. La terapia combinada de losartán y cerivastatina demostró ser la más eficaz para disminuir la progresión de la enfermedad renal en nuestro estudio, aunque debemos mencionar que el antagonismo del SRA solamente con losartán atenuó la albuminuria, la creatinina en plasma y los índices de glomeruloesclerosis y daño tubulointersticial, demostrando tener una capacidad renoprotectora importante. Debido a que el carvedilol dio lugar a la normalización de la PAS más rápidamente que el losartán, y que los efectos beneficiosos en el daño glomerular y en la albuminuria de este último superaron al primero, nos inclinamos a pensar que el efecto sobre la presión arterial juega un papel limitado en las acciones protectoras de los ARAII. En consonancia con esta hipótesis, Lafayette, R. A. y col. (1992) han demostrado que los efectos del bloqueo del SRA con un IECA o un ARAII en el modelo de 5/6Nx, dependen de la reducción de los niveles y de la actividad de la angiotensina II, más que de la normalización de la presión arterial sistémica provocada por estos fármacos. La cerivastatina también redujo, aunque de forma modesta, las cifras de presión arterial existentes al inicio del tratamiento, mientras que en los animales no tratados se observó un incremento adicional de PAS al final del período experimental. La modesta capacidad vasodilatadora de las estatinas, 114  Discusión ha sido reseñada en diversos trabajos (Glorioso, N., 1999; Sposito, A.C., 1999) y podría estar relacionada con su capacidad para modificar la síntesis de diversos mediadores vasoactivos como la ET-1 y el NO (Hernández-Perera, O. y col., 1998; Hernández-Perera, O. y col., 2000). La capacidad antiproteinúrica de los ARAII ya ha sido demostrada en estudios tanto in vitro como in vivo (Takao, T. y col., 2009; Tojo, A. y col., 2003), algo que se confirma en nuestro estudio, donde los dos grupos tratados con el ARAII, experimentan una clara reversión de la albuminuria. Sin embargo, resultó llamativo que el carvedilol, que revirtió el daño tubulointersticial y redujo parcialmente el daño glomerular, o la cerivastatina, que disminuyó de forma parcial el daño tubulointersticial, no tuvieran efecto alguno en la albuminuria. Una posible explicación a este fenómeno sería que estos fármacos estén actuando, al menos parcialmente, en algunos de los mecanismos proinflamatorios que se ponen en marcha como consecuencia de la exposición de la célula tubular a un exceso de albúmina, pero que no sean capaces de reparar las alteraciones sufridas por la barrera de filtración glomerular y consecuentemente, no lleguen a bloquear el incremento de albúmina en orina. Entre los mecanismos susceptibles de ser bloqueados mediante tratamiento farmacológico podría citarse la activación del sistema del complemento. De hecho, existen trabajos que demuestran que el bloqueo de ciertos componentes de este sistema es capaz de atenuar el daño renal, independientemente de que persista la proteinuria (Morita, Y. y col., 1997; Nangaku, M. y col., 2002; Nangaku, M., 2004). Por tanto, nos inclinamos a pensar que la proteinuria, a pesar de ser un excelente marcador del daño renal, no siempre lo es de la eficacia farmacológica en la progresión de la enfermedad, ya que aunque permanezca elevada durante el tratamiento, sus acciones lesivas en el riñón podrían estar atenuadas. Los animales tratados con el antagonista no selectivo de los receptores de ET-1, Ro 48-5695, presentaron tasas de expresión génica y magnitud de daño renal muy similares a los animales del grupo Ct5/6Nx-42d. La falta de efectividad de este fármaco en el modelo utilizado podría deberse al hecho de ser un antagonista no selectivo de los receptores de la ET-1, ETA y ETB, ya que se ha observado que éste último está implicado en la liberación de NO y PGI2, por lo que su bloqueo podría ir en detrimento de su capacidad como modulador de la vasoconstricción, mediada, sobretodo, por el receptor ETA (Shimizu, T. y col., 1999). En este sentido, recientemente se ha demostrado en glomérulos aislados de rata, que la 115  Discusión permeabilidad glomerular a la albúmina se reduce de manera significativa mediante el uso de un antagonista selectivo de los receptores ETA, pero no al utilizar un antagonista selectivo de los receptores ETB (Saleh, M.A. y col., 2010). Nuestros datos demuestran que el antagonista no selectivo utilizado en este estudio posee la capacidad de reducir parcialmente la proteinuria. Todos los tratamientos utilizados en el estudio fueron capaces de disminuir el incremento de ET-1 experimentado por los animales nefrectomizados, aunque debemos matizar que en el caso del Ro 48-5695 la reducción no fue completa, pues los animales tratados presentaron niveles de expresión dos veces superiores a los del grupo Sham. Este hallazgo podría estar relacionado con el hecho de que todos los tratamientos farmacológicos, a excepción del Ro 48-5695, presentaron niveles de c-Fos similares a los del grupo Sham. En consonancia con esta hipótesis, en un modelo de daño renal inducido por infusión de aldosterona, se ha demostrado que el uso de un antagonista del receptor ETA es capaz de atenuar la actividad de AP-1 (Tostes, R. C. y col., 2002). Quizás el uso de un antagonista selectivo de los receptores ETA habría generado resultados diferentes en nuestro estudio. De hecho, en la última década, la mayoría de los trabajos sugieren que el bloqueo selectivo de ETA podría ser más beneficioso que el bloqueo no selectivo (Brochu, E. y col., 1999; Cao, Z. y col., 2000; Dhaun, N. y col., 2009; Neuhofer, W. y col., 2009); sin embargo, es un tema controvertido que necesita ser esclarecido con la realización de ensayos clínicos aleatorizados. Este trabajo demuestra que el tratamiento combinado de los animales nefrectomizados con un ARAII más una estatina es capaz de promover la normalización de la actividad de NFκB, así como la expresión de MCP-1, pre-proET-1, TGF-β1, fibronectina 1, colágeno I, colágeno III, colágeno IV, colágeno V y colágeno VI. Sin embargo, los tratamientos sólo con losartán o con cerivastatina tuvieron una escasa repercusión en la expresión de la mayoría de los genes analizados. Estas diferencias tan evidentes a nivel molecular según el modelo de tratamiento elegido no lo fueron tanto en los análisis morfológicos y fisiológicos. Debido a que los genes analizados en este trabajo son factores patogénicos claves, pudiendo actuar como predictores del daño glomerular y tubulointersticial, cabría esperar que el tratamiento combinado con ambos fármacos pudiera demostrar una capacidad renoprotectora claramente superior, respecto al tratamiento con un ARAII en ausencia de una estatina, tras períodos más prolongados de evolución de la enfermedad. En este sentido, se ha documentado una remisión de la proteinuria y una reducción del daño renal mediante la administración simultánea de un IECA, un ARAII y una estatina en un modelo severo de 116  Discusión nefritis pasiva de Heymann (Zoja C. y col., 2002b). Estos efectos renoprotectores se acompañaron de una reducción importante de la expresión de TGF-β1. El bloqueo farmacológico del SRA en ausencia de la estatina, o el tratamiento con la estatina solamente, tuvieron efectos de menor magnitud tanto en la prevención de la progresión del daño renal como en la inhibición del incremento de expresión de TGF-β1. Igualmente, la combinación de un inhibidor de la ECA y una estatina ha resultado especialmente beneficiosa en la reducción de la expresión de MCP-1 en ratas con glomerulonefritis (Zoja, C. y col., 2002a). De acuerdo con estos resultados, nosotros encontramos que la expresión de MCP-1 y TGF-β1 presenta una respuesta similar al tratamiento combinado con un agente bloqueante del SRA y una estatina en un modelo experimental de ERC. Además, hemos ampliado estos hallazgos a la actividad de NF-κB p65, que como ya se ha comentado, es un factor de gran relevancia de los procesos inflamatorios que tienen lugar durante la progresión de la enfermedad renal, y a la expresión de las proteínas de matriz extracelular como fibronectina 1, colágeno I, colágeno III, colágeno IV, colágeno V y colágeno VI, cuya sobreexpresión da lugar a su acumulación a nivel glomerular e intersticial, siendo responsable del desarrollo de fibrosis renal. La utilidad del tratamiento combinado de un ARAII y una estatina debería confirmarse con la realización de ensayos clínicos suficientes que demuestren su valía. En este sentido, Ruggenenti, P. y col. han llevado a cabo un estudio en pacientes con IRC que presentaban proteinuria residual. Los individuos estaban siendo tratados simultáneamente con un ARAII y un IECA; al añadir una estatina a la terapia no se encontró disminución de los niveles de proteínas en la orina. Aunque estos resultados podrían hacernos pensar que la estatina no está aportando beneficio alguno al tratamiento con el ARAII más el IECA, sería interesante hacer un seguimiento a más largo plazo con la intención de ver cuántos de estos pacientes llegan a insuficiencia renal terminal, ya que cabría la posibilidad de que la estatina estuviera realizando acciones beneficiosas en el riñón no detectables con la medición exclusiva de la proteinuria. Fujihara, C.K. y col. (2005) han demostrado que dosis muy elevadas de losartán aportan una mayor renoprotección en ratas sometidas al modelo de 5/6 de nefrectomía, sugiriendo que las dosis utilizadas habitualmente, tanto en estudios experimentales como en la práctica clínica, no son suficientes para bloquear completamente los receptores AT-1 de la angiotensina II. Este descubrimiento induce a pensar que el losartán a las dosis utilizadas en la clínica, combinado con algún agente farmacológico capaz de actuar de manera complementaria en el SRA, podría ofrecer una mayor eficacia en el tratamiento de la ERC. 117  Discusión Los mecanismos mediante los que las estatinas pueden magnificar los efectos renoprotectores de los ARAII podrían estar relacionados con sus conocidas propiedades pleiotrópicas. El tratamiento con estatinas puede inhibir la actividad de la ECA (Luo, J.D. y col., 1999), pudiendo contribuir a la obtención de un bloqueo completo del SRA (Zoja, C. y col., 2002b). Además, la cerivastatina es capaz de reducir el aumento de angiotensina II experimentado por ratas dTGR (Dechend, R. y col., 2002). Por otra parte, la simvastatina puede prevenir los efectos adversos asociados con la infusión crónica de angiotensina II, como el desarrollo de hipertensión y la inducción de especies reactivas de oxígeno (Delbosc, S. y col., 2002). Asimismo, las estatinas atenúan la expresión de los receptores AT1 a través de la inhibición de las modificaciones postraducionales de la GTPasa Rho A, disminuyendo la función biológica de la angiotensina II (Ichiki, T. y col., 2001). En correspondencia con estos hallazgos, la vía de la Rho-quinasa ha sido relacionada con el daño renal causado por la angiotensina II (Rupérez, M. y col., 2005); además, la inhibición de dicha vía contribuye a la disminución del daño renal, debido en parte, a la atenuación de la actividad de NF-κB p65 (Meyer-Schwesinger, S. y col., 2009). Por otra parte, el tratamiento de células mesangiales con estatinas provoca reducción significativa de la actividad de NF-κB (Guijarro, C. y col., 1996). En nuestro estudio, aunque la cerivastatina per se no demostró tener capacidad para prevenir la activación de NF-κB en las ratas nefrectomizadas, en el contexto de una enfermedad renal atenuada como la observada en animales bajo tratamiento con losartán, la cerivastatina demostró tener capacidad para interferir en la actividad de NF-κB y contribuir a la normalización de la actividad de este factor nuclear. En nuestro trabajo, la actividad de NFκB p65 sólo revierte completamente con la combinación del ARAII y el inhibidor de la HMG-CoA reductasa. Sin embargo, la actividad de AP-1 también se normaliza con el ARAII o el inhibidor de la HMG-CoA reductasa usados individualmente. La mayor eficacia del tratamiento combinado de ARAII e inhibidor de la HMG-CoA reductasa en la reversión de los cambios de expresión génica, frente a las acciones más limitadas de los fármacos por separado, parecen sugerir un papel central de NF-κB, más que de AP-1, en este modelo de fallo renal progresivo. Una segunda explicación a estos hallazgos podría estar relacionada con la necesidad de inhibir simultáneamente ambos factores nucleares y, por tanto, las vías de señalización en las que intervienen para alcanzar el objetivo terapéutico deseado. En esta dirección parecen apuntar los hallazgos de un estudio (Mezzano, S.A. y col., 2001) donde sus autores han encontrado que la coactivación de NF-κB y AP-1, más que la simple activación de NF-κB, está relacionada con la presencia de lesiones 118  Discusión renales en pacientes con síndrome nefrótico. Por otro lado, la reducción selectiva y eficaz de NF-κB en diversos modelos experimentales no garantiza la reversiσn completa de la enfermedad renal progresiva (Rangan, G.K. y col., 1999; Mudge, S.J. y col., 2001), lo que sugiere la participación de forma independiente de otros mediadores moleculares en los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad. En los análisis de regresión lineal múltiple realizados, NF-κB p65 y c-Fos resultaron variables predictoras independientes de los niveles de expresión de colágeno IV, fibronectina 1, pre-proET-1 y MCP-1. Sin embargo, no se encontró asociación entre las actividades de c-Fos y NF-κB, sugiriendo que ambos factores de transcripción podrían contribuir independientemente al desarrollo de la fibrosis renal en el modelo de 5/6Nx. Nuestros datos parecen conferir un papel relevante al TGF-β1 en el desarrollo de fibrosis en el modelo de 5/6Nx. Como se ha comentado previamente, las vías de activación de TGF-β1 pueden actuar de forma coordinada con AP-1 en la regulación transcripcional de genes como colágeno I, fibronectina y pre-proET-1 (Tharaux, P.L. y col., 2000; de Borst, M.H. y col., 2007; Hocevar, B.A. y col., 1999; Rodríguez-Pascual, F. y col., 2003). Podríamos especular con la idea de que el TGF-β1, a través de la activación de las proteínas nucleares Smad, pueda contribuir a la progresión del daño de forma complementaria a la activación de NF-κB. En este sentido, el TGF-β se ha mostrado capaz de estimular la expresión de MCP-1 en células mesangiales sin que medie activación de NF-κB (Cheng, J. y col., 2005). En resumen, esta tesis doctoral pone de manifiesto que la terapia combinada de un ARAII y una estatina podría ser de gran utilidad para tratar la ERC. La capacidad de este tratamiento para reducir la actividad de factores nucleares como NF-κB y AP-1, así como la expresión de genes profibróticos involucrados en la enfermedad renal como TGF-β, colágeno I, III, IV, V y VI, fibronectina 1, laminina B1, pre-proET-1 y MCP-1, avala esta idea. La importancia de reducir NF-κB, en particular la subunidad p65, parece más que justificada debido a su estrecha asociación con los marcadores de daño glomerular y túbulo-intersticial. Por otra parte, la correlación entre los niveles nucleares de c-Fos y la expresión de diferentes genes implicados en la inflamación y fibrosis renal, sugiere que la activación de AP-1 podría contribuir al desarrollo de la ERC. Por último, nuestro trabajo propone que el eje TGFβ/BMP7 puede estar jugando un papel importante en la génesis de la ERC. La pérdida de actividad de la vía del BMP7 podría contribuir directa o indirectamente al incremento de la 119  Bibliografía  Behmoaras, J. y col. "Jund is a determinant of macrophage activation and is associated with glomerulonephritis susceptibility." Nat.Genet. 2008; 40: 553-59. Benigni, A. y col. "Blocking both type A and B endothelin receptors in the kidney attenuates renal injury and prolongs survival in rats with remnant kidney." Am J Kidney Dis. 1996; 27: 416-23. Benndorf, R.A. y col. "Angiotensin II type 2 receptor deficiency aggravates renal injury and reduces survival in chronic kidney disease in mice." 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