Determinación del contenido lipídico en "Crypthecodinium cohnii" por citometría de flujo

Trabajo de Suficiencia investigadora (Septiembre 2003) Determinación del contenido lipídico en Crypthecodinium cohnii por citometría de flujo Adelina de la Jara Valido Índice Ab · , . 1 reVlaturas y acrornmos ................... .. ... .. .......................... ... ... ...... ... ... . .. .. .. .. .. .. . 1. Introducción.............. ... ........................................................................... .. ..... 2 2. Material y métodos ...... .. .......... .. .. .. ... . .. ... .. ..................................................... 3 2.1. Cultivo celular 2.2. Análisis gravimétrico y cromatográfico 2.3. Citometría de flujo 2.4. Análisis de datos 3. Resultados................................... .. .............................................. ... .. .... ...... .. . 6 4. Discusión ............. .. .... .. ... .. .......................................... .. ...... . ... ...................... 8 5. Conclusión ............... .. .......................................................................... .. ....... 9 6. Bibliografia........................... ..... ..... .......... .. ... .. . .. .. ....... ............... ... ........... .... 10 Portada: células de Crypthecodinium cohnii Abreviaturas y acrónimos AGPCLs: ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga DHA: ácido docohexaenoico RN : rojo nilo 1. Introducción Los lípidos son nutrientes vitales para el crecimiento celular ya que, además de constituir • la reserva energética de la célula (Dempster y Sommerfeld, 1998), son estructuralmente indispensables. Químicamente son ésteres de ácidos grasos. Una clase especial dentro del conjunto de ácidos grasos son los poliinsaturados de cadena larga (AGPCLs) (Salhi, 1994) que encontramos fundamentalmente en los fosfolípidos de las membranas biológicas. Los precursores de este grupo se denominan ácidos grasos esenciales, su ruta de síntesis se encuentra únicamente en las células vegetales y el resto de los organismos nos vemos obligados a incorporarlos a través de la "dieta verde". La gran importancia de estos compuestos junto a las carencias de la alimentación actual conlleva la necesidad de usar complementos dietéticos (leches, mantequillas, postres y bollería enriquecidos con 00-3) fabricados a partir de aceites extraídos de organismos productores. Es importante que los organismos productores constituyan, de por si, una fuente de alto rendimiento. Si además se puede manipular el perfil a partir de las condiciones de cultivo, es posible rentabilizar el producto y abaratar su precio en el mercad o. Ciertas micro algas cumplen estos requerimiento, su perfil lipídico es realmente interesante y, además, se puede modificar manipulando ciertos parámetros fisico-químicos (luz, temperatura y/o disponibilidad de nutrientes) (Borowitzka, 1988; Chelf, 1990). El control de las distintas condiciones de cultivo sobre la calidad bioquímica del cultivo debe ser periódica. Las técnicas que nos permiten llevar a cabo esta tarea son muy diversas: cromatografia, gravimetría, y fluorimetría (Lee el al., 1998). De las técnicas enumeradas, la ~ rimetría es la más sencilla y rápida, es necesano, solamente, ~ marcador fluorescente específico. Diversos estudios sobre el marcador solvatocrórnico Rojo nilo (NR; 9-diethylarnina-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one) marca lípidos celulares, fluoresciendo exclusivamente en ambientes hidrofóbicos (Greenspan and Fowler, 1985; Greenspan el a l. 1985). Este marcador se ha usado previamente en la cuantificación espectrofluorométrica de lípidos polares y neutros (Alonzo and Mayzaud, 1999). La citometría de flujo es una técnica fluorimétrica que permite medir simultáneamente autofluorescencia y fluorescencia de células individuales a medida que viajan en un fl ujo laminar (fig. 1). 2 El organismo seleccionado para este estudio fue Crypthecodinium cohnii, un dinoflagelado heterotrófico marino con un contenido lipídico mayor del 20% de su peso seco y cuyo contenido en DHA representa más del 30% de los ácidos grasos totales (Harrington and Holz, 1968, Swaaf et al., 1999). El objetivo de este estudio fue comprobar la idoneidad del marcador RN combinado con la citometria de flujo para evaluar de forma rápida el contenido lipídico de cultivos de C. cohnii. (4) (3 ) (2) Unidades arbitrarias de fluorescencia Figura 1. Esquema de un citómetro de flujo. Las partículas (1) VIajan Inmersas en un flujo laminar, cada vez que el láser (2) incide en una de ellas se produce dispersión de luz y emisión de fluorescencia. Estos parámetros fisicos son detectados por los fotomultiplicadores (3) y traducidos a señales electrónicas que podemos leer con la ayuda de un software especial (4, 5). 2. Materiales y métodos 2.1. Cultivo celular Crypthecodinium cohnii (CCMP316) se cultivaron 500 mL de medio f/2 + NPM (Guillard et al. , 1975) enriquecido con 5 g de glucosa L1, usando erlenmeyers de borosilicato de 1000 mL. Los cultivos se mantuvieron en oscuridad a 20 ± 2°C con un suministro de oxígeno mediante burbujeo de aire. El inóculo se obtuvo de un stock que se mantiene mediante subcultivo semanal. 3 • • Las condiciones ensayadas fueron: Disponibilid ad de nitrógeno: se obtuvo con un f/ 2 + NPM completo enriquecido con 5 g de glucosa L1 Supresión de nitr óg eno: se obtuvo cosechando las células en fa se estacionaria mediantecentrifugación (5000 g min, 5 minutos) y reinoculando en medio sin N. El medio sin N se obtuvo eliminando completamente del medio las soluciones de nitrógeno (orgánica e inorgánica ). La densidad celular se controló mediante contaje diario en un hemocitómetro y se expresa como celo rnL -1• La tasa de crecimiento se calculó según Crow and Kimura (1970) y se expresa como divisiones por día (div' d-1 ). Las muestras para el análisis se tomaron de cultivos en diferentes fases de crecimiento. 2.2. Análisis gravimétrico y cromatográfico A partir de un concentrado celular congelado se llevó a cabo una extracción lipídica usando para ello una modificación del método de Folch (1957). A una alícuota del concentrado celular (50-100¡.tl) se le añadió un volumen de metanoVcloroformo (1 :2, v/v), depués de reposar 5 mino se centrifugó durante 2 min (5000 g min), el sobrenadante se recogió en un tubo limpio y se añadió 1 rnL de una solución de cloruro de sodio (0.9%, w/v) por cada 5 rnL de extracto lipídico. Esta mezcla se agitó fuertemente y se dejó reposar durante 5 minutos, al cabo de los cuales se observó la formación de dos fases, el sobrenadante se eliminó por ser una fase acuosa rica en componentes no lipídicos. La fase oleosa se denominó extracto lipídico y fue el material utilizado para determinar el contenido lipídico total, las fracciones de lípidos polares y neutros y el perfil de ácidos grasos. El contenido lipídico total se obtuvo deshidratando el extracto lipídico (85°C, 15 min.) mediante pesada. Las fracciones lipídicas se obtuvieron a partir del extracto lipídico mediante un protocolo modificado de Yongmanitchai and Ward, 1992. Primeramente se eluyeron los lípidos neutros con 16 mL de cloroformo a través de cartuchos de sílica. Luego se recuperaron los lípidos polares 4 eluyendo con 10 mL de metanol. Las fracciones obtenidas se deshidrataron (85°C, 15 min) Y se determinaron gravimétricamente. Los resultados se expresan como pg lípidos' Cerl. La composición de ácidos grasos se obtuvo a partir de bio ma sa congelada (una semana de almacenamiento a -20°C). Para ello se transesterificaron alícuotas de biomasa con cloruro de metanol (Petkov et al ., 1994). Los ácidos grasos obtenidos se purificaron usando cromatografia en capa fina. Se utilizó ácido pentadecanoico como estándar interno. Los análisis de cromatografia de gases se realizaron en un cromatógrafo Varian cp-38 con un detector FID. La identificación de los metil ésteres de ácidos grasos se llevó a cabo comparando los tiempos de retención con los de estándares auténticos (Supelco F.A.M. E. Mix C4-C24 ). 2.3. Citometría de flujo El marcado intracelular se realizó mediante una modificación del método de Dempster y Sornmerfeld (1988). Se añadieron 50 ~L de una solución de tra ba jo de RN en acetona (lmg / 10 mL) a 1 mL de cultivo (105-106 ceVmL) y se incubaron en oscuridad (10 min., 37°C). La señal de RN se determinó usando un citómetro de flujo F ACSCalibur (Instrumentos Becton Dickinson) equipado con un láser de argón de 488 nm. Rojo nilo es un marcador solvatocrómico, cuya fluorescencia varía espectralmente según la polaridad del medio en el que se encuentre. Al ser excitado por una longitud de onda de 488 nm, RN disuelto en lípidos neutros emite fluorescencia amarilla-dorada intensa, mientras que disuelto en lípidos polares emite fluorescencia roja (Shapiro, 1995). El sistema óptico usado en el sistema F ASCSCalib ur recoge la luz amarilla y naranja (560-640 nm , que corresponde a los lípidos neutros) en el canal FL2 y la luz roja (>650 nm correspondiente a lípidos polares) en el canal FL3. Aproximadamente 3000 células fueron analizadas mediante una amplificación logarítmica de la señal fl uorescente. Se utilizaron células no marcadas como control interno. Los datos se expresan en unidades arbitrarias de fluorescencia. 2.4. Análisis de datos La significación estadística de los datos se evaluó mediante un análisis de regresión lineal determinando el coeficiente de correlación de Pearson (R). Las d if erencias significativas entre las distintas condiciones de cultivo y el contenido total de lípidos, el cociente polares/neutros, el 5 contenido DHA Y el porcentaje de DHA del total de ácidos grasos se establecieron mediante un ANOV A. a=0.05, n = 14 excepto en el caso de la tasa de crecimiento en el que n =44. 3. Resultados La correlación obtenida entre la señal media de fluorescencia de células marcadas con RN y el contenido lipídico determinado gravimétricamente fue alta (FL2 -neutros, R2= 0.93 Y FL3 - polares, R2= 0.83) (fig.2). El cociente citométrico FL3/FL2, por tanto, también correlacionó con el cociente determinado gravimétricamente (R2= 0.96) (fig.3). 4000 -3000 - N r'l .,.;¡ Y = 14.895x - 863.29 .,.;¡ Y = 61,514x -689,36 ~ ~ '" 3000 -RZ =0.9336 '" R2 = 0,8293 :o :o Gol Gol 2000 - e e '" 2000 - '" .¡;¡ .¡;¡ e e Gol Gol c.¡ c.¡ 1000 - '" '" Gol 1000 - Gol lo lo <:) <:) = = ¡i; • ¡i; O O , O 100 200 300 O 20 40 60 Upidos neutros (pg/cel) Upidos polares (pg/cel) Figura 2. Los diagramas de dispersión representan lípldos polares y neutros Ys . FL3, FL2 media respectivamente. Los datos de lípidos se expresan como pg/cel y los datos de fluorescencia como unidades arbitrarias. Las correlaciones lineales para ambos (lípidos neutros (R2=0.93) y polares (R2=0.83)) son significativas. La fluorescencia de lípidos neutros y polares correlacionó significativamente con el contenido celular de DHA determinado por cromatografia (FL2 -neutros, R2= 0.60; FL3 - polares, R2= 0.71) (fig. 4). Se encontró una correlación significativa, aunque baja, entre el cociente FL3/FL2 y el porcentaje de DHA en el contenido total de ácidos grasos (R2= 0.44) (fig.5). Existe una tendencia entre el cociente FL3/FL2 y la tasa de crecimiento (R2= 0.56) (fig.6). En 10 referente al efecto de las condiciones de cultivo en la composición lipídica, las mayores cantidades de lípidos y DHA, se obtuvieron en aquellos cultivos en los que se eliminó el nitrógeno. Sin embargo, el mayor porcentaje de ácidos grasos totales se encontraron en aquellos 6 S.O 4 . _~ 4.0 ,... J.S ~ .- ~ . -J.O ('1 -1 2.5 u.. .......... 2.0 ¡-r. -1 L.:... 1.5 1.0 0.5 0.0 0.0 0.2 0.4 O .Ó O.X Polar/neutral ratiD Figura 3. El diagrama de dispersión representa el cociente polar/neutros determinados gravimétricamente frente al mismo cociente hallado citométricamente (R 2= 0.9592) 2S00 2000 ISOO 1000 - - SOO o o , .,:- ~ n. 71"¡-J :. - ___ • • • su • • • lOO DHA (pg' celr ') . .., - • ISO Figura 4. El diagrama de dispersión representa el contenido de DHA frente a la fluorescencia media en FL3 (R2= 0.7144)