Determinación del contenido lipídico en "Crypthecodinium cohnii" por citometría de flujo

T abajo de Su iciencia in es igado a (Sep iemb e 2003) De e minación del con enido lipídico en C yp hecodinium cohnii po ci ome ía de lujo Adelina de la Ja a Valido Índice Ab · , . 1 eVla u as y ac o nmos ................... .. ... .. .......................... ... ... ...... ... ... . .. .. .. .. .. .. . 1. In oducción.............. ... ........................................................................... .. ..... 2 2. Ma e ial y mé odos ...... .. .......... .. .. .. ... . .. ... .. ..................................................... 3 2.1. Cul i o celula 2.2. Análisis g a imé ico y c oma og á ico 2.3. Ci ome ía de lujo 2.4. Análisis de da os 3. Resul ados................................... .. .............................................. ... .. .... ...... .. . 6 4. Discusión ............. .. .... .. ... .. .......................................... .. ...... . ... ...................... 8 5. Conclusión ............... .. .......................................................................... .. ....... 9 6. Bibliog a ia........................... ..... ..... .......... .. ... .. . .. .. ....... ............... ... ........... .... 10 Po ada: células de C yp hecodinium cohnii Ab e ia u as y ac ónimos AGPCLs: ácidos g asos poliinsa u ados de cadena la ga DHA: ácido docohexaenoico RN : ojo nilo 1. In oducción Los lípidos son nu ien es i ales pa a el c ecimien o celula ya que, además de cons i ui • la ese a ene gé ica de la célula (Demps e y Somme eld, 1998), son es uc u almen e indispensables. Químicamen e son és e es de ácidos g asos. Una clase especial den o del conjun o de ácidos g asos son los poliinsa u ados de cadena la ga (AGPCLs) (Salhi, 1994) que encon amos undamen almen e en los os olípidos de las memb anas biológicas. Los p ecu so es de es e g upo se denominan ácidos g asos esenciales, su u a de sín esis se encuen a únicamen e en las células ege ales y el es o de los o ganismos nos emos obligados a inco po a los a a és de la "die a e de". La g an impo ancia de es os compues os jun o a las ca encias de la alimen ación ac ual conlle a la necesidad de usa complemen os die é icos (leches, man equillas, pos es y bolle ía en iquecidos con 00-3) ab icados a pa i de acei es ex aídos de o ganismos p oduc o es. Es impo an e que los o ganismos p oduc o es cons i uyan, de po si, una uen e de al o endimien o. Si además se puede manipula el pe il a pa i de las condiciones de cul i o, es posible en abiliza el p oduc o y aba a a su p ecio en el me cad o. Cie as mic o algas cumplen es os eque imien o, su pe il lipídico es ealmen e in e esan e y, además, se puede modi ica manipulando cie os pa áme os isico-químicos (luz, empe a u a y/o disponibilidad de nu ien es) (Bo owi zka, 1988; Chel , 1990). El con ol de las dis in as condiciones de cul i o sob e la calidad bioquímica del cul i o debe se pe iódica. Las écnicas que nos pe mi en lle a a cabo es a a ea son muy di e sas: c oma og a ia, g a ime ía, y luo ime ía (Lee el al., 1998). De las écnicas enume adas, la ~ ime ía es la más sencilla y ápida, es necesano, solamen e, ~ ma cado luo escen e especí ico. Di e sos es udios sob e el ma cado sol a oc ó nico Rojo nilo (NR; 9-die hyla nina-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one) ma ca lípidos celula es, luo esciendo exclusi amen e en ambien es hid o óbicos (G eenspan and Fowle , 1985; G eenspan el a l. 1985). Es e ma cado se ha usado p e iamen e en la cuan i icación espec o luo omé ica de lípidos pola es y neu os (Alonzo and Mayzaud, 1999). La ci ome ía de lujo es una écnica luo imé ica que pe mi e medi simul áneamen e au o luo escencia y luo escencia de células indi iduales a medida que iajan en un l ujo lamina ( ig. 1). 2 El o ganismo seleccionado pa a es e es udio ue C yp hecodinium cohnii, un dino lagelado he e o ó ico ma ino con un con enido lipídico mayo del 20% de su peso seco y cuyo con enido en DHA ep esen a más del 30% de los ácidos g asos o ales (Ha ing on and Holz, 1968, Swaa e al., 1999). El obje i o de es e es udio ue comp oba la idoneidad del ma cado RN combinado con la ci ome ia de lujo pa a e alua de o ma ápida el con enido lipídico de cul i os de C. cohnii. (4) (3 ) (2) Unidades a bi a ias de luo escencia Figu a 1. Esquema de un ci óme o de lujo. Las pa ículas (1) VIajan Inme sas en un lujo lamina , cada ez que el láse (2) incide en una de ellas se p oduce dispe sión de luz y emisión de luo escencia. Es os pa áme os isicos son de ec ados po los o omul iplicado es (3) y aducidos a señales elec ónicas que podemos lee con la ayuda de un so wa e especial (4, 5). 2. Ma e iales y mé odos 2.1. Cul i o celula C yp hecodinium cohnii (CCMP316) se cul i a on 500 mL de medio /2 + NPM (Guilla d e al. , 1975) en iquecido con 5 g de glucosa L- 1, usando e lenmeye s de bo osilica o de 1000 mL. Los cul i os se man u ie on en oscu idad a 20 ± 2°C con un suminis o de oxígeno median e bu bujeo de ai e. El inóculo se ob u o de un s ock que se man iene median e subcul i o semanal. 3 • • Las condiciones ensayadas ue on: Disponibilid ad de ni ógeno: se ob u o con un / 2 + NPM comple o en iquecido con 5 g de glucosa L- 1 Sup esión de ni óg eno: se ob u o cosechando las células en a se es aciona ia median e- cen i ugación (5000 g min, 5 minu os) y einoculando en medio sin N. El medio sin N se ob u o eliminando comple amen e del medio las soluciones de ni ógeno (o gánica e ino gánica ). La densidad celula se con oló median e con aje dia io en un hemoci óme o y se exp esa como celo nL -1• La asa de c ecimien o se calculó según C ow and Kimu a (1970) y se exp esa como di isiones po día (di ' d-1 ). Las mues as pa a el análisis se oma on de cul i os en di e en es ases de c ecimien o. 2.2. Análisis g a imé ico y c oma og á ico A pa i de un concen ado celula congelado se lle ó a cabo una ex acción lipídica usando pa a ello una modi icación del mé odo de Folch (1957). A una alícuo a del concen ado celula (50-100¡. l) se le añadió un olumen de me anoVclo o o mo (1 :2, / ), depués de eposa 5 mino se cen i ugó du an e 2 min (5000 g min), el sob enadan e se ecogió en un ubo limpio y se añadió 1 nL de una solución de clo u o de sodio (0.9%, w/ ) po cada 5 nL de ex ac o lipídico. Es a mezcla se agi ó ue emen e y se dejó eposa du an e 5 minu os, al cabo de los cuales se obse ó la o mación de dos ases, el sob enadan e se eliminó po se una ase acuosa ica en componen es no lipídicos. La ase oleosa se denominó ex ac o lipídico y ue el ma e ial u ilizado pa a de e mina el con enido lipídico o al, las acciones de lípidos pola es y neu os y el pe il de ácidos g asos. El con enido lipídico o al se ob u o deshid a ando el ex ac o lipídico (85°C, 15 min.) median e pesada. Las acciones lipídicas se ob u ie on a pa i del ex ac o lipídico median e un p o ocolo modi icado de Yongmani chai and Wa d, 1992. P ime amen e se eluye on los lípidos neu os con 16 mL de clo o o mo a a és de ca uchos de sílica. Luego se ecupe a on los lípidos pola es 4 eluyendo con 10 mL de me anol. Las acciones ob enidas se deshid a a on (85°C, 15 min) Y se de e mina on g a imé icamen e. Los esul ados se exp esan como pg lípidos' Ce l. La composición de ácidos g asos se ob u o a pa i de bio ma sa congelada (una semana de almacenamien o a -20°C). Pa a ello se anses e i ica on alícuo as de biomasa con clo u o de me anol (Pe ko e al ., 1994). Los ácidos g asos ob enidos se pu i ica on usando c oma og a ia en capa ina. Se u ilizó ácido pen adecanoico como es ánda in e no. Los análisis de c oma og a ia de gases se ealiza on en un c oma óg a o Va ian cp-38 con un de ec o FID. La iden i icación de los me il és e es de ácidos g asos se lle ó a cabo compa ando los iempos de e ención con los de es ánda es au én icos (Supelco F.A.M. E. Mix C4-C24 ). 2.3. Ci ome ía de lujo El ma cado in acelula se ealizó median e una modi icación del mé odo de Demps e y So nme eld (1988). Se añadie on 50 ~L de una solución de a ba jo de RN en ace ona (lmg / 10 mL) a 1 mL de cul i o (105-106 ceVmL) y se incuba on en oscu idad (10 min., 37°C). La señal de RN se de e minó usando un ci óme o de lujo F ACSCalibu (Ins umen os Bec on Dickinson) equipado con un láse de a gón de 488 nm. Rojo nilo es un ma cado sol a oc ómico, cuya luo escencia a ía espec almen e según la pola idad del medio en el que se encuen e. Al se exci ado po una longi ud de onda de 488 nm, RN disuel o en lípidos neu os emi e luo escencia ama illa-do ada in ensa, mien as que disuel o en lípidos pola es emi e luo escencia oja (Shapi o, 1995). El sis ema óp ico usado en el sis ema F ASCSCalib u ecoge la luz ama illa y na anja (560-640 nm , que co esponde a los lípidos neu os) en el canal FL2 y la luz oja (>650 nm co espondien e a lípidos pola es) en el canal FL3. Ap oximadamen e 3000 células ue on analizadas median e una ampli icación loga í mica de la señal l uo escen e. Se u iliza on células no ma cadas como con ol in e no. Los da os se exp esan en unidades a bi a ias de luo escencia. 2.4. Análisis de da os La signi icación es adís ica de los da os se e aluó median e un análisis de eg esión lineal de e minando el coe icien e de co elación de Pea son (R). Las d i e encias signi ica i as en e las dis in as condiciones de cul i o y el con enido o al de lípidos, el cocien e pola es/neu os, el 5 con enido DHA Y el po cen aje de DHA del o al de ácidos g asos se es ablecie on median e un ANOV A. a=0.05, n = 14 excep o en el caso de la asa de c ecimien o en el que n =44. 3. Resul ados La co elación ob enida en e la señal media de luo escencia de células ma cadas con RN y el con enido lipídico de e minado g a imé icamen e ue al a (FL2 -neu os, R2= 0.93 Y FL3 - pola es, R2= 0.83) ( ig.2). El cocien e ci omé ico FL3/FL2, po an o, ambién co elacionó con el cocien e de e minado g a imé icamen e (R2= 0.96) ( ig.3). 4000 -3000 - N 'l .,.;¡ Y = 14.895x - 863.29 .,.;¡ Y = 61,514x -689,36 ~ ~ '" 3000 -RZ =0.9336 '" R2 = 0,8293 :o :o Gol Gol 2000 - e e '" 2000 - '" .¡;¡ .¡;¡ e e Gol Gol c.¡ c.¡ 1000 - '" '" Gol 1000 - Gol lo lo <:) <:) = = ¡i; • ¡i; O O , O 100 200 300 O 20 40 60 Upidos neu os (pg/cel) Upidos pola es (pg/cel) Figu a 2. Los diag amas de dispe sión ep esen an lípldos pola es y neu os Ys . FL3, FL2 media espec i amen e. Los da os de lípidos se exp esan como pg/cel y los da os de luo escencia como unidades a bi a ias. Las co elaciones lineales pa a ambos (lípidos neu os (R2=0.93) y pola es (R2=0.83)) son signi ica i as. La luo escencia de lípidos neu os y pola es co elacionó signi ica i amen e con el con enido celula de DHA de e minado po c oma og a ia (FL2 -neu os, R2= 0.60; FL3 - pola es, R2= 0.71) ( ig. 4). Se encon ó una co elación signi ica i a, aunque baja, en e el cocien e FL3/FL2 y el po cen aje de DHA en el con enido o al de ácidos g asos (R2= 0.44) ( ig.5). Exis e una endencia en e el cocien e FL3/FL2 y la asa de c ecimien o (R2= 0.56) ( ig.6). En 10 e e en e al e ec o de las condiciones de cul i o en la composición lipídica, las mayo es can idades de lípidos y DHA, se ob u ie on en aquellos cul i os en los que se eliminó el ni ógeno. Sin emba go, el mayo po cen aje de ácidos g asos o ales se encon a on en aquellos 6 S.O 4 . _~ 4.0 ,... J.S ~ .- ~ . -J.O ('1 -1 2.5 u.. .......... 2.0 ¡- . -1 L.:... 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0 0.2 0.4 O .Ó O.X Pola /neu al a iD Figu a 3. El diag ama de dispe sión ep esen a el cocien e pola /neu os de e minados g a imé icamen e en e al mismo cocien e hallado ci omé icamen e (R 2= 0.9592) 2S00 2000 ISOO 1000 - - SOO o o , .,:- ~ n. 71"¡-J :. - ___ • • • su • • • lOO DHA (pg' cel ') . .., - • ISO Figu a 4. El diag ama de dispe sión ep esen a el con enido de DHA en e a la luo escencia media en FL3 (R2= 0.7144)