Obtención de puestas del pez de limón ("Seriola dumerili") mediante inducciones con GnRHa, aplicada con inyección e implante. Calidad de las puestas obtenidas

MASTER OFICIAL EN CULTIVOS MARINOS III MASTER INTERNACIONAL EN ACUICULTURA Las Palmas de Gran Canarias, España 2012-2014 Obtención de puestas del pez de limón (Seriola dumerili) mediante inducciones con GnRHa, aplicada con inyección e implante. Calidad de las puestas obtenidas ANTONINO LA BARBERA Las Palmas de Gran Canaria a Junio 2014 MASTER OFICIAL EN CULTIVOS MARINOS III MASTER INTERNACIONAL EN ACUICULTURA Organizado conjuntamente por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC), el Instituto Canario de Ciencias Marinas (Gobierno de Canarias) y el Centro Internacional de Altos Estudios Agronómicos Mediterráneos (CIHEAM), a través del Instituto Agronómico Mediterráneo de Zaragoza (IAMZ) Obtención de puestas del pez de limón (Seriola dumerili) mediante inducciones con GnRHa, aplicada con inyección e implante. Calidad de las puestas obtenidas. Trabajo realizado en el Instituto Canario de Ciencias Marinas (ICCM) de Las Palmas de Gran Canaria, España, bajo la dirección del Dr. Hipólito FernándezPalacios Barber y del Dr. Javier Roo Filgueira Presentado como requisito parcial para la obtención del Título oficial de Máster Universitario en Cultivos Marinos, otorgado por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC), el Instituto Canario de Ciencias Marinas (ICCM) y el Centro Internacional de Altos Estudios Agronómicos Mediterráneos (CIHEAM). Agradecimientos La presente Tesis es un esfuerzo en el cual, directa o indirectamente, participaron varias personas leyendo, opinando, corrigiendo, teniendo paciencia, dándome ánimo, acompañando en todos los momentos. Por esto dedico este trabajo a mi familia, mis padres Mario e Rosy, y mi hermano Domenico, que siempre me han apoyado en los buenos y malos momentos de toda mi vida. Mi más sincero agradecimiento a mi director, Dr. Hipólito Fernández-Palacios Barber, gracias por la ayuda a lo largo de todo este tiempo, por haber confiado en mi persona, por la paciencia y por la dirección de este trabajo. A todos los que me ayudaron a llevar a cabo este trabajo, Pipo, Javier R., Dominique, Samira, Antonio M., Lorena, Jesús R. y todo el grupo de investigación en acuicultura, gracias. A mi queridos amigos y compañeros Giampiero, Vincenzo, Nayra, Samira, Serhat, Yolanda, Bruno, Antonio M., gracias por haber compartito conmigo buenos momentos en esta isla tan preciosa. A Ylenia que con los buenos y malos momentos pasados juntos me hizo crecer y adquirir las ganas y pasión para seguir investigando. A todos mis amigos italianos……… GRACIAS Este estudio forma parte del proyecto AQUATRANS, un proyecto de cooperación transfronteriza financiado mediante recursos FEDER (Fondo Europeo de Desarrollo Regional) articulados a través del Programa POCTEFEX (Programa de Cooperación Transfronteriza España-Fronteras Exteriores). Parte de este estudio fue presentado como poster con el título: “Spawning quality obtained in greater amberjack (Seriola dumerili) through GnRHa inductions by injections or implants ” al IV Simposio Internacional de Ciencias del Mar, Las Palmas de Gran Canaria (España), 11-13 junio 2014. Índice Lista de figuras .......................................................................................... I Lista de tablas ......................................................................................... III Abreviaturas ........................................................................................... IV Resumen ................................................................................................. V 1. INTRODUCCION ...................................................................................... I 1.1. Acuicultura en el mundo ........................................................................................ 1 1.2. Acuicultura en la Unión Europea ............................................................................ 3 1.3. Acuicultura en España ............................................................................................ 6 1.4. Diversificación ......................................................................................................... 8 1.5. Disfunciones reproductivas en acuicultura........................................................... 10 1.6. Inducción hormonal a la puesta............................................................................ 11 1.6.1. Extractos hipofisarios ......................................................................................... 12 1.6.2. Gonadotrofina purificada o parcialmente purificada............................................. 12 1.6.3. Gonadotrofina Coriónica Humana (HCG) ............................................................. 13 1.6.4. Hormonas liberadoras de gonadotrofinas GnRH y análogos GnRHa ....................... 13 1.7. Técnicas de aplicación hormonal .......................................................................... 15 1.8. Aspectos económicos en las inducciones hormonales ......................................... 17 1.9. Calidad de puesta ............................................................................................... 188 1.10. Cultivo de la Seriola ............................................................................................ 19 2. OBJETIVOS .......................................................................................... 24 3. MATERIAL Y METODOS ......................................................................... 25 3.1. Especie objeto del experimento. .......................................................................... 25 3.1.1. Descripción ....................................................................................................... 26 3.1.2. Distribución....................................................................................................... 26 3.1.3. Biología............................................................................................................. 27 3.1.4. Reproducción en la naturaleza............................................................................ 27 3.2. Condiciones de cultivo .......................................................................................... 28 3.2.1. Reproductores .................................................................................................. 28 3.2.2. Tanques experimentales .................................................................................. 322 3.3. Inducciones ......................................................................................................... 333 3.4. Control de las puestas ........................................................................................ 355 3.5. Parámetros controlados ..................................................................................... 388 3.6. Análisis de datos ................................................................................................... 40 3.7. Nombres vulgares de las especies utilizados ........................................................ 40 4. RESULTADOS ....................................................................................... 41 4.1. Parámetros abióticos del agua durante el experimento ...................................... 41 4.2. Evolución biométrica de los reproductores .......................................................... 42 4.2.1. Diámetro de los oocitos ................................................................................... 444 4.3. Eficacia de la inducción ......................................................................................... 45 4.4. Efecto de los tratamientos sobre la calidad de la puesta ..................................... 46 4.5. Efecto de los tratamientos en la producción ...................................................... 466 4.5.1 Producción por puesta ...................................................................................... 466 4.5.2. Producción por inducción................................................................................... 48 4.5.3. Producción por kg de hembra y por puesta........................................................ 488 4.5.4. Producción por kg de hembra y por inducción ..................................................... 49 4.6. Eficacia económica de los tratamientos hormonales ......................................... 500 5. DISCUSION........................................................................................ 522 6. CONCLUSIONES ................................................................................. 666 7. BIBLIOGRAFIA .................................................................................... 677 Lista de figuras Fig. 1 . Producción mundial de la pesca de captura y de la acuicultura (FAO, 2012) ......... 2 Fig. 2 . Distribución de la producción de acuicultura en los Estados miembros de la Unión Europea, en 2011 (FAO 2012). ......................................................................................... 5 Fig. 3 . Evolución de la producción de la acuicultura en la Unión Europea por grupos principales, para el periodo 1950-2011 (FAO,2012). ........................................................ 6 Fig. 4 . Evolución de la producción acuática total (acuicultura y pesca) en España, en el periodo 1950-2011 (FAO, 2012)........................................................................................ 7 Fig. 5 . Evolución de la producción de la acuicultura en España por especie, en el periodo 1950-2011 (APROMAR, 2013). .......................................................................................... 8 Fig. 6 . Producción en Europa de Seriola dumerili, en el periodo 2005-2011 (FAO, 2012). .............................................................................................................................. 23 Fig. 7 . Producción mundial de Seriola dumerili, en el periodo 2005-2011 (FAO, 2012). . 23 Fig. 8 . Seriola dumerili, Risso, 1810. (www.google.it). ..................................................... 25 Fig. 9 . Distribución mundial de Seriola dumerili (AquaMaps Aug. 2013).. ....................... 26 Fig. 10 . Traslado a tierra de los reproductores capturados. ............................................ 28 Fig. 11 . Camión de trasporte con los reproductores. ...................................................... 29 Fig. 12 . Tanque de poliéster de 500 l para anestesiar los peces...................................... 30 Fig. 13 . Biopsia ovárica de ejemplares de Seriola dumerili. ............................................. 31 Fig. 14 . Esquema de los tanques experimentales. ........................................................... 32 Fig. 15 . Inducción con implante. ...................................................................................... 34 Fig. 16 . Inducción con jeringa. ......................................................................................... 34 Fig. 17 . Tanque con incubador de malla de 500 µm........................................................ 36 Fig. 18 . Huevos de la fracción flotante a las 36 horas de la puesta ................................. 37 I Fig. 19 . Vasos de precipitado con los huevos en bandejas, con recirculación de agua de mar. ................................................................................................................................. 38 Fig. 20 . Valores de la temperatura del agua, durante el periodo experimental. ............. 41 Fig. 21 . Valores de oxígeno disuelto, a lo largo del periodo experimental. ..................... 42 Fig. 22 . Evolución del peso del stock capturado en el 2011, desde la llegada a la instalación hasta el inicio del experimento. ...................................................................................... 43 Fig. 23 . Evolución de la longitud total del stock capturado en el 2011, desde la llegada a la instalación hasta el inicio del experimento.................................................................. 44 Fig. 24 . Evolución de la longitud furcal del stock capturado en el 2011, desde la llegada a la instalación hasta el inicio del experimento.................................................................. 44 Fig. 25 . Producción, por puesta, de cada tratamiento .................................................... 47 Fig. 26 . Producción, por inducción, de cada tratamiento ................................................ 48 Fig. 27 . Producción, por Kg de hembra y por puesta, de cada tratamiento .................... 49 Fig. 28 . Producción, por Kg de hembra y por inducción, de cada tratamiento ............... 50 II Lista de tablas Tabla I . Producción acuícola por países (incluyendo algas) en 2011, y tasa de variación interanual (FAO, 2012) ...................................................................................................... 3 Tabla II . Principales especies de peces producidas mediante acuicultura, en la Unión Europea en 2011 (FAO, 2012). .......................................................................................... 4 Tabla III . Resumen de las investigaciones sobre la reproducción de Seriola dumerili, en países mediterráneos de la UE en los últimos años. ....................................................... 21 Tabla IV . Datos biométricos de los reproductores utilizados en el experimento. .......... 43 Tabla V . Valores medios del diámetro de los oocitos de las hembras de cada tratamiento, antes del inicio del experimento. .................................................................................... 44 Tabla VI . Eficacia de la inducción hormonal. ................................................................... 45 Tabla VII . Parámetros de la calidad de la puesta. ............................................................ 46 Tabla VIII . Eficacia económica de la inducción en los dos tratamientos. ......................... 51 III Figura. 2. Distribucion de la produccion de acuicultura en los Estados miembros de la Union Europea, en 2011 (FAO 2012). En la Unión Europea, los principales productos de la acuicultura son pescados y moluscos, la producción de crustáceos, algas u otros invertebrados es muy reducida. La producción total de productos acuáticos en 2011 sumó 1.267.248 t, de estos 647.248 fueron de pescado, lo que supuso el 51,1% del total; 619.685 t de moluscos, el 48,9%; 280 t de crustáceos, el 0,04%; 125 t de plantas acuáticas, el 0,009% y 2 t de otros invertebrados acuáticos el 0,001 % (Fig. 3). La especie más producida en la UE es el mejillón (355.555 t), de la que se producen dos especies, el común (Mytilus edulis) y el mediterráneo (Mytilus golloprovincialis), seguido por la trucha arco iris (176.983 t, el 27,3% del total de pescados de acuicultura producidos, si bien con una reducción del 7,8% respecto al 2010), el salmón Atlántico (171.983 t, prácticamente la misma cantidad que en el año anterior, el 26,4% del total) y la dorada (98.840 t, el 15,3% con un aumento del 8,8% en relación con el año anterior)(APROMAR, 2013). 5 Figura. 3. Evolución de la producción de la acuicultura en la Unión Europea por grupos principales, para el periodo 1950-2011 (FAO, 2012). 1.3. Acuicultura en España En España, la acuicultura es una actividad empresarial importante, que cuenta una larga tradición en numerosos lugares, tanto costeros como fluviales. Este sector primario, del que es el principal productor en la Unión Europea, está formado por micro, pequeñas, medianas y grandes empresas que ofrecen empleo de calidad, son competitivas, cada una a su nivel, e innovadoras dentro de sus posibilidades. Según APROMAR (2013) en España la obtención de los productos acuáticos proveniente de pesca, marisqueo y acuicultura aumentó en 2011 en un 3,4% con respecto al 2010, alcanzando 1.265.657 toneladas. Mientras que la pesca creció un 2,3%, la producción de acuicultura alcanzó un 7,8% de crecimiento (Fig. 4). 6 Figura. 4. Evolución de la producción acuática total (acuicultura y pesca) en España, en el periodo 1950-2011 (FAO, 2012). De las especies producidas en España, destaca en la producción de mejillones con 212.556 t; de trucha arco iris con 18.612 t; de dorada con 19.430 t; de lubina europea con 14.270 t; y de rodaballo con 7.970 t (Fig. 5). Las principales especies de peces marinos cultivados en España son dorada, lubina europea y rodaballo, representando un 94% de la producción piscícola, la restante parte es ocupada por la corvina (Argyrosomus regius), el lenguado senegalés (Solea senegalensis), la anguila europea (Anguilla anguilla) y el besugo (Pagellus bogaraveo) (APROMAR, 2013). La búsqueda de nuevas especies en acuicultura se ha convertido en una cuestión muy importante, no solo para diversificar el mercado de especies producidas, sino también para seguir manteniendo la tendencia de aumento de la producción que la acuicultura ha tenido hasta hoy. 7 Figura. 5. Evolución de la producción de la acuicultura en España por especie, en el periodo 19502011 (APROMAR, 2013). 1.4. Diversificación En los países mediterráneos, la producción de peces marinos ha estado basada durante mucho tiempo en pocas especies, alcanzando su nivel máximo en el 2008, con una producción de 217.409 t (FEAP, 2013). En cuanto a la acuicultura marina mediterránea, en la actualidad la producción sigue centrada principalmente en dos especies, la dorada y la lubina europea, ambas especies representan el 97,87% de dicha producción. También hay especies nuevas que ya se encuentran en producción, como es el caso del besugo en España, y del lenguado senegalés y de la corvina en varios países mediterráneos. Además hay que subrayar el engorde del atún rojo (Thunnus thynnus), que se realiza desde hace unos años en Italia, Malta, Croacia, Chipre y España (FEAP, 2011). El aumento de la producción de la acuicultura, en los países mediterráneos, depende de la diversificación de las especies cultivadas, y de los productos comercializados (Fernández-Palacios et al., 2013). 8 Según Basurco y Abellan (1999), la selección de una nueva especie debe basarse en las siguientes fases: • Una primera fase con estudios de mercado: demanda, precio y posibles evoluciones; las condiciones biológicas básicas: tasa de crecimiento, talla, fecundidad, mortalidad etc.; las características abióticas del hábitat como: temperatura, oxigeno, profundidad, etc. • Una segunda fase basada en las investigaciones para: obtener alevines de buena calidad y de forma constante; definir protocolos para el cultivo larvario, requerimiento nutricional, densidad de cultivo, engorde, y condiciones ambientales de cultivo y tecnología disponibles. • Una última fase más empresarial que tiene cuenta factores como: los costes de producción, expectativa de los precios de mercado, riesgos, búsquedas de mercados y promoción. También hay que tener en cuenta el punto de vista medioambiental, por esto las especies seleccionadas deben ser especies locales, evitando la introducción de especies exóticas (Bartley, 1998). En los últimos años se ha investigado mucho sobre el cultivo de nuevas especies, realizándose grandes progresos en especies como la cobia (Rachycentrom canadum) (Faulk et al., 2007), el lenguado, Solea solea (Bonaldo et al., 2011), la lisa Chelon labrusus (Ben Khemis et al., 2006), el pez de limón, Seriola dumerili (Mylonas et al., 2004; Jerez et al., 2006; Fernández-Palacios et al., 2013;) el pez gato asiático, Pangasius bocourti (Hung et al., 2002), el atún rojo (Corriero et al., 2003, 2007, 2009; Mylonas et al., 2007; De Metrio et al., 2009, 2010; Caggiano et al., 2009) o el medregal negro (Seriola rivoliana) (Roo et al., 2012). El punto de partida para el cultivo y la producción industrial, de una nueva especie es el control de la reproducción. Para tener una producción sostenible es necesario el control de la reproducción en cautiverio, sin embargo, en la mayoría de las especies candidatas para la acuicultura, la reproducción en cautividad es el principal cuello de botella, de hecho muchas especies tienen disfunción reproductivas en cautividad. 9 1.5. Disfunciones reproductivas en acuicultura Como la mayoría de los animales salvajes mantenidos en cautividad, muchas especies piscícolas, de interés para la acuicultura presentan disfunciones reproductivas (Cataudella y Mazzola, 2013), estas disfunciones pueden ser debidas a diferentes causas como: falta de los hábitats naturales de reproducción (Zohar, 1989 a,b; Yaron, 1995; Battaglene y Selosse, 1996), estrés producido por el cautiverio (Sumpter et al., 1994; Pankhurst y Van der Kraak, 1997), factores abióticos, alimentación o manejos inadecuados (Schreck et al., 2001; Zohar y Mylonas, 2001; Duncan et al., 2012). Como ha sido descrito por Cataudella y Mazzola (2013), los problemas reproductivos suelen ser más graves en las hembras que en los machos y pueden ser de tres tipos: • Interrupción completa de los proceso de oogenesis y espermatogénesis: Es el caso, por ejemplo, de las anguilas donde la imposibilidad de realizar la migración, parece ser la causa de la interrupción del desarrollo gonadal (Fontaine, 1975). • La ausencia de puesta al final del ciclo reproductivo : En las especies que presentan este problema, los oocitos tienen un proceso normal de desarrollo, pero las hembras no desovan espontáneamente. En este punto los huevos puede tener dos destinos: o se mantienen en la cavidad abdominal, y se reabsorben lentamente como en el caso de los salmónidos (Bromage et al., 1992), o las hembras pueden liberar huevos inviables, poco después a la ovulación (desde unas pocas horas a unos pocos días), incluso en ausencia de comportamientos reproductivos, es el caso la lubina estriada (Morone saxatilis) (Zohar y Mylonas, 2001), y de la cherna de ley (Epinephelus aeneus) (Hassin et al., 1997). En estos caso se puede utilizar la técnica de masaje abdominal o stripping, para obtener huevos viables (Cataudella y Mazzola, 2013). • Interrupción de la maduración final de los oocitos (FOM): En esto caso el desarrollo ovárico parece desarrollare normalmente, pero al inicio de la estación reproductiva, cuando los oocitos están en estado avanzado de vitelogénesis se interrumpe el desarrollo, y los huevos entran en un proceso de regresión conocido como atresia (Berlinsky et al., 1997; Mylonas et al., 1997). Este es el problema más frecuente en acuicultura. Se ha observado en muchas especies 10 como: la cherna (Polyprion americanus ) (Suquet et al., 2001; Papandroulakis et al., 2004) y el pez de limón (Marino et al., 1995; Díaz et al.,1997; Micale et al., 1999). En los peces, el estrés del cautiverio puede afectar al sistema inmune, al crecimiento y a la reproducción, afectando en este último caso, al desarrollo de los gametos y su calidad, alterando la supervivencia de huevos y larvas, y su desarrollo (Campbell et al., 1992; Foo y Lam,1993; Pankhurst y Van der Kraak, 1997; Schreck et al., 2001; Wagner et al., 2002). Según Schreck et al. (2001), en la trucha arcoíris los niveles de cortisol después de un agente estresante, son mayores en peces que se encuentran cerca del proceso de maduración sexual, y aparece más marcado en hembras que en machos. Excluyendo el caso de la anguila, en los machos las disfunciones reproductivas habituales son la reducción de la cantidad, y la producción de esperma de baja calidad (Zohar y Mylonas, 2001). Berlinsky et al. (1997), observaron en el lenguado canadiense (Paralichthys dentatus), que los reproductores machos capturados en la naturaleza en el periodo reproductivo, y mantenidos en cautividad producían esperma poco activo y que no se mezclaba bien con el agua y por esto era poco viable. 1.6. Inducción hormonal a la puesta Son muchas las especies de peces, que manifiestan disfunciones reproductoras cuando son estabuladas en cautividad, por ello los tratamientos hormonales son hasta ahora la única alternativa, para lograr adecuados procesos reproductivos. En los últimos años se han utilizado con éxito, una gran variedad de hormonas y tecnologías, en numerosas especies (Hoar, 1969; Donaldson y Hunter, 1983; Zohar y Mylonas, 2001). Varios autores (Zohar, 1988; Mylonas et al., 1997, 1998), han señalado que la principal hormona responsable en los procesos de reproducción, es la hormona luteinizante (LH). Durante el proceso de vitelogénesis los niveles de hormona LH en la hipófisis va creciendo, alcanzando el máximo nivel al final de la vitelogénesis, posteriormente, durante los proceso de FOM y ovulación, se detectan niveles crecientes de hormona LH, en el fluido sanguíneo (Elizur et al., 1995; Zohar, 1988). Los peces estabulados en 11 cautividad, que tienen disfunciones en la FOM y en la ovulación, producen normalmente la hormona LH, por esto se completa la vitelogénesis, pero la LH no se encuentra en el torrente sanguíneo, y por tanto no puede llegar a los ovarios, y así completar la maduración final de los oocitos y la puesta. 1.6.1. Extractos hipofisarios Los primeros compuestos a base de gonadotropinas (GtH), usados para la inducción de la puesta en peces, fueron los homogeneizados y extractos. Su uso comenzó a finales de la década de los ‘30 (Von Ihering, 1937; Fontenele, 1955). Actualmente, este método es utilizado masivamente en la producción de carpas, en los países asiáticos. Zohar (1989 a,b), observó que hipófisis provenientes de peces en estadio reproductivo, eran mucho más eficaces para la inducción por su alto contenido en GtH. Esta técnica tiene muchos inconvenientes: la gran diferencia en contenido de LH hipofisario, la presencia de otras hormonas en el extracto que pueden afectar a la fisiología del organismo receptor, y la posibilidad de trasmisión de enfermedades (Yaron, 1995). 1.6.2. Gonadotrofina purificada o parcialmente purificada La preparación de gonadotrofinas purificadas de salmón chinoock (Oncorhynchus tschwawitscha) y de carpa común, fueron muy utilizadas en el pasado (Yaron, 1995; Donaldson, 1973). Sin embargo, el elevado costo de la purificación, y la alta especificidad de las gonadotrofinas, han restringido su uso a especies filogenéticamente cercanas (Zohar, 1988; Patiño, 1997; Peter y Yu, 1997; Mylonas y Zohar, 2001). 12 1.6.3. Gonadotrofina Coriónica Humana (HCG) La HCG por su fácil disponibilidad, es de las gonadotrofinas que ha sido más usada en acuicultura. Es extraída con facilidad da la orina de mujeres embarazadas (Lam, 1982; Donaldson y Hunter, 1983; Zohar, 1989b), su éxito se debe a su similitud con la Hormona Luteinizante (LH) (Hoar, 1969; Harvey y Hoar, 1980). La ventaja de esta hormona, es que actúa directamente al nivel de la gónada, y no requiere la activación de la glándula hipofisaria, o la presencia de LH almacenado, actuando así mucho más rápido, induciendo la maduración final del oocito, la espermiación y la puesta (Hodson y Sullivan, 1993). La mayor contraindicación para el uso de HCG, es que al ser un péptido grande, es altamente inmuno-estimulante, por lo que resulta ineficaz, si se suministra en la mismas dosis en épocas reproductivas siguientes, ya que el sistema inmune la reconoce como sustancia exógena, y desarrolla anticuerpos específicos contra ella (Lam, 1982; Donaldson y Hunter, 1983; Zohar, 1989a), por esto cada año es necesario incrementar las dosis, aun así, todavía puede ser insuficiente para el obtención de la puesta (Cataudella y Mazzola, 2013). 1.6.4. Hormonas liberadoras de gonadotrofinas GnRH y análogos GnRHa Las hormonas hipotalámicas liberadoras de gonadotrofinas (GnRH o LH-RH), son pequeños dacapéptidos, que actúan como control de la gandula hipófisis, para la liberación de gonadotrofinas, se descubrieron en los mamíferos en los años ‘70 (Schally, 1978), y ahora son unos de los métodos más modernos de inducción hormonal a la ovulación. Cuando Breton et al. (1990), probaron por primeva vez extractos hipotalámicos de GnRH nativo en la carpa, observaron un rápido incremento de GtH hipofisario. Rápidamente se crearon análogos sintéticos GnRHa o LH-RHa (Fujino et al., 1972), que actúan como los análogos nativos, pero de forma más potente y con mayor duración, 13 desde entonces su utilización se incrementó de forma notable (Zohar, 1988; Patiño, 1997; Peter y Yu, 1997). Las GnRH nativas producen un rápido incremento de GtH, en muchas especies de peces, pero este incremento es de baja intensidad, y de corta duración para inducir la FOM, la ovulación y la puesta (Omeljaniuk et al., 1987; Crim et al., 1988a,b; Zohar, 1988; 1989a), esto es debido al efecto degenerativo de las endopeptidasas, presentes en la hipófisis, hígado y riñón de los peces (Peter y Yu, 1997; Zohar et al., 1990), de hecho estas enzimas cortan los dacapéptidos en la posición 5-6 y 9-10, produciendo pequeños fragmentos inactivos. Con la preparación de análogos sintéticos (GnRHa), se consiguió sustituir los aminoácidos de la posición 6 y 10 con, respectivamente, un aminoácido dextrorso y un grupo etilamino, produciendo así una molécula resistente a la degradación enzimática, de las endopeptidasas (Goren et al.,1990; Weil et al.,1991, 1992), pudiendo así permanecer por más tiempo en el torrente sanguíneo, y regular de forma eficaz la liberación de gonadotrofinas por la hipófisis. Las GnRHa, por su mayor resistencia a la degradación enzimática, y la más alta afinidad a los receptores, son de 30 a 100 veces más eficaces que las GnRH nativas, en la inducción de la liberación de LH, tanto en términos de amplitud como de duración (Peter et al., 1988; Zohar, 1989a, b; Crim y Bettles, 1997), por tanto las GnRH y las GnRHa son capaces de inducir el desarrollo del ovario, la FOM y la ovulación, pero la dosis debe ser muy superior en la forma nativa (1-15 mg kg-1 GnRH) en comparación con la forma sintética (1-100 μg GnRHa kg-1) (Donaldson y Hunter, 1983; Zohar, 1989a, b). En los peces fueron probadas varias formas de GnRH (Peter et al., 1985; Crim et al., 1988a; Zohar, 1989a; Zohar et al., 1989a), pero las más usadas son la de mamíferos y la de salmon, con resultados variables según las especies, sin embargo la de mamíferos es usada en varias aplicaciones en los humanos (Barbieri, 1992; Emons y Schally, 1994), y por esto es de precio más bajo y de más fácil disponibilidad. La utilización de GnRH y homólogos GnRHa, en la inducción a la puesta en peces tienen varias ventajas: 14 Considerada la gran importancia del pez de limón como especie para la diversificación de la acuicultura de los países mediterráneos, en los últimos años varios grupos de investigación han realizados estudios sobre el desarrollo de técnicas de reproducción y cultivo larvario de esta especie (Tabla III). Tabla III. Resumen de las investigaciones sobre la reproducción de Seriola dumerili, en países mediterráneos de la UE en los últimos años País/Fuente Técnicas Puesta Observaciones Croacia: (Kozul et al., 2001) 1998-Inducción con HCG a la dosis de 1000 I.U./Kg 2 eventos reproductivos con 750 g de huevos en el primero y 1250g en el segundo En la primera puesta todos los huevos no fertilizado, en la segunda 200g fertilizados (16%) España (Jerez et al., 2006) (FernándezPalacios et al., 2013) (García-Gómez y De la Gándara, 2003) 2002: puestas espontaneas de reproductores mantenidos en cautividad durante 6 años 14 millones de huevos recogidos en 38 eventos reproductivos entre 29/04 y 01/10 Tanque 500 m3, T° entre 19,7 y 24,5°C; Peso medio reproductores 25 Kg (N=12); fecundación 62%; eclosión 16% 2012: inducciones con inyecciones intramusculares de GnRHa a la dosis de 20 μg kg-1 15 inducciones y 22 puestas en toda la estación reproductiva, 330.821 ± 219.519 huevos por inducción Tasa de fertilización media 93,13%; 98,64% eclosión y 89,76% supervivencia Inducción con jeringa intramuscular de HCG en dos hembras salvajes Cerca 2 millones de huevos en un evento reproductivo. 43.000 huevos/Kg de peso 2 hembras, peso medio 23 Kg, cerca de la mitad de los huevos obtenidos con masaje abdominal 21 Grecia: (Mylonas et al., 2004) (Caprioli, datos no publicados) 2003: inducción con implante intramuscular de GnRHa la dosis de 500 μg por pez Primera inducción 12/06, 36h después 36.000 huevos. Segunda inducción 27/06, 36h después 180.000 huevos, 5 días después 336000 huevos Tanque 40 m3, T° primera inducción 23°C; T° segunda inducción 25°C; Peso medio reproductores 14 Kg; fecundación 28%; 2007: inducción con implante intramuscular de GnRHa sobre reproductores F1 Dos eventos reproductivos a distancia de 5 días, total de 700.000 huevos Primera semana de julio, peso medio reproductores 10 Kg (N=12) Italia: (Lazzari et al., 2000) 1998: Inducción con LHRHa y decapeptyl a la dosis de 2-10 μm/Kg y 20-40 μm/Kg 3 eventos reproductivos con un total de 2.250g de huevos T° primera deposición 21°C; biopsia oocitos 400-600 μm de diámetro Malta : Producción estable de huevos desde el 2006 (Vitalini, datos no publicados) 2007-2008. Reproductores salvaje mantenidos en jaulas se trasfieren a tanque en tierra. Canulados e inducidos intramuscularmente con HCG 500 UI 2007: inducción 16/6 huevos no fecundados. Puesta espontanea en jaula el 19/6 2008: inducción 30/05, 48h después 4,5 millones de huevos. Inducción 10/7, 48h después 7 millones de huevos Dimensión tanque 200 m3, h 4m; T° primera inducción 20,3°C; T° 2° puesta 22°C; Peso medio reproductores 21 Kg; sex ratio 50:50; % fecundación > 60%; eclosión > 90%; biopsia: oocitos con 400-600 y 600-800 μm Según FAO (2012) la producción industrial europea de Seriola dumerili es muy limitada, de hecho en el 2011 no se superaron las dos toneladas (Fig. 6). A nivel mundial, la producción a partir de alevines nacidos en cautividad es también pequeña (Fig. 7). 22 Fig. 6. Producción en Europa de Seriola dumerili, en el periodo 2005-2011 (FAO, 2012). Fig. 7. Producción mundial de Seriola dumerili, en el periodo 2005-2011 (FAO, 2012). 23 2. Objetivo: El objetivo principal de este estudio fue determinar la eficacia, y el efecto en la calidad de la puesta, de diferentes métodos de aplicación de la hormona GnRHa, en la inducción de reproductores de pez de limón (Seriola dumerili). Para ello se establecieron como objetivos secundarios los siguientes: • Determinar la eficacia de la inducción hormonal en la obtención de las puestas. • Determinar el efecto de distintos métodos de aplicación sobre la calidad de las puestas. • Determinar el efecto de distintos métodos de aplicación sobre la producción de los reproductores. • Determinar la eficacia económica de los métodos de inducción. 24 3. Material y métodos 3.1. Especie objeto del experimento. Phyllum: Cordata Superclase: Gnathostomata Clase: Actinopterygii Orden: Perciformes Familia: Carangidae Género: Seriola Especie: Seriola dumerili El pez de limón Seriola dumerili (Risso, 1810) (Fig. 8), es un pez teleósteo de la familia Carangidae, que está formada por 33 géneros y 140 especies. Figura. 8. Seriola dumerili , Risso, 1810 (www.google.it). 25 3.1.1. Descripción La especie se caracteriza por tener un cuerpo alargado, moderadamente alto y ligeramente comprimido. Tienes ojos pequeños en comparación al cuerpo, los dientes son pequeños y se distribuyen en una gran banda en las dos mandíbulas. Posee dos aletas dorsales con 8 espinas dorsales y 29-35 radios blandos, 3 espinas anales y 18-22 radios blandos anales. El color dorsalmente, es amarillo-verdoso en juveniles, y en adultos es azulado o gris oliváceo, de color blanco plateado en lados y vientre; aletas oscuras (SmithVaniz, 1986). Segunda aleta dorsal y anal con lóbulo anterior (Smith, 1997). Alcanza un tamaño máximo entre 180-190 cm de longitud total y un peso máximo de 80-90 Kg (Bauchot, 1987), con una media de 100 cm de longitud total y 25-40 Kg (Smith-Vaniz, 1986). 3.1.2. Distribución Figura. 9. Distribución mundial de Seriola dumerili (Froese y Pauly, 2014). Es una especie de distribución global (Fig. 9). Se distribuye a lo largo del Mediterráneo hasta el Golfo de Vizcaya, Marruecos, y raramente en la costa británica. También se 26 encuentra en Nueva Escocia hasta Brasil, Sudáfrica, Golfo Arábico, Australia, Japón y Hawái. La distribución en el Atlántico centro oriental a lo largo de la costa africana no está bien establecida, debido a la confusión en el pasado con Seriola carpenteri, aunque su presencia en el Archipiélago Canario está bien documentada (Moro et al., 2003). 3.1.3. Biología Es un pez tanto pelágico como costero, los adultos se encuentran desde los arrecifes hasta el mar profundo, normalmente entre los 18 y 72 metros de profundidad pero pueden aparecer en profundidades mucho más elevadas, de vez en cuando entran en bahías costeras, frecuentemente forman bancos, aunque pueden ser solitarios (SmithVaniz, 1986). Los jóvenes entre 9 y 20 cm tienen hábitos alimentarios prevalentemente planctónicos, a base de larvas de crustáceos, gasterópodos y anfípodos pelágicos, mientras desde los 20-30 cm se alimentan principalmente de peces (Pipitone y Andaloro, 1995), y también de invertebrados (Smith-Vaniz, 1986), por esto es considerada una especie oportunista, y su dieta varía en función del tamaño (Mazzola et al., 1993; Matallanas et al., 1995; Pipitone y Andaloro, 1995). Los juveniles pequeños se asocian a plantas y algas flotantes, o desechos en las aguas oceánicas y en alta mar. Se pueden encontrar en bancos o en solitario (Fischer et al., 1990). 3.1.4. Reproducción en la naturaleza Los sexos son separados (Smith-Vaniz, 1986). La diferenciación sexual empieza a partir de 24 - 25,5 cm de longitud total, en el 4° - 5° mes de vida (Marino et al., 1995). A los 4 - 5 años de edad maduran sexualmente (Marino et al., 1995; Kožul et al., 2001). Son peces de puesta múltiple, con el ovario formado por grupos sincrónicos, donde al menos dos grupos de oocitos están presentes en el mismo momento (Grau et al., 1992). En el periodo reproductivo, que en el Mediterráneo coincide con meses de primavera y verano, desde mayo hasta julio (Lazzari y Barbera, 1988; Grau et al., 1992), se acercan a 27 las costas. El índice gonado-somático varía con los años entre 0,51 y 15,56 para las hembras y entre 0,05 y 8,23 para los machos (Cataudella y Mazzola, 2013). En cautiverio los machos alcanzan la madurez, produciendo pequeñas cantidades de esperma, mientras que en las hembras, la maduración de las gónadas se para al comienzo de la vitelogénesis (Cataudella y Mazzola, 2013). Las migraciones reproductivas se repiten de forma constante en el curso de los años, y es en este periodo cuando más ejemplares se capturan. Los huevos son pelágicos, esféricos, con un diámetro entre 1,0 y 1,2 mm, una sola gota lipídica de 0,2-0,3 mm (Masuma et al., 1990; Lazzari, 1991; Tachihara et al., 1993), la eclosión ocurre después de 35h (23-27°C) o 48h (20°C), tras la fecundación (Lazzari, 1991; Tachihara et al., 1993). 3.2. Condiciones de cultivo 3.2.1. Reproductores Los reproductores utilizados en el presente experimento, proceden de un lote de 22 ejemplares de pez de limón, que fueron capturados, en el año 2011, en la costa SO de Gran Canaria por barcos artesanales. Las artes utilizadas fueron nasas de profundidad, con dimensiones entre 2,5 y 3 m de diámetro, y 0,85 y 1,10 m de altura. Los peces una vez capturados, se mantuvieron en circuito abierto en los viveros de las embarcaciones hasta su llegada al puerto de Mogán (Gran Canaria) (Fig. 10). 28 Figura. 10. Traslado a tierra de los reproductores capturados. A continuación fueron trasladados por carretera, en tanques de 500 l con oxígeno disuelto (Fig. 11). A su llegada a las instalaciones, los peces se estabularon en un tanque de 10 m3 de capacidad, negro de fibra de vidrio reforzada con polyester (3 m x 3 m x 1,5 m), situado en la Planta Piloto de Producción de Alevines (PPPA) del Grupo de Investigación en Acuicultura (GIA), localizada en las instalaciones del Parque Científico Tecnológico Marino (PCTM), de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC), situado en el municipio de Telde (Gran Canaria). Figura. 11. Camión de trasporte con los reproductores. Una vez aclimatados a las condiciones de cultivo, los peces fueron anestesiados, en un tanque de poliéster de 500 l de capacidad (Fig. 12), utilizando aceite de clavo (GUINAMA, Valencia, España), a una concentración de 1ml por cada 10 l de agua de mar, y se determinó su longitud total (LT), la longitud furcal (LF) y el peso (P), procediendo al marcaje mediante microchip subcutáneo, PIT (Trovan Ltd. Reino Unido). Los peces se 29 alimentaron dos veces por semana con pienso comercial (Skretting, Burgos, España), y una vez a la semana con alimento fresco (calamar y mejillón). Figura. 12. Tanque de poliéster de 500 l para anestesiar los peces. En mayo del 2012, los 22 ejemplares del lote se muestrearon de nuevo, y dado que la biomasa se había duplicado, los peces se dividieron en dos tanques de 10 m3, iguales a los anteriormente descritos. En 2013, los 22 ejemplares del pez de limón se trasladaron a la nueva Estación de Reproductores del PCTM, y se estabularon en un tanque de 40 m3, de color negro, construido con poliéster reforzado con fibra de vidrio. Los tanques tienen un diámetro de 5 m y una profundidad de 2,35m en la parte central, y cuentan con una entrada de agua en su parte superior, y dos desagües situados en el fondo, uno de ellos en posición central para el vaciado total, y el otro en posición lateral para un vaciado parcial. Los 30 El día siguiente de la puesta, se cerraban la aireación y el flujo de agua en los tanques de incubación, y se esperaba una hora a que los huevos se separasen; con un sifón se aspiraba la fracción no flotante y se ponía en un cubo de 10 litros con aireación, la fracción flotante (Fig. 18) se ponía en otro cubo de 10 litros con aireación. En los dos cubos se contaban los huevos vivos, los muertos, sacando de cada cubo 5 ml de muestra, poniéndola en cámara de Bogorov y contando bajo la lupa binocular, también en esto caso la operación se repetía cinco veces. El número total de huevos de la puesta se calculaba según Fernández-Palacios et al. (2005). Figura 18. Huevos de la fracción flotante a las 36 horas da la puesta. Para determinar los porcentajes de eclosión y supervivencia larvaria, tres cantidades conocidas de huevos, se incubaban en tres vasos de precipitado de cristal de 250 ml, estos vasos se colocaban en bandejas, con recirculación de agua de mar, de manera que la temperatura de los vasos se mantenía a la misma temperatura que la del agua de mar en las instalaciones (Fig. 19). 37 Después de cincos días de la siembra (3 días post eclosión, 3 dpe), cuando el saco vitelino de la larva se ha reabsorbido, se contaban las larvas vivas, las larvas muertas y los huevos no eclosionados (Fernández-Palacios et al., 2005). Figura. 19. Vasos de precipitado con los huevos en bandejas, con recirculación de agua de mar. 3.5. Parámetros controlados Eficacia de la inducción (Fernández-Palacios et al., 2009): • N° de hembras inducidas que tuvieron puesta • N° de puestas por inducción • Periodo de latencia para cada puesta Calidad de la puesta (Fernández-Palacios et al., 2005): • Porcentaje de huevos fecundados • Porcentaje de huevos vivos • Porcentaje de eclosión • Porcentaje de supervivencia (larvas de 3 dpe) 38 Producción por puesta (Fernández-Palacios et al., 2005): • N° de huevos fecundados • N° de huevos vivos • N° de larvas eclosionadas • N° de larvas supervivientes (3 dpe) Producción por inducción (Fernández-Palacios et al., 2011): • N° de huevos fecundados • N° de huevos vivos • N° de larvas eclosionadas • N° de larvas supervivientes (3 dpe) Producción por kg de hembra y por puesta (Fernández-Palacios et al., 2005): • N° de huevos fecundados • N° de huevos vivos • N° de larvas eclosionada • N° de larvas superviviente (3 dpe) Producción por kg de hembra y por inducción (Fernández-Palacios et al., 2011): • N° de huevos fecundados • N° de huevos vivos • N° de larvas eclosionadas • N° de larvas supervivientes (3 dpe) Eficacia económica de la inducción (Hakuć-Błażowska et al., 2009) • Coste por kg de hembra inducida • Coste de 1000 huevos por kg de hembra y por puesta • Coste de 1000 larvas por kg de hembra y por puesta • Coste de 1000 huevos por Kg de hembra y por inducción • Coste de 1000 larvas por Kg de hembra y por inducción 39 3.6. Análisis de datos Los resultados se han expresado como media ± desviación estándar. Todos los datos recogidos, fueron estadísticamente tratados con el test de la t de Student’s p<0,05, usando el programa de análisis estadístico SPSS v.22.0 (versión 22.0 por Windows) (®IBM, Chicago, IL, USA). 3.7. Nombres vulgares de las especies utilizados Los nombres vulgares de las especies, utilizados en este trabajo fueron tomados del “Diccionario multilingüe de especies marinas para el mundo hispano” (Vera, 1992). En caso de no figurar, la especie, en dicho diccionario se utilizó la denominación FAO en español de la base de datos “Fishbase” (Froese y Pauly, 2014) y en el caso de no existir el nombre en español, se utilizó la denominación FAO en inglés de esa base de datos. 40 4. Resultados 4.1. Parámetros abióticos del agua durante el experimento La Fig. 20, indica los valores de temperatura del agua durante el periodo experimental. La temperatura más baja se registró en el mes de mayo, con una temperatura media de 20,83±0,32 C°, mientras que la más alta fue en el mes de septiembre con un valor medio de 23,84±0,18 C°. Figura. 20. Valores de la temperatura del agua, durante el periodo experimental. Los valores de concentración de oxígeno disuelto, representados en la Fig. 21, varían entre 7,05±0,15 ppm en el mes de septiembre, y 7,33±0,14 ppm en el mes de mayo. 41 Figura. 21. Valores de oxígeno disuelto, a lo largo del periodo experimental. 4.2. Evolución biométrica de los reproductores En la Tabla IV se indican las características biométricas de los reproductores utilizados en el experimento. Las Figs. 22, 23 y 24 muestran la evolución del peso, longitud total y furcal de todo el stock capturado en el 2011, desde la llegada a las instalaciones del GIA hasta el inicio del experimento. Las hembras han multiplicado su peso por casi 2,5, y los machos por casi 3,8, pasando desde 3,44±1,32 Kg hasta 8,18±1,09 Kg las hembras, y desde 2,35±0,97 Kg hasta 8,86±1,69 Kg los machos. 42 Tabla IV. Datos biométricos de los reproductores utilizados en el experimento Tratamiento Hembras Peso (Kg) (P) Longitud total (cm) (LT) Longitud furcal (cm) (LF) Biomasa kg/m3 Implante 8,74±1,29 87,50±3,90 77,73±4,90 5,31 Inyecion 7,78±0,97 84,25±4,44 73,87±4,75 4,68 Control 8,04±1,03 85,56±3,89 75,36±4,05 5,06 Machos Implante 8,98±2,08 87,83±7,78 74,76±4,90 5,31 Inyecion 7,85±1,77 83,66±7,78 73,27±6,50 4,68 Control 8,75±1,23 85,65±6,48 75,36±5,54 5,06 *Diferencias en los superíndices de la misma columna indican diferencias significativas (P<0,05). Figura. 22. Evolución del peso del stock capturado en el 2011, desde la llegada a la instalación hasta el inicio del experimento. En el año 2011, cuando los reproductores fueron capturados en la naturaleza, el peso total de los 22 ejemplares fue de 63,6 Kg y la biomasa en el tanque de 10m3 donde se estabularon fue de 6,36/m3. En el 2012 el peso total de los ejemplares fue de 134,89 Kg y la biomasa en los dos tanques donde se mantuvieron fue de 6,74 Kg/m3. 43 Figura. 23. Evolución de la longitud total del stock capturado en el 2011, desde la llegada a la instalación hasta el inicio del experimento. Figura. 24. Evolución de la longitud furcal del stock capturado en el 2011, desde la llegada a la instalación hasta el inicio del experimento. 4.2.1. Diámetro de los oocitos En la Tabla V, se indican las medidas del diámetro de los oocitos, de las hembras de los tres tratamientos, antes del inicio del experimento. El análisis estadístico de los datos, 44 indica que no hay diferencias significativas en el diámetro de los oocitos de los tres tratamientos. Tabla V. Valores medios del diámetro de los oocitos de las hembras de cada tratamiento, antes del inicio del experimento Tratamiento N° hembras inducidas Oocitos (mm) Implante 3 0,679±0,087 Inyecion 3 0,666±0,065 Control 0 0,677±0,076 *Diferencias en los superíndices de la misma columna indican diferencias significativas (P<0,05) 4.3. Eficacia de la inducción No se obtuvieron puesta en el grupo control. En la Tabla VI, se representan los datos de la eficacia de la inducción hormonal. En los dos tratamientos experimentales, todas las hembras tuvieron puestas en todas las inducciones, el número de puestas fue de 19 en el tratamiento con implante y de 10 en el tratamiento con inyección. El tiempo de latencia medio en los dos casos es similar. No hubo diferencias estadísticamente significativas en ningunos de los parámetros considerados para la eficacia de la puesta. Tabla VI. Eficacia de la inducción hormonal Tratamiento hormonal N° hembras inducidas N° inducciones % Hembras con puesta N° P uestas N ° Puestas por inducción Periodo de latencia Implante de GnRHa 3 9 100 19 2,11± 2,26 41,12 ± 2,08 Inyección de GnRHa 3 9 100 10 1,11± 0,33 42,37± 1,34 *Diferencias en el superíndices de la misma columna indican diferencias significativas (P<0,05). 45 4.4. Efecto de los tratamientos sobre la calidad de la puesta La Tabla VII muestra los datos de los parámetros de calidad de puesta. El porcentaje de huevos fecundados fue alto en los dos casos, y entre los dos tratamientos no hubo diferencias significativas en este parámetro, sin embargo, el bajo porcentaje de huevos viables en las inducciones con implantes (15,10), fue estadísticamente menor de que el de tratamiento con inyección (42,01). En cuanto a porcentaje de eclosión de los huevos y supervivencia de las larvas hasta la reabsorción del saco vitelino (3 dpe), el tratamiento con inyección tuvo mejores resultados en comparación con los implantes. En estos dos parámetros el análisis estadístico también relevo diferencias significativas. Tabla VII. Parámetros de la calidad de la puesta Tratamiento hormonal % huevos fecundados % Huevos viables % Eclosión % Supervivencia larvaria (3 dpe) Implante de GnRHa 96,99±4,29 15,10±19,18a 37,36±41,92a 31,43±36,63a Inyecion de GnRHa 98,83±1,43 42,01±31,65b 73,33±39,47b 81,56±29,56b *Diferencias en el superíndices de la misma columna indican diferencias significativas (P<0,05). 4.5. Efecto de los tratamientos en la producción 4.5.1 Producción por puesta La Fig. 25 representa los valores, en los dos tratamientos, de las producciones por puesta de: número de huevos, número de huevos fecundados, número de huevos viables, número de larvas nacidas y número de larvas con saco vitelino reabsorbido (3 dpe). 46 DISCUSION análogos (Valdebenito, 2008). Estas hormonas han sido utilizadas en muchas especies, tanto en especies ya producidas a nivel industrial, como en especies emergentes: lenguado senegalés (Agulleiro et al., 2006; Guzman et al., 2009, 2011), corvina (Cárdenas et al., 2009), mero moreno, Epinephelus marginatus (Marino et al., 2003; Conceição et al., 2008; Reñones et al., 2010), bocinegro (Büke et al., 2005; Aristizabal et al., 2009; Mylonas et al., 2011), atún rojo (Mylonas et al., 2007; Corriero et al., 2009), dentón (Mylonas et al., 2011), pez de limón (Mylonas et al., 2004; Fernández-Palacios et al., 2013) o medregal negro (Fernández-Palacios et al., in press). En S. dumerili, los mejores resultados se han obtenido utilizando GnRHa, induciendo los reproductores, tanto por medio de inyección, con una dosis de 20 µg Kg-1 (FernándezPalacios et al., 2013), como por medio de implante, con una dosis de 40 µg Kg-1 (Mylonas et al., 2004). En este estudio se compararon los dos métodos de aplicación de la hormona (inyección e implante), utilizando las dosis indicadas anteriormente. Un factor de importancia a considerar en cualquier tipo de alternativa elegida para la reproducción, es el comportamiento que S. dumerili tiene durante el cortejo nupcial previo al desove, esta especie se reúne en cardúmenes más o menos amplios donde predomina el número de machos (De La Gandara, 2004). Evidentemente, la posibilidad de desarrollar el cortejo nupcial de una forma más eficaz aumenta conforme las dimensiones del tanque de cultivo son mayores. En este sentido, Jerez et al. (2006) describen la reproducción natural de S. dumerili en tanques de 500 m3. De la misma forma se han obtenido puestas inducidas utilizando tanques de gran capacidad: Mylonas et al. (2004) en tanques de 30-40 m3, García et al. (2001) de 40 m3, Hamasaki et al. (2009) de 60 m3, Lazzari et al. (2000) y Kozul et al. (2001) de 70 m3. También se han utilizado tanques de gran capacidad con otras especies del genero Seriola: con S. lalandi, 70 m3 (Moran, 2007), 140 m3 (Stuart y Drawbridge, 2012) y 160 m3 (Sylvia et al., 2006). Con S. quinqueradiata, tanques de 90 m3 (Matsunari et al., 2006) y de 110 m3 (Mushiake, 1996). En S. rivoliana tanques de 18 m3 (Blacio, 2004) y de 25 m3 (Laidley et al., 2004). En nuestro estudio, las puestas inducidas se obtuvieron de reproductores estabulados en un tanque de 10 m3, lo que indica la posibilidad de utilizar tanques de menor volumen para la inducción y puesta del pez de limón, con el consiguiente ahorro de espacio, y con un manejo más sencillo de los reproductores a la hora de realizar muestreos e inducciones. 53 DISCUSION Marino et al. (1995), indican que, en el pez de limón, la diferenciación sexual comienza a expresarse con claridad a partir de los 24-25,5 cm de longitud, en el cuarto-quinto mes de vida, y que en ejemplares salvajes la madurez sexual no empieza antes de los cuatrocinco años de vida. Micale et al. (1999), describen ovarios desarrollados en mayo para hembras de 80 cm, que tenían cinco años de edad, mientras que Marino et al. (1995) encontraron niveles similares de desarrollo ovárico en hembras salvajes de 81,5 cm de longitud, pero con edades de tres y cuatro años. Estos resultados apuntan a que la talla del pez es un factor más importante que la edad, en la maduración gonadal de esta especie. Por otra parte Micaele et al. (1993), observaron una completa diferenciación sexual, al final del segundo año de vida, en peces cultivados. En nuestro caso, pensamos que los ejemplares estaban en el segundo año de vida en el momento de su captura, y que por lo tanto tenían cinco años al comienzo del experimento. En el Mediterráneo, Marino et al. (1995) señalan que el 50% de los ejemplares del pez de limón, alcanzan la madurez sexual con 109 cm las hembras, y con 113 cm los machos, y que el 100% de la madurez se alcanza con al menos 128 cm de longitud total (LT), Micale et al. (1999) indican una LT de 80±3.5 cm. En las islas Hawái, Kikkawa y Everson (1984), indican una longitud furcal (LF) de 72 cm, y en las costas de Florida se señala una LF de 85-90 cm para alcanzar la madurez sexual (Murie y Parkyn, 2010; SEDAR, 2011). En las Islas Canarias, con individuos mantenidos en cautividad, se observaron ejemplares maduros de S. dumerili con 75 cm de LT (Roo et al., 2009). En nuestro estudio las LT de los reproductores fue de 85,64±4,23 cm para las hembras, y de 85,75±6,54 cm para los machos y la LF fue de 75,35±4,76 y de 75,58±5,65 cm para hembras y machos, respectivamente. La época de puesta en el medio natural tiene lugar con el aumento primaveral de la temperatura, aunque varía en función del área geográfica (Lazzari y Barbera, 1988). En el Mediterráneo, tiene lugar entre mayo y julio (Lazzari y Barbera, 1988; Grau et al., 1992). Mandich et al. (2004), describen las primeras ovulaciones de S. dumerili en el mes de mayo, presentando además información relativa a la existencia de un pico de vitelogenina, simultáneamente al de otros esteroides sexuales, en el mes de junio, pasando a no detectarse en agosto, cuando el desove había terminado. Los machos presentan un máximo de testosterona en plasma coincidiendo con la espermatogénesis, 54 DISCUSION mientras que la 11-keto-testosterona, es la hormona que más incrementa su nivel entre los meses de mayo y junio, cuando los machos producían semen activamente. Las hembras presentan un ovario en el que maduran múltiples grupos de oocitos de naturaleza sincrónica (Marino et al., 1995; Micale et al., 1999; Mylonas et al., 2004). Dada la amplia distribución geográfica de esta especie, tanto el periodo natural de puesta como su duración, varía según la localidad, estando asociado este periodo fundamentalmente al incremento en la temperatura del agua producido en primavera (Grau et al., 1992). La temperatura del agua, a lo largo del periodo reproductivo, es un factor de gran relevancia en el proceso de la reproducción de los peces, y tiene efectos sobre la maduración final del oocito (FOM), la ovulación y la puesta (Bromage et al., 2000). La práctica totalidad de los eventos reproductores, y muy particularmente la maduración, ovulación o la liberación de los gametos, requieren de temperaturas óptimas de ejecución para así lograr el éxito reproductor. En caso contrario, la temperatura actúa como un factor limitante del mismo. Además, los valores térmicos que bloquean determinados procesos reproductivos son específicos de cada especie y es necesario caracterizarlos cada vez que se estudia una nueva especie. Carrillo et al. (1993) señalan en reproductores de lubina europea, inducidos mediante manipulación del fotoperiodo la no obtención de puestas con temperaturas por encima de 16 C°. En la trucha alpina (Salvelinus alpinus), temperaturas entre 12 C° y 16 C° retrasan la maduración de los oocitos (Jobling et al., 1995), y en el halibut (Hippoglossus hippoglossus), temperaturas por debajo de 6 C° reducen la producción de huevos y la supervivencia de las larvas (Brown et al., 1995). El periodo natural de puesta de esta especie en Hawái abarca de febrero a junio, con un pico en marzo-abril (Kikkawa y Everson, 1984), en el sur de Florida de marzo a junio, con un pico en abril-mayo (Burch, 1979), de febrero a abril en el Golfo de Méjico (Wells y Rooker, 2004; Thompson et al., 1998), en Carolina del Norte durante los meses de verano (Hildebrand y Cable, 1930). Thompson y Munro, (1974), encuentran hembras maduras en el Caribe a finales del mes de Noviembre, y Erdman (1977) las encuentra durante todo el año. En este mismo sentido, Leak (1981), encuentra hembras maduras en todas las estaciones del año en los cayos de Florida. Micale et al. (1993), comparando el tamaño 55 DISCUSION entre peces salvajes y cultivados con edad conocida, indican que la madurez sexual parece ocurrir al mismo tiempo en el medio natural que en cautividad. En algunas especies de género Seriola, la temperatura es clave en la obtención de puestas espontaneas en cautividad, y esta varia en según la especie, Benetti (2008), señala que la temperatura es la llave para la puesta natural, y difiere con las especies, señalando una temperatura de 17 C° en S. lalandi y de 26ºC para S. rivoliana, de hecho los reproductores de esta especie dejan de poner cuando la temperatura sube de 27ºC o baja de 25ºC, y retornan a poner cuando la temperatura vuelve a los 26ºC (Benetti, 1997). Sin embargo Kawabe et al. (1997), obtienen puestas naturales, de esta especie, con temperaturas entre 21.4 y 28.1ºC, y estiman que la temperatura óptima para la puesta del medregal negro es de 24,127ºC. Jerez et al. (2006) obtuvieron puestas espontáneas de S. dumerili en las Islas Canarias (España), con temperaturas desde 19,7 hasta 24,5 C°, a lo largo del ciclo reproductivo. En este estudio, los reproductores de S. dumerili fueron mantenidos bajo condiciones naturales (temperatura y fotoperiodo), siendo Canarias un lugar de distribución de esta especie. Los valores de temperaturas registrados a lo largo de nuestro experimento, oscilaron entre 20,83±032 C° en mayo y 23,84±0,18 C° en septiembre. La mayor amplitud del periodo de puesta registrado en Canarias, en comparación con los obtenidos en otras regiones, parece estar relacionada con este prolongado periodo con temperaturas del agua entre 19 °C y 24 °C, intervalo en el que se produce la puesta natural, en cautividad de esta especie. El tamaño de los oocitos es una condición muy importante, para que la inducción hormonal tenga éxito, y se produzcan huevos viables. El tamaño mínimo para la inducción es característico para cada especie, y varía de una a otra. En algunos casos inducciones hormonales tempranas, en la que el oocito no ha alcanzado el tamaño adecuado, pueden producir huevos de baja calidad y elevada mortalidad larvaria, como en el caso del salmon Atlántico, donde se observó una elevada proporción de huevos anormales y una mortalidad del 100%, 24h después de la fertilización (Crim y Geble, 1984). El diámetro mínimo de los oocitos, para que las inducciones hormonales tenga éxito, ha sido estudiado en varias especies: en la lubina europea el tamaño mínimo señalado es superior a 600 µm (Alvariño et al., 1992; Asturiano, 1999; Moretti et al., 1999; Prat et al., 56 DISCUSION 2001); en la dorada 500 µm (Moretti et al., 1999); en rodaballo, Mugnier et al. (2000) señalan un diámetro mayor de 600 µm, como el mínimo para la obtención de puestas viables; en la corvina debe de ser mayor de 500 µm, tanto en reproductores capturados en la naturaleza (Duncan et al., 2007), como en reproductores nacidos en cautividad (Fernández-Palacios et al., 2009). En cuanto a la especie objeto de este estudio, Mylonas et al. (2004) indican un tamaño de 650 µm para que la inducción mediante implantes tenga éxito. Si la inducción se realiza mediante inyección, se señalan tamaños del oocito de 550-600 µm (Kozul et al., 2001), o mayor de 600 µm (De la Gandara et al., 2004). El diámetro de los oocitos de los reproductores de este experimento, fue suficiente para inducir hormonalmente la puesta, como ha ocurrido con ejemplares de esta misma especie (García et al., 2001), y de otras especies de esta misma familia como el jurel dentón, Pseudocaranx dentex (Roo et al., 2011) o el medregal negro (Roo et al., 2012; Fernández-Palacios, et al., in press). En S. quinqueradiata, el tamaño del oocito aparece como un factor importante a la hora de realizar las inducciones, Chuda et al. (2005) encuentran que hembras con oocitos superiores a 700 µm ponen el doble de huevos que hembras con oocitos entre 650 y 700 µm, y que el porcentaje de eclosión aumenta con el tamaño del oocito en el momento de la inducción, aunque el tamaño de este no influye sobre el porcentaje de fertilización. Las canulaciones realizadas periódicamente al stock de reproductores, mostraron, hembras con oocitos superiores a 500 µm y machos fluyentes a finales del mes de mayo del 2013, comenzando las inducciones a principios del mes de junio. Las inducciones se realizaron semanalmente, en función de lo señalado por Jerez et al. (2006): puestas naturales, en cautividad, del pez de limón presentaron una periodicidad de siete días en los primeros meses de la época de puesta. Marino et al. (1995) en base a un análisis histológico, postularon que el intervalo de tiempo entre puestas, en esta especie, es superior al de otras especies acuícolas. En el presente estudio se han obtenido puestas en todas las hembras inducidas, por el contrario no se obtuvo ninguna puesta en el tanque de control no inducido. Esto puede indicar, que en las condiciones experimentales como las usadas en este estudio, las inducciones hormonales son la única forma para la obtención de puestas. Jerez et al. 57 DISCUSION (2006), obtienen puestas naturales después de mantener seis años los reproductores en cautividad, en tanques tipo race-way, de 500 m3 de capacidad. En este estudio el periodo de latencia medio fue de 41,12 ± 2,08 h, en los reproductores tratados con implante, y de 42,37± 1,34 h, en los tratados con inyección. El análisis estadístico muestra que no hay diferencias significativas en el periodo de latencia entre los dos tratamientos. Fernández-Palacios et al. (2013), indican que el periodo de latencia osciló entre las 40 y las 46 horas, con una media de aproximadamente 43 horas y media, en puestas de reproductores de esta misma especie, inyectados con GnRHa. García et al. (2001) señalan un periodo de latencia de 30 horas inyectando reproductores de esta misma especie con 50 µg.kg-1 de LHRHa, Mylonas et al. (2004) indican un periodo de latencia de 36 horas en una hembra de 12.5 kg, implantada con 500 µg de GnRHa, lo que implica una dosis de 40 µg.kg-1. Estos diferentes periodos de latencia podrían ser debidos a las diferentes dosis empleadas. En este sentido Fernández-Palacios et al. (2011), encuentran una correlación negativa altamente significativa (P< 0,01) entre la dosis empleada y el periodo de latencia en corvina. Por otra parte Kozul et al. (2001) señalan periodos de latencia de 46-66 horas utilizando HCG. Para S. quinqueradiata Chuda et al. (2001), señalan un periodo de latencia de entre 36 y 54 horas, la inducción se realizó mediante inyección de HCG (500UI/kg). Roo et al. (2012), indican un periodo de latencia de 32 horas en S. rivoliana. Totsui et al. (1979) y Tachihara et al. (1993), señalan periodos de latencia de 36-52 horas, dependiendo de la temperatura. La similitud entre los valores del presente estudio y los señalados por Fernández-Palacios et al. (2013), muestran como en similares condiciones de temperaturas los periodos de latencia son similares, Fernández-Palacios et al. (in press), encontraron una correlación negativa, altamente significativa, entre la temperatura y el periodo de latencia, en puestas de S. rivoliana. El número de puestas por inducción, es una variable usada en la evaluación de la eficacia de la inducción (Fernández-Palacios et al., 2009,2013). Lazzari et al. (2000) señalan que el tratamiento hormonal mediante implante o inyección generalmente, no inducen más que una única puesta en esta especie, posiblemente debido al excesivo estrés provocado por las inducciones. En el presente estudio, se obtuvieron 2,11±2,26 puestas por 58 DISCUSION inducción (19 puestas en 9 inducciones), en el tratamiento con implante, y 1,11±0.33 en el tratamiento con inyección (10 puestas por 9 inducciones). Fernández-Palacios et al. (2013), obtuvieron 22 puestas con 15 inyecciones de GnRHa a lo largo de 123 días, una media de 1,46 puestas por inducción, inyectando los reproductores de esta especie cada 10 días. En el caso de los implantes la liberación de la hormona es más lenta y esto puede aumentar el número de puestas por inducción, como consecuencia de la menor manipulación de los reproductores y el menor estrés generado, aunque como han descrito Carolsfeld et al. (1988), el tiempo de liberación de la hormona GnRHa de cada implante es muy variable. Es posible que el número de puestas por inducción, pueda variar en función del intervalo entre inducciones sucesivas, Mylonas et al. (2004) obtuvieron una puesta en la primera inducción con implante de GnRHa, en el pez de limón, y tres puestas en la segunda inducción con el mismo tratamiento 15 días después, a la 36 horas y el 4°y 5° día después de la inducción. El número de puestas por inducción parece depender de la especie y del método utilizado. En la lubina europea, una inyección de GnRHa induce una sola puesta (Alvariño et al., 1992), mientras que el uso de sistemas a liberación lenta induce puestas múltiples en el 60 % de las hembras (Forniés et al., 2001); en la dorada, una sola inyección de GnRHa produce puestas múltiples en el 20% de las hembras, y la utilización de sistemas de liberación lenta induce puestas múltiples en el 80% de las hembras (Zohar et al., 1995b); en el lenguado del Canadá (Paralichthys dentatus), un solo implante de GnRHa induce ocho puestas, mientras que el control sin tratamiento no tiene puesta (Berlinsky et al., 1997). Para la evaluación de la calidad de la puesta, se determinaron los porcentajes de fecundación, de huevos viables, de eclosión, y de supervivencia de las larvas hasta la reabsorción del saco vitelino (3 días después de la eclosión, 3dpe), usando el protocolo descrito por Fernández-Palacios et al. (2005) En este experimento se encontraron altas tasas de fertilización, tanto en el tratamiento con implante, donde se obtuvo un 96,99 %, como en el tratamiento con inyección donde el porcentaje de huevos fertilizados fue del 98,83, el análisis estadístico mostró que no hay diferencias significativas entre los dos tratamientos. Estos datos están de acuerdo 59 DISCUSION con lo indicado por Fernández-Palacios et al. (2013), que obtiene una tasa de fertilización del 92,28 en reproductores de S. dumerili inducidos con GnRHa, y mantenidos en condiciones similares a las de este estudio. Tanto los peces utilizados en este estudio como lo utilizados por Fernández-Palacios et al. (2013) fueron alimentados con alimento fresco y pienso de alta calidad, específico para reproductores. La alimentación, en reproductores de peces, puede influenciar tanto la calidad de los huevos como la producción de estos, deficiencias nutricionales pueden afectar el sistema cerebro-pituitaria-gónadas, o afectar la producción, y la disponibilidad de algún componente bioquímico, necesario para la formación de los huevos (Izquierdo et al.,2001). La obtención de estas altas tasas de fertilización, puede ser debida, también, a otros factores como: una buena selección de los reproductores, utilizando solo hembras con oocitos mayor de 500 µm y machos con esperma fluyente y una escrupulosa atención en los manejos de los peces, que limita los factores estresantes. Varios autores, han encontrado bajas tasas de fertilización, en puestas en cautividad de S. dumerili, tanto naturales como inducidas. Mylonas et al. (2004) indicaron una tasa de fertilización del 22 %, en reproductores salvajes inducidos con implantes de GnRHa, resultados similares (16-50 %) fueron obtenidos en inducciones con HGC (Kozul et al., 2001). Una tasa de fertilización del 61,75 % fue descrita en puestas espontáneas (Jerez et al., 2006). En otras especies del genero Seriola los resultados son similares a los descritos anteriormente, Muncaster et al. (2012) reportan una tasa del 74% de fertilización, en reproductores inducidos con implantes de GnRHa en S. lalandi, y en S. quinqueradiata, Mushiake (1996), obtuvo tasas de fertilización entre 49,1 y 54,9 %, en reproductores inducidos con HGC. El porcentaje de flotabilidad, de los huevos pelágicos es utilizado normalmente como un índice de la calidad de la puesta (Kjørsvik et al., 1990). No obstante este índice no es utilizable en todas las especies (Kjørsvik et al., 1990; Brooks et al., 1997; Barbaro et al., 1999; Bobe y Labbé, 2010). Además, la estimación de la calidad de la puesta mediante este criterio es complicada, porque los huevos con viabilidad reducida siguen siendo flotantes, o en todo caso se hunden muy lentamente (Barbaro et al., 1999). En nuestro estudio hemos utilizado como uno de los indicadores de la calidad de la puesta el porcentaje de huevos viables, definidos como huevos con morfología normal, 60 DISCUSION transparentes, perfectamente esféricos, y con blastómeros claros y simétricos (Kjørsvik et al., 1990), este porcentaje es utilizado como un indicador de la calidad de la puesta por numerosos autores (Bromage et al., 1994; Fernández-Palacios et al., 1995; Shields et al., 1997). En el tratamiento con implante, el porcentaje de huevos viables fue bajo (15,10), en comparación con lo obtenido con el tratamiento de inyección (42,01). FernándezPalacios et al. (2013) indican un 55,46±26,91%, Kawabe et al. (1996), señalan un porcentaje de huevos flotantes del 65,8-76% y del 89%, dependiendo del origen de los reproductores, salvajes o nacidos en cautividad, en puestas naturales de esta especie. Para otras especies del género se han señalado porcentajes del 60±37-81±17% (Stuart y Drawbridge, 2012), 18-100% con una media del 43% (Sylvia et al., 2006) y del 74±17% (Moran, 2007) en S. lalandi. En S. rivoliana el porcentaje medio de huevos viables fue de 77,19±72 (Fernández-Palacios et al., in press), similar al obtenido para esta misma especie por Roo et al. (2012), que fue del 72,6±17,2 para puestas inducidas, y muy superior al obtenido por Kawabe et al. (1997) que fue del 46.68-48,48%, y por Laidley et al. (2004), que fue de aproximadamente el 30%, para puestas no inducidas utilizando, estos autores, como criterio de viabilidad el porcentaje de huevos flotantes. La supervivencia embrionaria, hasta una etapa especifica del desarrollo, es uno de los métodos más comunes para caracterizar la capacidad del huevo fertilizado, de desarrollarse con éxito. La supervivencia se puede determinar así, en momentos específicos tales como la eclosión, o la reabsorción del saco vitelino (Bonnet et al., 2007). Además, el porcentaje de larvas con el saco vitelino reabsorbido, es un indicador de la calidad de las reservas endógenas contenidas en el saco vitelino, y del potencial intrínseco de supervivencia de la larva (Giménez et al., 2006). En nuestro experimento, obtuvimos una media del 37,36% de eclosión, en las puestas de los reproductores tratados con implante, y del 73,33% en los tratados con inyección. En cuanto al porcentaje de supervivencia de las larvas hasta la reabsorción del saco vitelino (3 dpe), fue del 31,43 con implante y del 81,56 con inyección. Estos datos, los obtenidos mediante inyección, son similares a los indicados por Fernández-Palacios et al. (2013), inyectando reproductores de esta misma especie con la misma hormona y dosis, 80,32±20,45 y 68,39±14,77%, respectivamente. 61 DISCUSION El porcentaje de eclosión en esos dos experimentos, fue muy superior al señalado en puestas no inducidas de S. dumerili por Jerez et al. (2006) que fue del 16,49. Estos autores relacionan este bajo índice con la alimentación de los reproductores, que ese caso, fueron alimentados a saciedad 5 días a la semana, con peces de bajo valor comercial principalmente caballa. En el Mediterráneo, el principal alimento de juveniles y adultos de S. dumerili consiste en: jurel (Trachurus trachurus), boqueron (Engraulis encrasicholus), sardina (Sardina pilchardus) y merluza (Merluccius merluccius), acompañados frecuentemente de cefalópodos, calamar europeo (Loligo vulgaris) y de sepias (Sepiola sp.) y ocasionalmente de crustáceos, galera (Squilla mantis) (Lazzari y Barbera, 1988, 1989b; Matallanas et al., 1995). En nuestro caso la alimentación consistió en caballa, una vez a la semana, y un pienso basado en harina de calamar Vitalis Cal (Skretting) dos veces a la semana. Varios estudios han puesto de manifiesto el efecto beneficioso, en la calidad de la puesta de la alimentación de los reproductores con sepia, calamar o las harinas preparadas de estos cefalópodos (Watanabe et al., 1984a,b; Mourente et al., 1989; Zohar et al., 1995a; Fernández-Palacios et al., 1997; Vassallo-Agius et al., 2001). En el estudio realizado por Fernández-Palacios et al. (1997) se vio una mejora en la calidad, en términos de número de puestas, porcentaje de huevos fecundados, de huevos viables y de eclosión, cuando los reproductores de dorada fueron alimentados con una dieta basada en la harina de calamar Vitalis Cal (Skretting), comparada con los resultados obtenidos con otra dieta basada en harina de pescado Vitalis Repro (Skretting), complementada con mejillón y choco frescos. En otras especies del mismo género Fernández-Palacios et al. (in press) indican un 96.20±5.62 y un 82.49±11.86, en los porcentajes de eclosión y larvas con el saco vitelino reabsorbido respectivamente en puestas inducidas de S. rivoliana. Roo et al. (2012), con la misma especie obtiene un 79,03±11,37% de eclosión y un 52,39±19,14% de supervivencia larvaria. Kawabe et al. (1997), señalan un porcentaje de eclosión del 66,0672,53 con medregal negro. En puestas inducidas de S. quinqueradiata fue del 18,2025,60% (Mushiake, 1996), o del 36-43,1%, dependiendo del alimento suministrado a los reproductores, pescado de desecho o pienso húmedo, respectivamente (Mushiake et al., 62 DISCUSION Bobe, J. y Labbé, C. 2010. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology., 165:535-548 Bonaldo, A., Parma, L., Badiani, A., Serratore, P. y Gatta, P. 2011. Very early weaning of common sole (Solea solea L.) larvae by means of different feeding regimes and three commercial microdiets: Influence on performances, metamorphosis development and tank hygiene. Aquaculture, 321: 237–244. Bonnet, E., Fostier, A. y Bobe, J. 2007. Characterization of rainbow trout egg quality: A case study using four different breeding protocols, with emphasis on the incidence of embryonic malformations. Theriogenology, 67: 786-794. Breton, B., Weil, C., Sambron, E. y Zohar, Y. 1990. 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