Observaciones micro-morfológicas y anatómicas en núculas de Prunella y Cleonia (Lamiaceae) del suroeste de España.

Núculas de Prunella y Cleonia 203 Acta Botanica Malacitana 29: 203-214 Málaga, 2004 INTRODUCCIÓN La afinidad entre Prunella L. y Cleonia L. ha sido puesta de manifiesto por numerosos autores que tradicio-nalmente los han agrupado conjuntamente bajo diversas categorías taxonómicas. Así, Bentham (1876) los incluye en la tribu Lamieae subtribu Scutellarineae junto a Brazoria Engelm. & Gray; Briquet (1895-1897) en la misma tribu pero en la subtribu Prunellineae, y más recientemente Cantino et al. (1992) que, apoyándose en los resultados de algunos análisis filogenéticos previos (Cantino, OBSERVACIONES MICROMORFOLÓGICAS Y ANATÓMICAS EN NÚCULAS DE PRUNELLA L. Y CLEONIA L. (LAMIACEAE) DEL SUROESTE DE ESPAÑA Mª Angeles MARTÍN MOSQUERO, Rocío JUAN y Julio PASTOR RESUMEN.Observaciones micromorfológicas y anatómicas en núnulas de Prunella L. y Cleonia L. (Lamiaceae) del suroeste de España. Se han estudiado las núculas de tres especies del género Prunella y una del género Cleonia, tanto al microscopio óptico como al electrónico de barrido. Los taxones de ambos géneros se diferencian fácilmente tanto mediante caracteres morfológicos como el contorno o la ornamentación, como por caracteres anatómicos como la morfología de las células esclerenquimáticas del mesocarpo. La excreción del mucílago también contribuye a esta diferenciación. Otros caracteres como el color, la presencia o ausencia de glándulas, o algunas diferencias en el mesocarpo o endocarpo permiten diferenciar las tres especies examinadas del género Prunella. Por último, se discute brevemente la utilidad del mucílago, así como los sistemas de dispersión más frecuentes. Palabras clave. Núcula, morfología, anatomía, mucílago, Prunella, Cleonia, Lamiaceae ABSTRACT. Micromorphological and anatomical observations on nutlets of Prunella L. and Cleonia L. (Lamiaceae), from the SW of Spain. The nutlets of three species of Prunella and another of Cleonia have been studied with light and scanning electron microscopy. The taxa of both genera can be easily differentiated through both morphologic features, such as the outline or the ornamentation, and anatomic features as the morphology of mesocarp’s sclerenchymatic cells. The mucilage secretion also contribute to this differentiation. Other features such as colour, presence/absence of glands, or some differences in the mesocarp or in the endocarp allow to distinguish the three examined species of genus Prunella. Lastly, the usefulness of mucilage and the most frequent dispersal systems are briefly discussed. Key words. Nutlet, morphology, anatomy, mucilage, Prunella, Cleonia, Lamiaceae 204 M. A. Martín Mosquero et al. 204 1992a, b; Wagstaff, 1992), incluyen Cleonia y Prunella en la subfamilia Nepetoideae, y a Brazoria en la subfamilia Lamioideae. No obstante, a pesar de los caracteres que tienen en común, y de que Linneo (1753) considerara C. lusitanica como P. lusitanica, ambos géneros tienen suficientes diferencias para ser tratados de forma independiente, como ya quedó reflejado en la segunda edición del Species Plantarum (Linneo, 1763). Dicho criterio ha sido mantenido posteriormente en numerosas obras (Bentham, 1876; Briquet, 1895-1897; Heywood & Richardson, 1972; Valdés, 1987; Rejdali & Montserrat, 2002). El género Prunella se distribuye principalmente por el norte de las regiones templadas y el noroeste de África (Willis, 1966). Se realizan observaciones de las tres especies presentes en el área de estudio (Smith, 1972; Valdés & Ubera, 1987; Navarro et al., 2002): P. laciniata (L.) L., P. hyssopifolia L. y P. vulgaris L. Esta última es la que tiene una distribución más amplia, mientras que P. laciniata se presenta por la campiña baja gaditana y Aracena, y P. hyssopifolia, que es más rara, se localiza en la subbética cordobesa en hábitats muy concretos de pastizales húmedos. En cuanto al género Cleonia que incluye dos especies, C. lusitanica L. y C. punica Beauverd, se distribuye por el oeste de la región Mediterránea (Willis, 1966). En el área de estudio sólo se presenta C. lusitanica (Fernándes, 1972; Ubera, 1987; Navarro et al. 2002), mientras que la otra especie, C. punica, se encuentra en el norte de África siendo endémica de Túnez . Los trabajos sobre Prunella no son frecuentes, si bien es tratado en estudios más amplios como los de Marin et al. (1991) y Harborne (1992) sobre fitoquímica, el de Cantino (1992b) sobre filogenia, el de Bouman & Meeuse (1992) sobre dispersión o el de Owens & Ubera (1992) sobre germinación. También sobre germinación, aunque referidos concre-tamente a P. vulgaris, destacan los trabajos de Winn (1985, 1988) y Winn & Werker (1987). Respecto al género Cleonia, no se han encontrado estudios específicos, si bien hay alguna información en trabajos generales de taxonomía o filogenia, como los de Cantino (1992b) y Cantino et al. (1992). En cuanto a las núculas, se puede resaltar el trabajo de Wojciechowska (1961) sobre morfología y anatomía de éstas en especies europeas de Prunella, y el de Wagner (1914) sobre su anatomía, concretamente en especies de Lamiaceae de la flora de Francia, donde incluye algunas especies de Prunella. Además, Ryding (1995), entre otros géneros de Lamiaceae, analiza la estructura del pericarpo de C. lusitanica en material de Argelia. MATERIAL Y MÉTODOS El material se fijó en FAA durante un mínimo de 24 horas, y posteriormente se pasó a etanol al 70 % donde se conservó hasta su análisis. Para las observaciones micromorfológicas se utilizaron núculas maduras, fijadas y sometidas a punto crítico. El material se montó en portas mediante adhesivo de doble cara. A continuación se metalizó con oropaladio y posteriormente se examinó con un microscopio electrónico de barrido (M.E.B.) Philips LX-30. Los datos sobre longitud y anchura se basan en un muestreo de 100-180 núculas por taxón. El estudio anatómico se realizó con núculas en distinto grado de madurez, fijadas y deshidratadas mediante la serie de alcohol butílico terciario (Johansen, 1940). Luego se incluyeron en parafina y fueron cortadas a 9 – 12 µm de grosor. Una vez montadas las secciones, fueron teñidas con safranina Núculas de Prunella y Cleonia 205 Tabla 1. Caracteres morfológicos y anatómicos de las núculas en los taxones estudiados de Prunella y Cleonia. Morphological and anatomical nutlets features in studied taxa of Prunella and Cleonia. alcohólica al 1 % y fast-green alcohólico al 0.1 %, y montadas de modo permanente para su posterior obser-vación al microscopio óptico (M.O.) Los dibujos de los cortes anatómicos se han realizado con ayuda de una cámara clara. En la terminología se ha seguido principalmente a Stearn (1992) y Font Quer (1993). Para el estudio del mucílago se utilizaron núculas que fueron colocadas, durante un máximo de 48 horas, en cámara húmeda y sometidas al “Test del agua destilada” (Alburquerque & Andrade, 1998). Las que tenían mucílago fueron sometidas a una solución de fast-green (0,1%) en alcohol de 70° durante unos segundos, lo que tiñó ligeramente el mucílago y permitió medir el grosor del halo. Se midieron 25 núculas por taxón. También se tomaron muestras del mucílago, se montaron en un portaobjetos sobre el que se colocó un cubreobjetos previamente humedecido con una gota de agua destilada, y se analizaron las preparaciones con ayuda del M. O. Los testigos están en el Herbario de la P. vulgaris P. laciniata P. hyssopifolia C. lusitanica Tamaño (mm) 1.9-2.4 x 0.8-1.2 2.1-3.2 x 0.9-1.7 2.1-3.2 x 0.9-1.4 1.6-2.4 x 1.0-1.8 Contorno/Forma obovado / ligeramente trígonas estrechamente elípticoelíptico / ligeramente trígonas estrechamente elíptico / ligeramente trígonas anchamente obovado a circular / ligeramente trígonas Color pardo pardo a pardo oscuro pardo rojizo pardo claro a pardo Superficie lisa lisa lisa rugulada Glándulas presentes ausentes ausentes ausentes Mucílago discontinuo discontinuo discontinuo continuo Grosor del mucílago (mm) 0.4-0.5 0.4-0.5 0.3-0.4 1.2-1.5 Grosor del pericarpo (µm) 87-218 87-233 89-237 119-188 Epicarpo (µm) 10-70 15-78 15-80 50-75 Mesocarpo (µm) Región externa Región media Región interna 41-101 4-8 25-75 12-18 42-105 2-5 30-80 10-20 43-105 8-15 20-65 15-25 39-66 7-15 22-33 10-18 Capa en empalizada (µm) 30-38 25-38 25-40 25-40 Endocarpo (µm) 4-7 3-10 4-10 3-5 206 M. A. Martín Mosquero et al. 206 Universidad de Sevilla (SEV). RESULTADOS El tamaño de las núculas de los cuatro taxones examinados es variable (1.6-3.2 x 0.8-1.8 mm). Son más o menos trígonas, al menos en la base, aunque el contorno difiere entre las especies estudiadas (tab. 1). Generalmente, la base es aguda, mientras que el ápice es de redondeado a subtruncado, salvo en P. hys sopifolia donde, a veces, es agudo. En todos los casos el hilo es blanquecino, de contorno, más o menos triangular, localizado en la base de la cara ventral, y cubierto por depósitos de ceras. Sin embargo, en las tres especies del género Prunella siempre se ha observado sobre un apículo de consistencia cornea. El color varía desde pardo claro hasta pardo rojizo o pardooscuro, y la simetría es dorsiventral. En Prunella la superficie es lisa delimitada en 4 regiones por dos pliegues laterales, uno dorsal, y otro ventral, de coloración más obscura y con un surco en la zona media que puede ensancharse hacia el ápice (figs. 1 a, b, g, k; 2 a, b, d, e). La superficie en Cleonia es rugulada, con una nerviación longitudinal normalmente poco patente (fig. 2 g, h). Generalmente las células son poligonales, de paredes radiales no visibles y tangencial externa lisa; aunque en Cleonia, suelen observarse también otras células de mayor tamaño y con la pared tangencial externa estriada (figs. 1 c, i; 2 c, j-l).Únicamente se han encontrado glándulas en P. vulgaris, localizadas en una cavidad de la zona apical ventral (fig. 1 e). El grosor del pericarpo oscila entre 87 – 237 µm. El epicarpo siempre está formado por dos tipos de células: mucilaginosas y no mucilaginosas. Las células mucilaginosas son alargadas radialmente; pero mientras que en Cleonia se distribuyen por toda la superficie y sus paredes son delgadas, en Prunella se localizan en los vértices de la núcula, en grupos de 10 - 12 células, y sus paredes son gruesas. Las células no mucilaginosas son más o menos rectangulares en Prunella, mientras que en Cleonia son osiformes. El grosor del mesocarpo es muy variable (39 – 105 µm), y en todos los taxones está diferenciado en tres regiones atendiendo a la morfología y naturaleza de sus células. La primera zona es la más delgada y está formada por células parenquimáticas más o menos rectangulares de paredes delgadas. La segunda, en el caso de Prunella, corresponde a varias capas de células esclerenquimáticas, de sección más o menos circular, de paredes gruesas y con un lumen central; mientras que en el caso de Cleonia, está formada por una sola capa de células esclerenquimáticas más o menos cuadradas, de paredes gruesas, pero con un lumen ensanchado hacia el ápice, en cuyo interior suele aparecer un cristal de 5 - 10 µm de diámetro. En todos los casos, la tercera región esta formada por una capa de células parenquimáticas, de isodiamétricas a más o menos rectangu-lares, y con numerosos cristales en su interior. La capa en empalizada (25 – 40 µm) siempre está formada por esclereidas alargadas radialmente y con paredes engrosadas, que muestran un lumen central e irregularmente estrellado, generalmente sin cristales en su interior, salvo en Cleonia, donde a veces se ha observado un pequeño cristal de 4 – 6 µm. El endocarpo delgado (3 –10 µm), constituido por células más o menos rectangulares que, a veces, presentan engrosamientos escalariformes (fig. 3 a-d; tab. 1). El grosor de la testa varia de 5 – 15 µm, y está formada por dos capas de células más o menos rectangulares. En Prunella, las células de la zona más externa presentan engrosamientos escalariformes; mientras que Núculas de Prunella y Cleonia 207 Figura 1. Núculas de Prunella. A – F. P. vulgaris. G – L. P. laciniata. Contorno dorsal: A, G; contorno ventral: B, H; detalles de la superficie: C, D, I-K; glándulas apicales: E; detalle del mucílago: F, L. Escalas: 50 µm (C, I); 100 µm (D, E, J, K); 500 µm (A, B, F, G, H, L) . Nutlets of Prunella. A – F. P. vulgaris. G – L. P. laciniata. Dorsal face: A, G; ventral face: B, H; details of surface: C, D, I-K; apical glands: E; detail of mucilage: F, L. Scale bars: 50 µ m (C, I); 100 µ m (D, E, J, K); 500 µ m (A, B, F, G, H, L). 208 M. A. Martín Mosquero et al. 208 en Cleonia esta capa está intensamente teñida, y suele formar crestas u ondulaciones. En todos los casos, la capa más interna está constituida por células teñidas y de paredes delgadas que, a veces, son difícilmente diferenciables (fig. 3 a-d). El mucílago está presente en los cuatro taxones estudiados, pero mientras en Prunella es discontinuo y transparente, formando cuatro bandas longitudinales, en Cleonia es continuo y de aspecto lechoso. En la matriz mucilaginosa predominan espinas patentes, hebras helicoidales y lineares de mayor longitud. En Cleonia, además, se han observado elementos discoidales (figs. 1 f, l; 2 f, i; tab. 1). Clave basada en los caracteres de las núculas 1. Superficie rugulada. Halo mucilaginoso > 1mm. Zona esclerenquimática del mesocarpo con una sola capa de células......................... ................................................... C. lusitanica 1. Superficie lisa con dos pliegues laterales. Halo mucilaginoso ≤ 0.5 mm. Zona esclerenquimática del mesocarpo con varias capas de células ........................................... 2 2. Núculas obovadas, con glándulas .................. .......................................................P. vulgaris 2. Núculas elípticas, sin glándulas...................3 3. Núculas pardas. Región externa del mesocarpo ≤ 5 µm. Banda mucilaginosa de hasta 0.5 mm P. laciniata 3. Núculas pardo-rojizas. Región externa del mesocarpo > 7 µm. Banda mucilaginosa ≤ 0.4 mm ......................................... P. hyssopifolia DISCUSIÓN Además de las diferencias morfológicas referentes al cáliz, labio superior de la corola u hojas, que permiten la separación de los géneros Prunella y Cleonia (Heywood & Richardson, 1972; Valdés, 1987), los resultados obtenidos en este trabajo, junto a los aportados por otros autores (Wagner, 1914, Wojciechowska, 1961 y Fabre & Nicoli, 1965), parecen indicar que ambos géneros también pueden ser identificados teniendo en cuenta los caracteres carpológicos. Desde un punto de vista morfológico, de acuerdo con Fabre & Nicoli (1965) y Wojciechowska (1961) los caracteres de mayor interés para diferenciar estos géneros son la ornamentación, el hilo y la disposición de las células mucilaginosas. Así, mientras que en Prunella las núculas son lisas, con hilo situado sobre un apículo y tienen las células mucilaginosas restringidas a los vértices, en Cleonia son ruguladas con hilo integrado y células mucilaginosas que se distribuyen por toda la superficie. Por otro lado, según los resultados obtenidos y los aportados por Wagner (1914) y Wojciechowska (1961), la organización básica del pericarpo resulta bastante similar en C. lusitanica y en las distintas especies de Prunella. Sin embargo, aunque los taxones de ambos géneros presentan una zona del mesocarpo con células esclerenquimáticas, éstas son claramente diferentes tanto en número como en morfología. Además, mientras en Cleonia suelen aparecer cristales en las células esclerenquimáticas, incluso en las que forman la capa en empalizada, en Prunella están ausentes. No obstante, la presencia de estos cristales en las células esclerenquimáticas del mesocarpo no parece ser un carácter constante, ya que Ryding (1995) no los observó en el material de Cleonia procedente de Argelia, al igual que los engrosamientos escalariformes del endocarpo. En cuanto a la capa de células con cristales localizada encima de la capa en empalizada, aunque también ha sido observada en el mesocarpo de otros géneros de Lamiaceae como Salvia y Rosmarinus (Wagner, 1914), puede caracterizarse atendiendo al grosor y disposición, así como por el tipo y número Núculas de Prunella y Cleonia 209 Figura 2. Núculas de Prunella y Cleonia. A – F. P. hyssopifolia. G – L. C. lusitanica. Contorno dorsal: A, G; contorno ventral: B, H; detalles de la superficie: C–E, J-L; detalle del mucílago: F, I. Escalas: 50 µm (C, F, J-L); 100 µm (D, E); 500 µm (A, B, G-I). Nutlets of Prunella and Cleonia. A – F. P. hyssopifolia. G – L. C. lusitanica. Dorsal face: A, G; ventral face: B, H; details of surface: C – E, J-L; detail of mucilage: F, I. Scale bars: 50 µ m (C, F, J-L); 100 µ m (D, E); 500 µ m (A, B, G-I). 210 M. A. Martín Mosquero et al. 210 de cristales que presenta. La diferenciación de las tres especies estudiadas de Prunella es posible teniendo en cuenta los caracteres morfológicos. Así P. vulgaris es la única que muestra glándulas en la región apical de la núcula, si bien Wojciechowska (1961) no las menciona en el material de Europa meridional. Por otro lado, aunque P. laciniata y P. hyssopifolia presentan un mayor número de caracteres comunes, entre los que se pueden destacar la diferenciación celular en los surcos de los vértices, la curvatura del apículo y la ausencia de glándulas, son fácilmente distinguibles ya que las núculas de P. hyssopifolia tienden a ser fusiformes y muestran una tonalidad rojiza que no se ha observado en P. laciniata. Por otra parte, según Wojciechowska (1961) el tamaño de las núculas es un carácter de utilidad para separar P. vulgaris y P. laciniata, si bien, en el material examinado se ha encontrado un rango tan amplio de variación, tanto a nivel interespecífico como intraespecífico, que impide la utilización de dicho carácter para diferenciar las especies. Con anterioridad, otros autores (Winn & Werker, 1987) encontraron también una alta variación en el tamaño de las núculas de P. vulgaris, el cual podría estar relacionado con el hábitat y las condiciones ambientales en las que crecen las poblaciones (Winn, 1985, 1988). Desde un punto de vista anatómico, la estructura interna de las núculas en las tres especies estudiadas es bastante similar, presentando únicamente algunas diferencias respecto a los grosores de las distintas capas, que son útiles fundamentales para diferenciar P. laciniata y P. h yssopifolia. No obstante, hay que destacar la complejidad que muestra el mesocarpo, en el que se observan tres regiones bien diferenciadas: una parenquimática, otra esclerenquimática y una capa de células con pequeños cristales, también destacadas por Wagner (1914) para el mesocarpo de las especies incluidas en su trabajo. El estudio del mucílago ha sido de gran interés en ambos géneros y, de acuerdo con Grubert (1974), Prunella y Cleonia son claramente diferenciables por la excreción de dicha sustancia, que es en forma de bandas longitudinales en el primero y continua en el segundo. Así pues, Prunella se caracteriza tanto por la disposición de las células mucilaginosas en los cuatro vértices de la núcula, como por su forma de excreción. No obstante, este tipo de excreción no es exclusiva de la familia Lamiaceae, ya que con anterioridad fue observada en Chrysanthemum nivellii por Grubert (1974) y en algunas especies de Euphorbia por Netolitsky (1926, sec. Grubert, 1974). En los taxones estudiados se ha comprobado que, tras la liberación del mucílago las células se desorganizan quedando una cavidad de contorno oval en cada vértice de la núcula, donde en un principio había un grupo de células mucilaginosas. Teniendo en cuenta la cantidad de mucílago excretado, también se observan ciertas diferencias entre los taxones estudiados, aunque el tipo de elementos presentes en la matriz permanece constante en todos ellos. Así, de acuerdo con la clasificación propuesta por Ryding (1992a), P. vulgaris y P. laciniata muestran una reacción mucilaginosa fuerte que, en algunos casos, provoca la fusión de las bandas mucilaginosas formando un halo continuo similar, en apariencia, al que se observa en otros géneros de Lamiaceae como Salvia (Hedge, 1970). Sin embargo, en P. hyssopifolia la producción de mucílago es mucho menor, por lo que las bandas quedan perfectamente definidas, pudiendo incluso quedar incompletas o no llegar a formarse. Este fenómeno podría deberse a que las células mucilaginosas no sean funcionales, Núculas de Prunella y Cleonia 211 Figura 3. Esquema de la sección del pericarpo de Prunella y Cleonia. A: P. vulgaris. B: P. laciniata. C: P. hyssopifolia. D: C. lusitanica. Cutícula: c; epicarpo: epi; célula mucilaginosa: c.m.; mesocarpo: mes; capa en empalizada: c.e.; endocarpo: end; testa: t. Escala: 100 µm. Prunella and Cleonia’s pericarp structure in transversal section. A: P. vulgaris. B: P. laciniata. C: P. hyssopifolia. D: C. lusitanica. Cuticle: c; epicarp: epi; mucilaginous cell: c.m.; mesocarp: mes; esclerenchymatic cell layer: c.e.; endocarp: end; seed coat: t. Scale bar: 100 µ m. ya sea porque se trate de células vestigiales o bien porque no estén completamente formadas. El hecho de producir más o menos mucílago, podría estar relacionado con la capacidad de germinación en las distintas especies, ya que según Grubert (1974) una elevada producción de esta sustancia favorece la germinación de las semillas y explicaría la alta capacidad de germinación observada por Winn & Werker (1987) en P. vulgaris. La comprobación de estos resultados en las poblaciones del area de estudio han revelado que P. vulgaris y P. l aciniata presentan unos porcentajes cercanos al 100 y 90%, respectivamente, mientras que, como cabría esperar, P. h yssopifolia no supera el 30%. Por otro lado, autores como Ryding (1992b) indican la existencia de una relación entre la producción de mucílago y el tipo de hábitat, por lo que teniendo en cuenta que las tres especies examinadas viven en zonas húmedas, según este autor, deberían presentar poco mucílago difiriendo de lo observado en P. vulgaris y P. laciniata. En el caso de Cleonia una de las características del mucilago es que cuando es excretado tiene una consistencia muy densa, con una tonalidad lechosa y una gran cantidad de elementos en su matriz. Además, el tamaño de la núcula puede aumentar algo más del doble cuando es hidratada debido en gran medida por la abundancia del mucílago. Por esto último este taxón podría incluirse en un grupo de producción de mucílago abundante junto a otras Lamiaceae, no representadas en el área de estudio, como Dracocephallum y Dicerandra, a pesar de que Ryding (1992a) considera a Cleonia un género cuya producción de mucílago es moderada. Considerando exclusivamente los caracteres de las núculas, parece ser que los géneros Cleonia y Prunella presentan más