Papel del metabolismo de la glutamina en el control de la sensibilidad a trail de células tumorales de mama.
Abstract
Desde su descubrimiento en 1995, TRAIL ha sido considerado como un ligando de muerte capaz de inducir selectivamente apoptosis en un amplio rango de células tumorales sin afectar a las células normales. Sin embargo, en estos años se ha observado que muchas células tumorales y especialmente de tumores de mama, muestran resistencia a este ligando de muerte. La causa de esta resistencia es diversa y puede producirse tanto a nivel extracelular, previo a la inducción de la señalización de TRAIL en el interior celular, como a nivel intracelular, por bloqueo de las rutas de señalización. Trabajos previos indicaban que la combinación de TRAIL con otros tratamientos que afectan al metabolismo tumoral podía ser una buena estrategia para vencer la resistencia de células tumorales de mama. La glutamina juega un papel importante en el metabolismo de las células tumorales a través de su contribución a la homeostasis redox, la bioenergética, la síntesis de macromoléculas y la señalización. Los cánceres de mama triple negativos (TNBC) son altamente metastásicos y están asociados con un mal pronóstico. Este tipo de cánceres todavía representan un reto importante en su tratamiento, siendo la quimioterapia convencional la única opción terapéutica. Curiosamente, diferentes estudios han demostrado que las células TNBC son dependientes de la glutamina exógena para su supervivencia y crecimiento. En este sentido, se han propuesto inhibidores del transporte y metabolismo de la glutamina como potenciales terapias antitumorales. En esta tesis hemos demostrado que la privación de glutamina produce un aumento de la expresión de los receptores TRAIL‐R2/DR5 y una bajada de los niveles de la proteína antiapoptótica FLIP en células TNBC, seguido de una sensibilización a la apoptosis inducida por TRAIL. La quinasa GCN2, cuya activación ocurre en respuesta a la falta de aminoácidos, es responsable de la inducción de la expresión de TRAIL‐R2 a través de una vía de señalización que implica a los factores de transcripción ATF4 y CHOP. Por el contrario, la bajada de los niveles celulares de FLIP tras la privación de glutamina en TNBC se produce por un mecanismo independiente de GCN2, en el que tiene lugar una inhibición general de la síntesis de proteínas, como consecuencia de la falta de aminoácidos no esenciales. Aunque el aumento de la expresión de los niveles de TRAIL‐R2 mediante la activación de la ruta de GCN2 puede contribuir a la sensibilización a TRAIL, los resultados obtenidos mediante interferencia de ARN demuestran que la reducción de los niveles de cFLIP es el evento responsable de la marcada sensibilización de las células TNBC a la apoptosis inducida por TRAIL tras privación de glutamina. Además, nuestros resultados demuestran que la inhibición farmacológica de las transaminasas aumenta los niveles de TRAIL‐R2 en membrana e inhibe la expresión de FLIP, sensibilizando a las células TNBC a TRAIL. Este último dato junto a otros obtenidos mediante el silenciamiento de enzimas clave implicadas en el metabolismo de la glutamina han permitido determinar la implicación de dicho metabolismo en la regulación de los niveles de FLIP y en la sensibilización a TRAIL. Por otro lado, la actividad glutaminasa de la enzima L‐asparraginasa (L‐ASNasa), utilizada en terapia antitumoral de leucemia linfática aguda, produce la sensibilización a TRAIL en las células TNBC. Los resultados obtenidos muestran que la L‐ASNasa provoca efectos similares a la privación de glutamina como son el aumento de los niveles de TRAIL‐R2 y la bajada de FLIP en las células TNBC. Por último, se ha llevado a cabo un estudio del papel del metabolismo de la glutamina en la sensibilidad de las células iniciadoras del cáncer de mama triple negativo, población responsable de la resistencia a las terapias convencionales y de la reaparición de los tumores. Los resultados obtenidos demuestran que este tipo de células también es dependiente de la glutamina extracelular para mantener la resistencia a TRAIL. Todos estos datos indican que el metabolismo de la glutamina podría ser una diana antitumoral en combinación con la activación de los receptores proapoptóticos de TRAIL en TNBC.
Full text
TesisDoctoral Papeldelmetabolismo delaglutaminaenel controldelasensibilidad aTRAILdecélulas tumoralesdemama MartaMauroLizcano 2018
Dr.AbelardoLópezRivas,ProfesordeInvestigacióndelConsejoSuperiordeInvestigaciones CientíficasymiembrodelCentroAndaluzdeBiologíaMolecularyMedicinaRegenerativa (CABIMER‐CSIC), CERTIFICA: Queeltrabajotitulado“Papeldelmetabolismodelaglutaminaenelcontroldelasensibilidad aTRAILdelascélulastumoralesdemama”presentadoporDoñaMartaMauroLizcano,para optaralGradodeDoctorporlaUniversidaddeSevilla,hasidorealizadobajosusupervisiónen elCentroAndaluzdeBiologíaMolecularyMedicinaRegenerativayreúne,asujuicio, originalidadycontenidossuficientesparaqueseadefendidoanteeltribunalcorrespondiente. Y,paraqueconstealosefectosoportunos,expidoyfirmoelpresentecertificadoenSevillaa17 deseptiembrede2018. Fdo.Dr.AbelardoLópezRivasFdo.Dr.DiegoRuanoCaballero DirectorTutordelaUniversidaddeSevilla
Amispadres
AGRADECIMIENTOS Despuésde5añosdedicadosaestatesisquieroagradecerelapoyoquemehandadolas personasquehanestadoamialrededorysinelquehubiesesidoimposibleterminarla, AmidirectordetesisAbelardopordarmelaoportunidaddepoderrealizarlaensulaboratorio, portodoloquemehaayudadoytodoloqueheaprendidoduranteestetiempo. AlSC4,atodaslaspersonasquehanpasadoporélenestosaños,conlasquesiemprehe podidocontarpararesolverdudas,paraecharmeunamanoconlosexperimentos,hasidouna maravillatrabajarconvosotros. Aloscompañerosdepasillosiempredispuestosaayudar,yalpersonaldelCABIMER,sobre tododemicroscopíaycitometríadondehepasadomuchotiempodeestatesis. AtodalagentequeheconocidoenSevilla,hamerecidomudarsesoloporconoceros. Amifamiliaporqueinclusoenlalejaníasoisungranapoyo. ¡Graciasatodos!
Índiceglobal ÍndicedecontenidosIII AbreviaturasVI Resumen1 Introducción4 Objetivos48 MaterialyMétodos50 Resultados: CapítuloI.RegulacióndelasensibilidadaTRAILencélulastumoralesde mamatriplenegativas(TNBC)porlaglutaminaextracelular.68 CapítuloII.Papeldelmetabolismodelaglutaminaenelcontroldela sensibilidadaTRAILdecélulastumoralestriplenegativasdemama.86 CapítuloIII.Elmetabolismodelaglutaminacomodianaantitumoralen combinaciónconTRAIL.98 Discusión: DiscusióncapítuloI.106 DiscusióncapítuloII.109 DiscusióncapítuloIII.112 Conclusiones114 Bibliografía117 Anexo138
I Índicedecontenidos
II ABREVIATURAS………………………………………………………………………………………………….VI RESUMEN............................................................................................................1 INTRODUCCIÓN 1. Muertecelular:significadobiológicoymecanismosinvolucrados..............5 1.1. Apoptosis…………………………………………………………………………………….6 1.2. Caspasas……………………………………………………………………………………..8 1.3. Rutasdeapoptosis………………………………………………………………………15 1.4. Necrosisprogramada:necroptosis……………………………………………….21 1.5. Autofagia……………………………………………………………………………………..22 2. Apo2L/TRAIL……………………………………………………………………………………………23 2.1. SeñalizaciónapoptóticadeTRAIL………………………………………………….25 2.2. RegulacióndelaapoptosisinducidaporTRAIL……………………………..27 2.3. Apo2L/TRAILcomoterapiaantitumoral………………………………………..29 3. Metabolismodelaglutamina…………………………………………………………………..31 3.1. Captacióndelaglutaminadelmedioextracelular…………………………31 3.2. Síntesisdenovodelaglutamina…………………………………………………..32 3.3. Glutaminacomofuentedenitrógeno……………………………………………32 3.4. Glutaminacomofuentedecarbono………………………………………………34 3.5. Efectodelaglutaminaenlahomeostasisredox…………………………….35 3.6. Laglutaminacomomoduladordevíasdeseñalizaciónydela expresióngénica……………………………………………………………………………35 3.7. Efectodeoncogenesygenessupresoresdetumoressobreel metabolismodelaglutamina…………………………………………………………36 3.8. Potencialterapéuticodeinhibidoresdelmetabolismodela glutamina………………………………………………………………………………………37 4. RutadeestrésGCN2‐ATF4‐CHOP………………………………………………………………39 4.1. QuinasasdeeIF2α………………………………………………………………………….40 4.2. SeñalizacióndeeIF2α…………………………………………………………………….41 5. Cáncerdemama……………………………………………………………………………………….43 5.1Tiposdecáncerdemama…………………………………………………………………43 5.2 Cáncerdemamatriplenegativo……………………………………………………….44 5.3Metabolismodelascélulasmadredelcáncerdemama…………………..46 OBJETIVOS…………………………………………………………………………………………………………….48 MATERIALYMÉTODOS………………………………………………………………………………………….50 1. Materiales…………………………………………………………………………………………………51 1.1. Cultivoscelulares……………………………………………………………………………51 1.2. Reactivos…………………………………………………………………………………………52
III 1.3. Anticuerpos…………………………………………………………………………………55 1.4. ARNdeinterferencia…………………………………………………………………..56 2. Métodos………………………………………………………………………………………………..56 2.1. Cuantificacióndelaapoptosis…………………………………………………….56 2.2. Medidadelaconcentracióndeproteínas……………………………………57 2.3. Inmunodeteccióndeproteínasporwesternblot…………………………57 2.4. ProduccióndeTRAILrecombinante……………………………………………..59 2.5. AnálisisdelosreceptoresdeTRAILenlasuperficiecelular………….60 2.6. TransfeccióntransitoriaconoligosdeARNdeinterferencia (siRNA)………………………………………………………………………………………..60 2.7. Producciónviral………………………………………………………………………….61 2.8. Infecciónviral……………………………………………………………………………..63 2.9. RT‐PCR…………………………………………………………………………………………63 2.10. RT‐Q‐PCR……………………………………………………………………………………..64 2.11. Ensayodemamosferas……………………………………………………………….65 2.12. Medidadelasíntesisdeproteínas………………………………………………66 2.13. Ensayodeclonogenicidad……………………………………………………………66 2.14. Análisisestadístico………………………………………………………………………66 RESULTADOS 1. CapítuloI.RegulacióndelasensibilidadaTRAILencélulastumoralesde mamatriplenegativas(TNBC)porlaglutaminaextracelular…………………….68 1.1. Sensibilizacióndecélulastumoralestriplenegativasdemamaala apoptosisporTRAILenmediodecultivocarentede glutamina……………………………………………………………………………………..68 1.2. PapeldelarutaGCN2/ATF4/CHOPenlaregulacióndelaexpresiónde TRAIL‐R2traslaprivacióndeglutamina…………………………………………74 1.3. LasensibilidadaTRAILnodependedelaumentodeTRAIL‐R2ydela rutaGCN2/ATF4/CHOP………………………………………………………………….78 1.4. LamodulacióndelosnivelesdeFLIPporlaglutaminaregulala sensibilidadaTRAILdelascélulasTNBC………………………………………..79 2. CapítuloII.Papeldelmetabolismodelaglutaminaenelcontroldela sensibilidadaTRAILdecélulastumoralestriplenegativasdemama………..86 2.1. ControldelasensibilidadaTRAILencélulasTNBCporelmetabolismo citosólicodelaglutamina…………………………………………………………….86 2.2. Lainhibiciónfarmacológicaygenéticadelmetabolismodela glutaminabajalosnivelesdeFLIPysensibilizanaTRAILalascélulas TNBC…………………………………………………………………………………………….89
IV 2.3. LainhibiciónfarmacológicaygenéticareducelosnivelesdeFLIPy sensibilizanalascélulasTNBC………………………………………………………..93 3. CapítuloIII.Elmetabolismodelaglutaminacomodianaantitumoralen combinaciónconTRAIL………………………………………………………………………………98 3.1. LaL‐AsparraginasasensibilizaalascélulasTNBCalaapoptosis inducidaporTRAIL………………………………………………………………………….98 3.2. EfectodelaprivacióndeglutaminaenlasensibilidadaTRAILde célulasmadredecáncerdemama…………………………………………………102 DISCUSIÓN 1. DiscusióncapítuloI…………………………………………………………………………………106 2. DiscusióncapítuloII………………………………………………………………………………..109 3. DiscusióncapítuloIII……………………………………………………………………………….112 CONCLUSIONES…………………………………………………………………………………………………..114 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………………………………117 ANEXO…………………………………………………………………………………………………………………138
2 Desdesudescubrimientoen1995,TRAILhasidoconsideradocomounligandodemuertecapaz deinducirselectivamenteapoptosisenunampliorangodecélulastumoralessinafectaralas célulasnormales.Sinembargo,enestosañossehaobservadoquemuchascélulastumoralesy especialmentedetumoresdemama,muestranresistenciaaesteligandodemuerte.Lacausa deestaresistenciaesdiversaypuedeproducirsetantoanivelextracelular,previoalainducción delaseñalizacióndeTRAILenelinteriorcelular,comoanivelintracelular,porbloqueodelas rutasdeseñalización.TrabajospreviosindicabanquelacombinacióndeTRAILconotros tratamientosqueafectanalmetabolismotumoralpodíaserunabuenaestrategiaparavencer laresistenciadecélulastumoralesdemama. Laglutaminajuegaunpapelimportanteenelmetabolismodelascélulastumoralesatravésde sucontribuciónalahomeostasisredox,labioenergética,lasíntesisdemacromoléculasyla señalización.Loscánceresdemamatriplenegativos(TNBC)sonaltamentemetastásicosyestán asociadosconunmalpronóstico.Estetipodecáncerestodavíarepresentanunretoimportante ensutratamiento,siendolaquimioterapiaconvencionallaúnicaopciónterapéutica. Curiosamente,diferentesestudioshandemostradoquelascélulasTNBCsondependientesde laglutaminaexógenaparasusupervivenciaycrecimiento.Enestesentido,sehanpropuesto inhibidoresdeltransporteymetabolismodelaglutaminacomopotencialesterapias antitumorales. Enestatesishemosdemostradoquelaprivacióndeglutaminaproduceunaumentodela expresióndelosreceptoresTRAIL‐R2/DR5yunabajadadelosnivelesdelaproteína antiapoptóticaFLIPencélulasTNBC,seguidodeunasensibilizaciónalaapoptosisinducidapor TRAIL.LaquinasaGCN2,cuyaactivaciónocurreenrespuestaalafaltadeaminoácidos,es responsabledelainduccióndelaexpresióndeTRAIL‐R2atravésdeunavíadeseñalizaciónque implicaalosfactoresdetranscripciónATF4yCHOP.Porelcontrario,labajadadelosniveles celularesdeFLIPtraslaprivacióndeglutaminaenTNBCseproduceporunmecanismo independientedeGCN2,enelquetienelugarunainhibicióngeneraldelasíntesisdeproteínas, comoconsecuenciadelafaltadeaminoácidosnoesenciales.Aunqueelaumentodelaexpresión delosnivelesdeTRAIL‐R2mediantelaactivacióndelarutadeGCN2puedecontribuirala sensibilizaciónaTRAIL,losresultadosobtenidosmedianteinterferenciadeARNdemuestranque lareduccióndelosnivelesdecFLIPeseleventoresponsabledelamarcadasensibilizacióndelas célulasTNBCalaapoptosisinducidaporTRAILtrasprivacióndeglutamina. Además,nuestrosresultadosdemuestranquelainhibiciónfarmacológicadelastransaminasas aumentalosnivelesdeTRAIL‐R2enmembranaeinhibelaexpresióndeFLIP,sensibilizandoalas
3 célulasTNBCaTRAIL.Esteúltimodatojuntoaotrosobtenidosmedianteelsilenciamientode enzimasclaveimplicadasenelmetabolismodelaglutaminahanpermitidodeterminarla implicacióndedichometabolismoenlaregulacióndelosnivelesdeFLIPyenlasensibilización aTRAIL. Porotrolado,laactividadglutaminasadelaenzimaL‐asparraginasa(L‐ASNasa),utilizadaen terapiaantitumoraldeleucemialinfáticaaguda,producelasensibilizaciónaTRAILenlascélulas TNBC.LosresultadosobtenidosmuestranquelaL‐ASNasaprovocaefectossimilaresala privacióndeglutaminacomosonelaumentodelosnivelesdeTRAIL‐R2ylabajadadeFLIPen lascélulasTNBC. Porúltimo,sehallevadoacabounestudiodelpapeldelmetabolismodelaglutaminaenla sensibilidaddelascélulasiniciadorasdelcáncerdemamatriplenegativo,poblaciónresponsable delaresistenciaalasterapiasconvencionalesydelareaparicióndelostumores.Losresultados obtenidosdemuestranqueestetipodecélulastambiénesdependientedelaglutamina extracelularparamantenerlaresistenciaaTRAIL. Todosestosdatosindicanqueelmetabolismodelaglutaminapodríaserunadianaantitumoral encombinaciónconlaactivacióndelosreceptoresproapoptóticosdeTRAILenTNBC.
4 III‐Introducción
5 1. Muertecelular:significadobiológicoymecanismos involucrados Lamuertecelularesunprocesobiológicofundamentalquejuegaunpapelclaveduranteel desarrolloembrionarioylaregulacióndelahomeostasistisularenorganismosadultos, mediantelaeliminacióndecélulasdañadasoqueyanosonnecesarias(Degterev&Yuan2008). EsunprocesodelquesetieneconocimientodesdequeCarlVogten1842lodescribieseenla espinadorsalycartílagoadyacentedeanfibios.Estamuertedescritaporlosprimeroshistólogos fuemástardedefinidacomounprocesonoaccidentalduranteelsigloXX,acuñándoseel terminoMuerteCelularProgramada(PCD,delinglésProgrammedCellDeath)porRichardA. Lockshinen1964,ensuestudiodeldañoproducidoenlosmúsculosintersegmentalesdelos gusanosdesedadurantelametamorfosis(Lockshin&Williams1964).Enestetiempoel embriólogoJohnW.SaundersJr.,tambiénreconocíalaexistenciadepatronesreproduciblesde muertecelularenembrionesdepollo(Saunders1966).Trasestosdescubrimientossefue caracterizandomorfológicamenteestamuertehastaqueunadécadadespuésseestablecióla primeraclasificación: MuertecelulardetipoI:caracterizadaporlacondensacióndelacromatina,laretracción depseudopodos,lareduccióndelcitoplasma,lafragmentaciónnuclear,ladivisiónsin pérdidadeintegridadfísicao“blebbing”delamembranaplasmáticaylafagocitosisde lacélula(apoptosis). MuertecelulardetipoII:caracterizadaporunamasivavacuolizacióndelcitoplasma (autofagia). MuertecelulartipoIII:caracterizadapornopresentarningunadelasmanifestaciones anteriores(necrosis). Sinembargo,enlosúltimosañosestaclasificaciónsehavueltomáscomplejayaquesehan añadidodiferentescaracterísticasmorfológicas,criteriosenzimáticos,aspectosfuncionaleso característicasinmunológicas.En2012,elComitédeNomenclaturadeMuerteCelular (NomenclatureCommiteeonCellDeath,NCCD)propusosustituirlaporunaclasificaciónmás objetiva. LaNCCDproponeclasificarlosdistintostiposdemuertecelularendosgrandesgrupos mutuamenteexcluyentes:MuerteCelularAccidental(ACD)oMuerteCelularRegulada(RCD).La
6 ACDseproduceporacciónseveradeagentesfísicos,químicosomecánicosynorequierela intervencióndeningunamaquinariamolecularespecífica.Estoprovocaquenopuedaser prevenidaomoduladay,portanto,noconstituyeunadianadeestudioparaeldesarrollode nuevasdianasterapéuticas.LaRCDesaquellaqueestéprogramadaono,suiniciacióno ejecuciónestamediadaporunamaquinariacelulardeterminada,yporlotantopuedeser modificadamedianteintervencionesfarmacológicasogenéticas.LaRCDserádenominada MuerteCelularProgramada(PCD)cuandoocurreenausenciadecualquierperturbación exógenayoperadentrodeunprogramafisiológicoparaeldesarrolloorenovacióndelostejidos. LaRCDtambiénpuedeoriginarseanteperturbacionesdelambienteextracelularointracelular. Cuandoestasperturbacionessondemasiadointensasoprolongadaseneltiempoparaquelas respuestasadaptativaspuedanhacerfrenteaesteestrésyrestaurarlahomeostasis celular(Galluzzietal.,2018). Enningúncasohayuneventobioquímicoquedeterminequelacélulaestásufriendounproceso demuertecelular,segúnlaNCCDunacélulaseconsideramuertacuandocumplealgunadelas siguientescaracterísticasmoleculares(Galluzzietal.,2012)(Galluzzietal.,2015): Perdidadelaintegridaddelamembranaplasmática,loqueimplicalapérdidadela identidadcelular. Fragmentacióncelularcompletadandolugaraloscomúnmentedenominadoscuerpos apoptóticos. Capturaydigestiónporcélulasadyacentesinvivoyposteriordegradaciónlisosomal. 1.1. Apoptosis Laapoptosisesunprocesofisiológicodemuertecelularprogramadaconservadoquetienelugar enorganismospluricelularessuperiorestantodurantesudesarrolloembrionariocomoenla faseadulta.Estemecanismopermitequeunacélulaanormalqueponeenriesgolavidadel organismoseaautodegradadadeformaregulada,seguraysinprovocardañoalascélulas colindantes(Ashkenazi2008). Kerr,WyllieyCurriefueronlosprimerosendescribirestetipodemuerteenladécadade1970, quesecaracterizabaporunacondensacióndelacromatina,lafragmentaciónnuclearyel “blebbing”delamembranaplasmática,acuñandoelterminoapoptosis(Kerr,Wyllie,&Currie 1972).Igualmentesedemostróenlosañosposterioresotroseventosbioquímicosdeestetipo
7 demuertecomolafragmentaciónnucleardelacromatinaenfragmentosmúltiplosde180pares debases,latranslocacióndelafosfatidilserina(PS)delacarainternaalaexternadela membranaplasmáticaylaexistenciadeproteínasimplicadasenelreconocimientoyfagocitosis delascélulasapoptoticas(Fadoketal.1992)(Wyllie,Kerr,&Currie1980).Mástarde,los estudiosdeHorvitzycolaboradoresenelnematodoCaenorhabditiselegansdemostraronque laapoptosiseraunprocesocontroladoporgenesespecíficosqueseejecutabademanera ordenada(Ellis&Horvitz1986)(Ellis&Horvitz1991).Losgenesdescubiertossedenominaron CED(delinglés,CellDeathAbnormal),yrápidamenteseidentificaronsushomólogosen mamíferos,aunqueelprocesoenestosúltimosesmuchomáscomplejo(Degterev&Yuan 2008). Contodoslosdatosobtenidossepudohacerunacronologíadeloseventosmorfológicosy bioquímicosqueseproducenduranteelprocesoapoptótico.Traslainduccióndelaapoptosis, seproduceunacondensacióndelcitosolycompactacióndelacromatinadandolugarala formacióndedensosagregadosquesedeslocalizanydesplazanhacialamembrananuclear. Posteriormente,sobrelacromatinaactúanlasendonucleasasquecortanelADNenlaregión internucleosómica.Almismotiempo,elretículoendoplasmáticosedilataoriginandounas vesículasquetiendenafusionarseconlamembranacelular,adquiriendounamorfologíatipo burbujaconocidacomo“blebbing”.Finalmente,lacélulasedivideenlosllamadoscuerpos apoptóticosquesonrápidamentereconocidosyfagocitadosporlosmacrófagosyotrascélulas vecinasloqueimpidelaexposicióndelmaterialcelularalsistemainmuneyportantouna respuestainflamatoria(Taylor,Cullen,&Martin2008)(Figura1).Elreconocimientodelas célulasapoptóticasporpartedelosfagocitossedebeaciertasseñales“eatme”queseexponen enlamembranaplasmáticadelascélulasapoptóticascomolaPSque,comohemosdicho anteriormente,enlasfasestempranasdelaapoptosissetranslocadesdelaregióninternaala externadelamembrana(Fadoketal.1992)(Fadoketal.1998).LaanexinaIesotraproteína queseexponeenlasuperficiedelacélulaapoptóticay,además,sepuedenproducir modificacionesenproteínasdemembranacomoICAM‐3yCD31,asícomocambiosenla composicióndeazúcaresyenlacargaeléctricadelasuperficiecelular(Henson,Bratton,&Fadok 2001)(Grimsley&Ravichandran2003).
8 Figura1|Etapasdelprocesodeapoptosis. Laapoptosisesclaveeneldesarrollodelostejidosysumantenimiento,asícomolaeliminación decélulasquedebenserreemplazadas,quenosenecesitanmásoestándañadas.Porello,su alteracióntantoporexcesocomopordefectopuededarlugaraciertaspatologíascomo desordenesneurodegenerativos(Alzheimer,Parkinson),cardiovasculares(muertecelulartras isquemiacardiaca),autoinmunes(diabetestipoI,lupuseritematoso,artritisreumatoide)o cáncer(Ashkenazi2008). 1.2. Caspasas Lascaspasassonloscomponentesenzimáticosprincipalesdelarespuestaapoptótica,cuya activacióneslaresponsabledetodosloscambiosmorfológicosquecaracterizanestetipode muerte.Lascaspasas(delinglés,Cysteine‐dependentASPartate‐directedProteASES)sonuna familiadeproteasasconcisteínaenelcentroactivoyespecificidaddecortetraslosresiduosde ácidoaspártico,muyconservadasevolutivamenteyampliamentereconocidasporsupapelen elcontroldelamuertecelularylainflamación(Green&Llambi2015)(Shalinietal.2015).
9 Estructurayclasificación. Sehandescrito11genesquecodificanpara11caspasashumanas,delacaspasa1ala10yla caspasa14.Estaúltimacaspasaseexpresaenqueratinocitos,estáimplicadaensu diferenciaciónynotiene,alparecer,ningúnpapelenlaapoptosiseinflamación(Pistrittoetal. 2002). Lascaspasasdemamíferossepuedenclasificaren2grandessubgruposbiendiferenciados funcionalmente:lascaspasaspro‐inflamatorias(caspasas‐1,‐4,‐5,‐11,‐12)queregulanla maduracióndelascitoquinasduranteelprocesoinflamatorioylascaspasaspro‐apoptóticas (caspasas‐2,‐3,‐6,‐7,‐8,‐9,‐10)lascualesinicianyejecutanelprocesodeapoptosis.Las caspasaspro‐apoptóticassedividenasuvezencaspasasiniciadoras,quesoncapacesde autoactivarse(caspasas‐2,‐8,‐9,‐10)ycaspasasefectoras,quenecesitanotracaspasaparasu activación(caspasas‐3,‐6,‐7).Estaclasificaciónpuedeserdemasiadosimplistayaquehay evidenciasqueindicanquelascaspasastienenmúltiplesfuncionesenotrosprocesoscelulares quenoseríanclasificadoscomopro‐apoptóticosopro‐inflamatorioscomomigracióny proliferacióncelular,regeneracióndetejidosodiferenciación.Además,laactivacióndelas caspasaspro‐inflamatoriaspuedeinducirapoptosisenalgunossistemas(Li&Yuan2008). Lascaspasassonsintetizadascomozimógenosquecontienenunprodominio,unasubunidad grande(p20)yunasubunidadpequeña(p10).Elcentrocatalíticodelacaspasaseencuentraen lasubunidadp20,setratadeunacisteína(Cys285)queformapartedeunasecuenciade aminoácidosmuyconservados“QACXG”.Lascaspasasreconocenasussustratosporalmenos cuatroaminoácidosP4‐P3‐P2‐P1,ycortandespuésdelaminoácidoC‐terminal(P1),que normalmenteesunresiduoaspártico.ElresiduoP3sueleserglutámico,ylosresiduosP2yP4 sonvariables,porloquelasecuenciadeespecificidaddecortedeunacaspasapuedeserX‐Glu‐ X‐Asp.Losaminoácidosdelaenzimaqueseunenalsustratoy,que,portanto,reconocenla secuenciaP4‐P3‐P2‐P1sedenominanS4‐S3‐S2‐S1.S1yS3sonresiduosmuyconservadosenlas diferentescaspasas,alcontrarioqueS2yS4,quevaríansignificativamenteentrelascaspasasy originanlasdiferentesespecificidadesporelsustratoenlasposicionesP2yP4(Li&Yuan2008). Laprincipaldiferenciaestructuralentreambostiposesquelascaspasasiniciadorasposeenun prodominioN‐terminaldegrantamaño(unos100aminoácidos)quepresentaunoodos dominiosdeinteracciónconproteínasadaptadoras:DED(delinglés,DeathEffectorDomain), queseencuentraenlacaspasa‐8y‐10,oCARD(delinglés,CaspaseRecruitmentDomain), presenteenlascaspasas‐2y‐9,aligualqueenlascaspasaspro‐inflamatorias‐1,‐4y‐6.
10 Porsuparte,lascaspasasefectoraspresentanunextremoN‐terminaldemenortamaño(menor de30aminoacidos)ynocontienedominiosDEDoCARD(Pop&Salvesen2009)(Figura2). Figura2|Estructuradelascaspasas.Adaptadode“Apoptosis:controlled demolitionatthecellularlevel”(TaylorRCetal.2008). Mecanismosdeactivación. Paralaactivacióndelascaspasasiniciadorasserequieresuhomodimerizaciónyaquese encuentrancomomonómerosinactivos.Ladimerizaciónsevefacilitadaporreclutadoresde caspasasqueseunenaplataformasdeactivación,yrequieredeunareorganizaciónespacialde lasubunidadgrandeypequeña,conlaposterioreliminaciónporproteólisisdelprodominio (Figura3).Trasunestímuloapoptóticocomolaunióndelligandodemuerteasureceptoroun estímulointracelularcomoeldañoalDNA,lascaspasassereclutanenestoscomplejos multiprotéicosatravésdesusdominiosDEDoCARDqueinteraccionanconlasproteínas
11 adaptadoras,incrementandosuconcentraciónanivellocalloquegeneraunadimerizaciónpor proximidadqueinducesuactivación.Cadacaspasatienesupropiaplataformadeactivación:el DISC(delinglés,DeathInducingSignallingComplex)quereclutayactivaalacaspasa‐8y‐10;el apoptosomaqueactivaalacaspasa‐9;yelPIDDosomaimplicadoenlaactivacióndelacaspasa ‐2. Estemodeloproponequeladimerizacióninduciríauncambioconformacionaltal,quesería suficienteparaformarelsitioactivoypermitirlaunióndesustratos,inclusoenausenciadelos cortesproteolíticos.Dehecho,laproteólisisinternanoactivaaestascaspasassinoqueesun eventosecundarioquefavorecelaestabilizacióndeldímeroactivoylaseñalizaciónpro‐ apoptótica.Lascaspasasefectoras,porsuparte,seencuentrancomohomodímerosinactivos quedebenserreconocidasycortadasporlascaspasasiniciadorasparaseractivadas(Figura3). Elprocesoproteolíticofavoreceunreordenamientoestructuralquehaceaccesibleelsitio activo,favoreciendolainteracciónconsussustratosylaseñalizaciónapoptótica(Green&Llambi 2015)(Pop&Salvesen2009)(Li&Yuan2008). Figura3|Estructuraymecanismodeactivacióndelascaspasas iniciadorasyefectoras.Adaptadode“Mitochondriaandcelldeath:outer membranepermeabilizationandbeyond”(Tait&Green2010).
18 EleventocentralquepermitelainiciacióndelaapoptosiseslaactivacióndeBakyBaxenla membranamitocondrialexterna.Baxseencuentraprincipalmenteenelcitosol,aunqueuna pequeñaporciónseencuentraviajandocontinuamentedelcitosolalamembranamitocondrial yviceversa,yaquelapresenciademiembrosantiapoptóticosBcl‐2oBcl‐Xenlamembrana mitocondrialimpediríasuacumulaciónyautoactivación.Porotrolado,Bakseencuentra inactivo,yancladoenlamembranaexternamitocondrial.Deestemodo,enrespuestaaun estímuloapoptótico,seproducelahomo‐oligomerizaciónyactivacióndeBaxyBakque conduciráalapermeabilizacióndelamembranaexternayalaliberacióndecitocromo‐cal citosol.Sinembargo,noexisteunmecanismoconsensoqueexpliquecómotienelugarla translocacióndeBaxalamitocondrianicomosedalaactivacióndeBaxyBak.Existen3modelos teóricosnoexcluyentesquetratandeexplicarlo.Elmodelodeactivacióndirectapostulaque ciertasproteínasBH3‐only(Bim,BidyPuma)seunentransitoriamenteaBaxyBakactivándolas deformaquelasotrasBH3‐onlysensibilizadoras(BadyNoxa)podríanunirseamiembros antiapoptóticosdelafamilia(Westphaletal.2011).Enelmodelodeactivaciónindirectase proponequelasproteínasBaxyBakseencuentransiempreunidasalosmiembrosBcl‐2anti‐ apoptóticosqueestaríanimpidiendosuactivación.Trasunestímuloapoptótico,lasproteínas BH3‐onlyseuniríanalosmiembrosanti‐apoptóticos,liberandoaBaxyBakypermitiendosu oligomerización(Willis2007).Porúltimo,enelmodelounificadolasproteínasanti‐apoptóticas estaríanimpidiendolaMOMPdedosmodos:secuestrandoalasproteínasBH3‐onlyactivadoras ysecuestrandoalasproteínasefectorasBaxyBakunavezactivadas(Llambietal.2011). Rutaapoptóticaextrínseca Larutaextrínsecaseiniciaenrespuestaaseñalesdeestrésextracelularquesondetectadasy transmitidasalinteriorcelularmediantereceptoresdemuerteespecíficos.Losreceptoresde muertesonunsubconjuntodentrodelafamiliadereceptoresdelfactordenecrosistumoral (TNF),eincluyenaTNFR1,FAS/CD95yTRAIL‐R(1‐2).Launióndelligandodemuerte(FAS/CD95L, TNFαyTRAIL)asusreceptoresespecíficosinducelaactivacióndeunaplataformadeactivación decaspasasiniciadorasqueprovocaraenúltimainstancialamuertecelular.Losreceptoresde muertesonproteínastransmembranadetipoIqueenelextremoN‐terminalextracelular presentandedosacuatrodominiosricosencisteína(CRD,delinglésCystein‐richDomain) implicadosenlauniónconsuligando.EnelextremoC‐terminalintracelularposeendominios específicosdenominadosdominiosdemuerte(DD,delinglésDeathDomain)esencialesparala
19 transmisióndelaseñalyqueactúancomositiosdeuniónparaelreclutamientodelasproteínas adaptadoras. LosligadosdemuertesonproteínastransmembranadetipoII,poseenunextremoC‐terminal enelespacioextracelularquepresentaundominiodehomologíaalTNFoTHD(delinglés,TNF‐ HomologyDomain)porelcualseunealreceptor(Bodmer,Schneider,&Tschopp2002).Los receptoresseencuentranformandohomo‐trímerosenlasuperficiecelularylasinteracciones necesariasparaformarestoscomplejosseproducenatravésdelosdominiosextracelulares ricosencisteínasPLAD(delinglés,PreligandAssemblyDomain)localizadosenelprimerCRDdel receptor(Clancyetal.2005)(Chan2007).Cuandoelhomotrímerodelligandodemuerteseune atresreceptoresdeFAS/CD95oTRAIL‐Rseproduceuncambioconformacionalquepermiteel reclutamientointracelulardelaproteínaadaptadoraFADD(delinglés,FasAssociatedDeath Domain)atravésdeunainteracciónDD‐DD.FADDademástieneundominioDEDquelepermite interaccionarconlapro‐caspasa8ydeestemodoformanelcomplejodeactivacióndemuerte DISC(delinglés,DeathInducingSignallingComplex). Sehanestablecidodostiposcelularesenfuncióndecómoseñalizanlosreceptoresdemuerte paraapoptosis(Figura8A).LascélulastipoIpromuevenapoptosisatravésdelaactivación directadelascaspasasefectoras‐3y‐7porlacaspasainiciadora.Porsuparte,enlascélulastipo II,laactivacióndelacaspasa‐8noessuficienteyaquelascaspasasejecutorasestáninhibidas porXIAPyportantolaapoptosisestábloqueada.Porello,necesitanlaactivacióndelaruta mitocondrialparalaconsiguienteactivacióndelascaspasasefectorasmedianteelbloqueode XIAPporproteínascomoSMAC/DIABLOliberadasdelamitocondria.Laconexiónentreambas rutasestamediadaporlaproteínaBH3‐only,Bid.Traslaactivacióndelacaspasa‐8enelDISC, estaserácapazdeprocesarBidgenerandosuformaactivatruncadatBid.Estaformaactivase translocaalamitocondriadondeinduceladimerizacióndeBaxyBakenlasuperficiedela membranamitocondrial. LaseñalizaciónqueseproduceatravésdeTNFR1esmáscomplejaypuededarlugaratres resultadosdiferentes:supervivencia,apoptosisynecrosis.Launióndelhomo‐trímerodeTNF alfaalreceptorTNFR1permitelaformacióndedoscomplejos,unoinicial(complejoI)que promuevelasupervivencia(Figura8B)yunsegundocomplejo(complejoII)queprovocamuerte celular(Figura8C).Launióndelligandoalreceptorpreviamentepreasociadoformandoun trímerodalugarauncambioconformacionalquepermiteelreclutamientodelaproteína adaptadoraTRADD(delinglés,TNF‐RAssociatedDeathDomain)atravésdeldominioDD.TRADD
20 noseunedirectamenteniactivaacaspasa8,sinoquereclutaproteínasadicionalescomoRIP1 (delinglés,Receptor‐interactingprotein1)atravésdelosdominiosdemuertepresentesen ambas.LaproteínaadaptadoraTRAF2(delinglés,TumornecrosisfactorReceptor‐Associated Factor2)ylasE3ubiquitinligasascIAP1/2tambiénsereclutanenelcomplejoI.Componentes deestecomplejo,incluyendoaRIP1,sonubiquitinadosporlascIAPsloqueculminaenla activacióndelarutadeseñalizaciónNF‐κByenunarespuestainflamatoria.Además,elcomplejo IpuedeactivarotrasrutasdeseñalizacióncomoJNKyp38.Cuandonoseproduceubiquitinación deRIP1porinhibicióndeubiquitinligasasenelcomplejoIoporunade‐ubiquitinacióndirecta porenzimascomoCYLD,RIP1formaráelcomplejoIIjuntoaFADD,TRADDypro‐caspasa‐8 dandolugaraapoptosis(Figura8C).LaisoformalargadeFLIPylapro‐caspasa‐8puedenformar unheterodímeroqueaunqueseacatalíticamenteactivonoinduceapoptosis.Sinembargo,la inhibicióndelacaspasa‐8permiteaRIP1reclutaraRIP3yformaruntercercomplejo denominadonecrosoma(Figura8C).RIP1fosforilaaRIP3loqueconducealafosforilaciónde MLKL(delinglés,MixedLineageKinase‐domain)quehacequeoligomericeysetrasloqueala membranaplasmática.Loqueenúltimainstanciaperturbalaintegridaddelamembranay promuevelanecroptosis. ABC Figura8|Rutaapoptoticadereceptoresdemuerte.Adaptadode“Cell deathsignalling”(Green&Llambi2015).
21 1.4. Necrosisprogramada:necroptosis Elterminonecrosishacereferenciaaunamuerteaccidentalproducidaporunaagresiónexterna, enlaquesepierdelaintegridadcelularyseproduceunasalidadeloscomponentes citoplasmáticosalmedioextracelular.Estamuertepuedeocurrircomoconsecuenciadeundaño queinterrumpelaintegridadcelularcomoaltatemperatura,congelaciónounestrésmecánico. Setratadeunamuertepasivaquenonecesitaningunaseñalizaciónparticular.Sinembargo, recientementesehademostradoquelamuertenecróticanosiempreesunprocesoaccidental ypasivosinoquetambiénpuederesultardeunacascadadeseñalizaciónfinamenteregulada (Golstein&Kroemer2007)(Bergheetal.2014)(Feoktistova&Leverkus2015). Lanecrosisreguladasedefinecomountipodemuertecelulargeneticamentecontroladay morfologicamentecaracterizadaporunagranulacióncitoplasmáticaacomañadadeun incrementoenelvolumencelularydelosorgánulos. ElmodelodenecroptosisinducidoporTNFαeslamuertepornecrosismejorestudiada.Launión deTNFα alreceptorTNFR1promuevesutrimerizaciónylaformacióndeuncomplejo intracelularformadoporTRADD,RIP1yTRAF2,estaúltimaproteínaadaptadorareclutaac‐IAP1 yc‐IAP2loquepermitelapoliubiquitinacióndeRIP1.Estecomplejodarálugaralaactivaciónde NF‐κBatravésdelaunióndelaquinasaTAKydeNEMO,lasubunidadreguladoradeIKK.TAK fosforilayactivaaIKK,lacualfosforilarámarcandoparasudegradaciónaIkB(inhibidordeNF‐ κB)loquepermitirálatranslocacióndeNF‐κBalnúcleodondeactivarálatranscripcióndegenes anti‐apoptoticoscomoFLIP,IAP‐1yIAP‐2(Eaetal.2006).SilaactivacióndeTNFR1coincidecon laausenciadec‐IAPs,conunainhibicióndelatraducciónoconladeubiquitinacióndeRIP1por ladeubiquitinasaCYLD,RIP1formaráelcomplejoIIqueprevienelainduccióndenecroptosise induceapoptosis.Sinembargo,sinoseproduceunaactivacióncompletadecaspasasose bloqueasuactividad,laproteínaRIP3esreclutadayseformaelnecrosoma.Trasunaseriede autoycros‐fosforilacionesquepermitenlaunióyactivacióndepseudoquinasaMLKLseproduce lanecroptosis.Estamuertepuedeserinhibidapornecrostatina1(Nec1)inhibidorespecíficode laactividadquinasadeRIP1(Linkermann&Green2014).Enlaactualidadsabemosquela necroptoispuedesertambiénindcidaporotrosreceptoresdemuertecomoFASyTRAIL‐R (Holleretal.2000),receptorestipoToll‐like(Kim,Ono,&Han2001)einfeccionesvirales (Linkermann&Green2014). Sehandescritootrasformasdeseñalizacióndenecrosis,peroalcontrarioquelanecrosis dependientedeRIPningunaestácompletamentecaracterizada.Porejemplo,laslesionespor isquemia/perfusióncausanmuertecelularcuandountejidosufreprivacióndesangreyluegose
22 restauraelflujo.Seproducenaltosnivelesdecalcioygeneracióndeespeciesreactivasde oxigenorelacionadosconestetipodenecrosisregulada(Halestrap&Pasdois2009).En neuronas,laaccióndelosreceptoresdeglutamatopuededarlugarauntipodenecrosis denominadaexcitotoxicidad(Wang&Qin2010). 1.5. Autofagia Laautofagiaesunprocesocatabólicoatravésdelcualproteínas,macromoléculasyorgánulos dañadosodelargavidasedegradanyreciclanenloslisosomas.Sehandescritotrestiposde autofagia:macroautofagia,microautofagiayautofagiamediadaporchaperonas(CMA).La macroautofagia,enlosucesivodenominadaautofagia,esfundamentalparalahomeostasis tisularyunarespuestaacondicionesestresantes.Losnivelesbasalesdeesteprocesoson importantesparamanteneralascélulaslibresdeagregadosproteicostóxicosyproteínasmal plegadasyseelevanenrespuestaaestrés.Laalteracióndeestetipodemuerteseveasociada condiversostrastornoshumanos,comoinfecciones,cáncer,enfermedadesneurodegenerativas ymusculares. LaautofagiaestáreguladaporlasproteínasAtg,delascuales,hastalafecha,sehanidentificado másde30.Lasproteínasligadasalaautofagiaseorganizanencomplejosfuncionalesque participanencadaunodelospasosdelaautofagia,quesonesencialesparaelproceso.Este procesoseiniciacuandounapartedelcitoplasma,incluidoslosorgánulos,estárodeadaporuna fagóforoomembranadeaislamientoparaformarunautofagosoma.Losautofagosomas finalmentesefusionanconloslisosomasysucontenidosedegradaporlashidrolasas lisosomales.Losproductosdeesteprocesodigestivo(aminoácidos,ácidosgrasosynucleótidos) seliberanalcitoplasmamediantepermeasaslisosómicas(Boya,Reggiori,&Codogno 2013)(Figura9)parasuutilizaciónenreaccionesbiosintéticas. Variascascadasdeseñalizaciónmodulanlaautofagiaenrespuestaanumerosasseñales celularesyambientalescomoprivacióndenutrientes,presenciaoausenciadeinsulina,factores decrecimiento,hipoxiaoestrésenelretículoendoplasmático.Lavíadeseñalizaciónmás conocidaeslaquesedesencadenaatravésdemTOR,enparticularenelcomplejoI(mTORC1), queregulanegativamentelaautofagiaenrespuestaacambiosnutricionalesyfactoresde crecimiento(Parzych&Klionsky2014).
23 Laautofagiaesgeneralmenteconsideradacomounmecanismodesupervivencia,porloquesu clasificacióndentrodelostiposdemuertesueledeberseaunintentofallidodesuperarun estrésletal.Lamuertecelularautofágicasecaracterizaporausenciadelacondensacióndela cromatinayunamasivavacualizacióndelcontenidocitoplasmático.Además,sueleproducirse unaconsiderablemovilizacióndelípidosenformadevesículasolipiddropletsyunadilatación delretículoendoplásmicoylascisternasdelaparatodeGolgi(Kroemer&Levine2008). Figura9|Mecanismodeautofagia.Adaptadode“Anoverviewof autophagy:morphology,mechanism,andregulation”(Parzych&Klionsky 2014). 2. Apo2L/TRAIL TRAILfueidentificadoen1995comounnuevomiembroapoptóticodelafamiliadeTNF.Setrata deunaproteínatransmembranatipoII,quepuedeserprocesadaproteolíticamenteensu dominioextracelularliberandounligandosolublede24KDaalamatrizextracelular.Tantola formatransmembranacomoelligandosolublepuedeinducirapoptosisenunagranvariedadde líneascelularesdecáncersinafectaralascélulasnormales,yademás,tantoensolitariocomo encombinaciónconquimioterapia,muestraunasignificativaactividadantitumoralenmodelos murinosxenoinjertadosdecáncer(Almasan&Ashkenazi2003) LosligandosdelafamiliadelTNFαpuedenmataracélulasquetienereceptoresespecíficosy estánpreparadasparalamuerte.Lascélulasquesonobjetivodeestosligandosdemuerteestán preparadasparalamuerteapoptóticacomopartedesuprogramadediferenciaciónnormalo debidoadaño,infecciónotransformaciónoncogénica.Dehecho,lafunciónbiológicamás destacadadelosreceptoresdemuerteysusligandosessuparticipaciónenlaregulacióny actividaddelsistemainmune.AunqueelARNmensajerodeTRAILestápresenteenlamayoría
24 detejidos,laproteínaseexpresaprincipalmenteencélulasdelsistemainmunecomolinfocitos, monocitos,célulasdendríticasycélulasnaturalkiller(NK)dependiendodelestadode estimulación(Fangeretal.1999)(Kayagakietal.1999). TRAILpuedeunirseacincoreceptores:cuatrotransmembranayunosoluble.Losreceptores transmembranasonproteínasdetipoIdelafamiliadereceptoresdeTNF,yaligualqueTRAIL, seexpresanconstitutivamenteenlamayoríadetejidosytiposcelulares(Figura10). Dosdelosreceptorestransmembrana,TRAIL‐R1/DR4yTRAIL‐R2/DR5,actúancomoreceptores agonistas,contienendominiosCRDextracelularatravésdeloscualesinteraccionanconla moléculadeTRAILtransmitiendoasílaseñalapoptótica. Losotrosreceptores,TRAIL‐R3/DcR1yTRAIL‐R4/DcR2,sonreceptoresdecoyotrampayaque TRAILsepuedeuniraellosperoactuaríancomoreceptoresantagonistasynotransmitiríanla señaldebidoaquenotienendominiosDDintracelularesopresentanunaformatruncada. TambiénhaymodelosquesugierenqueTRAIL‐R4podríaactivarlarutadeNF‐κBbloqueandola señalizaciónapoptótica.Noobstante,elpapelfisiológicodeestosdosreceptoressiguesiendo controvertidoysufunciónpodríadependerdeltipocelular. OPGporsuparteesunmiembrosolubledelasuperfamiliadeTNFcuyafunciónestárelacionada conlaremodelaciónóseaatravésdelainhibicióndeRANKL(delinglés,ReceptorActivatorNF‐ κB)(Laceyetal.2012),tambiénsehadescritoquepuedeinteractuarconTRAIL(Emeryetal. 1998).LaaplicaciónexógenadeOPGrecombinanteescapazdeinhibirlaapoptosisinducidapor TRAIL(Miyashitaetal.2004).Sinembargo,labajaafinidadentreTRAILyOPGatemperaturas fisiológicasponeendudaestainteracción(Trunehetal.2000).Además,ningúnestudioinvivo contratamientoslargosconTRAILadosiselevadashamostradoanomalíasóseasqueesloque seesperaríasilainteracciónOPG‐TRAILtuvieserelevanciafisiológica.Portodoello,elpapelde estainteracciónestodavíaincierto(Lemkeetal.2014).
25 Figura10|ReceptoresdeTRAIL.Adaptadode“GettingTRAILbackontrack forcáncertherapy”(Lemkeetal.2014). 2.1. SeñalizaciónapoptóticadeTRAIL LaformaactivadeTRAILesunhomotrímeroquepuedeunirseatresreceptores simultaneamente.Estosreceptorespresentanunátomodezinccentralqueinteracciona covalentementecontresresiduosdecisteínalocalizadosenlaposición230decadamonómero deTRAILyesesencialparasuestabilidad,solubilidadybio‐actividad(Bodmeretal. 2000)(Hymowitzetal.2000)(Trabzuni,Famulski,&Ahmad2000). LaunióndeTRAILasusreceptoresproapoptóticosdesencadenadirectamentelacascada apoptóticamediantelaformacióndelcomplejodemuerteDISC,quecontienecomomínimoa FADDyC8(Wallachetal.1997)(Kischkeletal.2000).Traslaunióndelligandoalosreceptores demuerteseproduceuncambioconformacionaleneldominiointracelulardelosreceptores (Scotteta.l2009)(Wangetal.2010)quepermiteelreclutamientodelaproteínaFADDporsu dominiodemuerte.EstaproteínaasuveztieneundominioDEDporelquereclutaacaspasa‐ 8,‐10ycFLIP.Loshomodímerosdecaspasa‐8y‐10seactivanporautoprocesamientoyunavez liberadosdelDISCactivanalascaspasasefectorasporproteólisis(Figura11).Siempreseha consideradoquelosprincipalescomponentesqueformanelDISCseencuentranen proporciones1:1.Sinembargo,recientementesehadescritounnuevomodeloenelquelas proporcionesdeTRAIL‐R:FADD:Caspasa‐8/cFLIPseríande3:1:9,deestemodo,lasmoléculas
26 decaspasa‐8interaccionaríansecuencialmenteatravésdesusDED,originandounacadenade activacióndecaspasas(Dickensetal.2012). TRAILtambiénpuedeactivaralarutamitocondrialdeapoptosismedianteelprocesamientode laproteína“BH3‐only”Bid,elcualsetraslocaensuformatruncadaalamembranaexternade lamitocondriadondeinducelaoligomerizaciónyactivacióndeBakyBax. Figura11|SeñalizacióndeapoptosisinducidaporTRAIL.Adaptadode “GettingTRAILbackontrackforcáncertherapy”(Lemkeetal.2014).
27 2.2. RegulacióndelaapoptosisinducidaporTRAIL LaapoptosisinducidaporTRAILseencuentrameticulosamentereguladaanivelestempranos desuseñalización,aniveldemembrana,controlandolaexpresiónylocalizacióndelos receptores;oaniveldelDISC,controlandolaactivacióndelacaspasa‐8mediantelaproteína cFLIP. Encuantoalaexpresiónylocalizacióndelosreceptoresenlasuperficiecelular,sehadescrito quelasmodificacionespost‐transduccionalescomolaglicosilaciónolapalmitoilaciónson importantesmoduladores.LaO‐glicosilacióndeDR4yDR5incrementalaestabilidaddelos receptoresenmembrana,previniendolaendocitosisyfacilitandolatraslocacióndelos receptoresagrupadosparaelensamblajedelDISCylaactivacióndelacaspasa‐8(Wagneretal. 2007).LaS‐palmitoilaciónpuedeinducirlalocalizacióndeTRAIL‐R1enloslipid‐raftsysuhomo‐ oligomerización(Rossinetal.2009).Lapresenciadelosreceptoresenloslipid‐rafs, microdominioslocalizadosenlamembranacelularquesecaracterizanporpresentarunaalta concentracióndeesfingomielina,esfingolípidosycolesterol(SimonsandIkonen1997)(Brown andLondon1998),constituyenunmecanismoesencialparalaseñalizacióneficientedeTRAIL. Cuandolosreceptoresselocalizanenestaszonasdelamembranasefacilitasuagregacióntras unióndelligando. Lainternalizacióndelosreceptorestambiénjuegaunpapelimportanteensuregulación.Esta internalizaciónmediadaporclatrinalimitalaseñalizaciónyreducelaactivacióndecaspasas.Sin embargo,laescisiónmediadaporcaspasa8deladaptadordeclatrinaAP2acontrarrestala internalización(Austinetal.2006)(Kohlhaasetal.2007).Porotraparte,E‐cadherinainteractúa conDR4yDR5,acoplaaestosreceptoresalcitoesqueletodeactinaatravesdelaα‐cateninalo queaumentaelensamblajedeDISC(Luetal.2014).Cuandolascélulastumoralespasanporla transiciónepitelio‐mesénquimaregulannegativamentelaexpresióndelaE‐cadherina,loque lashacemásresistentesalaactivaciónapoptóticaporDR4yDR5. EncuantoalaregulacióndelaseñalizacióndeapoptosisporTRAILaniveldelDISC,suprincipal reguladorenestepuntoeslaproteínacFLIP.cFLIPesunaproteínamultifuncionalconun importantepapelenprocesoscelularescomoapoptosis,necroptosis,autofagiaeinflamación (Safa2012).Ademástambiénparticipaenlainmunidadinnatayadaptativa,yduranteel desarrolloembrinario(Wuetal.2015)(Dillonetal.2016).Supapelenlarutaextrínsecacomose hacomentadoanteriormente,dependedequeisoformaseuneacaspasa‐8.FLIPSyFLIPR actúancomosimplesinhibidoresdelaprocaspasa‐8yaqueinhibenlaformacióndesus
34 3.4. Glutaminacomofuentedecarbono Laglutaminatambiénesunaimportantefuentedecarbononecesariaparalabioenergéticayla biosíntesisdemoléculas.Unaaltaproliferaciónesasociadaconunaltoflujodecarbonodela glutaminahaciaelcicloTCA.EnelTCAnosoloseestánobteniendoNADHyFADH2tambiénse estánformandoprecursoresparalasíntesisdemoléculas.Así,porejemplo,lamayoríadel citratoformadoenTCAseexportaelcitosoldondeseconvierteenacetyl‐CoA,unprecursorde lasíntesisdeácidosgrasosycolesterol(Metalloetal.2012)(Mullenetal.2012).Deigualmanera, eloxalacetato(OAA)seusaparalasíntesisdeaspartatoyasparragina.Lavíaporlaqueentrael carbonoderivadodelaglutaminaenelTCAesenformadeα‐KG.Paraellopreviamenteseha formadoapartirdelglutamato,porlaaccióntantodelastransaminasascomodelaglutamato deshidrogenasa(GDH),quesoloseencuentraenlarutametabólicamitocondrialdelaglutamina (Figura13)(JiZhang,Pavlova,&Thompson2017)(Still&Yuneva2017). Figura13|Laglutaminacomofuentedecarbono.Adaptadode“Cancer cellmetabolism:theessentialroleofthenonessentialaminoacid, glutamine”(JiZhang,Pavlova,&Thompson2017).
35 3.5. Efectodelaglutaminaenlahomeostasisredox Laglutaminatambiénestáimplicadaenelmantenimientodelbalanceredox.Porunaparte,el glutamatoquesehaformadoapartirdeglutaminaesutilizadoparalasíntesisdenovode glutation(GSH),unpotenteantioxidanteformadoporeltripeptidoglutamato‐cisteína‐glicina. Laglutamato‐cisteina‐ligasa(GCL)condensaelglutamatoconcisteínaenunareacción dependientedeATPgenerandoγ‐glutamilcisteina,lacualescondesadaconglicinaatravésde laglutatiónsintetasaparaformarelglutatión(Lu2009).Sehadescritoquelaprivaciónde glutaminareducelasreservasdeglutatiónpresentesenlacélula(Yunevaetal.2007).Una segundavíaporlaquelaglutaminacontribuyealaformacióndelglutatiónesgraciasal transportadorxCTdelamembranaplasmáticaporelcualentraunamoléculadecistinagracias alasalidadeunamoléculadeglutamato.Dentrodelacélulalasdosmoléculasdecisteínaque formanlacistinapodránincluirseenlaformacióndelglutatión.Porúltimo,tambiénpermitela produccióndeNADPHquepuedenrevertirelestadooxidadodelglutatión(GSSG). 3.6. Laglutaminacomomoduladordevíasdeseñalizaciónydela expresióngénica LosaminoácidosserequierenparalaactivacióndemTORenelcomplejomTORC1(delinglés, mammaliantargetofrapamycin)queregulalatraduccióndeproteínas,elcrecimientocelulary laautofagia.mTOResunaserina/treoninaquinasayensituacionesdondeelambienteesrico enaminoácidosmTORestáactivoyseactivalasíntesisdeproteínasyseproducelainhibición delaautofagia.Cuandoenelmedioextracelularhayfaltadeaminoácidosseactivalaautofagia, lacualreciclaloscomponentescelularesyproporcionaaminoácidosdemaneraalternativaala célula.Además,sehadescritoquelasalidadeglutaminaintracelularylaentradadeleucina extracelularatravésdeltransportadorbidireccionalSLC7A5permitelaactivacióndemTOR.La inhibicióndeestetransportadorimpideelcrecimientocelularyactivalaautofagia(Nicklinetal. 2009). Porotraparte,lapresenciadeglutaminayleucinaenlacélulapermitelaformacióndeα‐KG mediantelaglutaminolisis,activándoselaGTPasaRagquesetranslocaallisosomayactivaa mTORenelcomplejomTORC1(Duránetal.2012).
36 Recientesestudiosdemuestranquelaglutaminaextracelulartienetambiénunafunciónen señalizacióncelularmediantelaactivacióndelfactordetranscripciónSTAT3loquepromueve laproliferacióntumoral(Cacaceetal.2017)(CacaceAetal.2016).Además,otrosestudios conectanelmetabolismodelaglutaminaconlavíadeseñalizaciónNOTCHenleucemialinfática aguda(ALL).Deestaforma,lainhibicióndelaglutaminolisisydelaautofagiaaumentaelefecto delasterapiasanti‐NOTCHenestaleucemia(Herranzetal.2015). Laglutaminatambiénpuedeafectaralaepigéneticadelacélula,dadoqueelα‐KGactúacomo cofactordedemetilasasdehistonasquecontienenundominioJumonji.Lafaltadeglutaminay, portanto,labajadadelosnivelesdeα‐KG,conllevalainhibicióndelasdemetilasas.Estose traduceenunahipermetilacióndehistonasquesuprimelaexpresióndegenesimplicadosen diferenciación(Kinnairdetal.2016). 3.7. Efectodeoncogenesygenessupresoresdetumoressobreel metabolismodelaglutamina Diversosestudiosdemuestranqueelmetabolismodelaglutaminaestáreguladoporoncogenes ygenessupresores.cMycesunproto‐oncogenqueregulaproliferaciónyestimulalaexpresión degenesrelacionadosconelmetabolismo.Seharelacionadoclaramenteconelconsumode glutaminaporlacélulaysumetabolismo,pudiendounirsedirectamenteapromotoresgénicos yestimularlaexpresióndegenescomoeltransportadordeglutaminaSLC1A5.cMyctambién puedepromoverdemaneraindirectalaexpresióndelaglutaminasareprimiendolaexpresión demiR‐23a/b(Gao2009).TodasestasfuncionesdeMychacenque,enciertaslíneastumorales, lasobreexpresióndeMycinduzcaunfenómenodedependenciadeglutaminaextracelularyque laausenciadeesteaminoácidopuedaprovocarlamuertecelularporapoptosis(Yunevaetal. 2007). Krasesunadelasmutacionesoncogénicasmásfrecuentesennumerosostumores,provocando enlacélulaunareprogramacióndelmetabolismoqueincluyeunaumentodelflujoglicolítico, adicciónalaglutamina,autofagiaymacropinocitosis(Bryantetal.2014).Porello,tumoresque expresanKrasnecesitanalaglutaminaparasucrecimientoyaquepermiteelincrementodelos nivelesdecarbonoynitrógenorequeridosparalasíntesisdemacromoléculas(Gaglioetal. 2009).
37 p53esunimportantereguladortranscripcionalysupresordetumoresqueestátambién implicadoenlaregulacióndelmetabolismodelaglutamina.p53inducelaexpresióndeGLS2,lo queconllevaelincrementodelosnivelesdeGSHylareduccióndelosROS,inhibiendoasíla tumorogénesis.Alparecer,GLS1yGLS2tienenfuncionesopuestasentumorogénesisaunque losdostienenelmismopapelenelmetabolismodelaglutaminaenlaconversióndeglutamina aglutamato.MycinducelaexpresióndeGLS1mientrasquep53lohacedeGLS2.Unposible mecanismoqueexplicaestadiferenciadepapelespuedeserlaacciónnoenzimáticadeGLS2. DiversosestudioshandemostradoqueGLS2suprimelametástasisencélulasde hepatocarcinomaatravésdelainhibicióndelaexpresióndelfactordetranscripciónSnailode actividadGTPasadeRac(Kuoetal.2017)(Zhangetal.2016).Además,GLS1yGLS2tienen diferentesestructurasyestánsujetosadiferentesmecanismosderegulación(Curthoys1995). ParaconocerendetalleestasdiferentesfuncionesdeGLS1yGLS2esnecesariounestudiomás profundodelmecanismoquediferenciaaestasdosisoformasentumorogénesis. 3.8. Potencialterapéuticodeinhibidoresdelmetabolismodela glutamina Dadalaimportanciadelmetabolismodelaglutaminaenlahomeostasiscelularysu desregulaciónenprocesoscancerígenos,sehaconvertidoenlosúltimosañosenunadiana interesanteparanuevasterapiasoncogénicas.Miméticosdelaglutaminacomola6‐diazo‐5‐ oxo‐L‐norleucina(DON)olaacivicinasehanevaluadoenensayosclinicospero,apesardesus prometedoresefectosinvitro,todosestoscompuestoshanmostradotoxicidadeneltracto gastrointestinal,encélulasinmunesyenelsistemanerviosocentraldebidoasuinhibiciónno selectivadelmetabolismo(Ahluwaliaetal.1990).Enlabúsquedadeinhibidoresmásselectivos losestudiossecentraronenlaGLS,cuyaactividadsueleestardesreguladaendiversostumores. AesterespectosehandesarrolladoinhibidorescomoelBPTES,elcompuesto968oel compuestoCB‐389,siendoesteúltimoelúnicoquehapasadoaunafaseclínica(Grossetal. 2014)(Leetal.2012)(Stalneckeretal.2015).Sinembargo,comosehacomentado anteriormenteGLS2puedetenerunpapelsupresordetumores(Huetal.2010).Igualmente,el inhibidornoselectivodelasaminotransferasas,elaminoxiacetato(AOA),muestracitotoxicidad enestudiospreclínicosentumoresmamariosderatónyxenoinjertos(Korangathetal.2015) (Figura14).
38 Otroenfoqueparalautilizacióndelmetabolismodelaglutaminacomodianaterapéuticaha sidolareduccióndelosnivelesdeglutaminaensangre.LaL‐asparraginasa(L‐ASNasa)queseha usadorutinariamenteenleucemialinfáticaaguda(ALL),catalizaladeaminaciondela asparraginaydelaglutaminaloqueprovocaladisminucióndeestosaminoácidosensangre. Duranteañoslautilizacióndeestaenzimasehacentradopreferentementeensucapacidadpara eliminarlaasparraginaenelmedioysutratamientocontradiversostumoresquenecesitaneste aminoácido(Kidd1953)(Broome1963)(Krishnapura,Belur,&Subramanya2016). RecientementeseestádemostrandoquealgunosdelosefectosantitumoralesdelaL‐ASNasa dedebenasuactividadglutaminasa.Esporelloqueseevaluóestaactividadcomoterapia anticancerígena.Apesardeunosresultadospreclínicosprometedores,enalgunospacientesse haobservadociertatoxicidadenelsistemanerviosocentralyunarespuestaantitumoral deficiente(Lanvers‐Kaminsky2017).Apesardequelaactividadglucosidasanopareceuna opcióneneltratamientodepacientes,parececlaroquelaactividadglutaminasaesesencial paraelefectoantileucémicodelaL‐ASNasa,yaquelascélulaspuedensintetizarasparraginaa partirdeácidoaspárticoydeglutamina.LareduccióndeglutaminaprevienelaresistenciaaL‐ ASNasa(Lorenzietal.2013).Tambiénsehadescritoquelaprivacióndeglutaminamedianteel tratamientoconL‐ASNasaencélulasdeleucemiamieloideaguda(AML)provocamuertepor apoptosistraslainhibicióndemTORydelasíntesisdeproteínas(Willemsetal.2013).
39 CLASEDROGAS ESTATUS MiméticodelaglutaminaDON Acivicina Efectosinespecíficos Toxicidad DeplecióndeglutaminaL‐Asparraginasa AprovadoporlaFDAparael tratamientodeALL Efectosinespecíficos Toxicidad Inhibidoresdelaglutaminasa968 BPTES Ensayospreclínicos Inhibidoresdelas aminotransferasas AOA Usadoclínicamenteparatratar tinnitus Tóxicoaaltasdosis Inhibidoresdelaglutamato deshidrogenasa EGCG Ensayospreclinicos Figura14|Inhibidoresdelmetabolismodelaglutaminaysuaplicación entratamientosclínicos.Adaptadode“Glutamineandcancer:cellbiology, physiology,andclinicalopportunities”(Hensley,Wasti,&Deberardinis 2013)y“FromKrebstoclinic:glutaminemetabolismtocancer therapy”(Altman,Stine,&Dang2016) 4. RutadeestrésGCN2‐ATF4‐CHOP Trasdiversosestímulosdeestrés,laseñalizacióncelularconvergeenlafosforilacióndela subunidadαdelfactor2deiniciacióndelatraduccióndeARNmensajeroseneucariotas(eIF2α). Estafosforilaciónseproduceenelresiduodeserina51yproducelainhibicióngeneraldela síntesisdeproteínasyasuvezpermitelatraduccióndeARNmensajerosquetienenunpapel importanteenlarespuestaaestrés.Porestemotivo,lafosforilaciónyposteriorseñalizaciónse hadenominadorespuestaintegraldeestrésoIRS(delinglés,integratedstress response)(Hardingetal.2003).Elresultadodeestaseñalizaciónpuedeserunarespuesta adaptativaolainduccióndelamuertecelularporapoptosis,aunqueelmecanismoqueconduce aestasrespuestasfinalesestáaúnporelucidar.Enestesentidosehasugeridoqueladuración ynivelesdefosforilacióndeeIF2αpuedendeterminarlasupervivenciaomuertedelacélula (Donnellyetal.2013).
40 4.1. QuinasasdeeIF2α LafosforilacióndeeIF2αestáacargodecuatroquinasas:PERK(delinglés,PKR‐likeERKinase), PKR(delinglés,proteinkinasedoublé‐strandedRNA‐dependent),GCN2(delinglés,general controlnon‐derepressible‐2),yHRI(delinglés,heme‐regulatedinhibitor).Aunqueentodasellas existensimilitudesenlosdominiosquinasaresponsablesdelafosforilacióndeeIF2α,poseen característicasúnicasquepermitensuregulacióndiferencialbajodiferentesestímulos(Figura 15).Cadaquinasaseactivabajodiferentestiposdeestrésyjueganunpapelimportanteenla respuestaainfecciones,bajosnivelesdenutrientesydegruposhemoyproteotoxicidad.Por tanto,tienenunpapelrelevanteenprocesoscomolasinfeccionesvirales,elcánceroel desarrolloembrionario. PERKesuncomponenteindispensablederespuestaaproteínasmalplegadas(UPR,delinglés unfoldedproteinresponse).LaUPResunarespuestaadaptativaquecoordinalaexpresiónde chaperonas,enzimasydiferentescomponentesdelretículoendoplasmáticopararestaurarla funcióndelRE.AunquelafuncióndelaUPResayudaralacélulaasuperarelestrés,bajo condicionesdeunestrésseveropuededesembocarenapoptosis(SchröderandKaufman2005). LaUPRsepuedeiniciarportresproteínaspresentesenlamembranadelretículo:IRE1(del inglés,inositol‐requiringkinase1),ATF6(delinglés,activatingtranscriptionfactor6)yPERK. LaregiónN‐terminaldePERKseencuentraenellumendelREunidaalachaperonaBiP,actúa comosensordelestadodeplegamientodeproteínasenelREycontienelosdominiosde dimerizaciónyregulación.LaregiónC‐terminalescitoplasmáticayesdondeseencuentranel dominioquinasaylossitiosdeautofosforilación.Laacumulacióndeproteínasmalplegadasen elREprovocaladisociacióndeBiPdePERKloquellevaasudimerizaciónyautofosforilacion,y porúltimoasuactivación(Koromilas2015)(Harding,Zhang,&Ron1999). GCN2esunsensordelafaltadeaminoácidosyunreguladordeloscambiosenlaexpresión génicaenrespuestaaprivacióndeaminoácidos.Tambiénsehadescritosuactivaciónpor privacióndeglucosa,infecciónviraloradiaciónUV.LaestructuradeGCN2esmáscomplejaque ladelrestodequinasas.Muestraundominioquinasa,undominiopseudoquinasayundominio HisRS(delinglés,histidyl‐tRNAsynthetase‐relateddomain)elcualtienemayorafinidadporlos ARNtnocargadosqueloscargadosconelaminoácidocorrespondiente.CuandolosARNtno cargadosseacumulanporprivacióndeaminoácidosesenciales,seunenaldominioHisRSde
41 GCN2loqueprovocaladimerizacióndeGCN2ysuautofosforilación,yportantosuactivación (Kilbergetal.2005)(Devaletal.2009). PKRfueinicialmentedescritacomounaquinasaquefosforilabaaeIF2αenrespuestaauna infecciónviral,quebloqueabalatraduccióndeARNmensajerosviralesypromovíalaapoptosis enrespuestaalainfecciónviral.Sinembargo,parecequetambiénjuegaunpapelenrespuesta aestrésenelretículoyestrésoxidativo(Galluzzietal.2008)(Cole2007). HRIparticipaendosprocesosfisiológicos.Porunladoregulalasíntesisdeglobinassegúnla cantidaddegrupohemo,yporotroladopromuevelasupervivenciaenlosprecursoresde eritrocitoscuandolosnivelesdehierrosonbajos(Chen2007).Tambiénestáimplicadoen respuestaaestréscomolainhibicióndelproteosoma(Yerlikaya,Kimball,&Stanley2008)ola exposiciónaarsénico(Lu,Han,&Chen2001). Figura15|EstructuradelasquinasasdeeIF2α.Adaptadode“Rolesofthe translationinitiationfactoreIF2α serine51phosphorylationincancer formationandtreatment”(Koromilas2015). 4.2. SeñalizacióndeeIF2α ElfactordeiniciaciondelatraduccioneIF2estáformadoportressubunidades:α,βyγ.Elinicio delatraducciónrequierelauniónaeIF2deunamoléculadeGTPyelARNt‐Metdeiniciación paraformaruncomplejoqueseuniráalasubunidaddelribosoma40Sylosfactoresdeiniciación delatraduccióneIF1,eIF1AyeIF3.Todosellosformanelcomplejodepreiniciacion43S(Lorsch &Dever2010).TrasestoelGTPunidoaeIF2eshidrolizadoaGDPloqueprovocaquepierda afinidadporelARNt‐Met.Conelfindevolverasuestadoactivo,elGDPseintercambiaporGTP
42 graciasalaactividadGEF(delinglés,guanineexchangeactivity)deeIF2B.Elaumentoenla fosforilacionenlaserina51delasubunidadαconstituyeunmecanismodecontroldela traducciónencélulasexpuestasaunestrés.CuandoeIF2‐GDPesfosforiladoensusubunidadα porunadelasquinasasquehemosmencionadoantes,seconvierteenuninhibidordeeIF2B, porloquelosnivelesdeeIF2‐GTPcaenyseinhibelatraducción(Proud2001)(Figura16).Apesar delainhibicióngeneraldelatraducción,lafosforilacióndeeIF2αprovocalatraduccióndeARNm defactoresdetranscripciónresponsablesdelarespuestaadaptativaalestréscomoeselcaso deATF4.Elmecanismoquepermitelatraduccióndeestosfactoressebasaenlapresenciade marcoscortosdelecturaaguasarriba(uORFs)enlaregión5´UTRqueimpidensutraducciónen condicionesnormales.EnpresenciadeniveleselevadosdeeIF2α‐GTPsetraducentodoslos uORFsyseinhibelatraduccióndelORFdeATF4.Enrespuestaaestrés,seproducela fosforilacióndeeIF2αqueralentizalatraduccióndelosuORFsporloquesolollegaatraducirse elfragmentocorrespondienteaATF4.ATF4porsupartepuedefavorecerlaexpresiónde factoresdetranscripciónrelevantesenlarespuestaadaptativacomoCHOPoTRB3.(Ye& Koumenis2009). Figura16|RegulacióndeliniciodelatraducciónporeIF2α.Adaptadode “RolesofthetranslationinitiationfactoreIF2αserine51phosphorylation incancerformationandtreatment”(Koromilas2015)
43 5. Cáncerdemama 5.1. Tiposdecáncerdemama Elcáncerdemamaesunadelasprincipalescausasdemuerteenmujeres(Ferlayetal.2018). Setratadeunaenfermedadmuycomplejacondiferentescaracterísticasbiológicase implicacionesclínicas.Unodelosmayoresretosclínicosesencontraruntratamientoefectivo dadasugranheterogeneidad.Marcadoresclásicosdeinmunohistoquimicacomolapresenciao ausenciadelreceptordeestrógeno(ER)ydelreceptordeprogesterona(PR)ylasobreexpresión delreceptordelfactordecrecimientoepitelialhumano2(Her2/Neu),juntoconlastradicionales variablesclinicopatológicascomoeltamañoyelgradotumoralolaimplicaciónganglionar,se hanusadoconvencionalmenteparaclasificareltumoryhandeterminadoeltratamientoy pronósticodelpaciente.Sinembargo,losanálisisgenéticosactualeshanabiertounanuevavía paralaclasificacióndeltumorysuposteriortratamiento,yaquedemuestraquelarespuesta deltumornosebasaencaracterísticasanatómicas(Daietal.2015).Integrarlanueva informaciónadiferentesniveleshallevadoaunaumentodelossubtipos,ampliandola heterogeneidaddeestetipodecáncer.Diversosestudiosdeexpresióngenéticapermitieron clasificarelcáncerdemamaen5subtiposintrínsecos:luminalA,luminalB,tumoresque sobreespresanHer2,basalynormal(Sorlieetal.2001)(Z.Huetal.2006).Aunqueestaesla clasificaciónestándarotrosgruposhandesarrolladootrasclasificaciones(Fanetal. 2006)(Sotiriouetal.2003).Apesardetodo,lostumoresdemamaquesesuelendiagnosticarse puedenagruparentresgrandesgrupos:luminales,tumoresquesobreexpresanHer2ytumores triplenegativos,estosúltimossonlosmásheterogéneosylamayoríaseenglobaríaenelsubtipo basal. Lostumoresdetipoluminalexpresanreceptoreshormonalesconperfilesdeexpresiónque recuerdanalepitelioluminaldelamama(Perouetal.2000).Existenalmenosdossubtipos: luminalAyluminalBdondeAexpresaER+PR+HER2‐yBexpresaER+PR+HER2+,aunqueno siempreesasí(Vallejosetal.2010).ElsubtipoAmuestramayorexpresióndelosgenes relacionadosconERymenosexpresióndegenesrelacionadosconproliferaciónqueelsubtipo B,estosúltimostienesmayorgradoenlaprogresióntumoral.Lostumoresluminalessonlos máscomunes,siendoenlamayoríadeloscasosdesubtipoA.Generalmenteestostumores tienesunbuenpronósticosiendosignificativamentepeorenelcasodelsubtipoB,tambiénla recurrenciaespeorenestesubtipo(Sorlieetal.2001).Porúltimo,respondenbienalaterapia hormonalnoasíalaquimioterapiaconvencional(Brentonetal.2005).
50 V‐MaterialyMétodos
51 1. Materiales 1.1. Cultivoscelulares Línea Celular EspecieCaracterísticas/Origen Medio Cultivo Procedencia BT474HumanaEpitelial/Cáncerde mama RPMI1640 completo ATCC BT549HumanaMesenquimal/Cáncer demama DMEM completo+ 20mM glucosa ATCC MCF‐7HumanaEpitelial/Cáncerde mama DMEM competo ATCC MDA‐ MB231 HumanaMesenquimal/Cáncer demama RPMI1640 completo Dr.Joaquín Arribas(Vall d´Hebron, BCN) MDA‐ MB231 pBABEØ HumanaMesenquimal/Cáncer demama RPMI1640 completo Producidasen ellaboratorio MDA‐ MB231 pBABEFLIP L HumanaMesenquimal/Cáncer demama RPMI1640 completo Producidasen ellaboratorio MDA‐ MB436 HumanaMesenquimal/Cáncer demama DMEM‐F12 completo ATCC MDA‐ MB468 HumanaEpitelial/Cáncerde mama DMEM completo ATCC MDA‐ MB468 shSCR HumanaEpitelial/Cáncerde mama DMEM completo Producidasen ellaboratorio. MDA‐ MB468 shTRAIL‐ R2/DR5 HumanaEpitelial/Cáncerde mama DMEM completo Producidasen ellaboratorio. T47DHumanaEpitelial/Cáncerde mama RPMI completo+ 20mM glucosa ATCC
52 Abreviaturas: ATCC:AmericanTypeCultureCollection. Completo:10%desuerofetalbovino(FBS),2mMdeL‐glutamina,100µg/mlde estreptomicinay500Udepenicilina. Todaslascélulassemantuvieronenunincubadorhumidificadoa37ºC,conuna atmósferade5%deCO2y95%deaire. 1.2. Reactivos Mediosdecultivoysuplementos ProductoCasacomercial/Referencia DMEMSigma‐Aldrich/REF:D5546 DMEM‐F12Sigma‐Aldrich/REF:D6421 RPM11640Sigma‐Aldrich/REF:M8403 DMEMF‐12sinrojofenolGibco/REF:21041‐025 B27Gibco/REF:17504‐044 FBS(Suerofetalbovino)Sigma‐Aldrich/REF:F7524 GPS(L‐ glutamina/Penicilina/Estreptomicina;en solución) Sigma‐Aldrich/REF:G1146 L‐glutaminaSigma‐Aldrich/REF:G3126 L‐asparraginaSigma‐Aldrich/REF:A0884 Antibióticos(Penicilina‐Estreptomicina;en solución) Sigma‐Aldrich/REF:P0781 PuromicinaSigma‐Aldrich/REF:P7255 GlucosamonohidratadaMerck‐Millipore/REF:1.08342.1000 Reactivos ProductoCasacomercial/Referencia Acrilamida/Bissolution29:1Biorad/REF:161‐0156 AgarosaLOWEEOApplichemPanreac/REF:A2114.0250 APSSigma‐Aldrich/REF:A3678 BSA(seroalbuminabovinafracciónV)ApplichemPanreac/REF:A65880050 CompleteproteasecocktailRoche/REF:11836153001 ECL(ChemoluminiscentHRPsubstrate)Millipore/REF:WBKL50500 MembranasdetransferenciadePVDF 0,45µm Immobilion‐Millipore/REF:IPVH00010 Metanol(paraactivarlamembranade transferencia) ApplichemPanreac/REF:221091.1612
53 Streptavidina‐AgarosaSigma‐Aldrich/REF:S1638 TEMEDSigma‐Aldrich/REF:T9281 Drogaseinhibidores ProductoDescripciónConcentraciónCasa comercial/Referencia 6‐Diazo‐5‐oxo‐L‐ norleucina Antagonistadela glutamina.Puede inhibirdiversas enzimasdesu metabolismo,entre ellaslaglutaminasa. 50μMSigma‐Aldrich/REF:D2141 AcivicinaInhibealagamma glutamiltransferasa. 450μMSantaCruz/REF:SC‐ 200498 Aminooxiacetato Inhibidordelas transaminasas. 1mM Sigma‐ Aldrich/REF:C13408 BPTESInhibidordela glutaminasa. 20μMSigma‐ Aldrich/REF:SML0601 Bromurode etidio Agenteintercalante deDNA. 1µMSigma‐Aldrich/REF:E8751 Cicloheximida Inhibidordela síntesisgeneralde proteínasen eucariotas 5µg/mlSigma‐Aldrich/REF:C7698 Compuesto968Inhibidordela glutaminasa 10μMMerck/REF:352010 Dimetil2‐ oxoglutarato Intermediariodel ciclodeKrebs 5mMSigma‐ Aldrich/REF:349631 DHARMAFECTReactivode transfecciónde siRNA 2,5µl/transfec ción Dharmacon‐Thermo scientific/REF:T‐2001‐03 Epigalocatequina galato Inhibidordela glutamina deshidrogenasa 50μM N‐AcetilD‐ Glucosamina Intermediariodela rutadelas hexosaminas 20mMSigma‐Aldrich/REF:A8625 InosinaIntermediariodelas rutasdesíntesisde ácidosnucleicos 2,5mM Sigma‐Aldrich/REF:I4125 Iodurode propidio IntercalantedeADN yARNdedoble cadena.Utilizado comocolorantepara lamedidadelciclo 40μg/mlSigma‐Aldrich/REF:P4170
54 celularporcitometría deflujo. L‐AsparraginasaEnzimacon capacidadpara eliminarla asparraginayla glutaminadelmedio. Seutilizacomo tratamientode ciertostiposde leucemia 0.5U/mlSigma‐Aldrich/REF:A3804 N‐Acetil–L‐ cisteina Molecula antioxidante 10mM Sigma‐Aldrich/REF:A7250 Soluciónde nucleósidos100X 1XMerck‐Millipore/REF:ES‐ 008‐D Polybrene (sequabrene) Agenteanti‐ heparina.Empleado parapotenciarla infecciónconretro‐y lentivirus 8μg/mlSigma‐Aldrich/REF:S2667 RapamicinaInhibidordemTOR (mTORC1) 500nMLC‐ laboratories/REF:R50002 5M Soluciónde aminoácidosno esenciales Sigma‐Aldrich/REF:7145 OrotatoIntermediariodelas rutasdesíntesisde ácidosnucleicos 2,5mM Sigma‐Aldrich/REF:O2750 Torina1InhibidordemTOR (mTORC1ymTORC2) 250nMTocris/REF:4247 Transcriptasa reversa‐MLVRT Enzimaquepermite lasíntesisdeuna cadena complementariade DNAapartirdeuna secuenciadeDNAo RNAdecadena simple 200U/ul(ulpor reacción) Gibco/REF:28025013
55 1.3. Anticuerpos Anticuerposprimariosparawesternblot AntígenoPeso Molecular (KDa) Origen/TipoDiluciónCasa Comercial Referencia 4E‐BP115Conejo/PC1:1000Millipore07‐1416 P‐4E‐BP115Ratón/MC1:1000Millipore AKT60Conejo/PC1:1000Cell Signaling 9272 P‐AKT (Ser345) 60Conejo/PC1:1000Cell Signaling 9271S ATF438/55Conejo/PC1:1000SantaCruzSC‐200 Caspasa8‐ XMS 53/55‐ 42/44‐18 Conejo/PC1:1000Donadopor Dr.Gerald Cohen ‐ CHOP (D46F1) 27Conejo/PC1:1000Cell Signaling 5554S eIF2α (D7D3) 38Conejo/PC1:1000Cel Signaling 5324S P‐eIF2α 38Conejo/PC1:1000Cel Signaling 3597 FADD24Raton/MC1:1000BD‐ Pharmigen 610178 FLIP(7F10)55/28Ratón/MC1:1000ENZOALX‐804‐ 961‐0100 GAPDH37Ratón/MC1:40000SantaCruzSC‐47724 GCN2150Ratón/MC1:1000SantaCruzSC‐374609 P70S6K70Conejo/PC1:1000Cell Signaling 9202S P‐P70S6K (Thr389) 70Ratón/MC1:1000Cell Signaling 9206S PERK140Conejo/PC1:1000Cell Signaling 3192S TRAIL‐ R2/DR5 48Cabra/PC1:1000R&D Systems AF631 Anticuerposcitometríadeflujo AntígenoOrigen/Tipo DiluciónCasa Comercial Referencia IgG‐PERatónIgG2,5 μl/muestra BD‐ Pharmigen 554680
56 TRAIL‐ R1/DR4‐PE (CD262) RatónIgG2,5 μl/muestra Biolegend307206 TRAIL‐ R2/DR5‐PE (CD262) RatónIgG2,5 μl/muestra Biolegend307406 Anticuerpossecundariosparawesternblot Losanticuerpossecundariospoliclonalesconjugadosconperoxidasaderábano(HRP) fueronadquiridosalacasacomercialDAKO. 1.4. ARNdeinterferencia ARNdeinterferencia Secuencia5´‐3´ ATF4GCCUAGGUCUCUUAGAUGAdTdT CHOPpool(1‐2‐3‐4)AGGGAGAACCAGGAAACGGAA ACGGCUCAAGCAGGAAAUCGA AAGGAAGUGUAUCUUCAUACA CAGCUUGUAUAUAGAGAUUGU FLIPCUUUGGGUGAUCUACGUUAdTdT GCN2CAGCAGAAAUCAUGUACGAUU GLS#1AAGAGUGUAUGGAUAUGUUAdTdT GLS#2AAGUGCUAAAAGCAGUCUGGdTdT GOT1#1GGGCUUCCUGAAUGAUCUGdTdT GOT1#2GCUAAUGACAAUAGCCUAAAUdTdT GOT1#3GCGUUGGUACAAUGGAACAAAdTdT GOT2GGGACACCAAAUAGCAAAAAdTdT GPT2CGAGUGUGGUUACAGAGGAdTdT GSGAUUGGACCUUGUGAAGGAdTdT PERKCAAACUGUAUAACGGUUUAdTdT ScrambledcontrolGAGCGCUAGACAAUGAAG 2. Métodos 2.1. Cuantificacióndeapoptosis Laapoptosissecuantificóporcitometríadeflujomedianteladeteccióndecélulas hipodiploides.Paraellosesembraron250.000célulasporpocilloy,traseltratamiento
57 correspondiente,serecogieroncontripsina.Sefijaronypermeabilizaroncon900μlde unasolucióndeetanolfríoal70%,agitandosuavementeenelvortexeincubando5 minutosenhielo.Despuésdelavar,seañadieron250μldePBS1Xy250μldesoluciónde extraccióndeADN(0´2MNa2HPO4,0´1MácidocítricoenPBS;pH7´8)yseincubaron10 minutosa37ºC.Acontinuación,ytraslavarlas,lascélulasfijadasseresuspendieronen 250μldesoluciónPI/RNasa(100μg/mlRNasa,40μg/mldeIodurodePropidioenPBS) yseincubarondurante30minutosa37ºCenoscuridad.Lascélulasapoptóticas hipodiploidessedetectaronycuantificaronenlapoblacióndelciclocelularconmenor contenidoenADNquelascélulaselpicoG1(subG1).Lacitometriadeflujofuerealizada enuncitómetroFACScalibur,utilizandoelprogramaCellQuestPro(BectonDickinson, MountainView,CA,USA)paraelanálisisdelosdatos. 2.2. Medidadelaconcentracióndeproteínas Conelfindecuantificarlacantidaddeproteínasquesehabíaobtenidotrasrecogerlas células,seutilizaronlosreactivosdeBioRad(Hercules,CA,USA):Bio‐RadDcProtein AssayReagentA,ByS.ParaellosehizounacurvapatrónconBSAdesde1μg/mlhasta 8μg/ml,sobrelacualseextrapolaronlosvaloresobtenidosdelasmuestrasyseobtuvo laconcentracióndeproteína.Enprimerlugar,seañadieron5μldemuestra(ouna cantidadmenor,perosiemprecompletandohasta5μlconeltampónenqueestuviera diluídalamuestra),acadapocillodeunaplacade96pocillosdefondoplano.Enelcaso delblanco,seañadieron5μldeltampón.Acontinuación,seañadieron25μldela SoluciónA(1mldeSoluciónA+20μldeSoluciónS).Posteriormenteseañadieron200 μldelreactivoB.Sedejóincubando15minutosatemperaturaambienteysemidióla densidadópticaaunalongituddeondade750nmenellectordeplacasVarioskanFlash (TermoElectronCorporation). 2.3. Inmunodeteccióndeproteínasporwestern‐blot Paraelanálisisdelaexpresióndeproteínasporwestern‐blot,lascélulasfueron sembradasenplacasde6pocillosaunadensidadde250.000célulasporpocillo.Trasel tratamiento,seaspiróelmediodecultivoylamonocapacelularselavóunavezconPBS 1Xfrío.Unavezlavadasyenfrío,seañaden30‐60μldebufferTR3porcadapocillo,se lisanlascélulasutilizandounscrapperquerasparálamonocapayelvolumendelisisde
58 cadapocilloesrecogidoentuboeppendorfparacadacondición.Cadamuestraes sonicadadurante10segundosenmodoconstanteyal10%deamplitud.Acontinuación, seseparan5μldemuestrapararealizarlacuantificaciónproteicayalrestoseleañade un10%deunasolucióndeazuldebromofenol:β‐mercaptoetanolenproporción1:1o azuldebromofenol:aguaenproporción1:1encasodequelasmuestrasnorequieran agentereductor.Enestemomento,lasmuestraspuedenserconservadascongelándolas a‐20ºC. Unavezcuantificadalacantidaddeproteínapormuestra,estassehirvierona95ºC durante5minutosylasproteínassesepararonmedianteelectroforesisenungelde SDS‐poliacrilamidaencondicionesdesnaturalizantes,aunporcentajedel7,5%,10%o 12%dependiendodelpesomoleculardelaproteínaadetectar. ParalapreparacióndelgelseutilizóLowerBuffer(1),UpperBuffer(2),acrilamida,agua, APS(Ammoniumpersulfate,Sigma‐Aldrich)yTEMED(Sigma‐Aldrich).Laelectroforesis serealizóenRunnigBuffer(3),aunvoltajeconstantede150voltiosdurante1hora aproximadamente.LasproteínasdeestegelsetransfirieronaunamembranadePVDF (Inmobilon,Millipore),previamentetratadasconmetanolymantenidasentampónde transferencia1X(100mldetampóndetransferencia10X(4),200mldeetanolyhasta 1000mldeH2O)mediantelatécnicadetransferenciasemisecaconelsistemaTrans‐Blot Turbo(BioRad)a25voltiosconstantes,1Amperiodurante20minutos. LamembranasebloqueóconunasoluciónPBS0’1%Tween20(PBS/Tween)con5%de lecheenpolvoduranteunahoraatemperaturaambiente.Posteriormenteselavóla membranaconPBS‐Tweenyseincubóconelanticuerpocorrespondientedurante1 horaatemperaturaambiente,oa4ºCdurantetodalanoche,enagitación.Trasla incubaciónconelanticuerpo,selavólamembrana3vecesconPBS‐Tweendurantecinco minutoscadalavado,yseincubódurante1horaatemperaturaambienteconuna soluciónPBS‐Tween5%delecheenpolvoyelanticuerposecundariocorrespondiente, quellevaacopladolaperoxidasadelrábanopicante(HRP).Denuevosehicierontres lavadosdecincominutoscadaunoconPBS‐Tweenyseincubólamembranaconel reactivoECL(Millipore)durantecincominutos,traslocualserevelómediante quimioluminiscencia.
59 Tamponesutilizados: 1) LowerBuffer4X(pH8,8)2)Upperbuffer4X 90,85gTris‐base(Roche)6,06gTris‐base 20mlSDS10%(Sigma‐Aldrich)4mlSDS10% Aguahasta500mlAguahasta100ml 3) RunnigBuffer5X(pH8,3)4)Bufferdetrasferencia10X 15gTris‐base58gTris‐base 72gGlicina29gGlicina 5gSDS3,7gSDS Aguahasta1litroAguahasta1litro 2.4. ProduccióndeTRAILrecombinante ElTRAILrecombinantefueproducidoapartirdeunplásmidocedidoporlaDra.Marion MacFarlane(MCRToxicologyUnit.UniverisityofLeicester,UK)quecontienela secuenciaquecodificaparaTRAILrecombinante(aminoácidos95‐281)insertadaen BamHI/XhoIdelvectorpET‐28b(+)conresistenciaakanamicinayunacoladeseis histidinasparafacilitarlapurificacióndelaproteínarecombinante(MacFarlaneetal., 1997).SetransformaronbacteriasBL21con1‐2μgdeADNporchoquetérmicoyse crecieronenmedioLB(Luria‐Bertani),con20mMdeglucosay30μg/mldekanamicina. Cuandoelprecultivoalcanzóladensidadópticade0,6‐0,8alalongituddeondade 600nmseindujolasíntesisdelaproteínarecombinanteañadiendoalcultivo0,5μMde IPTG(isopropilβ‐D‐1‐tiogalactopiranósido).Trastreshorasdeinducciónatemperatura ambiente,lasbacteriasserecogieronporcentrifugaciónyselisaron,trasunlavadocon PBS1X,enuntampóndelisisquecontiene30mMdeTris‐HCl(pH7,5),150mMdeNaCl, 10%deglicerol,1%deTritónX‐100einhibidoresdeproteasas.Estelisadoseincubóen unrotorcirculardurante16horasa4ºC,enunacolumnadesefarosaqueladaconníquel (QuelatinSepharoseFastFlow;GEHealthcareBio‐SciencesAB,Uppsala,Suiza),alaque elTRAILquedaráunidoporlacoladehistidinas.Transcurridoestetiempo,selavala columnaseisvecesconPBSfríoantesdeeluirelTRAILconunasolución100mMdeEDTA enPBS.Lasfraccionesmáspurificadassetitularonenactividadrealizandounensayode apoptosisencélulasHeLasensiblesaTRAILysealmacenarona‐80ºC.
66 2.12. Medidadelasíntesisdeproteínas. Lasíntesisdeproteínassedeterminómedianteincorporaciónde(3H)‐leucina(2μCi/ml) enmaterialinsolubleenácidotricloroacético.Traslostratamientoscorrespondientes lascélulasrecibieronunpulsodedoshorasde(3H)‐leucina.Finalizadoestetiempose aspiróelmedioylascélulasselavaron3vecesconPBS1X.Porúltimo,seañadióacido tricloroacéticoal5%friodurante20minutos,traslocualsehizounlavadoconeste mismoacidoydoslavadosconetanolabsoluto.Unavezseco,elmaterialsedisolvióen 500μldeunbufferquecontenía0.1MdeNaOH,2%Na2CO3,0.1%SDS.Trasesto,se añadió4,5mldesolucióndecentelleolíquido(UltimaGoldTM,PerkinElmer).La radiactividadfuemedidaenuncontadordecentelleoBeckmanCoulterLS6500. 2.13. Ensayodeclonogenicidad Laclonogenicidadfuedeterminadamedianteunensayoconcristalvioleta.Lascélulas fueroncontadasdespuésdelosdiversostratamientos,ysesembraron1000célulasde cadacondiciónenplacasde12pocillos.Tras7díasdecrecimientoenunincubadora 37ºCy5%deCO2,sedeterminólacapacidadclonogénicamediantetinciónconcristal violeta.ParaelloseaspiróelmedioysehicierondoslavadosconPBS.Seincubólas célulasatemperaturaambientedurante20minutosenunasoluciónde0,2%decristal violetaen2%deetanol.Finalizadoestetiemposeaspirólasolucióndecristalvioleta,y selavaronlasplacasdosvecesconagua.Lasplacassedejaronsecardurante aproximadamenteunahoratraslocualseresuspendieronconSDSal1%.Semidióla densidadópticaaunalongituddeondade560nmenellectordeplacasVarioskanFlash (TermoElectronCorporation). 2.14. Análisisestadístico Todoslosdatossepresentancomolamedia±SDdealmenos3experimentos independientes.Lasignificaciónestadísticasedeterminómediantelaaplicacióndela pruebaT‐Student.Unvalordepmenorde0.05seconsideróestadísticamente significativo.
67 VI‐Resultados
68 CAPÍTULOPRIMERO:RegulacióndelasensibilidadaTRAILencélulastumoralesde mamatriplenegativas(TNBC)porlaglutaminaextracelular. Desdesudescubrimientoen1995,TRAILhasidoconsideradounpotenteligandodemuertecon potencialidadterapéuticayaqueescapazdeinducirapoptosisencélulastumoralessindañar tejidosnormales((Ashkenazietal.1999)(Walczaketal.1999).Estosresultadosllevarona proponeraTRAILcomounaposibleterapiaantitumoraly,porello,laactividaddeTRAIL recombinanteydeanticuerposagonistashasidoevaluadaendiversosensayosclínicos(Von Karstedt,Montinaro,&Walczak2017).Sinembargo,aunquesehaobservadoescasatoxicidad delosagonistasdelosreceptoresdeTRAILenestosensayosclínicos,lostumoresprimariosson, enmuchoscasos,resistentesalaacciónapoptóticadeestosagonistasy,porello,lasrespuestas terapéuticashansidonegativasenlamayoríadelostumoresensayados.Portanto,es importanteabordarelestudiodeestasresistenciasparaeldesarrollodetratamientos combinadosconotrosagentesterapéuticosquesensibilicenaestascélulastumoralesaTRAIL, comoyasehadescritoalcombinarTRAILconradioterapiaoquimioterapia(Palacioset al.2014)((Lemke,etal.2014). 1.1.SensibilizacióndecélulastumoralestriplenegativasdemamaalaapoptosisporTRAILen mediodecultivocarentedeglutamina. Laglutaminadesempeñaunpapelimportanteenelmetabolismotumoralatravésdesu contribuciónalahomeostasisredox,labiosíntesisdemacromoléculasolaseñalizacióncelular, esporelloquepuedeserunapotencialdianaterapéutica.Enestesentido,sehadescritoque lascélulasdeTNBC,conmalpronósticoyreducidasopcionesterapéuticas,sonaltamente dependientesdelaglutaminaexógenanecesariaparasuproliferaciónycrecimiento(Van Geldermalsenetal.2016)(Timmermanetal.2013).Confirmamosestosestudiosutilizandouna líneacelulardecadaclase,lalíneaMDA‐MB468comorepresentativadelasTNBCylalíneaT47D delasnoTNBC,yestudiamoscomoafectabalaprivacióndeglutaminaenelmedioextracelular alaproliferacióndurante5díasdecultivo.Aunqueenpresenciadeglutaminaenelmediode cultivolascélulasdeambaslíneasproliferandemanerabastantesimilar,enausenciadeeste aminoácidoelcrecimientodelascélulasTNBCestácompletamenteinhibido,comosepuede observarenlafigura1,loqueconvierteestadependenciaenunaposibledianaantitumoral frenteacélulasTNBC.
69 Figura1|Efectodelaprivacióndeglutaminaenelcrecimientocelular.Las célulasfueronincubadasenmedioconosinglutaminadurante5días.La proliferacióncelularsedeterminómediantetinciónconcristalvioletacomose describeenMaterialesyMétodos. Dadalaimportanciadelaglutaminaenlaregulacióndelmetabolismotumoral(DeBerardinis& Cheng2010)(Wise&Thompson2010),enestetrabajodetesishemosestudiadoelposible papeldelaglutaminaenlaregulacióndelasensibilidadaTRAILdecélulasTNBCylaposible utilizacióndeestadependenciadeglutaminaexógenacomodianaparalasensibilizaciónde célulasTNBCaTRAIL.Paraello,hemosanalizadoinicialmentelaregulacióndelasensibilidada TRAILencultivosdecélulasTNBCynoTNBCprivadasdeglutamina.Comosepuedeverenla figura2todaslaslíneascelularesutilizadassonmuyresistentesaTRAIL,sinembargo,mientras quelascélulasTNBCsesensibilizantraslaprivacióndeglutamina,enelcasodelascélulasno TNBCnoseproducesensibilizaciónalaapoptosisporTRAIL.
70 Figura2|SensibilidadaTRAILtrasprivacióndeglutaminaencélulasTNBCyno TNBC.CélulasTNBC(A)ycélulasnoTNBC(B)fueronincubadasdurante24horas enmedioconosinglutamina(2mM)traslocualseincubaronenelmismomedio enpresenciaoausenciadeTRAILduranteotras24horas(100ng/mlMDA‐MB468, 50ng/mlMDA‐MB231,10ng/mlMDA‐MB436,100ng/mlBT549,500ng/mllíneas noTNBC).Laapoptosissedeterminócomoelporcentajedecélulashipodiploides porcitometríadeflujotalycomosedescribeenMaterialesyMétodos.Lasgráficas muestranlosvalores+/‐ SDdealmenostresexperimentosindependientes. **p<0,01,***p<0,001. ParacaracterizarelmecanismoimplicadoenlaapoptosisinducidaporTRAILtrasprivaciónde glutaminaenlascélulasTNBC,seexaminóenprimerlugarlaactivacióndelacaspasa8,un eventobioquímicoclavequesedesencadenaalunirseTRAILasusreceptoresproapoptóticos enlasuperficiecelular.Paraello,determinamoselprocesamientodeprocaspasa8ensus fragmentosproteolíticosintermediosde43/41KDaylageneracióndelasubunidadmayorde 18KDaencélulastratadasconTRAIL.ComparandolalíneacelularTNBCMDA‐MB468conla líneanoTNBCT47Dsepuedeobservarqueenestasúltimasnoseproduceelprocesamientode laprocaspasa8traslaprivacióndeglutaminaytratamientoconTRAIL.Encambio,enlascélulas TNBCseobservaunclaroprocesamientodelaprocaspasa8traseltratamientoconTRAILen célulascultivadasenausenciadeglutamina(Figura3). Figura3|Procesamientodelaprocaspasa8trasprivacióndeglutaminay tratamientoconTRAIL.LascélulasMDA‐MB468(A)ylascélulasT47D(B)fueron incubadasdurante24horasenmedioconysinglutaminaytratadasconTRAIL segúnlostiemposindicados.Losnivelesproteicosdelacaspasa8fueron determinadosmedianteWesternBlot.GAPDHfueutilizadocomocontroldecarga deproteínas.
71 EnlaapoptosisinducidaporTRAILlacaspasa8esreclutadayprocesadaenelcomplejoinductor demuertecelular(DISC)demaneradependientedeFADDydereceptoresdeTRAIL(Green& Llambi2015).Enelcomplejotambiénsepuedeencontrarlaproteínainhibidoradelaapoptosis FLIPquecompiteconlacaspasa8parasuuniónaFADDyaquepresentaunaaltahomologíacon ella,provocandolainhibicióndelaapoptosiscuandolosnivelesdeFLIPsonelevados.La isoformaFLIP(L)puedetambiénfacilitarlaactivacióncontroladadecaspasa‐8enelDISC(Olivier Micheauetal.2002)permitiendolaproteólisislimitadadesustratosproteicos. Trasdemostrarquelaeliminacióndeglutaminadelmediodecultivofacilitabalaactivaciónde caspasa‐8porTRAILencélulasTNBC,estudiamoselreceptorproapoptóticoimplicadoenesta activación.SehadescritoqueencélulastumoralesdemamaTRAIL‐R2/DR5esprincipalmente elreceptorquetransmitelaseñalapoptóticaenlarutaextrínsecaactivadaporTRAIL.Porello, generamosmedianteinfecciónconvectoreslentiviralesdeshRNAdeTRAIL‐R2/DR5célulasque expresarannivelesreducidosdeestaproteína.Comosepuedeobservarenlafigura4A,las célulasinfectadasconlentivirusshTRAL‐R2expresannivelesindetectablesdeestaproteína cuandosecomparanconcélulasinfectadasconlentiviruscontrol(shScr).Enestosmodelos celularesestudiamoslasensibilidadalaapoptosisinducidaporTRAILtraslaprivaciónde glutamina.Comoseobservaenlafigura4B,mientrasqueenlascélulasshScrlaeliminaciónde laglutaminadelmediodecultivoinducíaunaimportantesensibilizaciónaTRAIL,lascélulas shTRAIL‐R2eranmarcadamenteresistentesalprocesodesensibilización. Figura4|TRAIL‐R2eselreceptorimplicadoenlasensibilizaciónaTRAILtras privacióndeglutamina.CélulasMDA‐MB468conunainhibiciónestabledeTRAIL‐ R2oconelvectorvacíofueronincubadasenunmedioconosinglutaminadurante 24horastraslocualselastratóenpresenciaoausenciadeTRAIL.Laapoptosisse
72 midiócomoelporcentajedecélulasenSubG1porcitometríadeflujotalycomo sedescribeenMaterialyMétodos.ElsilenciamientodeTRAIL‐R2sedeterminó porWesternblot.LosnivelesdeGAPDHseutilizaroncomocontroldecarga.Las gráficasmuestranlosvalores+/‐ SDdealmenostresexperimentos independientes.***p<0,001,n.s.nosignificativoestadísticamente. ParaprofundizarenelestudiodelmecanismodesensibilizaciónaTRAIL,examinamosa continuaciónlaexpresión,enlascélulastumoralesdemama,delosprincipalescomponentes proteicosdelDISCparadeterminarsilaprivacióndeglutaminaalterabalosnivelesdelos mismosdemaneraqueexplicasenlasensibilizaciónalaapoptosisporTRAIL.Comosepuede verenlafigura5,aunquenohabíadiferenciassignificativasenlosnivelesproteicosdeFADDy decaspasa8(Figura5A)traslaprivacióndeglutamina,síseobservabaunclaroaumentoenlos nivelesdeTRAIL‐R2yunaimportantedisminuciónenlosnivelesdeFLIPenlalíneacelularTNBC MDA‐MB468.Sinembargo,estoscambiosnoseproducíanenlalíneanoTNBCT47D(Figura5B). Figura5|NivelescelularesdecomponentesdelDISCtrasprivacióndeglutamina. CélulasMDA‐MB468(A)ycélulasT47D(B)fueronincubadasdurante24horasen presenciaoausenciadeglutaminaylosnivelesproteicosdeFADD,Caspasa‐8, TRAIL‐R2yFLIPfuerondeterminadosmedianteWesternblot.Losnivelescelulares deGAPDHseutilizaroncomocontroldecargadeproteínasenelWesternblot.
73 TrasobservaresteaumentodelosnivelestotalesdeproteínaTRAIL‐R2,determinamossieste aumentoseproducíatambiénaniveldeexpresióngénicaanalizandolosnivelesdeARNm mediantePCRcuantitativa.Comosepuedeobservarenlafigura6A,laeliminacióndela glutaminaenelmediodecultivoinducíadeformamarcadalaexpresióndelARNmdeTRAIL‐R2 enlascélulasMDA‐MB468peronoenlascélulasT47D.Asímismo,analizamoslosnivelesdelos receptoresproapoptóticosTRAIL‐R1yTRAIL‐R2receptorenlasuperficiecelulartantoenlas célulasMDA‐MB468comoenlascélulasT47Dprivadasdeglutamina(Figura6B).Losresultados quesemuestranenlafigura6Bindicanclaramentequelafaltadeglutaminaenelmediode cultivoinduceunincrementoenlaexpresióndelreceptorTRAIL‐R2enlasuperficiedelascélulas MDA‐MB468peronoenladelascélulasT47D,confirmandolosresultadosobtenidosalanalizar laexpresióntotaldeproteínaTRAIL‐R2mediantewesternblot.Encambio,losnivelesdeTRAIL‐ R1enlasuperficiecelularnoaumentantraslaincubacióndelascélulasenmediocarentede glutamina(Figura6B). TodosestosdatossugierenqueelaumentodelosnivelesdeTRAIL‐R2traslaprivaciónde glutaminapuedeserresponsabledelamayorsensibilizaciónaTRAILdelascélulasTNBC. Figura6|LaprivacióndeglutaminaaumentalosnivelesdeTRAIL‐R2.Células MDA‐MB468ycélulasT47Dfueronincubadasdurante24horasenpresenciao ausenciadeglutamina.(A)LosnivelesdeARNmdeTRAIL‐R2fuerondeterminados medianteqPCR.Lasgráficasmuestranlosvalores+/‐ SDdealmenostres experimentosindependientes.***p<0,001.(B)LosnivelesdeTRAIL‐R1yTRAIL‐R2 enlasuperficiecelularsedeterminaronporcitometríadeflujocomoseindicaen MaterialesyMétodos.
74 HasidodescritoquelascélulasnoTNBCtienenaltosnivelesdeglutaminasintetasa(GS)ybajos nivelesdeglutaminasa,loquelashaceindependientesdelaglutaminaexógenaparasu viabilidadyproliferación,yaqueestaenzimalespermitesintetizarlaglutaminanecesariapara estasfuncionesapartirdelglutamato,enunareaccióninversaaladelaglutaminasa(Kung, Marks,&Chi2011).Porestemotivo,determinamossielsilenciamientodelaGSenlalínea celularnoTNBCT47DlashacíadependientesdeglutaminayportantosensiblesaTRAILtrasun tratamientodeprivacióndeglutamina.Comosepuedeobservarenlafigura7,elsilenciamiento delaGSaumentasignificativamentelasensibilidadaTRAILdelascélulasT47D. Figura7|SensibilizaciónaTRAILtrassilenciamientodelaGSencélulasnoTNBC. LascélulasMDA‐MB468setransfectaronconeloligodeRNAdeinterferencia controlyfrenteaGSdurante30horas,seincubaronenpresenciaoausenciade glutaminadurante24horas.TrasestosetrataronconTRAIL(100ng/ml).La apoptosissemidiócomoelporcentajedecélulasenSubG1porcitometríadeflujo talycomosedescribeenMaterialyMétodos.Lasgráficasmuestranlosvalores +/‐ SDdealmenostresexperimentosindependientes.***p<0,001.Para determinarelgradodesilenciamientosemidieronlosnivelesdeARNmdeGSpor RT‐qPCR. 1.2.PapeldelarutaGCN2/ATF4/CHOPenlaregulacióndelaexpresióndeTRAIL‐R2tras privacióndeglutamina. Basándonosenlosresultadosanteriores,analizamosacontinuaciónelmecanismoqueregulala expresióndeTRAIL‐R2traslaprivacióndeglutamina.Enestesentido,algunosdatosdeotros laboratorioshabíandescritoquelaexpresióndeTRAIL‐R2seregulaenrespuestaasituaciones deestrés(Martin‐Perezetal.2014).Laprivacióndeaminoácidosy,enparticular,deglutamina puededarlugaraestréscelularyactivarrespuestasadaptativaspararesolveresteestrés.Uno deloseventosinicialesdeestarespuestaadaptativaeslafosforilacióndelfactordeiniciación delatraduccióneIF2αporlaquinasaGCN2oporlaquinasaPERK,loqueinhibelatraducciónde mensajerosdependientesdecapy,porello,lasíntesisglobaldeproteínas(Hardingetal.2003).
75 Almismotiempo,sefavorecelatraduccióndeARNmespecíficosquecontienenotrosmarcos delectura(uORF)ensuregión5´notraducible.EntreestosARNm,seinducelatraduccióndel factordetranscripciónATF4,eventoclaveenlarespuestaadaptativaaestrés,quepuedeinducir muertecelularatravésdelaactivacióntranscripcionaldelgenCHOP(GADD153),queasuvez esunfactordetrancripciónimplicadoenlaregulacióndelaexpresióndeTRAIL‐R2(P.D.Lu, Harding,andRon2004)(Zinszneretal.1998).Paracaracterizarelmecanismoimplicadoenel aumentodeTRAIL‐R2trasprivacióndeglutamina,sedeterminóenprimerlugarelgradode fosforilacióndeeIF2αyelniveldeexpresióndeATF4yCHOPenlascélulasMDA‐MB468yT47D. AlincubarestascélulasenunmediosinglutaminaseobservóunafosforilaciónmayordeeIF2α enlascélulasMDA‐MB468queenlasT47D,yenconsecuenciaunamayorinduccióndeATF4y CHOP,tantoaniveldeproteína(Figura8A)comotambiéndeARNm(Figura8B)enelcasode CHOP.Porotraparte,elsilenciamientodelaglutaminasintetasaenlascélulasT47Dquehace queestascélulasseanmássensiblesaTRAIL(Fig.7),permiteunarespuestadeestrésen respuestaalaretiradadelaglutaminadelmediodecultivocomosemuestraenlafigura8Cal analizarlaexpresióndelfactordetranscripciónCHOP,aunquelosnivelesdeinducciónson considerablementemenoresquelosqueseobservanenlacélulasTNBC(Fig.8B), probablementeporlaexistenciadeactividadglutaminasintetasaresidualenlascélulasT47D transfectadasconelsiRNAdeGS(Fig.7)
82 Figura13|LarutadeGCN2/ATF4/CHOPnoregulalosnivelesdeFLIP.Lascélulas MDA‐MB468setransfectaronconeloligodeRNAdeinterferenciacontrol(SCR)y frenteaPERK,GCN2,ATF4yCHOPonofuerontranfectadas(NT)durante30horas, trasestoseincubaronenpresenciaoausenciadeglutaminadurante24horas.Se recogieronlascélulasysedeterminaronlosnivelesdeproteínasporWesternblot. GAPDHseutilizócomocontroldecarga. TambiénexaminamoselpapeldemTORC1,otrosensorimportantedeladisponibilidadde glutaminaencélulasdemamífero(Nicklinetal.2009),enlaregulacióndeFLIPylasensibilidad aTRAILencélulasMDA‐MB468sometidasaprivacióndeglutamina.Comosemuestraenla figura14A,eldescensodelosnivelesdeFLIPtrasprivacióndeglutaminavaacompañadadeuna inhibicióndemTORC1comosepuedeobservarporlapérdidadefosforilacióndelossustratos demTORC1p70S6Ky4EBP1.Sinembargo,eltratamientodelascélulasTNBCconelinhibidor demTORC1/mTORC2Torina‐1noredujolosnivelesdeFLIP(Figura14A)nisensibilizóaestas célulasalaapoptosisinducidaporTRAIL(Figura14B).Delmismomodo,lainhibicióndemTORC1 porlarapamicinanodiólugaralasensibilizacióndeestascélulasaTRAIL(Figura14B)En conjunto,estosdatosindicanquelainhibicióndemTORC1noesresponsabledela sensibilizaciónaTRAILencélulasTNBCprivadasdeglutamina.
83 Figura14|PapeldemTORenlaregulacióndelosnivelesdeFLIPylasensibilidad aTRAIL.(A)LascélulasMDA‐MB468fueronincubadasenmedioconosin glutaminayenpresenciaoausenciadetorina‐1(250nM)durante24horas.Los nivelesdeproteínassedetectaronporWesternblotutilizandoGAPDHcomo controldecarga.(B)LascélulasMDA‐MB468fueronincubadasenmediocon glutamina(+GLN),singlutamina(‐GLN),conglutaminaytorina‐1(+GLN+Torina)y conglutaminayrapamicina(500nM)(+GLN+Rapa)durante24horasantesdel tratamientoenpresenciaoausenciadeTRAIL(100ng/ml).Laapoptosissemidió comoelporcentajedecélulasenSubG1porcitometríadeflujotalycomose describeenMaterialyMétodos.Lasgráficasmuestranlosvalores+/‐SDdeal menostresexperimentosindependientes.***p<0,001,n.s.nosignificativo estadísticamente. Paraseguirinvestigandoelmecanismoimplicadoenlareduccióndelosnivelescelularesdelas proteínasanti‐apoptóticasFLIP(L)yFLIP(S)encélulasprivadasdeglutamina,comenzamos analizandolacinéticadereduccióndelaexpresióndeambasisoformasdeFLIPencélulasMDA‐ MB468encondicionesdeprivacióndeglutamina.SeobservóunabajadadelosnivelesdeFLIP alas3horasenausenciadeglutaminayunadesaparicióncasicompletadeambasisoformasa las16horas(Figura15A).Acontinuación,analizamossiestareducciónenlosnivelesde proteínasFLIPseobservabatambiénenlosARNmcorrespondientes,paralocualrealizamos ensayosdeqPCRdelosARNmdeFLIPencélulasMDA‐MB468tras24horasdecultivoen presenciaoausenciadeglutamina.EncontrastealabajadadenivelesdeproteínasFLIP
84 observadatraslaincubacióndelascélulasenunmediolibredeglutamina,enelcasodelARNm noseobservóunareducciónsinounaumentobajoestascondicionesdecultivo.(Figura15B). Comoambasisoformassonproteínasdevidamediacortasujetasaubiquitinaciónydegradación porelproteasoma(Fukazawaetal.2001)(Palacios,Yerbes,&López‐Rivas2006)(Zhangetal. 1999),determinamossilaprivacióndeglutaminapodríadisminuirlavidamediadelasisoformas deFLIPencélulasMDA‐MB468.Sinembargo,comosemuestraenlafigura15C,laestabilidad deambasisoformasnoseveafectadaporlaeliminacióndelaglutaminadelmediodecultivo. DadoquenilosnivelesdeARNmnilavidamediadeFLIPseredujerontraslaprivaciónde glutamina,decidimosdeterminarsilasíntesisglobaldeproteínasestabainhibidatrasel tratamientodeprivacióndeglutaminay,comoconsecuencia,losnivelesdeFLIPseverían tambiénreducidos.Losdatosobtenidosmostrabanquelasíntesisdeproteínasdisminuye drásticamentedesdelas3horasdeincubaciónenunmediosinglutamina(Figura15D),loque ademássecorrelacionaconlacinéticadebajadadelosnivelesdeproteínadeFLIP(Figura15A).
85 Figura15|LareducciónenlosnivelesdeFLIPcorrelacionaconlainhibición globaldelasíntesisdeproteínasdebidaalaprivacióndeglutamina.(A)Las célulasMDA‐MB468fueronincubadasenpresenciaoausenciadeglutamina durantelostiemposindicados,traslocualserecogieronlascélulasyseanalizaron losnivelesdeFLIPmedianteWesternblotysecuantificaronrespectoalcontrolde cargaGAPDH.(B)Lascélulasseincubaronconosinglutaminadurante24horasy sedeterminaronlosnivelesdeARNmdeFLIP(L)yFLIP(S)medianteunaqPCR.(C) LascélulasMDA‐MB468fueronincubadasenmedioconosinglutaminadurante 3horasantesdeañadircicloheximida(CHX,5μg/ml)eincubacióndurantelos tiemposindicados.LosnivelesdeFLIPsedeterminaronmedianteWesternblot. GAPDHfueusadocomocontroldecargadeproteínas.(D)Lasíntesisglobalde proteínassedeterminóencélulasMDA‐MB468despuésdelaprivaciónde glutaminadurantelostiemposindicados,comosedescribeenMaterialy Métodos.Lasgráficasmuestranlosvalores+/‐SDdealmenostresexperimentos independientes.***p<0,001.
86 CAPÍTULOSEGUNDO:Papeldelmetabolismodelaglutaminaenelcontroldela sensibilidadaTRAILdecélulastumoralestriplenegativasdemama. 2.1.ControldelasensibilidadaTRAILencélulasTNBCporelmetabolismocitosólicodela glutamina Lasalteracionesmetabólicasenlascélulastumoralesasícomoenlascélulasqueformanel estromatumoralesunodelostemasdemayorinterésactualenlainvestigaciónsobreelcáncer (Hanahan&Weinberg2011).Además,lasposiblesvulnerabilidadesderivadasdeestas alteracionesestásiendoobjetodenumerosostrabajosencaminadosadefinirnuevasdianas terapéuticasfrentealcáncer(Luengo,Gui,&VanderHeiden2017).Laelevadaproliferaciónde lascélulastumoraleshacequeestastenganunosrequerimientosbioenergéticosydesíntesis demoléculasmásaltosporloqueelconsumodenutrientesydiversasrutasmetabólicasestán alteradasenestascélulas.Estudiosrecientesmuestrancomolascélulastumoralesutilizan, ademásdelaglucosa,fuentesalternativasdeenergíayprecursoresparalasíntesisde nucleótidos,lípidosyproteínascomoporejemplo,laglutamina,parasatisfacerlasdemandas metabólicasderivadasdesuelevadaproliferación(DeBerardinisandCheng2010)(Medinaetal. 1992).Porestemotivo,elmetabolismodelaglutaminasehaconvertidoenunadianapara posiblestratamientosantitumorales.Aesterespecto,sehanpropuestodiversosenfoques terapéuticoscomolareduccióndeglutaminaensangre,elbloqueodesutransportealinterior delascélulastumoralesolainhibicióndeenzimasimplicadasenlasíntesisdelaglutaminaoen sucatabolismo(Altman,Stine,&Dang2016). Elcatabolismodelaglutaminacomienzaconsuconversiónenglutamatoenreaccionesque producenlatransferenciadelgrupoaminogammadelaglutaminaparalasíntesisde nucleótidosyhexosaminasomediantereaccionescatalizadasporglutaminasas(GLS)enla mitocondriaqueliberanamonio(Hensley,Wasti,&Deberardinis2013).Elglutamatopuede, porunaparte,darlugaraglutatión,unodelosantioxidantescelularesprincipales(Lu2009),o convertirseenα‐cetoglutarato(α‐KG)pordeaminaciónoxidativaatravésdelaglutamato deshidrogenasa(GDH)enlamitocondriaoportransaminación,produciendoaminoácidosno esenciales,tantoenelcitosolcomoenlamitocondria(Zhang,Pavlova,&Thompson2017).A suvez,elα‐KGpuedeentrarenelciclodeKrebsoparticiparendiversosprocesoscomo substratodedioxigenasasquemodificandiversasproteínasoelADNyenseñalizacióncelular (Xiaoetal.2016).Sehanidentificadodiversosinhibidoresparacadaunodeestospasosdel metabolismodelaglutamina(Altman,Stine,&Dang2016).
87 UnavezdescartadoelpapeldelarutadeGCN2/ATF4/CHOPasícomomTORC1enelmecanismo desensibilizaciónaTRAILtrasprivacióndeglutamina,decidimosestudiarelpapeldel metabolismodelaglutaminacomoreguladordelaseñalizaciónapoptóticadelreceptorTRAIL‐ R2deTRAIL.Comohemosmencionado,laconversióndeglutaminaaglutamatopuedeaportar nitrógenoparalaformacióndenucleótidosyhexosaminas,porloquelaprivacióndeglutamina podríaestarinhibiendolasíntesisdeestoscompuestos,permitiendolaapoptosisdelascélulas TNBCtraslaadicióndeTRAIL(Evans,Jones,&Ziegler2005)Porello,incubamosalascélulas MDA‐MB468enmediosinglutaminaenlapresenciadenucleósidosoglucosaminacomo precursoresenlasíntesisdenucleótidosohexosaminas,respectivamente.Trasestaincubación, lascélulasfuerontratadasconTRAILparaanalizarelprocesodesensibilización.Sinembargo, comosepuedeobservarenlafigura16,ningunadelasadicionesprevinolasensibilizacióna TRAILporprivacióndeglutamina.Además,enlosexperimentosconglucosaminaobservamos queestaadiciónfacilitabalaapoptosisporTRAIL,inclusoenelmedioconglutamina(Fig.16). Figura16|Papeldelasrutasdesíntesisdelashexosaminasydelosnucleótidos enlasensibilidadaTRAIL.LascélulasMDA‐MB468fueronincubadasenmedio conosinglutaminayenpresenciaoausenciade(A)unasolucióndenucleósidos 1Xo(B)deglucosamina(20mM)durante24horas.Trasestosetratóalascélulas enpresenciaoausenciadeTRAIL(100ng/ml).Laapoptosissemidiócomoel porcentajedecélulasenSubG1porcitometríadeflujotalycomosedescribeen MaterialyMétodos.Lasgráficasmuestranlosvalores+/‐ SDdealmenostres experimentosindependientes.n.s.nosignificativoestadísticamente. Porotraparte,dadoqueelmetabolismodelaglutaminaproduceglutamatoyésteparticipaen lasíntesisdeglutatión,analizamostambiénelposiblepapeldelosnivelescelularesdeglutatión y,porlotanto,deespeciesreactivasdeoxígenoenlasensibilizaciónaTRAILtrasincubaciónen
88 mediosinglutamina.Paraello,lascélulasfueronprivadasdeglutaminaenausenciaopresencia delantioxidanteN‐acetilcisteína(NAC),utilizadoconfrecuenciaenestudiosparadeterminarla implicacióndeespeciesreactivasdeoxígenoenprocesosdeseñalizacióndemuertecelular.En estosexperimentos,observamosqueesteantioxidanteinhibíasignificativamentela sensibilizaciónaTRAIL(Fig.17).Sinembargo,apesardelainhibicióndelasensibilizacióna TRAIL,laadicióndeNACnopreveníaloscambiosinducidosporlaprivacióndeglutaminaenlos nivelesdeTRAIL‐R2ydeFLIPenlascélulasMDA‐MB468(Figura17). Figura17|NACprevienelasensibilizaciónaTRAILperonoelaumentodeTRAIL‐ R2nieldescensodelosnivelescelularesdeFLIPencélulasprivadasde glutamina.LascélulasMDA‐MB468fueronincubadasenmedioconosin glutaminayenpresenciaoausenciadeNAC(10mM)durante24horas.Trasesta incubación(A)lascélulassetrataronenpresenciaoausenciadeTRAIL(100ng/ml) ysedeterminólaapoptosismediantecitometríadeflujotalycomosedescribeen MaterialyMétodos.Lasgráficasmuestranlosvalores+/‐ SDdealmenostres experimentosindependientes.**p<0,01.En(B)sedeterminaronlosnivelesde proteínadeTRAIL‐R2porWesternblotylosnivelesensuperficiecelularpor citometriacomosedescribeenMaterialyMétodos.(C)Seanalizaronlosniveles deFLIPporWesternblot.GAPDHfueutilizadocomocontroldecarga.
89 2.2.Lainhibiciónfarmacológicaygenéticadelmetabolismodelaglutaminabajalosniveles deFLIPysensibilizanaTRAILalascélulasTNBC. Laobservacióndequelasrutasmetabólicasanalizadasnoestabanimplicadasenelcontrolde losnivelesdeFLIP,elprincipaldeterminantedelasensibilidadaTRAILenlascélulasTNBCyno TNBC(Fig.11),ydadoquegranpartedelcatabolismodelaglutaminaconducealaformación deglutamatoyeste,asuvezproduceα‐KG,determinamoselefectoquelaadicióndelanálogo permeabledelα‐KG,dimetil‐alfa‐cetoglutarato(DM‐α‐KG),teníaenelcontroldelosnivelesde FLIPylasensibilizaciónaTRAILencélulasMDA‐MB468privadasdeglutamina.Comosemuestra enlafigura18,laadicióndeα‐KGalmediodecultivocarentedeglutaminaprevino significativamentetantolareduccióndelosnivelesdeFLIP(Figura18A)comolasensibilización alaapoptosisporTRAIL(Figura18B). Figura18|Papeldelα‐KGenlasensibilidadaTRAIL.LascélulasMDA‐MB468 fueroncultivadasenmedioconosinglutaminayenpresenciaoausenciadeα‐KG (5mM)durante24horasysetrataronconTRAIL(100ng/ml)durante24horas antesdedeterminarlaapoptosisporcitometríadeflujo.Lasgráficasmuestranlos valores+/‐SDdealmenostresexperimentosindependientes.***p<0,001,n.s. nosignificativoestadísticamente.SeanalizaronlosnivelesdeFLIPporWestern blotusandoGAPDHcomocontroldecarga. Comoindicamosanteriormente,laconversióndeglutaminaenglutamatopuedetenerlugara travésdelaaccióndeglutaminasas,codificadasenhumanosporlosgenesGLSyGLS2(Curthoys 1995),Particularmente,laactividaddelasisoenzimasGLScorrelacionaestrechamenteconel crecimientoylamalignidadentumoresysusilenciamientooinhibiciónfarmacológicaretrasala progresióntumoral(J.Wangetal.2010).Enestesentido,lascélulasTNBCsondependientesde laglutaminaymuestranaltosgradosdeexpresióndelaGLS(Kung,Marks,&Chi2011). Partiendodeestosdatos,llevamosacaboexperimentosparasilenciarsuexpresiónoinhibirsu
90 actividadydeterminarsusefectosenlaresistenciadeestascélulasaTRAIL.Comosemuestra enlafigura19A,elsilenciamientodelaexpresióndeGLScondosoligonucleótidosdesiRNA diferentesnoresultóenunaumentosignificativoenlasensibilidaddecélulasMDA‐MB468a TRAIL.Delmismomodo,laincubacióndeestascélulasenpresenciadelosinhibidoresdeGLS BPTESo968enmedioconglutaminaniredujolosnivelesdeproteínasFLIPnisensibilizóalas célulasdemanerasignificativaalaapoptosisinducidaporTRAIL(Fig.19B). Figura19|EfectodelsilenciamientodeGLSolainhibicióndelaactividad glutaminasaenlasensibilidadaTRAIL.(A)LascélulasMDA‐MB468se transfectaronbienconunoligonucleótidodeRNAcontrolocondosoligos diferentesdesiRNAdeGLSdurante30horas.Trasestaincubaciónlascélulasse trataronenpresenciaoausenciadeTRAILdurante24horas.Paradeterminarel gradodesilenciamientosemidieronlosnivelesdeARNmdeGLSporRT‐qPCR.(B) LascélulasMDA‐MB468fueronincubadasenpresenciaoausenciadelos inhibidores968(10μM)oBPTES(20μM)durante24horasantesdeltratamiento conTRAIL(100ng/ml)SedeterminaronlosnivelesdeproteínasdeFLIPpor Westernblot.GAPDHseutilizócomocontroldecarga.Laapoptosissemidiócomo elporcentajedecélulasenSubG1porcitometríadeflujotalycomosedescribeen MaterialyMétodos.Lasgráficasmuestranlosvalores+/‐ SDdealmenostres experimentosindependientes.***p<0,01,n.s.nosignificativoestadísticamente.
91 Comohemosindicado,ademásdelaglutaminolisiscatalizadaporlasglutaminasas mitocondriales,otrasrutasmetabólicascomolabiosíntesisdenucleótidosylasíntesisde hexosaminas,utilizanlaglutaminacomodonadordegruposamino,generandoglutamato. Aunque,comosehademostradoanteriormenteenestatesis,laproduccióndeintermediarios deestasrutasmetabólicasnopareceserrelevanteenlaregulacióndelasensibilidadaTRAILen célulasTNBC,lainhibicióndelaproduccióndeglutamatoyconsecuentementedelageneración deα‐KGatravésdeestasvíasmetabólicaspodríadesempeñarunpapelenlasensibilizacióna laapoptosisporTRAIL.Pararesponderaestascuestionessellevaronacaboexperimentoscon análogosdelaglutaminacomolaacivicinayelDON(6‐Diazo‐5‐oxo‐L‐norleucina)queinhibenla conversióndeglutaminaenglutamato(Ahluwaliaetal.1990).Conambosinhibidoresse observólasensibilizaciónaTRAILenpresenciadeglutaminaenelmediodecultivo,acompañada delareducciónenlosnivelesdeFLIP,comparablealadeltratamientoconprivaciónde glutamina(Figura20Ay20B).Denuevo,lapresenciaenelmediodecultivodeintermediarios delarutadelaspirimidinasypurinascomolainosinayelorotato,noinhibieronlasensibilización observadaaTRAIL.Estosresultadossugeríanquelainhibicióndelaproduccióndeglutamatoa travésdeestasrutascitosólicaspodríaserlaresponsabledelasensibilizacióninducidaporestos inhibidoresdelmetabolismodelaglutamina.
98 CAPÍTULOTERCERO:Elmetabolismodelaglutaminacomodianaantitumoralen combinaciónconTRAIL. 3.1.LaL‐AsparraginasasensibilizaalascélulasTNBCalaapoptosisinducidaporTRAIL. Lascélulastumoralesreprogramansumetabolismoparaobtenerlaenergíaylosprecursores biosintéticosquenecesitanparasusupervivenciayproliferación.Seproducenmodificaciones eneltransportedeglucosa,lacadenatransportadoradeelectrones,larutadelaspentosas fosfatoolaglutaminolisis,llegandoamostrarunadependenciadelaglutaminaqueseconvierte enunaimportantefuentedeenergíaeintermediariosenlasíntesisdemacromoléculas.Por tanto,elmetabolismodelaglutaminaseconvierteenunpuntoclaveenlaprogresióntumoral. Esporelloqueenlaactualidadungrannúmerodeestrategiasantitumoralessehancentrado enelmetabolismotumoralyconcretamenteenelmetabolismodelaglutaminacomodiana terapéutica. Sehanrealizadonumerososestudiosdelefectodelamodulacióndelmetabolismodela glutaminaentratamientosclínicos.Estosenfoqueshanincluidolainhibicióndelaglutaminolisis medianteinhibidoresdeGLS(Wangetal.2010)(Robinsonetal.2007),supresióndelaexpresión dec‐MYC(Niuetal.2015),bloqueodelacaptacióndeglutamina(Hassaneinetal.2013)oeluso demiméticosdeglutamina(Ortlundetal.2000).Sinembargo,muchasdeestosensayosiniciales hanreveladounatoxicidadsistémicainaceptableparasuaplicaciónenlaclínica. Apesardeestosinconvenientes,ladependenciadelascélulastumoralesdelaportede glutaminasiguesiendounavulnerabilidaddeestascélulasconposibilidadesterapéuticaspara eltratamientodepacientesconcáncer.Enestesentido,otradelasestrategiasempleadasen terapiadelcáncerhasidoladereduciroeliminarlaconcentracióndeglutaminaensangre.Para ellosehadescritoquelaenzimaL‐Asparraginasa(L‐ASNasa),obtenidadediversasfuentes bacterianas,catalizaladeaminacióndelaasparraginaenamonioyácidoaspárticoydela glutaminaenamonioyacidoglutámico,portantoreducelosnivelesdeestosdosaminoácidos ensangre(Grigoryanetal.2004)(Lukey,Wilson,&Cerione2013).Enlaclínica,estaenzimase utilizaeneltratamientodeleucemialinfoblásticaagudadondeyasehadescritolabajadadelos nivelesdeglutaminaensangreasícomodelosnivelesdeglutaminaalmacenados(Ollenschlager etal.1988).Encultivo,laasparraginasainhibeelcrecimientocelularyprovocalamuertede célulasdecáncerdepáncreas.Esteefectopuederevertirsemediantelareintroducciónde pequeñascantidadesdeglutamina(Wu,Arimura,&Yunis1978).
99 Porestosantecedentes,decidimosprobarestaenzima,conunalargatrayectoriaen tratamientosclínicos,paracomprobarsisucapacidaddedeplecióndelaglutaminadelmedio podíasensibilizaralascélulasTNBCaTRAILyabrirlaposibilidaddeutilizarsuefectocombinado conTRAILcomounposibletratamientoantitumoral.Primerodeterminamoselefectodel tratamientodelaL‐ASNasasobrelarespuestaaestrés.Paraello,lascélulasMDA‐MB468se incubaronenunmediodecultivoconglutaminaperotambiénconL‐ASNasa.Losresultados indicanlainduccióndeATF4,CHOPyTRAIL‐R2similaralobservadoenmediosinglutamina(Fig. 24Ay24B).TambiénpudimosobservarqueeltratamientoconL‐ASNasareducíalosnivelesde expresióndeFLIP(Figura24C).Además,laadicióndeglutaminaenlasúltimas6horasde tratamientoconL‐ASNasainhibíaestasrespuestas,loqueindicaqueeslaactividadglutaminasa delaL‐ASNasalaqueprovocabalosefectosobservados. Figura24|EfectodelaL‐asparraginasaenlarespuestaaestrésyenlosniveles deFLIP.LascélulasMDA‐MB468fueronincubadasenmedioconglutamina (+GLN),singlutamina(‐GLN)yconglutaminayL‐Asparraginasa(L‐ASNasa, 0.5U/ml))durante48horas.Seañadióglutaminaenalgunospocillos
100 durantelas6horasfinalesdetratamiento(L‐ASNasa+GLN).Trásestos tratamientos,lascélulasseincubaronenpresenciaoausenciadeTRAIL (100ng/ml).(A)SedeterminóATF4medianteWesternblotylosnivelesde ARNmdeCHOPyTRAIL‐R2medianteRT‐qPCR.En(B)sedeterminaronlos nivelesproteicosdeTRAIL‐R2medianteWesternblotyaniveldesuperficie celularporcitometriadeflujocomosedescribeenMaterialyMétodos.(C) LosnivelesdeFLIPsedeterminaronmedianteWesternblot.GAPDHfue utilizadocomocontroldecarga.Lasgráficasmuestranlosvalores+/‐SDde almenostresexperimentosindependientes.**p<0,01. EstosresultadosnosllevaronainvestigarsieltratamientoconL‐ASNasasensibilizaríaalas célulasTNBCalaapoptosisinducidaporTRAIL.LaincubacióndecélulasMDA‐MB468conL‐ ASNasaenmedioquecontieneglutaminasensibilizófuertementeaestascélulasalaapoptosis inducidaporTRAIL.Estasensibilizaciónseanulócompletamenteconlaadicióntardíade glutaminaperonoasíconlaadicióndeasparragina,loquedemuestraclaramentequeesla actividadglutaminasadelaL‐ASNasalaquetieneunefectosinérgicoconTRAILenlaactivación deunprocesoapoptóticoencélulasTNBC(Fig.25). Figura25|EfectodelaL‐asparraginasaenlasensibilidadaTRAIL.Lascélulas MDA‐MB468fueronincubadasenmedioconglutamina(+GLN),singlutamina(‐ GLN)yconglutaminayL‐Asparraginasa(L‐ASNasa)durante48horas.Seañadió glutaminaenalgunospocillosdurantelas6horasfinalesdetratamiento(L‐ASNasa +GLN)oasparragina(L‐ASNasa+ASN).Despuésdeltratamientosetrataronalas células24horasconTRAIL(100ng/ml)ylaapoptosissedeterminócomoel porcentajedecélulasenSubG1porcitometríadeflujotalycomosedescribeen MaterialyMétodos.Lasgráficasmuestranlosvalores+/‐ SDdealmenostres experimentosindependientes.***p<0,001,n.s.nosignificativoestadísticamente.
101 Aunqueelanálisisdelainduccióndeapoptosisenuntiempodeterminadoesunamanera frecuentementeutilizadadeanalizarlarespuestaatratamientosantitumorales,la heterogeneidadeneltiempoenqueesteprocesodemuertecelularpuedeocurrirenlascélulas deunamismapoblaciónnosllevóaanalizarlafraccióndecélulasquesobrevivenaltratamiento deL‐ASNasayTRAILutilizandounensayodeclonogenicidad(Frankenetal.2006).Esteensayo permitedeterminarlacapacidaddelascélulasindividualesdeproliferaryllegaraformaruna coloniade50célulasomás.Comopuedeverseenlafigura26,eltratamientodeprivaciónde glutaminaoconL‐ASNasaelefectosemantieneenlascélulastratadasconrespectoalcontrol, yaqueseformanmenosclones.Ademásseveunefectosinérgicoentreestostratamientosy TRAIL,yaqueenlospocillosenlosquesecombinanambostratamientoselnúmerodecolonias esmenor.Porúltimo,elefectodelaL‐ASNasaesrevertidocuandosereintroduceglutaminaen elmedioyelnúmerodecoloniasaumentahastalosnivelesdelcontrol,tambiénenel tratamientocombinadoconTRAIL. Figura26|LaL‐ASNasamantienesuefectodespuésdeltratamientoenlas célulasTNBC.LascélulasMDA‐MB468fueronincubadasenmedioconglutamina (+GLN),singlutamina(‐GLN)yconglutaminayL‐Asparraginasa(L‐ASNasa)durante 48horas.Seañadióglutaminaenalgunospocillosdurantelas6horasfinalesde tratamiento(L‐ASNasa+GLN),trasestostratamientosseincubaronlascélulasen presenciaoausenciadeTRAIL(100ng/ml).Finalizadoslostratamientos,sesembró elmismonúmerodecélulasysedejaroncrecerensumediodecrecimiento durante7días.Sedeterminoelnúmerodeclonesmediantecristalvioletacomo sedescribeenelapartadodeMaterialyMétodos.
102 3.2.EfectodelaprivacióndeglutaminaenlasensibilidadaTRAILdecélulasmadredecáncer demama. Numerosasevidenciasindicanquelascélulasmadretumoralesocélulasiniciadorasdetumores jueganunpapelimportanteenlarecurrenciadeltumorylaresistenciaalosmedicamentos,y portantorepresentanunimportanteretoenlaterapiaactualfrentealcáncer.Estascélulas iniciadorassonresponsablesdelaformaciónyprogresióndeltumorypresentan,además, propiedadesprogenitoras,entrelasquedestacasucapacidaddeautorenovación,lacualjunto conellimitadonúmerodecélulaspresentesenelconjuntodeltumorpermiteexplicarsu habilidadparaescapardelasterapiasconvencionalesyprovocarlareaparicióndetumor(Ponti etal.2006)(Al‐Hajjetal.2003).Elmicroambientetumoral,comolosfactoresdecrecimiento,los nutrientesyeloxígeno,afectanalageneraciónyproliferacióndelascélulasmadredelcáncer alproporcionarleslasfuentesdeenergíaylasseñalesdecrecimientonecesarias.Porello,es importanteconocerelmetabolismoy,enparticular,elmetabolismodelaglutamina,deestas célulasyaquepuederepresentarunadianadeestrategiasterapéuticasquepermitavencersu resistenciaatratamientos. Porestemotivo,hemosqueridoanalizarelefectodelaprivacióndeglutaminayelefectodel tratamientoconlaL‐ASNasaenlascélulasmadredecáncerdemama.Paraello,realizamos cultivosdemamosferastalycomosedetallaenmaterialymétodos.Lasmamoferasson conjuntosesféricosnoadherentesdecélulas,enriquecidasencélulasmadredelcánceryquese obtienenencondicionesselectivasdecultivo.Comomostramosenlafigura27,elnúmerode mamosferasdisminuyósignificativamenteconlostratamientosdeprivacióndeglutaminayL‐ ASNasa,yesteefectoesaúnmayorencombinaciónconTRAIL.Estosdatossugierenunamayor sensibilidaddelascélulasmadredelcánceraestostratamientosqueelrestodelapoblaciónde célulastumoralesexistentesenelcultivo.Además,aligualqueocurrecuandosedeterminala apoptosisenestostratamientos(Fig.25),lareadicióndeglutaminaalascélulastratadasconL‐ ASNasayTRAILprevinoelefectodeestetratamientosobrelaformacióndemamosferas(Fig. 27),denuevoindicandoquelosefectosobservadossedebenalaactividadglutaminasadelaL‐ ASNasay,porlotanto,alaprivacióndeglutaminaenelmediodecultivo.
103 Figura27|EfectodelaL‐ASNasaeneltratamientodecélulasmadredelcáncer demama.LascélulasMDA‐MB468fueronincubadasenmedioconglutamina (+GLN),singlutamina(‐GLN)yconglutaminayL‐Asparraginasa(L‐ASNasa)durante 48horas.Seañadióglutaminaenalgunospocillosdurantelas6horasfinalesde tratamiento(L‐ASNasa+GLN),trasestostratamientosseincubaronlascélulasen presenciaoausenciadeTRAIL(100ng/ml)durante24horas.Finalizadosestos tratamientoslascélulassecontaronysesembraron5000célulasporpocilloen mediodemamosferasenplacastratadasconpoliHEMA.Sedeterminóelnúmero demamosferasalos7díasdeincubación.Lagráficamuestralosvalores+/‐SDde almenostresexperimentosindependientes.*p<0,05,**p<0,01,n.s.no significativoestadísticamente.Enelpanelinferiorsemuestranfotos repreentativasdelosresultadosobtenidosenlosexperimentos. Delmismomodo,analizamoselefectodelainhibicióndelastransaminasasconAOAenlas célulasmadredelcáncer,yaquecomohemosvistoenelcapítuloanterioresteinhibidordelas transaminasasteníaunclaroefectosensibilizadorenlainduccióndeapoptosisporTRAILen TNBC.Paraesteestudiotambiénserealizaronensayosdemamosferasycomoseveenlafigura 28eltratamientoconAOAdisminuyeelnúmerodeestas.ElefectocombinadodeAOAyTRAIL produceunefectomásacusadoenlabajadadelnúmerodemamosferas,indicandounamayor
104 sensibilidadalostratamientosdelascélulasiniciadorasdelcáncerconrespectoalrestodela poblacióndecélulasTNBC. Figura28|EfectodelAOAeneltratamientodecélulasmadredelcáncerde mama.LascélulasMDA‐MB468fueronincubadasenmedioconglutaminayen presenciaoausenciadeAOAdurante24horas,trasestetratamientolascélulasse incubaronenpresenciaoausenciadeTRAIL(100ng/ml)durante24horas. Finalizadosestostratamientoslascélulassecontaronysesembraron5000células porpocilloenmediodemamosferasenplacastratadasconpoliHEMA.Se determinóelnúmerodemamosferasalos7díasdeincubación.Lagráficamuestra losvalores+/‐SDdealmenostresexperimentosindependientes.*p<0,05,** p<0,01.Enelpanelinferiorsemuestranfotosdeunexperimentorepresentativo.
105 VII‐Discusión
106 CAPÍTULOPRIMERO:RegulacióndelasensibilidadaTRAILencélulastumoralesde mamatriplenegativas(TNBC)porlaglutaminaextracelular. Elcáncerdemamatriplenegativomuestraunagranheterogeneidadagrupando,bajoesta denominación,adiversossubtiposatendiendoacriterioshistológicosymoleculares.Además, alestardefinidoporlaausenciademarcadoresmolecularesutilizadoscomodianas terapéuticas,elcáncerTNBCesresistenteatratamientoscomolaterapiaantihormonalo terapiascontraHER2,utilizadasenotrostiposdecáncerdemama(Tomaoetal.2015).Hastael momento,laquimioterapiaeseltratamientoestablecidoparapacientesconcáncerdemama triplenegativo(TNBC),aunquesoloesefectivoendeterminadoscasos.Porello,juntoconla heterogeneidadclínicaymolecular,lafaltadedianasterapéuticasyelmalpronósticodeestos pacientes,hacennecesariolabúsquedadenuevasestrategiasparaeltratamientodeesta neoplasia(Bianchinietal.2016). Unaampliavariedaddelíneastumoralesmuestrasensibilidadalaprivacióndeglutamina, incluyendoglioblastomamultiforme,leucemiamieloideagudaocáncerdemama.Eneste últimocaso,numerosaslíneascelularesdecáncerdemamatriplenegativomuestranuna marcadaadicciónalaglutaminaextracelular,apesardeseresteunaminoácidoconsiderado comonoesencialyaquepuedesersintetizadoapartirdeglucosa.Sinembargo,loscambios metabólicosasícomolaelevadaproliferacióndeestascélulastumoralesaumentanlos requerimientosdenutrientescomoglucosa,glutamina,cisteínayasparraginadelmedio extracelular(DeBerardinisetal.2008)(Iglehartetal.1977)(Asselinetal.1989).Recientes evidenciashanindicadoqueelincrementodelacaptacióndeglutaminaysumetabolismoen lascélulasTNBCpermiteaestascélulaslasíntesisdenucleótidosyproteínas,lahomeostasis redoxylaenergíamitocondrialnecesariosparasuelevadacapacidadproliferativa(Timmerman etal.2013)(VanGeldermalsenetal.2016)(Kung,Marks,andChi2011).Aesterespecto,la dependenciadeglutaminadelascélulasTNBChaconvertidoalmetabolismodeesteaminoácido enunapotencialdianaterapéutica(Timmermanetal.2013)(Grossetal.2014).Sinembargo, estudiosclínicosinicialesconmonoterapiasquecontrolanelmetabolismodelaglutaminahan reveladounaactividadtumorallimitadayunatoxicidadsistémicaexcesivasugiriendola necesidaddeevaluartratamientoscombinadoscondosisnotóxicasdeestoscompuestosjunto otrasterapiasantitumorales. Sehanobservadodiferenciasenladependíaaglutaminaentrelíneasluminalesybasales (Timmermanetal.2013)(VanGeldermalsenetal.2016)(Kung,Marks,&Chi2011).Además, estudiosrecienteshabíansugeridounposiblepapeldelmetabolismodelaglutaminaenel
107 controldelaexpresióndelreceptorproapoptóticoTRAIL‐R2ydelasensibilidadaTRAILde diferentescélulastumorales,aunqueelmecanismodetrásdeestarelaciónseguíasinestar determinado(Qin,Xin,&Nickoloff2010)(Dilsharaetal.2017).Losresultadosexpuestosenesta tesismuestranclaramentecomolainhibicióndelautilizacióndelaglutaminaencélulasTNBC conunfenotipobasaldisminuyelaproliferacióncelulareincrementasusensibilidadala induccióndeapoptosisporTRAIL.Encontraste,célulastumoralesdemamanoTNBCconun fenotipoluminalsonmenosdependientesdelaglutaminaextracelularparalaproliferaciónyno muestranestasensibilizaciónaTRAILtrasprivacióndeglutaminaoinhibicióndesu metabolismo.Laindependenciaalaglutaminadelaslíneascelularesdecáncerdemamaconun fenotipoluminalestáasociadoconunaexpresiónelevadadeglutaminasintetasa(GS)loqueles permitesintetizarglutaminaapartirdeglutamatoenunareaccióninversaaladelaglutaminasa (GLS),cuyaexpresiónsemantieneennivelesreducidosenestascélulas(Kungetal.,211).En estesentido,esimportantedestacarquesehandescritodiferenciasenlaexpresióndeGSyGLS entremuestrasdetumoresprimariosdefenotiposluminalAybasal(Kung,Marks,&Chi2011). NuestrosresultadosdemuestranquealsilenciarlaexpresióndelaGSencélulasluminalesno TNBC,losnivelesdeGSseredujeronhastanivelespróximosalosdelascélulasTNBC,loque permitiórevertirlaresistenciaalasensibilizaciónaTRAILporprivacióndeglutamina.Durante estatesishemosdemostradotambiénquelosnivelescelularesdeTRAIL‐R2yFLIPestán reguladoscríticamenteporelmetabolismodelaglutaminaencélulasTNBC,aunquepor diferentesmecanismos.MientrasqueelaumentodelaexpresióndeTRAIL‐R2trasprivaciónde glutaminadependedelaactivacióndelarutadeseñalizaciónmediadaporGCN2,ladisminución delosnivelesdeFLIPrespondeaunmecanismoindependientedelarutadeGCN2enelque estáimplicadaunabajadageneraldelasíntesisdeproteínascomoconsecuenciadelafaltade aminoácidosnoesencialesprovocadaporlaprivacióndeglutamina(JiZhang,Pavlova,& Thompson2017).PreviamenteaestosresultadoshabíamosdescartadoelpapeldemTORC1en laregulacióndeFLIPylasensibilidaddeTRAIL.mTORC1esunimportantesensordela disponibilidaddenutrientesentreelloslaglutamina,queregulalatraduccióndeproteínas,el crecimientocelularylaautofagia(Nicklinetal.2009).LaactividaddemTORC1esespecialmente sensiblealadisponibilidaddefuentesdenitrógenocomolaglutaminademodoqueensu ausenciaseinhibeelcrecimientocelularyseactivaotrasformasdeobtenernitrógenocomo porejemplo,atravésdelaautofagia.Ennuestrosdatosobservamosqueeltratamientocon inhibidoresdemTORC1noreducelosnivelesdeFLIPnisensibilizaaestascélulasalaapoptosis inducidaporTRAIL.
114 VIII‐Conclusiones
115 1. Laprivacióndeglutaminasensibilizaalascélulastumoralestriplenegativas(TNBC)de cáncerdemamaalaapoptosisinducidaporelligandodemuertecelularTRAIL. 2. Laexpresióndenivelesmáselevadosdeglutaminasintetasaencélulastumoralesde mamanoTNBChaceaestascélulasmásresistentesalaacciónapoptóticadeTRAILen ausenciadeglutaminaextracelular. 3. EncélulasTNBC,laprivacióndeglutaminaaumentalosnivelesdelreceptor proapoptóticoTRAIL‐R2yproduceundescensodelaproteínaantiapoptóticaFLIP.El aumentodelaexpresióndeTRAIL‐R2dependedelaactivacióndelarutadeseñalización mediadaporGCN2/ATF4/CHOP.LareduccióndelosnivelesdeFLIPesindependientede laactivacióndelarutadeGCN2. 4. LabajadadelosnivelescelularesdeFLIPtrasprivacióndeglutaminaessuficientepara lasensibilizaciónaTRAILdelascélulasTNBC. 5. LareducciónenlosnivelesdeFLIPenlaausenciadeglutaminaextracelularesuna consecuenciadelainhibicióndelasíntesisgeneraldeproteínas. 6. EnlascélulasTNBC,lainhibiciónfarmacológicadelcatabolismodelglutamatoatravés delastransaminasas,peronoatravésdelaglutamatodeshidrogenasa,reproducelos efectosdelaprivacióndeglutaminaencuantoainhibicióndelasíntesisgeneralde proteínas,disminucióndelosnivelesdeFLIPysensibilidadaTRAIL. 7. Laadicióndeaminoácidosnoesencialesalmediodecultivoprevienelosefectosque, sobrelasensibilizaciónaTRAILdelascélulasTNBC,tienelainhibicióndelas transaminasas. 8. LatransaminasacitosólicaGOT1,conexpresiónelevadaenlascélulasTNBC,es responsabledelmantenimientodelosnivelesdeFLIPyTRAIL‐R2enestascélulas. 9. LaactividadglutaminasadelaL‐asparraginasaexógenasensibilizaalascélulasTNBCa TRAILmediantelosmismosmecanismosdescritosenlaprivacióndeglutamina.
116 10. LapoblacióndecélulasTNBCconcaracterísticasdecélulasiniciadorasdetumores muestrandependenciadelaglutaminaextracelularparaformarmamosferasy sensibilidadaTRAILenausenciadeesteaminoácido. 11. Enresumen,elmetabolismodelaglutaminaseperfilacomounapotencialdiana terapéuticaentratamientocombinadoconTRAILencáncerdemamatriplenegativo.
117 IX‐Bibliografía
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Mauro-Lizcano and López-Rivas Cell Death and Disease (2018) 9:205 DOI 10.1038/s41419-018-0263-0 Cell Death & Disease ARTICLE Open Access Glutamine metabolism regulates FLIP expression and sensitivity to TRAIL in triplenegative breast cancer cells Marta Mauro-Lizcano 1 and Abelardo López-Rivas 1,2 Abstract Glutamine plays an important role in the metabolism of tumor cells through its contribution to redox homeostasis, bioenergetics, synthesis of macromolecules, and signaling. Triple-negative breast cancers (TNBC) are highly metastatic and associated with poor prognosis. TNBC cells show a marked dependence on extracellular glutamine for growth. Herein we demonstrate that TNBC cells are markedly sensitized to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis upon glutamine deprivation. Upregulation of pro-apoptotic TRAIL receptor 2 (TRAILR2/DR5) and downregulation of FLICE-inhibitory protein (FLIP) are observed in glutamine-deprived TNBC cells. Activation of the amino-acid-sensing kinase general control nonderepressible 2 (GCN2) upon glutamine deprivation is responsible for TRAIL-R2 upregulation through a signaling pathway involving ATF4 and CHOP transcription factors. In contrast, FLIP downregulation in glutamine-deprived TNBC occurs by a GCN2-independent mechanism. Importantly, silencing FLIP expression by RNA interference results in a marked sensitization of TNBC cells to TRAIL-induced apoptosis. In addition, pharmacological or genetic inhibition of transaminases increases TRAIL-R2 expression and downregulates FLIP levels, sensitizing TNBC cells to TRAIL. Interestingly, treatment with L-asparaginase markedly sensitizes TNBC cells to TRAIL through its glutaminase activity. Overall, our findings suggest that targeting the glutamine addiction phenotype of TNBC can be regarded as a potential antitumoral target in combination with agonists of proapoptotic TRAIL receptors. Introduction Oncogenic transformation leads to alterations in glutamine metabolism 1,2 and makes transformed cells highly dependent on glutamine 3 . Triple-negative breast cancer (TNBC) is a heterogeneous group of breast cancer characterized by the absence of expression of estrogen (ER) and progesterone (PR) receptors, and lack of HER2 receptor gene amplification 4 . Patients with TNBC have a poor prognosis and a high rate of early relapse. TNBC still pose a major challenge in cancer management, being conventional chemotherapy the only therapeutic option 5 . Interestingly, different studies have demonstrated that TNBC cells are dependent on exogenous glutamine for survival and growth 6,7 . In this regard, inhibitors of glutamine transport and metabolism have been proposed as potential antitumor therapies 6,8 . However, targeting glutamine metabolism for cancer therapy may require identification of synergistic combinations with other therapeutic treatments to selectively target tumor cells in cancer patients and thus prevent unacceptable toxicity 9 . Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is a member of the TNF family that induces apoptosis selectively in a wide variety of cancer cells 10,11 . Binding of TRAIL to its pro-apoptotic receptors leads to the formation of a death-inducing signaling complex (DISC), where activation of initiator caspase-8 © The Author(s) 2018 Open Access This article is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License, which permits use, sharing, adaptation, distribution and reproduction in any medium or format, as long as you give appropriate credit to the original author(s) and the source, provide a linktotheCreativeCommons license, and indicate if changes were made. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons license, unless indicated otherwise in a credit line to the material. If material is not included in the article’s Creative Commons license and your intended use is not permitted by statutory regulation or exceeds the permitted use, you will need to obtain permission directly from the copyright holder. To view a copy of this license, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Correspondence: Abelardo López-Rivas ([email protected]) 1 Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa-CABIMER, CSIC-Universidad de Sevilla-Universidad Pablo de Olavide, Avda Américo Vespucio 24, Sevilla 41092, Spain 2 Centro de Investigación Biomédica en Red-Oncología (CIBERONC), Carlos III Health Institute, Madrid, Spain Edited by M. Agostini Official journal of the Cell Death Differentiation Association 1234567890():,; 1234567890():,;