Influencia del polimorfismo del receptor de andrógenos en la masa ósea, masa muscular y condición física en niños y niñas

CONTENIDOS Agradecimientos.................................................................................................................. 3 Lista de publicaciones originales................................................................................7 Fuentes de financiación....................................................................................................8 Abreviaturas............................................................................................................................9 Resumen general.................................................................................................................13 Summary.................................................................................................................................16 1. Introducción.....................................................................................................................21 1.1. Tejido óseo.................................................................................................................22 1.1.1. Características generales......................................................................22 1.1.2. Estructura del hueso durante el crecimiento..............................24 1.1.3. Proceso de remodelado óseo en el crecimiento.........................24 1.1.4. Efectos del ejercicio durante el crecimiento óseo.....................26 1.2. Tejido muscular.........................................................................................................27 1.2.1. Características generales......................................................................27 1.2.2. Efectos del ejercicio en el tejido muscular durante el crecimiento................................................................................................28 1.3. Tejido adiposo..........................................................................................................29 1.3.1. Características generales...................................................................29 1.3.2. Efectos del ejercicio en el tejido adiposo durante el crecimiento................................................................................................29 1.4. Andrógenos y Testosterona.................................................................................30 1.5. Polimorfismo del receptor de andrógenos...................................................30 1.5.1. Mecanismo de acción clásico o genómico del receptor de andrógenos................................................................................................33 1.6. Efectos del polimorfismo del receptor de andrógenos en el crecimiento.................................................................................................................34 2. Objetivos............................................................................................................................39 3. Hipótesis............................................................................................................................40 4. Metodología.....................................................................................................................43 4.1. Sujetos..........................................................................................................................43 4.2. Composición corporal............................................................................................45 4.2.1. Antropometría........................................................................................45 4.2.2. Absorciometría fotónica dual de rayos x.....................................45 4.3. Condición física........................................................................................................46 4.3.1. Capacidad de salto................................................................................46 4.3.2. Capacidad anaeróbica...........................................................................46 4.3.3. Capacidad aeróbica máxima...............................................................46 4.3.4. Test de velocidad de carrera................................................................47 4.3.5. Test de oxidación máxima de grasa (MFO): calorimetría indirecta.......................................................................................................47 4.4. Muestras de saliva....................................................................................................48 4.4.1. Aislamiento de ADN mediante saliva y reacción en cadena de lapolimerasa (PCR) para la medición de los polimorfismos CAG y GGN del gen del receptor de andrógenos........................48 4.5. Consentimientos y aprobación ética...............................................................49 4.6. Estadística...................................................................................................................49 5. Resultados........................................................................................................................53 5.1. Resumen de los resultados del artículo I (En revisión)..........................53 5.2. Resumen de los resultados del artículo II (En revisión)........................54 5.3. Resumen de los resultados del artículo III (En revisión)......................55 6. Discusión...........................................................................................................................61 7. Conclusiones...................................................................................................................73 8. Bibliografía......................................................................................................................79 9. Anexos................................................................................................................................91 Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Agradecimientos 3 Agradecimientos Los estudios en los que se basa esta tesis nunca hubieran podido ser realizados sin la ayuda del grupo de investigación de “Rendimiento Humano, Ejercicio físico y Salud” del Departamento de Educación Física de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria. En primer lugar me gustaría agradecer a la profesora Cecilia Dorado por darme la oportunidad de trabajar y de formar parte del grupo de investigación de Rendimiento Humano, así como a escoger el camino correcto para crecer en mi carrera profesional. Gracias a José Antonio López Calbet por despertar en mi lo que significa el mundo de la investigación y por permitirme trabajar en su grupo de investigación de Rendimiento Humano, donde he podido formarme y superarme cada día más y sobre todo aprender a valorar que con esfuerzo se consigue todo en esta vida. En especial, quiero agradecer a Amelia Guadalupe, por brindarme a cualquier hora del día su ayuda, a enseñarme cada una de las técnicas que he aprendido trasmitiéndome todos sus conocimientos adquiridos en todos estos años para llegar a ser una gran investigadora. Y sobre todo, darte las gracias por ser una gran amiga tanto dentro como fuera del grupo de investigación y darme tu mano para levantarme cuando lo he necesitado. Muchísimas gracias. A Jesús Ponce, por demostrarme en estos años que siempre que te he necesitado has estado ahí para hacerme este camino más fácil y seguir adelante en los momentos más difíciles. Muchas gracias por tu amistad y por compartir tus conocimientos como investigador conmigo. A Teresa Fuentes, por enseñarme a trabajar en equipo y a no perder nunca la alegría y la ilusión que siempre transmites. Eres una gran persona y una gran amiga. Muchas gracias. Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Fuentes de financiación 4 A Borja Guerra, por enseñarme hacer mi primer Western blot e introducirme en las técnicas de biología molecular. A Hugo Olmedillas, por haberme prestado su ayuda desde el primer día y hacer que mi entrada al laboratorio fuese mucho más fácil, teniendo siempre un buen consejo que darme. A Alfredo Santana, agradecerte tu confianza depositada en mi para formarme en diferentes técnicas de biología molecular y de permitirme trabajar a tu lado en tu laboratorio. Muchísimas gracias. A José Losa, por ayudarme y enseñarme todos los trucos informáticos habidos y por haber. Gracias por tu amistad. Agradecer a Bonifacio Nicolás Díaz Chico, su ayuda en la medición de los polimorfismos y por tener el placer de compartir nuestras raíces de Fasnia en el mundo de la investigación. Muchas gracias por ayudarme y guiarme en este largo camino. A Rafael Sánchez, por ser un gran compañero y por prestarme su ayuda en cualquier momento que lo he necesitado. A David Morales, por compartir estos años de investigación en el grupo de Rendimiento Humano. A José Navarro, por darme siempre buenos consejos y enseñarme día a día a trabajar sin dejar nada fuera de su lugar. Gracias por facilitarnos los medios técnicos en el laboratorio. A Ismael Pérez, por ser el futuro del laboratorio y siempre tener disposición para colaborar en todo y muchas ganas de querer aprender. A Macame, por su colaboración y por compartir sus conocimientos como técnico, y sobre todo por su gran amabilidad en hacer que el trabajo sea mucho más llevadero. Muchas Gracias. Agradecimientos Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria 5 A Esther y a Yanira, de la Unidad de Investigación del Hospital Dr. Negrín por acogerme como parte de su grupo y compartir sus conocimientos conmigo, y sobre todo por llevarme una gran amistad. Gracias a Pilar y a Germán por ayudarme a medir los polimorfismos y sacar el trabajo adelante en el menor tiempo posible. Especial agradecimiento a mi tutora de estancia Eva Blomstrand, “en la Escuela Sueca del Deporte y Ciencias de la Salud” por hacerme sentir como en casa y enseñarme su forma de trabajar en el mundo de la investigación. A Juan José González, por enseñarme sus conocimientos de estadística y por sus buenos consejos y ánimos para llegar a la recta final. A José Antonio Serrano, por enseñarme a exportar los datos de los cuestionarios IPAQ. Agradecer a David, Pedro, Andrea y Marta por venir con esas ganas y energías de aprender y contribuir a sacar el trabajo diario en el laboratorio. Gracias al resto de profesores miembros del grupo de investigación del Rendimiento Humano, Joaquín Sanchís, Javier Chavarren y Rafael Arteaga. En especial agradecer la colaboración de todos los sujetos que participaron en los estudios de esta tesis ya que sin ellos este trabajo no se hubiese llevado a cabo, así como a la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria y en especial a todo el personal de Administración (Mila, Carmelo y Anselmo) por darme siempre ánimos y sacarme una sonrisa en los momentos más difíciles. También agradecer al equipo de Vicerrectorado de Investigación, al Departamento de Educación Física y a los servicios de Conserjería de la Facultad de Educación Física. Agradecimientos en especial a mis amigos que han estado ahí apoyándome en todos estos años para verme cumplir mi sueño y por acabar lo que un día empecé. Gracias por los ánimos y las fuerzas transmitidas para luchar y conseguir mi objetivo, sin ustedes este camino no hubiese sido igual Eliezer, Agradecimientos Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria 6 Carmen, Azahara, Dafne, Laura, Anita, Gema.... y muchos más. Muchísimas gracias. En especial quiero agradecer a Marta por apoyarme y darme las fuerzas necesarias para que llegara a la recta final. Muchísimas gracias. Y por último quiero agradecer a lo que más quiero en esta vida, a mi familia y en especial a mis padres y a mi hermano, que sé que para ellos no ha sido nada fácil, desde la distancia, motivarme y animarme en los días más duros de esta etapa para que luchara y me esforzara por terminar este camino que un día elegí. Gracias por haber confiado siempre en mí y apoyarme en todas mis decisiones. Muchas gracias a todos. Agradecimientos Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria 7 Lista de publicaciones originales La presente tesis se basa en las siguientes publicaciones: Artículo I: Lorena Rodríguez-García, Jesús G. Ponce-González, Juan J GonzálezHenríquez, Francisco G. Rodríguez-González, Bonifacio N Díaz-Chico, José A L Calbet, Cecilia Dorado, Amelia Guadalupe-Grau. (2015). Androgen receptor CAG and GGN repeat polymorphisms are associated with performance in boys and girls. (En revisión). Artículo II: Lorena Rodríguez-García, Jesús G. Ponce-González, Juan J GonzálezHenríquez, Francisco G. Rodríguez-González, Bonifacio N Díaz-Chico, José A Serrano-Sánchez, José A L Calbet, Cecilia Dorado, Amelia Guadalupe-Grau. (2015). Androgen receptor CAG and GGN repeat polymorphisms and bone mass in boys and girls. (En revisión). Artículo III: Jesús G. Ponce-González, Lorena Rodríguez-García, José Losa-Reyna, Amelia Guadalupe-Grau, Francisco G. Rodríguez-González, Bonifacio N Díaz-Chico, Cecilia Dorado, José A Serrano-Sánchez, José A L Calbet. (2015). Androgen receptor gene CAG and GGN repeat polymorphism influence fat accumulation: a longitudinal study from adolescence to adult age. (En revisión). Fuentes de financiación Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Summary 16 Summary The study of factors that influence the development of muscle mass and bone mass, as well as the accumulation of fat mass during growth have a great interest in sports science, in order to detect sporting talents and designing training strategies and / or effective for future therapeutic effective in the future. The main objective of this thesis was to determine, from a genetic perspective, some of the variability in certain components of body composition such as muscle mass, bone mass and fat mass, and to assess influence on the physical condition of children in growth. Moreover, the degree of fat accumulation may vary during the period between childhood and adulthood, although lifestyles are similar. Another objective of this study was to explain the possible causes of fat accumulation and fat oxidation capacity from the perspective of the influence of possible genetic variations, known as polymorphisms. To determine the effect of certain polymorphisms of the androgen receptor gene on muscle and bone mass, a population sample of 152 children and 116 healthy and physically active girls (Studies I and II) was studied. Body composition was determined by dual-energy X-ray absorptiometry (DXA) and anthropometry. Physical fitness was assessed by running tests to measure running speed at 30m, and to estimate the anaerobic capacity (running test 300m), and aerobic capacity (Course Navette). In addition, the muscular power of the lower limbs was determined by vertical jump test with and without countermovement (SJ and CMJ); and maximum isometric force and dynamics of the lower extremities using a force platform. In 45 healthy male adults from cohort studies I and II longitudinal data on accumulation of fat mass and maximum capacity for fat oxidation (measured by indirect calorimetry test) were obtained over a period of 15 years (Study III). The number of CAG repeats (polyglutamine) and GGN polymorphisms (polyglycine) of the androgen receptor gene was determined by the technique of Polymerase chain reaction (PCR). Considering the allelic distribution, the study population was divided into the following groups: Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Summary 17 CAG short (short) (CAG S ) repeats those subjects with CAG≤21. CAG long (long) (CAG L ): If CAG> 21. GGN short (short) (GGN S ) if subjects fulfilled the condition number of repetitions GGN ≤ 23. GGN long (long) (GGN L ) if GGN ≥ 23. The results were analyzed using t-tests, ANOVA for repeated measures, bivariate correlations and multiple regression analysis. In general, it was observed that anaerobic fitness is higher in the CAG S and aerobic fitness in GGN L girls. Also, long alleles of polymorphisms CAG and GGN repeat androgen receptor were associated with higher bone mass in prepubertal children with no apparent effect on prepubescent girls (Studies I and II). CAG and GGN polymorphisms may influence physical fitness through increased androgenic signaling in those individuals with CAG S , since at ages prepubertal the amount of circulating androgens is limited. On the other hand, the greater bone mass observed in GGN L children and CAG L can be determined by a greater "window of opportunity" for bone development, because less androgenic effect on the closure of the bony epiphysis during the growth. In Study III, it is shown that the number of polymorphic CAG repeats and GGN have a relationship with fat mass, as groups of short repeat polymorphisms showed lower body fat mass, which remained over the years. Nevertheless, the maximum capacity for fat oxidation was higher in CAG L . In conclusion CAG and GGN repeat polymorphisms of the androgen receptor exerts an influence on the lean mass, fat mass and physical fitness of boys and girls during growth. However, no influence was detected on bone mass in growth in girls. Finally, the longitudinal study of the changes in the body composition from the childhood up to the adult age demonstrates that androgen receptor polymorphisms influence the accumulation of body fat and the maximum capacity for fat oxidation in males. INTRODUCCIÓN Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Ca naria Introducción 21 1. Introducción El importante desarrollo industrial, tecnológico y electrónico que ha experimentado nuestra sociedad durante el último siglo ha reducido la necesidad del trabajo manual y físico, incrementando en consecuencia y de forma exponencial el sedentarismo. Esta falta de actividad física también afecta a los niños en crecimiento, en los que el sobrepeso y la obesidad han aumentado de forma alarmante, constituyendo hasta un 45% del total en España, como se extrae de los datos aportados desde el estudio “Aladino”, (Alimentación, Actividad física, Desarrollo Infantil y Obesidad), desarrollado por el Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad durante el curso escolar 2010/2011 en 7.659 niños y niñas de 6 a 9 años de edad pertenecientes a todas las Comunidades Autónomas de España(Perez-Farinos et al., 2013) (Figura 1). Por tanto, la obesidad infantil y sus posibles complicaciones de salud (diabetes, hipertensión arterial, arterioesclerosis, dislipemia) constituyen en la actualidad un importante problema de salud pública en España. El estudio de los factores que influencian el desarrollo de los demás elementos que forman parte de la composición corporal (la masa ósea y muscular) durante el crecimiento, han atraído a la comunidad científica en los últimos años. Con respecto a la masa ósea, se ha postulado que la osteoporosis es una “enfermedad pediátrica”, puesto que la adecuada adquisición del pico de masa ósea en la niñez y adolescencia minimiza el riesgo del desarrollo en la edad adulta de esta patología caracterizada por una pérdida cuantitativa de masa ósea, deterioro microarquitectural, y mayor susceptibilidad a fracturas óseas. Es precisamente la infancia y la adolescencia, el período de la vida en el que se puede intervenir disminuyendo los factores de riesgo de un inadecuado pico de masa ósea, planificando estrategias para la prevención de la osteoporosis (por ejemplo, actividad física, ingesta de calcio, exposición solar) (Fassler et al., 1995). El desarrollo de la masa muscular de los niños en crecimiento ha sido principalmente estudiado de cara a la detección de talentos deportivos, especialmente en aquellos deportes donde la fuerza y/o la velocidad tienen un Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 22 papel prioritario en el rendimiento. Sin embargo, la utilidad del entrenamiento de fuerza en niños ha sido criticado al alegarse la falta de un entorno hormonal adecuado (andrógenico principalmente) en esta etapa de la vida (Lloyd et al., 2014). Mucho menos estudiado está el efecto de la variabilidad genética sobre el rendimiento físico de los niños y niñas en crecimiento, más concretamente, sobre el desarrollo de la masa muscular, masa grasa y masa ósea. Las Ciencias de la Actividad física y del Deporte son un ámbito de investigación que no puede escapar a los cambios que está experimentando la biología molecular y, en concreto, el campo de la genómica y de la genética humana. En este sentido, las investigaciones tratan de buscar un gen candidato que se cree que tiene una influencia en la regulación de alguno de los fenotipos de la condición física. El grupo de investigación de la ULPGC “Rendimiento Humano, Ejercicio Físico y Salud” ha descrito con anterioridad la asociación de los diversos polimorfismos del gen del receptor de andrógenos (AR) en la composición corporal y condición física de hombres y mujeres adultos (Guadalupe-Grau et al., 2010b; Guadalupe-Grau et al., 2011; Ponce-Gonzalez et al., 2012). En consecuencia, y con el ánimo de completar estos estudios, la presente tesis se centra en identificar las posibles asociaciones de los diferentes polimorfismos del gen del receptor de andrógenos, como principal candidato a influenciar en el rendimiento físico y composición corporal en el crecimiento de los niños y niñas. 1.1. Tejido óseo 1.1.1. Características generales En los seres humanos, el desarrollo del esqueleto comienza en el periodo embrionario. Cuando el desarrollo fetal está completo, se han formado el esqueleto, los músculos, el tejido conjuntivo y el corazón a partir de la capa mesodérmica original embrionaria. La regulación del crecimiento del esqueleto en el niño está controlada por la hormona del crecimiento (GH) hasta la Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Ca naria Introducción 23 pubertad, momento en el cual la testosterona y los estrógenos desempeñan el papel más importante. Los huesos son los órganos del sistema esquelético, y el tejido óseo es el componente estructural de los huesos. Algunas de las funciones que les atribuimos a los huesos son la fijación para los músculos (función biomecánica), proteger los tejidos delicados tales como los órganos vitales y el sistema nervioso central (función protectora), actuar como reservas de calcio y fósforo (función metabólica), e incluso participar en la formación de glóbulos rojos (Ross, 2009). Los componentes básicos del hueso son la matriz ósea y los elementos estructurales celulares específicos, entre los que destacamos los siguientes: Osteoblastos: sintetizan osteoide e intervienen en la mineralización. La garantía de su abundancia depende en buena medida del factor de crecimiento epidérmico (EGF) que activa genes específicos (Figura 2). Osteoclastos: es el agente principal del recambio óseo (Figura 2). Esto le otorga una gran transcendencia, puesto que la mayoría de las enfermedades del esqueleto están ligadas a un exceso de actividad osteoclástica, que conduce a un incremento de la resorción ósea. Dentro de estas enfermedades destacamos la osteoporosis, la artritis reumatoide, la enfermedad de Paget o las metástasis óseas de los tumores malignos. Osteocitos: constituyen el 90% de la población celular del hueso, que se encuentra distribuida a lo largo del tejido. Se trata de células diferenciadas que proceden de los osteoblastos, una vez que estos quedan encastrados en la matriz ósea que ellos fabrican. Figura 2. Micrografía con osteoclastos y osteoblastos. Conceptos básicos. Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 24 1.1.2. Estructura del hueso durante el crecimiento Los huesos largos del esqueleto maduro tienen una estructura hueca cilíndrica que forma el cuerpo del hueso llamada diáfisis y dos extremos más anchos con una superficie articular recubierta de cartílago que recibe el nombre de epífisis. La porción de hueso que se encuentra entre la diáfisis y la epífisis se denomina metáfisis, y se define como la unión de la diáfisis con la placa de crecimiento (Young, 2008) (Figura 3). El crecimiento de los huesos largos tiene lugar en las placas de crecimiento epifisiario a través de un proceso continuo de formación de hueso endocondral. Una vez completo el crecimiento longitudinal, se fusionan las placas epifisiarias de los extremos de los huesos largos (Ljunggren, 2006; Young, 2008). 1.1.3. Proceso de remodelado óseo en el crecimiento El hueso es un tejido de origen conectivo, de carácter dinámico, que como se ha señalado anteriormente desempeña primordialmente una función de sostén y una labor metabólica. Ambas funciones son posibles gracias a un proceso continuo de recambio al que se ven expuestos los huesos, conocido como remodelado óseo (RO). Durante la niñez y la adolescencia hay un modelado constante del hueso que comprende el crecimiento longitudinal, transverso y por aposición. Es preciso señalar dos actividades celulares básicas, el depósito mineral y la reabsorción ósea. Ambas permiten los procesos de crecimiento y remodelado. El crecimiento del hueso endocondral se inicia en el segundo trimestre de la vida fetal y continúa después del nacimiento hasta el principio de la vida adulta (Ross, 2009). Figura 3 . Estru ctura del hueso largo. Anatomía de los huesos. www.sabelotodo.org Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Ca naria Introducción 25 El RO es una compleja secuencia de eventos celulares que tiene como función principal el “rejuvenecimiento de los huesos”. Por otro lado el RO desempeña un papel importante en el control de la homeostasis mineral, mediante la liberación de iones de calcio y fósforo al torrente sanguíneo. Cualquier desequilibrio en este balance resorción-formación conduce a una pérdida del tejido óseo si la resorción excede la formación (Young, 2008). El desarrollo del RO se lleva a cabo en múltiples unidades microscópicas bien delimitadas, dispersas por todo el esqueleto. En cada una de ellas, el hueso es destruido y después sustituido por otro recién formado. El conjunto de células que desarrollan este proceso en cada una de las localizaciones, constituye lo que llamamos “Unidades de Remodelación Ósea” (URO), (Roca, 2010). Este proceso que se produce a lo largo de toda la vida es controlado por una etapa permanente de reabsorción llevada a cabo por los osteoclastos y seguido por un perfecto equilibrio de formación realizado por los osteoblastos. El hueso renueva cada año el 25% del hueso trabecular y el 3% del hueso cortical. Mediante estas remodelaciones óseas se evita la aparición de lesiones por fatiga, manteniendo una estructura que permita la adaptación de las tensiones mecánicas (Castelo-Branco, 2009). En la fase de crecimiento y modelado, hay un desequilibrio entre la formación y la resorción de hueso. Durante este período, el esqueleto alcanza su forma y densidad finales (Maimoun & Sultan, 2011). A partir de los 20 a 30 años el recambio esquelético anual supone alrededor del 5 al 10% de la masa ósea total y hay un equilibrio entre la cantidad de hueso que se forma y que se reabsorbe. A continuación, a partir de los 30 a 40 años, la cantidad de hueso que se reabsorbe comienza a superar a la que se renueva (Ljunggren, 2006). El resultado es una disminución constante de la masa ósea en un pequeño porcentaje anual. El proceso de remodelado completo dura unos 10 años. Se calcula que en un adulto joven se ponen en marcha 3-4 millones de URO cada año (Castelo-Branco, 2009). Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 26 1.1.4. Efectos del ejercicio durante el crecimiento óseo. Los niños cada vez realizan menos actividad física y se ven atraídos por comportamientos sedentarios como ver la televisión, estando esto asociado con un mayor riesgo de poseer una baja “densidad mineral ósea” (DMO) (Vicente-Rodriguez et al., 2009; Gracia-Marco et al., 2012). Los efectos provocados por la práctica deportiva en la infancia apoyan la conjetura sobre la persistencia de la acumulación de masa ósea durante la edad adulta (Baxter-Jones et al., 2008). Alrededor de un 90% del total de los recursos óseos que se obtienen durante la etapa adulta han sido depositados hacia el final de la adolescencia (Glastre et al., 1990; Matkovic et al., 1990). El pico de masa ósea se alcanza alrededor de los 25-30 años, pero es en la adolescencia, la etapa más sensible, donde se aprecian las mayores ganancias en la masa ósea, especialmente entre los 11 y 14 años en el caso de las chicas y entre los 14 y 16 en el caso de los chicos, pudiendo alcanzar hasta un 51% del pico de masa ósea en este periodo de desarrollo puberal (Gordon et al., 1991; MacKelvie et al., 2002). Aquellas actividades físicas que conllevan especialmente cargas de alto impacto, realizadas antes de la maduración del esqueleto, tienen una gran influencia en el crecimiento de la masa ósea. La práctica de ejercicio físico desde edades tempranas está justificada no sólo a nivel de mejora de la salud general, sino también a nivel de salud ósea (Gunter et al., 2012). Por ello, para obtener el máximo beneficio derivado de la práctica deportiva es preciso que este se realice antes de que los niños/as hayan superado el estadio 23 de Tanner (Vicente-Rodriguez et al., 2003). Una masa ósea “máxima” elevada puede actuar como un “banco óseo” en una fase posterior de la vida y reducir el riesgo de fracturas y padecer osteoporosis (Ljunggren, 2006). Actualmente, se ha demostrado que en edades prepuberales los niños y niñas físicamente activos/as tienen mayor BMD en la columna lumbar y/o fémur que los niños y niñas de sus mismas características menos activos (Lehtonen-Veromaa et al., 2000; Lima et al., 2001; Vicente-Rodriguez et al., Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Ca naria Introducción 27 2003). La influencia sobre el efecto que tiene la práctica de actividad física sobre la masa ósea en niños y niñas en edades pre y postpuberales, ha sido bastante estudiada (Bradney et al., 1998; Calbet et al., 1998; Courteix et al., 1998; Flodgren et al., 1999; Andreoli et al., 2001; Bahouth et al., 2001; Calbet et al., 2001). El aumento de la masa magra es uno de los predictores más importantes para la acumulación de masa ósea durante el crecimiento prepuberal en la población (Vivanco-Munoz et al., 2012). El músculo esquelético es el principal componente de la masa magra, la participación en actividades deportivas podría tener no solo un efecto osteogénico directo, sino también una forma indirecta de aumentar la masa muscular y, con ellos, las tensiones generadas en los huesos durante los años pre púberes (Vicente-Rodriguez, 2006). Por tanto, la práctica deportiva tiene un efecto directo de ganancia de masa ósea, pero también indirecto a través del incremento de la masa magra debido al ejercicio (Vicente-Rodriguez et al., 2004; El Hage et al., 2009). 1.2. Tejido muscular 1.2.1. Características generales Los músculos esqueléticos son un tipo de músculos estriados unidos al esqueleto. Formados por células o fibras alargadas y multinucleadas que sitúan sus núcleos en la periferia. Obedecen a la organización de proteínas de actina y miosina que le confieren esa estriación que se ve perfectamente al microscopio. Son usados para facilitar el movimiento y mantener la unión hueso-articulación a través de su contracción. Son, generalmente, de contracción voluntaria (a través de inervación nerviosa), aunque pueden contraerse involuntariamente. El cuerpo humano está formado aproximadamente por un 90% de este tipo de músculo y un 1% de músculo cardíaco y 9% visceral. En el músculo esquelético humano existen dos tipos diferentes de fibras: de contracción rápida y de contracción lenta. La proporción de cada tipo de fibra en un determinado músculo probablemente es bastante constante a lo largo de la vida. Las fibras musculares de contracción rápida, que Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Introducción 34 Figura 5. Mecanismo de acción clásico o genómico del receptor de andrógenos. ARE, elementos de respuesta androgénica. Adaptado de (Heemers & Tindall, 2007). 1.6. Efectos del polimorfismo del receptor de andrógenos en el crecimiento El polimorfismo del receptor de andrógenos CAG y GGN parece jugar un papel importante en la masa magra y grasa en humanos adultos (Gustafson et al., 2003; Walsh et al., 2005; Stanworth et al., 2008; Nielsen et al., 2010; Ponce-Gonzalez et al., 2012). Sin embargo, poco se sabe acerca de la influencia del polimorfismo AR sobre la composición corporal en niños y su desarrollo puberal hasta la edad adulta. La pubertad es la primera fase de la adolescencia y de la juventud, normalmente se inicia a los 10 años en las niñas y a los 11 años en los niños y finaliza a los 14-15 años. En la pubertad se lleva a cabo el proceso de cambios físicos en el cual el cuerpo del niño o niña se convierte en adolescente, capaz de la reproducción sexual. El crecimiento se acelera en la primera mitad de la pubertad, y alcanza su desarrollo al final. Las diferencias corporales entre niños y niñas antes de Núcleo Testosterona Libre Citoplasma RECEPTOR DE ANDRÓGENOS: MECANISMO DE ACCIÓN CLÁSICO O GENÓMICO Genes diana mRNA Proteína AR ARE Núcleo Testosterona Libre Citoplasma RECEPTOR DE ANDRÓGENOS: MECANISMO DE ACCIÓN CLÁSICO O GENÓMICO Genes diana mRNA Proteína AR ARE Núcleo Testosterona Libre Citoplasma RECEPTOR DE ANDRÓGENOS: MECANISMO DE ACCIÓN CLÁSICO O GENÓMICO Genes diana mRNA Proteína AR ARE Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Ca naria Introducción 35 la pubertad son casi únicamente sus genitales. Los cambios más importantes en la composición corporal, incluyendo alteraciones en las proporciones relativas de agua, músculo, hueso y grasa corporal, acontecen durante la pubertad. Bajo la influencia de los esteroides gonadales y la GH, se produce un incremento en el contenido mineral óseo y en la masa muscular, y el depósito de grasa alcanza el momento de máxima expresión en su dimorfismo sexual. En términos generales, desde los 5 a los 10 años de edad, los varones tienen de 1 a 3 kg más de masa grasa que las niñas, pero ambos ganan masa grasa en proporciones similares (Ojeda et al., 2006). OBJETIVOS E HIPÓTESIS Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Objetivos 39 2. Objetivos 1. Determinar la influencia del polimorfismo (CAG)n del gen del receptor de andrógenos en las diferencias fenotípicas de la masa muscular y su distribución regional en niños de ambos sexos. 2. Evaluar si el polimorfismo (CAG)n del gen del receptor de andrógenos influye en la condición física en niños de ambos sexos. 3. Elucidar si el polimorfismo (CAG)n del gen del receptor de andrógenos influye en la masa ósea en niños de ambos sexos. 4. Establecer si el polimorfismo del AR CAG y GGN está asociado con los cambios de composición corporal de la adolescencia a la edad adulta (articulo III). 5. Determinar si el polimorfismo del AR se asocia a la capacidad máxima de oxidación de grasas en los hombres y como podría influir en la acumulación de masa grasa durante el crecimiento (articulo III). Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Hipótesis 40 3. Hipótesis 1. Determinados polimorfismos del gen que codifica el receptor de andrógenos se asocian a una mayor masa muscular en niños de ambos sexos. 2. Determinados polimorfismos del gen que codifica el receptor de andrógenos se asocian a una mayor condición física en niños de ambos sexos. 3. Determinados polimorfismos del gen que codifica el receptor de andrógenos se asocian a una mayor masa ósea en niños de ambos sexos. 4. Determinados polimorfismos del gen que codifica el receptor de andrógenos se asocian a niveles de grasa y masa grasa en edades tempranas. 5. Determinados polimorfismos del gen que codifica el receptor de andrógenos se asocian a cambios longitudinales desde la pubertad hasta la edad adulta. METODOLOGÍA Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Metodología 43 4. Metodología 4.1. Sujetos Todos los sujetos fueron instruidos para que no realizaran actividad física vigorosa, ni tomarán cafeína y/o derivados, bebidas energéticas, alcohol ni tabaco desde el día antes de los experimentos con test sensibles a estos factores como son la recogida de saliva, y test relacionados con medidas de gases ventilatorios y de tolerancia a la glucosa. Además, los sujetos debieron pasar una noche en ayunas previo a estos test, pudiendo comer una vez finalizados. Se midieron un total de 268 niños/as, 152 niños y 116 niñas de la población Gran Canaria con edades comprendidas entre los 7 y 13 años. El estado de desarrollo puberal se determinó mediante autoevaluación siguiendo el método Tanner (Tanner, 1962), que es un método de reconocida validez (Duke et al., 1980) y reproductibilidad (r =0.97) (Morris & Udry, 1980). Los valores medios de los parámetros edad, talla, peso corporal y porcentaje de grasa de los sujetos que participaron en cada estudio realizado se describen en la Tabla 1. Estudio I Un total de 152 niños y 116 niñas caucásicos participaron en este estudio. Fueron reclutados de diferentes clubes deportivos de Gran Canaria. Todos los sujetos y padres fueron informados de los beneficios y riesgos del estudio y firmaron un consentimiento antes de empezar el estudio. Los criterios de inclusión eran 1) que hicieran un mínimo 3h de actividad física a la semana, 2) que no tuvieran ninguna enfermedad crónica y 3) que no tomaran medicamentos. Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Metodología 44 Estudio II En este estudio participaron los mismos niños que en el estudio I, un total de 152 niños y 116 niñas caucásicos. Los participantes fueron reclutados de diferentes clubes deportivos de Gran Canaria. Todos los participantes y padres fueron informados de los beneficios y riesgos del estudio y firmaban un consentimiento antes de empezar el estudio. Los criterios de inclusión fueron los mismos que en el estudio I. Estudio III Inicialmente partimos con un total de 129 niños de Gran Canaria pertenecientes a estudios previos del grupo de investigación Rendimiento Humano, Ejercicio Físico y Salud, de los cuales se obtuvieron datos longitudinales de 45 sujetos. El primer reclutamiento comenzó en Febrero de 1998 y la segunda medición se obtuvo en Enero de 2013. Los criterios de inclusión fueron 1) que no tuvieran ningún tipo de enfermedad crónica, 2) que no tomaran medicamentos y 3) que no fueran fumadores. Tabla1. Características de los sujetos. Estudio I y II Estudio III Niños Niñas pre post n=152 n=116 n=45 n=45 Edad (años) 11.5 ± 2.6 10.1 ± 3.2 12.8 ± 3.6 26.6 ± 4.0 Talla (cm) 147.9 ± 14.8 138.4 ± 15.9 155.1 ± 17.6 179 ± 7.2 Peso (kg) 41.7 ± 13.1 36.4 ± 12.6 49.5 ± 16.6 81.3 ± 17.6 Grasa corporal (%) 21.1 ± 8.7 27.2 ± 8.5 22.1 ± 10.5 20.8 ± 9.9 Datos representados como Media ± SD. * (P<0.05). Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Metodología 45 4.2. Composición corporal 4.2.1. Antropometría. Para la determinación de las medidas antropométricas se utilizó el protocolo “O-Scale System” (Ward et al. 1989). La talla se midió en bipedestación con los talones, los glúteos, la espalda y la región occipital en contacto con el plano del tallímetro. Estas medidas se efectuaron mediante un tallímetro de 1mm de precisión (Atlántida, Añó Sayol, Barcelona, España), manteniendo la cabeza en el plano de Francfort. La masa corporal se midió mediante una báscula (Atlántida, Añó Sayol, Barcelona, España) de 50 g de precisión, calibrada a 50.0, 70.0 ó 90.0 Kg, mediante masas patrón de la clase M1. Todos los pliegues cutáneos se midieron mediante un plicómetro Holtain, que ejerce una presión constante de 10 g·mm -2 y tiene una precisión de 0.1mm. Cada pliegue se determinó por triplicado, eligiendo el valor medio de las tres mediciones. Aquellas mediciones que se apartaron 2 o más desviaciones estándar de la media fueron descartadas y nuevamente repetidas. Las lecturas del grosor de los pliegues se efectuaron hacia el cuarto segundo de la aplicación del plicómetro, para reducir la variabilidad asociada a las diferencias de comprensibilidad cutánea. Todos los perímetros fueron medidos 3 veces con una cinta métrica inextensible de 1mm de precisión. Como valor correspondiente a cada perímetro se tomó la media de las 3 mediciones efectuadas. Cuando alguna se apartó 2 o más desviaciones estándar de la media, ésta fue descartada y repetida. 4.2.2. Absorciometría fotónica dual de rayos x La composición corporal de los sujetos se analizó mediante absorciometría fotónica de rayos X (DXA) (Hologic QDR-1500, Hologic, software versión 7.10, Waltham, MA), tal como se describe en numerosos trabajos publicados por nuestro grupo de investigación (Ara et al., 2004); (Guadalupe-Grau et al., 2010a). Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Metodología 46 4.3. Condición física 4.3.1. Capacidad de salto Las fuerzas generadas durante el salto vertical se midieron mediante una plataforma de fuerza (Kistler, Winterthur, Suiza). Cada sujeto realizó dos tipos diferentes de saltos verticales máximos en los que se eliminó la contribución de los brazos: 1) Squat jump (SJ): Es un tipo de salto en el que hay que saltar desde una posición de salida con las piernas flexionadas, la rodilla a 90º, y durante el cual no se puede realizar contramovimiento previo. Un goniómetro digital (Lafayette Instrument Company, Lafayette, IN) fue utilizado para verificar la flexión de rodilla a 90º antes de realizar el SJ. 2) Salto con contramovimiento (CMJ): Es un tipo de salto en el que se parte de la posición de pie y se realiza un contramovimiento flexionando rápidamente las rodillas hasta unos 90º para conseguir impulso previo. A partir de los datos recogidos con la plataforma de fuerza se determinó la altura de vuelo (VJH), la fuerza máxima (Fp), siendo Fp = fuerza máxima – masa corporal, la potencia media (MP), el impulso mecánico positivo (PI) y la velocidad de desarrollo de fuerza (RFD) entre otras variables. Para ambos tipos de salto se empleó el mejor de tres intentos. La RFD media fue calculada a través de regresión lineal mediante la relación de la fuerza-tiempo durante la fase de impulso en el SJ y CMJ entre el 25 y 75% del pico de fuerza. 4.3.2. Capacidad anaeróbica Para estimar la capacidad anaeróbica se utilizó un test de carrera de 300m. Este test fue elegido debido a que la capacidad anaeróbica es el principal determinante del rendimiento en esfuerzos máximos que llevan al agotamiento entre 30 y 60s (Calbet et al., 1997). El test se realizó en una pista de atletismo de 400m y se midieron los tiempos mediante un cronómetro. A todos los sujetos se les pidió que corrieran los 300m tan rápido Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Resultados 54 media en el test de 30m y 300m, así como la altura de los saltos SJ y CMJ fueron similares en ambos grupos y sexos. Sin embargo, en las niñas el grupo GGN L mostraron unos valores mayores de VO 2 max comparado con el grupo GGN S (48.6 ± 6.0 vs 45.4 ± 4.4 ml·kg -1 ·min -1 ) respectivamente (P<0.05, Tabla 3, incorporada en anexo artículo 1). 5.2. Resumen de los resultados del artículo II (En revisión) Androgen receptor CAG and GGN repeat polymorphisms and bone mass in boys and girls. En los niños se observaron 16 alelos del polimorfismo CAG (rango de 13 a 33 repeticiones) y 12 alelos del polimorfismo GGN, con un rango de 14 a 33 repeticiones. En las niñas existían 11 alelos diferentes del polimorfismo CAG (rango de 14 a 35 repeticiones) y 9 alelos del polimorfismo GGN, con un rango de 13 a 24 repeticiones. La composición corporal de los niños y niñas, los datos antropométricos, la masa ósea total y regional se reportan en la Tabla 1(incorporada en anexo artículo 2). En general los niños eran más altos, más pesados y tenían mayor peso corporal, BMD y BMC que las niñas (P<0.05, Tabla 1, incorporada en anexo artículo 2). Efectos del polimorfismo CAG del AR en la composición corporal El grupo CAG L de los niños mostró una mayor talla, masa corporal, densidad mineral ósea en el cuerpo entero (BMD), contenido mineral óseo en el cuerpo entero (BMC), en las extremidades superiores (BMC), en las extremidades inferiores (BMC), en el cuello femoral (BMD), triangulo de Ward´s (BMC), triangulo de Ward´s (BMD) y en la espina lumbar que los niños del grupo CAG S (P<0.05, Tabla 2, incorporada en anexo artículo 2). No hubo diferencias significativas en las niñas entre los grupos CAG S y CAG L (Tabla 2, incorporada en anexo artículo 2). Después de ajustar por las variables confusoras (edad, talla, peso, porcentaje de grasa, Tanner H, Tanner G), no se apreciaron diferencias significativas en ninguna región medida en relación al CAG S y CAG L en niños ni en niñas. Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Resul tados 55 Efectos del polimorfismo GGN del AR en la composición corporal Los niños que poseían un polimorfismo GGN L tenían una mayor densidad mineral ósea en las extremidades superiores que aquellos con un GGN S . Estas diferencias se mantuvieron significativas después de ajustar por las variables confusoras (edad, talla, peso, porcentaje de grasa, Tanner H, Tanner G) (P<0.05). Las niñas clasificadas tanto en el grupo GGN S o GGN L no mostraron ninguna diferencia en cualquiera de las mediciones. Correlaciones Las correlaciones de Spearman ajustadas mostraron una asociación positiva entre el número de repeticiones CAG, el BMD de las extremidades inferiores y el BMC del triangulo de Ward´s en niños (r=0.16 and 0.14 respectivamente, P<0.05), y una asociación negativa entre el BMC del triángulo de Ward, BMD y la longitud de repeticiones del GGN en niños (r = -0.18 y 0.17, respectivamente, p < 0.05). 5.3. Resumen de los resultados del artículo III (En revisión) Androgen receptor gene CAG and GGN repeat polymorphism influence fat accumulation: a longitudinal study from adolescence to adult age. Polimorfismo CAG del AR, composición corporal y VO 2 max al inicio del estudio. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en la edad, peso, talla, masa corporal magra ni en la aptitud cardiorrespiratoria (VO 2 max) entre los grupos CAG S y CAG L (Tabla 1, incorporada en anexo artículo 3). Sin embargo, el BMI, el porcentaje de grasa corporal, el cuerpo entero y la masa grasa del tronco fueron menores en el CAG S comparado con el grupo del CAG L . (P=0.04, P=0.03, P=0.03 y P=0.05, respectivamente) (Figura 2a), incluso teniendo en cuenta el estado puberal (P=0.002, P=0.05, P=0.01, P=0.02; respectivamente), la edad (P=0.003, P=0.07, P=0.01 y P=0.03, respectivamente), o ambos como covariables (P=0.002, P=0.05, P=0.01, P=0.02; respectivamente) (Tabla 1, incorporada en anexo artículo 3). Estas diferen- Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Resultados 56 cias se mantuvieron estadísticamente diferentes después de considerar el VO 2 max (ml/kg de peso corporal/min), la edad y el estadio del Tanner (P=0.004, P=0.08, P=0.02 y P=0.04, respectivamente. El grupo CAG S , en comparación con el grupo CAG L poseía una mayor masa total corporal magra, y masa magra en las extremidades inferiores y superiores después de considerar el estadio del Tanner (todos P<0.05), edad (todos P<0.05), estadio de Tanner y la edad (todos P=0.01) o VO 2 max (L/min) mostraron una tendencia a ser mayor en CAG L comparado con el CAG S después de considerar la etapa de Tanner (P=0.07), la edad (P=0.13), o ambos como covariables (P=0.08). Polimorfismo GGN del AR, composición corporal y VO 2 max al inicio del estudio. No se observaron diferencias significativas entre los grupos GGN S y GGN L en la edad, la masa corporal, la talla, la composición corporal y el VO 2 max (Tabla 2, incorporada en anexo artículo 3). Sin embargo, el porcentaje de grasa corporal, la masa corporal y la grasa del tronco fueron menores en GGN S en comparación con el grupo GGN L después de considerar la etapa del Tanner y el VO 2 max (ml/kg de peso corporal/min) (todos P<0.05). No se observaron diferencias significativas en la masa magra entre grupos GGN incluso después de considerar el estadio del Tanner, la edad o el VO 2 max. Tampoco hubo una diferencia en el VO 2 max entre grupos GGN, incluso teniendo en cuenta el estadio de Tanner, la edad, la masa magra total o la masa magra de las extremidades inferiores. Polimorfismo CAG del AR en la edad adulta y cambios longitudinales en la composición corporal. No se observaron diferencias significativas entre los grupos CAG S y CAG L en la edad, la talla, el gasto diario de energía y el tiempo transcurrido entre las dos medidas. Sin embargo, el grupo CAG L acumuló 11.4 ± 2.0 kg más de masa corporal total y 2.3 ± 3.4 kg de grasa corporal total que el grupo CAG S durante los 13.7 ± 0.6 años de seguimiento (P=0.04 y P=0.03, respectivamen- Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Resul tados 57 te). Por otra parte, el grupo CAG L mostró una mayor masa corporal, BMI, masa grasa del cuerpo entero y del tronco en comparación con CAG S (P=0.001, P=0.001, P=0.05 y P=0.04, respectivamente), incluso teniendo en cuenta la edad (P=0.001, P=0.001, P=0.04 y P=0.06, respectivamente), por el gasto total de energía (P=0.002 , P=0.001, P=0.04 y P=0.03, respectivamente), el VO 2 max (ml/kg de masa corporal/min) ( todos P<0.001 ), MFO por kg de masa magra total (P=0.003 , P=0.002 , P=0.06 y P=0.04, respectivamente) o para todas las covariables conjuntamente (todos P< 0.01). No hubo diferencias significativas en el porcentaje de grasa corporal entre los grupos (P=0.25), incluso teniendo en cuenta la edad (P=0.29), el gasto energético total (P=0.20), o el MFO por kg de masa magra total (P=0.27). Sin embargo, después de ajustar por el VO 2 max (ml/kg de peso corporal/min), el porcentaje de grasa corporal fue de un 27% mayor en CAG L en comparación con el CAG S (P=0.03). Por otra parte, el CAG L también mostró mayor masa magra en las extremidades inferiores (15%) y de las extremidades superiores (22%), así como una mayor masa magra total corporal (16%) en comparación con el CAG S (todos, P<0.01), incluso después de considerar como covariable la edad (todos, P<0.01), el gasto energético total (todos, P<0.01), VO 2 max (ml/kg de masa corporal/min) (todos, P<0.01), o para todas las covariables conjuntamente (todos, P<0.01). A su vez, el grupo CAG L acumuló 5.8 g/día más de masa magra total en comparación con CAG S (4.1 g/día) durante el tiempo de seguimiento (P=0.02). El grupo CAG L mostró un 9% mayor de masa magra en las extremidades inferiores que el CAG S (P=0.048), pero esta diferencia se perdió después de considerar la edad (P=0.06). La MFO (valores absolutos), MFO por kg de la masa magra de las extremidades inferiores y MFO por kg de la masa magra total fueron mayores en el CAG L que en el grupo CAG S (P=0.01, P=0.09, y P=0.12, respectivamente, incluso después de considerar la edad (P=0.01, P=0.09, y P=0.12, respectivamente), el VO 2 max (P=0.02, P=0.12, y P=0.16, respectivamente), o ambas covariables conjuntamente (P=0.01, P=0.12, y P=0.16, respectivamente). El RMR fue un 15% mayor en el CAG L que en el Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Resultados 58 grupo CAG S (P=0.03). Esta diferencia desapareció después de considerar la edad (P=0.06), la masa magra total (P=0.30) o para ambas conjuntamente (P=0.98). Polimorfismo GGN del AR en la edad adulta y cambios longitudinales en la composición corporal. No existieron diferencias significativas en la edad, la talla, el gasto diario de energía y el tiempo transcurrido entre las dos mediciones observadas entre los grupos GGN S y GGN L . Ambos grupos del GGN tenían similar composición corporal, incluso después de considerar la edad, el gasto energético total, el VO 2 max, (ml.kg de masa corporal -1 .min -1 ) o MFO por kg de masa magra total. Sin embargo, el GGN L tenía un porcentaje mayor de masa grasa de todo el cuerpo y masa grasa del tronco que el grupo GGN S después de considerar el VO 2 max (ml.kg de masa corporal -1 .min -1 ) y MFO por kg de masa magra total conjuntamente (todo P<0.05). Los sujetos del grupo GGN S y los sujetos con un GGN L acumularon un 6.4 ± 8.3 y 7.6 ± 10.8 kg de grasa en todo el cuerpo 13.7 ± 0.6 en los años de seguimiento respectivamente. Esta diferencia en la acumulación de masa grasa no fue estadísticamente significativa (P=0.67), incluso después de considerar la edad inicial, cambios en el VO 2 max, la talla corporal, la masa inicial de grasa corporal, la oxidación de grasas basal y el MFO como covariables. . DISCUSIÓN Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Discusión 61 6. Discusión Estudio I: Androgen receptor CAG and GGN repeat polymorphisms are associated with performance in boys and girls. (En revisión). Este estudio demostró que los niños prepúberes con un alelo CAG S tenían un rendimiento en el test de 300m un 5.5% superior a aquellos que poseían un CAG L , indicando que un genotipo CAG S podría ser asociado con un incremento de la capacidad anaeróbica. Este estudio también demuestra que un genotipo GGN largo está asociado con un mejor VO 2 max en niñas prepúberes. Estos resultados contrastan con los obtenidos en estudios realizados por nuestro laboratorio y por otros autores, en los que no se observa asociación entre las repeticiones CAG y GGN y la composición corporal y condición física en 282 hombres jóvenes (Guadalupe-Grau et al., 2011), y masa muscular en 677 en hombres respectivamente (De Naeyer et al., 2014). Se ha demostrado que un número de repeticiones cortas del polimorfismo CAG y GGN está asociado con una mayor actividad androgénica (Chamberlain et al., 1994; Ding et al., 2005; Perez-Gomez et al., 2008). Esto podría facilitar una mayor adquisición de masa muscular durante el crecimiento en humanos. Durante el crecimiento el eje gonadal hipotalámico pituitario está relativamente silenciado y las gónadas sólo producen una cantidad pequeña de andrógenos. En este entorno de baja biodisponibilidad de andrógenos los individuos que posean cualquiera de las repeticiones polimórficas, bien CAG o GGN cortos podrían beneficiarse de una señalización androgénica más eficiente, estimulando una mayor adquisición de masa muscular en comparación con sus contrapartes que tengan el alelo más largo. De acuerdo con esta hipótesis, la presente investigación muestra que los niños que poseen un número de repeticiones CAG≤21, desarrollaron una velocidad un 5.5% mayor en el test de carrera de 300m que los que tenían un CAG>21. El rendimiento en el test de 300m, depende de la masa muscular, del VO 2 max y de la capacidad anaeróbica (Perez-Gomez et al., 2008). Como nosotros no encontramos diferencias ni en la masa muscular ni en el VO 2 max Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Discusión 62 entre el grupo CAG corto y largo, la explicación más probable para las diferencias en el rendimiento es una mayor capacidad anaeróbica asociada con el fenotipo CAG S . Esto concuerda bien con la mayor capacidad anaeróbica de los hombres en comparación con las mujeres, en parte debido a su mayor capacidad glucolítica muscular (Komi & Karlsson, 1978; Green et al., 1984). Esto puede ser debido también en parte a la expresión aumentada de fibras musculares de tipo II con aumento de la sensibilidad de andrógenos. De hecho, algunos estudios sugieren que los hombres poseen mayor proporción de fibras tipo II en el músculo vasto lateral que las mujeres (Steffensen et al., 2002; Guadalupe-Grau et al., 2009). Voorhoeve y colaboradores investigaron la relación entre la repetición polimórfica CAG del receptor de andrógenos (AR) y el crecimiento longitudinal desde la pre pubertad hasta la edad adulta joven (Voorhoeve et al., 2011). En este estudio, se encontró que la desviación estándar de la talla estaba asociada inversamente con la longitud del número de repeticiones CAG en niños prepuberales y púberes. Esta asociación disminuye en los años siguientes y desaparece por completo después de la edad de 16 años. En concordancia, la presente investigación no encontró ninguna diferencia en la longitud del número de repeticiones CAG S y CAG L en nuestros niños de mayor edad. Voorhoeve y col no encontraron ninguna asociación entre la longitud del CAG y las variables de composición corporal (Voorhoeve et al., 2011). Sin embargo, la condición física no fue evaluada en esta investigación (Voorhoeve et al., 2011). La influencia de las repeticiones polimórficas GGN del AR en la composición corporal o en el rendimiento no ha sido estudiada en niños y los datos en adultos son escasos (Guadalupe-Grau et al., 2010b; Guadalupe-Grau et al., 2011; Ponce-Gonzalez et al., 2012). Los estudios existentes han informado de la falta de asociación entre la longitud de repeticiones del GGN con la condición física (Guadalupe-Grau et al., 2010b; Guadalupe-Grau et al., 2011; Ponce-Gonzalez et al., 2012) y la composición corporal (Guadalupe-Grau et al., 2010b; Guadalupe-Grau et al., 2011; Ponce-Gonzalez et al., 2012; De Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Discusión 63 Naeyer et al., 2014). En las niñas, nosotros hemos observado una mayor capacidad aeróbica (VO 2 max) en el grupo GGN L . Dado que esta diferencia estaba presente después de considerar las diferencias en la composición corporal, parece razonable suponer que el polimorfismo de repetición GGN puede influir en el sistema de transporte y/o de utilización de oxígeno. Durante el ejercicio del cuerpo entero el VO 2 max depende en mayor medida de la difusión de O 2 y en menor medida de la extracción de O 2 por los músculos (Saltin & Strange, 1992; Saltin & Calbet, 2006). La asociación entre la longitud de repetición GGN y el VO 2 max podrían deberse a una mayor capacidad de transporte de oxígeno en el grupo GGN L , lo que podría explicarse por una mayor capacidad de bombeo del corazón o del aumento arterial del contenido de O 2 por un aumento en la concentración de hemoglobina o un intercambio pulmonar de gases más eficiente. Sin embargo, los parámetros hematológicos no han sido asociados a los polimorfismos del AR (van der Harst et al., 2012; Li et al., 2013). El corazón expresa tanto receptores de andrógenos como de estrógenos y es funcionalmente sensible a los esteroides sexuales circulantes. Aunque la testosterona puede facilitar la hipertrofia cardiaca (Marsh et al., 1998; Basualto-Alarcon et al., 2013) ninguna asociación se ha informado hasta ahora entre la capacidad de bombeo del corazón y la cantidad o actividad de los andrógenos. Por otra parte, la longitud de repeticiones polimórficas del GGN está asociada lineal e inversamente con el contenido de proteína del AR en cultivos celulares (Ding et al., 2005). Debido a la interacción de esteroides sexuales en el corazón, un GGN L podría traducirse en un manejo más eficiente del calcio, lo que podría favorecer una mayor capacidad de bombeo del corazón (Bell et al., 2013). Sin embargo, esto último requiere pruebas específicas que no son posibles de realizar en niños, debido a la necesidad de la utilización de catéteres para obtener valores precisos de gasto cardiaco durante el ejercicio. Finalmente, otro mecanismo por el que un polimorfismo GGN L podría influir en el VO 2 max es por favorecer una mayor expresión de las fibras tipo I. Una mayor acción androgénica se asocia con una mayor expresión de fibras de tipo IIa, como se muestra por la mayor área de sección transversal y proporción de fibras tipo IIa en los hombres Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Discusión 64 que en las mujeres (Staron et al., 2000). Las fibras musculares tipo I tienen mayor capacidad oxidativa en comparación con las tipo IIa y IIx (Shortreed et al., 2009; Jiang et al., 2010), por lo que un fenotipo muscular con fibras tipo I predominantes, favorecerían una mayor extracción muscular de O 2 y por lo tanto el VO 2 max (Calbet et al., 2005). De acuerdo con esta explicación estudios basados en necropsias han demostrado en los niños un aumento progresivo en la proporción de fibras tipo II con la maduración (Lexell et al., 1992), esto es debido al aumento de los niveles de testosterona. En resumen, los polimorfismos de repetición del receptor de andrógenos CAG y GGN están asociados con la capacidad de ejercicio en niños. En los varones un genotipo CAG más corto se asocia con un mayor rendimiento en el sprint prolongado, probablemente mediado por una capacidad anaeróbica mejorada. En niñas un GGN largo de repeticiones polimórficas está asociado con un aumento del VO 2 max, después de considerar el tamaño del cuerpo. Se requieren más estudios con un enfoque mecanicista para determinar los mecanismos por los cuales una repetición polimórfica del GGN largo podría favorecer un mayor VO 2 max en las niñas. Estudio II: Androgen receptor CAG and GGN repeat polymorphisms and bone mass in boys and girls. (En revisión). En contraste con nuestra hipótesis, el principal resultado de este estudio muestra que los niños clasificados como GGN largo, después de ajustar por posibles factores de confusión como la altura, el peso y estado puberal, muestran una mayor masa ósea en las extremidades superiores que aquellos que tienen un polimorfismo GGN corto. Además, ni la longitud del polimorfismo CAG ni GGN parecen tener una influencia sobre la masa ósea y la densidad mineral ósea en niñas prepúberes. La longitud del CAG largo ha sido asociada con un aumento del BMC y BMD (Kannus et al., 1995; Simm et al., 2008; Guadalupe-Grau et al., 2010b), en el presente estudio los niños con un CAG largo, tenían un promedio más alto de los valores en las siguientes variables: estatura, peso, contenido mi- CONCLUSIONES (CONCLUSIONS) Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Conclusiones 73 7. Conclusiones Las investigaciones realizadas sobre los polimorfismos del gen del receptor de andrógenos incluidos en esta tesis permiten explicar parte de la variabilidad de variables de composición corporal como son la cantidad de masa muscular, masa grasa (y su acumulación), masa ósea así como el rendimiento físico en niños y niñas en crecimiento. Estos conocimientos son de gran interés en Medicina y en las Ciencias del Deporte, especialmente para diseñar estrategias terapéuticas para tratar enfermedades y procesos que cursan con pérdida de masa muscular y ósea durante el crecimiento, así como para tener en cuenta la influencia de ciertos polimorfismos del receptor de andrógenos en la acumulación de grasa con los años y en la capacidad de oxidación de grasas. Las principales conclusiones alcanzadas con los estudios integrados en esta tesis doctoral son por tanto las siguientes: 1) Los polimorfismos CAG cortos del gen del receptor de andrógenos están relacionados con una mayor capacidad anaeróbica en niños prepúberes físicamente activos. 2) Los polimorfismos GGN largos del gen del receptor de andrógenos están relacionados con una mayor capacidad aeróbica en niñas prepúberes físicamente activas. 3) Los alelos largos de los polimorfismos de repetición CAG y GGN del receptor de andrógenos están asociados con una mayor masa ósea en niños prepúberes. 4) No existe relación aparente entre la masa ósea y los polimorfismos de repetición CAG y GGN del receptor de andrógenos en niñas prepúberes. Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Conclusiones 74 5) Los polimorfismos de repetición cortos del receptor de andrógenos CAG y GGN determinan una menor cantidad y distribución regional de masa grasa en varones adolescentes. 6) El polimorfismo CAG del gen del receptor de andrógenos influencia la acumulación de la masa grasa a lo largo de los años desde la niñez hasta la edad adulta en varones. 7) Los polimorfismos de repetición cortos del receptor de andrógenos influyen en la capacidad máxima para oxidar grasas en varones adultos. Lorena Rodríguez García Universidad de Las Palmas de Gran Canaria Conclusions 75 Conclusions The research about the androgen receptor gene polymorphisms included in this thesis offers new explanations on the variability body composition variables and physical fitness of children during growth. It also partially explains the variability on fat mass accumulation. The main conclusions are:: 1) A short CAG androgen receptor gene polymorphism seem to be associated with greater anaerobic capacity in physically active prepubescent children 2) A long GGN androgen receptor gene polymorphism seem to be associated with a greater aerobic capacity in physically active prepubescent girls. 3) A long allele of CAG and GGN repeat polymorphisms is associated with greater bone mass in physically active prepubescent boys. 4) There is no apparent relationship between bone mass and CAG and GGN repeat polymorphisms in prepubescent girls. 5) Short CAG and GGN repeat polymorphisms is associated with lower accumulation of total and regional fat mass in male adolescent. 6) The CAG androgen receptor gene polymorphism seems to have an influence on the accumulation of fat mass from childhood to adult life in boys. 7) Short androgen receptor gene repeat polymorphisms seem to have an influence on maximal fat oxidation capacity in adult males. 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Journal: British Journal of Sports Medicine Manuscript ID: Draft Article Type: Original Article Date Submitted by the Author: n/a Complete List of Authors: Rodríguez-García, Lorena; University of Las Palmas de Gran Canaria, Physical Education; University of Las Palmas de Gran Canaria, Research Institute of Biomedical and Health Sciences Ponce-Gonzalez, Jesus Gustavo; University of Las Palmas de Gran Canaria, Department of Physical Education; University of Las Palmas de Gran Canaria, Research Institute of Biomedical and Health Sciences González-Henriquez, Juan J; University of Las Palmas de Gran Canaria, Research Institute of Biomedical and Health Sciences; University of Las Palmas de Gran Canaria, Department of Mathematics Rodríguez-González, Francisco G.; University of Las Palmas de Gran Canaria, Department of Biochemistry and Physiology; Canary Islands Cancer Research Institute (ICIC), Díaz-Chico, Bonifacio N; University of Las Palmas de Gran Canaria, Department of Biochemistry and Physiology; Canary Islands Cancer Research Institute (ICIC), Calbet, Jose Antonio; University of Las Palmas de Gran Canaria, Department of Physical Education; University of Las Palmas de Gran Canaria, Research Institute of Biomedical and Health Sciences Dorado, Cecilia; University of Las Palmas de Gran Canaria, Physical Education; University of Las Palmas de Gran Canaria, Research Institute of Biomedical and Health Sciences Guadalupe-Grau, Amelia; University of Las Palmas de Gran Canaria, Physical Education https://mc.manuscriptcentral.com/bjsm British Journal of Sports Medicine Confidential: For Review Only Androgen receptor CAG and GGN repeat polymorphisms are associated with performance in boys and girls. Lorena Rodríguez-García1-2, Jesús G. Ponce-González1-2, Juan J González-Henriquez2-3, Francisco G. Rodríguez-González4-5, Bonifacio N Díaz-Chico4-5, Jose A L Calbet1-2, Cecilia Dorado1-2, Amelia Guadalupe-Grau1. 1 Department of Physical Education, University of Las Palmas de Gran Canaria, Campus Universitario de Tafira s/n, Las Palmas de Gran Canaria, 35017, Spain 2 Research Institute of Biomedical and Health Sciences, University of Las Palmas de Gran Canaria, Las Palmas de Gran Canaria, Spain 3 Department of Mathematics, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Spain 4 Department of Biochemistry and Physiology, Universidad de Las Palmas de Gran Canaria, Spain 5 Canary Islands Cancer Research Institute (ICIC), Las Palmas de Gran Canaria, Canary Islands, Spain Running title: “Androgen receptor and performance in children” Keywords: Muscle, strength, androgen receptor polymorphisms, fitness, pre and pubertal growth. Word count: 2936. Correspondence to: Amelia Guadalupe-Grau, PhD. Department of Physical Education, Faculty of Sport Sciences, University of Las Palmas de Gran Canaria, Spain. Address: Campus Universitario de Tafira s/n, Las Palmas de Gran Canaria, 35017, Spain Phone: 0034--911349218 e-mail: [email protected] Page 1 of 24 https://mc.manuscriptcentral.com/bjsm British Journal of Sports Medicine 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Confidential: For Review Only Abstract 1 Background. The androgen receptor gene (AR) contains two polymorphic trinucleotide 2 microsatellites in exon 1 due to repetitions of the glutamine codon (CAG) and the 3 glycine codon (GGN). Shorter CAG and GGN repeat polymorphism is associated with 4 stronger androgen signaling, and therefore, could influence lean mass and exercise 5 performance during growth. Methods. Physical fitness was measured by standardized 6 procedures and the length of CAG and GGN repeats was determined by PCR and 7 fragment analysis in 152 boys (11.5 ± 2.6 years; Tanner ≤ 5) and 116 girls (10.1± 3.2 8 years; Tanner ≤ 5). Body composition was assessed by dual energy x-ray 9 absorptiometry (DXA). Individuals were grouped as CAG short (CAGS) if harboring 10 repeat lengths of ≤21 and CAG long (CAGL) if CAG >21. Moreover, subjects were 11 grouped as GGN short (GGNS) if harboring repeat lengths of ≤23 and GGN long 12 (GGNL) if GGN >23. Results. No significant differences in age, height, body mass, and 13 body composition were observed between either CAGS and CAGL groups and GGNS 14 and GGNL groups. Boys harboring CAGS completed the 300m test faster than their 15 CAGL counterparts. Moreover, girls from the GGNL group showed a significant higher 16 VO2max than those in the GGNS group. These differences were maintained after 17 correcting by age, body mass, tanner stage and height. Conclusions. The length of CAG 18 repeat of the AR gene is associated to anaerobic performance in boys, whereas the 19 length of GGN of the AR gene is associated to aerobic capacity in girls. 20 Page 2 of 24 https://mc.manuscriptcentral.com/bjsm British Journal of Sports Medicine 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Confidential: For Review Only Introduction 21 The androgen receptor (AR), also known as NRC4 (nuclear receptor subfamily 3, group 22 C, member 4), is a type of nuclear receptor activated by transmembrane binding to 23 androgenic hormones such as testosterone or dihydrotestosterone 1. The AR gene is 24 located on the long arm of chromosome X (Xq 11-12) 2. This gene consists of 8 exons 25 and encodes a protein having 919 amino acid residues. The exon 1 of this gene has two 26 polymorphic repeats motives (CAG and GGN), which encode polyglutamine and 27 polyglycine respectively, of variable lengths at the N-terminal (transactivation domain) 28 of AR protein 3. Several studies have shown high expression of ARs in skeletal muscle 29 tissue 4, 5 this being even higher in response to muscle overload 6. 30 The CAG repeat varies in length or number of repetitions between 8 and 35, 31 with an average of 22. The GGN, which is a complex repeat, is represented as 32 (GGT3GGG1GGT2GGC)n and ranges from 10 to 30 repetitions 3. The length of CAG 33 repeat polymorphism and AR transactivation potential are inversely correlated 7, 8. 34 Although GGN polymorphism has been less studied than CAG polymorphism, a short 35 GGN is associated with more androgenic activity in cell cultures 9. 36 Consequently, a greater androgenic effect is expected for AR with lower CAG 37 and GGN repeat number. In agreement, lower number of CAG repeat polymorphisms 38 has been linked to greater fat-free mass in healthy elders 10. However, in 282 physically 39 active young men no relationship between physical fitness, muscle mass, levels of free 40 testosterone, osteocalcin and the length of the CAG repeat number has been reported 11, 41 12. 42 In contrast to adults, little is known about the potential effect of AR CAG and 43 GGN repeat polymorphisms in the development of physical fitness during growth. 44 Page 3 of 24 https://mc.manuscriptcentral.com/bjsm British Journal of Sports Medicine 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Confidential: For Review Only 4 Several traits influencing fitness in children may be modulated by androgens, and 45 therefore, by an enhanced androgen transductional activity facilitated by shorter CAG or 46 GGN AR polymorphisms. For example, free androgen index levels in prepubertal and 47 early pubertal boys engaged in systematic resistance training are shown to be higher 48 than their aerobic training and sedentary counterparts, evidencing the significant effect 49 of a specific training stimulus in this hormone-sensitive phase of maturation 13. Such 50 associations have not been observed in girls, mainly due to the fact that testosterone is 51 thought not to be the main determinant of muscle growth in girls, even at the pubertal 52 stage 14. 53 However, the potential benefit of an enhanced androgen signaling in girls during 54 the prepubertal stage is still largely unknown. Some authors suggest that there is a 55 progressive increase in the exposure of peripheral tissues to testosterone, given by the 56 raise in the systemic testosterone levels from 4 to 7 years old 15. This increment might 57 play a role in the muscle mass development of girls before the onset of puberty, and 58 might be enhanced by shorter CAG AR polymorphisms.59 Although less studied, endurance capacity may be also enhanced by the action of 60 androgens. Human lungs express AR 16 and studies performed in mammal lung showed 61 that androgen treatment increases expression of genes involved in oxygen transport, 62 such as those encoding hemoglobin, oxygen binding, heme binding and iron ion 63 binding, therefore suggesting a potential role of enhanced AR signaling and aerobic 64 fitness 17. Although no differences have been observed in respect to aerobic fitness 65 among prepubertal boys and girls 18, genetic determinants that could influence the 66 oxygen transport system via an enhanced androgenic environment remain unexplored. 67 Page 4 of 24 https://mc.manuscriptcentral.com/bjsm British Journal of Sports Medicine 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Confidential: For Review Only 5 Therefore our hypothesis is that short CAG or GGN repeat polymorphisms of 68 the gene encoding the androgen receptor are associated with greater muscle mass, lower 69 fat mass and enhanced fitness in children. 70 The aim of this study was to determine whether the CAG and GGN androgen 71 receptor repeat polymorphisms are associated with body composition and the physical 72 fitness in children. 73 74 Methods 75 Pre and peripubertal children (152 boys and 116 girls, all Tanner stage <5) agreed to 76 participate in this study. Subjects were recruited from sports clubs in Gran Canaria 77 (Spain) aged between 7 and 13 years. Children with chronic illness of taking 78 medications were excluded. The study was performed in accordance with the Helsinki 79 Declaration of 1975 as regards the conduct of clinical research, being approved by the 80 Ethical Committee of the University of Las Palmas de Gran Canaria. Volunteers and 81 parents were informed about the study risk and benefits and provided written consent 82 before the start of the studies. Pubertal Tanner status was self-assessed 19, using a valid 83 20 and reproducible (r = 0.97) 21 procedure. 84 Body composition 85 Whole body composition was assessed with dual-energy X-ray absorptiometry (DXA; 86 QDR-1500, Hologic Corp., Software version 7.10, Waltham, Massachusetts, USA). 87 Upper and lower limbs lean mass were calculated using the regional analysis feature of 88 the software, as previously described 22, 23. 89 Page 5 of 24 https://mc.manuscriptcentral.com/bjsm British Journal of Sports Medicine 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Confidential: For Review Only 6 90 Vertical jump performance and running sprint tests 91 The forces generated during vertical jumps were measured with a force platform 92 (Kistler Quattro Jump, Winterthur, Switzerland). During this test, two differing types of 93 jumps were executed. The first was a squat jump (SJ), performed from a static position 94 with the knees bent at 90º. The second type of jump was a countermovement jump 95 (CMJ) starting from the upright position. The CMJ was executed with a fast downward 96 movement down to a 90º knee flexion, followed by a rapid vertical jump. Jumping 97 height (JH) and the maximal power (Wmax), generated were determined in the best of 98 three trials.99 Thirty meters running speed was measured indoor with photocells (General 100 ASDE, Valencia, Spain). Subjects performed three maximal 30m sprints with 5 minute 101 rest periods in between. 102 103 Anaerobic Capacity 104 The anaerobic capacity was estimated using a 300 m running test. This distance was 105 chosen because it has been shown that for all test lasting between 30 and 60 seconds 106 more than 50% of the overall energy yield is supplied by anaerobic energy sources 24. 107 The test was performed in the 400m track of the University and the time needed to 108 complete the distance was determined using an electronic stopwatch. 109 110 Maximal aerobic power 111 Page 6 of 24 https://mc.manuscriptcentral.com/bjsm British Journal of Sports Medicine 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Confidential: For Review Only 13 estrogen receptors and is functionally responsive to circulating sex steroids 39 . Although 242 testosterone may facilitate cardiac hypertrophy 40, 41 no association has been reported so 243 far between the pumping capacity of the heart and androgens. Moreover, the length of 244 the GGN repeat polymorphism is linearly and inversely associated with AR protein 245 content in cell cultures 9 . Due to the sex steroids interaction in the heart a longer GGN L 246 may translate into a more efficient calcium handling, which may favor a greater 247 pumping capacity of the heart 39 . However, the latter would require specific testing, 248 which is not possible in children, due to the necessity of using catheter to obtain 249 accurate peak cardiac output values during exercise. Finally another mechanism by 250 which a longer GGN polymorphism could influence VO 2 max is by favoring a greater 251 expression of type I fibers. A greater androgenic action is associated with greater 252 expression of type IIa fibers, as shown by the higher cross sectional area proportion of 253 type IIa fibers in men than women 42 . Predominantly type I fiber muscles have higher 254 oxidative capacity compared to type IIa and IIx predominant muscles 43, 44 and such a 255 phenotype would favor a greater O 2 extraction and, hence, VO 2 max 45 . In agreement 256 with this explanation, necropsy-based studies have shown in boys a progressive increase 257 in the proportion of type II fibers with maturation 46 , i.e., with the increase of 258 testosterone levels. 259 In summary, androgen CAG and GGN repeat polymorphism are associated with 260 exercise capacity in children. In boys, a shorter CAG genotype is associated with 261 increased performance in prolonged sprint, likely mediated by an enhanced anaerobic 262 capacity. In girls, a longer GGN repeat polymorphisms is associated with increased 263 VO 2 max, after accounting for body size. Further studies with a mechanistic approach 264 are required to determine the mechanisms by which a longer GGN repeat polymorphism 265 may favor a greater VO 2 max in girls. 266 Page 13 of 24 https://mc.manuscriptcentral.com/bjsm British Journal of Sports Medicine 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Confidential: For Review Only 14 Acknowledgments 267 The authors thank José Navarro de Tuero for his excellent technical assistance. This 268 study was supported by Ministerio de Educación y Ciencia (DEP2006-56076-C06269 04/ACTI) and FEDER, Gobierno de Canarias (PI2005/177), Proyecto Interreg IIIB 270 BIOPOLIS, Fundación del Instituto Canario de Investigación del Cáncer (FICIC), 271 Cabildo de Gran Canaria, Cabildo de Tenerife and La Caja de Canarias, and Proyecto 272 Estructurante “Integración de los grupos de investigación en Ciencias de la Salud”, 273 ULPGC, Gobierno de Canarias. None of the authors has conflicts of interest. All 274 financial sources have been reported. 275 276 Page 14 of 24 https://mc.manuscriptcentral.com/bjsm British Journal of Sports Medicine 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Confidential: For Review Only 15 References 277 1. Roy AK, Lavrovsky Y, Song CS et al. Regulation of androgen action. Vitam 278 Horm 1999; 55: 309-52. 279 280 2. 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Body composition, anthropometrics, physical activity and fitness in boys and 453 girls (mean ± standard deviation). Ht: height; SJJH: jumping height in squat jumps; 454 SJWmax: maximal power in squat jumps; CMJJH: jumping height in countermovement 455 jumps; CMJWmax: maximal power in countermovement jump; T30m and T300m 456 running time in the 30 and 300 m running sprint, respectively. 457 Table 2. Body composition, anthropometrics, physical activity and fitness in boys and 458 girls with CAGs and CAG L androgen receptor polymorphisms (mean ± standard 459 deviation). Ht: height; SJJH: jumping height in squat jumps; SJWmax: maximal power 460 in squat jumps; CMJJH: jumping height in countermovement jumps; CMJWmax: 461 maximal power in countermovement jump; T30m and T300m running time in the 30 462 and 300 m running sprint, respectively. Subjects were grouped as CAG short (CAG s ) if 463 harboring repeat lengths of ≤21 and CAG long (CAG L ) if harboring repeat lengths of 464 >21. *P<0.05 vs CAG L . 465 Table 3. Body composition, anthropometrics, physical activity and fitness in boys and 466 girls with GGN s and GGN L androgen receptor polymorphisms (mean ± standard 467 deviation). Ht: height; SJJH: jumping height in squat jumps; SJWmax: maximal power 468 in squat jumps; CMJJH: jumping height in countermovement jumps; CMJWmax: 469 maximal power in countermovement jump; T30m and T300m running time in the 30 470 and 300 m running sprint, respectively. Subjects were grouped as GGN short (GGN s ) if 471 harboring repeat lengths of ≤23 and CAG long (GGN L ) if harboring repeat lengths of 472 >23. *P<0.05 vs GGN L . 473 Page 20 of 24 https://mc.manuscriptcentral.com/bjsm British Journal of Sports Medicine 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Confidential: For Review Only 21 Table 1 . Body composition, anthropometrics, phys ical activity and fitness in boys and girls (mean ± standard deviation). boys n girls n Age 11.5 ± 2.6 152 10.1 ± 3.2 116 Height (cm) 147.9 ± 14.8 152 138.4 ± 15.9 116 Body mass (kg) 41.7 ± 13.1 152 36.4 ± 12.6 116 Percentage of body fat (%) 21.1 ± 8.7 152 27.2 ± 8.5 116 Lean body mass (kg) 30.6 ± 9.9 152 24.4 ± 7.8 116 Lean mass arms (kg) 2.9 ± 1.1 152 2.1 ± 0.7 116 Lean mass legs (kg) 10.1 ± 3.8 152 7.5 ± 2.8 116 Lean mass extremities (kg) 13.0 ± 4.9 152 9.6 ± 3.5 116 Lean mass arms/Ht 2 (kg.m -2 ) 1.3 ± 0.2 152 1.1 ± 0.2 116 Lean mass legs/Ht 2 (kg.m -2 ) 4.5 ± 0.8 152 3.8 ± 0.6 116 Lean mass extrem i ties/Ht 2 (kg.m -2 ) 5.7 ± 1.0 152 4.8 ± 0.8 116 Tanner G 2.5 ± 1.2 152 2.0 ± 1.2 116 Tanner H 2.6 ± 1.2 152 2.2 ± 1.4 116 Jumping tests SJJH (m) 0.19 ± 0.06 134 0.16 ± 0.06 79 CMJJH (m) 0.23 ± 0.08 133 0.17 ± 0.06 77 SJWmax(W) 1429.7 ± 657.9 133 1308.6 ± 559.4 44 CMJWmax(W) 1539.8 ± 690.5 132 1473.1 ± 586.2 43 Running tests T30m (s) 5.5 ± 0.5 133 6.4 ± 1.1 103 T300m (s) 72.0 ± 12.6 114 85.2 ± 17.8 99 Maximal aerobic power VO 2 max (ml.kg -1 .min -1 ) 47.7 ± 4.7 130 47.2 ± 5.6 102 Ht: height; SJJH: jumping height in squat jumps; SJWmax: maximal power in squat jumps; CMJJH: jumping height in countermovement jumps; CMJWmax: maximal power in countermovement jump; T30m and T300m running time in the 30 and 300 m running sprint, respectively. 474 475 476 477 478 479 Page 21 of 24 https://mc.manuscriptcentral.com/bjsm British Journal of Sports Medicine 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 Confidential: For Review Only Ht: height; SJJH: jumping height in squat jumps; SJWmax: maximal power in squat jumps; CMJJH: jumping height in countermovement jumps; CMJWmax: maximal power in countermovement jumps; T 30m and 480 T300m running time in the 30 and 300 m running sprint, respectively. * P<0.05 vs CAG L . 481 482 483 Table 2. Body composition, anthropometrics, physical activity and fitness in boys and girls with CAGs and CAG L androgen receptor polymorphisms (mean ± standard deviation). CAG S boys n CAG L boys n CAG S girls n CAG L girls n Age 11.3 ± 2.4 90 11.7 ± 2.8 62 10.1 ± 3.4 51 10.2 ± 3.0 65 Height (cm) 146.1 ± 14.0 90 150.5 ± 15.6 62 138.2 ± 15.8 51 138.6 ± 16.0 65 Body mass (kg) 39.9 ± 12.0 90 44.2 ± 14.4 62 36.3 ± 13.3 51 36.5 ± 12.2 65 Percentage of body fat (%) 20.9 ± 8.1 90 21.3 ± 9.5 62 27.0 ± 8.7 51 27.3 ± 8.4 65 Lean body mass (kg) 29.5 ± 9.0 90 32.3 ± 10.9 62 24.3 ± 7.6 51 24.4 ± 8.0 65 Lean mass arms (kg) 2.8 ± 1.0 90 3.1 ± 1.2 62 2.1 ± 0.7 51 2.1 ± 0.7 65 Lean mass legs (kg) 9.6 ± 3.4 90 10.8 ± 4.3 62 7.5 ± 2.7 51 7.5 ± 2.9 65 Lean mass extremities (kg) 12.5 ± 4.4 90 13.9 ± 5.4 62 9.6 ± 3.4 51 9.6 ± 3.6 65 Lean mass arms/Ht 2 (kg.m -2 ) 1.3 ± 0.2 90 1.3 ± 0.2 62 1.1 ± 0.2 51 1.1 ± 0.2 65 Lean mass legs/Ht 2 (kg.m -2 ) 4.4 ± 0.7 90 4.6 ± 0.9 62 3.8 ± 0.6 51 3.8 ± 0.7 65 Lean mass extremties/Ht 2 (kg.m -2 ) 5.6 ± 0.9 90 5.9 ± 1.1 62 4.9 ± 0.8 51 4.8 ± 0.8 65 Tanner G 2.5 ± 1.1 90 2.5 ± 1.2 62 2.0 ± 1.2 51 2.0 ± 1.3 65 Tanner H 2.6 ± 1.2 90 2.6 ± 1.2 62 2.2 ± 1.3 51 2.2 ± 1.4 65 Jumping tests SJJH (m) 0.19 ± 0.07 77 0.19 ± 0.06 57 0.16 ± 0.06 28 0.16 ± 0.06 51 SJWmax (w) 1376.0 ± 608.5 77 1503.5 ± 719.4 56 1326.2 ± 542.1 19 1295.2 ± 583.0 25 CMJJH (m) 0.23 ± 0.09 76 0.22 ± 0.06 57 0.19 ± 0.07 28 0.16 ± 0.06 49 CMJWmax (w) 1473.4 ± 645.9 76 1629.8 ± 743.3 56 1515.3 ± 615.2 19 1439.8 ± 573.4 24 Running tests T30m (s) 5.6 ± 0.5 82 5.5 ± 0.5 51 6.4 ± 1.1 44 6.4 ± 1.2 59 T300m (s) 70.3* ± 12.3 68 74.4 ± 12.8 46 84.6 ± 14.1 41 85.7 ± 20.1 58 Maximal aerobic power VO 2 max (ml.kg -1 .min -1 ) 47.6 ± 4.4 78 47.8 ± 5.2 52 47.2 ± 6.2 43 47.1 ± 5.2 59 Page 22 of 24 https://mc.manuscriptcentral.com/bjsm British Journal of Sports Medicine 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 Abstract Purpose. The human androgen receptor (AR) gene possesses two trinucleotide polymorphic repeats, (CAG and GGN) that affects the amount of AR protein translated. In this study, we genotyped these polymorphic tracts in a representative sample of Caucasian children (Tanner ≤ 5), 152 boys (11.5  2.6 yrs) and 116 girls (10.1 3.2 yrs) from Spain and investigated their association with bone mass. Methods. The length of CAG and GGN repeats was determined by PCR and fragment analysis. Body composition was assessed by dual energy x-ray absorptiometry (DXA). Individuals were grouped as CAG short (CAGS) if harboring repeat lengths of ≤21 and CAG long (CAGL) if CAG >21. Moreover, subjects were grouped as GGN short (GGNS) if harboring repeat lengths of ≤23 and GGN long (GGNL) if GGN >23. Results. In boys, significant differences in height, body mass, whole body bone mineral density (BMD) and content (BMC), upper extremities BMC, lower extremities BMC, femoral neck BMD, Ward’s triangle BMC and BMD and lumbar spine BMD were observed between CAGS and CAGL groups (P<0.05). Thus, upper extremities BMD differed between GGNS and GGNL groups. After adjusting for confounding variables, only upper extremities BMD between GGNS and GGNL groups remained significant (P<0.05). No differences were observed in girls in any measured site in relation to either CAG or GGN polymorphisms length. Conclusions. Our results support the hypothesis that longer alleles of the AR CAG and GGN polymorphisms are associated with increased bone mass in prepubertal boys. Keywords: Bone mass, gene, androgen receptor polymorphisms, prepubertal growth. *D. Manuscript Click here to view linked References 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 Introduction About 60-80% of peak bone mass variability is determined by hereditary factors; although there are other important elements like diet and hormonal status that could also affect on the optimal bone mass acquisition during childhood and adolescence (1). Bone strain elicited by physical activity promotes bone mineralization and facilitates bone mass accrual during growth (2). The osteogenic effect of physical activity is particularly effective when exercise is started before puberty in both girls and boys (3-5). Longitudinal studies evaluating changes in bone mass during growth, have shown that the greatest increases in bone mass occurs at ages of 12-15 years in girls compared to 14-17 years in boys (6), i.e., during the transition from adolescence to adulthood. Bone mass acquisition before or at the first stages of the pubertal phase likely depends on the ability to transcribe anabolic hormonal signals into discrete bone formation, particularly because systemic anabolic hormones (i.e. free and total testosterone or estradiol) are almost inexistent (7, 8). Although estradiol is required for the attainment of maximal peak bone mass in both sexes, testosterone has an additional action through the stimulation periosteal apposition promoting periostal expansion (7). Therefore, those children able to generate a greater androgenic response would, in theory, benefit from a greater bone formation. Androgenic activity in bone is mediated by the androgen receptors (ARs), a type of nuclear receptor present in osteoblasts and activated by transmembrane binding to androgenic hormones such as testosterone or dihydrotestosterone (9). The AR gene has two polymorphic motives due to polyglutamine (CAG, encoded), polyglycine (GGN) tracts, whose repetition length is negatively associated to its transcriptional activity (10, 11). Consequently, a greater androgenic effect is expected for AR with lower CAG and GGN repeat number. In agreement, a lower number of CAG repetitions have been linked to greater fat-free mass in healthy elders (12) as well as benign prostatic hypertrophy, prostate cancer, male infertility (13-15) and higher systemic concentrations of total and free testosterone (16). The effect of ARs polymorphisms on bone mass has also been studied by our laboratory in a group of 282 healthy men, where we found a higher femoral neck BMD in those subjects carrying a CAGS + GGNS haplotypes (17). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 Much less investigated is the effect of harboring a short or long CAG or GGN repeat polymorphism on bone mass formation during growth. In this line, Voorhoeve et al. have shown that height-standard deviation scores were inversely associated with AR CAG repeat length in boys at young prepubertal and early pubertal age (18). Therefore, the aim of this study was to determine whether the CAG and GGN androgen receptor repeat polymorphisms are associated with bone mass in prepubertal boys and girls. Our hypothesis is that a short CAG or GGN repeat polymorphisms of the gene encoding the androgen receptor is associated with greater bone mass in children. Methods Caucasians physically active boys (152) and girls (116), aged between 7 and 13 years (Tanner stage <5), were recruited from sports clubs in Gran Canaria (Spain). Children having any chronic illness or taking medications were excluded. The study was performed in accordance with the 1975 Helsinki Declaration and was approved by the Ethical Committee of the University of Las Palmas de Gran Canaria. Parents and children provided written consent after receiving a full explanation on the benefits and risk before the start of the studies. Tanner pubertal stage (19) was self-assessed by the children (20), a procedure of recognized reproducibility (r = 0.97) (21). Body composition Whole body composition was determined by dual-energy X-ray absorptiometry (DXA; QDR-1500, Hologic Corp., Software version 7.10, Waltham, Massachusetts, USA) as reported in Perez-Gomez et al. [(22)]. Calculations related to upper and lower limb lean mass was conducted by regional analysis of the whole body scan (23, 24). CAG and GGN repeat polymorphisms DNA was extracted from saliva samples (200 l) using High Pure PCR Template Preparation Kits (Roche Applied Science). To determine the length of the CAG and GGN repeats the corresponding regions located on the exon 1 of the AR gene (Genbank accession no. M27423) were amplified using two pairs of primers whose sequences have been previously reported (25). One primer from each pair was marked with fluorescent dye 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 (FAM or VIC). Amplification was performed in a 25 µl reaction volume, containing 50 ng of genomic DNA, 200 µM of each deoxynucleotide triphosphate, 1x Fast Start Taq DNA polymerase Buffer (Roche Applied Science, Mannheim, Germany), 1x GC-rich solution buffer (Roche Applied Science) and 1U of Fast Start Taq DNA polymerase (Roche Applied Science). The concentration of each pair of primers was 1.2 and 1.5 µM for the amplification of the CAG and GGN repeats, respectively. PCR conditions were: 30 cycles of 95ºC for 45 sec, 56ºC for 30 sec and 72ºC for 30 sec for CAG amplification; 30 cycles of 95ºC for 1 min, 55ºC for 2 min and 72ºC for 2 min for GGN amplification. Each PCR was initiated with a denaturation step at 95ºC for 5 min and terminated with an extension step at 72ºC for 5 min. The PCR product was diluted 1:100 in distilled water and 1 µl of the dilution was mixed with 10µl of formamide and 0.3 µl of GeneScan 500 LIZ Size Standard (Applied Biosystems, Warrington, UK), denatured at 98ºC for 5 min and cooled on ice. Fragment separation was performed by automated capillary electrophoresis, using an ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) and the length was determined with Gene Scan Analysis Software (version 3.7) (Applied Biosystems). Internal standards supplied by the manufacturer were used for quality control. We blindly repeated the genotype analysis in 54 of the samples, and the results were completely coincident. The fragments size was confirmed by sequencing 48 DNA samples harboring different size alleles for both repeats by using the Big Dye Terminator Sequencing Kit (Applied Biosystem) at University of Las Palmas Sequencing Facility with excellent agreement between both procedures. Genotyping was performed specifically for research purposes based on the hypothesis that the aforementioned polymorphisms may influence VO2 max, lean mass and muscle strength. The researchers in charge of genotyping were totally blinded to the subjects’ identities, that is, blood samples were tracked solely with code numbers, and personal identities were only made available to the main study researcher who was not involved in actual genotyping. Statistical analysis Descriptive statistics are presented as the mean values and standard deviation (SD). The homogeneity of variances was established by the Levene test. A logarithmic transformation was performed for variables that were not normally distributed. Since both CAG and GGN 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 repeats were not normally distributed, the Spearman correlation coefficient (rho) was used to test the strength of the association between the number of these repeats and diverse continuous variables. Differences between data subsets were analyzed using either analysis of variance or analysis of covariance, both with the Bonferroni post hoc test. The influence of the length polymorphism repeats CAGn and GGNn on body composition and fitness variables was determined by taking the polymorphisms as continuous variables or dichotomous by allelic limits. The mean value showed the best balance between groups of children was used as the cutoff, therefore, subjects who had a number of repetitions ≤ 21 were classified as short CAG (CAGS) and those subjects who showed a number of repeats > 21 were classified as long CAG (CAGL). In the case of GGN, subjects carrying a number of repetitions ≤ 23 were classified as short GGN (GGNS), and those showing a number of repetitions > 23 were considered as long GGN (GGNL). Statistical analysis was performed with SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Significant differences were assumed at P <0.05. Results There were 16 different CAG alleles (ranging from 13 to 33 repeats) and 12 GGN alleles, ranging from 14 to 30 repeats in boys. In the girls there were 11 different CAG alleles (ranging from 14 to 25) and 9 GGN alleles, ranging from 13 to 24 repeats. Boys and girls body composition, anthropometrics, total and regional bone mass are reported in table 1. In general, boys were taller, heavier and had higher whole body BMD and BMC than girls (P<0.05, table 1). CAG repeat polymorphism Anthropometrics, maturational stage, total and regional bone mass in the CAGS and CAGL groups are reported in table 2 for boys and girls respectively. CAGL boys showed greater height, body mass, whole body bone mineral density (BMD) and content (BMC), upper extremities BMC, lower extremities BMC, femoral neck BMD, Ward’s triangle BMC, Ward’s triangle BMD and lumbar spine BMD than CAGS boys (P<0.05, table 2). No intergroup (CAGS vs CAGL) differences were observed in girls (Table 2). After adjusting for confounding variables (age, height, weight, fat percentage, Tanner H, Tanner G), no 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 differences were observed in any measured site in relation to CAGS and CAGL classification. GGN repeat polymorphism Anthropometrics, total and regional bone mass in the GGNS and GGNL groups are reported in table 3 for boys and girls respectively. The boys with the polymorphism GGNL had higher BMD in the upper extremities than those with a GGNS (P<0.05, table 3). This difference remained significant after adjusting for confounding variables (age, height, weight, fat percentage, Tanner H, Tanner G) (P<0.05). Girls classified in either GGNS or GGNL groups did not show any difference in any of the measured sites. Correlations Adjusted Spearman correlations showed a positive association between CAG repeat number and lower extremities BMD and Ward’s triangle BMC in boys (r=0.16 and 0.14 respectively, P<0.05), and a negative association between Ward’s triangle BMC, BMD and GGN repeat length in boys ( r=-0.18 and 0.17 respectively, P<0.05). Discussion In contrast to our hypothesis, the main result of this study shows that boys classified as GGN long, after adjusting for potential confounders as height, weight and pubertal status, show higher bone mass in the upper extremities than those harboring the shorter GGN polymorphism. Moreover, neither CAG nor GGN polymorphism length seem to have an influence on bone mass and density in prepubertal girls. Long CAG length has been associated with increased BMC and BMD (3, 8, 26). In this study, children with long CAG have, on average, higher values in the following variables: size, weight, bone mineral content of whole body, upper and lower extremities (and respectively) and Ward´s triangle, as well as bone mineral density of total body, lower extremities, femoral neck, Ward´s triangle and lumbar spine. In agreement, Lappalainen and collaborators reported a positive correlation between BMI and the number of CAG repeats (27), whereas another study performed in adolescent boys did not confirm such an association between body composition and CAG repeats (18). Previous work from our 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 laboratory has shown that there is no relationship between physical fitness, muscle mass, levels of free testosterone, osteocalcin and the length of the CAG repeat number in a group of 282 healthy young men (17, 26). However, another study that investigated the relationship between the AR CAG repeat polymorphism and longitudinal growth from prepuberty until young adult age found that height-standard deviation scores were inversely associated with AR CAG repeat length in boys at young, prepubertal and early pubertal age. This association diminishes in the following years and completely disappears after the age of 16 years (18). In agreement, we did not find differences in height between CAGS and CAGL in our older children. Other studies indicate that age, physical activity, body composition, sex steroid levels and anthropometrics are determinants of muscle mass and function in young men, and although the number of CAG repeats of the AR are related to sex steroid levels and anthropometrics, there is no evidence that these variations in the AR gene also affect muscle mass or function (28). The differences observed in the present investigation with previously published data could be explained by the children’s degree of physical activity. Our participants were practicing physical activity at least three times a week for two or more years at schools or after-school sport clubs. Therefore, the potential added effect of harboring a short CAG polymorphism on bone mass may not be large enough to be detected because of the wellknown effects of physical activity and sports participation on bone mass acquisition during growth (29). Additional studies are required to determine whether the CAG repeat polymorphism is associated with bone mass in sedentary children and how this polymorphism may modulate physical activity osteogenic effects. Alternatively it may be argued that in a normally functioning adult hypothalamic– pituitary–gonadal axis, a diminished testosterone feedback, in case of a long AR CAG repeat, is compensated for by increased androgen production, because of increased LH stimulation (12, 16, 30). It was suggested that several phenotypic effects are probably more attributable to oestrogen action than to androgen action, because of the increased effective bioactive oestrogen/androgen ratio in increasing AR CAG length (31). In prepubertal boys, the hypothalamic–pituitary–gonadal axis is not responding as in adulthood, because the axis is relatively silent and the gonads only produce minor amounts of androgens. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 Moreover, a very small amount of androgens is produced by the adrenals, which are not under control of the hypothalamic– pituitary–gonadal axis. One could argue that in these boys, the compensatory mechanism of increasing androgen production in increasing AR CAG repeat length is absent. Therefore, prepubertal boys with long AR CAG repeats are relatively androgen deficient in prepubertal compared with boys with short AR CAG repeat, leading to subtle differences in prepubertal growth as shown in our study. Although the influence of AR GGN repeat polymorphisms on bone mass has not been studied in children, we have found a positive correlation between AR GGN repeat length, BMD at different skeletal regions and the bone formation marker osteocalcin in young men (26), and women (32). These studies support the abovementioned opportunity window for a prolonged bone grow span in those children with a relatively lower androgenic activity. However, more studies are needed in order to confirm this affirmation, especially in physically active and inactive children. In conclusion, our results support the hypothesis that the longer alleles of the AR CAG and GGN polymorphisms are associated with increased bone mass in prepubertal boys, whereas no apparent association is found in prepubertal girls. Implications and Contribution Our results support the hypothesis that longer alleles of the androgen receptor CAG and GGN polymorphisms are associated with increased bone mass in prepubertal boys, whereas no apparent association is found in prepubertal girls. The present investigation adds to the current knowledge about the genetic influence of bone mass development during growth. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 References [1] Bachrach LK. Acquisition of optimal bone mass in childhood and adolescence. Trends Endocrinol Metab 2001;12:22-28. [2] Vicente-Rodriguez G. How does exercise affect bone development during growth? Sports Med 2006;36:561-569. [3] Kannus P, Haapasalo H, Sankelo M, et al. Effect of starting age of physical activity on bone mass in the dominant arm of tennis and squash players. Ann Intern Med 1995;123:27-31. 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J Androl 2012;33:644-650. 2 Abstract 1 To determine the influence of androgen receptor CAG and GGN repeat polymorphisms 2 on fat mass and maximal fat oxidation (MFO), CAG and GGN repeats length was 3 measured in 129 young boys, from which longitudinal data were obtained in 45 subjects 4 [mean ± SD: 12.8±3.6 years old at recruitment, and 27.0±4.8 years old at adult age]. 5 Subjects were grouped as CAG short (CAGS) if harbouring repeat lengths ≤21, the rest 6 as CAG long (CAGL); and GGN short (GGNS) if GGN repeat lengths ≤23, or long if 7 >23 (GGNL). Boys with CAGS showed lower BMI, percentage of body fat, whole body 8 fat mass, fat mass in the trunk region, and total lean body mass than CAGL (P<0.05). 9 The percentage of body fat, whole body and trunk fat mass was lower in GGNS than 10 GGNL (P<0.05). At adult age, CAGS-men showed lower accumulation of whole body 11 mass, BMI, total body and trunk fat mass, total lean body mass. CAGs had lower resting 12 metabolic rate (RMR) and MFO per kg of total lean mass compared to CAGL (P<0.05). 13 GGNS showed at adult age lower percentage of body fat, whole body and trunk fat mass 14 than GGNL group after accounting for VO2max and MFO per kg of total lean mass 15 (P<0.05). The logarithm of CAG repeats at adolescent and adult period was associated 16 with the logarithm of BMI (r=0.364, P=0.014 and r=0.542, P<0.001; respectively), 17 percentage of body fat (r=0.385, P=0.009 and r=0.296, P=0.057), fat mass in the trunk 18 region (r=0.395, P=0.007 and r=0.412, P=0.007; respectively), of body fat (r=0.388, 19 P=0.008 and r=0.383, P=0.012; respectively), and with the changes in total lean body 20 mass (r=0.369, P=0.016). In summary, androgen receptor CAG and GGN repeat 21 polymorphisms determine fat mass and it regional distribution in healthy male 22 adolescents and influences fat accumulation from adolescence to adult age. 23 3 Introduction 24 The androgen receptor (AR) gene contains a polyglutamine tract encoded by CAG 25 repeats and a polyglycine tract (GGN) encoded by (GGT)3GGG(GGT)2(GGC)n. 26 Androgen receptor CAG and GGN repeat length polymorphisms are associated with fat 27 and lean mass in adult humans 1-5. However, little is known about the influence of AR 28 CAG polymorphism on body composition changes during growth in children and 29 adolescents, while the potential influence of AR GGN polymorphism remains unknown. 30 Cross-sectional studies have reported an inverse relationship between the AR 31 CAG repeat length and height in prepubertal boys. This association, however, 32 disappeared during puberty in two comparable cohorts of 226 (age 12.9-36 years) and 33 244 subjects (age 8-14 years), respectively 6. Moreover, no associations were found 34 between AR CAG repeat length and body composition in this study 6. This contrast with 35 a positive association between CAG length and skinfold thickness between 10 and 12 36 years of age was observed in a cohort of 78 healthy Danish boys (age 6.2-12.4 years) 7. 37 Therefore, the main aim of this study was to determine whether AR CAG and 38 GGN repeat polymorphisms may be associated with the changes in body composition 39 from adolescence to adult age. Another aim was to investigate whether AR 40 polymorphisms are associated to the maximal fat oxidation capacity in men and how 41 this could influence the accumulation of fat mass during growth. 42 We hypothesized that androgen sensitivity, indicated by the length of CAG and 43 GGN repeats in the X-chromosomal androgen receptor (AR) gene determines the level 44 of fat and lean mass at young age, and the longitudinal changes from puberty to the 45 adult age. 46 47 4 Methods 48 Subjects 49 Initially, this cohort included 129 young boys from Gran Canaria (Spain), from which 50 longitudinal data were obtained in 45 subjects. The recruitment started in February 1998 51 while the second assessment was obtained in January 2013. All subjects underwent a 52 medical examination. Inclusion criteria were: age ranging from 8 to <17 years at 53 recruitment. Subjects smoking, taking any kind of medications or having any chronic 54 disease, hypertension or orthopaedic limitations were excluded. The study was 55 performed in accordance with the Helsinki Declaration of 1975 as regards the conduct 56 of clinical research, being approved by the Ethical Committee of the University of Las 57 Palmas de Gran Canaria. After receiving written and verbal information on the potential 58 risk and benefits of the study all subjects and parents signed a consent form to 59 participate in this study. 60 61 Tests 62 Boys reported to the laboratory between 07:30 and 08:30 a.m., under fasting overnight 63 conditions. After saliva collection, the International Physical Activity Questionnaire 64 (IPAQ) was applied and a Tanner stage self-assessed as previously reported 8-9. Then, 65 their body composition was measured by dual-energy X-ray absorptiometry (DXA). 66 This was followed by the assessment of physical fitness (VO2max) as previously 67 reported 10. 68 Approximately 14 years later, subjects reported to the laboratory after an 69 overnight fast for assessment of their body composition (same DXA analyzer) followed 70 by measurement of their resting metabolic rate (RMR), maximal fat oxidation (MFO) 71 5 capacity and VO2max with indirect calorimetry. Subjects were requested to refrain from 72 non-habitual exercise, caffeine or alcohol drinks, for at least 24h prior to the test. 73 74 Body composition 75 Whole body composition was assessed by dual-energy X-ray absorptiometry (DXA) 76 (QDR-1500, Hologic Corp., Software version 7.10, Waltham, MA) 11. Upper and lower 77 limb lean mass (kg) was calculated from the regional analysis of the whole body scan, 78 which gives a valid and reliable estimate of muscle mass in the extremities 12. 79 80 Indirect calorimetry 81 After overnight fast, RMR was measured during 30 minutes while subjects lied supine 82 on a bed using a metabolic cart (Vmax N29; Sensormedics, California, USA). This was 83 followed by an incremental exercise test to determine the maximal fat oxidation (MFO), 84 and the intensity at which MFO occurred (FatMax) during leg cycling 13. The test 85 started at 30 W for 5 min, followed by 30 W increments every 3 min. When subjects 86 reached an RER>1.0 the exercise was stopped at the end of the corresponding 3 min 87 period load. After 5 minutes of recovery, an incremental test (30 W/min) beginning in 88 the last load of the MFO test was performed to determine the VO2max. Subjects were 89 instructed to maintain a pedaling rate of 80 rpm. Fat and carbohydrate oxidation was 90 calculated from VO2 and VCO2 values during the last 60 s of each exercise step in the 91 graded exercise tests, using standard indirect calorimetry equations 14. It was assumed 92 that protein oxidation was similar and small during the incremental exercise tests. 93 94 6 CAG and GGN repeat polymorphisms 95 CAG and GGN repeat polymorphisms were determined as previously reported 5. 96 Briefly, DNA was extracted from saliva samples (200 μl) using High Pure PCR 97 Template Preparation Kits (Roche Applied Science). To determine the length of the 98 CAG and GGN repeats the corresponding regions located on the exon 1 of the AR gene 99 (Genbank accession no. M27423) were amplified using two pairs of primers whose 100 sequences have been previously reported 5. Fragment separation was performed by 101 automated capillary electrophoresis, using an ABI Prism 3100 Genetic Analyzer 102 (Applied Biosystems) and the length was determined with Gene Scan Analysis Software 103 (version 3.7) (Applied Biosystems). Internal standards supplied by the manufacturer 104 were used for quality control. 105 Statistical analysis 106 All variables were checked for normal distribution using the test of Shapiro-Wilk. When 107 necessary, the analysis was done on logarithmically transformed data. The influence of 108 CAG and GGN repeat lengths on body composition, RMR, MFO, and VO2max was 109 determined taking CAG and GGN repeat lengths as either continuous or as dichotomous 110 variables with allele cut-off thresholds. The relationship between CAG and GGN as 111 continuous variables with body composition, and physical fitness variables was 112 examined using linear regression analysis. The median value that resulted in the most 113 balanced grouping was used as a cutoff threshold 15-16. The CAG and GGN number 114 distributions were: CAGS (short ≤ 21 repeats; n=24), CAGL (long > 21 repeats; n=21), 115 GGNS (short ≤ 23 repeats; n=30), and GGNL (long ≥ 24 repeats; n=15). Comparisons 116 between short and long groups were carried out with ANOVA after accounting for age, 117 height, total lean body mass, Tanner, and VO2max as covariates. When it was 118 7 necessary, lean mass was corrected for differences in height by dividing muscle mass by 119 height2 17. 120 121 Results 122 Subjects’ characteristics, body composition and physical fitness at young and adult age 123 for the CAG and GGN groups are reported in Tables 1 and 2, respectively. Longitudinal 124 data, daily energy expenditure, basal fat oxidation, RMR and MFO are reported in 125 Table 3. The distribution of AR allele frequencies for CAG and GGN repeat numbers 126 are illustrated in Figure 1. The median CAG repeat length was 21 (range: 15 -26), while 127 the GGN median length was 23 (range: 14 - 27). The median CAG values for short and 128 long groups were 19 and 24, respectively. The corresponding mean values for the GGN 129 groups were 22 and 24, for the GGNS and GGNL, respectively. 130 131 CAG, body composition and VO2max at recruitment 132 No statistically significant differences in age, body mass, height, lean body mass and 133 cardiorespiratory fitness (VO2max) were observed between CAGS and CAGL groups 134 (Table 1). However, the BMI, percentage of body fat, whole body and trunk fat mass 135 were lower in the CAGS compared to the CAGL group (P=0.04, P=0.03, P=0.03, and 136 P=0.05, respectively) (Figure 2 A), even after accounting for pubertal status (P=0.002, 137 P=0.05, P=0.01, P=0.02; respectively), age (P=0.003, P=0.07, P=0.01, and P=0.03, 138 respectively), or both as covariates (P=0.002, P=0.05, P=0.01, P=0.02; respectively) 139 (Table 1). These differences remained statically different after accounting for VO2max 140 (ml/kg of body mass/min), age and Tanner stage (P=0.004, P=0.08, P=0.02, and P=0.04, 141 respectively). 142 8 Compared to the CAGS, the CAGL group had greater total lean body mass, and 143 lean mass in the lower and upper extremities after accounting for Tanner stage (all 144 P<0.05), age (all P<0.05), Tanner stage and age (all P=0.01), or VO2max (ml/kg of 145 body weight/min) (P<0.05). Only absolute values of VO2max (L/min) showed a trend 146 to be higher in CAGL compared to CAGS after accounting for Tanner stage (P=0.07), 147 age (P=0.13), or both as covariates (P=0.08). 148 149 GGN, body composition and VO2max at recruitment 150 No differences between GGNS and GGNL groups were observed in age, body mass, 151 height, body composition and VO2max (Table 2). However, the percentage of body fat, 152 and whole body and trunk fat mass were lower in GGNS compared to GGNL after 153 accounting for Tanner stage and VO2max (ml/kg of body mass/min) (all P<0.05) 154 (Figure 2 A). 155 No significant differences were observed in lean mass between GGN groups 156 even after accounting for Tanner stage, age or VO2max. Neither was there a difference 157 in VO2max between GGN groups, even after accounting for Tanner stage, age, total 158 lean body mass or lower extremities lean mass. 159 160 CAG at adult age and longitudinal changes in body composition. 161 No significant differences in age, height (Table 1), daily energy expenditure, and time 162 elapsed between the two measurements (Table 3) were observed between CAGS and 163 CAGL groups. However, CAGL group accumulated 11.4 ± 2.0 kg more total body mass 164 and 2.3 ± 3.4 kg more total body fat than the CAGS group during 13.7 ± 0.6 years of 165 follow up (P=0.04 and P=0.03, respectively) (Figure 2 B). Moreover, CAGL showed a 166 greater body mass, BMI, whole body and trunk fat mass (Figure 2 A) compared to 167 9 CAGS (P=0.001, P=0.001, P=0.05, and P=0.04, respectively), even after accounting for 168 age (P=0.001, P=0.001, P=0.04, and P=0.06, respectively), for total energy expenditure 169 (P=0.002, P=0.001, P=0.04, and P=0.03, respectively), VO2max (ml/kg of body 170 mass/min) (all P<0.001), MFO per kg of total lean mass (P=0.003, P=0.002, P=0.06, 171 and P=0.04, respectively) or for all covariates conjointly (all P<0.01) (Table 1). There 172 was no difference in percentage of body fat between groups (P=0.25), even after 173 accounting for age (P=0.29), for total energy expenditure (P=0.20), or for MFO per kg 174 of total lean mass (P=0.27). However, after adjusting for VO2max (ml/kg of body 175 mass/min) the percentage of body fat was 27% higher in CAGL compared to CAGS 176 (P=0.03). 177 Moreover, CAGL also showed greater lean mass in the lower (15%) and upper 178 (22%) extremities, as well as greater total lean body mass (16%) compared to CAGS (all 179 P<0.01), even after accounting for age (all P<0.01), for total energy expenditure (all 180 P<0.01), VO2max (ml/kg of body mass/min) (all P<0.01), or for all covariates 181 conjointly (all P<0.01). In turn, CAGL accumulated 5.8 g of total lean body mass per 182 day compared to 4.1 g/day in CAGS during the time of follow up (P=0.02). 183 CAGL group showed a 9% higher VO2max per kg of lower extremity lean mass 184 than CAGS (P=0.048), but this difference was lost after accounting for age (P=0.06). 185 The MFO (absolute values), MFO per kg of lower extremity lean mass, and 186 MFO per kg of total lean mass were greater in the CAGL than in the CAGS group 187 (P=0.01, P=0.09, and P=0.12, respectively) (Figure 2 C), even after accounting for age 188 (P=0.01, P=0.09, and P=0.12, respectively), for VO2max (P=0.02, P=0.12, and P=0.16, 189 respectively), or both covariates conjointly (P=0.01, P=0.12, and P=0.16, respectively). 190 The RMR was 15% higher in the CAGL than CAGS group (P=0.03). This difference, 191 10 however, disappeared after accounting for age (P=0.06), total lean mass (P=0.30), or for 192 both conjointly (P=0.98). 193 194 GGN at adult age and longitudinal changes in body composition 195 No significant differences in age, height (Table 2), daily energy expenditure, and time 196 elapsed between the two measurements were observed between GGNS and GGNL 197 groups (Table 3). Both GGN groups had similar body composition, even after 198 accounting for age, total energy expenditure, VO2max (ml.kg of body mass-1.min-1), or 199 MFO per kg of total lean mass. However, GGNL had a higher percentage of whole body 200 and trunk fat mass than GGNS group after accounting for VO2max (ml.kg of body mass201 1.min-1) and MFO per kg of total lean mass jointly (all P<0.05) (Figure 2 A).The GGNS 202 and GGNL subjects accumulated 6.4 ± 8.3 and 7.6 ± 10.8 kg of whole body fat over 203 13.7 ± 0.6 years of follow up (Figure 2 B). This difference in fat mass accumulation was 204 not statistically significant (P=0.67) even after accounting for initial age, change in 205 VO2max, body height, initial body fat mass, basal fat oxidation and MFO as covariates. 206 207 Correlations 208 There was an association between the logarithm of CAG repeats polymorphism and the 209 changes of body mass (r=0.34, P=0.03). At adolescent and adult age, the logarithm of 210 CAG repeats polymorphism was associated with logarithm of BMI (r=0.36, P=0.01 and 211 r=0.54, P<0.001; respectively), logarithm of percentage of body fat (r=0.39, P=0.009 212 and r=0.3, and P=0.057, respectively), logarithm of fat mass in the trunk region (r=0.4, 213 P=0.007 and r=0.41, and P=0.007, respectively), and logarithm of body fat (r=0.39, 214 P=0.008 and r=0.38, and P=0.012, respectively) (Figure 3). Moreover, there was an 215 association between the logarithm of CAG repeats polymorphism and the changes in 216 11 total lean body mass (r=0.37, P=0.016) and the total lean body mass accumulated per 217 day during the time elapsed between the two measurements (r=0.35, P=0.024). 218 Logarithm of CAG repeats polymorphism was associated to the changes of VO2max 219 (absolute values) (r=0.34, P=0.03). 220 221 Discussion 222 This study shows that the CAG repeat polymorphism determines long-term changes in 223 fat mass in humans. Young subjects with short CAG had lower whole body and trunk 224 fat mass, and lower whole body lean mass compared to long CAG subjects. These 225 differences in body composition were maintained until adult age. More importantly, we 226 have shown that the CAGL is associated with increased whole body fat and lean mass 227 gain with growth than the CAGS genotype. 228 In agreement with our results at adolescent age, Mouritsen et al. based on cross-229 sectional data from 78 healthy Danish boys reported a greater body fat in CAGL 230 compared to CAGS group 7. Our results also agree with cross-sectional data obtained in 231 adult men reporting that the CAG repeat polymorphism is positively associated with 232 higher body fat content 2, 18, and lean mass 4. These associations could be due to 233 enhanced androgen sensitivity, since it has been shown that short CAG repeats are 234 associated to increased AR transactivation activity and stronger transcriptional potential 235 19. Thus, subjects with shorter CAG may have increased responsiveness to androgens 236 and this may results in lower accumulation of fat mass over the years. In agreement 237 with this interpretation, there is compelling evidence indicating that androgen 238 administration reduces fat mass, while in men reduced androgen levels are associated 239 with lower lean mass and greater fat mass 20-22. The observed increased lean mass in the 240 CAGL group is likely due to the higher fat mass, since it has been shown in 24 young 241 18 Figure legends 420 Figure 1. Histogram representing the number of subjects with each (A) CAG and (B) 421 GGN repeat number. 422 423 Figure 2. Levels of (A) total body fat (kg) for CAG and GGN groups at young and 424 adult age, (B) total body fat accumulation (g.day-1) for CAGS vs CAGL, and GGNS vs 425 GGNL groups and (C) maximal fat oxidation per kg of lean body mass (mg·kg-1·min-1) 426 for CAGS vs CAGL, and GGNS vs GGNL groups. *P<0.05 between short and long 427 groups without adjusting for any variable; ‡P<0.05 between short and long groups after 428 accounting for Tanner stage and VO2max. †P<0.05 between short and long groups after 429 accounting for MFO per kg of total lean mass and VO2max. #P=0.12 between short and 430 long groups using raw unadjusted data. Subjects were grouped as CAG short (CAGS) if 431 harboring repeat lengths of ≤21 and CAG long (CAGL) if harboring repeat lengths of 432 >21. The cutoff point for GGN short (GGNS) was GGN repeat polymorphism ≤23, 433 otherwise subjects were included in the GGN long (GGNL) group. Plotted values 434 correspond to raw unadjusted variables. 435 436 Figure 3. Graphical display of the partial correlation between the logarithm of CAG 437 repeat number with logarithm of total body fat at young (r=0.39, P=0.008) and adult age 438 (r=0.38, P=0.012). No significant differences were observed between the slopes of the 439 straight lines. 440 Table 1 . Subjects´ characteristics, body composition and physical fitness at young and adult age for short and long CAG groups. Young age Adult age CAGS (n) CAGL (n) CAGS(n) CAGL (n) Age 13.4 ± 3.8 24 12.1 ± 3.4 21 27.2 ± 4.3 24 26.1 ± 3.7 21 Height (cm) 156.9 ± 17.8 24 153.1 ± 17.6 21 178.2 ± 7.1 24 179.8 ± 7.5 21 Body mass (kg) 48.0 ± 15.1 24 51.3 ± 18.4 21 73.8 ± 12.4 24 89.9 ± 19.0 * 21 Body mass index (BMI) 18.9 ± 3.0 24 21.2 ± 4.2 * 21 23.2 ± 3.6 24 27.8 ± 5.4 * 21 Percentage of body fat (%) 19.0 ± 9.3 24 25.7 ± 10.9 * 21 19.2 ± 10.0 23 22.7 ± 9.8 † 19 Fat mass in the trunk region (kg) 2.8 ± 2.6 24 4.9 ± 3.4 * 21 6.8 ± 5.7 23 11.0 ± 8.2 * 19 Body fat mass (kg) 9.2 ± 6.1 24 12.9 ± 6.9 * 21 14.9 ± 9.6 23 21.8 ± 13.6 * 19 Lean body mass (kg) 36.3 ± 12.3 24 35.8 ± 14.7 ‡21 55.7 ± 6.4 23 64.5 ± 8.7 * 19 Lean mass arms (kg) 3.5 ± 1.4 24 3.5 ± 1.8 ‡21 6.4 ± 1.1 23 7.9 ± 1.5 * 19 Lean mass legs (kg) 12.3 ± 4.7 24 12.3 ± 5.7 ‡21 18.2 ± 2.3 23 20.9 ± 3.3 * 19 Lean mass extremities (kg) 15.9 ± 6.1 24 15.8 ± 7.5 ‡21 24.7 ± 3.1 23 28.8 ± 4.5 * 19 Maximal aerobic power VO2max (ml·min-1) 2.2 ± 0.8 24 2.3 ± 0.8 18 3.1 ± 0.6 24 3.8 ± 0.5 21 VO2max/Body mass (ml·kg-1·min-1) 47.9 ± 8.4 24 47.1 ± 6.1 18 42.6 ± 7.7 24 44.4 ± 9.3 21 VO2max/LBM (ml·kg-1·min-1) 62.7 ± 12.8 24 66.8 ± 9.3 18 55.4 ± 7.6 23 59.8 ± 8.3 19 VO2max/LML (ml·kg-1·min-1) 187.6 ± 38.8 24 199.8 ± 36.2 18 169.4 ± 22.2 23 185.2 ± 28.1 * 19 LBM: lean body mass; LML: lean mass legs. Subjects were grouped as CAG short (CAGS) if harbouring repeat lengths of 21 and CAG long (CAGL) if harbouring repeat lengths of >21. Body composition statistical analysis was done with logarithmic data * P < 0.05 without adjusting for any variable. ‡ P < 0.05 after adjusting for Tanner stage. † P < 0.05 after accounting for VO2max Table 2 . Subjects´ characteristics, body composition and physical fitness at young and adult age for short and long GGN groups. Young age Adult age GGNS (n) GGNL (n) GGNS (n) GGNL (n) Age 12.8 ± 4.0 30 13.0 ± 3.1 15 26.6 ± 4.3 30 26.8 ± 3.4 15 Height (cm) 153.6 ± 18.4 30 158.2 ± 15.9 15 178.7 ± 7.4 30 179.5 ± 7.1 15 Body mass (kg) 47.7 ± 16.7 30 53.1 ± 16.3 15 79.6 ± 17.5 30 84.7 ± 17.9 15 Body mass index (BMI) 19.6 ± 3.6 30 20.8 ± 4.0 15 24.9 ± 4.8 30 26.3 ± 5.4 15 Percentage of body fat (%) 20.9 ± 10.6 30 24.5 ± 10.4 ‡15 19.4 ± 9.8 27 23.2 ± 10.1 † 15 Fat mass in the trunk region (kg) 3.3 ± 2.8 30 4.8 ± 3.6 ‡15 7.8 ± 6.7 27 10.3 ± 7.8 † 15 Body fat mass (kg) 9.9 ± 6.4 30 12.9 ± 6.9 ‡15 16.6 ± 11.3 27 20.6 ± 13.1 † 15 Lean body mass (kg) 35.4 ± 13.9 30 37.5 ± 12.5 15 59.4 ± 9.0 27 60.1 ± 8.1 15 Lean mass arms (kg) 3.4 ± 1.6 30 3.7 ± 1.6 15 7.0 ± 1.4 27 7.2 ± 1.6 15 Lean mass legs (kg) 12.0 ± 5.3 30 12.9 ± 4.8 15 19.5 ± 3.3 27 19.4 ± 2.8 15 Lean mass extremities (kg) 15.4 ± 6.9 30 16.6 ± 6.2 15 26.6 ± 4.5 27 26.5 ± 4.0 15 Maximal aerobic power VO2max (ml·min-1) 2.2 ± 0.8 29 2.4 ± 0.7 13 3.4 ± 0.7 30 3.5 ± 0.6 15 VO2max/Body mass (ml·kg-1·min-1) 47.6 ± 7.6 29 47.5 ± 7.3 13 43.5 ± 8.4 30 43.4 ± 8.9 15 VO2max/LBM (ml·kg-1·min-1) 63.6 ± 12.2 29 66.1 ± 9.8 13 56.5 ± 8.7 27 59.1 ± 7.0 15 VO2max/LML (ml·kg-1·min-1) 192.5 ± 40.9 29 193.5 ± 31.0 13 172.4 ± 25.5 27 184.0 ± 26.0 15 LBM: lean body mass; LML: lean mass legs. Subjects were grouped as GGN short (GGNS) if harbouring repeat lengths of 23 and GGN long (GGN L) if harbouring repeat lengths of >23. Body composition statistical analysis was done with logarithmic data * P < 0.05 without adjusting for any variable. ‡ P < 0.05 after adjusting for Tanner stage and VO2max. †P < 0.05 after accounting for VO2max and MFO per kg of total lean mass. Table 3 . Changes in body composition, resting metabolic rate and maximal fat oxidation and androgen receptor polymorphism. CAGS (n) CAGL (n) GGNS (n) GGNL (n) Longitudinal data (changes) Time elapsed between the measurements (ys) 13.73 ± 0.57 24 13.93 ± 0.62 21 13.82 ± 0.61 30 13.83 ± 0.58 15 Body fat mass accumulated (g/day) 1.16 ± 1.52 23 1.61 ± 2.23 * 19 1.27 ± 1.68 27 1.53 ± 2.21 15 Trunk fat mass accumulated (g/day) 0.81 ± 0.95 23 1.13 ± 1.31 19 0.88 ± 1.07 27 1.09 ± 1.25 15 Lean body mass accumulated (g/day) 4.05 ± 2.34 23 5.77 ± 2.38 * 19 5.00 ± 2.63 27 4.52 ± 2.26 15 Energy expenditure tests Energy expenditure (IPAQ) (Mets-h/week) 72.66 ± 69.53 24 82.34 ± 45.24 21 77.40 ± 68.07 30 76.73 ± 36.64 15 Basal Fat Oxidation (mg/min) 79.55 ± 28.67 24 88.46 ± 32.10 21 87.94 ± 32.74 30 75.25 ± 23.47 15 Basal Fat Oxidation/LBM (mg·kg-1·min-1) 1.49 ± 0.55 23 1.42 ± 0.63 19 1.56 ± 0.62 27 1.29 ± 0.46 15 Basal Fat Oxidation/LML (mg·kg-1·min-1) 4.58 ± 1.74 23 4.41 ± 1.97 19 4.78 ± 1.97 27 4.01 ± 1.48 15 Basal Fat Oxidation/LML·Ht-2 (mg·kg-1·min-1) 14.58 ± 5.50 23 13.96 ± 6.07 19 15.15 ± 6.24 27 12.77 ± 4.36 15 Resting metabolic rate (Kcal·min-1) 1.16 ± 0.26 24 1.36 ± 0.31 * 21 1.29 ± 0.32 30 1.19 ± 0.24 15 Resting metabolic rate/LBM (kcal·kg-1·min-1) 0.021 ± 0.004 23 0.021 ± 0.005 19 0.022 ± 0.005 27 0.020 ± 0.005 15 Maximal Fat Oxidation (mg/min) 242.6 ± 100.6 24 332.8 ± 117.1 * 21 292.4 ± 136.2 30 269.1 ± 62.3 15 Maximal Fat Oxidation/LBM (mg·kg-1·min-1) 4.47 ± 1.48 23 5.30 ± 1.98 ‡19 5.02 ± 2.02 27 4.52 ± 1.11 15 Maximal Fat Oxidation/LML (mg·kg-1·min-1) 13.62 ± 4.50 23 16.31 ± 5.64 ‡19 15.25 ± 5.85 27 14.11 ± 3.71 15 Maximal Fat Oxidation/LML·Ht-2 (mg·kg-1·min-1) 43.62 ± 14.67 23 52.22 ± 18.57 19 48.75 ± 19.43 27 45.28 ± 11.29 15 LBM: lean body mass; LML: lean mass legs; Ht: height. Subjects were grouped as CAG short (CAGS) if harbouring repeat lengths of 21 and CAG long (CAGL) if harbouring repeat lengths of >21. The cutoff point for GGN short (GGNS) was GGN repeat polymorphism 23, otherwise subjects were included in the GGN long (GGNL) group.* P < 0.05 without adjusting for any variable. ‡ P < 0.12 without adjusting for any variable