Efecto de la irradiación y el flujo de nutrientes sobre el contenido en polisacáridos ácidos en macroalgas cultivadas

MASTER OFICIAL EN CULTIVOS MARINOS III MASTER INTERNACIONAL EN ACUICULTURA Las Palmas de Gran Canarias, España 2012-2014 EFECTO DE LA IRRADIACIÓN Y EL FLUJO DE NUTRIENTES SOBRE EL CONTENIDO EN POLISACÁRIDOS ÁCIDOS EN MACROALGAS CULTIVADAS YOLANDA GARCÍA FERNÁNDEZ TESIS PRESENTADA Y PUBLICAMENTE DEFENDIDA PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE MASTER OFICIAL EN CULTIVOS MARINOS Las Palmas de Gran Canaria 23 de junio de 2014 MASTER OFICIAL EN CULTIVOS MARINOS III MASTER INTERNACIONAL EN ACUICULTURA Organizado conjuntamente por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC), el Instituto Canario de Ciencias Marinas (Gobierno de Canarias) y el Centro Internacional de Altos Estudios Agronómicos Mediterráneos (CIHEAM), a través del Instituto Agronómico Mediterráneo de Zaragoza (IAMZ) EFECTO DE LA IRRADIACIÓN Y EL FLUJO DE NUTRIENTES SOBRE EL CONTENIDO EN POLISACÁRIDOS ÁCIDOS EN MACROALGAS CULTIVADAS YOLANDA GARCÍA FERNÁNDEZ Trabajo realizado en el BEA, Banco Español de Algas; ULPGC Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Islas Canarias, España, bajo la dirección del Dr. Juan Luís Gómez Pinchetti. Presentado como requisito parcial para la obtención del Título oficial de Máster Universitario en Cultivos Marinos otorgado por la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y del Diploma de Master of Science en Acuicultura otorgado por el Centro Internacional de Altos Estudios Agronómicos Mediterráneos (CIHEAM). Director Autor Fdo: Fdo: Agradecimientos i Agradecimientos Mis más sincero agradecimiento a todas las personas que a lo largo de este tiempo me han estado apoyado con mis sueños. A mi director Juan Luis Gómez Pinchetti por todo el apoyo y conocimiento que me lleva transmitiendo durante este tiempo, también por su paciencia y por las horas de sueño que le estoy quitando sobre todo en los últimos meses, gracias por confiar en mí. Al BEA por ofrecerme sus instalaciones y a todo su personal, que al final resultó ser mi segunda familia, gracias a todos pero en particular a Nere, Virgy, Mone, Edu, Loli, Carol, Mireia, Leire, Elena, Antera, gracias chicas por todo vuestro apoyo en los buenos, pero sobre todo en los malos momentos. A mis compañeros de máster y qué máster!!! Aunque todos han sido importantes, algunos han sido compañeros y otros pasan a ser amigos, Nayra, Wafa y Najlae por todas esas charlas resolviendo nuestros problemas, incluso de madrugada, Vini, Giampiero por ser mis niños, Antonio por ayudarme con los programas, seguiré siendo rubia para que me los vuelvas a explicar con tanta paciencia y cariño. Blanqui mi panchiña, gracias por ser como eres. Yani, Samira, me encantó conocerlas y trabajar con ustedes, son muy especiales para mí. Jesús, mi compañero bajo el invernadero, “cuánta caló” hemos pasado, pero a pesar de todo, lo pasamos bien. Al resto Zehor, Serhat, Daniel, Luis, Houda, Giulia, Ana, Rober, Juani e Iván, gracias por haber sido parte importante del máster. Son tantos los amigos que fuera de este mundo de la ciencia me han estado apoyando a pesar de todo, la gente de Asturias, Silvia, Eva, Mónica, Patri y la gente de aquí, sobre todo Isa, amiga, eres la mejor, gracias por estar ahí siempre. A los que sí están en este mundo por muchos méritos también muchísimas gracias, Séfora, cuántas horas al teléfono explicándome cosas para orientarme. Agradecimientos ii Fer, gracias a ti la visión científica de las cosas tiene otro color. A mis compañeras de la facultad, Ruth, Noe, Idaira, Silvia, Yai, Leti, Ico que a pesar de todo seguimos unidas por las redes sociales y se interesan por todo lo que hago, la quiero un montón. Y para finalizar a mi familia, a la que quiero y adoro y a pesar de estar lejos, no dejo de pensar en ellos ni un minuto. Gracias mamá por darme la vida y por ser la mejor madre he podido tener, tu apoyo ha sido muy importante y decisivo en mi vida, me inculcaste buenos valores y eres la que me das fuerza para seguir hacia delante, te quiero mamá. A mi hermana que siempre me ha animado a seguir con mis ilusiones aunque no entendiese por qué quiero seguir estudiando durante tantos años, te quiero Chunchi. A mi cuñado por ser parte ya de la familia, gracias también por estar ahí. A mi padre, al que quiero tanto y ya no está con nosotras, sé que te sentías orgulloso de mí y allá donde estés seguirás apoyándome. Te echo mucho de menos, te quiero papá. Índices iii Contenido AGRADECIMIENTOS ....................................................................................................... I ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................................... V ÍNDICE DE TABLAS ...................................................................................................... VII RESUMEN ....................................................................................................................... IX ABSTRACT ..................................................................................................................... XI LISTAS DE ABREVIATURAS ...................................................................................... XIII 1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 1 1.1. CULTIVOS MULTITRÓFICOS INTEGRADOS (AMTI) ................................................. 5 1.2. SISTEMAS DE CULTIVO ....................................................................................... 8 1.3. UTILIDADES DE LAS ALGAS ................................................................................. 9 1.3.1. Industria de los ficocoloides ..................................................................... 10 1.3.2. Otros polisacáridos con actividad biológica ............................................. 14 1.4. OTROS USOS .................................................................................................. 20 1.4.1. Alimentación, nutracéutica y cosmética ................................................... 20 1.4.2. Agropecuaria ............................................................................................ 20 1.4.3. Acuicultura ................................................................................................ 21 1.4.4. Biocombustibles ....................................................................................... 21 2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 24 3. MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................................... 25 3.1. ESPECIES SELECCIONADAS, DISEÑO EXPERIMENTAL Y CONDICIONES DE CULTIVO 25 3.2. DISEÑO EXPERIMENTAL Y CONDICIONES DE CULTIVO ......................................... 29 3.3. CÁLCULO DE LA PRODUCCIÓN DE LAS DISTINTAS ESPECIES ................................ 32 3.4. BIOFILTRACIÓN DE AGUAS RESIDUALES: AMONIO .............................................. 33 3.5. DETERMINACIÓN DEL RENDIMIENTO CUÁNTICO ÓPTIMO (FV/FM) DEL PSII COMO INDICADOR DE ESTRÉS (MEDIDAS DE FLUORESCENCIA DE CLOROFILA) ................ 34 Índices iv 3.6. CARACTERIZACIÓN DE LA BIOMASA ................................................................... 35 3.7. DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS ............................................ 35 3.8. ANÁLISIS DE CONTENIDO DE CARBONO Y NITRÓGENO (C/N) ............................... 36 3.9. EXTRACCIÓN DE POLISACÁRIDOS ÁCIDOS ......................................................... 36 4. RESULTADOS ...................................................................................................... 38 4.1. PRODUCCIÓN DE LAS ESPECIES ENSAYADAS ..................................................... 38 4.2. CAPACIDAD DE BIOFILTRACIÓN ......................................................................... 42 4.3. RENDIMIENTO CUÁNTICO ÓPTIMO DEL FOTOSISTEMA II (FV/FM) ......................... 45 4.4. EVOLUCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS ................ 46 4.5. ANÁLISIS DE LAS RELACIONES C:N ................................................................... 53 4.6. CONTENIDO EN POLISACÁRIDOS ....................................................................... 56 5. DISCUSIÓN ........................................................................................................... 61 6. CONCLUSIONES .................................................................................................. 69 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 71 Índices v Índice de figuras Figura 1. Utilización y suministro mundial de pescado. FAO, 2011. ................................................. 1 Figura 2. Impactos producidos por la acuicultura sobre el medio acuático, modificado a partir de “The fishprint of Aquaculture. Can the blue revolutio n be siutanable?. K Wolowicz, 2005. ...... 2 Figura 3. Países que invierten en trabajos de investigación en acuicultura con algas, en amarillo, países productores de biomasa, en naranja, y países que registran patentes. Mazarrasa et al., 2013 ..................................................................................................................................... 3 Figura 5. Producción de macroalgas por especies. FAO, 2012. ...................................................... 4 Figura 4. Producción de macroalgas por países. FAO, 2012. ........................................................... 4 Figura 6. Sistema de cultivo multitrófico (AMTI), formado por peces, crustáceos, equinodermos, moluscos y algas en el medio marino. ...................................................................................... 6 Figura 7. Usos industriales de las algas. ......................................................................................... 10 Figura 8. Hydropuntia cornea, izquierda en naturaleza, derecha en cultivo.................................... 26 Figura 9. Hypnea spinella, izquierda en naturaleza, derecha en cultivo ......................................... 27 Figura 10. Jania adhaerens, izquierda en naturaleza, derecha en cultivo. ..................................... 28 Figura 11. Halopithys incurva, izquierda en naturaleza, derecha en cultivo.................................... 28 Figura 12. BEA, Banco Español de Algas, situado en el muelle de Taliarte s/n, Telde, donde tuvo transcurso el experimento. ...................................................................................................... 29 Figura 13. Circuito del sistema de bombeo a escala piloto. ............................................................ 30 Figura 14. Esquema de distribución de los tanques ........................................................................ 30 Figura 15. Disposición de los tanques a escala piloto, A bajo invernadero (80% PAR +10%UVA) y B en el exterior (100% PAR). .................................................................................................. 31 Figura 16. Toma de muestras de agua en la entrada del tanque (izquierda) y a la salida del tanque (derecha) para el análisis de biofiltración. ............................................................................... 33 Figura 17. Precipitación de los polisacáridos ácidos (izquierda), polisacárido purificado (derecha) y polisacárido purificado liofilizado y envasado (abajo). ............................................................ 37 Figura 18. Radiación PAR acumulada semanal interior y exterior y temperatura media en el interior y exterior semanal durante el cultivo de Hypnea spinella. ...................................................... 40 Figura 19. Rendimiento cuántico óptimo del PSII por especies, a lo largo del experimento, 4 semanas con aporte de nutrientes y 2 semana con agua de mar (SW). Datos expresados como medias ± SE. ................................................................................................................. 45 Figura 20. . Hydropuntia cornea con distinta morfología, ramas cortas y finas a modo de pequeños pompones. Color amarillo sin aporte de nutrientes (izquierda) y con aporte de nutrientes, color rojo (derecha). Otra morfología es la de tamaño pelota de tenis, ramas más gruesas y alargadas. ................................................................................................................................ 51 Figura 21. Distintos cambios morfológicos, tanto en color como en forma. A Halopithys incurva, con aporte de nutrientes B Jania adhaerens con aporte de nutrientes y C Hypnea spinella, con aporte de amonio, color rojizo y sin aporte de nutrientes, color amarillo. ........................ 51 Índices vi Figura 22. Relaciones C:N por tanque y semana de cultivo. Datos expresados como medias ± SE, n=3. .......................................................................................................................................... 54 Figura 23. Relaciones entre el contenido en polisacáridos con la relación C:N en función de la irradiancia por tanque. Datos expresados como medias ± SE, n=3. ...................................... 59 Índices vii Índice de tablas Tabla I. Países productores de macroalgas y volumen de producción en millones de toneladas. FAO, 2012. ................................................................................................................................ 3 Tabla II. Solubilidad de los carragenatos. ........................................................................................ 13 Tabla III. Códigos asignados a los alginatos en la industria. ........................................................... 14 Tabla IV. Revisión de las aplicaciones de los polisacáridos de distintas especies de algas en la literatura reciente (2003-2014). ............................................................................................... 17 Tabla V. Valores de irradiación y temperatura durante el experimento. Datos expresados como medias ± SE, n=16. ................................................................................................................. 39 Tabla VI. Producción media por especies y semanas de cultivo en condiciones experimentales a escala piloto exterior e interior (bajo invernadero). (1) Después de dos semanas sin aporte/flujo de N/P (sólo agua de mar) (2) Experimento de co-cultivo. Datos expresados como medias ± SE, n=3. ................................................................................................................... 41 Tabla VII. Flujos medios ± SE durante los cultivos experimentales tanto en interior como en exterior. Datos expresados como medias ± SE, n=3. ............................................................. 42 Tabla VIII. Valores de NUE (%) y NUR (mmol m-2h-1) tasa de eliminación por especie y semana de cultivo, en condiciones experimentales a escala piloto exterior e interior (bajo invernadero). (1) Después de dos semanas sin aporte/flujo de N/P (sólo agua de mar) (2) Experimento de cocultivo. Datos expresados como medias ± SE, n=3. ............................................................... 44 Tabla IX. Concentraciones de ficobiliproteínas (Ficoeritrina y Ficocianina) (mg g-1 PS) por especie y semana de cultivo, en condiciones experimentales a escala piloto interior (bajo invernadero) y exterior. (1) Después de dos semanas sin aporte/flujo de N/P (sólo agua de mar) (2) Experimento de co-cultivo. Datos expresados como medias ± SE, n=3. ............................... 49 Tabla X. Concentraciones de clorofila a (mg g-1 PS) por especie y semana de cultivo, en condiciones experimentales a escala piloto interior (bajo invernadero) y exterior. (1) Después de dos semanas sin aporte/flujo de N/P (sólo agua de mar) (2) Experimento de co-cultivo. Datos expresados como medias ± SE, n=3. ........................................................................... 52 Introducción 1 1. Introducción Debido al gran interés por las materias primas, el medio marino se ha visto sometido a una gran sobreexplotación, la acuicultura ha colaborado con la generación del 39% de los alimentos de origen acuícola, de ellos el 46.2% son algas (FAO, 2009), que al haberse desarrollado las bases científicas del cultivo de algas a nivel mundial (Santélices and Doty, 1989), mantienen un ritmo de crecimiento sostenible. Otros organismos marinos cultivados en acuicultura son los bivalvos con un 42.9%, peces diádromos 5.3%, peces marinos 3.7% y crustáceos 1.8%. (FAO, 2011). El crecimiento de la producción en acuicultura se ha debido al progreso en la distribución, aumentando el suministro mundial de alimento cuantiosamente en las últimas 5 décadas, con una tasa media del 3.2 % desde 1961-2009, superando así el índice de crecimiento de la población mundial del 1.7 % anual (fig. 1). La producción acuícola mundial ha seguido creciendo, aunque a un ritmo más lento que en las décadas de 1980 y 1990. En 2010 se alcanzó otro máximo histórico en producción acuícola mundial llegando a los 60 millones de toneladas, excluyendo las plantas acuáticas y los productos no alimentarios, pero si se Figura 1. Utilización y suministro mundial de pescado. FAO, 2011. Introducción 2 incluyesen las cifras aumentarían hasta 79 millones de toneladas (FAO, 2011). El aumento en las producciones pone de manifiesto otro tipo de problemas que hay que solventar para que la acuicultura pueda ser sostenible en el tiempo. Estos problemas son básicamente debidos a la gestión en el abastecimiento y calidad de los piensos que se dan a los animales, los relacionados con enfermedades y también con problemas de impactos ecológicos derivados de los escapes, ubicación de las granjas, etc (fig. 2). (Buschmann et al., 2008a; Duarte et al., 2009; Troell et al., 2009; Chávez-Crooker y ObrequeContreras, 2010). El incremento de los recursos biológicos representa un cambio, en el que el ser humano consigue beneficios del océano (Duarte et al., 2009). Siendo una oportunidad de desarrollo para el país, ya que hay una diversificación en los productos, apostando por nuevos mercados emergentes. El efecto combinado de una rápida domesticación y producción, por ejemplo con las algas, hace que incremente la demanda, a la vez que se promueve la innovación en la investigación biotecnológica desarrollando patentes, pero continúa habiendo grandes diferencias entre países productores y los países que invierten en Figura 2. Impactos producidos por la acuicultura sobre el medio acuático, modificado a partir de “The fishprint of Aquaculture. Can the blue revolution be siutanable?. K Wolowicz, 2005. Introducción 3 investigación y crean patentes (Mazarrasa et al., 2013) (fig. 3). No obstante, existe una enorme diferencia entre la acuicultura animal y el cultivo de algas, no tanto en producción, debido a que es equiparable a las tasas de las de los animales acuáticos, con un incremento de 3.8 millones de toneladas a 19 millones de toneladas desde los años 1990 a 2010, además sólo un 4.5 % de la producción pertenece a las recolectadas en la naturaleza, si no en el número de países que se dedican al cultivo de algas (FAO, 2012). Sólo 31 países produjeron algas en 2010 y el 99.6 % de la producción provienen de 8 países (tabla I), (fig. 4). Figura 3. Países que invierten en trabajos de investigación en acuicultura con algas, en amarillo, países productores de biomasa, en naranja, y países que registran patentes. Mazarrasa et al., 2013. Tabla I. Países productores de macroalgas y volumen de producción en millones de toneladas. FAO, 2012. Introducción 4 El 98.9 % de la producción mundial en 2010 pertenece a un única especie de alga, Saccharina/Laminaria japónica, cultivadas en las aguas costeras de China, le sigue en producción Eucheuma (Kappaphycus alvarezii y Eucheuma spp), Gracilaria spp, Porphyra spp, Undaria pinnatifida después hay especies no identificadas, principalmente en China. En menor cantidad también son cultivadas otras macroalgas como Sargassum fusiforme y Caulerpa spp, las microalgas también se tienen en cuenta, principalmente se cultivan Spirulina spp y en menor proporción Haematoccocus pluvialis (fig. 5) (FAO, 2012). Figura 5. Producción de macroalgas por países. FAO, 2012. Figura 4. Producción de macroalgas por especies. FAO, 2012. Introducción 5 1.1. Cultivos multitróficos integrados (AMTI) Como se ha comentado anteriormente uno de los principales inconvenientes para lograr la sostenibilidad medioambiental de la industria acuícola, es el poder reciclar todos los desechos que se generan, como es la liberación de nutrientes al medio, que básicamente provienen en forma particulada como restos de pienso no consumido y las excreciones de los organismos cultivados y en forma disuelta sobre todo en forma de N-amonio (NNH4+) y P-fosfatos (P-PO3 2-), (Neori et al., 2000; Schuenhoff et al., 2003), además hay que tener en cuenta la producción del CO2 generado en los procesos respiratorios, todos estos procesos son los que ocasionan un gran impacto en el medio sobre todo en las zonas más cercanas a las costas dónde se encuentran las granjas acuícolas (Ackefors y Enell, 1990; Tovar et al., 2000). Estos procesos conllevan una eutrofización del medio por el excesivo contenido en nutrientes (Chopin et al., 2001; Troell et al., 2003; Neori et al., 2004). Si bien se conocen y se aceptan estos impactos, se asume que deberán ser minimizados al máximo, donde los residuos sean reconvertidos en biomasa aprovechando las sustancias bioactivas asociadas, evitando vertidos y diluciones en el medio (Gómez Pinchetti et al., 2011), además de emplear procedimientos de cultivo adecuados que incluyan unas garantías en la regulación, control y monitoreo de las aguas. Sin embargo, todavía hay que aprender de la estrategia y el marco normativo para esa regulación, control y monitoreo de los impactos ambientales de la acuicultura marina en la Unión Europea (Read y Fernandes, 2003). Hay asociaciones involucradas en el sector acuícola que creen que la aplicación de mejoras en prácticas de manejo, pudiendo ser una manera más razonable y al alcance de todos para reducir el volumen de los efluentes y mejorar la calidad del medio ambiente (Boyd, 2003). La biofiltración de esos efluentes puede ser realizada por las macroalgas, teniendo en cuenta dos conceptos básicos, la eficiencia de asimilación (UE), que es la reducción en porcentaje en la concentración de nutrientes y la tasa de asimilación (UR), es la concentración de nutrientes que es asimilada/eliminada por unidad de tiempo y en relación a la superficie/volumen del sistema de cultivo (Troell et al., 2003). La biofiltración puede verse afectada por parámetros ambientales, físicos o biológicos y en Introducción 6 Figura 6. Sistema de cultivo multitrófico (AMTI), formado por peces, crustáceos, equinodermos, moluscos y algas en el medio marino. función de ello se pueden plantear varios objetivos, una eficiencia de biofiltración alta donde las tasas de asimilación, la producción de biomasa y la concentración de nutrientes en el efluente sean bajas, o por el contrario haya una eficiencia de la biofiltración baja dónde la tasa de asimilación, la producción de biomasa y la concentración de nutrientes en el efluente sean altas (Buschmann el al., 2001). Bajo todos estos preceptos, se estimula la acuicultura multitrófica integrada (AMTI), no desechando nada, esto es, que el residuo que genera un eslabón de la cadena trófica, puede ser reutilizado por otro como base de su alimentación (Chopin et al., 2008; Neori, 2008; Troell et al., 2009). Se investiga el uso de algas en la depuración de efluentes de piscifactorías cargados de compuestos de nitrógeno, fósforo y carbono que al ser consumidos por las algas reducen la eutrofización de aguas costeras, aprovechando la biomasa generada con otros objetivos (Figueroa et al., 2011). La biomasa generada en estos sistemas sufre estrés debidos al exceso o defecto de nutrientes, condiciones adversas de irradiación, etc, este estrés puede ser medido in vivo mediante la determinación de la capacidad fotosintética, midiendo la fluorescencia de la clorofila asociada al fotosistema II (PSII), caracterizando así estos cultivos (Figueroa et al., 2006, Mata et al., 2006). Los sistemas de cultivo multitróficos están diseñados para que haya una armonía entre el flujo de materia y energía entre los distintos eslabones de la cadena, siendo lo más efectivo posible. Así, en el mismo espacio se encuentran distintos organismos con funciones muy diferentes, como peces, crustáceos, equinodermos, moluscos (fig. 6). Introducción 7 El fin del cultivo conjunto, como hemos comentado, es aprovechar los desechos de unos y convertirlos en nutrientes para otros, a la vez que se eliminan los productos que eutrofizan el medio y se aumenta la productividad del sistema (Shpigel et al., 1993; Neori et al., 1998, 2000, 2004; Chow et al., 2001; Jones et al., 2002; Troell et al., 2003). Si además incluimos macroalgas, estaremos diversificando aún más las especies (Bunting y Shpigel, 2009), al mismo tiempo las macroalgas aprovechan no sólo el exceso de nutrientes sino que al realizar los procesos fotosintéticos eliminan el CO2 y lo convierten en O2, mejorando el medio al aportarle oxígeno y elevar el pH. Las algas al realizan varios procesos metabólicos, durante el día, consumen el amonio transformándolo en proteínas. Confieren al sistema una pequeña protección ya que tienen propiedades antifúngicas, antioxidantes y antibacterianas contra los ataque de hongos y bacterias (Prabha et al., 2013). Existen distintos estudios que indican cuales son las mejores especies de algas para ser cultivadas en los sistemas AMTI, así pues especies de los géneros como Ulva, Codium, Gracilariopsis, Gracilaria, Palmaria, Hypnea, Chondrus, Kappaphycus, Porphyra, Falkenbergia y Laminaria dan buenos resultados como biofiltro (Neori et al., 2004; Msuya y Neori, 2008), y como especies plásticas que se acomodan a las distintas condiciones del cultivo. En otros trabajos se seleccionaron algas rojas (Rhodophyta), verdes (Chlorophyta) y pardas (Phaeophyta) y se observó la alta capacidad de biofiltración que poseen (Kang et al., 2013). Otra tendencia es la de incorporar co-cultivos de dos especies de macroalgas en el mismo tanque (Güenaga, 2011), y ver si la combinación aumenta los potenciales que cada especie tiene por separado. En los sistemas AMTI, las macroalgas actúan como biofiltro (Porter et al., 1987; Neori et al., 1996; Msuya et al., 2006; Cahill et al., 2010), se puede dar uso a la producción obtenida, ya sea como alimento para especies más apreciadas en el mercado (Schuenhoff et al., 2003; Viera et al., 2005; Troell et al., 2009), como para la extracción de sustancias bioactivas de interés. Las macroalgas se pueden utilizar como sistemas de biorremediación ya Introducción 8 que pueden absorber iones de metales pesados, como zinc y cadmio, del agua contaminada (Cuizano y Navarro, 2008). Algunas de las ventajas que ofrece la fitorremediación son el bajo costo y la rapidez con que pueden llevarse a cabo ciertos procesos degradativos (Carton-Kawagoshi et al., 2014). 1.2. Sistemas de cultivo Alrededor de 221 especies de algas son utilizadas (Duarte et al., 2007), 145 especies están destinadas a la alimentación y 101 para la producción de ficocoloides (Zemke-White y Ohno, 1999), las más utilizadas han sido Laminaria sp., Macrocystis, Ascophyllum, Gelidium y Pterocladia, entre otras. Así pues, cada vez se hace más patente el avance en los modelos de cultivo de algas, no sólo para la preservación de las especies en la naturaleza que son explotadas, si no para mejorar la calidad de la biomasa producida en dichos sistemas, haciendo al mismo tiempo la producción sostenible. El cultivo de macroalgas es muy versátil, ya que pueden ser cultivadas de manera semi-intensiva en estanques o lagunas sin control efectivo, también se puede intensificar el cultivo, cultivando en raceways y en tanques. En los sistemas intensivos se puede jugar con el diseño, materiales de construcción, superficies, volúmenes, aireación y mecanización para obtener un mejor rendimiento del cultivo además de tener un alto control sobre la biomasa demostrando que son sistemas más productivos que los semi-intensivos (Friedlander y Levy, 1995). Es fundamental un buen diseño del sistema de cultivo, para procurar que el estado fisiológico de las macroalgas sea el idóneo, ya que de lo contrario, repercutirá en la productividad y eficiencia del sistema, para evitar estos problemas hay que tener en cuenta varios parámetros que resultan importantes para que las macroalgas estén fisiológicamente bien y puedan desarrollar su función primaria, que es la fotosíntesis. Hay que tener en cuenta, la irradiación y temperatura, el aporte de nutrientes y bombeo del agua, aireación, aporte de carbono inorgánico, pH, competencia entre especies, predadores, densidad de cultivo, ya que no todas las Introducción 9 algas son susceptibles de ser cultivadas debido a su ecología y biología, así pues cuanto más controlado sea el sistema, los rendimientos serán mayores y la biomasa obtenida tendrá una mejor calidad (Friedlander y Levy, 1995). Se puede combinar el diseño de los sistemas también en favor de solucionar problemas derivados de la eutrofización del medio, es decir, aprovechando las capacidades de biofiltración, incluso incrementarla, distribuyendo los tanques en cascada con distintas concentraciones de nutrientes y flujo de nutrientes (Gómez Pinchettti et al., 2011) o como mencionamos antes co-cultivos de varias especies, en el mismo tanque, aprovechando los potenciales de distintas especies al mismo tiempo (Güenaga, 2011). Diversificando, tanto el sistema de cultivo como las especies en sí, podemos comparar los beneficios de un monocultivo frente a co-cultivos, de igual modo que los cultivos multitróficos integrados (AMTI) y los cultivos en cascada, observándose grandes diferencias y beneficios de estos últimos (Abreu et al., 2009; Nobre, et al., 2010, Gómez Pinchetti et al.,2011; Güenaga, 2011). A pesar de ser sistemas de cultivo muy eficientes en cuanto a biofiltración, producción y obtención de metabolitos de interés a escala de planta piloto (Buschmann et al., 2001; Troell et al., 2003; Neori et al., 2004), si lo extrapolamos a escala industrial, surgen una serie de limitaciones que hay que resolver, sobre todo relacionados con las demandas superficiales en los sistemas de cultivo de macroalgas, que al contrario que los peces que son cultivados en función del volumen, las macroalgas dependen de superficie aérea debido a que necesitan la radiación solar para realizar la fotosíntesis. Estos problemas se podrían solucionar si se plantease aumentar el número de nuevas especies con alta capacidad de biofiltración, los co-cultivos de varias especies con intereses aplicados o incluso la distribución de los biofiltros, por ejemplo en cascada, haciendo más interesantes, eficaces y sostenibles los sistemas multitróficos integrados (AMTI) con macroalgas. 1.3. Utilidades de las algas Las algas están arraigadas en la cultura desde tiempos ancestrales, Introducción 10 habiéndoles dado distintos usos, como alimento suplementario por su alto contenido de sales minerales (Yodo, Potasio, etc.) o por el hecho de poseer sustancias viscosas o coloidales dando una consistencia gelatinosa a los alimentos, utilidades que en la actualidad se siguen manteniendo de forma tradicional en pequeñas aldeas o pueblos, en cambio otras han evolucionado sacándoles partido a gran escala de manera industrial, por otro lado gracias a la investigación se han descubierto nuevos usos. Entre las utilidades que se les da a las algas se encuentran, la industria alimentaria, agropecuaria, nutracéutica, química, cosmética, biofuel, médicafarmacológica, industria de los ficocoloides, biorremediación, acuicultura (Chan et al., 2006) (fig. 7). 1.3.1. Industria de los ficocoloides El principal extracto comercial de las algas son los denominados hidrocoloides o ficocoloides que son polisacáridos de cadena larga y se encuentran en las paredes celulares de algunas especies de macroalgas. Cuando son extraídos, forman disoluciones no cristalinas con el agua dando una solución viscosa, propiedad muy utilizada en la industria alimentaria. Los ficocoloides de importancia comercial obtenidos a partir de las algas son el agar-agar, los Figura 7. Usos industriales de las algas. Introducción 17 Tabla IV. Revisión de las aplicaciones de los polisacáridos de distintas especies de algas en la literatura reciente (2003-2014). Especie Gracilaria caudata - Swiss mice Hypnea spinella y Halopithys incurva Sphaerococcus coronopifolius y Boergeseniella thuyoides Giganinaceae y Tichocarpaceae Gracilaria caudata Porphyridium sp., P. cruentum, P. aerugineum, and Dixoniella grisea Botryocladia occidentalis Giganina acicularis, G. pisillata, Eucheuma cottonií, E. spinosa, F. vesiculosus Schizymenia dubyi Hydropuntia cornea· Solea senegalensis Grateloupia indica Actividad Rhodophyta Actividad antiinflamatoria y anticonceptiva en ratones Propiedades inmunoestimuladores , para ver los efectos en la síntesis de citoquinas Inhibidores in vitro de la replicación del VIH , además del Herpes simplextipo 1 (HSV·1) Actividad antioxidante estimulando la actividad catalítica de la superóxido dismutasa. Protector intestinal frente a daños inducidos en ratas Múltiples aplicsciones , biotecología , bioingeniería , bioquímica , fisiología , etc Actividad antioxidante en post larvas de Litopenaeus vannamei Actividad antioxidante comparando algas pardas y rojas Anticoagulante , siendo efecticos , seguros y más fáciles de utilizar . Estimulación de los fagocitos en el proceso respiratorio en Solea senegalensis Actividad antiviral frente al virus HSV·1 y HSV·2 Referencia Chaves et al , 2013 Abdala Díaz et al ., 2011 Bouhlal et al ., 2011 Sokolova et al ., 2011 Silva et al , 2011 Arad y Levy-Ontman , 2010 Cavalcante et al , 2007 Rocha de Souza et al. , 2007 Ekanayake et al ., 2007 Díaz-Rosales et al ., 2007 Chatlopadhyay et al ., 2007 Introducción 18 Gracilaria tenuistipitata - Litopenaeus vannamei Porphyra haitanensis - mice Gymnogongrus griffnhsiae, Cryptonemia crenulata - virus type 1 (HSV-1), 2 (HSV-2) Porphyra haitanesis - rats Ecklonia cava Sargassum naozhouense Sargassum vulgare lonarla sp., Chnoospora sp. Sargassum sp ., Spatoglossum sp. y Sargassum sp. Ecklonia cava - células cancerígenas humanas Laminaria japónica Macrocystis Pyriter, Chondrus crispus - Epinephelus coicoides Inmunoestimulación frente a parámetros como contajel de hemocitos, la actividad fenoloxidasa, proceso respiratorio, la superóxido dismutasa ,la actividad fagocítica y eficiencia frente al patógeno Vibrio alginolyticusen Lilopenaeus vannamei Actividad antioxidante in vivo de la peroxidación lipídica en ratones. Propiedades antivirales frente al virus Herpes simplex Actividad antioxidante en radicales hidroxilo libres, inhibidores de la lipasa oxidasa en el hígado de ratones Phaeophyta Actividad antiinflamatoria en líneas celulares de macrófagos murinos Composición química para la industria alimentaria y actividad antiviral para usos en medicina Actividad anticoagulante, antitrómbica, antioxidante y antiinflamatoria en ratas. Usos industriales Actividad anticoagulanteantiproliferativa en el carcinomade colon Actividad antioxidante en estudios en sistemas in vilro, eliminando radicales superóxido e hidroxilo, capacidad quelante, y poder reductor Actividad inmunoestimuladora frente al Vibrio alginolylicus Hou y Chen, 2005 Zhang el al ., 2004 Talarico el al ., 2004 Zhang el al ., 2003 Wijesinghe el al., 2013 Peng el al ., 2013 Guerra Dore, el al., 2013 Andriamanantoanina y Rinaudo,2010 Athukorala el al., 2009 Wang el al ., 2008 Chen el al ., 2007 Introducción 19 Laminaria japonica Actividad antioxidante y hepatoprotectiva en polisacáridos de bajo Zhao el al. , 2004 peso molecular Chlorophyta Enteromorpha linza - plasma Actividad de sulfatación , anticoagulante y antioxidante Wangel al. , 2013 de pollo Ulva sp. Aplicaciones biológicas Alves el al ., 2010 Ulva rigidaTurbot Evaluar la capacidad estimuladora de los fagocitos del rodaballo Castro el al. , 2006 Ulva conglobara Actividad anticoagulante en plasma humano Mao el al ., 2006 Ulva perlusa Actividad antioxidante en función de los distintos pesos moleculares Qi el al ., 2005 de los polisacáridos sulfatados Diferentes especies Diferentes especies Reducir la hipertensión , preclampsia EI-Said y EI-Sikaily , 2013 Diferentes especies Inmunoestimulantes y prebióticos en acuicultura. PesoEcharri el al. , 2013 Diferentes especies Actividad antioxidante , inmunoestimulación , industria nutracéutica Freitas el al ., 2012 Diferentes especies Aplicaciones diversas , cosmética , farmacológica , alimentaria , Stengel el al ., 2011 anticoagulante , antiinflamatoria , antiviral , antioxidante , etc Diferentes especies Actividad antioxidante , inmunoestimulador , antiinflamatorias , etc Brown , el al ., 2014 Introducción 20 1.4. Otros usos 1.4.1. Alimentación, nutracéutica y cosmética La macroalgas son apreciadas debido a sus altos contenidos en proteínas y fibra contribuyendo y promoviendo la salud humana (Ferreira et al., 2011), previenen el desarrollo de la hipertensión y arteriosclerosis y mejoran el metabolismo de grasas, ya que son fuente de los llama dos “PUFA”, ácidos grasos poliinsaturados (Nagao y Yanagita, 2005). Algunas especies pueden reducir los niveles de colesterol en sangre gracias a los micro y macronutrientes que tienen, les confieren no solo un alto valor nutricional sino un gran potencial nutracéutico (Abirami y Kowsalya, 2011). Todas las algas tienen en su composición vitaminas y especialmente minerales (hasta 30% por volumen), como el Fe, Mg, Na, K, Fe, Mn, Zn, Cu, Ni, Co, Cr, Cd, y hasta un 10% más de calcio que los productos lácteos, además tienen carbohidratos (El Said y El-Sikaily, 2013), aunque la composición varía según la especie, hábitat, estado de maduración y condiciones ambientales (Ito y Hori, 1989). A partir de ellas se extraen sustancias antioxidantes como la vitamina C (ácido ascórbico), vitamina E (α-tocoferol), carotenoides (β-caroteno, astaxantina), polifenoles de té verde, flavonoides, extractos de Polypodium leucotomos y ácidos grasos Omega-3, entre otros (Figueroa et al., 2011). Las aplicaciones cosméticas son de las más conocidas, creando toda una gama de productos como jabones, champús, cremas, mascarillas, lociones, barras de labios, espumas de afeitar, etc, ya que la acción benéfica es visible en tratamientos contra el acné, dermatitis, psoriasis (Grether-Beck et al., 2008), la caída del cabello, antiarrugas, seborrea y un largo etc. 1.4.2. Agropecuaria Los arribazones de algas, mejoran la composición nutricional y acondicionan el suelo por sus propiedades, ayudan al control del crecimiento de las malas hierbas y mantienen la humedad (Coupland et al., 2007). Las más utilizadas han sido Laminaria, Ascophyllum y Sargassum, también son utilizadas como complemento en la dieta del ganado (Casas-Valdez et al., Introducción 21 2006), como extractos para mejorar el estado inmunitario de los animales frente al estrés (Kannan et al., 2007) o en cultivos hidropónicos mejorando el tamaño de las plantas además de mejorar parámetros bioquímicos como pigmentos o contenido en proteínas (Latique et al., 2013). Hay empresas que fabrican harinas de algas para suministrárselas al ganado, por su aporte en algunos aminoácidos esenciales como la Arginina, Triptófano y Fenilalanina, también por los betacaroteno y vitaminas (Marin et al., 2009). El procesado de las harinas es costoso, la industria optimiza el recurso desarrollado fertilizantes basados en extractos líquidos de algas, y aplicarlos a cultivos de alto valor aportando un mayor valor económico, como ciertas hortalizas y las bayas. 1.4.3. Acuicultura En acuicultura las algas pueden ser el cultivo principal o un cultivo auxiliar, son las llamadas aguas verdes y son microalgas, aunque también hay cultivos auxiliares de macroalgas que sirven de alimento para un cultivo principal que serán distintas especies de moluscos, crustáceos o peces. Las microalgas van a servir de alimento para las fases larvarias y conseguir una alta tasas de supervivencia (Palmer et al., 2007). El cultivo de las especies auxiliares es la base del desarrollo acuícola (Neori, 2011), estos cultivos se ven obligados a soportar amplios rangos de temperatura y salinidad, además de cultivarse durante todo el año. Las líneas de investigación siguen la búsqueda de nuevas especies que mejoren los requerimientos alimentarios necesarios para que la especie de cultivo principal tenga una mayor tasa de supervivencia y un mayor y mejor crecimiento, evitando deformaciones y enfermedades así que se proponen especies alternativas a las tradicionales (Chen et al., 2012). 1.4.4. Biocombustibles La importancia de la búsqueda de biocombustibles es debida al agotamiento de los combustibles tradicionales y al aumento de los gases de efecto invernadero, los biocombustibles provenientes de las algas son sostenibles ecológicamente y ayudan a la reducción de esos gases ya que son organismos autótrofos que transforman el CO2 en lípidos, que podrán ser usados como Introducción 22 biodiesel (Saharan et al., 2013), que se obtiene por procesos de transesterificación a partir de triglicéridos y son una mezcla de ésteres monoalquilo de ácidos grasos de cadena larga. Las algas presentan muchas ventajas que las hacen ser atractivas para la producción de biofuel (Demirbas y Demirbas, 2011), tener una tasa de crecimiento rápida, que puedan crecer y poder ser cultivadas en cualquier entorno como en áreas sumergidas, tierras infértiles e incluso con agua de mar (Singh et al., 2011), poseen grandes rendimientos, que aunque dependen de cada especie, pueden variar su composición en función de las condiciones de cultivo, controlando factores ambientales como la luz, pH, temperatura (Beer et al., 2009), también se puede modificar el contenido de lípidos con la limitación de nutrientes (Chisti, 2007). El cosechado de algunas especies puede ser diario, y pueden reducir las emisiones de CO2 del lugar dónde está creciendo, estos son algunos de esos beneficios. De los biocombustibles obtenidos a partir de algas, se obtienen ciertas ventajas, al no contener azufre no son tóxicos, incluso se pueden utilizar los extractos de aceite como alimento para el ganado, incluso siendo procesados con etanol. Son biodegradables, los altos niveles de ácidos grasos poliinsaturados hacen que sean adecuados a países de climas muy fríos, aunque esto a su vez es una desventaja, ya que lo hace inestable. Un inconveniente es la tecnología que ha de usarse para su producción y que funciona peor que el resto de alternativas del mercado. Los dos biocombustibles más comunes son el biodiesel y el bioetanol, y que tratan de sustituir a los combustibles convencionales como el diésel y la gasolina (Rojan et al., 2011). Las macroalgas contienen mayor proporción de carbohidratos lo que las convierte en buenas productoras de bioetanol y biometanol (Anastasakis et al., 2011). El precio de las macroalgas en el mercado y el uso por parte de la industria alimentaria y de los ficocoloides hacen que no sean rentables en la producción de combustible (Dave et al., 2013). Otros autores se dedican a hacer valoraciones para ver distintas especies y sus beneficios para la producción de biocombustibles, dando como resultado que Introducción 23 las que mayor cantidad de lípidos totales tenían fueron las algas pardas, seguidas de algas verdes, mientras que las algas rojas son las que menos contenido tienen, aunque los lípidos totales y el perfil de ácidos grasos varía también en función del genotipo y del tipo de cultivo que hayan tenido (Gosch et al., 2012), son las microalgas son las que de por sí tienen un mayor porcentaje de lípidos. Los criterios que hay que hay que considerar a la hora de seleccionar las cepas de microalgas más eficientes para la producir biodiesel, son tener una buena tasa de crecimiento, tener cierta cantidad y calidad lipídica, que las cepas sean resistentes a los cambios ambientales y que el cultivo y procesado sean sencillos (Singh et al., 2011). Un ejemplo es el caso de Botryococcus braunii que tiene entre un 25-75% de aceite en relación a su peso seco (Metzger y Largeau, 2005), lo que es una de las mejores candidatas para la producción de biofuel (Lardon et al., 2009). Objetivos 24 2. Objetivos Los objetivos del presente trabajo fueron: 1. Comparar la capacidad de crecimiento de las distintas especies de macroalgas en monocultivo (Hydropuntia cornea e Hypnea spinella) y en co-cultivo (Jania adhaerens, Halopithys incurva) en sistemas de cultivo intensivo, mediante la producción de biomasa, con aporte continuo de nutrientes con alto contenido en N-amonio, estimulando las rutas metabólicas del carbono y del nitrógeno de la biomasa. 2. Evaluar la capacidad de biofiltración de nitrógeno (N-amonio) provenientes de aguas residuales de piscifactoría, por las distintas especies de macroalgas ensayadas, en condiciones bajo radiación natural (100% PAR) y radiación natural bajo invernadero (80% PAR + 10% UVA + 0% UVB). 3. Extracción, valoración y cuantificación de polisacáridos ácidos obtenidos de la biomasa producida por las diferentes especies de macroalgas rojas (Rhodophyta) ensayadas en las distintas condiciones de cultivo (irradiación y aporte de nutrientes). Material y Métodos 25 3. Material y métodos 3.1. Especies seleccionadas, diseño experimental y condiciones de cultivo Los experimentos descritos en el presente trabajo forman parte de los desarrollados en el proyecto BIFARO, dónde se planteó el uso de algas rojas cultivadas de forma intensiva en efluentes de piscifactorías y con gran capacidad de biofiltración para la obtención de sustancias con aplicación fotobiológica. Se proyectó investigar sobre el desarrollo de mejoras en los sistemas de cultivo y biofiltración empleando tanques distribuidos en cascada y estanques tipo “raceway”. Se estudió la relación entre la alta disponibilidad de amonio y fosfato en los efluentes y la radiación solar ultravioleta en la acumulación de compuestos nitrogenados y fotoprotectores: aminoácidos tipo micosporina (MAAs), vía estimulación del metabolismo del nitrógeno. Concretamente, se analizaron la capacidad de fotoprotección de los MAAs no sólo contra el eritema sino sobre otros marcadores relacionados con fotocarcinogénesis. Por otro lado, se investigó la estimulación de la vía del carbono en el sistema de biofiltración de efluentes con el fin de incrementar la acumulación de polisacáridos y oligosacáridos con potencial inmunoestimulador. Se analizó la capacidad inmunoestimuladora de diversos tipos de polisacáridos: polisacáridos ácidos de microalgas rojas (Porphyridium cruentum), polisacáridos de la familia del agar (Gracilaria sp) y los carragenatos (Hypnea spinella y Grateloupia dichotoma) y aquellos obtenidos de nuevas especies de algas rojas ensayadas en el sistema (Halopithys incurva y Jania Adhaerens). La capacidad inmunoestimulante de los polisacáridos será ensayada tanto in vitro como in vivo con modelos animales (ratón). El proyecto BIFARO pretende investigar y aplicar una doble función del cultivo de algas rojas previamente seleccionadas: (1) capacidad y mejora de la biofiltración de aguas residuales de piscifactorías y (2) valoración en aplicaciones fotodermatológicas de compuestos de la vía del nitrógeno, MAAs (fotoprotectores y antioxidantes) y de la vía del carbono, polisacáridos (inmunoestimulantes). La función fotoprotectora-antioxidante e inmunoestimulante de productos de algas Material y Métodos 26 (ingredientes funcionales) podría reducir el riesgo de fotocarcinogénesis e inmunosupresión. Los experimentos tuvieron lugar desde Junio de 2007 hasta Mayo de 2008. Todas las especies seleccionadas para el estudio pertenecen al Phylum Rhodophyta o algas rojas, las seleccionadas fueron: Hydropuntia cornea (fig. 8) (J. Agardh) M.J. Wynne (Gracilariaceae; Rhodophyta), anteriormente descrita como Gracilaria cornea, Hypnea spinella (fig. 9) (C. Agardh) Kützing (Hypneaceae; Rhodophyta), Jania adhaerens (fig. 10) J.V. Lamouroux, (Corallinaceae; Rhodophyta) y Halopithys incurva (fig. 11) (Hudson) Batters, (Rhodomelaceae; Rhodophyta). Algunas de las características taxonómicas de estas especies son descritas a continuación: Hydropuntia cornea (fig. 8) (J.Agardh) M.J. Wynne, 1989; Gracilaria cervicornis (Turner) J. Agardh, Fucus cervicornis Turner, que pertenece a la familia Gracillariaceae. Posee un talo cilíndrico, ramificado, de consistencia cartilaginosa, carnoso, flexible, ligeramente gelatinoso; de color rojo-marrón a verde-amarillento; de hasta 20 cm de alto. Ejes principales con bifurcaciones claramente comprimidas; ramificación casi dicótoma, con rámulas subcilíndricas, distalmente cervicornes. Es una especie productora de agar. Figura 8. Hydropuntia cornea, izquierda en naturaleza, derecha en cultivo. Material y Métodos 33 Después del cosechado semanal los tanques fueron ajustados de nuevo a las mismas densidades volumétricas iniciales. Los datos de producción fueron normalizados a g PS m-2 d-1. 3.4. Biofiltración de aguas residuales: Amonio De acuerdo con la planificación semanal, durante el periodo de enriquecimiento con nutrientes, los análisis de biofiltración de amonio fueron realizados el día posterior al cosechado, cuando los tanques están reajustados a una densidad inicial. Para ello fueron recolectadas muestras de agua tanto en la salida del tanque de decantación como en la entrada y la salida de cada tanque (fig. 16). Las muestras fueron procesadas inmediatamente siendo utilizado un método colorimétrico, (Parsons et al., 1984). El control utilizado en éste análisis fue agua de mar filtrada. Con los resultados obtenidos se calculó la eficiencia de eliminación de N-amonio (NUE): Dónde Cs y Ce son las concentraciones de amonio y fosfatos en la salida (s) y en la entrada (e) del tanque; y la tasa de asimilación de Namonio (NUR): Figura 16. Toma de muestras de agua en la entrada del tanque (izquierda) y a la salida del tanque (derecha) para el análisis de biofiltración. Material y Métodos 34 Dónde: Q = flujo de agua (l h-1) Ce = concentración de N-amonio en la entrada (mmol) Cs = concentración de amonio en la salida (mmol) A = superficie del tanque (m2) 3.5. Determinación del rendimiento cuántico óptimo (Fv/Fm) del PSII como indicador de estrés (medidas de fluorescencia de clorofila) Uno de los indicadores de estrés, en la biomasa de macroalgas creciendo bajo diferentes condiciones de cultivo, es la medida de emisión de la fluorescencia de la clorofila. Con este tipo de medidas se puede determinar el grado de adaptación de las macroalgas a las condiciones de cultivo, siendo un método no destructivo en que las medidas se realizan in vivo. Para ello se utilizó el Plant Efficiency Analizer (PEA Hansatech, UK) con el que se obtienen valores del rendimiento cuántico óptimo del PSII (Fv/Fm) Dónde: F0, es el nivel mínimo de fluorescencia Fm, es el nivel de fluorescencia máximo en un pulso de saturación Fv, es la fluorescencia variable PSII, fotosistema II Las muestras de biomasa fueron adaptadas a la oscuridad durante un tiempo de 15 min antes de aplicar un pulso de luz de 2.000 µmoles de fotones m-2 s-1 (100% de saturación) durante un intervalo de 5 s. Las medidas fueron tomadas Material y Métodos 35 por triplicado semanalmente durante todo el experimento. 3.6. Caracterización de la biomasa Los excedentes de la producción de la biomasa cosechada semanalmente fueron almacenados en congeladores a - 20ºC. Posteriormente parte de la biomasa fue descongelada para la realización de los correspondientes análisis. Para la extracción y cuantificación de polisacáridos ácidos, las muestras fueron secadas por liofilización (Freezone 6L, Labconco, USA). Las muestras secas fueron envasadas al vacío y almacenadas en oscuridad hasta el momento de su análisis. 3.7. Determinación de pigmentos fotosintéticos Los pigmentos mayoritarios (clorofila a y las ficobiliproteínas; R-ficoeritrina y R-ficocianina) fueron determinados a partir de 2 gramos de las muestras recolectadas en cada cosechado y de cada tanque de cultivo. Las muestras fueron homogeneizadas con mortero. Para la clorofila a se realizó la extracción con 4 mililitros de metanol. La muestra fue centrifugada durante 5 min a 9.000 r.p.m y 15 ºC, y los pigmentos concentrados en el sobrenadante fueron cuantificados por espectrofotometría de acuerdo con la ecuación (Wellburn, 1994): En el caso de las ficobiliproteínas 1 g de muestra fue homogeneizado en 4 mililitros de tampón fosfato (0,1 M; pH 6,0). Después de centrifugar 5 min a 9.000 r.p.m. y 15ºC, el sobrenadante obtenido fue cuantificado mediante espectrofotometría (Shimadzu UV160) de acuerdo con las ecuaciones de Beer y Eshel (1985): [ ] [ ] Las medidas fueron tomadas por triplicado semanalmente durante todo el experimento y los datos obtenidos fueron normalizados a mg g-1 PS. Material y Métodos 36 3.8. Análisis de contenido de carbono y nitrógeno (C/N) El contenido interno de carbono y nitrógeno total de las muestras almacenadas y liofilizadas y las relaciones C:N, de las distintas especies cultivadas fue determinado mediante combustión con el analizador de CHN (Perkin Elmer 2400 CHN Elemental Analizer). Es un análisis sencillo en el que las muestras son pesadas en cápsulas de estaño, posteriormente son selladas e introducidas en una cámara de reacción, trabajando con un exceso de oxígeno. El material es mineralizado a 960 ºC. Los contenidos de carbono y nitrógeno fueron determinados en mg (carbono o nitrógeno) g-1 PS y la relación C/N fue expresada en porcentaje. 3.9. Extracción de polisacáridos ácidos Para la extracción de polisacáridos ácidos se siguió el método descrito por Abdala Díaz et al., (2010). Para ello se utilizó la biomasa previamente liofilizada. Las muestras fueron seleccionadas específicamente para ver la variabilidad en contenido y calidad del polisacárido a lo largo del periodo experimental. Las muestras tomadas fueron las del inicio del experimento, pertenecientes a la primera semana, las de la 4 semana, que corresponden al final del tratamiento con nutrientes y a las de la 6 semana, última semana del experimento y en la que se mantuvieron en agua de mar. Además de las muestras seleccionadas, se tuvieron en cuenta los controles de cada una de esas semanas. Se tomaron 20 gramos de muestra liofilizada añadiéndosele un volumen de 500 ml de agua destilada, posteriormente se agita y se autoclava (mod. SterilclavC AE-75-DRY de la marca Raypa) a una temperatura de 110ºC durante 10 minutos. Una vez obtenidas las muestras del autoclave, se separa el sobrenadante filtrándolo, repitiendo el proceso para obtener un segundo sobrenadante. Los dos sobrenadantes son calentados con agitación constante, añadiéndoseles Bromuro de N-Cetylpyrimidinium-monohydrato al 2% (Cetavlon; Morris Quevedo et al., 2000) de la casa Merck. De este modo se consigue precipitar sólo los polisacáridos ácidos separándolos de los neutros. Una vez fueron precipitados los polisacáridos ácidos se deja reposar durante 10 minutos. Posteriormente son llevados a la centrífuga (Avanti centrifuge J-26 XP, Material y Métodos 37 rotor JA-10, Beckman-Coulter) durante 10 minutos a 10.000 r.p.m. El precipitado obtenido fue purificado utilizando una solución 4 M de NaCl. Una vez frío de nuevo es precipitado pero ahora con etanol 96% v/v y se centrifuga durante 10 minutos más a 10.000 r.p.m. La purificación fue realizada cómo mínimo dos veces obteniéndose un precipitado de color blanquecino. Una vez purificado el polisacárido es dializado utilizando membranas de diálisis (Sigma), frente una solución de NaCl 2M durante 24 horas y en agitación, favoreciendo el intercambio iónico. Transcurridas las 24 horas se procede al vaciado de la membrana, el contenido es precipitado con etanol al 96% y centrifugado durante 10 minutos a 10.000 r.p.m. el polisacárido obtenido es congelado y liofilizado durante 24-48 horas e introducido en viales para su posterior utilización. En la (fig. 17) se puede apreciar el proceso de precipitado de los polisacáridos (izquierda), el polisacárido purificado (derecha) y el posterior envasado del polisacárido purificado liofilizado (abajo). Figura 17. Precipitación de los polisacáridos ácidos (izquierda), polisacárido purificado (derecha) y polisacárido purificado liofilizado y envasado (abajo). Resultados 38 4. Resultados 4.1. Producción de las especies ensayadas Los datos medios de producción para las distintas especies cultivadas en éste experimento son mostrados en la tabla V. Se tomaron como representativas las semanas 1, 4 y 6, la semana 1 es el inicio del experimento y adaptación de las algas a las condiciones de cultivo, la semana 4 es el final del periodo de enriquecimiento con nutrientes y la semana 6 es el final del experimento que coincide con 2 semanas de cultivo sin aporte de nutrientes. La evolución en cuanto a la producción que siguieron las especies cultivadas en el caso de los tanques control, fue la de disminuir con el tiempo, en cambio en los tanques tratamiento con nutrientes, fue aumentar en las semanas dónde hubo aporte de nutrientes, de la semana 1 a la 4, en las especies que estuvieron el co-cultivo, Jania adhaerens y Halopithys incurva, y en Hypnea spinella, mientras que en Hydropuntia cornea, hubo una disminución en las semanas en las que hubo un enriquecimiento con nutrientes, mientras que en las semanas con agua de mar volvió a aumentar la producción. En general, los tanques tratamiento tuvieron mayor producción que los tanques control, tanto en las situaciones de aporte de nutrientes como cuando fueron mantenidas sólo con agua de mar. Aunque hubo excepciones como en el caso de los tanques control de la semana 1 de Hydropuntia cornea en el exterior, Hypnea spinella en el interior y el co-cultivo tanto en el exterior (100% PAR) como bajo invernadero (80% PAR + 10% UVA + 0% UVB) además del tanque control dentro del invernadero de la semana 4. En el caso de H. cornea y del co-cultivo, los tanques control de la primera semana fueron los más productivos, aunque para el caso de H. cornea fue el tanque de control en el exterior con alta irradiación 82.2 g PS m-2 d-1, siendo el valor de producción más alto para todas las especies, mientras que en el cocultivo fue en el tanque interior el que más produjo con 66 g PS m-2 d-1. Resultados 39 Con respecto a los tanques tratamiento los que más produjeron fueron los de H. cornea de la primera semana tanto interiores como exteriores con valores de 73.33±4.41 g PS m-2 d-1 y 64.8±7.30 g PS m-2 d-1 respectivamente e H. spinella en la semana 4 con valores 48.85±5.37 g PS m-2 d-1 en el interior y 65.21±8.85 g PS m-2 d-1 en el exterior, así pues, la mayor producción media fue para H. cornea seguida de H. spinella. Los diferentes experimentos de cultivo de las especies tuvieron lugar en distintos periodos del año, con la consiguiente variación de la radiación PAR tanto en el exterior como en el interior del invernadero (tabla IV). Tabla V. Valores de irradiación y temperatura durante el experimento. Datos expresados como medias ± SE, n=16. En la zona de Taliarte (Telde) los valores de radiación solar aumentan hasta valores máximos que se alcanzan durante el mes de julio (Gómez Pinchetti, com. pers). La radiación PAR diaria acumulada durante el periodo de cultivo de H. cornea varió desde 3354 7547 kj m-2 d-1 en el exterior, mientras que en el interior fue de 2683.2 6037.6 kj m-2 d-1. Para los ensayos con H. cornea y el cocultivo de J. adhaerens y H. incurva, los sensores de temperatura no estuvieron disponibles. En el caso del co-cultivo los valores de irradiación fueron de 1456 - 5038 kj m-2 d-1 en el exterior, y dentro del invernadero fueron de 1164 - 4030.4 kj m-2 d-1, con un valor medio de 3602.10±247.57 kj m-2 d-1 en el exterior y de 2881.68±198.06 kj m-2 d-1 en el interior. En el cultivo de H. spinella varió en el rango de 1058 - 4407 kj m-2 d-1 en el exterior con unos valores medios de 3181.3±163.15 kj m-2 d-1, en cambio en el interior el rango fue de 846.4 - 3525.6 kj m-2 d-1, con valores medios de 2545.0±130.52 kj m-2 d-1. Con respecto a la temperatura durante el experimento de H. spinella los valores alcanzados fueron en el rango desde 17.89±0.02 42.09±0.02 ºC en los Resultados 40 tanques del exterior y de 18.72±0.03 32.63±0.08º C con unos valores medios de 21.5±0.37ºC en los tanques en el interior del invernadero y de 21.4±0.41ºC en los tanques exteriores. Si se compara la radiación solar con la temperatura durante el periodo de cultivo para H. spinella (fig. 18) se observa una relación ascendente, a medida que la irradiación aumenta, aumenta la temperatura del agua en los tanques de cultivo. Figura 18. Radiación PAR acumulada semanal interior y exterior y temperatura media en el interior y exterior semanal durante el cultivo de Hypnea spinella. PAR vs Tª (Hypnea spinella) Tiempo (Semanas) 1 semana 2 semana 3 semana 4 semana 5 semana 6 semana 7 semana 8 semana PAR (kj m-2 d-1) 0 1000 2000 3000 4000 5000 Temperstura (ºC) 19 20 21 22 23 24 Irradiación Exterior Irradiación Interior Temperatura Interior Temperatura Exterior Resultados 41 Tabla VI. Producción media por especies y semanas de cultivo en condiciones experimentales a escala piloto exterior e interior (bajo invernadero). (1) Después de dos semanas sin aporte/flujo de N/P (sólo agua de mar) (2) Experimento de co-cultivo. Datos expresados como medias ± SE, n=3. PRODUCCiÓN (g PS m2 d1 ) Interior Exterior Especie Semana Control Tratamiento Control Tratamiento 1 54.00 73 . 33 ± 4.41 82.8 64.80 ± 7.30 Hydropuntia cornea [ 4 14 . 57 37.71 ±3. 96 18.00 28.86 ± 8.24 6 (SW) (l) 22 . 29 41.43 ± 1. 59 14.57 39.14± 1.87 1 66 . 00 19.90 ± 9.70 53.43 29.86 ± 14 . 85 Ha/opnhys incurva 4 37.13 34.83 ± 17.42 0.00 30.25±5.99 Jania adhaerens (2) 6 (SW) (l) 37.71 42.43 38.76 ±6. 04 11.00 ± 2.40 1 35 . 36 30 . 90 ±5. 67 26.71 46 . 62 ±6. 81 Hypnea spinella 14 33 . 00 48 . 85 ±5. 37 18 . 07 65 . 21 ±8. 85 6 (SWP) (l) 0.00 30.25 ± 5.37 0.00 46.62±3.96 Resultados 42 4.2. Capacidad de biofiltración Los datos de los flujos medios de aporte de N-NH4+ durante los periodos ensayados se muestran en la tabla VI. Tabla VII. Flujos medios ± SE durante los cultivos experimentales tanto en interior como en exterior. Datos expresados como medias ± SE, n=3. Flujos medios (mmoles de N-NH4 h-1) Especie Interior Exterior Hydropuntia cornea 4.20±0.77 4.46±0.56 Jania adhaerens Halopithys incurva 1.30±0.22 1.60±0.30 Hypnea spinella 3.65±0.89 3.00±0.56 La eficiencia de eliminación (NUE) y la tasa de eliminación (NUR) de amonio se muestran en la tabla VII. Todas las especies muestran altos valores de eficiencia (NUE), llegando incluso al 100% en el caso del experimento de co-cultivo, seguida de Hypnea spinella con valores entre 56±7.37% – 100±3.60% en el exterior y 38.3±4.03% – 98.7±0.67% en el interior y por último Hydropuntia cornea con un rango que va desde 22.3±0.62% - 99.6±0.65% en el exterior y 35.4±9.67% – 96.2±1.86% en el interior. Cabe destacar que, en general, los datos obtenidos en el exterior son mayores que en el interior, aunque puntualmente haya algunas disminuciones, que pueden ser atribuidas a una variación en la concentración del flujo de nutrientes. En el caso de la NUR, que es la tasa de eliminación por unidad de superficie, la especie que mejor asimiló los nutrientes fue H. cornea con valores entre 24.3±0.41 – 69.7±15.18 mmol m-2h-1 en el interior, 18.9±3.44 – 24.9±0.12 mmol m-2h-1 en el exterior. El co-cultivo varió entre 6.1±0.02 – 50.1±0.06 mmol m-2h-1 en el interior y 6.1±0.0434.0±15.50 mmol m-2h-1 en el exterior y por último H. spinella con rangos entre 2.7±0.02 – 28.0±0.41 mmol m-2h-1 en el interior y 1.8±0.22 - Resultados 49 Tabla IX. Concentraciones de ficobiliproteínas (Ficoeritrina y Ficocianina) (mg g-1 PS) por especie y semana de cultivo, en condiciones experimentales a escala piloto interior (bajo invernadero) y exterior. (1) Después de dos semanas sin aporte/flujo de N/P (sólo agua de mar) (2) Experimento de co-cultivo. Datos expresados como medias ± SE, n=3. PIGMENTOS Ficoeritrina IR-FE] mg g -1 PS Ficocianina IR-Fe] mg g -1 PS Especie Semana Interior Exterior Interior Exterior Control Tratamiento Control Tratamiento Control Tratamiento Control Tratamiento 0.27 1.60±0.11 0.66 1A2±0.05 0.06 0.32±0.01 0.10 0.26 ± 0.01 Hydropuntía 4 0.00 1.90 ± 0.30 0.00 1.27 ± 0.08 0. 00 0.33 ± 0.04 0.00 0. 27±0.00 cornea 6 (SW) II) 0.00 OAO±0.04 0.00 0.37±0.14 0.01 0.07±0.01 0.03 0.07±0.01 2A6 1.34 ± 0.10 0.65 1.69 0.25 1.53 ± 0.03 0.02 0.28 Ha/opíthys 4 0.20±0.03 0.69±0.07 0.13 ± 0.04 0.05 0.00 0.06±0.01 0.03±0.02 0.005±0.00 íncurva (2) 6 (SW) II) 0. 32 ±0. 03 0.33 ± 0.05 000 0.32 ± 0.12 0. 00 0.02 ± 0.00 000 0. 01 ± 0.00 2.02 1.89 ± 0.012 1.26 1AO 0. 11 0.19±0.03 0.09 0.13 Janía 4 adhaerens (2) 0.25 0.26 ± 0.07 0.09 ±0. 00 0. 13 0.00 0.01 ± 0.05 0.005 ± 0.00 0.01 6 (SW) II) 0.01 ± 0.003 0.29 ± 0.12 0.55 ± 0.12 0.11 ± 0.01 0.00 0.02 ± 0.01 0.06±0.00 0.007±0.001 14.87 ± 2.09 20 . 04 ±2 .1 4 4. 35 ±0. 31 13.75 ± 1.29 0. 57 ± 0.3 1.02 ± 0.18 022±O . 02 0. 63 ±002 Hypnea 4 1.58±0.16 16.98±023 026± 0.04 18.18±0.14 0. 03 ± 0.OO 1.75±029 000 1.24 ±003 spínella 6 (SW) II) 0. 05 ±0. 02 15 . 76 ±0. 71 0.00 9. 92 ±1.9 0. 01 1.21 ± 0.10 0.00 1.17±0.16 Resultados 50 Con respecto a la clorofila (tabla IX), las concentraciones más bajas fueron mostradas por H. cornea, no llegando a 0.60 mg g-1 PS, esta especie evolucionó de forma que fue disminuyendo la concentración de clorofila desde la semana 1 a la 6 a excepción del tanque control en el interior del invernadero, en el que durante la semana 6 hubo un ligero aumento con respecto a la semana 4. No se puede hablar de una evolución general, pero en el co-cultivo de J. adhaerens y H. incurva, se dio la particularidad que después de 4 semanas con aporte de nutrientes, aumentaron las concentraciones de pigmentos en todos los tanques, tanto control como tratamiento y en condiciones bajo invernadero (80% PAR + 10 % UVA+ 0% UVB) como en el exterior con alta irradiación, para luego disminuir durante las semanas en las que estuvieron solo con agua de mar, pero con concentraciones mayores a las registradas en la semana 1, aunque hay una excepción en la especie H. incurva en los tanques tratamiento exteriores, y es que en la semana 6 aumentó la concentración en vez de disminuir. En H. spinella, los tanques tratamiento, tanto en el interior como en el exterior, tuvieron la misma evolución que las especies del co-cultivo, no sucediendo lo mismo en los tanques control, en ellos la concentración de clorofila fue disminuyendo desde la semana 1 a la semana 6. Durante la semana 4 se alcanzó la mayor concentración de clorofila en los tanques tratamiento en el interior del invernadero con un valor de 5.73±0.13 mg g-1 PS. Las especies que mayores concentraciones medias obtuvieron fueron H. incurva en los tanques control tanto en el interior como en el exterior y H. spinella en los tanques tratamiento tanto interiores como exteriores. A lo largo de las semanas del cultivo, se pudo apreciar morfológicamente una serie de cambios, aumentando la intensidad del color en el periodo de aporte de nutrientes y disminuyendo, incluso perdiendo el color rojo en el periodo de cultivo sólo en el agua de mar, lo que indica la utilización del nitrógeno almacenado (fig. 20). Además todas las especies, presentan una gran plasticidad y su morfología variaba en relación a la superficie volumen (fig. 21). Resultados 51 Figura 21. Distintos cambios morfológicos, tanto en color como en forma. A Halopithys incurva, con aporte de nutrientes B Jania adhaerens con aporte de nutrientes y C Hypnea spinella, con aporte de amonio, color rojizo y sin aporte de nutrientes, color amarillo. Figura 20. . Hydropuntia cornea con distinta morfología, ramas cortas y finas a modo de pequeños pompones. Color amarillo sin aporte de nutrientes (izquierda) y con aporte de nutrientes, color rojo (derecha). Otra morfología es la de tamaño pelota de tenis, ramas más gruesas y alargadas. Resultados 52 Tabla X. Concentraciones de clorofila a (mg g-1 PS) por especie y semana de cultivo, en condiciones experimentales a escala piloto interior (bajo invernadero) y exterior. (1) Después de dos semanas sin aporte/flujo de N/P (sólo agua de mar) (2) Experimento de co-cultivo. Datos expresados como medias ± SE, n=3. PIGMENTOS Clorofila a (mg g"1 PS) Especies Semana Interior Exterior Control Tratamiento Control Tratamiento 1 0.54 0.55±0. 01 0.28 0.49±0.05 Hydropunlia 4 0.14 0.42±0.00 0.00 0.39±0.05 cornea 6 (SW)( 1) 0.20 0.24±0. 01 0.00 0.32±0.04 1 0.58 0.60±0. 01 0.65 0. 51 Halopilhys I 4 1.30±0.06 2.63±0.28 2.64±0.06 1.43±0.14 incurva (2) 6 (SW) (1) 1.24±0. 11 1.84±0. 01 0.83 1.69±0.85 1 0.28 0.27±0.00 0.32 0.27 Jania adhaerens 4 0.63±0. 04 1.16±0.20 0.64±0. 01 102±006 ( 2) 6 (SW)( 1) 0.30±0.00 1.16±0.63 0.67±0.23 0.49±0.19 1 2.69±0.26 4.45±0.06 1.54±0.05 3.65±0. 10 Hypnea spinella 4 0.71±0.08 5.73±0.13 0.52±0.02 5.27±0.63 6 (SW)( 1) 0.51±0.04 3.69±0.03 0.20±0.02 4.45±0.30 Resultados 53 4.5. Análisis de las relaciones C:N Los resultados del análisis de carbono nitrógeno son mostrados a continuación (tabla X). Si se observa el comportamiento por tanque (fig. 22), en los tanques control del interior de todas las especies se ve un aumento de la relación C:N durante las 4 primeras semanas (fig. 22 A), para luego disminuir, con valores inferiores incluso a los de la primera semana, excepto en el caso H. cornea y de H. spinella que los valores en la semana 1 y 6 son prácticamente iguales, y que al tratarse de los tanques control, no hay aporte de nutrientes. En los tanques tratamiento en el interior, se encuentra el valor más alto dado para esta relación en la especie J. adhaerens con 27.64±4.86 (fig. 22 B) en la primera semana, para después bajar y mantenerse en el mismo valor en las semanas 4 y 6. En H. incurva los valores van aumentando de la semana 1 a la 6, al igual que en H. cornea. Al contrario que el resto de las especies H. spinella disminuye en las semanas con aporte de nutrientes para luego aumentar en las semanas en las que sólo está con agua de mar, incluso la relación es mayor que en la primera semana. En los tanques control del exterior (fig. 22 C), H. cornea y H. incurva siguen la misma evolución que en el interior, aumentando de la semana 1 a la 4 para luego disminuir, J. adhaerens va disminuyendo a lo largo de las semanas de cultivo, en cambio H. spinella aumenta la relación C:N a lo largo del periodo de cultivo, alcanzando en la semana 6 el valor más alto 23.79±2.08 en los tanques control, tanto exteriores como interiores. Con respecto a los tanques tratamiento del exterior (fig. 22 D), en H. cornea al contrario que en los tanques tratamiento del interior los valores van disminuyendo a lo largo de las semanas, en J. adhaerens van aumentando a la inversa que en el tanque control del exterior. H. incurva sigue la misma evolución de los tanques control, tanto en el Resultados 54 interior como el exterior, aumentando en la semana 4 para luego disminuir en la semana 6, en cambio H. spinella mantiene una estabilidad a lo largo del cultivo. A B C D Figura 22. Relaciones C:N por tanque y semana de cultivo. Datos expresados como medias ± SE, n=3. Resultados 55 Tabla XI. Relaciones C/N obtenidas en las macroalgas cultivadas, (1) Después de dos semanas sin aporte/flujo de N/P (sólo agua de mar) (2) Experimento de co-cultivo. Datos expresados como medias ± SE, n=3. Relación Carbono:Nitrogeno Interior Exterior Especies Semana Control Tratamiento Control Tratamiento 1 15 . 52 ±O. 31 7. 38 ± O.71 8. 68 ±O .1 0 11 . 82 ±4. 04 Hydropuntia 4 22.38 ± O.12 12.85 ± 5.47 14.7±O.26 8.24 ± O.21 cornea 6 (SW) (1) 17.47 ± O.83 20.38 ± 2.79 7.49 ± O.O3 7.79 ± O.66 1 12 . 24 ±O .32 10.63±O.98 10 . 84 ± 1.48 9. 29 ±O .3 5 Halopithys incurva 4 19.04 ± 2.04 11.89 ±3. 24 16.07±1.3 11.41 ± 1.27 (2) 6 (SW) (l) 10.90 ± 1.52 15.25 ± 3.61 12.44 ± 1.71 8.23 ± O.36 1 13.51 ± O.14 27.64 ±4 .86 18.46 ± 1.19 8.81 ± O.O4 Jania adhaerens 4 16.03 ±O. 52 10.53 ± O.20 11 . 13 ±O. 25 11 . 05 ±O. 75 (2) 6 (SW) (1) 11 . 04 ±1. 21 10.96±2.12 7.3±O.15 17.01 ±4. 8 1 6.85 ± O.21 17.25 ± 6.42 9.36 ± O.17 6.43 ± O.12 Hypnea spinella 4 13.96 ±. O2 12.74±O.11 12.23 ± O.73 6.7 ± O.24 6 (SW) (1) 6.42 ± .OO3 20 . 56 ±2. 88 23.79 ± 2.08 6.58 ±O. O9 Resultados 56 4.6. Contenido en polisacáridos Los datos de contenido de polisacáridos ácidos en porcentaje se muestran en la tabla XI. Las especies que produjeron mayor cantidad de polisacáridos fueron Hydropuntia cornea con rangos entre 21.8% 45.4% e Hypnea spinella con rangos entre 23.3% 47.1%, mientras que Halopithys incurva y Jania adhaerens no sobrepasan el 10%. H. cornea tiene mayor porcentaje de polisacáridos en la semana 4 del cultivo, coincidiendo con el fin del periodo de aporte de nutrientes, luego en las dos semanas con aporte sólo con agua de mar disminuye el contenido. En el caso de los tanques control, tanto en el interior del invernadero como en el exterior, los valores son incluso más bajos que en la primera semana, no ocurre lo mismo con los tanque tratamiento, ya que los valores están por encima. A lo largo de todo el cultivo los tanques control, tanto en el interior como en el exterior, tienen un mayor porcentaje de polisacáridos, esta situación se revierte en la última semana de cultivo. El valor más alto para H. cornea se da en el tanque control del interior en la semana 4 con un 45.4%. En Jania adhaerens, durante todo el cultivo, los tanques control tanto en el interior del invernadero como en el exterior, tienen menos porcentaje de polisacáridos que los tanques tratamiento respectivos, también sigue la evolución de H. cornea, aumentando en las semanas con aporte de nutrientes para luego disminuir. El mayor valor se obtuvo en el tanque tratamiento del exterior de la semana 4 con 6.4%, mientras que el mínimo fue de 0.5% en la semana 6 del tanque control interior. Halopithys incurva, fue la especie con menor contenido en polisacáridos de todas las especies ensayadas, no superando el 3%, el valor máximo está dado en la semana 6 en el tanque control en el interior con un 2.2%. En el exterior durante la semana 4 y 6 tanto el tanque control como en el de tratamiento, el porcentaje es prácticamente el mismo. Hypnea spinella se comportó de manera diferente a H. cornea ya que fue incrementando el porcentaje de polisacáridos en el transcurso del cultivo, Resultados 57 alcanzando el valor máximo en el tanque de control en el interior en la semana 6 con 47.1% seguido del tanque control en el exterior de la misma semana con 41.3%, también produjeron más cantidad de polisacáridos los tanques control, tanto en el interior como en el exterior que los tanques tratamiento a excepción del tanque tratamiento de la semana 1 que fue el que más produjo sobre el resto de los tanques en esa semana, con 31.0%. Durante todo el cultivo los tanque tratamiento del exterior tuvieron una producción muy parecida, al igual que sucedió con H. incurva. Si comparamos el rendimiento de los polisacáridos con la relación C:N durante las semanas de cultivo, podemos observar ciertas diferencias por tanque y tratamiento (fig. 23). En general las especies que produjeron más polisacáridos, como se mencionó anteriormente, fueron Hydropuntia cornea e Hypnea spinella, por el contrario Jania adhaerens y Halopithys incurva, mostraron valores bajos en contenido de polisacáridos en todos los tanques, tanto en los controles con agua de mar como en los tanques tratamiento. Al comparar los dos factores observamos una tendencia similar en las especies del co-cultivo J. adhaerens y H. incurva, en cambio para H. cornea e H. spinella, la evolución fue más variable. En los tanques control del interior (fig. 23 A), se observa que para las mismas relaciones C:N, entre 10 20, H. cornea e H. spinella tienen mayor contenido en polisacáridos, aún incluso para relaciones más pequeñas y más altas que este rango, estas dos especies son las que acumulan mayor porcentaje de polisacáridos, llegando al máximo en H. cornea en la semana 4 con 45.1 % y una relación de C/N de 22.38±0.12. En los tanques tratamiento interiores (fig. 23 B), se observa una variación, hay una disminución en las relaciones C:N en las especies del co-cultivo y un aumento en el contenido de polisacáridos, menos en el caso de J. adhaerens que aumentó su relación C:N y el contenido en polisacáridos es el menor de todas las semanas de cultivo. En H. cornea entre la semana 4 y 6 no varían mucho su contenido en polisacáridos mientras que la relación C:N pasa de 12.85±5.47 a 20.38±279, al Resultados 58 contrario que en H. spinella, que se mantuvieron iguales durante la semana 1 y 4 y la relación C:N pasa de 17.25±6.42 a 12.74±0.11. En los tanques control exteriores (fig. 23 C), aumentan el contenido en polisacáridos de las especies del co-cultivo en comparación con los tanques control interiores, mientras que en el caso de H. incurva el C:N aumenta de la semana 1 a la 4 en J. adhaerens va disminuyendo la relación con el transcurso del experimento. En H. cornea, hay un aumento en el contenido de polisacáridos de la semana 1 a la 4 mientras que en H. spinella aumenta en todas las semanas de cultivo, comportándose igual la relación C:N. En el caso de los tanques tratamiento exteriores (fig. 23 D), las especies del co-cultivo obtuvieron mayores rendimientos que en el resto de tanques incluso si se comparan con los tanques interiores, sobre todo J. adhaerens, aunque la relación C:N aumentó con respecto a las semanas de cultivo, siendo el valor más bajo de polisacáridos en la semana 6 con un 1.1±0.34 % frente al mayor valor de C:N con un 17.01±4.08, en H. incurva tanto el contenido en polisacáridos como la relación C:N no varió excesivamente. En H. cornea hay una disminución de los polisacáridos frente a los tanques control aunque con el transcurso de las semanas de cultivo van aumentando, sobre todo entre la semana 4 y la 6 a la par que disminuye la relación C:N durante todo el cultivo. Mientras que en H. spinella tanto los valores de polisacáridos como la relación C:N permanece constante a lo largo del cultivo. Discusión 65 Lideman et al., 2013). Los datos obtenidos en nuestro experimento, nos indican que los cultivos estuvieron fisiológicamente estables, a pesar de haber sido sometido a un estrés por falta de nutrientes durante un periodo de dos semanas, únicamente los controles exteriores, sobre todo en la especie Hypnea spinella fueron los que se vieron más afectados por este estrés, a la vista de los valores de rendimiento cuántico máximo del PSII (Mata et al., 2006). Como hemos mencionado anteriormente, una vez terminada la fase de cultivo desarrollamos el análisis y la valoración de la biomasa. Los valores obtenidos de los análisis no son independientes y están relacionados entre sí como veremos a continuación. En la tabla VIII se muestran los valores de ficobiliproteínas (ficoeritrina y ficocianina), en nuestro estudio obtuvimos mayores valores de concentración de ficoeritrina que de ficocianina, como cabría esperar, ya que la ficoeritrina es el pigmento accesorio característico de las algas rojas, les da el color y se encuentra en mayor concentración en los ficobilisomas. En Hydropuntia cornea hay mayor contenido de ficobiliproteínas en los tanques con aporte de nutrientes que en los tanques control, además de que una vez cortado el aporte extra de nutrientes, disminuye el contenido rápidamente, al igual que en el estudio de Figueroa et al. (2008). La que más concentración de ficobiliproteínas tuvo fue Hypnea spinella, no hubo grandes diferencias entre interior del invernadero y el exterior con respecto a la ficoeritrina a excepción de la primera semana, pero puede deberse a diversos factores, uno de ellos puede ser que estas algas fueron mantenidas, durante un periodo previo al experimento, en otras condiciones y este cambio genera un estrés de adaptación a las nuevas condiciones de cultivo (Ribeiro y Necchi, 2001;Aguilera et al., 2002; Figueroa et al., 2009). En el co-cultivo, la concentración de ficoeritrina fue disminuyendo con el transcurso del periodo de cultivo, aun habiendo aporte de nutrientes, esto coincide con el estudio de Figueroa et al., (2012), en el cual observó que durante periodos largos de cultivo, sin aporte de nutrientes, las especies cultivadas sufren una Discusión 66 disminución en la acumulación de compuestos con nitrógeno como las ficobiliproteínas, produciendo una degradación en los ficobilisomas para proporcionar el nutriente deficitario (Aráoz & Häder, 1997), en alta irradiación disminuyen menos ya que la radiación PAR provoca un efecto positivo en estos compuestos (Grossman et al., 1993). En otros estudios el contenido en biliproteínas incrementó un 90% respecto a los controles crecidos en agua de mar, en condiciones de radiación PAR+UVR y con nutrientes provenientes de piscifactoría (Figueroa et al., 2010). En general, la ficocianina dio valores muy inferiores a la ficoeritrina, en la mayoría de las especies no se llegó a 0.65 mg g-1PS, la que mayor concentración mostró fue Hypnea spinella, llegando a 1.75±0.29 mg g-1PS. En Hydropuntia cornea, la concentración de clorofila a evolucionó de forma que fue disminuyendo a lo largo del periodo de cultivo, en cambio en el resto de las especies ensayadas siguieron la evolución de aumentar la concentración de clorofila a en el periodo de aporte de nutrientes, sobre todo en las especies del co-cultivo que se incrementó hasta el doble en el caso de los tanques control y se llegó a cuadruplicar en el caso de los tanques tratamiento, esto puede ser debido a la radiación UV como señalan Aguilera et al., (2008) y Buschmann et al., (2008b), mientras que disminuyeron al cesar, esto concuerda con los estudios de Buschmann et al. (2008b) ya que el nitrógeno incrementa la concentración en pigmentos fotosintéticos, proteínas solubles y nitrógeno interno. El aporte de nutrientes como estamos viendo, contribuye tanto a la concentración de pigmentos como a la producción de polisacáridos. Si relacionamos el contenido C:N de las especies con los periodo de cultivo, cuando tienen una baja disponibilidad de nitrógeno, se refleja con valores altos de la relación C:N y que en las algas generalmente oscila entre un 1 y 7 % de su peso seco (Ito y Hori, 1989). Martínez y Rico, (2008) señalan que las algas aclimatadas a alta irradiación presentan un mayor contenido en carbono y menor contenido en nitrógeno, que las algas aclimatadas a zonas con menos irradiación. En el experimento en general, hubo un aumento en la relación C:N en relación a las semanas donde Discusión 67 hubo aporte de nutrientes, esto es que el alga no necesita utilizar las reservas ya que hay disponibilidad en el medio, pero necesita tener reservas para su crecimiento o dirigir el metabolismo hacia la síntesis de polisacáridos o pigmentos. Con respecto al contenido en polisacáridos, en general, se pudo observar dos evoluciones, las especies que produjeron gran cantidad como Hydropuntia cornea e Hypnea spinella que son típicas productoras de ficocoloides, agar y carragenatos respectivamente (Marinho-Soriano, 2001; Freile-Pelegrín y Murano., 2005; Bezerra y Marinho-Soriano, 2010; Vázquez-Delfín et al., 2014), y las que produjeron pocos polisacáridos que fueron las especies que estuvieron en cocultivo Jania adhaerens y Halopithys incurva (Abdala et al., 2011; Güenaga, 2011). Esto es debido al metabolismo propio de cada especie, que en el caso de las especies del co-cultivo está más dirigido a la concentración de metabolitos secundarios con actividad antioxidante (Güenaga, 2011). En nuestro caso, Hydropuntia cornea mostró valores más bajos de concentración de polisacáridos en aguas con aporte de nutrientes que en los tanques control, mientras que en las semanas en las que fue cultivada en agua de mar aumentaron, esto hace pensar que acumula el nitrógeno por largos periodos de tiempo (Figueroa et al., 2008) y dirige el metabolismo hacia la acumulación de polisacáridos durante los periodos de limitación. En el co-cultivo los polisacáridos extraídos no llegaron al 7% frente a los de Hypnea spinella que superaron el 23%, pero en cambio las calidades son distintas, como lo demuestran los estudios de Abdala-Díaz et al. (2011). Los polisacáridos obtenidos fueron analizados por espectroscopia infrarroja obteniendo claras diferencias entre los polisacáridos extraídos de H. spinella, que resultaron ser similares en un 90% al kappa carragenato del tipo III, un polisacárido sulfatado que demuestra tener actividad antitumoral e Inmunomoduladora (Abdala-Díaz et al., 2011), ya que el grupo sulfato parece ser importante en la activación de macrófagos, mientras que los polisacáridos de H. incurva fueron similares al pululano en un 86%, estos polisacáridos en cambio demostraron tener actividad antiinflamatoria induciendo la liberación de citoquinas. Discusión 68 En otros estudios, también demostraron que los polisacáridos ácidos, obtenidos en este caso de Ulva rigida, inducen la expresión de las interleuquinas y la formación de leucocitos en el riñón del rodaballo, pero si se desulfatan los polisacáridos, pierden esa actividad, lo que indica que se requieren los grupos sulfato para la inducción (Castro et al., 2006). A pesar de ser estructuralmente diferentes, este tipos de polisacáridos ácidos pueden ser utilizados como potenciales productos farmacéuticos aplicados cuando la activación de macrófagos sea necesaria (Abdala-Díaz et al., 2011). Conclusiones 69 6. Conclusiones De los resultados obtenidos y presentados en este trabajo, podemos extraer las siguientes conclusiones: 1. Todas las especies de macroalgas ensayadas (Hydropuntia cornea, Jania adhaerens, Halopithys incurva e Hypnea spinella), se adaptaron a las condiciones establecidas en el sistema de cultivo, principalmente, aporte de nutrientes, irradiación y agitación libre en la columna de agua, demostrando una gran plasticidad frente a su morfología en la naturaleza. 2. Las medidas de la fluorescencia de la clorofila tomadas in vivo como indicador del estrés del cultivo, se mantuvieron estables durante todo el experimento, observándose diferencias entre los tanques control y los tanques tratamiento, para el caso de Hypnea spinella, lo que está relacionado con sus capacidad fotosintética bajo condiciones de limitación de nutrientes. 3. Todas las especies mostraron un aumento de la producción, en las semanas con aporte de nutrientes, a excepción de Hydropuntia cornea que se mantuvo estable. Las mayores producciones medias fueron observadas para Hydropuntia cornea e Hypnea spinella en comparación a las obtenidas en el sistema de co-cultivo de Jania adhaerens y Halopithys incurva. 4. En condiciones de aporte de nutrientes las capacidades de biofiltración para todas las especies ensayadas, alcanzaron valores medios de NUE superiores al 40% en Hydropuntia cornea e Hypnea spinella llegándose a determinar valores del 100%, y en el caso del co-cultivo (Jania adhaerens y Halopithys incurva) llegando al100% durante todo el experimento, lo que está directamente relacionado con los flujos de amonio en el sistema. En cuanto a la NUR, la especie más efectiva fue Hydropuntia cornea con valores máximos de 69.7±15.2 mmoles m-2h-1 bajo invernadero, seguida de las especies del co-cultivo con 50.0±01 mmoles m-2h-1, por último Hypnea spinella con 28.3±0.4 mmoles m-2h-1, en condiciones del exterior. Conclusiones 70 5. El aporte de nutrientes produjo el aumento esperado en la concentración de pigmentos fotosintéticos (clorofila y ficobiliproteínas) bajo las condiciones ensayadas, cumpliéndose la evolución esperada de consumo como fuente de nitrógeno, en el caso de las ficobiliproteínas, en los periodos de limitación de nitrógeno. 6. Hydropuntia cornea e Hypnea spinella mostraron los mayores porcentajes en la producción de polisacáridos ácidos, con posibles aplicaciones biotecnológicas, en comparación con las especies co-cultivadas, lo que concuerda con la evolución obtenida para las relaciones C:N. Este hecho está directamente relacionado con el tipo de metabolismo utilizado por los dos grupos de especies, siendo Halopithys incurva y Jania adhaerens productoras de metabolitos secundarios (H. incurva) o estructuras calcificadas (J. adhaerens), en detrimento de sustancias del metabolismo primario como los polisacáridos estructurales. Referencias bibliográficas 71 7. 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