Relevancia de polimorfismos génicos y ls S - homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta

Composición Epigenética Obra conjunta maestro/discípulo Juan Betancor González /Jaime Alberto Serna Gómez /2015 Pintura Abstracta Acrílico S/DM 37 x 27 cm IN MEMORIAM Alberto Serna Gutiérrez MD. Diana María Serna Gómez Angélica Gómez Gómez A quienes me debo A quienes amo, cuyo amor correspondiente y tolerante, ha permitido mi realización personal y profesional A mis padres Alberto y Nelly A mis hermanos Carlos Mario, Jorge Diego, John Jairo, Elvira, Diana María y Juan Guillermo A Mariola González López A quienes con su esfuerzo diario propugnan por la ascensión y convergencia del Universo 3 TABLA DE CONTENIDO RESUMEN 9 ABSTRACT 13 INTRODUCCIÓN 17 MARCO CONCEPTUAL 23 1. Escenario actual de la aterosclerosis 23 1.1 Panorama mundial de las enfermedades cardiovasculares 1.2 Las enfermedades cardiovasculares en los EE. UU. de América 1.3 Las enfermedades cardiovasculares en Europa 1.4 Las enfermedades cardiovasculares en España y Canarias 2. Enfoque actual de la aterosclerosis 27 2.1 La aterosclerosis como prototipo de enfermedad inflamatoria 2.1.1 Placa aterosclerótica vulnerable e inflamación 2.2 Hipótesis oxidativa de la aterosclerosis 2.2.1 Estrés oxidativo y enfermedad cardiovascular 2.2.2 Superóxidos y función endotelial 2.2.3 Estrés oxidativo y homocisteína 3. Biología celular y molecular de las lesiones ateroscleróticas 41 3.1 Endotelio y función endotelial 3.2 Disfunción endotelial y aterosclerosis 3.3 Citocinas y moléculas de adhesión 3.4 Monocitos (macrófagos) y aterosclerosis 3.5 Transmigración endotelial, monocitos y el factor de transcripción NFkB 3.6 Células espumosas, captación de las LDLm y el proceso aterogénico 3.7 Las células musculares lisas y la matriz extracelular de los vasos sanguíneos 4. Biología molecular de las HDL 53 4.1 Transporte inverso del colesterol 4.2 Funciones de las HDL independientes del transporte inverso del colesterol 4.3 Enzimas antioxidantes vinculadas a las HDL 5. Óxido nítrico y aterosclerosis 59 5.1 El óxido nítrico como mensajero intercelular 5.2 Óxido nítrico y función endotelial 5.3 Sintasas del óxido nítrico 5.4 Gen eNOS, óxido nítrico y enfermedades cardiovasculares 5.4.1 Ratones transgénicos knockout eNOS -/- 6. Factores de riesgo cardiovascular 65 7. Prevención y estimación del riesgo cardiovascular 68 8. Factores de riesgo epigenéticos 70 9. Homocisteína como factor de riesgo en la aterogénesis 75 9.1 Bioquímica de la homocisteína y de las reacciones de transmetilación celular 9.1.1 S-adenosil-homocisteína 9.2 Factores que determinan la concentración de homocisteína 9.2.1 Determinantes genéticos Tabla de contenido 4 9.2.1.1 Polimorfismo C677T MTHFR 9.2.2 Factores Demográficos 9.2.2.1 Género 9.2.2.2 Envejecimiento 9.2.3 Factores nutricionales 9.2.4 Factores ambientales 9.2.5 Enfermedades asociadas a hiperhomocisteinemia 9.2.6 Medicamentos asociados a hiperhomocisteinemia 9.2.7 Otros factores relacionados con hiperhomocisteinemia 9.3 Valores de referencia de la homocisteína 9.4 Homocisteína y estrés oxidativo 9.4.1 Especies reactivas de oxígeno y especies reactivas de nitrógeno 9.4.2 Homocisteína y señalización redox 9.5 Homocisteína, eNOS, ADMA, DDAH y función endotelial 9.6 Homocisteína y trombosis 9.7 Homocisteína, folatos y función vascular 9.8 Homocisteína, folatos y evolución clínica 10. Enfermedad vascular mediada por la homocisteína tiolactona 106 10.1 Homocisteinilización de las proteínas 10.2 Metabolismo de la homocisteína a través de la homocisteína tiolactona 10.3 N-homocisteinilización de las proteínas 11. Paraoxonasas y aterosclerosis 115 11.1 Paraoxonasa 1 11.1.1 Gen PON1 11.1.2 Polimorfismos de la región codificante del gen PON1 11.1.3 Polimorfismos de la región del promotor del gen PON1 11.1.4 Polimorfismos de la región codificante del gen PON1 y enfermedad coronaria 11.1.5 Actividad de la enzima PON1 11.1.6 Determinantes de la expresión del gen PON1 11.2 Paraoxonasa 2 11.2.1 Gen PON2 11.2.2 Polimorfismos del gen PON2 11.2.3 Actividad de la enzima PON2 11.2.4 Polimorfismos del gen PON2 y enfermedad coronaria 11.3 Paraoxonasa 3 11.3.1 Gen PON3 11.3.2 Actividad de la enzima PON3 11.4 Paraoxonasas, género y enfermedad coronaria 11.5 Paraoxonasas y su actividad durante el proceso de envejecimiento 12. Dimetilarginina asimétrica como factor de riesgo cardiovascular 130 12.1 ADMA, DDAH y enfermedad cardiovascular 12.2 Gen DDAH 12.3 Tejidos de expresión y actividad de las DDAH 12.4 Expresión y actividad de las DDAH en los vasos sanguíneos 12.5 Expresión del gen DDAH 12.6 ADMA, NOS y DDAH 13. Epigenética 139 13.1 Métodos de cribado (screening) epigenéticos Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 5 13.2 Epigenética y medio ambiente 13.3 El Paradigma DOHaD 13.4 Mecanismos epigenéticos 13.5 Metilación del DNA 13.5.1 Metiltranferasas del DNA 13.5.2 Desmetilación del DNA 13.6 Modificación de histonas 13.6.1 Cromatina, histonas y organización del núcleo celular 13.6.2 Modificación postrasduccional de histonas 13.6.3 Metiltransferasas de histonas 13.6.4 Desmetilación de histonas 13.7 RNAs no codificantes 13.8 Epigenética y enfermedades complejas 13.8.1 Alteraciones de la impronta genómica y enfermedades complejas 14. Epigénesis, homocisteína y aterosclerosis 167 14.1 S-adenosil-homocisteína, metilación y aterogénesis 14.2 Metilación, células musculares lisas de los vasos sanguíneos y aterosclerosis 14.2.1 Hipometilación del DNA 14.2.2 Hipermetilación del DNA 14.3 S-adenosil-homocisteína, metilación, homocisteína y aterosclerosis 14.4 Epigénesis, gen eNOS y homocisteína 14.5 Epigénesis, eNOS, homocisteína y gen DDAH2 15. Arteria mamaria interna y aterosclerosis 176 15.1 Conceptos anatómicos y fisiopatológicos 16. Cirugía de revascularización coronaria 179 16.1 Breve reseña histórica 16.2 Conceptos generales 16.3 Técnica quirúrgica 16.4 Indicaciones generales JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 189 METODOLOGÍA 195 1. Tipo de estudio 195 2. Técnica operatoria y toma de muestras 195 2.1 Técnica operatoria 2.2 Técnica quirúrgica 3. Tamaño muestral 200 4. Extracción del DNA 202 5. Determinación de la variante C677T [rs1801133, g.14783C>T, pAla222Val] del gen MTHFR 203 6. Determinación de los genotipos Gln192Arg [rs662, g21439A>G, pGln192Arg] y Met55Leu [rs85 del gen PON1] 205 7. Determinación del polimorfismo Ser311Cys del gen PON2 205 8. Determinación del grado de metilación en el promotor del gen DDAH2 206 9. Extracción del RNA 208 10. Transcripción Inversa de RNA 210 11. Expresión de los genes eNOs, iNOs y DDAH2 en los homogeneizados vasculares 210 12. Protocolo HPLC 211 13. Determinación protéica por el Método de Lowry 214 Tabla de contenido 6 14. Análisis estadístico 215 RESULTADOS 221 1. Características principales de la población estudiada 221 2. Homocisteína plasmática total, homocisteína (S/N) unida a proteínas y su relación con los diferentes genotipos 222 3. Diferencias en la expresión génica entre los diferentes territorios arteriales 232 4. Concentración de homocisteína total, S-homocisteína y grado de metilación del promotor del gen DDAH2 236 5. Grado de metilación del promotor del gen DDAH2 y expresión de los genes eNOS y DDAH2 238 DISCUSIÓN 243 PERSPECTIVA “TRASLACIONAL” 251 1. Medicina e investigación “traslacional” 251 2. Investigación fundamental (básica) e investigación clínica 252 3. Investigación cardiovascular “traslacional” 253 LIMITACIONES DEL ESTUDIO 261 CONCLUSIONES 265 CONCLUSIONS 269 APORTACIONES ORIGINALES 273 FUTURAS LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN 277 ABREVIATURAS y ACRÓNIMOS 281 FIGURAS 289 TABLAS 295 PUBLICACIONES 299 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 335 RESUMEN 9 RESUMEN Solo conocemos parcialmente los mecanismos que explican la resistencia de la arteria mamaria interna (AMI) a la aterosclerosis (ATS). La homocisteína (Hcy) se encuentra en el plasma de diferentes formas: 1. Hcy reducida u oxidada. 2. Hcy-tiolactona (Hcy-T). 3. Hcy unida a proteínas (Hcy-p), como resultado de la S/N-homocisteinilización. En el presente trabajo, evaluamos la concentración de las proteínas S/N-homocisteiniladas en fragmentos de AMI obtenidos de pacientes en los que se efectuó cirugía de revascularización coronaria (CRC). Adicionalmente, investigamos si la concentración de estas proteínas se relacionó con algunas variantes genéticas comunes (polimorfismos). Analizamos si la concentración de Hcy plasmática total (tHcy), el nivel de S-homocisteína (S-Hcy) unida a proteínas (S-Hcy-p), los genotipos evaluados, o el grado de metilación promovido por la Hcy, se correlacionó con la expresión de los genes que codifican la sintasa endotelial del óxido nítrico (eNOS), la sintasa inducible del óxido nítrico (iNOS) y la dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 2 (DDAH2) en los territorios vasculares evaluados (AMI versus aorta). Hallamos escasa proporción de S-Hcy-p en los fragmentos de AMI estudiados. Observamos relación entre la S-Hcy-p y los polimorfismos C677T de la enzima metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) [rs1801133] y Metionina 55 Leucina (Met55Leu) de la enzima paraoxonasa 1 (PON1) [rs854560]. Apreciamos diferencia graduada en la concentración de S-Hcy-p y el grado de metilación del promotor del gen DDAH2 en los punches aórticos, pero no en los fragmentos de AMI. No encontramos correlación entre el grado de metilación y la expresión del gen DDAH2 en los tejidos analizados (AMI versus aorta). Los polimorfismos evaluados parecen contribuir in vivo a las propiedades de unión de la Hcy a la AMI. La contribución a la expresión del gen eNOS Resumen 10 y la metilación del promotor del gen DDAH2 inducido por la Hcy, parece ser tejidoespecífica e independiente de la vía DDAH2/ADMA/eNOS. Palabras Claves. Homocisteína. Homocisteinilización. Polimorfismo. Expresión génica. Metilación. ABSTRACT 13 ABSTRACT The striking resistance of internal mammary artery (IMA) toward atherosclerosis is modulated by hitherto unknown mechanisms. In plasma, homocysteine (Hcy) occurs in reduced, oxidized, homocysteine thiolactone and a component of proteins as a result of N/S-homocysteinylation. We evaluated N/S-homocysteinylated protein levels in IMA fragments of patients undergoing coronary artery bypass grafting (CABG) and whether they were affected by genetic common variants (polymorphisms). We tested whether total Hcy (tHcy), Hcy-S incorporated proteins (Hcy-S-p) levels, genotypes or Hcy-induced methylation modifications, were related to differences in endothelial nitric oxide synthase (eNOS), inducible endothelial nitric oxide synthase (iNOS) and dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 (DDAH2) gene expression between territories (IMA versus aorta). A small percentage of Hcy-S-proteins were found in IMA fragments. The methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T [rs1801133] and paraoxonase 1 (PON1) Leu55Met (rs854560) polymorphisms were associated with Hcy-S-proteins. We observed a gradual difference according to Hcy-S-proteins levels in the methylation degree of the DDAH2 gene promoter in aortic, but not in IMA fragments. No correlation between the degree of methylation and the DDAH2 gene expression levels was found in both types of analyzed fragments. Analyzed polymorphisms seem to contribute to the in vivo Hcy binding properties to IMA. The contribution of the Hcy-derived methylation modifications to DDAH2 and eNOS gene expression seems to be tissue-specific and independent of the DDAH2/ADMA/eNOS pathway. Keywords. Homocysteine. Homocysteinylation. Gene polymorphisms. Gene expression. Methylation. Abstract 14 23 MARCO CONCEPTUAL “Logic is not Truth”. “One cannot rely on logic; one must perform experiments to discover the truth”. Seymour Glagov (1925-2008). 1. Escenario actual de la aterosclerosis Han trascurrido ya seis décadas desde que se inició el Framingham Heart Study (FHS)26. No obstante, las ECV continúan liderando la mortalidad en ambos géneros, siendo la EC y el accidente cerebrovascular (ACV), la primera y segunda causa de muerte, respectivamente27,28 (Figura 1). Figura 1. Escenario aterosclerótico. Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la causa numero uno de la mortalidad global del planeta. Mueren más personas anualmente en el mundo por ECV que por cualquier otra causa4. Imagen de conjunto (margen superior) tomada de: Closing the gap in a generation: health equity through action on the social determinants of health. Final Report of the Commission on Social Determinants of Health. Geneva, World Health Organization (WHO). CSDH 2008. http://whqlibdoc.who.int/publications/2008/9789241563703_eng.pdf. 1.1 Panorama mundial de las enfermedades cardiovasculares Las enfermedades del sistema circulatorio constituyen un problema de salud de primer orden, ya que a su radical importancia en los países desarrollados, se adiciona su creciente relevancia en los países en vías de desarrollo. Gran número de individuos con Marco conceptual 24 alto riesgo de presentar eventos cardiovasculares residen en países de nivel económico medio o bajo, en los que ~80% de los fallecimientos se generan como consecuencia de las ECV27. Las prácticas insalubres propias de los países industrializados se vienen arraigando de forma creciente en los países en vías de desarrollo. Cinco de las diez principales amenazas mundiales para la salud están relacionadas con las ECV29,30 (Figura 2). Aproximadamente 9.4 millones de muertes cada año (16.5% de los fallecimientos) son atribuibles a la hipertensión arterial (HTA), 51% de las cuales son consecuencia del ACV y el 45% de la EC4. Pese a ello, los FR clásicos implicados en la génesis de las ECV, no predicen con acierto los eventos cardiovasculares31. Figura 2. Morbilidad y mortalidad atribuible a las enfermedades cardiovasculares. ECV (enfermedades cardiovasculares); HTA (hipertensión arterial); DLP (dislipemia). Adaptada de: Plos Medicine. PLoS Med. 2005;2(5):e14830. Se estima que menos de la mitad de las personas que presentan algún FR para el desarrollo de las enfermedades cardiovasculares (FRECV) conoce su diagnóstico, que menos de la mitad de estos individuos recibe tratamiento específico y que a su vez, menos de la mitad de los pacientes logran los objetivos terapéuticos recomendados en las guías de la práctica clínica29. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 25 El coste social, económico y humano de las ECV continúa ascendiendo de forma exponencial. Según los estimativos, 17.3 millones de personas fallecieron como consecuencia de las ECV en 2008, representando el 30% de todas las muertes. De estos decesos, 7.3 millones fueron debidos a EC y 6.2 millones al ACV. De acuerdo con las previsiones, el número de personas que fallece por ECV (principalmente por EC y ACV) se incrementará hasta alcanzar los 23.3 millones de muertes en 20304. Se prevé que las ECV serán en el año 2020 la causa más importante de muerte y de años de vida ajustados a la discapacidad27, al mismo tiempo que continuarán liderando la mortalidad global del planeta4,32. En el año 2008, la WHO (World Health Organization), enfatizó que de no adoptar medidas oportunas, a partir del año 2015 cerca de 28 millones de personas morirían cada año en el mundo como consecuencia de las ECV4. Se afirmó en la Declaración de Victoria33: “Muchas enfermedades cardiovasculares pueden prevenirse. Poseemos los conocimientos científicos necesarios para crear un mundo prácticamente libre de enfermedad coronaria y de accidentes cerebrovasculares”. Los principios enunciados en la “Declaración de Luxemburgo”34, en el EHHC35 (European Heart Health Charter) y en la AHA36,37 (American Heart Association) encaminados hacia la modificación del estilo de vida para alcanzar la salud cardiovascular han sido contundentes. Es asombroso que con el conocimiento adquirido, persista tan inadmisible prevalencia de hábitos malsanos, HTA, obesidad y dislipemia (DLP), insuficiente e inadecuadamente controlada en todo el mundo4,32. 1.2 Las enfermedades cardiovasculares en los EE. UU. de América El reporte estadístico del año 2013 de la AHA38, reveló que aunque la tasa de mortalidad por ECV declinó entre 1999 y 2009, las ECV continúan siendo la mayor causa de mortalidad (en ambos géneros), siendo responsables de una de cada tres muertes en los EE.UU. de América. Según este reporte, en 2009 más de 2150 americanos fallecieron diariamente como consecuencia de las ECV (en promedio una muerte cada 40 segundos). Marco conceptual 26 La EC causó una de cada 6 muertes. Cada 34 segundos un americano presentó un evento coronario, y cada minuto un americano murió como consecuencia de dicho episodio. 1.3 Las enfermedades cardiovasculares en Europa Las ECV siguen liderando la mortalidad en Europa y en la Unión Europea (UE) en ambos géneros, ocasionando más de 4 millones de muertes cada año en Europa (1.9 millones en la UE), coexistiendo asimismo amplia diferencia en las tasas de mortalidad entre los diferentes países del continente europeo. Las ECV causan el 47% de todas las muertes en Europa (40% en la UE). La EC y el ACV constituyen la primera y segunda causa de mortalidad respectivamente, tanto en Europa como en la UE28. 1.4 Las enfermedades cardiovasculares en España y Canarias En el contexto mundial, España no está al margen de la alarmante situación de salud que entrañan las ECV. Con todo ello, España presenta entre la mitad y la cuarta parte de la incidencia de ECV que en los países del Norte, Este y Oeste de Europa, EE.UU y otras naciones anglosajonas, aunque la prevalencia de FRECV en la población española es semejante a la de estos países (paradoja del sur de Europa)28,39. No obstante, se prevé que España tendrá proporcionalmente la población de mayor edad del mundo en pocas décadas (Figura 3), con lo que se espera que incremente la morbimortalidad por enfermedades crónicas, entre las que se cuentan las ECV, verbigracia la EC40. En España desde el año 1996, la EC ha ocasionado el mayor número de muertes por ECV, con predominio de los hombres. Esta hegemonía de la EC sobre el ACV se ha atribuido al descenso relativo de la mortalidad cerebrovascular respecto a la mortalidad coronaria, invirtiéndose así el llamado “patrón mediterráneo de mortalidad cardiovascular”, en el que predominaba el AVC. En las mujeres por el contrario, continúa prevaleciendo el ACV sobre la EC39. En la Comunidad Autónoma de Canarias, las ECV siguen cobrando el mayor número de víctimas mortales, duplicando las tasas de mortalidad por ECV de otras regiones del territorio español como Gerona. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 27 Figura 3. Proyecciones de población 2012-2052 para España. La simulación de la proyección a largo plazo de la población española elaborada por el Instituto Nacional de Estadistica (INE)(1), muestra el proceso de envejecimiento al que se enfrenta nuestra estructura demográfica, el cual se ve acelerado por el descenso de la natalidad y los saldos migratorios negativos. Los mayores crecimientos de población se concentrarían en las edades avanzadas. Concretamente, el grupo de edad de mayores de 64 años pasaría a constituir el 37% de la población total de España en 2052. Una estructura demográfica cada vez más envejecida produciría un continuo crecimiento del número anual de defunciones. Así, en los próximos 40 años morirían en España unos 17,9 millones de personas, un 34% más que en los últimos 40 años. Las previsiones ofrecen una perspectiva de crecimiento natural negativo desde 2018. Si se mantuvieran las actuales tendencias(2), la estructura de la población de España nos llevaría a la pérdida progresiva de habitantes en las próximas décadas. Gráficas adaptadas de: INEbase-www.ine.es. Nota de Prensa INE de 19 de noviembre de 2012 (actualizada el 04/12/ 2012). www.ine.es/prensa/prensa.htm. La proyección de la población de España a largo plazo puede consultarse en: http://www.ine.es. (1)Metodología general del cálculo basada en el método clásico de componentes aplicado de acuerdo a un modelo de proyección multirregional. (2)Las proyecciones de población elaboradas por el INE constituyen una simulación estadística del tamaño y estructura demográfica de la población que residiría en España en los próximos años, en caso de mantenerse las tendencias demográficas actuales. Estos datos reflejan el efecto que sobre la población futura tendría nuestra presente estructura poblacional y los comportamientos demográficos observados a la fecha. Las enfermedades del sistema circulatorio continúan siendo en España la principal causa de muerte, si bien han mantenido una tendencia discretamente descendente en los dos últimos años (–0,7%)41. Adicionalmente, algunos FRECV como el sobrepeso, la DLP, la diabetes mellitus (DM) y el tabaquismo, siguen entorpeciendo el descenso de la mortalidad por EC en España42. 2. Enfoque actual de la aterosclerosis Donald D. Heistad al iniciar su ponencia: Oxidative Stress and Vascular Disease durante la 2005 Duff Memorial Lecture43, describió los cambios estructurales y funcionales de la ATS caracterizados por depósito de lípidos, fibrosis y calcificación de las lesiones ateroscleróticas44, afirmando: “Based on the histological appearance of arteries, logic would dictate that these vascular changes are irreversible. But Mark Armstrong my mentor in studies of atherosclerosis, with Emory Warner and William Connor, provided landmark morphometric evidence in primates that atherosclerosis can regress”45. Desde entonces, el estudio clásico de Armstrong y cols.45, ha inspirado a multitud de generaciones de investigadores a profundizar en el conocimiento de la ATS en los humanos43. Marco conceptual 28 Debido a que durante décadas se atribuyó al incremento del colesterol plasmático, en particular al colesterol trasportado en las lipoproteínas de baja densidad (LDL) como el principal FR en la ATS46, la noción del proceso aterogénico se consolidó a través de los años, como el depósito pasivo de lípidos en el interior de la pared arterial. Sin embargo, la enfermedad aterosclerótica es más que esto. El concepto actual involucra a la ATS como una enfermedad sistémica crónica que acontece como respuesta a la disfunción del endotelio vascular y está caracterizada por presentar un prototipo inflamatorio y fibroproliferativo, el cual presupone un proceso dinámico en el que están implicados la formación de la placa ateromatosa, su ruptura y la trombosis del vaso sanguíneo. En la ATS participan diversos fenómenos como la activación celular (infiltración de macrófagos) y la liberación de citocinas proinflamatorias44 (Figura 4). Figura 4. Aterosclerosis coronaria. La aterosclerosis (ATS) es una enfermedad progresiva de las arterias que ocasiona reducción del flujo sanguíneo tisular. La restricción del flujo sanguíneo al músculo cardiaco es responsable del síndrome coronario agudo. Con frecuencia la ATS debuta por sus complicaciones. CD (arteria coronaria derecha); ADA (arteria descendente anterior). Imagen adaptada de: http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ A.D.A.M. Quality. La ATS es un proceso complejo (poligénico y multifactorial) parcialmente hereditario, en el que la manifestación individual de la enfermedad depende de la interacción entre los genes y su entorno. Este proceso altera el endotelio vascular y origina un fenotipo específico, el cual representa el punto de partida de las ECV ateroscleróticas. Los rasgos Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 29 complejos se heredan de forma no convencional, entendiendo por ello, un fenómeno que no se rige ad integrum por las leyes de la herencia mendeliana47,48. Entendemos por enfermedades complejas, aquellas nosologías que no son el resultado obvio de las mutaciones o de la influencia ambiental única49. Desconocemos en su totalidad los genes involucrados en dicho proceso7,8. Gran número de factores del crecimiento, citocinas y moléculas vasoactivas participan en la ATS44. Nuestra habilidad para controlar la expresión de los genes que codifican estas moléculas y los blancos específicos de algunos tipos celulares permitirán mejorar la comprensión del proceso aterosclerótico. La ATS y la aterotrombosis (ATB) son patologías estrechamente relacionadas, coexistiendo ambas enfermedades en más de un lecho vascular de un mismo paciente50 (Figura 5). Figura 5. Manifestaciones de la aterotrombosis. La aterotrombosis habitualmente coexiste en varios territorios arteriales. EVC (enfermedad vascular cerebral/enfermedad cerebrovascular); EC (enfermedad coronaria); EAP (enfermedad arterial periférica/enfermedad vascular periférica). Izquierda. Imagen tomada de http: //www.texasheartinstitute.org/HIC/Anatomy/. Derecha. Adaptada de: Coccheri S. Eur Heart J. 1998;19(Suppl):126850. El incremento de la actividad procoagulante y/o la disminución de la capacidad fibrinolítica, contribuyen a la progresión de la placa ateromatosa, favoreciendo la trombogénesis y la oclusión de las arterias coronarias47. El avance en el conocimiento de la ATB no ha conseguido disminuir la prevalencia de las ECV en la población general. Las estatinas se han perfilado como terapia eficaz en la Marco conceptual 30 prevención primaria y secundaria de las ECV51. Pese al tratamiento con estatinas y a la reducción farmacológica de las LDL, gran proporción de individuos continúa presentando eventos cardiovasculares51,52. Cerca de la mitad de los pacientes que mueren por ECV no presentan alteraciones significativas en el metabolismo lipídico, ni FR independientes que expliquen la génesis de las ECV y sus temidas complicaciones53. En este contexto, el concepto de que la variabilidad genética desempeñe un papel determinante del riesgo coronario resulta bastante atractivo. Es por esta razón que se están buscando nexos con las ECV en el ámbito de la genética molecular. Las nuevas técnicas de biología molecular aplicadas al diagnóstico genético, posibilitan el estudio de los mecanismos que subyacen a la predisposición individual y familiar a padecer determinadas enfermedades. Se han descrito numerosos alelos de riesgo en la génesis de las ECV y la lista de genes candidatos no cesa de ampliarse. No obstante, nuestro conocimiento presenta importantes limitaciones. En la mayoría de los casos, su relación con el riesgo coronario es apenas modesto. A pesar de las limitaciones existentes, está tomando forma la hipótesis de que el riesgo de padecer EC es función del número de polimorfismos desfavorables que porta cada individuo48. Por consiguiente, los polimorfismos adquieren especial relevancia en el contexto de las interacciones con otros factores (genéticos y/o ambientales) y con el conjunto de genes del organismo47. La última década ha estado marcada por creciente interés hacia la caracterización de las bases genéticas de la trombosis arterial. Se han identificado numerosas variantes genéticas relacionadas con la tríada patogénica de Virchow (1821-1902) descrita hace más de 150 años. No sin razón se afirma que: “el hombre vive con aterosclerosis, pero muere de trombosis”52. La genética se ha revelado como una disciplina imprescindible en el progreso de las ciencias médicas54. El conocimiento etiológico y fisiopatológico de la enfermedad aterotrombótica se acrecienta día a día, si bien, desconocemos los aspectos fundamentales que nos permiten prevenir su aparición o curarla48. La biomedicina ha Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 31 experimentado en las últimas cinco décadas avances sorprendentes. La investigación no cesa en la búsqueda de nuevos logros en el ámbito de la genética y de la biología molecular. En el contexto actual, estas disciplinas constituyen una necesidad apremiante para los profesionales implicados en las ciencias de la salud, ya que este campo de acción cobra cada vez más relevancia en la práctica clínica diaria. En la medicina cardiovascular moderna, esta circunstancia ha sido particularmente trascendente. La incorporación a las opciones técnicas actuales de los novedosos conocimientos en biología molecular, inmunología, genómica (estudio de la organización molecular del DNA y su cartografía física), proteómica (estudio del proteoma o conjunto de proteínas presentes en las células) y metabolómica (estudio del estado metabólico de los fluidos y tejidos), ha modificado sustancialmente nuestro enfoque biológico de la ATS y ha estimulado la investigación de nuevos mecanismos, biomarcadores y blancos terapéuticos55. El conjunto de metabolitos del organismo suministra información del fenotipo, ya que los metabolitos constituyen el producto final de la transcripción génica y por ende, reflejan de forma más exacta la actividad celular o el fenotipo funcional. Luego, el metaboloma representa el escenario idóneo para el estudio de los procesos celulares en condiciones tanto fisiológicas como patológicas56. Hoy en día no es suficiente con la aportación de técnicas terapéuticas por muy sofisticadas que estas sean. Urge una novedosa percepción de la ATS, de los FR implicados en su génesis, así como de aquellas circunstancias que eviten la progresión de la enfermedad aterosclerótica y sus infortunadas consecuencias. El secuenciamiento del genoma humano supuso un gran avance en el conocimiento del esqueleto molecular del DNA. No obstante, el genoma per se, no explica la complejidad de las funciones biológicas de los diferentes órganos y tejidos, ni la diversidad de las patologías que los afectan. Por lo tanto, se ha inferido la existencia de un nivel adicional de regulación y desregulación del genoma en caso de enfermedad. Uno de estos Marco conceptual 32 niveles adicionales de complejidad lo explica la epigenética, la disciplina que estudia las modificaciones químicas que experimenta el DNA y las proteínas que lo regulan. En consecuencia, el desentrañamiento de la función de los genes (epigenoma), marca la senda del interés primordial de la investigación contemporánea57-60. Las enfermedades complejas como la ATS y las ECV (EC), representan modelos ideales para los estudios de genómica. La aproximación genómica permite identificar infinidad de genes y vías de señalización en diferentes fases evolutivas de la enfermedad, ofreciendo una alternativa más eficiente en el conocimiento de los procesos implicados en su origen. Entender las ECV a escala genómica permite estratificar más adecuadamente los pacientes, en aras a la obtención de terapias más específicas e individualizadas. No obstante, tan importante como la información que aportan estas ciencias, es el hecho que resulte imprescindible desarrollar instrumentos destinados a analizar y a evaluar con eficiencia tan amplia información. En este ámbito, la bioinformática de alto rendimiento y la biología computacional se cristalizan como herramientas en el alcance de estos objetivos61. Con todo ello, la biología del sistema cardiovascular se halla aún en sus inicios62-65. 2.1 La aterosclerosis como prototipo de enfermedad inflamatoria La presunción de que la ATS morfológicamente constituía una enfermedad inflamatoria se derivó de los estudios en modelos experimentales. Friedman y cols.66, reportaron por primera vez el nexo existente entre inflamación y cardiopatía isquémica en 1974. Al margen de algunas consideraciones metodológicas, el mensaje transmitido por estos autores, es que la inflamación en la fisiopatología del IAM permanece vigente. Posteriormente, Bevilacqua67, demostró que las citocinas favorecían la adhesividad de los leucocitos al endotelio vascular. Este hallazgo marcó un hito en la comprensión de la inflamación en la enfermedad aterosclerótica. Estudios ulteriores sugirieron que el endotelio vascular era el órgano diana donde se generaba la respuesta inflamatoria. En los Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 39 la EC, la HTA, la insuficiencia cardiaca, el ACV, la DM y el síndrome metabólico69. El estrés oxidativo desempeña una función crucial en la disfunción del endotelio vascular inherente a estas enfermedades, ya que los superóxidos inactivan el NO˙. El endotelio disfuncionante aumenta la permeabilidad de las LDL. Las LDL ingresan al espacio subendotelial, en donde interactúan con las proteínas de la matriz extracelular (MEC), convirtiéndosen en blanco del proceso oxidativo43. Cualquier sistema enzimático en el que se generen radicales libres, puede estar involucrado en la oxidación de las LDL. El incremento del estrés oxidativo generado por la falta de acoplamiento enzimático de la eNOS, el aumento de las ROS y la fosforilación de la eNOS, explican parcialmente el fenómeno de oxidación de las LDL. El mecanismo de formación de las LDL mínimamente oxidadas (LDLmox) consta al menos de tres pasos: 1. El sembrado (seeding) de las LDL con productos del metabolismo del ácido araquidónico y los ésteres de colesterol peroxidados70. 2. El traslado de las LDL al espacio subendotelial, en donde se acumulan también las ROS. 3. La oxidación de los fosfolípidos de las LDL, cuando se alcanza cierto umbral de ROS71. No obstante, las LDLox no son la única explicación a la disfunción del endotelio. El atrapamiento de las LDLox en el interior de la pared arterial y la expresión de diversos genes proinflamatorios aumentan la respuesta inflamatoria a nivel celular. En consecuencia, los polimorfismos involucrados en el proceso oxidativo de las LDL constituyen FR primordiales en la génesis de las ECV43,72. 2.2.2 Superóxidos y función endotelial En las dos últimas décadas se ha estudiado extensamente la actividad de los superóxidos en la respuesta vasomotora mediada por el NO˙. Los superóxidos, además de otras ROS, actúan sobre el músculo liso vascular independientemente del NO˙. Los superóxidos impiden la apertura de los canales de potasio (K+) en las VSMC, predisponiendo a la vasoconstricción. En los vasos ateroscleróticos existe incremento en la concentración de superóxidos. Los superóxidos activan las metaloproteinasas de la Marco conceptual 40 MEC, encontrándose incremento del estrés oxidativo en las placas ateromatosas de los pacientes con SCA. Aunque en los vasos ateroscleróticos no se altera la expresión de la eNOS, al menos hasta que las lesiones ateroscleróticas están demasiado avanzadas. Por consiguiente, se ha cuestionado que la disminución de la biodisponibilidad de NO˙ sea el punto de partida del endotelio disfuncionante en la ATS43. Se presume que deben concurrir factores adicionales que expliquen la disfunción del endotelio vascular. Diferentes estudios avalan la relevancia de la eNOS en la ATS y en las ECV, encontrando relación entre algunas variantes polimórficas del gen de la eNOS y el riesgo de padecer EC68. El descubrimiento de que las VSMC de los vasos ateroscleróticos representaban una fuente importante de producción de superóxidos, ha sido un hallazgo tan sorpresivo como trascendental, ya que en antaño se asumía que las células inflamatorias de la pared de los vasos ateroscleróticos, eran la fuente primaria de la producción de superóxidos. En las VSMC de los vasos ateroscleróticos, la angiotensina II (ANG II) activa la fosfato nicotinamida adenina dinucleótido oxidasa (NADPH oxidasa), generando superóxidos. Otras enzimas como la xantinooxidasa, la mieloperoxidasa, la lipooxigenasa, la ciclooxigenasa, el citocromo P450, las oxidasas mitocondriales y la cadena transportadora de electrones mitocondrial, también están involucradas en este proceso. Si bien existe amplia evidencia que relaciona el estrés oxidativo y las ECV ateroscleróticas, las intervenciones que atenúan el estrés oxidativo, no se traducen en los beneficios esperados43. 2.2.3 Estrés oxidativo y homocisteína Uno de los mecanismos que explican los efectos perjudiciales de la Hcy, es su capacidad para generar ROS e incrementar el estrés oxidativo (Figura 10). Sharma y cols.73, han sugerido que la oxidación promovida por la Hcy obedece a la menor capacidad de las células para eliminar el peróxido de hidrógeno (H2O2) y otros lípidos peroxidados, como consecuencia de la alteración de las enzimas antioxidantes intracelulares. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 41 Figura 10. Homocisteína y estrés oxidativo. La hiperhomocisteinemia incrementa el estrés oxidativo por diferentes vías. NO˙ (óxido nítrico); S-nitroso-Hcy (S-nitroso-homocisteína); EC-SOD (superoxido dismutasa extracelular); H2O2 (peróxido de hidrógeno); GPx (glutatión peroxidasa); O (oxígeno); VCAM (moléculas de adhesión de las células vasculares); ICAM-1 (molécula de adhesión intercelular 1); MCP-1 (sustancia quimiotáctica plaquetaria 1); PAI-1 (inhibidor del activador del plasminógeno tisular 1); eNO (NO˙ endotelial); eNOS (sintasa endotelial del óxido nítrico); NOS (sintasas del óxido nítrico); PRMT-1 (protein arginine methyltransferase 1 o metiltransferasa de arginina 1); ADMA (dimetilarginina asimétrica); DDAH1 (dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 1). Gráfica adaptada de: Sharma P, et al. Lipids Health Dis. 2006;5(1):11973. 3. Biología celular y molecular de las lesiones ateroscleróticas 3.1 Endotelio y función endotelial El endotelio es la capa de células que reviste la superficie interna de los vasos sanguíneos de los mamíferos. Esta superficie representa en los humanos un área aproximada de 1.200 metros cuadrados. El endotelio está constituido por células endoteliales (CE) poliédricas acopladas entre sí mediante un sistema de uniones intercelulares. Las CE reposan sobre la membrana basal, la cual está conformada a su vez por las CE. La membrana basal está en contacto estrecho con la intima. La intima es una Marco conceptual 42 estructura de estirpe hematopoyético, cuya población mesenquimal indiferenciada se encuentra inmersa en la MEC. Las células de la intima, son células pluripotenciales con capacidad para diferenciarse en: CE, macrófagos, linfocitos, fibroblastos, VSMC, condrocitos y osteoblastos, entre otra variedad de células. La intima separa el endotelio de la capa media, teniendo como límite externo la lámina limitante elástica interna (LEI). El endotelio está localizado estratégicamente y capta las señales intravasculares trasmitiéndolas a la intima y a la media (Figura 11). Figura 11. Anatomía microscópica de los vasos sanguíneos. Histológicamente los vasos sanguíneos están formados por tres capas concéntricas o túnicas (intima, media y adventicia). Mediante tinción tricrómica, el colágeno adopta el color azul y el musculo liso toma el color rojo. La intima es la capa más delgada y está constituida por el endotelio y una capa fina de tejido conectivo de soporte. La media es la capa situada entre la intima y la adventicia. La media es la capa muscular y/o elástica, la cual contiene células musculares lisas (VSMC) y tejido elástico en proporción variable. La adventicia es la capa más externa y está compuesta por tejido conectivo fibroadiposo, terminales nerviosas y vasa vasorum. La imagen derecha aunque corresponde a una preparación con hematoxilina-eosina, muestra la ubicación espacial de la lámina limitante elástica interna (LEI) y de la lámina limitante elástica externa (LEE). TA (tunica adventicia). Imágenes adaptadas de: Blue histology. School of Anatomy and Human Biology, Western Australia University (WAU). http://www.lab.anhb.uwa.edu.au/mb140/ e Histology Study Guide Cardiovascular System. SIU, School of Medicine. Board of Trustees, Southern Illinois University. 2011-2012. http://www.siumed.edu/. Durante décadas se afirmó que el endotelio vascular se limitaba a desempeñar una función de barrera entre la sangre y la pared de los vasos sanguíneos. Hoy sabemos que el endotelio es un órgano dinámico que posee actividad tanto autocrina como paracrina. Las CE son células altamente especializadas con capacidad para adaptar su estado funcional a diversos estímulos: 1. Las CE detectan los cambios físicos inherentes al estrés hemodinámico y a la liberación de diversas moléculas, convirtiéndolos en respuestas Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 43 funcionales adaptativas. 2. El endotelio vascular regula la interacción entre las diferentes células que lo componen. 3. El endotelio modula el tránsito de macromoléculas (como las lipoproteínas) y el “tráfico” de las células inflamatorias al interior de los vasos sanguíneos, ejerciendo una función crucial como receptor y mensajero en la trasmisión de diferentes estímulos. 4. El endotelio controla la actividad contráctil, secretora y mitogénica de la pared vascular, mediante la producción de sustancias localmente activas. Esta particularidad le atribuye al endotelio una acción categórica en la homeostasia de los vasos sanguíneos. Con todo lo anterior, la función más conocida del endotelio es la conservación del tono vascular, el cual garantiza la perfusión tisular mediante la producción de moléculas vasodilatadoras (como el NO˙ y la prostaciclina) y de sustancias vasoconstrictoras (como la endotelina y la angiotensina II). Estas moléculas ejercen una acción antagónica, la cual depende del tipo de estímulo que recibe el endotelio. El endotelio además de su acción vasodilatadora, ejerce diferentes funciones ateroprotectoras: 1. Actividad antitrombótica. 2. Actividad fibrinolítica. 3. Actividad antiinflamatoria. 4. Actividad antiapoptótica. 5. Actividad antioxidante, imprescindible en la protección de la pared vascular contra el efecto aterogénico de las LDL y de otros agentes lesivos. Todas estas funciones están íntimamente relacionadas con la capacidad del endotelio de producir NO˙, contrarrestando los efectos de las ROS liberadas en el metabolismo tisular. 3.2 Disfunción endotelial y aterosclerosis Numerosas observaciones fisiopatológicas llevaron a plantear que el proceso aterosclerótico obedecía a la respuesta a la agresión tisular, por lo que inicialmente se postuló que la lesión del endotelio representaba el primer estadio en la génesis de la ATS. Sin embargo, este concepto ha sido modificado constantemente44. La versión más reciente de esta hipótesis hace énfasis en la disfunción del endotelio y en la alteración del equilibrio Marco conceptual 44 oxidativo, más que en el daño endotelial per se como desencadenante del proceso aterogénico74 (Figura 12). Figura 12. Histopatología coronaria y aterotrombosis. Izquierda. Corte histológico de una arteria coronaria sana. La luz de la arteria es amplia, no existe estrechamiento de su luz por placas de ateroma y la proporción de la capa muscular es normal. Centro izquierda. Aterosclerosis (ATS) coronaria oclusiva (estenosis ~60-70% de la luz del vaso). Placa de ateroma excéntrica. El depósito lipídico está separado de la luz de la arteria coronaria por el casquete de la placa formado por tejido conjuntivo y células musculares lisas. Centro derecha. Aterotrombosis coronaria severa con evidencia de trombosis previa, organización de los trombos, recanalización de los mismos y presencia de tres pequeñas luces remanentes, una de las cuales contiene un trombo reciente. Derecha. Trombosis de una arteria coronaria y oclusión de su escaso lumen residual. Diferentes estudios han relacionado los factores de riesgo cardiovasculares con la disfunción del endotelio vascular, la ATS y sus complicaciones trombóticas. La elevada trombogenicidad sanguínea existente bajo estas condiciones desencadena el síndrome coronario agudo. Imágenes adaptadas de: Blue histology. School of Anatomy and Human Biology, Western Australia University (WAU), http://www.lab.anhb.uwa.edu.au/mb140/ e Histology Study Guide Cardiovascular System. Southern Illinois University (SIU) School of Medicine. Board of Trustees, SIU. 2011-2012. http://www.siumed.edu/. El descubrimiento de que la disfunción del endotelio vascular promueve la formación de la placa ateromatosa y el desarrollo de eventos coronarios agudos, ha sido una de las aportaciones más relevantes en la comprensión de la ATS. Entendemos por disfunción endotelial el desequilibrio de la biodisponibilidad de diversas sustancias de origen endotelial que favorecen la inflamación, el espasmo vascular y el incremento de la permeabilidad vascular. Condiciones estas que favorecen el origen y la progresión de las lesiones arterioscleróticas, la agregación plaquetaria y la trombosis del vaso sanguíneo74,75. El endotelio disfuncionante favorece la proliferación celular a nivel de la pared vascular, generando disbalance entre los agentes vasoactivos y su función protrombótica y antitrombótica. Los agentes proinflamatorios estimulan el endotelio Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 45 vascular, aumentando la expresión de diversas CAMs, como la molécula de adhesión de las células vasculares 1 (VCAM-1), los leucocitos circulantes, la sustancia quimiotáctica plaquetaria 1 (MCP-1), la interleucina 1 (IL-1), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF)44,74 (Figura 13). Figura 13. Disfunción endotelial. Los primeros cambios que preceden la formación de las lesiones ateromatosas tienen lugar en el endotelio. Estos cambios incluyen: 1. Incremento de la permeabilidad vascular a las lipoproteínas y a otros componentes del plasma. 2. Aumento de las moléculas de adhesión leucocitaria. 3. Migración de los leucocitos hacia el interior de la pared vascular. Modificada de: Ross R. N Engl J Med. 1999;340(2):115-12644. Cuando se limita la respuesta inflamatoria, aumenta el espesor de la pared arterial creándose una placa fibrosa. Luego, a través de un mecanismo compensatorio (remodelación arterial), la pared de la arteria se dilata progresivamente evitando que se reduzca la luz del vaso sanguíneo. Cuando el estímulo inflamatorio persiste, se desplazan los monocitos (macrófagos) y los linfocitos, desde el torrente circulatorio hasta el lugar de la lesión. Estas células liberan enzimas hidrolíticas, citocinas, sustancias quimiotácticas y factores del crecimiento de origen endotelial, produciendo necrosis focal en el área de la lesión aterosclerótica. Los ciclos celulares y humorales repetitivos ocasionan afluencia de células mononucleares, mayor proliferación y migración de las VSMC, así como formación adicional de tejido fibroso. Como consecuencia, se reestructura la lesión ateromatosa Marco conceptual 46 generando una estructura central lipídica y de tejido necrótico que degenera en la lesión aterosclerótica avanzada (Figura 14).o Figura 14. Lesión aterosclerótica avanzada. En la medida en que la estría grasa progresa hacia las lesiones intermedia y avanzada, se forma una capa fibrosa situada entre esta lesión y la luz de la arteria. Este proceso constituye una forma de reparación (respuesta fibrosa) a la agresión vascular. La capa fibrosa está compuesta por una mezcla de leucocitos, lípidos y detritos celulares que conforman el centro necrótico de la lesión. Modificada de: Ross R. N Engl J Med. 1999;340(2):115-12644. La estría grasa (Figura 6) progresa hacia la lesión intermedia y avanzada formando una estructura fibrosa que recubre la lesión. La arteria afectada por el proceso aterosclerótico se expande como consecuencia de la migración de los leucocitos promovida por el dinamismo del proceso inflamatorio. No obstante, la pared de la arteria tiene un límite en su capacidad de ensanchamiento. Una vez rebasado ese punto crítico, se disminuye la luz del vaso sanguíneo a expensas del desplazamiento de dicha lesión hacia el lumen de la arteria, alterando la reología vascular. El colágeno producido por las VSMC en el interior de la placa fibrosa del ateroma conserva la estabilidad y firmeza de la placa fibrosa durante esta fase. La respuesta inflamatoria generada por el estímulo inflamatorio altera la regeneración de las fibras de colágeno producido por las VSMC, destruyendo el colágeno existente44. La ruptura de la estructura fibrosa de la placa de ateroma (especialmente en los lugares en donde existe mayor afluencia de macrófagos y/o en las regiones de mayor adelgazamiento de la pared vascular) favorece la formación y la Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 47 liberación de trombos. Cuando la placa ateromatosa, no se fisura, esta se calcifica progresivamente reduciendo el diámetro del vaso sanguíneo, hasta ocluirlo (Figura 15). Figura 15. Placa fibrosa inestable. La ruptura de la capa fibrosa y/o su ulceración induce la formación de trombos. Esta ruptura sucede con mayor frecuencia en los lugares de mayor adelgazamiento de la capa fibrosa que recubre la lesión aterosclerótica avanzada. Se presume que el adelgazamiento de la capa fibrosa es consecuencia de la actividad de los macrófagos, los cuales liberan metaloproteinasas y otras enzimas proteolíticas. Estas enzimas degradan la matriz extracelular, generando hemorragia de los vasa vasorum de la arteria con la consiguiente oclusión del vaso sanguíneo. Modificada de: Ross R. N Engl J Med. 1999;340(2):115-12644. 3.3 Citocinas y moléculas de adhesión Las citocinas son péptidos señalizadores que se producen en respuesta a la agresión de los tejidos, activando la respuesta inflamatoria. Las citocinas actúan a través de sus receptores de alta afinidad, los cuales se expresan en la superficie de las células. Las placas de ateroma son estructuras dinámicas y su estabilidad depende en última instancia, del balance entre la actividad de las citocinas proinflamatorias (las cuales favorecen la progresión y complicación de la placa ateromatosa) y las citocinas antiinflamatorias (que limitan la respuesta inflamatoria local). Durante el proceso inflamatorio, los leucocitos migran a través de la pared de los vasos sanguíneos hacia el tejido extravascular, donde ejercen gran variedad de funciones biológicas. Las citocinas y las CAMs (selectinas, integrinas e inmunoglobulinas), ejercen una función específica en el “tráfico” de los leucocitos en la respuesta inflamatoria. Marco conceptual 48 Las selectinas se expresan en la superficie de los leucocitos (L-selectina), de las plaquetas (P-selectina) y de las células endoteliales (E-selectina). Las citocinas inflamatorias, principalmente el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) y la IL-1, activan las selectinas, aumentando su expresión en la superficie celular. Este proceso es esencial en la fase inicial de la respuesta inflamatoria, interviniendo en el reclutamiento e interacción de las CE con los leucocitos. La siguiente etapa de la migración de los leucocitos, está mediada predominantemente por las integrinas (LAF-1, CAM-1, VLA-4), el receptor para la glucoproteína (GPIIb/IIIa), la VCAM-1, las moléculas de adhesión intercelular 1 y 2 (ICAM1 e ICAM-2), las citocinas inflamatorias (IL-1, IL-4, IL-8), el TNF-α, el interferón γ (INF-γ) y las quimiocinas. Conjuntamente a la expresión de las CAMs en las CE, en los leucocitos y en las plaquetas, las inmunoglobulinas VCAM-1 e ICAM-1 se expresan también en las VSMC76,77. Desde el punto de vista inmunológico, la adherencia de los monocitos a la superficie endotelial de los vasos sanguíneos, representa uno de los estadios más tempranos en la formación de la lesión aterosclerótica. En la fase inicial de la enfermedad aterosclerótica inducida experimentalmente con dieta aterogénica, los monocitos se adhieren a la superficie del endotelio vascular en zonas que posteriormente evolucionan hacia placas ateromatosas. La evolución de los monocitos (macrófagos), hacia las características células espumosas, sugiere que los macrófagos están expuestos a una carga abrumadora de lípidos y detritos celulares que alteraran su función ateroprotectora. Por consiguiente, se presume que la interrupción del ingreso de los monocitos al interior de la pared de los vasos sanguíneos, evitaría la progresión de las lesiones ateroscleróticas. 3.4 Monocitos (macrófagos) y aterosclerosis Los granulocitos excepcionalmente hacen parte del proceso aterogénico. Por el contrario, los monocitos (derivados de los macrófagos) y algunos subtipos específicos de Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 55 mediación de la LCAT (lecitina colesterol aciltransferasa o transferasa de grupos acilo desde lecitina a colesterol) y por consiguiente, el eflujo de colesterol. A su vez, la acción combinada de la CETP y de la lipasa hepática sobre las HDL maduras (HDL con abundante contenido de lípidos y escaso contenido protéico) generan fracciones de HDL con bajo contenido de lípidos que son mejores aceptoras de colesterol72. 4.1 Transporte inverso del colesterol Las HDL constituyen un mediador del fenómeno inflamatorio en el interior del ateroma, merced a su mecanismo de acción involucrado en el transporte inverso del colesterol (TRC). El TRC desempeña una función ateroprotectora al extraer las lipoproteínas aterogénicas del interior de la pared arterial limitando la perpetuación del estímulo inflamatorio. El depósito de lípidos en la pared arterial es un proceso dinámico y bidireccional, en el que concurren mecanismos específicos involucrados en la extracción del colesterol que se acumula en la pared de los vasos sanguíneos52. Existen varios mecanismos a través de los cuales las HDL ejercen efectos antiaterogénicos, siendo el más importante de ellos el TRC. El TRC es un mecanismo complejo mediante el cual las HDL captan el exceso de colesterol procedente de los tejidos extrahepáticos que tras ser esterificado por acción de la LCAT, se transporta selectivamente al hígado para su ulterior metabolismo y excreción por la bilis. Las HDL cumplen una función primordial en el TRC. Existen receptores indispensables en el TRC localizados en diferentes tejidos. Entre estos, el receptor ABCA-1 (ATP binding cassette transporter A-1) de los macrófagos y el receptor SCAR-B1 de los hepatocitos, son imprescindibles. En el hígado, el receptor SCAR-B1 media la captación hepática selectiva de las HDL y su excreción biliar, a diferencia de algunas proteínas de las HDL como la apoA-I que no las capta. El receptor SCAR-B1 se expresa en el hígado y en los macrófagos, favoreciendo el flujo de colesterol hacia las HDL. La contribución del transporte bidireccional de las HDL en el macrófago durante el TRC y el proceso Marco conceptual 56 aterosclerótico, solo se conoce parcialmente44,52. La necesidad fisiológica del TRC obedece a que el colesterol que captan las células por medio de las lipoproteínas (o el que sintetizan de novo) es tóxico para la propia célula si no se esterifica. El proceso de captación de colesterol a través de las HDL de reciente formación (HDL con escaso contenido lipídico) se realiza por varios mecanismos, entre los que se incluye: 1. El receptor ABCA-1 (a través de las apoA-1 de reciente formación). 2. El receptor SCAR-B1, mediante aceptores que poseen HDL y apolipoproteínas que contienen lípidos. 3. Los receptores ABCG-1/ABCG-4 (highly homologous members of the ATP binding cassette ABC transporter family) que regulan la homeostasia celular de colesterol. El receptor ABCG-1 también constituye una ruta alterna al transporte del colesterol libre desde los macrófagos hacia las HDL que contienen lípidos, pero no hacia las HDL de reciente formación. Las HDL de reciente formación “sufren” un proceso de remodelado y “maduración” intravascular mediante la acción de diversas enzimas como la LCAT, la CETP, la proteína de transferencia de fosfolípidos y de diferentes lipasas (lipoproteinlipasa, lipasa hepática y lipasa endotelial). El ciclo del TRC se completa mediante la captación de ésteres de colesterol por el hígado a través de los receptores hepáticos de las LDL. La importancia de la CETP radica en su capacidad para depletar ésteres de colesterol y enriquecer las HDL en triglicéridos, reduciendo su tamaño52. La importancia antiaterogénica de las HDL también deriva de su actividad antioxidante directa e indirecta, ya que las HDL captan ésteres de colesterol peroxidados (CEOOH) desde las LDL, siendo eliminados posteriormente como hidróxidos de ésteres de colesterol (CEOH) mediante el TRC. Pese a ello, existe contradicción en la literatura respecto al protagonismo del transporte de los CEOOH por parte de las HDL versus las LDL72. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 57 4.2 Funciones de las HDL independientes del transporte inverso del colesterol Las HDL al mismo tiempo que desempeñan su cometido en la regresión de la placa de ateroma a través del TRC limitan la progresión de la lesión ateromatosa. Esto obedece a que las LDL disminuyen selectivamente la producción de las CAMs, ya que estas moléculas favorecen la permanencia de las células inflamatorias en la pared de los vasos sanguíneos. Las HDL ejercen otras acciones antiaterogénicas a razón de sus propiedades antioxidantes: 1. Interfieren con los efectos proinflamatorios de las LDLox, reduciendo de este modo la expresión de las CAMs promovidas por las citocinas. 2. Impiden la formación de las LDLmox70. 3. Inhiben la actividad de las LDLox y evitan que las células de la pared arterial transfieran radicales libres y ROS a las LDL que permanecen retenidas en la intima de las arterias. 4. Inactivan los fosfolípidos oxidados proinflamatorios formados a partir de las LDLox, interrumpiendo la oxidación de las LDL a diferentes niveles. 5. Disminuyen el reclutamiento de los monocitos y la expresión de las metaloproteinasas de la MEC en el interior de la pared arterial86. 6. Inhiben la actividad del TNF-α (un mediador de la apoptosis celular), en el centro necrótico del ateroma inestable. 7. Restablecen la función endotelial, al incrementar la expresión de la eNOS a través de su receptor para las HDL, aumentando la biodisponibilidad de NO˙87. Todas estas acciones reducen el riesgo de trombosis y la probabilidad de ruptura de la placa ateromatosa52. El hallazgo y caracterización del receptor SCAR-B1 para las HDL y del transportador del colesterol ABCA-1, ha contribuido a comprender los mecanismos moleculares implicados en la protección contra la ATS. Del mismo modo, diferentes enzimas vinculadas a la actividad antioxidante de las HDL como las fosfolipasas o las paraoxonasas (PON), las cuales poseen gran capacidad para hidrolizar lípidos proinflamatorios en la placa aterosclerótica88-92, han sido imprescindibles en este aspecto. Marco conceptual 58 4.3 Enzimas antioxidantes vinculadas a las HDL Las propiedades antioxidantes de las HDL no son exclusivas de las enzimas PON. La acetilhidrolasa del factor activador de las plaquetas (PAF-AH) es una de las enzimas más importantes de las HDL. La PAF-AH inhibe el factor activador de las plaquetas (PAF). La PAF-AH constituye la única fosfolipasa A2 de las HDL, ya que la PON1 carece de actividad fosfolipasa sobre el PAF y sobre los fosfolípidos oxidados93. Pese a ello, existen evidencias que sugieren que la PON1 debe estar presente para justificar las propiedades antioxidantes y antiaterogénicas de las HDL94. Se sospecha que ambas enzimas ejercen su acción conjuntamente in vivo, ya que estas enzimas difieren en su afinidad hacia los fosfolípidos oxidados, en función de la longitud de la cadena del ácido graso esterificado en la posición sn-272,94. La presunción de la existencia de la actividad conjunta PON-HDL surgió al menos en parte, como una respuesta a la relación inversa existente entre la concentración de HDL y la presencia de EC en diferentes estudios poblacionales95. De esta forma, su actividad antioxidante justificaría el papel protector incluso en el TRC. La esterificación del exceso de colesterol se realizaría en las HDL mediada por la acción de la LCAT, la cual es particularmente sensible a los CEOOH. La actividad PON1 dirigida a la eliminación de fosfolípidos peroxidados y de CEOOH y su posterior eliminación a través del TRC, contribuirían sinérgicamente a la reducción del riesgo cardiovascular72. Se han descrito mecanismos moleculares adicionales que median la protección vascular en la interacción HDL-PON72,96. A la función ateroprotectora vinculada al TRC, a de aunarse el efecto antioxidante de las diferentes enzimas asociadas a las HDL. La identificación de múltiples sustratos de la actividad PON amplía el horizonte de la protección vascular mediada por las HDL. Sin embargo, los mecanismos moleculares involucrados en la interrelación HDL-PON y de Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 59 cada uno de los componentes de este binomio, continúan siendo asignaciones pendientes72. 5. Óxido nítrico y aterosclerosis A mediados de la década de los 80, el factor relajante derivado del endotelio (EDRF) fue identificado como el NO˙, implicando su importancia en el sistema cardiovascular y en todos los sistemas biológicos97,98. La revolucionaria trascendencia de estos hallazgos, motivó a la revista Science a elegir el NO˙ como la molécula del año en 1992 (Figura 16). En 1998, se concedió el premio Nobel de Medicina y Fisiología a los investigadores estadounidenses: Ferid Murad, Robert Furchgott y Louis Ignarro, por sus trabajos en el estudio y descubrimiento del NO˙. Figura 16. Óxido Nítrico. Imagen de la portada de la revista Science, publicada el 18 de diciembre de 1992. Koshland Jr DE. The molecule of the year. 1992;258(5090):1861. Marco conceptual 60 5.1 El óxido nítrico como mensajero intercelular El estudio del NO˙ ha sido el campo de mayor expansión en el conocimiento biológico en las dos últimas décadas. Su trascendencia radica en ser la primera sustancia química gaseosa que se ha demostrado que producen las células para emitir señales intercelulares (mediador biológico)97. El NO˙ es una sustancia afín en sus acciones a los nitrovasodilatadores y es esencial para comprender los mecanismos fisiológicos y fisiopatológicos de numerosos órganos y sistemas celulares98. Aunque el NO˙ es una molécula vital para el funcionamiento del organismo, su producción no siempre es beneficiosa. El exceso o disminución de la producción de NO˙ puede traer nefastas consecuencias, como de hecho sucede en ciertos procesos patológicos99. Esto obedece a que el NO˙ actúa directamente sobre la respiración mitocondrial o a través de sus metabolitos (como el peroxinitrito), favoreciendo la muerte de las células. Un mecanismo inespecífico de defensa contra el huésped98. En 1989, poco tiempo después de que el NO˙ fue identificado97, Ochoa JB y cols. (Figura 17), evaluaron la hipótesis que contrastaba el aumento del NO˙ y la inestabilidad hemodinámica de los pacientes con sepsis. Dos años después, estos investigadores reportaron las primeras observaciones en humanos que relacionaban el exceso en la producción del oxido nítrico y la fisiopatología de la sepsis. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 61 Figura 17. Óxido nítrico y sepsis. En 1991, Ochoa JB y cols.(1), reportaron las primeras observaciones en humanos que relacionaron el incremento del oxido nítrico y la inestabilidad hemodinámica de los pacientes sépticos. Figura adaptada de: Ochoa JB. A Rational Approach Towards Immunonutrition in Surgical and Critical Illness. University of Kentucky General Surgery Grand Rounds lectures 2011. Nestlé Health Science. Nestlé Health Care Nutrition, Inc. Copyright 2011. http://surgery.med.uky.edu/surgery/education/grand_rounds/2011. (1)Ochoa JB, Udekwu AO, Billiar TR, Curran RD, Cerra FB, Simmons RL, Peitzman AB. Nitrogen oxide levels in patients after trauma and during sepsis. Ann Surg. 1991 Nov;214(5):621-6. Más recientemente, el descubrimiento de Ochoa y cols. (Figura 18), de que las células mieloides (MC) bajo ciertos estímulos expresan argininasa 1 (MDSC/Myeloid Derived Suppressor Cells), destruyendo la arginina y suprimendo las funciones biológicas arginino dependientes (producción de óxido nítrico, función de los linfocitos T, cicatrización de las heridas), ha tenido trascendentales implicaciones clínicas en el entendimiento y abordaje de la disfunción inmune en diferentes enfermedades (cáncer, infecciones crónicas), además de otros escenarios como la cirugía y el trauma. Marco conceptual 62 Figura 18. Células mieloides y arginina(1). El incremento del óxido nítrico (NO˙) en pacientes sépticos descrito por Ochoa JB y cols.(2) (Figura 17) no se encontraba inicialmete en víctimas de traumatismo y sepsis secundaria, en los que el NO˙ incluso disminuía, circunstancias estas sin clara explicación inicial. Margen superior. La disponibilidad de un modelo murino ideado por Ochoa y cols. permitió comprender el metabolismo de la arginina en las células mieloides (MC) posterior al trauma. CATs (transportadores de aminoácidos catiónicos). Figura adaptada de: Ochoa JB. A Rational Approach Towards Immunonutrition in Surgical and Critical Illness. University of Kentucky General Surgery Grand Rounds lectures 2011. Nestlé Health Care Nutrition, Inc. 2011. http://surgery.med.uky.edu/surgery/education/grand_rounds/2011. Margen inferior. Izquierda. Las MC que producen argininasa 1 (MDSC/Myeloid Derived Suppressor Cells) muestran lobulaciones en sus núcleos conformando anillos. Figura adaptada de: Ochoa JB. Improving Outcomes in Surgery, Trauma and Critical Illness: One Bite at a Time. Nestlé Health Care Nutrition, Inc. 2011. http://www.scoap.org/downloads/1107_Nutrition_Ochoa.pdf. Derecha y centro. Las MDSC (matiz azul) invaden el bazo en las primeras 12 horas después del trauma, causando disfunción de las células T a través de un mecanismo mediado por la argininasa 1 (depleción de arginina). En condiciones basales (control) se observan pocas MDSC. Figuras adaptadas de: Makarenkova VP, Bansal V, Matta BM, Pérez AL, Ochoa JB. CD11b_/Gr1_ Myeloid Suppressor Cells Cause T Cell Dysfunction after Traumatic Stress. The Journal of Immunology. 2006;176:2085-2094. (1)Nestle Nutr Inst Workshop Ser. 2013;77:29-45. Ochoa J.B. Arginine Deficiency Caused by Myeloid Cells: Importance, Identification and Treatment. In: Makrides M, Ochoa JB, Szajewska H (eds): The Importance of Immunonutrition. Nestlé Nutr Inst Workshop Ser. Nestec Ltd. Vevey/S. Karger AG Basel, © 2013. (2)Ochoa JB, Udekwu AO, Billiar TR, Curran RD, Cerra FB, Simmons RL, Peitzman AB. Nitrogen oxide levels in patients after trauma and during sepsis. Ann Surg. 1991 Nov;214(5):621-6. Las MC constituyen una compleja línea celular que incluye los granulocitos y los macrófagos. El metabolismo de la arginina es mínimo en las MC en ausencia de actividad del sistema inmunológico. La activación del sistema inmune durante la enfermedad hace que se utilice la arginina por dos vías diferentes, con consecuencias biológicas y Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 63 metabólicas disímiles: 1. Respuesta inflamatoria clásica de las MC (M1) que estimula la sintasa inducible del óxido nítrico (iNOS), produciendo grandes cantidades de NO˙ (observada en el curso de las infecciones agudas), esencial en la defensa contra los microorganismos y las células cancerosas. 2. Respuesta alternativa de activación de los macrófagos (M2) que estimula la argininasa 1, desdoblando la arginina en ornitina y urea. El Síndrome de la Deficiencia de Arginina (Arginine Deficiency Syndrome) postulado por estos autores (Figura 18), representa la primera descripción del déficit de un aminoácido (arginina), como consecuencia de la destrucción de un nutriente por el sistema inmunológico. 5.2 Óxido nítrico y función endotelial El NO˙ representa en esencia una molécula gaseosa generada por distintas células del endotelio vascular (entre ellas los neutrófilos), siendo el NO˙ un vasodilatador endógeno vital y una molécula ateroprotectora por excelencia. En condiciones fisiológicas, el NO˙ endotelial se sintetiza en el endotelio vascular por intermedio de la eNOS (Figura 19). Figura 19. Óxido nítrico endotelial. El óxido nítrico (NO˙) endotelial se sintetiza en el endotelio vascular por intermedio de la sintasa endotelial del oxido nítrico (eNOS). La dimetilarginina asimétrica (ADMA) inhibe la eNOS, disminuyendo la biodisponibilidad de NO˙ con la consiguiente alteración del endotelio vascular. O (oxígeno). El NO˙ de origen endotelial posee gran variedad de acciones fisiológicas encaminadas a conservar la función del endotelio vascular, su integridad y el entorno Marco conceptual 64 antitrombótico. Por consiguiente, la disminución de la biodisponibilidad de NO˙ constituye un mecanismo primordial en la génesis de la enfermedad aterosclerótica (Tabla 1). Tabla 1. Efectos biológicos del óxido nítrico99 Efectos ateroprotectores Función vasodilatadora al difundirse a las células musculares lisas de los vasos sanguíneos (VSMC) Neutraliza la acción de las especies reactivas de oxígeno (ROS) liberadas durante el metabolismo celular Regula la angiogénesis, la proliferación y migración de las VSMC Regula el tono vascular Regula la permeabilidad del endotelio vascular Regula la interacción entre los leucocitos y el endotelio vascular Disminuye la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) Incrementa el GMP cíclico (GMPc) en las plaquetas, disminuyendo la adhesividad y la agregabilidad plaquetaria Consecuencias derivadas de la disminución la biodisponibilidad del óxido nítrico Alteración de la homeostasia vascular Pérdida de la protección de la pared vascular Incremento de la permeabilidad vascular Favorece el daño del endotelio vascular Facilita la migración de los leucocitos y la respuesta inflamatoria Aumenta la proliferación de las VSMC Incrementa la agregación plaquetaria Favorece el espasmo vascular a través de la síntesis de la endotelina-1, los tromboxanos y la serotonina Favorece diferentes procesos: hipercolesterolemia, DM, HTA, IC, ATS, envejecimiento Impide la adecuada cicatrización de las heridas GMPc (guanosín monofosfato cíclico); DM (diabetes mellitus); HTA (hipertensión arterial); IC (insuficiencia cardiaca); ATS (aterosclerosis). 5.3 Sintasas del óxido nítrico Se conocen al menos 3 isoenzimas de las NOS: la NOS inducible (iNOS o NOS-II), la NOS neuronal (nNOS o NOS-I) y la eNOS (NOS-III). A su vez, las NOS presentan dos tipos funcionales diferentes. Un primer grupo representado por las NOS de clase constitutiva (la eNOS y la nNOS). El segundo prototipo denominado NOS inducibles (i), está representado por la iNOS99. Las NOS se expresan en diferentes líneas celulares por mediación de una familia de genes localizados en diferentes cromosomas: 1. El gen que expresa la iNOS se localiza en el cromosoma 17 (17cen-q11.2)100. 2. El gen que expresa la nNOS se encuentra en el cromosoma 12 (12q24.2). 3. El gen eNOS que codifica la eNOS, se identificó en el cromosoma 7q35-36101. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 71 Figura 20. Marcadores del riesgo cardiovascular. La aterosclerosis comienza a gestarse antes de la concepción. Las influencias del entorno durante el desarrollo del organismo repercuten en la salud cardiovascular a lo largo de la vida de cada individuo. Adaptada de: Morrison K, et al. Am Heart J. 2009;158(4):535-539129. Existe evidencia creciente de que las interacciones entre los genes y el entorno (circunstancias estas inherentes a las enfermedades complejas) son reguladas al menos parcialmente por mecanismos epigenéticos. A diferencia de los conceptos clásicos de la herencia mendeliana, la epigenética hace énfasis en la heredabilidad de las alteraciones del DNA (diferentes a la variación en la secuencia de sus nucleótidos) promovidas por factores del entorno. Fenómeno este que ha sido denominado herencia epigenética133 y del cual se deriva el compromiso hacia nuestros genes y hacia nuestra propia especie, además de la responsabilidad de nuestros progenitores y ancestros; un concepto ignorado por décadas. ¿Epigenetics? si, epigenética. A este respecto, Thomas Jenuwein afirmó: “The longstanding question of nature versus nurture begs the question: to what extent does genetic determination vis-a-vis environment driven signals affect the development and personal Marco conceptual 72 profiles of given individuals? Thanks to epigenetic research, we now know there are mechanisms beyond genetic determinism (there is no ‘intelligent design’) and that gives us the freedom to live as true individuals. This is best exemplified by genetically identical twins that can develop distinct disease profiles and life projections. Thus, ‘we are more than the sum of our genes’, and epigenetic research is likely to have significant impact on cultural and ethical values in our ‘post-genomic’ society”134. Las influencias del entorno en las etapas iniciales del desarrollo causan variaciones epigenéticas que afectan la programación del metabolismo celular influyendo en la salud cardiovascular a lo largo de la vida de cada individuo135,136. Las complejas interacciones entre la genética, la epigenética y la exposición ambiental, aunadas al entorno infantil postnatal, constituyen el sustrato de la relación entre la salud de la madre, el crecimiento fetal, los FRECV en la infancia y las manifestaciones de la enfermedad en los adultos129. Los FRECV alteran el funcionamiento del genoma mediante diversos mecanismos epigenéticos, promoviendo la aterogénesis25. Existen pocos estudios de cohorte que relacionen la influencia genética y el entorno familiar más allá del estado de la salud materna137. Estos estudios aportan conclusiones contradictorias sobre la magnitud del efecto y la influencia de las variables de confusión, incluyendo los hábitos de los padres, el estado socioeconómico, el medio ambiente y la etnicidad en los resultados finales. El estudio FAMILY129 (Family Atherosclerosis Monitoring In earLY life), pretende esclarecer algunos enigmas sobre los determinantes prenatales y de la infancia acerca de los FRECV en las fases críticas del desarrollo infantil. Se vislumbra que este estudio contribuya en positivo al diseño de programas de prevención más eficaces en aquellas nosologías, que como la ATS, se gestan en el entorno prenatal. Los fenómenos epigenéticos son esenciales para el ordenamiento e interpretación del genoma, para el desarrollo y el proceso fisiológico del organismo, así como para Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 73 perfeccionar nuestro conocimiento de las enfermedades138,139. El conjunto de las enfermedades en los humanos presenta causas epigenéticas. En la célula enferma, a través de los diferentes mecanismos epigenéticos se distorsiona el equilibrio celular. En este aspecto, la caracterización de los diferentes epigenomas, la identificación de las variables epigenéticas, los estudios sobre las fuentes de variabilidad epigenética y los EWAS (estudios de asociación del epigenoma completo), aunados al perfeccionamiento bioinformático, prometen mejorar nuestro entendimiento de las enfermedades. No obstante, aún se requiere un cuantioso esfuerzo para determinar el perfil del epigenoma humano138-140. La correlación de los patrones de metilación entre los diferentes tejidos es compleja y locus dependiente. Con todo ello, los rasgos epigenéticos presentes en las muestras clínicas convencionales (células sanguíneas), constituyen un material fácilmente asequible para su estudio141. Hoy disponemos de los instrumentos imprescindibles para revelar infinidad de enigmas de la biología humana y un universo de dilemas médicos. Recientemente y en esta línea de compromiso, la comunidad científica internacional en un esfuerzo coordinado, dio luz verde al esperanzado proyecto AHEAD (Alliance for the Human Epigenome and Disease), en su afán de perfeccionar el conocimiento de las enfermedades como el cáncer y las ECV, entre otras patologías57,58,134. La epigenética del sistema cardiovascular se encuentra aún en sus inicios. El desentrañamiento del epigenoma en la célula aterosclerótica, en el endotelio afectado por la formación de ateromas en el contexto de la EC y el estudio de los epigenomas de las diferentes líneas celulares que conforman la red de vasos sanguíneos del organismo, representan solo algunos de sus retos (Figura 21). Marco conceptual 74 Figura 21. Conocimiento actual de la aterosclerosis. Metáfora aterosclerótica. Que sabemos y que deberíamos saber. Nuestro conocimiento actual sobre la aterosclerosis se simboliza en el interior del circulo azul (una mota solitaria), frente a lo que ignoramos (representado por la inmensa oscuridad cósmica, matizada entre las líneas del óvalo escarlata). Fotografía del Universo tomada por la NASA. Tapoddle, VCG 10214. NASA and ACS Science Team. http:// wwwnasa.gov/tpoics/universo/index.html. A la espera de una nueva realidad, conviene tener siempre a mano aquel acreditado refrán del humanista holandés, Erasmo de Rotterdam (1466-1536): “Más vale prevenir que curar”, ya que es imprescindible, tal y como lo han planteado las guías europeas de la práctica clínica de octubre de 2007 sobre la prevención de las enfermedades cardiovasculares63: retomar las recomendaciones propuestas en la “Declaración de Luxemburgo” de junio de 200534 sobre el estilo de vida para alcanzar la salud cardiovascular, ya que son principios universales, están avalados por evidencias científicas contundentes y por consiguiente, deben indicarse en la prevención de las ECV de manera sistemática e independientemente del nivel del riesgo cardiovascular de cada individuo, porque: “prevenir sigue siendo mejor que curar”29 (Tablas 3 y 4). Tabla 3. “Declaración de Luxemburgo” sobre el estilo de vida para alcanzar la salud cardiovascular34 No fumar Realizar ejercicio de intensidad al menos moderada, mínimo durante 30 minutos diarios Al momento de alimentarse escoger alternativas saludables Evitar el sobrepeso Mantener la tensión arterial por debajo de 140/90 mm/hg Mantener el colesterol total por debajo de 200 mgr/dL Disponible en http: //www.ptkardio.pl/files//file/luxembourgdeclarationfinal.pdf. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 75 Tabla 4. Recomendaciones de las guías europeas de la práctica sobre la prevención de las enfermedades cardiovasculares63 No fumar Al momento de alimentarse escoger alternativas saludables Realizar ejercicio de intensidad al menos moderada, mínimo durante 30 minutos diarios Mantener el índice de masa corporal (IMC o BMI) por debajo de 25 kg/m² y evitar la obesidad central Mantener la tensión arterial < 140/90 mm/hg Mantener el colesterol total (CT) < 5 mmol/L (~190 mgr/dL) Mantener las lipoproteínas de baja densidad (LDL) < 3 mmol/L (~115 mgr/dL) Mantener la glucosa en sangre < 6 mmol/L (~110 mgr/dL) Disponible en http: //www.escardio.org/knowledge/guidelines/rules. 9. Homocisteína como factor de riesgo en la aterogénesis Han transcurrido más de cuatro décadas desde que Kilmer McCully142 implicó la Hcy en la aterogénesis y han pasado ya más de 30 años desde que Wilcken y Wilcken143, reportaron que los aminoácidos azufrados estaban relacionados con la EC. Entre los aminoácidos sulfurados, el incremento de Hcy está en relación con el riesgo cardiovascular de forma independiente a otros FR involucrados en la etiopatogenia de las ECV13,144. La Hcy altera el metabolismo oxidativo de las células al formar sustancias biológicamente reactivas15 y tóxicas a las células ejerciendo un efecto deletéreo en la pared de los vasos sanguíneos. La hiperhomocisteinemia (HHcy) ocasiona un fenotipo aterotrombótico por diversos mecanismos que incluyen: 1. Alteración de la estructura de las proteínas17. 2. Incremento del estrés oxidativo y de la respuesta inflamatoria15,145. 3. Disfunción endotelial15. 4. Apoptosis146. 5. Proliferación de las VSMC147. 6. Trombogénesis146. 7. La HHcy induce ATS al interferir con el metabolismo y el transporte de los lípidos a través de la vía del estrés oxidativo y/o del estrés del retículo endoplásmico (RE). 8. Adicionalmente, la HHcy disminuye la biodisponibilidad de NO˙ y modula la concentración de otros metabolitos como la SAM y la SAH, generando alteraciones neurológicas y cardiovasculares. El estrés del RE representa la vía común que relaciona la Hcy con la apoptosis y la ATS. La Hcy ejerce sus efectos al modular diversos procesos Marco conceptual 76 catalíticos, además de regular la expresión de los genes involucrados en la génesis de las enfermedades complejas73 (Figura 22). Se han descrito ampliamente las vías metabólicas a través de las cuales la Hcy causa daño a las células endoteliales145-152. Los modelos experimentales de HHcy favorecen su nexo de causalidad con la ATB152. Adicionalmente, las vitaminas del complejo B reducen la concentración de Hcy14,153. Figura 22. Homocisteína y aterosclerosis (ATS). La homocisteína (Hcy) altera la biosíntesis del colesterol (1); la expresión de las proteínas de la matriz extracelular (2); la expresión del gen LOX-1 (lectin like oxidized LDL receptor-1) y del factor de necrosis tumoral α (TNFα), promoviendo la oxidación de las LDL (3,8); altera las moléculas de adhesión celular CAMs (4); estimula la proliferación de las células del musculo liso vascular (VSMC) al incrementar la actividad de la ciclina A (5), aumentando la expresión de la LPL (lipoprotein lipase) tanto a nivel traslacional como transcripcional, mediante la activación de la PKC (proteína cinasa C), la cual regula los genes de la respuesta inflamatoria en las células del endotelio vascular (6,7). La Hcy además disminuye la expresión de los PPARs (peroxisome proliferators-activated receptors) (9). AP-1 (proteína activadora 1); Mo (monocitos); TNFR1B (tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B); SREBPs (sterol regulatory element-Binding Proteins); LOX1 (oxidized low-density lipoprotein receptor 1) ; PPARs (peroxisome proliferator-activated receptors); *La Hcy compite con el ligando PPARs; PPARα (peroxisome proliferator-activated receptor alfa); HMGCR (hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa); VLDL (lipoproteínas de muy baja densidad); MEC (matriz extracelular); NF-kB (factor de transcripción nuclear kappa B); MCP-1 (sustancia quimiotáctica plaquetaria 1); IL-8 (citocina/interleucina 8); VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular); VCAM (moléculas de adhesión de las células vasculares); P selectin (selectina P); E selectin (selectina E); LDL (lipoproteínas de baja densidad); LDLox (LDL oxidadas); DLP (dislipemia); Ang (angiotensina); ACE (enzima convertidora de angiotensina); NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate). Adaptada de: Sharma P, et al. Lipids Health Dis. 2006;5(1):1-1973. Pese a la idoneidad de las observaciones descritas existe incertidumbre sobre la fuerza de asociación entre la Hcy y la ATS como FR modificable, ya que la disminución de la Hcy versus el beneficio del riesgo cardiovascular esperado es a la luz actual Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 77 contradictorio154-156. Algunos autores han concluido que todavía no se ha validado la hipótesis que involucra la Hcy en la etiología de las ECV156. Sin embargo, existen resultados contradictorios157. Algunos ensayos clínicos controlados, reportan que la relación entre la Hcy y las ECV es más débil de lo esperado158 (Figura 23). Figura 23. Homocisteína y enfermedades cardiovasculares. Existe incertidumbre acerca de la correlación entre la homocisteína como factor de riesgo modificable y la génesis de las enfermedades cardiovasculares ateroscleróticas. A pesar del entusiasmo inicial de los resultados favorables de los estudios sobre el aporte de folatos en la dieta, el riesgo cardiovascular y la regresión de la placa aterosclerótica159, estos beneficios no han sido confirmados en diversos estudios clínicos randomizados160-165. Una explicación propuesta a estos hallazgos alude que la Hcy per se quizás no sea el agente causal de la alteración vascular, sino más bien el marcador Marco conceptual 78 biológico de otro FR coexistente166. No obstante, se cree que la respuesta a estos hechos, se encuentra a nivel molecular155. En la historia natural de la HHcy de origen genético, las complicaciones vasculares constituyen la principal causa de morbilidad y mortalidad en los pacientes que no han recibido tratamiento167. En 1969, McCully142 describió la presencia de lesiones arteriales avanzadas en niños con trastornos congénitos en el metabolismo de la Hcy, subrayando el nexo existente entre la enfermedad vascular y la HHcy severa de causa hereditaria. Desde entonces, se ha estudiado extensamente la Hcy como FRECV en diferentes revisiones sistemáticas146,168, hallándose adecuadamente documentada la relación entre Hcy y ATB13,169. A diferencia de los estudios prospectivos, en los que se ha observado escasa relación entre la Hcy y las ECV, diferentes metaanálisis realizados en la última década han evidenciado resultados contundentes170. La HHcy leve (un hallazgo prevalente en la población general) se relaciona con el riesgo cardiovascular171. Más del 10% de la población en riesgo de padecer EC presenta HHcy. El incremento de Hcy en 5µmol/L es equiparable al aumento de 20 mg/dL del colesterol plasmático frente al riesgo de padecer EC168. El Homocysteine Studies Collaboration170 (HSC) mostró que la disminución de 3µmol/L en la Hcy redujo el riesgo relativo de EC en 11% y de apoplejía en 19%. Wald y cols.172, reportaron que la reducción de Hcy en 3µmol/L redujo el riesgo de EC en 16%, de trombosis venosa profunda en 25% y de apoplejía en 24%. La HHcy predice el desarrollo de eventos cardiovasculares recurrentes (muerte de origen cardiaco, IAM o reinfarto) en pacientes con SCA173,174, estando asimismo relacionada con el riesgo cardiovascular en la población general y en los pacientes con ATS establecida. Aunque la evidencia acumulada favorece el vínculo entre Hcy y ATS, poco se sabe acerca de los mecanismos moleculares que involucran la Hcy como FR modificable en la aterogénesis. Los expertos afirman que esta relación de causalidad únicamente se podrá Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 79 establecer cuando se logre demostrar en estudios clínicos prospectivos randomizados que la reducción de la Hcy disminuye de forma fehaciente el riesgo cardiovascular145,150. 9.1 Bioquímica de la homocisteína y de las reacciones de transmetilación celular La Hcy es un aminoácido no protéico (ya que no participa en la síntesis protéica) que contiene azufre en forma de sulfuro175,176, cuyo metabolismo se encuentra en la intersección de dos vías: la vía de la remetilación y la vía de la transulfuración celular110. La Hcy es a su vez un producto intermediario del metabolismo de la metionina (Met), ya que en los mamíferos la Hcy se sintetiza a partir de la Met175,176 (Figura 24). Figura 24. Estructura química de los aminoácidos azufrados. Estructura molecular de los aminoácidos sulfurados (que contienen grupos sulfuro) fisiológicamente más relevantes. H (hidrógeno); C (carbono); O (oxígeno); S (azufre); CH3 (grupo metil); SH (grupo sulfhidrilo/tiol o thiol). Adaptada de: Masella R, et al. Glutathione and sulfur amino acids in human health and disease. 2009176. La metilación del DNA (a través del ciclo de la Met) es crucial en la transmetilación celular16,25 debido a: 1. La participación en el control epigenético de la expresión génica. 2. La metilación postrasduccional de las proteínas. El proceso de metilación celular comprende unas decenas de reacciones enzimáticas, las cuales utilizan SAM como donante de grupos metil. Por el contrario, las moléculas aceptoras de grupos metil son más numerosas y varían desde moléculas de pequeño tamaño (lípidos, aminoácidos), hasta macromoléculas como el DNA, las proteínas y el ácido ribonucléico (RNA). Mediante el aporte de los grupos metil se garantiza el aporte de carbono para la síntesis de las cuatro principales biomoléculas del organismo: ácidos nucléicos (DNA, RNA), aminoácidos (proteínas), carbohidratos y lípidos (derivados Marco conceptual 80 lipídicos). La Hcy constituye un mediador biológico en las reacciones de transmetilación celular, incluyendo la metilación del DNA25. En la vía de la transmetilación celular, la SAM se sintetiza a partir de la transferencia de la adenosina del ATP al grupo sulfhidrilo de la Met16. La producción de Hcy depende de la concentración de SAM, responsable a su vez de múltiples reacciones de metilación celular. La SAM se transforma en SAH (al transferir su grupo metil a un aceptor). La SAH se metaboliza hacia adenosina y Hcy mediante un proceso de hidrólisis. En condiciones fisiológicas, la Hcy se regula primordialmente por medio de: 1. Su remetilación hacia Met, con la participación de la metionina sintasa (MS) y 2. Por la vía de la transulfuración hacia cistationa y cisteína. La enzima responsable del metabolismo de la Hcy a cistationa es la cistationa β sintasa (CBS) en presencia de piridoxina (vitamina B6) como cofactor146,177. Debido a que la MS posee una constante de Michaelis-Menten (KM) más baja que la CBS, a menor concentración de Hcy se favorece la síntesis de Met y viceversa. A mayor concentración de Hcy se promueve la vía de la transulfuración, protegiendo al organismo del potencial tóxico de la Hcy. De este modo, cuando se incrementa la concentración de Met, la Hcy se metaboliza por la vía de la transulfuración. Por el contrario, si existe déficit de Met, la Hcy se remetila hacia Met167. La remetilación de Hcy hacia Met se realiza en el hígado y en el riñón con la participación de la betaína homocisteína metiltransferasa (BHMT). No obstante, en la mayoría de los tejidos la Hcy se remetila a Met por acción de la MS, de la vitamina B12 (cianocobalamina) y del 5-MTHF. El 5-MTHF actúa como donante de grupos metil en la conversión de Hcy a Met. La enzima 5,10-MTHFR convierte el tetrahidrofolato (THF) en 5-MTHF151. En la figura 25 se esquematiza el ciclo metabólico de la Hcy y su relación con los folatos. El ciclo metabólico de la Hcy incluye (Figura 25): 1. Conversión de la Met de la dieta a SAM, a través de la metionina adenosil transferasa (MAT) o SAM sintasa. La SAM se sintetiza a partir de la transferencia de la adenosina del ATP, al grupo sulfhidrilo de la Met. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 87 la MTHFR (ubicado en el cromosoma 1p36.3). 2. El gen de la MS (localizado en el cromosoma 1q43). El gen que codifica la metionina sintasa reductasa (MSR) confinado al cromosoma 1p15.3-p15.2 y 3. El gen que regula la CBS (con localización cromosómica 21q22.3). Se han identificado además de las mutaciones responsables de la HHcy hereditaria severa, algunos polimorfismos que promueven incrementos menos pronunciados (leves a moderados) en la Hcy104. La homocistinuria como consecuencia de la deficiencia de la CBS es una enfermedad mendeliana excepcional y está en relación con el desarrollo de ATS severa y de complicaciones trombóticas en el lecho vascular150. En la HHcy (leve/moderada), además del polimorfismo C677T, la Hcy está influenciada por las variantes en los genes PON1 y PON2. Estas variantes regulan la actividad y la concentración de sus respectivas isoenzimas a través de su capacidad para hidrolizar distintas lactonas, entre ellas la HcyT20,21. Adicionalmente, el NO˙ regula la concentración de Hcy: 1. De forma directa, al inhibir la actividad de la MS. 2. Indirectamente, a través del catabolismo de los folatos, al inhibir la síntesis de la ferritina (proteína que inhibe irreversiblemente el metabolismo oxidativo de los folatos, incrementando su concentración intracelular). Debido a que el nivel de folatos se relaciona inversamente con la Hcy, se establece una correspondencia reciproca entre la concentración de NO˙ y la concentración de Hcy104. 9.2.1.1 Polimorfismo C677T MTHFR El polimorfismo C677T MTHFR es la variante hereditaria más frecuente y estudiada como causa de HHcy moderada. Su prevalencia es variable entre los diferentes grupos étnicos y raciales. Este polimorfismo presenta un patrón de herencia mendeliana autosómico recesivo179,180. Marco conceptual 88 Los estudios pioneros de la enzima MTHFR realizados por Kang y cols.181,182, identificaron una variante termolábil de la enzima con menor actividad, relacionada con el incremento de Hcy y el riesgo de desarrollar EC. La alteración que ocasiona la termolabilidad de la enzima consiste en un defecto de transición del gen que codifica la enzima MTHFR. Una modificación en la estructura del DNA en la que el residuo de citosina (C), se sustituye por timina (T) en el nucleótido 677 del exón 4 del gen. La sustitución de estos nucleótidos genera el cambio del aminoácido valina (Val), por alanina (Ala) en la posición 114 de la enzima MTHFR (Ala222Val). El polimorfismo C677T codifica en el alelo T180 una enzima menos eficiente en el metabolismo de la Hcy (~30% en los heterocigotos y ~60% en los homocigotos) impidiendo la formación del 5-MTHF179. Frosst y cols.179, señalaron que esta variante incrementaba ~25% la concentración de Hcy en los individuos homocigóticos para el alelo T (genotipo TT), en comparación con los individuos que no portaban el alelo de riesgo (genotipo CC). Desde el reporte original de Frosst y cols. en 1995, el polimorfismo C677T MTHFR ha sido objeto de investigación como FR genético en el desarrollo de las ECV. Kang y cols.181,182, mostraron que no todas las personas con termolabilidad de la MTHFR presentaban incremento de Hcy. Estos investigadores señalaron que el aporte de folatos reducía la Hcy en los individuos con HHcy. En concordancia con estas observaciones, Jacques y cols.183, reportaron HHcy moderada en individuos homocigotos para el alelo T (T/T) con deficiencia de folatos. Diferentes estudios han revelado que la actividad de la MTHFR se incrementa cuando la concentración de folatos es adecuada, disminuyendo la Hcy. Si bien la disminución de folatos está en relación con la HHcy moderada, la contribución de este hallazgo in vivo en la aterogénesis se encuentra en entredicho104. Bagley y Selhub184, encontraron que la expresión clínica del polimorfismo C677T obedece a la distribución diferenciada de los folatos en el interior de las células (glóbulos Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 89 rojos, CE, entre otras células). Así, los homocigotos CC almacenan exclusivamente 5MTHF en los glóbulos rojos, optimizando el metabolismo de la Hcy en las células. Los homocigotos TT, además del 5-MTHF, almacenan derivados no metilados de los folatos como el THF. En consecuencia, los heterocigotos CT presentan modesto incremento en la Hcy respecto a los homocigotos CC. Debido a que la Hcy constituye un FR en el desarrollo de la enfermedad aterosclerótica, el enunciado anterior predice que los tres genotipos del polimorfismo C677T MTHFR confieren diferentes niveles de riesgo aterotrombótico en la población genéticamente vulnerable185. Una explicación propuesta a este hallazgo es que el genotipo CT confiere mayor riesgo aterotrombótico. Aunque otra interpretación establece que el genotipo CC ejerce efecto protector contra la ATB. Recientemente y siguiendo la metodología investigativa del gen candidato, se evaluó la variante C677T MTHFR en diferentes estudios clínicos controlados randomizados, corroborando que los portadores del genotipo C677T presentan incremento de la Hcy, a la vez que el aporte exógeno de folatos disminuye su concentración186 . Estos hallazgos han sido confirmados en el primer Scan GWAS a gran escala de la Hcy plasmática14. La variación más significativa en este sentido se encontró en el cromosoma 1, específicamente en el gen que codifica la enzima MTHFR (Figura 27). Marco conceptual 90 Figura 27. Scan GWAS de la homocisteína. Scan graficado de acuerdo a la posición de los cromosomas y al -valor de p del -log10. GWAS (genome-wide association study); MTHFR (metilentetrahidrofolato reductasa); SYT9 (proteína synaptotagmin-9). Adaptada de: Miyaki K. J Epidemiol. 2010;20(4):266-27014 y Tanaka T, et al. Am J Hum Genet.2009;84(4):477-482186. 9.2.2 Factores demográficos Diversos factores demográficos determinan la concentración de Hcy104. 9.2.2.1 Género Biológicamente existe un nivel superior de Hcy plasmática en el género masculino. Este hallazgo se atribuye a la mayor proporción de masa muscular en los hombres. Si bien se presume que esta diferencia en la concentración de Hcy con el género femenino (la cual desaparece con la menopausia) refleja el efecto de los estrógenos sobre el metabolismo de la Hcy. Este hecho justificaría la mayor prevalencia de EC en el género masculino y la observación epidemiológica del incremento de EC en las mujeres posmenopáusicas, ya que los estados de deficiencia estrogénica se asocian a HHcy. A su vez, la terapia de remplazo hormonal con estrógenos, disminuye la Hcy en la mujer posmenopáusica. Se desconoce si el efecto cardioprotector asociado a la terapia hormonal obedece a la disminución de Hcy145. Recientemente se identificó en un GWAS el locus del gen CPS1 (carbamoyl-phosphate synthetase 1) el cual regula la concentración de Hcy en Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 91 las mujeres, encontrando que la Hcy varía en las diferentes etapas del desarrollo. Este hecho sugiere una importante actividad de la MTHFR en la población joven187. 9.2.2.2 Envejecimiento A lo largo del proceso de envejecimiento se incrementa la Hcy, aunque se desconocen los mecanismos involucrados en dicho proceso. Se atribuye este hallazgo a la baja ingesta de vitaminas del complejo B, al deterioro de la función renal y/o a la reducción de la actividad de las enzimas implicadas en el metabolismo de estas vitaminas188. En la tercera edad la Hcy se incrementa ~1µmol/L por cada década (~15-20% en las personas mayores de 65 años)145. Algunos autores encuentran relación entre Hcy, y la edad exclusivamente en homocigotos TT que padecen EC (variante C677T MTHFR). En las personas con genotipo TT el rango de Hcy superior a 15 μmol/L se relaciona con la EC. Por el contrario, en los individuos con los genotipos CT y CC (incluso con valores superiores de Hcy) no se ha encontrado relación con la edad, ni con la presencia de EC. Estos resultados indican que el genotipo TT se asocia con EC cuando coexiste HHcy. También se ha documentado que la HHcy (así como sus determinantes genéticos), desempeña una función preponderante en los pacientes jóvenes que desarrollan IAM189. 9.2.3 Factores nutricionales Aproximadamente el 60% de la HHcy de origen nutricional obedece a la deficiencia de las vitaminas del complejo B (B6, B9 y B12) implicadas en el ciclo metabólico de la Hcy188 (Figura 34). El consumo frecuente de carne roja (por su alto contenido en Met) predispone al desarrollo de ATS190 al igual que el consumo de café191, ya que aumentan la Hcy. Por el contrario, la dieta mediterránea (alto consumo de folatos) reduce la Hcy192. La dieta es un determinante fundamental de la concentración de Hcy debido a que condiciona la fuente donante de grupos metil a través del aporte de ciertos nutrientes, especialmente de aquellos alimentos que contienen folatos, colina, betaína y Met. Por consiguiente, la dieta regula el metabolismo de los aminoácidos sulfurados (como la Hcy) y Marco conceptual 92 las reacciones de transferencia de grupos metil a nivel celular. Esta particularidad acrecienta la relevancia de la Hcy como biomarcador ya que la dieta rica en vegetales verdes y ácido fólico disminuye la concentración de Hcy, y viceversa109. Existe relación inversa entre la concentración de Hcy, ácido fólico y la metilación del DNA193,194, un aspecto biológico imprescindible en la expresión génica194-197 (Figura 34). Algunos estudios evidencian que la variante C677T MTHFR se asocia a hipometilación del DNA197. En la población general el aporte de folatos favorece el metabolismo de la Hcy al reducir su concentración plasmática, inclusive en personas que presentan Hcy en rangos fisiológicos150. Debido a que los depósitos de ácido fólico en el organismo son escasos (~5-20 mgr), las entidades que aumentan su demanda en la dieta y/o que alteran su absorción en el yeyuno proximal, alteran los niveles de ácido fólico145 (Tabla 5). Tabla 5. Causas más habituales de la deficiencia de folatos Malabsorción Aumento de utilización Aumento de pérdida Esprue tropical Enteropatía por gluten Resección intestinal o gástrica amplia Enfermedades inflamatorias del intestino Enfermedad de Crohn Colitis ulcerativa Enteropatía diabética Embarazo Lactancia Prematuréz Alcoholismo Enfermedades hematológicas crónicas: anemia hemolítica, anemia falciforme y mielofibrosis Enfermedades oncológicas: neoplasias, linfomas, leucemia, mieloma múltiple Insuficiencia cardiaca congestiva Enfermedad hepática activa Hemodiálisis, diálisis peritoneal Alcoholismo Enfermedades inflamatorias crónicas que aumentan la demanda de folatos pero disminuyen el apetito (tuberculosis, enfermedad de Crohn, psoriasis, etc.) Tomada de: Maron BA, Loscalzo J. Annu Rev Med. 2009;60:39-54145. La vitamina B12 es fundamental para la actividad de la MS. Esta vitamina no se sintetiza de novo en los humanos, por ende, sus depósitos dependen exclusivamente del aporte de la dieta. A diferencia del acido fólico, la vitamina B12 se encuentra exclusivamente en la carne o en alimentos de origen animal, lo que torna a los vegetarianos estrictos al déficit de esta vitamina. La absorción de la vitamina B12 en el yeyuno distal requiere del factor intrínseco producido conjuntamente en el estómago con el ácido hidroclorhídrico. Por ello, los individuos que padecen aclorhidria, disminución del factor intrínseco, insuficiencia exocrina del páncreas, personas con historial de Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 93 enfermedad inflamatoria intestinal o cirugía gástrica, son más propensos al déficit de vitamina B12. Por este motivo, al menos en parte, las personas de la tercera edad son más susceptibles a la deficiencia de esta vitamina (Tabla 5). La disminución de la vitamina B12 altera la actividad de la MS e incrementa la Hcy, además de afectar el metabolismo del 5-MTHFR, favoreciendo el aumento del THF. No obstante, en estas circunstancias el THF no actúa eficazmente como precursor del 5MTHF. Incluso mediante el aporte de ácido fólico su efecto biológico no se traduce en la reducción de la Hcy esperada. Por esta razón la terapia de la HHcy debe incluir tanto ácido fólico, como vitamina B12. Esta combinación garantiza que los cofactores de la MS sean apropiados y se promueva el metabolismo del THF y la remetilación de la Hcy a Met145. La vitamina B6 es indispensable para la actividad enzimática de la CBS. La vitamina B6 se encuentra en todos los alimentos y se almacena en el hígado, lo que hace que esta deficiencia nutricional sea poco habitual. Sin embargo, los individuos con enfermedad hepática y estado nutricional precario (como sucede en los alcohólicos) son propensos al déficit de esta vitamina. Las manifestaciones clínicas de la deficiencia de vitamina B6 no se relacionan con HHcy aunque los estudios observacionales han reportado mayor riesgo de tromboembolismo venoso recurrente. En las enfermedades asociadas a deficiencia de 5MTHF y de vitaminas B6 y/o B12 coexiste HHcy, siendo el aporte de estos sustratos sus principales blancos terapéuticos145,150. 9.2.4 Factores ambientales La HHcy como FRECV constituye uno de los fenotipos de riesgo inherentes a los fumadores190. La HHcy yace como efecto aterogénico añadido a los efectos perniciosos del tabaco (tanto en fumadores activos como pasivos)198. Simultáneamente, el tabaquismo inhibe la eNOS199. Marco conceptual 94 9.2.5 Enfermedades asociadas a hiperhomocisteinemia En la tabla 6, se describen diversas patologías relacionadas con HHcy e incremento del riesgo cardiovascular200. Tabla 6. Entidades que cursan con incremento de homocisteína145,200 Enfermedades que causan déficit de ácido fólico y vitaminas del complejo B* Enfermedades digestivas Esprue tropical, enteropatía por gluten, resección intestinal o gástrica amplia, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enteropatía diabética, infección por Helicobacter Pylori Alteraciones hepáticas incluyendo la enfermedad hepática de origen alcohólico Complicaciones de la gestación Trombosis venosa profunda, aborto recurrente espontáneo, preeclampsia, abruptio placentae Afecciones neurológicas, psiquiátricas y neurodegenerativas201 Demencia, autismo, esquizofrenia, depresión, defectos del tubo neural Enfermedades sistémicas78,145,202 Diabetes mellitus, insuficiencia renal crónica, hipotiroidismo, neoplasias y leucemias, enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico, la artritis reumatoide y la psoriasis Síndromes genéticos145,150 Déficit de cistationa β sintasa (CBS), metionina sintasa (MS) y metionina sintasa reductasa (MSR) Polimorfismo C677T de la enzima 5,10 metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) Síndrome de Down203 Trasplante de órganos145,150 *En la tabla 6, se exponen las causas más frecuentes de deficiencia de folatos145. 9.2.6 Medicamentos asociados a hiperhomocisteinemia Diversos fármacos incrementan la concentración de Hcy. Al margen se describen algunos de ellos (Tabla 7). Tabla 7. Medicamentos que incrementan la homocisteína145,150, 200 Antifolatos Trimetoprim Antimetabolitos e inmunosupresores Sulfazalazina, metrotexate Anticonvulsivantes Fenitoína, carbamazepina, fenobarbital, ácido valpróico Metilxantinas191 Cafeína y otras metilxantinas Andrógenos Hipolipemiantes204 Ácido nicotínico, fibratos Antidiabéticos orales205 Metformina Antihipertensivos y diuréticos*206 Anestésicos Óxido nitroso207 *Algunos antihipertensivos y diuréticos aumentan la concentración de homocisteína, a diferencia de los bloqueantes de los receptores β adrenérgicos y de los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA) que la disminuyen.  Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 95 9.2.7 Otros factores relacionados con hiperhomocisteinemia El nexo existente entre el incremento de la concentración plasmática de Hcy y la iatrogenia secundaria al uso y abuso de medicamentos representa una causa frecuente y relevante de HHcy como FRECV202. 9.3 Valores de referencia de la homocisteína La tHcy depende del balance entre la producción y el metabolismo de la Hcy. La Hcy plasmática se encuentra en el 99% en su forma oxidada y el 1% en forma reducida. En el plasma humano existen una variedad de Hcy inestables: Hcy unida a proteínas, Hcy como compuestos disulfuro y Hcy como compuestos sulfhidrilo145. Aproximadamente el 80-90% de la Hcy plasmática se encuentra unida a las proteínas (bHcy), en particular a la albúmina (su mayor reservorio plasmático). La mitad de la bHcy está unida a las proteínas mediante puentes disulfuro y la otra mitad a través de enlaces amida (más estables). No obstante, cuando nos referimos al total de la sangre (no al plasma únicamente), esta proporción solo alcanza el 22%, ya que el mayor pool de Hcy (75%) está constituido por la hemoglobina. El 1% de la Hcy se encuentra en la grasa como Hcy libre (fHcy) u Hcy no unida a proteínas. El resto de la Hcy (10-20%) circula como compuestos intermedios de su metabolismo. El grupo sulfhidrilo (SH o tiol/thiol) de la Hcy se une mediante puentes disulfuro a otra Hcy formando homocistina (Hcy-S-S-Hcy), a la cisteína conformando disulfuros de homocisteína-cisteína (Hcy-S-S-Cys) y a otros grupos SH de diversas proteínas plasmáticas. La suma de los diferentes tipos de Hcy conforma lo que conocemos como tHcy. Las técnicas de laboratorio actualmente disponibles detectan en conjunto los diferentes tipos de Hcy, expresándola como tHcy en µmol/L. Según la opinión de los expertos73,150, el rango normal de tHcy oscila entre 5-15 µmol/L, aunque algunos autores consideran HHcy al rango de tHcy superior a 12 µmol/L145. Marco conceptual 96 tHcy = bHcy + fHcy, en donde: .tHcy es homocisteína (Hcy) plasmática total .bHcy es Hcy unida a proteínas .fHcy es Hcy libre (Hcy no unida a proteínas) En circunstancias fisiológicas existe equilibrio en la redistribución de la fHcy y la bHcy. Se desconoce el mecanismo mediante el cual la Hcy abandona la célula, si bien se ha descrito un sistema transportador para la Hcy. El grupo amino de la Hcy-T posee una constante pK (constante de equilibrio) inusualmente baja (~7.1) que le permite reaccionar a pH (pondus hydrogenii/potentia hydrogenii) fisiológico como molécula neutra y rebasar libremente la membrana celular. Los riñones son responsables del aclaramiento de más del 70% de la Hcy, siendo la función renal determinante esencial de su concentración plasmática. Existe relación directa entre la concentración de creatinina sérica y la tHcy tanto en personas sanas, como en individuos con ECV178. 9.4 Homocisteína y estrés oxidativo 9.4.1 Especies reactivas de oxígeno y especies reactivas de nitrógeno La HHcy estimula la NADPH oxidasa y la iNOS aumentando la producción de radicales superóxido en los vasos sanguíneos (arterias coronarias). La HHcy moderada altera la función de las enzimas antioxidantes intracelulares como la superóxido dismutasa y la glutatión peroxidasa. La autooxidación de Hcy hacia homocistina y la oxidación de Hcy a Hcy-T generan ROS, contribuyendo a explicar la toxicidad vascular de la Hcy. La HHcy aumenta la ADMA y por ende las ROS. Adicionalmente, la HHcy promueve falta de acoplamiento enzimático de la eNOS. Todos estos factores incrementan la producción de radicales superóxido, los cuales reaccionan con el NO˙ para formar radicales peroxinitrito y Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 103 Alteración del potencial de metilación a nivel celular y de la expresión génica mediante la hipermetilación del promotor de varios genes proaterogénicos. c. Aumento de la expresión de diversas moléculas proaterogénicas en las células del endotelio vascular145,150 (Figuras 25 y 28). 3. Una tercera explicación planteada se deriva de la acción de los folatos sobre la síntesis de la timidina, al estimular la proliferación de las células en la neoíntima de los vasos sanguíneos, acelerando el proceso aterosclerótico en individuos con ATS preexistente150. Este hecho obedece a que los folatos son esenciales para la síntesis del DNA y la proliferación celular145,150. Como consecuencia de esta particularidad, se ha reportado incremento no significativo en la incidencia de neoplasias en relación con la intervención con folatos para reducir la Hcy160,161,213. 4. Se presume que algunas especies altamente reactivas derivadas de la oxidación de la Hcy (como los enlaces no protéicos) pudiesen ser mejores indicadores de la estimación del riesgo cardiovascular que la Hcy per se. La oxidación de la Hcy puede derivar en la formación de grupos disulfuro unidos a la propia Hcy o favorecer su unión a otros grupos SH aumentando las ROS, alterando la señalización redox y la función antioxidante de ciertas enzimas145, como la glutatión peroxidasa 1. Se ha inferido que derivado de estos hechos se altera el fenotipo de las células del endotelio vascular. Existe evidencia científica de que la Hcy-T y la N-Hcy-p constituyen procesos afines a la toxicidad de la Hcy en el endotelio vascular humano17,214 (Figura 30). Es perentorio esclarecer si las especies reactivas derivadas de la oxidación de la Hcy, son mejores indicadores del riesgo cardiovascular que la Hcy misma145. Marco conceptual 104 Figura 30. Auto-oxidación de la homocisteína. Margen superior. Bajo condiciones de oxidación como sucede en el plasma, la homocisteína (Hcy) “sufre” un proceso de autooxidación formando homocistina (Hcy-SS-Hcy) y/o Hcy unida a otros grupos disulfuro. En condiciones de acidificación, la Hcy forma homocisteína tiolactona (Hcy-T). Los radicales hidroxilo (OHˉ, OH˙) y el anión superóxido (O2˙ˉ), son productos generados en estas reacciones que luego se convierten en peróxido de hidrógeno (H2O2) por acción de la superóxido dismutasa (SOD). La Hcy favorece el estrés oxidativo alterando la expresión de la glutatión peroxidasa 1 (Gpx1), una enzima antioxidante que convierte el H2O2 en agua (H2O). Margen inferior. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) formadas por la Hcy alteran la biodisponibilidad de óxido nítrico (NO˙) ya que: 1. Disminuyen los cofactores esenciales de las sintasas del óxido nítrico (NOS) como la tetrahidrobiopterina (BH4). 2. Convierten el NO˙ en peroxinitrito (ONOOˉ) provocando muerte celular. eNOS (sintasa endotelial del óxido nítrico); oxidación (pérdida de electrones o incremento del estado oxidativo de una molécula, átomo o ión); reducción (ganancia de electrones o disminución del estado oxidativo de una molécula, átomo o ión). H (hidrógeno); C (carbono); O (oxígeno); N (nitrógeno); R-SH (compuestos que contienen grupo sulfhidrilo (SH/tiol o thiol); S (azufre); HCl (cloruro de hidrógeno). Gráfica adaptada de: Maron BA, Loscalzo J. Annu Rev Med. 2009;60:39-54145. Imagen en aguada (microfotografía de la célula del endotelio vascular) reproducida de: Badimón L. Protección Vascular. El Endotelio como Diana Terapéutica. X Reunión del Grupo de Trombosis Cardiovascular de la Sociedad Española de Cardiología. http:// www.gtcv.org/. 5. El aporte de ácido fólico disminuye gradualmente la concentración de Hcy y los autoanticuerpos contra las N-Hcy-p en las personas sanas215 (controles), a diferencia de los individuos con EC en quienes este efecto no se consigue216. Estos hallazgos sugieren que una vez formados los antígenos (N-Hcy-p) se promueve la respuesta del anticuerpo. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 105 Luego, el daño crónico causado a las proteínas por la N-Hcy-p no revierte fácilmente en los pacientes con EC146. En las personas con EC y ACV el análisis de los autoanticuerpos contra las N-Hcy-p revelan que la autoinmunidad promovida por la Hcy es refractaria al aporte de ácido fólico en los individuos con ATS establecida215,216. Por consiguiente, aunque la intervención con folatos sea beneficiosa en prevención primaria, esta medida resulta ineficaz en la prevención secundaria de las ECV150,161. Todos los mecanismos enunciados con antelación explicarían al menos en parte el fracaso de la terapia con folatos en la prevención del riesgo cardiovascular en los estudios clínicos de intervención que pretenden reducir la Hcy plasmática150. Como consecuencia de estos hechos la evidencia actual no avala la terapia farmacológica con folatos en la población general211,212. Según los expertos, se recomienda el aporte de folatos y de vitaminas B6 y B 12 en presencia de HHcy moderada/severa, ya que esta condición promueve la ATB145,150. Persiste incertidumbre respecto a la indicación del aporte de folatos en los individuos con HHcy leve/moderada. El debate alusivo al beneficio de dicha pauta en la prevención primaria y secundaria de las ECV en personas con Hcy plasmática en rango fisiológico, sigue abierto. Algunos autores150 insisten en que el tratamiento con bajas dosis de folatos disminuye el riesgo cardiovascular, si bien subrayan que es improbable que los folatos (a dosis altas) logren efectos beneficiosos aditivos en individuos que presentan Hcy en rangos normales. La HHcy en presencia del genotipo C677T MTHFR debe tratarse con 5-MTHF por vía oral, ya que este compuesto no precisa reconversión por parte de la enzima MTHFR. Los individuos con HHcy severa que no responden a las pautas adecuada de folatos requieren restricción de Met en la dieta y suplemento de cisteína. Las personas que no responden a la vitamina B6 necesitan adicionalmente ácido fólico y vitamina B12, ya que estas vitaminas son cofactores esenciales en el metabolismo de la Met. También se ha utilizado como Marco conceptual 106 terapia coadyuvante los donantes de grupos metil (como la betaína, la colina y la creatina), ya que promueven la remetilación de la Hcy a Met145,150. Existe consenso en que se requieren estudios adicionales que aporten resultados más categóricos al evaluar la intervención de los folatos sobre la concentración de Hcy, y las ECV150,212. Se ha subrayado la necesidad de realizar estudios clínicos a mayor escala en la población general que evalúen los efectos del tratamiento con bajas dosis de folatos en relación con el riesgo cardiovascular150. Aunque no existe suficiente información que ratifique la bondad del tratamiento de la HHcy moderada frente al riesgo cardiovascular, existe anuencia general en que las estrategias que disminuyan la concentración de Hcy (causa dependiente), no son perjudiciales. Asimismo, se ha estipulado que las estrategias que favorecen la eliminación renal de Hcy, reducen la concentración de ADMA y aumenten la concentración intracelular de 5-MTHF (al optimizar el metabolismo intracelular de la Hcy) constituyen blancos terapéuticos prometedores. 10. Enfermedad vascular mediada por la homocisteína tiolactona En el interior de las células tras un error de edición durante la síntesis protéica, cuando se selecciona equívocamente Hcy en lugar de Met, mediante ciertas aminoaciltRNA sintasas (MetRS), se genera Hcy-T146 (Figura 31). La incorporación de Hcy a través de las MetRS representa un mecanismo de protección celular frente a la incorporación de aminoácidos desconocidos a las proteínas. Sin embargo, el coste metabólico de este proceso para el organismo es la síntesis de Hcy-T. Un compuesto altamente reactivo y tóxico para las células que altera la estructura y la función protéica mediante la Hcy-p175. Un factor preservador en este sentido, lo constituye la mayor afinidad de las MetRS hacia la Met, que hacia la Hcy (relación 100:1). Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 107 El proceso de edición de Hcy requiere ATP. Por consiguiente, la HHcy implica un elevado coste energético, promoviendo un efecto proapoptótico de tipo oxidativo en las células. Figura 31. Incorporación de homocisteína a las proteínas. Mecanismo a través del cual la homocisteína (Hcy) se adhiere a las proteínas en los lugares usualmente ocupados por metionina (Met). NO˙ (óxido nítrico); MetRS (aminoacil-tRNA sintasas); tRNA (RNA de transferencia); RNA (ácido ribonucléico); R-SH (compuestos que contienen grupo sulfhidrilo (SH/tiol o thiol); R-S-NO˙ (S-nitrosotiol); S (azufre); Hcy-T (homocisteína tiolactona); H (hidrógeno); C (carbono); O (oxígeno). Modificada de: Bełtowski J. Postepy Hig Med Dosw (online). 2005;59:392-404175 y Masella R, et al. Glutathione and sulfur amino acids in human health and disease. 2009176. El NO˙ en proporciones fisiológicas neutraliza la Hcy, formando S-nitrosohomocisteína (S-nitroso-Hcy), la cual actúa sobre las plaquetas, generando una acción antitrombótica. La Hcy se involucra erróneamente durante la síntesis protéica exclusivamente si la Hcy se transforma mediante el proceso de nitrosación hacia S-nitrosoHcy, uno de los nitrosotioles más estables del plasma. Este proceso se genera en presencia de altas concentraciones de NO˙ y de RNS. La S-nitroso-Hcy no se edita hacia Hcy-T. El 50% de la incorporación de Hcy a las proteínas se produce por esta vía y la otra mitad, se genera como consecuencia de la elevada reactividad de la Hcy-T18,19,146 (Figuras Marco conceptual 108 31 y 32). La hipótesis de la Hcy-T propuesta por Jakubowski217 en 1997, establece que la conversión de Hcy a Hcy-T favorece la toxicidad de la Hcy originando cambios proaterogénicos en el endotelio vascular. La Hcy-T es más tóxica a las células que la Hcy per se. El perfilamiento de las técnicas de alta sensibilidad en química e inmunohistoquímica ha permitido contrastar esta hipótesis en la fisiopatología del sistema vascular, particularmente en aquellas entidades que predisponen a la aterogénesis, como la HHcy (Figura 33). Figura 32. Formación de homocisteína tiolactona. En el interior de las células, tras un error de edición durante la síntesis protéica, al seleccionar erróneamente homocisteína (Hcy) en lugar de Metionina (Met), mediante ciertas aminoacil-tRNA sintasas (MetRS) se genera homocisteína tiolactona (Hcy-T). Esta vía requiere de la participación de ATP (adenosintrifosfato) formando Hcy-AMP. La Hcy captada erróneamente durante la activación de los aminoácidos no se transfiere al tRNA y se transforma en Hcy-T. PPi (pirofosfato inorgánico); SH (grupo sulfhidrilo/tiol o thiol); AMP (monofosfato de adenosina); S (azufre); H (hidrógeno); NH2 (grupo amino); C (carbono); O (oxígeno). Modificada de: Jakubowski H. J Physiol Pharmacol. 2008;59(Suppl 9):155-167146. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 109 Figura 33. Hipótesis fisiopatológica de la enfermedad vascular mediada por la homocisteína tiolactona. Hcy-T (homocisteína tiolactona); 5,10-MTHF (5,10-metiltetrahidrofolato); THF (tetrahidrofolato); MTHFR (metilentetrahidrofolato reductasa); 5-MTHF (5-metiltetrahidrofolato); MS (metionina sintasa); B12 (cianocobalamina); Met (metionina); Hcy (homocisteína); CBS (cistationa β sintasa); B6 (piridoxina); Cys (cisteína); MetRS (aminoacil-tRNA sintasas); BLH (bleomicina hidrolasa); paraoxonasa 1 (PON1); N-Hcy-p (Nhomocisteinilización de las proteínas). Modificada de: Jakubowski H. J Physiol Pharmacol. 2008;59 (Suppl 9):155-167146. 10.1 Homocisteinilización de las proteínas La Hcy-p es el proceso químico mediante el cual la Hcy se une a las proteínas. Este fenómeno ha sido estudiado fundamentalmente in vitro. Se desconoce su relevancia en estudios in vivo. La Hcy-T posee un grupo de enlace SH de alta energía. Este grupo sulfidrilo le confiere gran reactividad y capacidad para alquilar o acilar diferentes aminoácidos (en especial la lisina y la cisteína) mediante el proceso de Hcy-p146 (Figuras 34 y 35).  Marco conceptual 110 Figura 34. N-homocisteinilización de las proteínas (N-Hcy-p). La homocisteína (Hcy) se une a las proteínas (p), mediante el proceso de homocisteinilización (Hcy-p). La magnitud de la Hcy-p depende fundamentalmente de la producción de homocisteína tiolactona (Hcy-T). La hiperhomocisteinemia (HHcy) aumenta la producción de Hcy-T, mientras que la metionina (Met) la disminuye. La Hcy formada a partir del ciclo de la Met (Figura 34), se metaboliza por la vía SAM/SAH (S-adenosil-metionina/S-adenosil-homocisteína). tRNA (RNA de transferencia): ácido ribonucléico (RNA) encargado de transportar los aminoácidos a los ribosomas y ordenarlos a lo largo de la molécula del mRNA (RNA mensajero), a la cual se unen por medio de enlaces peptídicos para formar proteínas durante la síntesis protéica; NH2 (grupo amino); S (azufre); C (carbono); O (oxígeno); H (hidrógeno); N-Hcy-p (N-homocisteína unida a proteínas). El proceso de Hcy-p se produce de diferentes modos: cuando la homocisteinilización de las proteínas se realiza a nivel de los enlaces isopeptidicos que contienen residuos de cisteína, nos referimos a la S-homocisteinilización de las proteínas. De otro lado, hacemos alusión a la N-Hcy-p, cuando dicho proceso modifica los enlaces isopeptidicos de las proteínas que contienen residuos de lisina (Figura 35). La incorporación de Hcy a las proteínas durante la Hcy-p se establece mediante puentes disulfuro en la S-Hcy-p, mientras que en la N-Hcy-p, se efectúa mediante enlaces amida (más estables). Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 111 Figura 35. Estructura de las proteínas S/N homocisteiniladas. Margen superior y centro. En las proteínas S-homocisteiniladas (S-Hcy-p) el grupo sulfhidrilo (grupo SH o tiol/thiol) de la homocisteína (Hcy) se une mediante puentes disulfuro a nivel del residuo de cisteína de la proteína. En las proteínas N-homocisteiniladas (N-Hcy-p) el grupo carboxilo de la Hcy se une mediante enlaces amida a la cadena lateral del grupo amino (NH2) a nivel del residuo de lisina de la proteína. El óvalo representa las proteínas. N (nitrógeno); H (hidrógeno); S (azufre); C (carbono); O (oxígeno); Hcy-T (homocisteína tiolactona); CH2 (grupo funcional metileno o meteno). Modificada de: Jakubowski H. J Biol Chem. 2000;275:3957-3962218. Margen inferior. Reacción de la Hcy-T (matizada en rojo) con los grupos amino ε (NH2), a nivel de los residuos de lisina de las proteínas. Modificada de: Bełtowski J. Postepy Hig Med Dosw (online). 2005;59:392-404175. 10.2 Metabolismo de la homocisteína a través de la homocisteína tiolactona La Hcy-T se genera en el interior de las células y su concentración plasmática oscila entre 0 y 35 nM, lo que representa ~0.002-0.29% de la tHcy. La Hcy-T se une a las proteínas a pH y temperatura fisiológicas. A diferencia de la eliminación de Hcy (~0.1-0.3% respecto a la creatinina), el aclaramiento renal de Hcy-T puede incrementarse ~20-700%. En estudios in vitro se ha demostrado que la formación de Hcy-T y de N-Hcy-p, es Marco conceptual 112 directamente proporcional a la tHcy e inversamente proporcional a la concentración de Met. En la HHcy se encuentra aumento en la concentración plasmática de Hcy-T. En los humanos, tanto la Hcy-T, como la N-Hcy-p se correlacionan con la tHcy. La alteración genética de diferentes enzimas (MTHFR, MS, CBS), el aporte insuficiente de 5-MTHF y los fármacos antifolatos, al interferir con las reacciones de remetilación y/o de transulfuración de la Hcy favorecen su metabolismo hacia Hcy-T, aumentando los niveles de Hcy-T y de N-Hcy-p. Por el contrario, el aporte de acido fólico (al reducir la relación Hcy/Met), reduce ambos compuestos. Adicionalmente, la actividad homocisteína tiolactonasa (HTasa) de la PON1, disminuye la concentración de N-Hcy-p (Figura 24). Este hecho es particularmente relevante, ya que diferentes estudios in vitro, sugieren que en determinadas situaciones fisiológicas la N-Hcy-p esta mediada por la conversión metabólica de la Hcy en su correspondiente lactona146. Luego, la detoxificación de Hcy-T constituye un mecanismo vital para el organismo218. La actividad enzimática de la hidrólisis de esta lactona es competencia de la enzima PON146. Jakubowski y cols.20, demostraron que la actividad de la hidrólisis de la Hcy-T difiere en virtud de los polimorfismos del gen PON1. Estas variantes génicas afectan la función de la enzima PON1219, incluyendo su actividad HTasa220 (Figura 33). Se conocen dos enzimas con capacidad para hidrolizar la Hcy-T: 1. A nivel extracelular, la actividad HTasa de la enzima PON1220,221. 2. A nivel intracelular, la actividad HTasa/bleomicina hidrolasa (BLH)222. La BLH, denominada así por su capacidad para hidrolizar la bleomicina, fue estudiada inicialmente en el contexto de la terapia antineoplásica. En los estudios in vitro, la actividad HTasa de la PON1 protege al organismo contra la N-Hcy-p146 (Figura 33). En modelos experimentales murinos, la HHcy disminuye la expresión de la PON1. En los humanos, la HHcy altera la actividad HTasa de la PON1221 y favorece el desarrollo de las ECV220-222. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 119 G), 832/824 (A o G), 162/160 (A o G), 126 (C o G), 162 y 108/107 (C o T) del promotor del gen PON1230,232. De otro lado, se ha descrito la existencia de desequilibrio de ligamiento entre los polimorfismos de la región del promotor y la región codificante del gen PON1. Brophy y cols.230, han reportado desequilibrio de ligamiento entre la variante 107 y el polimorfismo de la región codificante R192 y su relación con la EC. La relación existente entre los polimorfismos de la región del promotor del gen PON1 y la presencia de EC ha sido contradictoria91,92. Recientemente Mackness y cols.91, reportaron que los polimorfismos de la región del promotor del gen PON1 influyen en el status (estado) de la enzima PON1 y que a su vez el status de la enzima PON1 es menor en los individuos con EC. Los autores concluyen que la disminución de la actividad PON1 (más que los polimorfismos de la región del promotor del gen) está relacionada con la EC. 11.1.4 Polimorfismos de la región codificante del gen PON1 y enfermedad coronaria Varios estudios poblacionales han evaluado la relación entre los polimorfismos Q192R y Met55Leu del gen PON1 y la EC92. Sin embargo, los resultados han sido discordantes90,92. La relación entre la variante Q192R del gen PON1 y la EC ha sido evaluada en extensos metaanálisis publicados antes del año 2011, no hallando asociación significativa entre el alelo 192R y la presencia de EC233. De forma análoga, otros dos amplios metaanálisis realizados independientemente, no encontraron relación entre la variante Q192R y EC234,235. Tampoco se halló relación entre los polimorfismos Met55Leu y 108/107(C o T) PON1 y la EC en los primeros metaanálisis realizados234. Algunos estudios epidemiológicos han señalado relación entre los polimorfismos del gen PON y el desarrollo de ECV. Regieli y cols.126, observaron que los portadores de glutamina (alelo Q) en el codón 192 y de Met (Alelo M) en el codón 55 del gen PON1 (alelos con baja actividad PON) presentaron mayor riesgo de muerte por EC. Estos autores señalaron que las variaciones genéticas con mayor actividad PON1 influyen en el riesgo estimado a 10 años de padecer complicaciones letales por EC, lo que deja en Marco conceptual 120 evidencia la relevancia de la actividad PON1 en la génesis de la enfermedad vascular. Tang y cols.236, reportaron que la disminución de la actividad sérica (arilesterasa) de la enzima PON1 permite evaluar y reclasificar el riesgo cardiovascular de padecer eventos cardiovasculares mayores (MACE/major adverse cardiovascular events): IAM, ACV o muerte Un metaanálisis más reciente (publicado en 2012) compiló 47 estudios (9853 individuos con EC y 11.408 controles) hallando relación entre la disminución de la actividad PON1 y el riesgo de padecer EC237. Otro meta análisis (que incluyó 43 estudios y 20.629 enfermos) publicado el mismo año mostró resultados análogos238. En sendos metaanálisis, se evidenció incremento del riesgo de EC en los individuos con menor actividad PON1 con independencia de la edad y del grupo étnico237,238. En la tabla 9 se resumen los hallazgos de los estudios de la enzima PON1 y su nexo con las ECV. Tabla 9. PON1 humana y su relación con las enfermedades cardiovasculares La disminución de la actividad de la enzima PON1 se relaciona con el riesgo de padecer enfermedad coronaria Algunos estudios evidencian que la presencia del alelo R del polimorfismo Gln192Arg PON1 incrementa el riesgo de padecer aterosclerosis y enfermedad coronaria No existe certeza acerca de la correlación entre los polimorfismos M55L y 108/107 PON1 (C o T) y la enfermedad coronaria, ya que los resultados de los estudios son inconsistentes El alelo 192R PON1 incrementa discretamente el riego de presentar ACV No hay evidencia suficiente que relacione el polimorfismo M55L PON1 y el riesgo de presentar ACV PON1 (paraoxonasa 1); enfermedades cardiovasculares (ECV); R (arginina); M (metionina); L (leucina); 55 leucina); C (citosina); T (timina); ACV (accidente cerebrovascular). Modificada de: Litvinov D, et al. Am J Med Sci. 2012;4(11):523-53292. Se ha sugerido que la incongruencia encontrada en los resultados de los estudios de la enzima PON1 obedece a: 1. Escaso número de pacientes de diferentes poblaciones y/o falta de estandarización de la metodología. 2. Diversidad de los sustratos empleados en la determinación enzimática de la PON. 3. Diferencias en los métodos empleados en la genotipación, lo cual dificulta la interpretación de los resultados. Pese a la versatilidad de los resultados de los estudios de la PON1 se ha insistido en que la diferencia individual entre la actividad y la concentración de la enzima PON1 desempeña una función relevante en su protección frente a la EC. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 121 Se han propuesto diversos métodos para optimizar el estudio de la PON1240: 1. Se aduce que la información que proporciona el haplotipo clarificaría la influencia genética de la actividad de la PON1. 2. La bioinformática de alto rendimiento ha permitido reconstruir los haplotipos y estimar su frecuencia en poblaciones no relacionadas entre sí, basándose en la información que proporcionan los SNPs. 3. Se ha estimado la máxima probabilidad de la ocurrencia de un evento mediante el algoritmo Bayesiano. Este algoritmo es el método más ampliamente difundido hacia la aproximación en la inferencia de los haplotipos. 4. El Phase (software for haplotype reconstruction, and recombination rate estimation from population data) y el tagging SNPs (tagSNPs), son dos programas bioinformáticos desarrollados para inferir los haplotipos de los cinco SNPs más comunes del gen PON1 y evaluar su asociación con la actividad de la enzima PON1. Estos programas estadísticos minimizan la probabilidad de error en la reconstrucción de los haplotipos. 5. Se ha subrayado la relevancia de la estimación conjunta de los factores que regulan tanto la actividad, como la concentración de la enzima PON1. El denominado status de la enzima PON1239. 11.1.5 Actividad de la enzima PON1 La PON1 [EC 3.1.1.2] es una glucoproteína de síntesis esencialmente hepática, aunque se encuentra ampliamente distribuida en otros órganos como el riñón y el intestino90. La secuencia de sus aminoácidos es indispensable para lograr su acoplamiento a las HDL241. La PON1 se transporta acoplada a las HDL, especialmente a una subclase de HDL que transporta apoA-I241, 242. La actividad de la PON1 se consolida en presencia de la apoA-1 estimulando selectivamente la actividad lipolactonasa243. La disminución de las HDL y de la apoA-I estan relacionadas con menor actividad PON1244. Experimentalmente la apoA-I capta los hidroperóxidos de las LDL e inhibe la respuesta inflamatoria responsable de la formación de la estría grasa y de las lesiones ateroscleróticas70,71. La Marco conceptual 122 actividad antioxidante de las HDL se realiza en gran medida merced a la enzima PON121,245. Clásicamente se ha descrito la PON1 como una enzima paraoxonasa/arilesterasa246, aunque la PON1 es en realidad una lactonasa, siendo las lactonas lipofilicas su esencia primaria88. La PON1 hidroliza tiolactonas como la Hcy-T20. La PON1 favorece las propiedades antioxidantes de las HDL, ya que: 1. Disminuye la oxidación de las LDL227,247 y de los ésteres de colesterol peroxidados mediante la hidrólisis de los fosfolípidos. 2. Reduce la acumulación de las LDL en la pared de los vasos sanguíneos. 3. Incrementa la movilización del colesterol por parte de los macrófagos, a través de la actividad quimiotáctica de los monocitos. 4. Destruye las moléculas proinflamatorias involucradas en la aterogénesis248,249. 5. Metaboliza algunos lípidos oxidados, derivados del ácido araquidónico y del ácido decosahexanoico (Figura 37). A más de las evidencias precedentes, el nexo más convincente entre la actividad PON1 y la EC proviene de los estudios realizados en ratones trasgénicos250-252: 1. Los ratones KO PON1-/- sometidos a dietas aterogénicas desarrollan ATS. 2. El ratón DKO apoE/PON1-/- presenta ATS más severa que el ratón apoE-/-. Este hallazgo señala que la PON1 protege contra la aterogénesis251. 3. El aumento de la expresión del gen PON1 protege frente la ATS, tanto en el ratón silvestre, como en el ratón ApoE-/-252. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 123 Figura 37. Metabolismo de las HDL, función protectora frente a la oxidación de las LDL e interrelación con la enzima PON1. El potencial antiaterogénico de la enzima paraoxonasa 1(PON1) está dado por su capacidad para hidrolizar lípidos oxidados, fosfolípidos y ésteres de colesterol peroxidados (CEOOH),limitando su acopio en las lipoproteínas de baja densidad (LDL)94. Navab y cols.70, presentaron evidencia experimental del mecanismo de sembrado (seeding) de las LDL. Se presume que la PON1 interfiere en el proceso de seeding de las LDL (la primera de las tres fases implicadas en la oxidación de las LDL)70. La actividad de la enzima PON1 se restringe a una subclase de lipoproteínas de alta densidad (HDL) que transporta apolipoproteína A-1 (apoA-I)242. A su vez las HDL requieren de apoA-I para lograr estabilidad enzimática243. El gen CLA-1 (CD36 and Lysosomal integral membrana protein-II analogous-1/ LIMP II analogous-1), es el homólogo humano del gen SR-B1 (Scavenger Receptor class B type 1) y constituye el primer receptor de alta afinidad de las HDL bien caracterizado. El receptor CLA-1 participa en el transporte inverso de colesterol (TRC) mediante la entrada selectiva de ésteres de colesterol (CE) nativos y oxidados. En los humanos, el gen CLA-1 es polimórfico y algunas de sus variantes se asocian a cambios fenotípicos en las lipoproteínas plasmáticas. Ambos genes participan en el complejo metabolismo de las HDL y en los mecanismos de defensa antioxidantes72. El TRC se refleja con mayor detalle en la figura 23 52. PAF-AH (acetilhidrolasa del factor activador de las plaquetas); PAF (factor activador de plaquetas); CEOH (hidróxidos de ésteres de colesterol); HPODE (ácido 13-hidroperoxioctadecadienoico); HPETE (ácido hidroperoxieicosatetraenoico); COOH (ácido carboxílico). Reproducida de: Rodríguez F, et al. Rev Esp Cardiol. 2006;59:154-6470. 11.1.6 Determinantes de la expresión del gen PON1 Existe amplia variación individual y racial en la concentración y la actividad de la enzima PON1 en los humanos. Esto sucede igualmente entre las personas de un mismo genotipo. Pese a ello, ambos parámetros permanecen relativamente constantes en cada Marco conceptual 124 persona a lo largo de la vida223. Concurren varios factores de transcripción y diferentes vías que regulan la expresión del gen PON192 (Figura 38). Algunas diferencias en la actividad y la concentración de la enzima PON1 son atribuibles a los polimorfismos en la región codificadora del gen PON1 (Q192R y Met55L). La variabilidad en la concentración de la PON1 obedece adicionalmente, al menos en parte, a las variantes en la región reguladora 5’ del promotor del gen PON1 (T-108). Además de los polimorfismos génicos, la actividad PON1 se modifica como consecuencia de otros determinantes no genéticos (aún no identificados) los cuales contribuyen a explicar las diferencias individuales observadas en el estado de la enzima PON190,92 (Tabla 10 y figura 38). Las estrategias que incrementan la actividad de la enzima PON1 en las personas con alto riesgo de padecer EC, previenen o retardan el inicio de la EC91. Tabla 10. Factores que determinan la expresión de la enzima paraoxonasa 190,92 Determinantes genéticos Polimorfismos de la región codificante del gen PON1: Gln192Arg y Met55Leu Polimorfismos de la región reguladora 5’ del promotor del gen PON1: 909/907, 832/824, 126, 162 y 108/107 Determinantes no genéticos asociados a disminución de la actividad de la enzima PON1 Dieta proaterogénica(1) Hábitos de vida: tabaquismo(2) Envejecimiento(3) Procesos patológicos: obesidad y síndrome metabólico, hipertensión arterial, diabetes mellitus, nefropatía diabética, cirrosis hepática de origen etílico, hepatitis C, infección por el virus de la inmunodeficiencia adquirida, alteraciones neurológicas (esclerosis lateral amiotrófica), estados de ansiedad, insuficiencia renal crónica, enfermedad carotidea, preeclampsia, “Síndrome de la Guerra del Golfo” Determinantes no genéticos asociados a incremento de la actividad de la PON1 Dieta cardiosaludable: ácido oleico, aceite de oliva, vitaminas antioxidantes (C y E), polifenoles(4) Agentes farmacológicos: estatinas, fenofibratos, polifenoles dietéticos ⁴ (resveratrol, quercetin) Ingesta moderada de alcohol(5) Ácido acetil salicílico (ASA) y los productos derivados de la hidrólisis del ASA (salicilatos) Factores aún no identificados Trans-acting factors y algunas variantes exónicas e intrónicas en el secuenciamiento de las bases de los nucleótidos en la región reguladora 5’ y 3’ del gen PON1 PON1 (paraoxonasa 1); (1)Se asocia a disminución de las lipoproteínas de alta densidad (HDL); (2)Disminuye la concentración y la actividad de la PON1; (3)El polimorfismo Q192R PON1 parece ser determinante de la perdida de la actividad enzimática durante el proceso de envejecimiento. Los homocigotos QQ desarrollan perdida adicional de la actividad PON1 en este proceso; (4)Los polifenoles además de aumentar la expresión del gen PON1 y la actividad de la PON1 poseen actividad antioxidante y antiinflamatoria, disminuyendo los triglicéridos y las lipoproteínas de baja densidad (LDL) in vivo; (5)Incrementa la concentración y actividad de la PON1, las HDL y la apolipoproteína A1 (apo-A1). Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 125 Figura 38. Determinantes de la regulación transcripcional del gen PON1. Los procesos reflejados en la gráfica acontecen en el hígado, aunque se presume que en el íleon los ácidos biliares estimulan la síntesis del factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF-19 en los humanos y FGF-15 en los ratones). El PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) y la hiperglicemia estimulan el factor de transcripción Sp1 (Spcificity Protein 1) a través de la PKC (protein kinase C) y de la MAPK (p44/p42 mitogen-activated protein kinase). Las estatinas favorecen la transcripción del gen PON1 al activar el factor Sp1. Las estatinas además estimulan la MAPK y el SREBP-2 (sterol regulatory element binding protein 2) aumentando la transcripción del gen PON1. Los polifenoles, la aspirina y los ligandos artificiales del receptor AhR (aryl hydrocarbon receptor) activan el AhR y la transcripción del gen PON1. El c-Jun es otro factor de transcripción involucrado en la expresión del gen PON1. La acción del c-Jun está regulada por la JNK (c-Jun N-terminal kinase). Asimismo, la berberina (benzyl tetrahydroxyquinoline), un alcaloide que reduce el colesterol, activa la JNK y el c-Jun, favoreciendo la transcripción del gen PON1 en las células hepáticas. Sin embargo, la activación de la vía JNK/c-Jun por parte de los ácidos biliares, ejerce el efecto contrario, suprimiendo la expresión del gen PON1 en el hígado. La activación del receptor FXR (farnesoid X receptor) por los ácidos biliares, promueve la expresión de FGF-19 y FGF-15, inhibiendo la expresión del gen PON1. El factor del crecimiento estimula el FGFR4 (fibroblast growth factor receptor 4), con la consecuente activación de la JNK, además de la fosforilación del c-Jun. Contrariamente a lo que sucede con el estímulo del c-Jun por la berberina, la vía FXR/FGF-19/FGFR4/JNK/cJun, inhibe la transcripción del gen PON1. Tanto el FXR, como el FGFR4 son indispensables en esta vía transcripcional. El c-jun es un gen que codifica la proteína c-Jun, la cual, tras combinarse con la proteína c-Fos, conforma el factor de transcripción AP-1. Su activación se produce mediante doble fosforilación a través de la ruta JNK, aunque también se ha descrito una función alternativa independiente de la fosforilación. Se ha podido comprobar que el modelo knockout de c-jun es letal, a diferencia de los animales transgénicos cuyo gen c-jun había sido mutado para evitar la fosforilación de la proteína c-Jun (c-JunAA). La proteína c-Jun reconoce de un modo directo secuencias específicas del DNA para regular su expresión. El gen c-jun no posee intrones y se encuentra en una región cromosómica implicada en procesos de traslocaciones y deleciones en diversas patologías humanas. Adaptada de: Litvinov D, et al. Am J Med Sci. 2012;4(11):523-53292. Marco conceptual 126 11.2 Paraoxonasa 2 11.2.1 Gen PON2 El gen PON2 es el segundo miembro del clúster PON. 11.2.2 Polimorfismos del gen PON2 Se han identificado dos polimorfismos del gen PON2: glicina 148 alanina (Gly148Ala/G148A) y cisteína 311 serina (Cys311Ser/C311S). A este último polimorfismo también se le denomina variante Ser311Ser PON2 [rs7493]253. La variante en la posición 148 (G148A) se asocia a: concentración de colesterol; niveles de glicemia; nefropatía en pacientes con DM tipo 2 y peso al momento del nacimiento. Estos hallazgos sugieren que dicho polimorfismo se relaciona con una importante actividad metabólica254. De otro lado, la variante Cys311Ser se relaciona con: engrosamiento de la pared arterial; retinopatía diabética; DM tipo 2; ACV e hipercolesterolemia familiar heterocigótica255. 11.2.3 Actividad de la enzima PON2 El análisis de la enzima PON2 es más complejo, ya que a diferencia de las enzimas PON1 y PON3 (las cuales se encuentra acopladas en el plasma a las HDL), la PON2 ejerce su actividad antioxidante exclusivamente a nivel intracelular256. Existe poca información disponible referente a la enzima PON2. Los análisis filogenéticos sugieren que la PON2 es la enzima más antigua, además de poseer la mayor actividad lactonasa de los miembros de la familia PON. El mRNA (RNA mensajero) de la PON2 se expresa de forma ubicua en los tejidos de los mamíferos, aunque su expresión es predominantemente testicular, placentaria, hepática, pulmonar y cardíaca. Se desconoce la acción fisiológica de la enzima PON2255, aunque se expresa en las células endoteliales y en las VSMC de la aorta en los humanos257. Se vienen atribuyendo diferentes propiedades antiaterogénicas a la PON2: 1. Disminución del estrés oxidativo y de la oxidación de las LDL (al igual que la PON1 y la PON3). 2. Reducción del depósito de triglicéridos en los macrófagos. 3. Disminución de la quimiotaxis sobre los monocitos. 4. Protección frente a la apoptosis Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 127 inducida por el RE. 5. Regulación de las propiedades de las lipoproteínas. 6. Atenuación de la respuesta inflamatoria257. 11.2.4 Polimorfismos del gen PON2 y enfermedad coronaria Pocos trabajos hacen alusión a los polimorfismos del gen PON2 y la EC. Se ha relacionado el polimorfismo Cys311Ser y la EC en algunos estudios258. Martinelli y cols.259, reportaron esta asociación exclusivamente en fumadores. Leus y cols.255, encontraron que los portadores del alelo Ser311 PON2 presentaron mayor riesgo de padecer EC, mientras que la homocigosis Cys/Cys 311 ejerció un efecto protector contra la EC. Shanguera y cols.260, señalaron que el alelo Ser 311 incrementó el riesgo de EC en una población Hindú. Su y cols.261, reportaron efecto sinérgico entre los polimorfismos 107CT PON1 y Cys311Ser PON2 en un subgrupo de mujeres chinas que presentaba mayor prevalencia de EC. Marchegiani y cols.262, investigaron la relación existente entre el polimorfismo Cys311Ser PON2 y el pronóstico de IAM en pacientes de la tercera edad. Estos investigadores concluyeron que los portadores del alelo Cys constituyen un subgrupo con mayor riesgo de padecer IAM de peor pronóstico, recomendando un seguimiento más estrecho de esta cohorte. Los estudios mencionados con antelación reflejan que los polimorfismos en el codón 311 del gen PON2 incrementan el riesgo de presentar EC y que dicho riesgo difiere entre los subgrupos poblacionales263. 11.3 Paraoxonasa 3 11.3.1 Gen PON3 Disponemos de poca información acerca de este miembro recientemente clonado de la familia PON264. El gen PON3 se encuentra localizado en el brazo largo del cromosoma 7, en el clúster PON, entre los genes PON1 y PON2265. 11.3.2 Actividad de la enzima PON3 La PON3 es la enzima menos conocida de la familia PON. La PON3 se sintetiza en el hígado y al igual que la PON1 se encuentra acoplada a las HDL en los humanos265. La Marco conceptual 128 actividad lactonasa de la PON3 se consolida mediante su incorporación a la apo-A1 de las HDL de forma análoga a como sucede con la PON1265,266. A diferencia de la PON1, la PON3 posee escasa actividad arilesterasa y no hidroliza el paraoxón, ni el fenilacetato. Sin embargo, hidroliza rápidamente diversas lactonas, como aquellas incorporadas a ciertas prodrogas (estatinas, espironolactona)265. La escasa evidencia disponible de las propiedades antiateromatosas de la PON3 se deriva de los trabajos experimentales267,268. 1. En los cerdos, la PON3 se expresa ubicuamente, aunque de forma predominante en el tejido graso perirenal y subcutáneo de los animales obesos. Estos hallazgos señalan su implicación en la fisiopatogenia de las enfermedades relacionadas con la obesidad. 2. En los ratones transgénicos, la PON3 disminuye la obesidad y previene contra la aterogénesis. 3. En los ratones KO apoE-/-, los efectos ateroprotectores de las PON humanas (1 y 3) son similares, aunque difieren sus mecanismos antiaterogénicos. 4. El aporte exógeno de PON3 en los cultivos de células endoteliales de aorta humana disminuye la oxidación de las LDL. 5. La PON3 además de presentar propiedades similares a la enzima PON1 (aunque con menores propiedades antiaterogénicas) desempeña una actividad ateroprotectora más estable, a diferencia del efecto ateroprotector que se atribuye a la PON1, el cual es más variable. 11.4 Paraoxonasas, género y enfermedad coronaria La mayoría de estudios sobre las PON no han estimado la diferencia por género o han tenido mayor participación de hombres. Luego, es escasa la información alusiva a los polimorfismos de los genes PON y su correspondencia con el género y la presencia de EC269. Su y cols.261, evaluaron el gen PON1 y su relación con la EC en una población china de etnia Han (mujeres blancas, afroamericanas y chinas), encontrando correlación entre los polimorfismos 107CT PON1, Cys311Ser PON2 y EC en este subgrupo de mujeres. La interrelación genotipo/fenotipo mostró que la baja expresión de la enzima PON1 determinada por la presencia del alelo 107T incrementó el riesgo de padecer EC. El Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 135 Figura 41. Formación y actividad de la ADMA en el interior de la célula. Participación de la Nmetiltransferasa de la L-arginina (PRMT) en la formación de la dimetilarginina asimétrica (ADMA) y de esta en la disminución de la biodisponibilidad de óxido nítrico (NO˙), como consecuencia de la alteración de la actividad de las NOS. Se refleja la degradación enzimática de la ADMA por parte de las dimetilarginina dimetilaminohidrolasas 1 y 2 (DDAH1 y DDAH2) y el transporte de la ADMA desde el interior de las células hacia el torrente sanguíneo por los aminoácidos catiónicos (CAT). Se detalla la interacción entre las DDAH y la angiotensina II (ANG II) y su acción sobre los receptores tipo 1 de la angiotensina (AT1-R), los cuales a su vez activan la proteína cinasa C (PKC). Además se ilustra el efecto del anión superóxido (02ˉ) generado por la NADPH oxidasa y el incremento del estrés oxidativo inducido por la hiperhomocisteinemia (HHcy). Met (metionina); SAM (S-adenosil-metionina); SAH (S-adenosil-homocisteína); NOS (sintasas del NO˙); NADPH oxidasa (fosfato nicotinamida adenina dinucleótido oxidasa); p22phox (critical component of the superoxidegenerating NADH/NADPH oxidase system). Adaptada de: Palm F, et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007;293:H3227-H3245177. 12.4 Actividad y expresión de las DDAH en los vasos sanguíneos La DDAH2 se expresa en las células endoteliales y en las VSMC. La DDAH2 regula la expresión de la iNOS en las VSMC a través del metabolismo de la ADMA al estimular la IL-1β. La IL-1β a su vez incrementa la expresión del gen DDAH y la actividad enzimática de las DDAH. Las DDAH regulan la producción de NO˙ mediante las citocinas y protegen el endotelio contra la injuria vascular de la iNOS que acontece en la ATS. Adicionalmente, las DDAH participan en diferentes procesos biológicos como la reparación del endotelio vascular y la angiogénesis. Marco conceptual 136 12.5 Expresión del gen DDAH El gen DDAH modula la expresión de un amplio rango de genes subsidiarios, además de regular la concentración de ADMA y la producción de NO˙ en las células endoteliales. La inactivación y/o la delección del gen DDAH en modelos murinos ha permitido estudiar el gen DDAH y saber que: 1. Regula la concentración de ADMA. 2. Es indispensable en la actividad de los vasos de resistencia mediados por el NO˙ (EDRF/NO˙). 3. Regula la expresión de los genes involucrados en la angiogénesis. 4. La ADMA activa la vía RhoA (the Ras homolog gene family member A) y Rho cinasa (the Ras homolog gene family) en las células endoteliales, alterando la angiogénesis. 5. La ADMA actúa como inhibidor endógeno de la angiogénesis, alterando la vía NOS/NO˙. Las DDAH están sujetas a inhibición postrascripcional por medio de las ROS generadas por la NADPH oxidasa y la HHcy. Se han identificado múltiples factores que regulan la transcripción del gen DDAH y la actividad de las DDAH. Los agentes que incrementan el estrés oxidativo, reducen la expresión del gen DDAH2. Contrariamente, los factores antioxidantes, incrementan la expresión del gen DDAH2 (Tabla 12 y figuras 41,42). Se desconocen los mecanismos moleculares implicados en la expresión y actividad de las DDAH. Tabla 12. Factores que regulan la expresión del gen DDAH2177 Factores que disminuyen su expresión El factor CF6, un componente esencial en la transducción de energía de la ATP sintasa mitocondrial Los lipopolisacaridos La hiperglicemia Las lipoproteínas de baja densidad oxidadas (LDLox) El factor de necrosis tumoral α (TNF-α) El colesterol La infección por citomegalovirus La hiperhomocisteinemia (HHcy) Factores que aumentan su expresión Los ácidos trasretinóicos La pioglitazona (un ligando del receptor gama activado del proliferador de peroxisomas) El estradiol (contrarresta los efectos de las LDLox sobre las células endoteliales humanas) DDAH2 (dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 2); CF6 (mitochondrial coupling factor 6); ATP (adenosintrifosfato). Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 137 12.6 ADMA, NOS y DDAH La disminución de la L-arginina o del BH4 interrumpe el flujo de electrones hacia la eNOS y la nNOS, generando falta de acoplamiento enzimático e incremento de superóxidos. La interacción química entre el anión superóxido y el NO˙ oxida el BH4, produciendo peroxinitrito (BH2). El BH2 perpetúa la falta de acoplamiento de las NOS, incrementando los superóxidos y la ADMA, además de alterar la actividad de las DDAH. La ADMA a su vez inhibe las NOS generando falta de acoplamiento de las DDAH e incremento de superóxidos (a través de la eNOS y de la iNOS), promovida por los lipopolisacáridos de las células endoteliales. Sin embargo, para que esto suceda, se requieren niveles significativamente elevados de ADMA. Estos hallazgos señalan la importancia de interrumpir el ciclo oxidativo a nivel de las DDAH y el consiguiente aumento de la ADMA a nivel celular177 (Figura 42). Marco conceptual 138 Figura 42. DDAH, homeostasia cardiovascular y renal. Principales factores que regulan la actividad y expresión de las dimetilarginina dimetilaminohidrolasas (DDAH) y sus implicaciones en la función cardiovascular y renal. NADPH oxidasa (fosfato nicotinamida adenina dinucleotido oxidasa); p22phox (critical component of the superoxide-generating NADH/NADPH oxidase system); NADH (nicotinamida adenina dinucleotido en su forma reducida); O (oxígeno); AGEs (glicación avanzada de productos terminales); epogen (epoetin alfa)(1); TNFα (factor de necrosis tumoral α); LDLox (lipoproteínas de baja densidad oxidadas); CMV (citomegalovirus); AT1-R (receptor tipo 1 de la angiotensina II/ANG II); SNIPs (polimorfismos de inserción de un solo nucleótido); ROS (especies reactivas del oxígeno); IL-1β (interleucina 1 β); NF-kB (factor de transcripción nuclear kappa B); PKA (proteína cinasa A); VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular); eNOS (sintasa endotelial del oxido nítrico); NO˙ (óxido nítrico); BP (presión arterial). (1)Medicamento utilizado para tratar la anemia y evitar la transfusión de glóbulos rojos en pacientes con insuficiencia renal crónica sometidos a hemodiálisis. Adaptada de: Palm F, et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007;293:H3227H3245177. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 139 13. Epigenética “Nothing in biology makes sense except in the light of evolution”. Theodosius Dobzhansky278 (1900-1975). “The difference between genetics and epigenetics can probably be compared to the difference between writing and reading a book. Once a book is written, the text (the genes or DNA stored information) will be the same in all the copies distributed to the interested audience. However, each individual reader of a given book may interpret the story slightly differently, with varying emotions and projections as they continue to unfold the chapters. In a very similar manner, epigenetics would allow different interpretations of a fixed template (the book or genetic code) and result in different read-outs, dependent upon the variable conditions under which this template is interrogated”. Thomas Jenuwein134. El término epigenética fue acuñado por Conrad Waddington (1905-1975) en 1942134,279, para referirse a la ciencia que estudia las interacciones causales entre los genes y sus productos que dan lugar al fenotipo. Sin embargo, las primeras nociones de epigenética reportadas en la literatura datan de mediados del siglo XIX, si bien sus orígenes se remontan a 300ac (antes de Cristo) a las doctrinas de Hipócrates y Aristóteles (384-32ac.)134,280. El conocimiento de que un mismo genotipo da lugar a diferentes fenotipos (mediante la regulación epigenética de la función génica), se ha consolidado a través del tiempo. Del mismo modo, el concepto de epigenética ha evolucionado paralelamente al avance en la identificación de los mecanismos moleculares involucrados en las vías epigenéticas. Inicialmente se aludió a la epigenética, como al estudio de los cambios heredables del genoma que suceden sin alterar la secuencia del DNA. No obstante, múltiples procesos de la expresión génica (durante la diferenciación celular) involucrados en la determinación del fenotipo, no son heredables. Un planteamiento más moderno, alude que la epigenética estudia las modificaciones genéticas estables que generan cambios en la expresión y en la función de los genes que no alteran la secuencia del DNA. Aunque este enunciado precedente ha sido ampliamente aceptado entre los científicos, recientemente se propuso a la epigenética, como aquella ciencia que estudia los mecanismos moleculares implicados en el estado funcional de la cromatina281. Marco conceptual 140 En circunstancias fisiológicas, las células somáticas que proceden de una célula progenitora única (que contienen un mismo genotipo) se diferencian y adquieren rasgos y funciones propias mediante la expresión o la supresión (“silenciamiento, inactivación, inhibición, represión”) de algunos genes138-140. En nuestro organismo existen cientos de líneas celulares. Si bien todas estas células poseen el mismo origen, las características (estructurales, moleculares y funcionales) difieren entre ellas. Las neuronas, los hepatocitos, los cardiomiocitos, las células del sistema de conducción del corazón y las VSMC, son sumamente heterogéneas. En el genoma humano existen ~30.000 genes, por ende, la trascendencia de la supresión génica no debe subestimarse. Tanto la formación como el destino de las células se controlan mediante la expresión y la supresión selectiva de los genes. Este complejo proceso está regulado por mecanismos epigenéticos. Luego, el fracaso en la supresión de algunos genes puede generar consecuencias dramáticas en la homeostasia del organismo134. Los mecanismos epigenéticos explican las modificaciones del material genético que suceden como consecuencia del entorno en algunos fenómenos de la naturaleza (mediante el silenciamiento génico). Este hecho, ha permitido a los científicos estudiar la modulación de la expresión génica. Un complejo mecanismo que permite a un mismo genoma expresarse de diferentes formas (epigenomas) en todo el organismo. En el año 2006, Andrew Fire (Stanford, CA) y Craig Mello (Massachusetts, MA), fueron galardonados con el Premio Nobel de Medicina y Fisiología por el descubrimiento del RNA de interferencia (iRNA) o siRNA (small interfering RNA) en el nematodo Caenorhabditis elegans, publicado en la revista Nature en 1998282. La introducción de RNA antisentido en la célula interrumpe la expresión génica. En el mismo año, Roger Kornberg seguramente influenciado por su padre Arthur Kornberg (Premio Nobel en 1959 por sus trabajos sobre la DNA polimerasa-la enzima que facilita la replicación del DNA), recibió el Premio Nobel de Química por sus aportaciones Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 141 en el estudio de la transcripción génica. Sus descubrimientos han permitido comprender como el DNA se trasforma en RNA por acción de la RNA polimerasa II283 (RNAasa II). Roger Kornberg y otros científicos, describieron los principios básicos que rigen la conversión de la información almacenada (DNA), en la información funcional (RNA) en la cromatina de las células eucariotas. Tanto en los animales como en las plantas, el siRNA representa un mecanismo de defensa nativo contra la invasión del material genético, constituyendo a su vez, uno de los elementos responsables del silenciamiento génico durante el desarrollo. El siRNA (iRNA) presenta enormes implicaciones terapéuticas, ya que la identificación y supresión de los genes defectuosos representan una enorme promesa en el tratamiento de las enfermedades con componente genético134. En 2008, David Baulcombe, Victor Ambros y Gary Ruvkun, recibieron el prestigioso galardón: “Albert Lasker Basic Medical Research Award” por el descubrimiento de los microRNAs (http://www.laskerfoundation.org/awards/2008_b_description.htm). En los modelos murinos, la supresión del gen Dicer, promueve la formación de neoplasias y otras enfermedades adquiridas. El gen Dicer es fundamental en la biogénesis de los microRNAs (miRNAs), ya que modula la expresión de la enzima Dicer; una endoribonucleasa perteneciente a la familia de la RNA polimerasa III (RNAasa III) presente en el citoplasma de las células. Esta enzima corta los RNAs de doble hebra (double-stranded RNA o dsRNA) y los pre-miRNAs en pequeños fragmentos de dsRNA de ~20-25 bp (pares de bases) de longitud. En las células, estos diminutos fragmentos de RNA regulan la expresión de gran número de genes. Tanto los siRNAs, como los miRNAs, son producidos mediante “dicing” por acción de las enzimas Dicer. La inactivación del cromosoma X en las hembras, se explica al menos parcialmente por mecanismos epigenéticos. Los calico cats siempre son hembras, lo que significa que poseen dos cromosomas X en cada célula. El gen que codifica el color naranja del pelaje se localiza en el cromosoma X. No obstante, existe otro alelo del mismo gen que codifica Marco conceptual 142 el color negro del pelo. En las hembras, uno de los dos cromosomas X permanece inactivo en todas las células. En consecuencia hereda un par de alelos (naranja y negro), por lo que su pelambre presenta manchas de ambos colores. No obstante, el proceso de inactivación del cromosoma X es aleatorio, por lo que la clonación de los calico cats, nunca producirá el mismo patrón. Adicionalmente, la epigenética es vital para el progreso de la tecnología aplicada a las células madre (stem cells). Estas células totipotenciales se diferencian hacia cualquier línea celular del organismo en respuesta a ciertos estímulos. Se ha descubierto que el DNA de las células madre es más prono a la manipulación epigenética. En la medida en que las células desarrollan una línea celular específica (“se especializan”), “restringen” el acceso a ciertas regiones de su genoma mediante diversas modificaciones epigenéticas. Este acceso que ha sido restringido, se manifiesta posteriormente como su potencial limitado. Sin embargo, se desconoce el itinerario epigenético de las células madre. Los científicos pretenden desarrollar líneas celulares predeterminadas (manipuladas epigenéticamente) con fines específicos (regeneración del tejido neurológico, cardiaco, vascular) en los cultivos de células madre (Figura 43). Figura 43. Células madre. Izquierda. Imagen de una célula totipotencial (célula madre/stem cell) de la médula ósea humana tomada mediante SEM (scanning electron microscopic). Imagen de Andrew Leonard (www.aplmicro.com). Centro y derecha. Cultivos de células madre en diferentes biomateriales. Fotografías de: Daniel G Anderson. Imágenes reproducidas de: Epigenetic?. The Epigenome Network of Excellence. 2006. copyright © Epigenome NoE134. Los fenómenos epigenéticos implican numerosas modificaciones químicas del material genético, las cuales no alteran la secuencia de los nucleótidos del genoma (Figura Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 143 44). Un hecho crucial en dichos fenómenos es su reversibilidad, lo que implica que el código genético permanece inalterado. Por consiguiente, es fundamental reconsiderar el concepto de fenotipo (definido desde antaño), frente a su acepción contemporánea en el contexto epigenético; ya que el fenotipo particular de cada célula, no se define exclusivamente por la secuencia de los nucleótidos del DNA, presentes en el genoma. El genotipo, el entorno y la epigenética, generan un fenotipo específico284,285. Los mecanismos que conforman la maquinaria de metilación epigenética hacen parte de ciertos procesos celulares vitales para el desarrollo del organismo, como la diferenciación celular y la respuesta celular al estrés284-286. Figura 44. Modificaciones químicas del material genético. Las transformaciones químicas del DNA y las histonas promovidas por factores epigenéticos se heredan a través de las sucesivas divisiones celulares. Estas modificaciones no alteran la secuencia de los nucleótidos del genoma, lo que implica que el código genético permanece incólume. Estas modificaciones del DNA hacen parte de ciertos procesos celulares esenciales. Reproducida con mínimos cambios en la forma de: Cassiday LA. Chem Eng New. 2009;87(37):11-16286. Los primeros descubrimientos epigenéticos fueron realizados en las células cancerosas287. Este hallazgo ha sido solo el comienzo de la caracterización de los epigenomas que subyacen a multitud de patologías (neurológicas, inmunológicas y cardiovasculares), entre otras enfermedades. Hoy día es factible dilucidar la totalidad de los epigenomas representados en las marcas epigenéticas de un determinado tipo celular. La epigenética regula la variación fenotípica, tanto en la salud como en la enfermedad. En Marco conceptual 144 consecuencia, el epigenoma permitirá optimizar el entendimiento de las enfermedades en los seres humanos. La epigenética además ofrece una nueva perspectiva en las actuaciones preventivas y terapéuticas dirigidas a mejorar la salud57,288. Dada la reversibilidad del proceso epigenético y a que las proteínas son cruciales en dicho proceso, las proteínas constituyen blancos potenciales en las intervenciones farmacológicas y de prevención289. En este prometedor campo de investigación se vienen evaluando fundamentalmente dos tipos de tratamientos epigenéticos289-291: 1. Los inhibidores de la metilación del DNA. 2. Los inhibidores de las deacetilasas de histonas (HDACi). Las deacetilasas de histonas (HDAC), merced a su interacción con determinados factores de transcripción, son enzimas claves en el control de diversos procesos biológicos como: a. La expresión génica. b. La homeostasia celular. c. Regulación del ciclo celular. d. Diferenciación celular. e. Apoptosis celular. f. Proceso de envejecimiento. g. Reparación del DNA (Figura 45). Perspectiva “traslacional” 252 Hoy en día es ineludible que los profesionales de las ciencias de la salud asuman una visión amplia y moderna de la investigación fundamentada en aquellas nociones que les permitan aplicar los conocimientos de las ciencias básicas (fundamentales), vis a vis, en beneficio de los enfermos y con mira a la medicina individualizada. El compromiso del Sistema Nacional de Salud (SNS), a través de sus diferentes administraciones, es vital en la promoción de proyectos de investigación y el fomento de grupos multidisciplinarios de investigación “traslacional” en los hospitales. Recíprocamente, desde estas instituciones la actividad investigadora exige e incita a la administración a trabajar a su lado, facilitando los medios y la formación en esta disciplina. El esfuerzo en equipo permite que la comunidad se favorezca de los avances científicos y que bilateralmente, desde la práctica clínica se desplieguen iniciativas científicas innovadoras en la asistencia a los ciudadanos, tanto en la salud como en la enfermedad. En definitiva, nuestro compromiso como profesionales de las ciencias médicas, es obtener de la investigación un beneficio tangible para la sociedad. Sin el ímpetu permanente de los científicos, por el ahínco en el conocimiento y en la aplicación de sus logros en la reyerta contra las enfermedades, el SNS no avanzaría. 2. Investigación fundamental (básica) e investigación clínica Durante décadas se han hecho esfuerzos para unir estas dos vertientes del espectro (investigación básica e investigación clínica) y lograr transformar los hallazgos del laboratorio en terapias cada vez más eficientes. Diferentes instrumentos procedentes de la investigación básica se vienen abriendo frente en la medicina cardiovascular moderna. Entre estas herramientas se cuentan: la farmacogenómica463, los nuevos biomarcadores, las revolucionarias técnicas de imagen, la terapia génica y la epigenómica55,309. La investigación básica ha evolucionado considerablemente en los últimos años y se encuentra capacitada para dar el paso; “from bench to bedside”, hacia la medicina e investigación “traslacional”. Sin embargo, es perentoria una comunicación fluida y Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 253 permanente entre la investigación básica y la investigación clínica, para que se pueda llevar a buen término, una investigación “traslacional” real y efectiva. La necesidad de sortear esta dificultad, es sustancialmente apremiante en la medicina cardiovascular, debido a la enorme trascendencia de las ECV. La medicina “traslacional” está por lo tanto dirigida a amortizar en beneficio social, médico y económico, todo el esfuerzo dedicado a la investigación básica preclínica460. Este fue el objetivo que dio lugar en los EE.UU, a la iniciativa Critical Path de la FDA (Food and Drug Administration) y a la reorientación de la financiación de los NIH (National Institutes of Health) hacia los centros de medicina “traslacional”464-466. Las entidades que integran la investigación básica y clínica a nivel asistencial, son las instituciones idóneas para realizar investigación “traslacional”460,467. En consecuencia, la investigación “traslacional” no puede efectuarse en los departamentos de las universidades, ni en los centros dedicados exclusivamente a la investigación, ya que en estas entidades, la investigación clínica no se desarrolla plenamente por adolecer de centros hospitalarios. En España, existen pocos grupos que hacen investigación “traslacional” en la propia institución, además de ser insuficientes y estar dicha actividad concentrada en tópicos muy selectos. El deseo de mejorar la investigación “traslacional” ha dejado en evidencia grandes dificultades en esta interfase. Al igual que en otros retos de la ciencia, la clave que abre las puertas al éxito de la investigación “traslacional”, está en el perfeccionamiento de los métodos y en la idoneidad de los sistemas que permitan aproximar el salto: “from bench to bedside”460-462. 3. Investigación cardiovascular “traslacional” La investigación cardiovascular “traslacional” incorpora este nuevo modelo de investigación, en el que se pondera la estrecha colaboración entre los investigadores en ciencias básicas y los investigadores nacionales e internacionales del ámbito clínico, a Perspectiva “traslacional” 254 más de la implementación de una red de centros clínicos que permitan que el conocimiento adquirido, se transforme de manera eficiente en beneficios de salud reales para la sociedad (Figura 86). La excelencia en este campo requiere, por tanto, un contacto permanente con los centros en los cuales se realiza la práctica clínica diaria467. Figura 86. Investigación cardiovascular “traslacional”. La esencia de la investigación biomédica, es la transferencia del conocimiento generado en los laboratorios de investigación básica, hacia el perfeccionamiento de la práctica medica diaria y recíprocamente, desde la clínica hacia el estímulo de la investigación sobre las inquietudes científicas generadas en los centros asistenciales. En el ámbito cardiovascular, la necesidad de aproximar la investigación básica y clínica, surgió recientemente con los primeros estudios que validaban nuevos tratamientos biológicos en la práctica clínica460. No obstante, a pesar del ingente esfuerzo realizado en las últimas décadas, siguen existiendo limitaciones substanciales en el estudio de las ECV, por lo que se viene imponiendo este nuevo enfoque conceptual56. Durante el último lustro, la incursión de la terapia celular, ha promovido un nexo indispensable entre clínicos, Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 255 biólogos, bioquímicos y diferentes profesionales de las ciencias de la salud460. En esta senda, son tres los artífices del avance de la biomedicina, hacia los tratamientos individualizados: pacientes, clínicos e investigadores. Este ánimo colaborativo, constituye el enfoque primordial de la investigación cardiovascular actual. Pese a ello, el vínculo entre la medicina clínica y la investigación básica sigue siendo precario. En España, en los últimos años, la puesta en marcha del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)467,468, a través de la iniciativa del Instituto de Salud Carlos III469, el frenesí de la Fundación Jiménez Díaz y de las diferentes Redes Temáticas de Investigación Cooperativa en las ECV469-471, representan una clara postura en esta dirección460. Nuestra comprensión de la ATS, demanda el abordaje de diversos aspectos, como los estudios epidemiológicos, los trabajos de investigación en ciencias básicas y los ensayos clínicos. En la investigación básica, se ha progresado considerablemente en el análisis molecular de los determinantes genéticos de gran número de procesos, sus interacciones, los mecanismos relacionados con la transcripción génica, las vías de señalización molecular, los mecanismos moleculares implicados en el estado funcional de la cromatina y su contribución al entendimiento de las enfermedades (epigenómica). Información ésta, que ha de proporcionar nuevas evidencias en el desarrollo y la función de diferentes órganos y sistemas. En el contexto de la ATS, además de la complejidad añadida que implica la integración y el abordaje de todos estos aspectos, la mayor dificultad estriba en su aplicación en la práctica clínica diaria. La búsqueda de FRECV no convencionales y de los determinantes genéticos que subyacen a la EC, son cruciales en la investigación de nuevos nexos con la enfermedad aterosclerótica105,107. Las alteraciones genéticas suceden paulatinamente, lo cual contrasta con el dinamismo del epigenoma, el cual se ve afectado por diferentes aspectos del desarrollo y del entorno, al que está expuesto sucesivamente Perspectiva “traslacional” 256 el organismo337,338. Los fenómenos epigenéticos son críticos en la expresión de los genes involucrados en la aterogénesis285,360. La alteración de la expresión de ciertos genes, más que los fenómenos mutacionales, inducen y establecen la evolución de las ECV55. Por consiguiente, nuestra habilidad para controlar la expresión de estos genes y las dianas específicas de algunos tipos celulares, permitirán mejorar nuestra comprensión del proceso aterosclerótico. Es inexcusable profundizar en la comprensión de tan complejo escenario. La respuesta de los genes, así como la regulación, la actividad y la función de las proteínas, pueden ser modificadas. Debido a la reversibilidad del proceso epigenético y a que las proteínas son esenciales en este proceso, las proteínas constituyen blancos potenciales en las intervenciones farmacológicas y de prevención289. Persuadidos de la influencia que ciertos fenómenos epigenéticos presentan en la génesis y evolución de la enfermedad aterosclerótica, nuestra aportación en la búsqueda de nuevos FRECV, favorece el avance del conocimiento, en la medida que pretende esclarecer la causalidad de la Hcy como FR modificable en la ATS, contribuyendo así a mejorar nuestra comprensión sobre el desarrollo de la placa ateromatosa en la práctica clínica. Consideramos que en este aspecto se circunscribe nuestro trabajo y su relevancia traslacional. El empleo de la AMI constituye un reconocido y acreditado indicador de calidad en la CRC435-437. El registro nacional del corazón (National Cardiac Database, NCD) de la STS8, refleja que los cirujanos emplean al menos una AMI en ~92.4% de los enfermos, mientras que utilizan BIMA, exclusivamente en el 4% de los pacientes en la CRC, siendo esta tendencia creciente en el tiempo. Con todo ello, un número considerable de pacientes con EC aún no se benefician de los injertos de AMI en la CRC, pese a la contundencia de la evidencia. Existe certeza adicional respecto de la infrautilización de la AMI (en la CRC) en el género femenino, en los pacientes de raza negra y en los pacientes de la tercera edad, si bien no existe evidencia científica alguna que condicione el menoscabo para que se Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 257 favorezcan de la AMI en la CRC; y/o que se aluda en la literatura y/o en la práctica clínica y/o quirúrgica, a mayor incidencia de complicaciones como consecuencia del empleo de la AMI en la CRC en estos subgrupos poblacionales. Derivado de nuestro presente trabajo, conceptuamos que la mayor plasticidad homeostática de la AMI, modulada a través de la metilación celular tejido-específica (regulada por mecanismos epigenéticos), además de representar un hallazgo novedoso en la comprensión de su resistencia innata a la aterogénesis, constituye a su vez una aportación traslacional que consolida el alcance de la AMI como injerto vascular autólogo en los pacientes con EC candidatos a CRC9-11 (Tabla 16). En este aspecto, nuestro planteamiento frente al acicate en el empleo de la AMI durante la CRC es contundente y coincidente con el de la comunidad científica internacional435-437. Perspectiva “traslacional” 258 LIMITACIONES DEL ESTUDIO 261 LIMITACIONES DEL ESTUDIO El actual trabajo presenta ciertas limitaciones. En primer término, el tamaño de la muestra obtenido resultó ser inferior al esperado. Brevemente, afirmar que en el diseño del estudio y el tamaño muestral, establecimos como exigencia la cumplimentación del consentimiento informado específico, a más de satisfacer una serie de criterios de inclusión, entre los que destacamos singularmente como requisito sine qua non, aquellos pacientes en quienes se empleó la AMI (al menos una AMI) y no otro injerto, en la cirugía de revascularización coronaria. A dicha acotación, que por ende significó excluir pacientes del estudio, se añadió la restricción propia de la logística que conlleva la obtención de dichos fragmentos, como: la coordinación entre el personal, las condiciones de conservación de las muestras y del traslado de las mismas, además de la idoneidad del fragmento obtenido, entre otros factores. Como consecuencia, un número significativo de pacientes se excluyó finalmente del estudio. Señalar adicionalmente que sobre una misma muestra se realizaron diversas determinaciones. Por consiguiente, se requería una cantidad suficiente de tejido que permitiese la extracción de DNA, RNA y proteínas totales. Esto no siempre fue posible, lo que se tradujo en que en ocasiones no logramos obtener correlación entre las variantes polimórficas analizadas y los fenotipos evaluados. Particularmente y como señalamos en la discusión, la ausencia de N-homocisteinilación observada, pudiera deberse entre otras causas, a este hecho. De forma similar, la comparación a pares entre los territorios arteriales (AMI vs aorta) se realizó en un pequeño número de pacientes en los que obtuvimos simultáneamente fragmentos de AMI y aorta (punches aórticos). Concretamente, la determinación y análisis de los punches aórticos no siempre fue posible por las características propias del fragmento. Limitaciones del estudio 262 APORTACIONES ORIGINALES 273 APORTACIONES ORIGINALES Describimos por primera vez, la relación entre la S-Hcy-p y el grado de metilación del promotor del gen DDAH2 in vivo, a concentraciones fisiológicas de Hcy. Esta correlación había sido reportada previamente exclusivamente in vitro. Igualmente, aludimos como resultado de nuestro estudio, que la mayor plasticidad homeostática de la AMI a través de la expresión génica diferenciada mediada por mecanismos epigenéticos (metilación celular tejido-específica), contribuye decisivamente a explicar la resistencia de la AMI a la aterogénesis. Al margen de dichas aportaciones, consideramos pertinente mencionar posibles campos de investigación relacionados: 1. Profundizar en los mecanismos biológicos que subyacen a la labilidad vascular y a los factores implicados en la protección de los vasos sanguíneos frente a la ATS, especialmente de aquellas circunstancias que justifican la resistencia intrínseca de la AMI a la aterogénesis. 2. Ahondar en el estudio de los FRECV, más allá de los FR clásicos. 3. Trasladar los conocimientos de la investigación fundamental (ciencias básicas) a la práctica clínica diaria, mediante la investigación cardiovascular “traslacional” real y efectiva. 4. Sugerir nuevas vías de estudio que contribuyan a la evidencia científica de la ATS y la EC. Aportaciones originales 274 FUTURAS LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN 277 FUTURAS LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN Consideramos perentorio avanzar en el aprendizaje de los siguientes ítems, entre otros: 1. Mecanismos moleculares que involucran la Hcy como FR en las ECV de origen aterosclerótico. 2. Estudios clínicos prospectivos randomizados y de asociación de genómica que establezcan la relación de causalidad entre la Hcy y la ATS, al demostrar que la reducción de Hcy, disminuye a su vez el riesgo cardiovascular. 3. Otros mecanismos mediante los cuales la HHcy altera el endotelio vascular. 4. Evaluar si los productos metabólicos derivados de la oxidación de la Hcy, entre ellos la Hcy-TL, son mejores indicadores del riesgo cardiovascular que la tHcy per se. 5. Profundizar en el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la interrelación HDL-PON que permitan vislumbrar nuevas estrategias en la prevención y tratamiento de las ECV. 6. Inquirir sobre los determinantes genéticos y no genéticos de la actividad PON que contribuyan a explicar las diferencias individuales observadas en el status de la enzima PON1. 7. Efectuar estudios prospectivos amplios que ayuden a determinar la inconsistencia entre los polimorfismos de la región del promotor del gen PON1 y la EC. 8. Elaborar estudios de los polimorfismos de los genes PON con mayor participación de mujeres en la cohorte objeto del estudio para evaluar su diferencia por género y su relación con la EC. 9. Efectuar trabajos que evalúen la correlación entre los polimorfismos de los genes PON2, PON3 y la EC. Futuras líneas de investigación 278 10. Interacción ADMA-NO˙ en los vasos sanguíneos y su relevancia como marcador del riesgo cardiovascular. 11. Estudio de las vías epigenéticas implicadas en la génesis de las ECV ateroscleróticas, verbigracia la EC. 12. Desentrañamiento del epigenoma en la célula aterosclerótica, en el endotelio vascular distorsionado por la placa de ateroma y en los epigenomas de las diferentes líneas celulares que conforman la red de los vasos sanguíneos del organismo. 13. Desenmascaramiento de los componentes en el adecuado engranaje del puzle Hcy-SAH-metilación-ATS. 14. Comprensión de la HHcy y sus implicaciones en la vía DDAH/ADMA/NOS/ NO˙. 15. Umbral mínimo de Hcy proaterogénica que permita seleccionar más adecuadamente los individuos que se benefician del aporte exógeno de folatos y de vitaminas del complejo B. 16. Determinar las indicaciones del aporte de folatos en los individuos con HHcy leve/moderada, así como del beneficio de dicha pauta en la prevención primaria y secundaria de las ECV en personas con Hcy plasmática en rango fisiológico. 17. Efectuar estudios que aporten resultados más categóricos, al evaluar la intervención del aporte de folatos sobre la concentración de Hcy, así como de su repercusión en la prevalencia de las ECV. 18. Estudios de intervención sobre la Hcy en el desarrollo de eventos vasculares en pacientes con IRC y alteración moderada del aclaramiento de creatinina. 19. Factores que regulan la síntesis de Hcy-T y su reactividad hacia las proteínas. 20. Relación entre la concentración de Hcy-T y las N-Hcy-p en condiciones patológicas. 21. Actividad HTasa de las enzimas PON2 y PON3. 22. Proceso intracelular de N-Hcy-p in vivo en los humanos. ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS 281 ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS A Adenosina ABCG-1 Receptor ATP-binding cassette, sub-family G (WHITE), member 1 ABCG-4 Receptor ATP-binding cassette, sub-family G (WHITE), member 4 ACC American College of Cardiology ACQA Ambulatory Care Quality Alliance ACTP Angioplastia coronaria transluminal percutánea ACV Accidente cerebrovascular A Adenosina AA Aorta ascendente ADMA Dimetilarginina asimétrica ADA Arteria descendente anterior AHA American Heart Association AHEAD Alliance for the Human Epigenome and Disease Ala Alanina AMI Arteria mamaria interna ANG II Angiotensina II ApoA-I Apolipoproteína A-I ApoA-II Apolipoproteína A-II apoB Apolipoproteína B apoE Apolipoproteína E apoE-/- knockout para apoE apoE/PON1-/- knockout para apoE/paraoxonasa 1 Arg Arginina ATB Aterotrombosis ATP Adenosintrifosfato AT1-R Receptor tipo 1 de la angiotensina II ATS Aterosclerosis BCP Bypass cardiopulmonar BH2 Peroxinitrito BH4 Tetrahidrobiopterina bHcy Hcy unida a proteínas BIMA Arteria mamaria interna bilateral (bilateral internal mammary artery) BHMT Betaína homocisteína metiltransferasa BLH Bleomicina hidrolasa C Citosina CAC Calcificación de las arterias coronarias CAMs Moléculas de adhesión celular CAM-1 Molécula de adhesión celular 1 CAT Aminoácidos catiónicos CBS Cistationa β sintasa CCN Células de la cresta neural CCS Canadian Cardiovascular Society Abreviaturas y acrónimos 282 cDNA DNA complementario CE Células endoteliales CEC Circulación extracorpórea CEOH Hidróxidos de ésteres de colesterol CEOOH Ésteres de colesterol peroxidados CETP Proteína de transferencia de ésteres de colesterol CH3 Grupo metil CNIC Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares CpG Nucleótidos pareados de citosina y guanina del genoma CRC Cirugía de revascularización coronaria Cys Cisteína DDAH Dimetilarginina dimetilaminohidrolasas DDAH1 Dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 1 DDAH2 Dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 2 DLP Dislipemia DM Diabetes mellitus DMR Dominios de cromatina con metilación diferenciada DNA Ácido desoxirribonucleico DNMT Metiltransferasas del DNA DNMT1 Metiltransferasa del DNA 1 DNMT3A Metiltransferasa del DNA 3A DNMT3B Metiltransferasa del DNA 3B DOHaD Developmental Origins of Health and Disease dsRNA double-stranded RNA DTT Ditiotreitol DTT DKO Doble knockout EBCT Electrom beam computed tomography. EC Enfermedad coronaria ECV Enfermedades cardiovasculares de origen aterosclerótico EDRF Endothelium-derived relaxing factor EDRF/NO˙ Respuesta vasodilatadora del endotelio mediada por óxido nítrico EGF Epidermal growth factor EHHC European Heart Health Charter eNOS-/- knockout para la sintasa del óxido nítrico endotelial eNOS (NOS-III) Sintasa del óxido nítrico endotelial ERα Receptor α de estrógenos ERβ Receptor β de estrógenos E-selectina Selectina de expresión endotelial ET-1 Endotelina 1 EWAS Epigenome-wide association studies FAMILY Family Atherosclerosis Monitoring In earLY life FDA Food and Drug Administration FEVI Fracción de eyección del ventrículo izquierdo FGF-β Factor de crecimiento de los fibroblastos β fHcy Homocisteína libre (no unida a proteínas) FHS Framingham Heart Study FR Factor (es) de riesgo Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 283 FRECV FR para el desarrollo de las enfermedades cardiovasculares G Guanina GIMc Grosor de las capas media e íntima de la arteria carótida Gln Glutamina GM-CSF Factor estimulante de la formación de colonias de los granulocitos GPIIb/IIIa Receptor para la glucoproteína GPIIb/IIIa GWAS Genome-wide association studies H1 Histona 1 o histona de unión H4 Histona H4 H2A Histona H2A H2O2 Peróxido de hidrógeno HAT Acetiltransferasas de histonas H2B Histona H2B Hcy Homocisteína Hcy-p Homocisteína unida a proteínas/proteína homocisteinilada Hcy-S-S-Cys Homocisteinil cisteína Hcy-S-S-Hcy Homocistina Hcy-T Homocisteína tiolactona HDAC Deacetilasas de histonas HDACi Inhibidores de las deacetilasas de histonas HDL Lipoproteínas de alta densidad HHcy Hiperhomocisteinemia HinfI Enzima de restricción Haemophilus influenzae I HMT Metiltransferasas de histonas HPLC High Performance Liquid Chromatography HTA Hipertensión arterial HTasa Homocisteína tiolactonasa H3K4me2 Histona H3K4me2 H3K4me3 Histona H3K4me3 IAM Infarto agudo de miocardio ICAM-1 Moléculas de adhesión intercelular 1 ICAM-2 Moléculas de adhesión intercelular 2 IGF-1 Factor de crecimiento tipo insulina 1 IL-1 Citocina/interleucina IL-1 IL-1β Citocina/interleucina 1β IL-4 Citocina/interleucina IL-4 IL-8 Citocina/interleucina IL-8 IMC Índice de masa corporal INE Instituto Nacional de Estadística INF-γ Interferón γ iNOS (NOS-II) Sintasa inducible del óxido nítrico INTERHEART Global case-control study of risk factors for acute myocardial infarction IRC Insuficiencia renal crónica iRNA Ácido ribonucléico de interferencia o siRNA (small interfering RNA) K-HMT Metiltransferasa de histona K KO Knockout LAF-1 Integrina leucocitaria (lymphocyte function-associated antigen 1) Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 291 81 Expresión del gen iNOS en la arteria mamaria interna y la aorta 235 82 Expresión del gen DDAH2 en la arteria mamaria interna y la aorta 235 83 Evaluación del grado de metilación de las islas CpG del promotor del gen DDAH2 mediante nMSP 236 84 Metilación de las islas CpG del promotor del gen DDAH2 en la arteria mamaria y la aorta 237 85 Correlación significativa entre la S-Hcy-p y el grado de metilación del promotor del gen DDAH2 en los punches aórticos 238 86 Investigación cardiovascular “traslacional” 254 Figuras 292 TABLAS 295 TABLAS 1. Efectos biológicos del óxido nítrico 64 2. Factores de riesgo cardiovascular 66 3. “Declaración de Luxemburgo” sobre el estilo de vida para alcanzar la salud cardiovascular 74 4. Guías europeas de la práctica clínica sobre la prevención de las enfermedades cardiovasculares 75 5. Causas más habituales de la deficiencia de folatos 92 6. Entidades que cursan con incremento de homocisteína 94 7. Medicamentos que incrementan la homocisteína 94 8. Mecanismos que relacionan la hiperhomocisteinemia y la trombosis 100 9. PON1 humana y su relación con las enfermedades cardiovasculares 120 10. Factores que determinan la expresión de la enzima paraoxonasa 1 124 11. Entidades y factores del riesgo cardiovascular relacionados con incremento de ADMA 132 12. Factores que regulan la expresión del gen DDAH2 136 13. Enfermedades asociadas a pérdida de la impronta genómica 167 14. Genes involucrados en la aterosclerosis y regulados por mecanismos epigenéticos 171 15. Explicaciones propuestas a la resistencia de la arteria mamaria interna a la aterosclerosis 179 16. Principales momentos históricos de la cirugía de revascularización coronaria 180 17. Indicaciones y criterios de aceptabilidad en la revascularización coronaria 185 18. Indicaciones de la cirugía de revascularización coronaria sin circulación extracorpórea 196 19. Secuencia de primers y condiciones de la reacción de la nMSP 207 20. Características de la población. Variables cualitativas 221 21. Características de la población. Variables cuantitativas 222 22. Genotipo C677T MTHFR/Ala222Val (rs 1801133) y concentración media de homocisteína 223 23. Genotipo Gln192Arg PON1 (rs 662) y concentración media de homocisteína 224 24. Genotipo Met55Leu PON1 (rs 854560) y concentración media de homocisteína 224 25. Genotipo Cys311Ser (rs 7493) del gen PON2 y concentración media de homocisteína 226 26. Concentración de S-homocisteína en la arteria mamaria interna y su distribución por genotipos 229 27. Expresión de S-homocisteína en la arteria mamaria interna y su relación con los genotipos. Modelo del logaritmo aditivo 230 28. Expresión de los genes eNOS, iNOS y DDAH2, según el genotipo y el territorio arterial evaluado 233 29. Correlación entre tHcy, S-Hcy y metilación del promotor del gen DDAH2 en la arteria mamaria interna y la aorta 237 Tablas 296 30. Correlación entre el grado de metilación del promotor del gen DDAH2 y la expresión de los genes DDAH2, eNOS e iNOS, en la arteria mamaria interna y la aorta 239 PUBLICACIONES 299 PUBLICACIONES Introducción En la cirugía de revascularización coronaria es habitual la elección de la arteria mamaria interna (AMI) frente a otras alternativas (injertos), debido a su mayor resistencia al desarrollo de aterosclerosis. Se ha sugerido que a esta resistencia contribuye entre otras variantes: 1. La mayor capacidad funcional del endotelio de la AMI, a través de su mayor producción de NO˙. 2. Disminución en la expresión de genes protrombóticos. 3. Disminución de la actividad de la ruta de la señalización RhoA/ROK. La mayor parte de la homocisteína (Hcy) se encuentra en el plasma ligada a la albumina. La unión de la Hcy a proteínas u homocisteinilación se produce a través de dos mecanismos principales: la N-homocisteinilación y la S-homocisteinilación. Cada vez Publicaciones 300 adquiere mayor importancia médica la determinación de proteínas homocisteiniladas en diversos territorios y en pacientes concretos. Las variantes paraoxonasa 1 (Gln192Arg y Met55Leu) y paraoxonasa 2 (Cys311Ser) influencian la concentración de Hcy a través de su capacidad tiolactona hidrolasa. La variante C677T en el gen MTHFR se asocia con concentraciones elevadas de homocisteína (moderada e intermedia). Objetivos Determinar la concentración de homocisteína unida a proteínas (Shomocisteinilación) en fragmentos de AMI y su relación con los genotipos MTHFR (C677T), PON1 (Gln 192Arg) y PON2 (Cys311Ser). Métodos Se obtuvieron fragmentos de AMI descartados durante la cirugía de revascularización en 192 pacientes. Para la determinación de S-homocisteína se obtuvieron homogeneizados que fueron analizados por cromatografía HPLC y detección por espectrofluometría. El mismo homogeneizado se utilizó para la cuantificación proteica y para la extracción de DNA y determinación de los fenotipos MTHFR C677T, PON1 Gln 192Arg y Met55Leu y PON2 Cys311Ser. Resultados Del total de 192 pacientes analizados se obtuvo S-homocisteína (S-Hcy) en 66 fragmentos de AMI (34.375%). No se halló correlación estadística entre los niveles de SHcy unida a proteína en fragmentos AMI y los genotipos PON1 Gln 192Arg y PON2 Cys311Ser; únicamente los genotipos MTHFR C677T y PON1 Met55Leu correlacionan con los niveles de S-Hcy (p = 0.005 y p = 0.038 respectivamente). Conclusiones Aún está por establecer la relevancia in vivo de la modificación por unión reversible de la homocisteína a proteínas vasculares. Nuestros resultados, preliminares, sugieren sin Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 301 embargo, la relevancia de la concentración de HDL (estrechamente vinculada a los genotipos PON1 Met55Leu) y de marcadores clásicos (genotipos C677T del gen MTHFR) en la dinámica de esta unión en los fragmentos de AMI. Publicaciones 302 Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 309 methylation-specific PCR (MSP) method. Mean of MSP values were expressed as Normalized Methylation Index (NIM). Also, we encompassing only proximal promoter iNOS sequence and was assessed by developing a Sensitive Melting after Real TimeMethylation Specific PCR (SMART-MS-PCR) assay, and values were expressed (%). The iNOS mean gene expression was slightly higher in punch aortic fragments with respect to the mean value observed in IMA fragment, without statistical significance. Total plasma Hcy concentration was strongly related with iNOS gene expression in IMA fragments (r=0.653; p = 0.006; n = 14). When assessed iNOS proximal promoter methylation by SMART-MS-PCR, tHcy levels were statistically correlated with iNOS gene promoter methylation percentages in either IMA or punch fragments. Total Hcy levels and methylation percentages values were directly correlated in IMA fragments (r = 0.943; p = 0.002; n = 6) and inversely in punch aortic fragments (r = -0.771; p = 0.036; n = 6). Neither of the described correlations contributed in a significant way to iNOS gene expression variations. CONCLUSIONS: Our data, evaluating both distal and proximal iNOS promoter regions argue in favour of the major relevance of other Hcy induced mechanisms acting on iNOS gene expression variation, rather than, a direct effect of Hcy-induced CpG methylation on iNOS gene expression. KEYWORDS: Homocysteinemia; Coronary Artery Bypass Grafting; Inducible Nitric Oxide Synthase. Publicaciones 310 To cite this abstract, please use the following information: Rodriguez-Esparragón, Francisco, Serna-Gómez, Jaime, Hernández-Trujillo, Yaridé, Buset-Ríos, Nisa, García-Bello, Miguel, Hernández-Velázquez, Érika, et al; Methylated region analysis of the iNOS gene in internal mammary artery (IMA) and aortic fragments from mild homocysteinemic patients undergoing coronary artery bypass grafting (CABG) [abstract]. Journal of Clinical Hypertension 2012;14 Suppl 1 :212. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 311 Introducción La homocisteína (Hcy) es un factor de riesgo cardiovascular independiente. La insuficiencia renal, ciertas deficiencias nutricionales y la variante 677T en homocigosis del gen MTHFR se asocian, entre otros determinantes, con niveles altos entre moderados e intermedios de Hcy. Algunos autores sugieren comportamientos diferentes de la Hcy plasmática respecto a la unida a la pared mediante residuos de cisteína (Shomocisteinilación). Publicaciones 312 Objetivos Evaluar en fragmentos de arteria mamaria izquierda (AMI) procedentes de pacientes sometidos a cirugía de revascularización coronaria, los niveles de proteínas homocisteiniladas. Métodos Los niveles de homocisteína plasmática total se midieron mediante HPLC. Los niveles de proteínas homocisteiniladas se determinaron, como ha sido descrito con anterioridad por Perna et al. (Kidney International, 2006) con modificaciones. Resultados Evaluamos un total de 192 pacientes (86,7% hombres) con una edad media de 64,1 ± 7,4 años. La concentración plasmática media de homocisteína (tHcy) fue de 12,96 ± 3,9 μM. Todos los pacientes evaluados mostraron valores normales de ácido fólico y vitamina B12. Los niveles de ácido fólico correlacionaron de forma inversa con los niveles de tHcy (r = –0,362; p = 0,04). Confirmamos la presencia de homocisteína-S-proteína (Hcy-S-proteína) en 66 (34,3%) de los fragmentos de AMI evaluados. Por el contrario, no pudimos detectar proteínas unidas a homocisteína mediante enlace amida. El valor medio de Hcy-S-proteínas fue de 16,44 ± 31,5 μM. El valor medio ajustado al contenido proteico del homogeneizado fue de 38,6 ± 49 (μM/μg proteína). Los niveles de tHcy no correlacionaron con los niveles de Hcy-S-proteína en fragmentos AMI. Es más, no encontramos correlaciones significativas cuando evaluamos la concentración de tHcy o la de Hcy-S-proteína con el grado de metilación en el promotor del gen Ddah2. Conclusiones Los valores de Hcy-S-proteína no correlacionaron con los valores de tHcy en fragmentos de AMI. Nuestros datos confirman los de otros autores, en el sentido de que la Hcy que se une a residuos proteicos en la pared arterial se comporta de manera independiente de la tHcy. Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 313 Publicaciones 314 Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 315 Introducción La aterosclerosis, la enfermedad renal y la hipertensión arterial se asocian con incrementos en la expresión del gen iNOS. In vitro, en una gran variedad de tipos celulares es difícil lograr esta inducción a la exposición a citocinas. Aunque no se han caracterizado islas CpG en el promotor del gen iNOS, se han aportado evidencias de que la metilación de dinucleótidos CpG conjuntamente con la metilación del residuo de lisina 9 en la histona H3 están ligadas a la ausencia de inducción del mensajero del gen iNOS en células humanas. Objetivos Analizar el grado de metilación global y en regiones específicas en el promotor del gen iNOS en fragmentos aórticos y de arteria mamaria interna (AMI) en pacientes con Publicaciones 316 hiperhomocisteinemia moderada, sometidos a cirugía de revascularización coronaria (CRC). Métodos Las concentraciones de homocisteína plasmática total (tHcy) se evaluaron por HPLC. El grado de metilación global se determinó analizando la secuencia completa del promotor del gen humano iNOS y diseñando primers específicos para metilación (MSP). En una segunda aproximación, la secuencia del promotor del gen iNOS, para lo cual se desarrolló un protocolo de Sensitive Melting after Real Time-Methylation Specific PCR (SMART-MS-PCR). Resultados La media de valores de la expresión relativa del gen iNOS resultó superior en fragmentos aórticos versus fragmentos de AMI. Se observó una correlación entre los valores de tHcy con los valores de expresión relativa del gen iNOS en fragmentos AMI (r = 0,653; p = 0,006; n = 14). Por el contrario, no se observaron correlaciones significativas entre los valores de tHcy y los porcentajes de metilación en el promotor del gen iNOS, evaluados mediante MSP. Cuando se evaluó el grado de metilación en la región proximal del promotor iNOS mediante SMART-MS-PCR, los valores de tHcy correlacionaron con los porcentajes de metilación. Los valores de tHcy y el porcentaje de metilación correlacionaron de forma directa en AMI (r = 0,943; p = 0,002; n = 6) e inversa en fragmentos aórticos (r = –0,771; p = 0,036; n = 6). Ninguna de las correlaciones contribuyó de modo significativo a las variaciones de expresión del gen iNOS. Conclusiones Nuestros datos, tras la evaluación distal y proximal de las regiones promotoras del gen iNOS, argumentan en favor de otros mecanismos a través de los cuales la Hcy induce Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 317 variaciones en la expresión del gen iNOS. La contribución del efecto directo de la Hcy sobre la metilación de dímeros CpG en el promotor del gen iNOS parece ser menor. Publicaciones 318 Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 325 Publicaciones 326 Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 327 Publicaciones 328 Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 329 Publicaciones 330 Relevancia de polimorfismos génicos y la S-homocisteína en la epigénesis en arteria mamaria interna y aorta 331 Publicaciones 332 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 335 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Osler W. The principles and practice of medicine, designed for the use of practitioners and students of medicine. 1892. New York: D. Appleton and Company. 2. Childs B. Genetic medicine: a logic of disease. 1999. Baltimore: Johns Hopkins University Press. 3. Dover GJ. The Barker Hypothesis: How Pediatricans Will Diagnose And Prevent Common Adult-Onset. 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