Estudio de dos modelos de alcoholización en ratas adolescentes sobre el selenio y los sistemas de defensa antioxidante. Proyección a pacientes alcohólicos crónicos

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA “ESTUDIO DE DOS MODELOS DE ALCOHOLIZACIÓN EN RATAS ADOLESCENTES SOBRE EL SELENIO Y LOS SISTEMAS DE DEFENSA ANTIOXIDANTE. PROYECCIÓN A PACIENTES ALCOHÓLICOS CRÓNICOS” TESIS DOCTORAL RUI MANUEL GOMES DE FIGUEIREDO RUA Directores: Olimpia Carreras Sánchez María Luisa Ojeda Murillo Fátima Nogales Bueno Sevilla, 2013 Dña. Olimpia Carreras Sánchez, Catedrática de Fisiología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, Dña. Mª Luisa Ojeda Murillo, Profesora Titular de Fisiología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla y Dña. Fátima Nogales Bueno, Profesora Contratada Doctor de Fisiología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, INFORMAN: Que la Tesis Doctoral titulada: “ESTUDIO DE DOS MODELOS DE ALCOHOLIZACIÓN EN RATAS ADOLESCENTES SOBRE EL SELENIO Y LOS SISTEMAS DE DEFENSA ANTIOXIDANTE. PROYECCIÓN A PACIENTES ALCOHÓLICOS CRÓNICOS” presentada por el Licenciado Rui Manuel Gomes de Figueiredo Rua, para optar al Grado de Doctor por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Fisiología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, reuniendo los requisitos exigidos. Y para que así conste donde proceda, en cumplimiento de las disposiciones vigentes, extendemos el presente informe, en Sevilla con fecha 11 de Septiembre de 2013. Fdo.: Olimpia Carreras Sánchez Fdo.: Mª Luisa Ojeda Murillo Fdo.: Fátima Nogales Bueno AGRADECIMIENTOS Quiero expresar mi afectuoso agradecimiento a todas aquellas personas que, de un modo u otro, han contribuido para la realización de esta Tesis Doctoral. A mis tutoras: A la Dra. Olimpia Carreras Sánchez, responsable de nuestro grupo, por sus consejos experimentados y confianza depositada en mí desde el primer momento. Gracias por todo lo que he aprendido y continúo aprendiendo. A la Dra. María Luisa Ojeda Murillo por sus valiosas observaciones. Sus útiles puntualizaciones en la realización de esta Tesis han sido cruciales para el feliz desenlace de la misma. A la Dra. Fátima Nogales Bueno por su inestimable ayuda y paciencia, y por las muchas horas que hemos compartido juntos. Sin su apoyo, su dedicación y sus conocimientos no hubiera sido posible llevar a buen puerto esta investigación. Quiero agradecer también: Al grupo de investigación del Departamento de Fisiología de la Universidad de Granada, bajo la dirección de la Dra. María Inmaculada López Aliaga, por su prestigiosa colaboración, cálida acogida y recursos técnicos proporcionados. Mi gratitud especial al Dr. Javier Díaz Castro por su disponibilidad y mi admiración por su competencia demostrada en el laboratorio. A los Departamentos de Medicina Interna y Digestiva de los Hospitales Universitarios Virgen de Valme y Virgen Macarena que ofrecieron las muestras sanguíneas y los datos clínicos de forma desinteresada. A todos los miembros de nuestro Departamento por el buen trato recibido. Por último, pero no menos importante, a mis padres y a mi hermano, mi eterna gratitud por su apoyo sin reservas. “Valeu a pena? Tudo vale a pena Se a alma não é pequena.” Fernando Pessoa ÍNDICE I. ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS ...............................................................3 1. Alcohol: generalidades .........................................................................................3 2. Alcohol y balance oxidativo .................................................................................4 2.1 Estrés oxidativo ………………………………………………………………... 4 2.1.1. Generalidades ……………………………………………………………... 4 2.1.2. Radicales libres y formación de especies reactivas de oxigeno ..................4 2.1.3. Daños celulares provocados por las especies reactivas de oxígeno (ERO) ..7 2.1.3.1. Reacción de radicales libres con los lípidos …………………………..8 2.1.3.2. Reacción de radicales libres con las proteínas ……………………….10 2.1.3.3. Reacción de radicales libres con el DNA ……………………………..10 2.1.4. Alcohol y estrés oxidativo ………………………………………………..11 2.1.4.1. Mecanismos involucrados en el daño oxidativo provocado por el alcohol ………………………………………………………………..14 2.1.4.1.1. Efectos metabólicos del exceso de NADH ……………………....14 2.1.4.1.2. Efectos ocasionados por el acetaldehído ………………………...15 2.1.4.1.3. Efectos generados por las especies reactivas de oxigeno ……….17 2.2. Sistemas de defensa antioxidante ……………………………………………18 2.2.1. Generalidades ……………………………………………………………18 2.2.2. Alcohol y sistemas de defensa antioxidante ……………………………..23 2.3. Selenio y selenoproteínas ……………………………………………………23 2.3.1. Generalidades ……………………………………………………………23 2.3.2. Selenoproteínas ………………………………………………………….25 2.3.2.1. Glutatión peroxidasa 1 ………………………………………………25 2.3.2.2. Glutatión peroxidasa 4 ………………………………………………26 2.3.2.3. Selenoproteína P …………………………………………………….27 2.3.3. Alcohol y selenio ………………………………………………………..28 3. Alcohol y daño hepático ...................................................................................30 4. “Binge drinking” ..............................................................................................37 4.1. Generalidades .................................................................................................37 4.2. Modelos de “binge drinking” .........................................................................40 4.2.1. Modelos animales de “binge drinking” administrado por vía parental ........................................................................................................41 4.2.1.1. Inyección intraperitoneal ……………………………………………...42 4.2.1.2. Inyección intravenosa …………………………………………………42 4.2.1.3. Infusión intragástrica ………………………………………………….42 4.2.2. Modelos animales de “binge drinking” administrado por vía oral ……......43 4.2.2.1. Gavage ...................................................................................................43 4.2.2.2. Consumo nocturno ................................................................................43 4.2.2.3. Modelo de 2 botellas (acceso intermitente de etanol) ..........................44 4.3. “Binge drinking” y balance oxidativo ………………………………………..44 4.4. “Binge drinking” y daño hepático ……………………………………………46 5. Alcoholismo crónico ...........................................................................................50 5.1. Generalidades ………………………………………………………………...50 5.2. Alcoholismo crónico y balance oxidativo ……………………………………54 5.3. Alcoholismo crónico y daño hepático ………………………………………. 55 II. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS …………………………………………………..59 III. MATERIAL Y MÉTODOS …………………………………………………..63 1. Diseño experimental – animales …………………………………………….. 63 1.1. Animales y condiciones experimentales …………………………………… 64 1.1.1. Dieta utilizada …………………………………………………………...64 1.1.2. Métodos de alcoholización ……………………………………………...64 1.1.3. Estudio nutricional ………………………………………………………65 1.1.4. Estudio macroscópico …………………………………………………...65 1.2. Toma y procesamiento de las muestras de ratas …………………………….66 1.2.1. Obtención y tratamiento de las muestras de sangre ……………………. 66 1.2.2. Obtención y tratamiento de las muestras de hígado …………………….66 1.2.3. Obtención y tratamiento de las muestras de orina ………………………66 1.2.4. Obtención y tratamiento de las muestras de heces ……………………...66 1.2.5. Estudio de índices biológicos …………………………………………...67 1.2.6. Homogeneizaciones hepáticas …………………………………………..67 1.2.6.1. Homogeneización hepática para la determinación de la actividad de las enzimas antioxidantes ……………………………………….67 1.2.6.2. Homogeneización hepática para la determinación de la peroxidación lipídica y oxidación de proteínas ………………………………….68 1.2.6.3. Homogeneización hepática para la determinación de proteínas por inmunodetección “Western Blotting” ……………………………...68 2. Población y diseño experimental – humanos ……………………………....69 2.1. Toma de las muestras de sangre …………………………………………...71 2.2. Determinación de la concentración total de proteínas …………………….71 2.3. Determinación de selenio ………………………………………………….71 2.4. Determinaciones enzimáticas y de biomoléculas ………………………….71 3. Determinaciones analíticas …………………………………………………72 3.1. Determinación de la concentración total de proteínas …………………….72 3.2. Determinación de alcohol en orina de ratas ……………………………….73 3.3. Determinación de selenio en suero, hígado, heces y orina ………………..74 3.4. Determinaciones enzimáticas y de biomoléculas …………………………77 3.4.1. Determinación de la actividad glutatión peroxidasa …………………. 77 3.4.2. Determinación de la actividad glutatión reductasa …………………....78 3.4.3. Determinación de la actividad superóxido dismutasa ………………...80 3.4.4. Determinación de la actividad catalasa ……………………………….82 3.4.5. Determinación de la peroxidación lipídica ……………………………84 3.4.6. Determinación de la oxidación de proteínas ………………………….85 3.4.7. Determinación del daño en el DNA …………………………………..87 3.5. Análisis de expresión de las proteínas GPx-1, GPx-4 y selenoproteína P ..90 3.5.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS: SDS-PAGE ……….91 3.5.2. Transferencia de proteínas …………………………………………….95 3.5.3. Inmunodetección ……………………………………………………...96 3.5.4. Revelado ………………………………………………………………97 3.6. Parámetros bioquímicos de las ratas ………………………………………98 4. Tratamiento estadístico .................................................................................98 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................103 1. Animales …………………………………………………………………...103 1.1. Control nutricional y homeostasis del selenio …………………………...103 1.1.1. Estudio del peso corporal …………………………………………...103 1.1.2. Estudio de la ingesta sólida …………………………………………104 1.1.3. Estudio de la ingesta líquida ………………………………………..105 1.1.4. Estudio de la ingesta calórica ……………………………………….106 1.1.5. Estudio de la homeostasis del selenio ………………………………107 1.2. Determinación de alcohol en orina ……………………………………..108 1.3. Estudios en suero y sangre ……………………………………………...109 1.3.1. Parámetros bioquímicos …………………………………………….109 1.3.2. Estudio del estrés oxidativo en suero ……………………………….112 1.4. Estudio del estrés oxidativo en el hígado ……………………………….119 1.4.1. Análisis macromorfológico del hígado ……………………………..120 1.4.2. Balance antioxidante y marcadores del estrés oxidativo …………...121 1.4.3. Expresión de las selenoproteínas hepáticas ………………………...130 2. Humanos .....................................................................................................134 2.1. Estudios en suero y en sangre …………………………………………..134 2.1.1. Parámetros bioquímicos y hematológicos ………………………….134 2.1.2. Estrés oxidativo …………………………………………………….136 V. CONCLUSIONES .......................................................................................147 VI. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................151 I-ANTECEDENTES BIBLIOGRÁFICOS Antecedentes Bibliográficos 8 2.1.3.1. Reacción de radicales libres con los lípidos La peroxidación lipídica es el daño oxidativo provocado por el ataque de una especie reactiva, generalmente el OH•, sobre los ácidos grasos poliinsaturados de las membranas celulares, aunque también, se produce peroxidación en otras estructuras supramoleculares, como son los fosfolípidos y los agregados de lipoproteínas. El proceso de peroxidación lipídica, ocurre en tres etapas bien caracterizadas: iniciación, propagación y terminación (Figura 3). La iniciación se basa en la extracción de un electrón a un átomo de carbono contiguo a un doble enlace por parte de un iniciador como el OH•. De este modo se forma un radical alquilo (L•) que se transforma en peroxilo (LOO•) por adición de O2 y que en diversas reacciones, como su reducción a hidroperóxido lipídico (LOOH), puede llevar a la propagación de la peroxidación al generar otro radical alquilo (L•) en un ácido graso contiguo en la membrana. La propagación explica el carácter de reacción en cadena de la peroxidación lipídica, por medio de la cual una sola iniciación puede dañar un gran Figura 2. Daños celulares provocados en función de la cantidad de especies reactivas que se forman en las células (Martindale y Holbrook, 2002). Especies reactivas de oxígeno Nivel bajo Nivel intermedio Nivel alto Mitogénesis Detención del crecimiento Envejecimiento Muerte celular Apoptosis Necrosis Antecedentes Bibliográficos 9 número de moléculas. Por fin, este proceso termina mediante la reacción de radicales contiguos (por ejemplo de tipo alquilo), originando puentes cruzados (L-L), o mediante la fragmentación del ácido graso en un gran número de productos como el malondialdehído (MDA), el 4-hidroxinonenal o los alcanos (Porter y cols., 1995). La cuantificación del MDA es el método más utilizado para evaluar la peroxidación lipídica (Chen y cols., 2011). Todo este proceso genera cambios en las propiedades físicas y químicas de las membranas, alterando el transporte activo y pasivo, provocando la rotura de las mismas, incluso la muerte celular (Barreiros y cols., 2006; Vasconcelos y cols., 2007). A su vez, la oxidación de lípidos en la sangre daña las paredes de las arterias y venas, facilitando la acumulación de estos lípidos y, por tanto, favoreciendo la aterosclerosis, pudiendo generar trombosis, infarto o accidentes cerebrovasculares (Barreiros y cols., 2006). Figura 3 . Las reacciones principales de la peroxidación lipídica: LH= lípido intacto; L• = radical lipídico alquilo; LOO• = radical lipídico peroxilo; LOOH= hidroperóxido lipídico; LO• = radical lipídico alcoxilo; LOH= hidróxido lipídico (estable) (Barja de Quiroga, 1997). Antecedentes Bibliográficos 10 2.1.3.2. Reacción de radicales libres con las proteínas El radical OH•, entre otros, reacciona con las proteínas y puede originar alteraciones en diversos residuos aminoacídicos. Forma entrecruzamientos de tipo covalente e induce la fragmentación de la cadena polipeptídica, llevando a una pérdida de la función, o a un incremento de la susceptibilidad a enzimas proteolíticas (GonzálezTorres, 2000). Estos cambios, eventualmente, pueden inducir inflamación en los tejidos y muerte celular (Goetz y Luch, 2008). La oxidación de aminoácidos específicos como la arginina, la lisina y la prolina provoca la formación de derivados de tipo carbonilo (Yan y Forster, 2011). La determinación de la concentración de los grupos carbonilo es un buen indicador del nivel de oxidación proteica (Valko, 2007). 2.1.3.3. Reacción de radicales libres con el DNA Las ERO son la principal fuente de daño al DNA. La lesión del DNA puede surgir por interacción directa de estos radicales con las bases del ácido nucleico o puede ser debida a los componentes producidos durante la oxidación lipídica (Seifried y cols., 2007). Se estima que la frecuencia del daño oxidativo al DNA, en células humanas, es de 104 lesiones/células/día (Klaunig y cols., 2010). Los radicales libres atacan el azúcar desoxirribosa y las bases purínicas (adenina y guanina) y pirimidínicas (timina, citosina y uracilo), y pueden llegar a provocar la rotura de la cadena de DNA. La permanente modificación del material genético, por este proceso, representa el primer paso para el desarrollo de oncogénesis y muerte celular (Vasconcelos y cols., 2007). Varias ERO tienen la capacidad de formar bases oxidadas, siendo el radical OH• el más relacionado con esta situación. La reactividad de esta molécula es tal que su migración en la célula es limitada y por eso interacciona rápidamente con los constituyentes celulares, modificando las bases, provocando inestabilidad genómica y alterando la expresión de los genes (Klaunig y Kamendulis, 2004; Fruehauf y Meyskens Jr, 2007). Por otro lado, el H2O2 es menos reactivo, pero puede difundir más fácilmente que el OH•, participando en la formación de bases oxidadas a través de las reacciones de Antecedentes Bibliográficos 11 Fenton y Haber-Weiss (Klaunig y cols., 2010). También las ERO provocan la activación de oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores, favoreciendo la aparición de procesos cancerígenos (Kundu y Surh, 2008). El ensayo de electroforesis en gel de células individuales o “Ensayo Comet” es un método ampliamente utilizado para monitorizar posibles daños producidos por agentes genotóxicos, como las ERO, en el DNA (Duthie y cols., 1996). 2.1.4. Alcohol y estrés oxidativo La inducción del estrés oxidativo, provocado por la ingesta de alcohol, está relacionada con su propio metabolismo. La degradación metabólica del alcohol se produce esencialmente en el hígado (alrededor de un 90%) y en menor extensión en el estómago, siendo este último órgano especialmente relevante a dosis bajas de alcohol, por encargarse de su metabolización. Sólo una pequeña proporción del etanol ingerido (entre un 2-10%) escapa de la oxidación y es eliminado por los riñones y los pulmones (Lieber, 1997). Existen tres vías mediante las cuales se produce el metabolismo del alcohol, que han sido asumidas como clásicas e implican enzimas como la alcohol deshidrogenasa (ADH), el sistema microsomal oxidativo del etanol (SMOE) y la catalasa (Figura 4). Cada una de estas vías lleva a la formación de numerosos radicales libres y al consiguiente desbalance del estado oxidativo (Zima y cols., 2001). La actuación de la alcohol deshidrogenasa (ADH) es fundamental para el metabolismo del etanol. La mayor parte del etanol es oxidado por esta vía, dado que, en circunstancias fisiológicas normales, el SMOE metaboliza el 10% del alcohol en el hígado, y la catalasa sólo un 2% (Cederbaum y cols., 2009; Guo y Ren, 2010; ManzoAvalos y Saavedra Molina, 2010). La ADH se encuentra predominantemente en el citosol hepático, aunque también se expresa en otros tejidos, entre ellos el estómago y el riñón, siendo la ADH gástrica responsable del primer paso metabólico del alcohol, actuando como una “barrera protectora” y modulando su paso a la circulación sistémica (Fortea y cols., 1999; Bode y Bode, 2003). Antecedentes Bibliográficos 12 En las personas que consumen alcohol de forma esporádica o en dosis moderadas, la ADH hepática es la enzima encargada de llevar a cabo la oxidación de la mayor parte del etanol ingerido y convertirlo en acetaldehído (una molécula muy tóxica), con la consiguiente formación de la coenzima nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) a partir de la misma coenzima en su forma oxidada (NAD+). El acetaldehído formado se transforma a su vez en acetato por medio de una enzima de la matriz mitocondrial, la acetaldehído-deshidrogenasa (ALDH) (Lieber, 2005). A pesar de su alta afinidad (Km = 0.2-2 mmol/L), la dotación enzimática de ADH es limitada, siendo efectiva cuando las concentraciones de alcohol en sangre no son elevadas (Comporti y cols., 2010; ManzoAvalos y Saavedra-Molina, 2010). Además, si se producen cantidades excesivas de NADH, este no es reoxidado en proporción suficiente para reponer el NAD+, por lo que se altera la homeostasis redox NAD+/NADH, lo que compromete la actividad de la ADH y provoca desequilibrios metabólicos (Cascales y cols., 1997; Otero y Cortés, 2008). El sistema microsomal oxidativo del etanol (SMOE), dependiente del citocromo P450, también está involucrado en el metabolismo oxidativo del etanol. Este sistema presenta varias isoformas, las cuales poseen distintas capacidades de oxidar el etanol. La isoforma 2E1 (CYP2E1), ubicada en la membrana del retículo endoplasmático hepático, es inducida por un consumo crónico y agudo de alcohol y desempeña un papel importante metabolizando el alcohol a acetaldehído ante concentraciones elevadas (Das y Vasudevan, 2007; Lu y Cederbaum, 2008; Artun y cols., 2010). Parece existir una correlación entre el grado de inducción de esta isoforma y la producción de radicales libres como el anión O2y el H2O2 (Dey y Cederbaum, 2006; Wu y cols., 2006). En presencia de metales de transición, como el hierro, las especies reactivas de oxígeno pueden ser convertidas además, en radicales OH•, ocasionando peroxidación lipídica y oxidación de proteínas (Wu y cols., 2006). La elevada eficiencia en reducir el O2 a O2y H2O2 por el CYP2E1 lleva a que éste sea considerado uno de los factores clave que favorecen el estrés oxidativo producido por el consumo crónico y agudo de alcohol (Albano, 2006; Lu y Cederbaum, 2008). La inducción microsomal provocada por el consumo alcohólico crónico no sólo incrementa la oxidación del etanol, sino también aumenta el metabolismo de diversos substratos microsomales, concretamente fármacos como la varfarina, el propanolol, el diazepam, la rifampicina, entre otros, lo que acarrea Antecedentes Bibliográficos 13 una menor efectividad de estas moléculas en la dosis habitual. Por otro lado, el consumo agudo de alcohol inhibe el metabolismo hepático de los fármacos, por competencia en un proceso común con el citocromo P450 (Lieber, 1997). El papel de la catalasa (CAT) en la oxidación del etanol parece tener menor importancia (Lieber, 1999). De ubicación en los peroxisomas celulares y especialmente en el hígado, requiere la producción de una cantidad significativa de H2O2 que puede ser generada mediante la oxidación de NADPH por acción de la NADPH oxidasa o por la oxidación de la hipoxantina por la xantina oxidasa (Lieber, 1997; Comporti y cols., 2010). Pero además de las principales vías oxidativas, el etanol también se metaboliza, aunque en menor medida, por una vía no oxidativa mediante la cual se forman esteres etílicos de ácidos grasos, que pueden estar involucrados en los daños tisulares provocados por el alcohol. Esta reacción es catalizada por la enzima ácido graso etil ester sintetasa (FAEE = fatty acid ethyl ester) y aparece en diversos órganos como corazón, páncreas, cerebro e hígado (Beckemeier y Bora, 1998; Quertemont, 2004). Catalasa Etanol (CH3CH2OH) Acetaldehído (CH3CHO) Acetato (CH3COOH) CYP2E1 Figura 4 . Vías del metabolismo oxidativo del etanol (Zhu y cols., 2012). Antecedentes Bibliográficos 14 2.1.4.1. Mecanismos involucrados en el daño oxidativo provocado por el alcohol La acumulación de acetaldehído y de NADH (los dos principales productos resultantes del metabolismo oxidativo del alcohol) es responsable de la gran mayoría de los daños celulares que el alcohol genera, sea por la toxicidad intrínseca del acetaldehído, sea por el desequilibrio del estado redox que se produce al incrementar la ratio NADH/NAD+ o por las ERO generadas (Zhang y cols., 2004). 2.1.4.1.1. Efectos metabólicos del exceso de NADH El incremento en la ratio NADH/NAD+ en el citosol y las mitocondrias de los hepatocitos influye sobre determinadas reacciones reversibles que tienen lugar en el hígado ocasionando alteraciones en el metabolismo hepático de los lípidos, carbohidratos y proteínas, entre otros. Así, como consecuencia de este desbalance se produce (Figura 5): Hiperlactacidemia e Hiperuricemia: Niveles elevados de NADH, y por consiguiente la falta de NAD+, llevan a una síntesis anormal de ácido láctico a partir de piruvato. El aumento de ácido láctico produce una acidosis alcohólica y acarrea una reducción en la capacidad excretora de ácido úrico por el riñón, pudiendo causar gota (Lieber, 2003). Hipoglucemia: El incremento del NADH ocasiona una reducción en la concentración de piruvato evitando su conversión a glucosa, lo cual a su vez, disminuye la reacción de la piruvato carboxilasa, inhibiendo la gluconeogénesis hepática (Zakhari y Li, 2007). Hipertrigliceridemia: El aumento de NADH eleva la concentración de αglicerofosfato, que promueve la acumulación de triglicéridos hepáticos por atrapamiento de ácidos grasos, contribuyendo a la formación de un hígado graso (esteatosis). Además, el exceso de NADH también disminuye la oxidación de ácidos grasos (Lieber, 1997). Antecedentes Bibliográficos 15 Hipoxia: El metabolismo del alcohol favorece el consumo de oxigeno, originando un estado de hipoxia significativa en los hepatocitos perivenosos, situación que puede favorecer al desarrollo de la lesión hepática (Bunout, 1999; Zakhari y Li, 2007). 2.1.4.1.2. Efectos ocasionados por el acetaldehído El acetaldehído es el principal producto metabólico de la oxidación del etanol. Su metabolización a acetato por la ALDH, a nivel mitocondrial, puede disminuir por efecto de la ingesta crónica de alcohol, situación esta que conjuntamente con la inducción del SMOE puede originar una acumulación excesiva de acetaldehído (Lieber, 2005). En consecuencia, el acetaldehído así formado desencadena diversos efectos nocivos a nivel celular: ● Disminuye los niveles de glutatión reducido (GSH), amplia los efectos tóxicos de las especies reactivas de oxígeno y promueve la peroxidación lipídica, originado daños en la integridad de las membranas celulares y mitocondriales (Manzo-Avalos y Saavedra Molina, 2010). ● Se une de manera covalente a las enzimas microsomales hepáticas como el CYP2E1, o a otras proteínas como la tubulina y el colágeno, induciendo la formación de aductos de proteínas, complejos que actúan como neoantígenos. Estos promueven la respuesta inmune y pueden provocar la muerte de los hepatocitos (Setshedi y cols., 2010). Figura 5 . Consecuencias del desequilibrio NADH/NAD + . Antecedentes Bibliográficos 16 Además, el enlace con la tubulina de los microtubulos lleva a una disminución de la secreción proteica, incrementando la retención de proteínas en el hígado, haciendo que los hepatocitos adquieran un aspecto redondeado de tamaño aumentado, concomitante a la acumulación de lípidos y agua (Ishii y cols., 1997). ● Genera aductos de DNA que pueden favorecer el proceso de carcinogénesis desencadenando errores de replicación y mutaciones puntuales. A su vez, el acetaldehído puede unirse directamente a proteínas relacionadas con la reparación y metilación del DNA y, de esta manera, interferir en los procesos que mantienen la estabilidad y la integridad del DNA genómico (Seth y cols., 2010). ● Estimula la síntesis de colágeno tipo I en las células estrelladas hepáticas, favoreciendo el desarrollo de la fibrosis hepática (Greenwel, 1999; Tuma y Casey, 2003). ● Perjudica la función de los factores de coagulación inactivándolos, incrementando el tiempo de coagulación (Brecher y cols., 2006). Además, parece contribuir en la macrocitosis que se verifica en pacientes con un consumo excesivo de alcohol, por la formación de aductos en la membrana de los eritrocitos (Koivisto y cols., 2006). ● Estimula la liberación de moléculas de señalización (histamina, epinefrina, norepinefrina y bradiquinina), incrementando los síntomas cardiovasculares que se verifican por reacción de sensibilidad alcohólica, tales como la vasodilatación y el enrojecimiento facial (Guo y Ren, 2010). ● Influye en la contractilidad miocárdica, al interferir en el proceso de excitacióncontracción y al inhibir la liberación de Ca2+ por el sarcolema y el retículo endoplasmático, pudiendo contribuir, de este modo, al desarrollo de la cardiomiopatía alcohólica (Li y Ren, 2008). ● Se puede unir a la apolipoproteína B-100, un componente de las LDL oxidadas y generar aductos que fomentan la producción y la liberación en las células del endotelio Antecedentes Bibliográficos 17 de citoquinas con actividad proinflamatoria y moléculas de adhesión, conocidos mediadores del proceso de aterosclerosis (Ström y cols., 2007; Redmond y cols., 2009). 2.1.4.1.3. Efectos generados por las especies reactivas de oxígeno Como hemos comentado anteriormente el metabolismo oxidativo del etanol ocurre, predominantemente, en el hígado, verificándose un incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) en las células hepáticas, concretamente por acción de las mitocondrias, el CYP2E1, la NAD(P)H oxidasa (NOX) y por la oxido nítrico sintasa inducida (iNOS), con una consecuente depleción de los mecanismos de defensa antioxidante. Tal desbalance puede provocar una disfunción mitocondrial con una pérdida en la producción de energía e incluso, originar la muerte celular (Sato, 2007; Zhu y cols., 2012). ● Las ERO, como comentamos anteriormente, provocan daño en biomoléculas tales como lípidos, proteínas y los ácidos nucleicos. La peroxidación lipídica de los componentes lipídicos de las membranas celulares lleva, a su vez, a la producción de más radicales libres, ampliando los daños celulares. Además, aminoácidos como la cisteína, la metionina y la histidina, son particularmente susceptibles a los ataques y la oxidación provocada por el radical OH•, elemento este que tiene una producción facilitada por la acumulación de hierro a nivel hepático debido al consumo del alcohol. Como resultado se producen cambios significativos a nivel de la estructura de las proteínas, que pueden dañar las células de forma irreversible (Purohit y cols., 2009; Ajakaiye y cols., 2011). Por otro lado, las ERO pueden lesionar el material genético por medio de diversos mecanismos, tales como oxidación y fragmentación de bases, rotura de las cadenas, sencilla y doble, del DNA y formación de puentes cruzados, lo que lleva a cambios en los procesos de transcripción y transducción, y a errores en la replicación celular (Rulten y cols., 2008; Zhu y cols., 2012). ● Las ERO también pueden llevar a la activación del factor de transcripción nuclear (NFkB) y a toda su cascada de señalización, provocando un aumento en la expresión de citoquinas pro-inflamatorias y de moléculas de adhesión, que juegan un papel importante en la iniciación y en la progresión de diversas enfermedades inflamatorias Antecedentes Bibliográficos 24 suplementos, y en el agua, siendo útil también como fuente nutricional en animales (Lucia y cols., 2010; Rayman, 2012). De manera general, el Se es bien absorbido por el tracto gastrointestinal (cerca de 93%) (Lucia y cols., 2010). El contenido de Se en el cuerpo humano varía entre 10 y 20 mg, siendo inferior al 0.01% del peso corporal total (Forceville, 2001). Este nutriente es almacenado en los tejidos en concentraciones variables: el 30% del Se tisular se localiza en el hígado, el 15% en los riñones, un 30% en el músculo, un 10% en el plasma y el 15% restante se encuentra distribuido por otros órganos (Patrick, 2004). Su biodisponibilidad depende de su absorción intestinal y de su conversión a una forma biológicamente activa, presentando las formas orgánicas del Se una mayor biodisponibilidad (Navarro-Alarcon y Cabrera Vique, 2008). Una vez ingerido, la transformación del Se a formas biológicamente activas tienen lugar mediante diferentes rutas metabólicas (Mercadal y cols., 2005). La selenometionina se incorpora al azar en lugar del aminoácido metionina, en distintas proteínas, y es transformada a selenocisteína mediante una transulfuración (Almondes y cols., 2010). La selenocisteína, al contrario de la selenometionina, no se almacena de esta forma, sino que es catabolizada directamente y, el Se resultante (selenuro) constituye otra reserva de Se. Las formas inorgánicas, como el selenato (Se+6) y el selenito (Se+4), al igual que la selenocisteína, son almacenadas en forma de selenuro (Se-2), el cual se utiliza para la formación de selenofosfato, que es un precursor de la selenocisteína. Cuando las células necesitan las reservas de selenometionina, ésta se libera por proteólisis. Sin embargo, algunos autores preconizan que la cantidad de Se disponible en el organismo desde el reservorio de selenometionina está sujeta al metabolismo de la metionina, de manera independiente de la necesidad de Se del organismo (Mercadal y cols., 2005). El Se es eliminado principalmente por excreción urinaria, sea en condiciones adecuadas de ingesta o en casos de suplementación, aunque también se produce una pérdida significativa por vía fecal, mientras que alrededor del 5% se elimina por vía cutánea y pulmonar (Castro, 2007; Lucia y cols., 2010). Antecedentes Bibliográficos 25 2.3.2. Selenoproteínas La selenocisteína es la responsable de la actividad biológica de 25 selenoproteínas, entre ellas las GPxs (Sánchez, 2009; Rayman, 2012). La localización principal y las funciones más importantes de las selenoproteínas más conocidas se encuentran resumidas en la Tabla 1. Precisamente, por formar parte de las diferentes selenoproteínas, se le han atribuido al selenio propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y antivirales (Negro, 2008). Se postula que el selenio modula el estrés oxidativo, principalmente, a través de las diferentes GPxs y por la selenoproteína P (la mayor selenoproteína presente en el plasma), fundamentalmente, reduciendo los niveles de peróxido de hidrógeno, lípidos y fosfolípidos hidroperóxidos (Rayman, 2000). Por esta razón, entre otras, la deficiencia de Se ha sido relacionada con diversas alteraciones como son el cáncer, la infertilidad, el deterioro de las funciones inmunes y tiroideas, el desarrollo de enfermedades cardiovasculares y de patologías neurodegenerativas como Alzheimer y Parkinson, e incluso en la enfermedad alcohólica (Johansson y cols., 1986; Papp y cols., 2007; Tinggi, 2008). Las isoformas de GPx: GPx1 y GPx4, así como la selenoproteína P se encuentran entre las selenoproteínas más abundantes en el hígado (Hoffmann, 2007). 2.3.2.1. Glutatión peroxidasa 1 La GPx1 fue la primera selenoproteína identificada. Se localiza en el citosol celular y se expresa de manera ubicua (Tapiero y cols., 2003). La GPx1 protege a las células de los fenómenos oxidativos generados por las especies reactivas de oxígeno. Para ello, cataliza la reducción del H2O2 y de algunos hidroperóxidos orgánicos, utilizando el GSH como reductor, transformándolos en agua y alcoholes. Durante este proceso el glutatión es oxidado, regresando, posteriormente, a su estado original por acción de la enzima GR, con el objetivo de mantener los niveles de GSH (Papp y cols., 2007). La GPx1 es una de las selenoproteínas más sensibles a los cambios de Se en el organismo, presentando niveles drásticamente reducidos ante una disminución de este nanoelemento (Sunde y cols., 2009). La síntesis global de la proteína se reduce en Antecedentes Bibliográficos 26 condiciones de estrés como forma de reserva de recursos celulares y su recuperación se produce de forma más rápida que otras selenoproteínas (Reeves y Hoffmann, 2009). Se verificó que ratones knockout GPx1 presentaban un desarrollo normal, lo que sugería que la ausencia de esta selenoproteína, en el sistema de defensa antioxidante, podría ser compensada por otras proteínas. Por otra parte, se comprobó que estos ratones no sobrevivían ante situaciones generadoras de estrés oxidativo severas, independientemente de cualquier suplementación de Se, al contrario de ratones normales selenio suplementados. Tales hallazgos indican que la GPx1 no puede ser reemplazada por cualquier otra selenoproteína en la protección del estrés oxidativo generalizado y que esta presenta una función primaria antioxidante in vivo (BrigeliusFlohé y Maiorino, 2013). 2.3.2.2. Glutatión peroxidasa 4 La GPx4 es una enzima esencial para la vida como se comprobó al utilizar ratones knockout GPx4, que presentaron mortalidad embrionaria temprana (Liang y cols., 2009). Esta selenoproteína es la única glutatión peroxidasa, y probablemente la única enzima antioxidante, que reduce de manera directa los hidroperóxidos de fosfolípidos en las membranas y lipoproteínas (Brigelius-Flohé y Kipp, 2009). Debido a esta función biológica, la GPx4 se encuentra íntimamente asociada a la membrana celular. Además, esta selenoproteína está involucrada en el metabolismo de lípidos tales como el ácido araquidónico y el ácido linoleico, disminuye la síntesis de leucotrienos, de la prostaglandina E, y del factor activador de plaquetas (mediadores que desempeñan un papel de relevo en la inflamación y en la aterogénesis), y favorece la actividad de leucocitos polimorfonucleares, pudiendo modular también por esta vía la respuesta inflamatoria e inmunológica (Hattori y cols., 2005; Guo y cols., 2008; Reeves y Hoffmann, 2009). Por otro lado, la sobreexpresión de esta enzima disminuye la activación del NFkB en una diversidad de células sometidas a diferentes estímulos, lo que pone de manifiesto, aún más, su importancia como mediador en los procesos inflamatorios (BrigeliusFlohé Antecedentes Bibliográficos 27 y Kipp, 2009). Además, por amortiguación de la vía de señalización del NFkB, la GPx4 reduce la expresión de la metaloproteinasa 1 de la matriz, la cual se sobreexpresa durante los períodos de invasión y metástasis de diversos tumores (Ufer y Wang, 2011). La GPx4 se expresa de manera elevada en los testículos de mamíferos, existiendo estudios que correlacionan la infertilidad masculina con una depleción de los niveles de GPx4 (Imai y cols., 2001; Foresta y cols., 2002). Estando también implicada en la maduración de los espermatozoides, y por ende, en la fertilidad masculina. Es el componente estructural principal de la cápsula espermática mitocondrial y juega un papel preponderante en la condensación de la cromatina espermática, al actuar como una peroxidasa tiol de proteínas (Conrad y cols., 2005). 2.3.2.3. Selenoproteína P La selenoproteína P es una proteína de gran relevancia muy abundante en el plasma, que alcanza, en ratas, una concentración de alrededor de 30 µg/mL, lo cual representa el 60% del Se plasmático (Tapiero y cols., 2003). Fue la segunda selenoproteína identificada, y al contrario que cualquier otra selenoproteína, contiene diez residuos de selenocisteína en lugar de uno (Burk y cols., 2005; Rayman, 2009). La selenoproteína P posee dos importantes propiedades: actúa como biomarcador de la cantidad de Se corporal, ya que es la proteína transportadora mayoritaria de Se en suero, y posee capacidad antioxidante. La selenoproteína P se sintetiza, principalmente, en el hígado y transporta el Se desde el hígado (principal reservorio de Se en el organismo) hacia otros órganos. Por esta razón, diversos hallazgos sugieren que la selenoproteína P es un buen indicador del estado nutricional de Se en el organismo (Ashton y cols., 2009; Rasmussen y cols., 2009; Hurst y cols., 2010). Además, la selenoproteína P funciona como un antioxidante extracelular asociado al endotelio vascular que inhibe la actividad de radicales libres como el peroxinitrito y reduce los fosfolípidos hidroperóxidos actuando en asociación con el GSH o la tiorredoxina (Andoh, 2005). En caso de enfermedad crítica se ha verificado una disminución de esta proteína, siendo este un fenómeno secundario a la regulación negativa desencadenada por mediadores inflamatorios tales como el Factor de Necrosis Tumoral α (TNF-α), la Antecedentes Bibliográficos 28 Interleuquina 1 β (IL-1 β) y el Interferón γ (IFNγ) (Angstwurm y Gaertner, 2006; Geoghegan y cols., 2006). Selenoproteínas Localización Funciones GPx1 Hígado y eritrocitos Antioxidante Cataliza la reducción de H2O2 y otros peróxidos orgánicos GPx2 Aparato gastrointestinal Actividad antiapoptótica Mantiene la integridad de la mucosa intestinal GPx3 Plasma, intestino, riñón Antioxidante en los fluidos extracelulares Cataliza la reducción de H2O2 y otros peróxidos orgánicos GPx4 Testículos, cerebro e hígado Cataliza la reducción de los hidroperóxidos de fosfolípidos Antiinflamatoria/ S.Inmune Esencial para la condensación de la cromatina de las espermátidas Tiorredoxinas reductasas 1, 2 y 3 Todos los tejidos Actividad redox Síntesis de DNA Controla la actividad de factores de transcripción, proliferación celular y apoptosis Isoenzimas Deiodinasas 1, 2 y 3 Diversos tejidos Regulan la síntesis y degradación de las hormonas tiroideas Selenoproteína P Hígado Transporte y distribución de selenio por vía plasmática Antioxidante endotelial 2.3.3. Alcohol y selenio Numerosos estudios demuestran que el consumo de alcohol influye sobre los niveles de selenio (agente antioxidante) en diversos órganos de animales y humanos. Así, en crías de ratas sometidas a un consumo crónico de alcohol, se verificó una disminución de los niveles de selenio en hígado, corazón y riñón (Ojeda y cols., 2010). Esta deficiencia también se había observado, anteriormente, en el hígado y las heces de Tabla 1. Selección de selenoproteínas mejor estudiadas. Antecedentes Bibliográficos 29 cerdos tratados con etanol (Sivaram y cols., 2003). A su vez, en humanos se ha encontrado una reducción significativa de los niveles de selenio en suero e hígado de pacientes alcohólicos con o sin enfermedad hepática (Thuluvath y Triger, 1992; Guarini y cols., 1998; Zachara y cols., 2001; González-Reimers y cols., 2009). Varias hipótesis han sido propuestas para explicar la depleción de selenio como consecuencia del consumo de etanol: (1) una ingesta dietética insuficiente como resultado de una mala nutrición; (2) un déficit en su absorción intestinal, por alteración de la mucosa intestinal; (3) la producción de ERO por el metabolismo oxidativo del alcohol; (4) así como una disfunción hepática (Van Gossum y Nève, 1995; GonzálezReimers y cols., 2008; Sher, 2008; Ojeda y cols., 2009). Generalmente, los individuos alcohólicos no suelen llevar una dieta equilibrada, pudiendo presentar alteraciones a nivel de absorción intestinal y aprovechamiento de nutrientes. Tal situación hace que estos pacientes, puedan padecer malnutrición primaria o secundaria (Moreno y Cortés, 2008). La malnutrición primaria se verifica cuando el consumo de alcohol reemplaza a otros nutrientes de la dieta, disminuyendo la ingesta sólida total (Lieber, 2003). Esto puede ser debido a que el alcohol es un nutriente rico en energía (1 g de alcohol equivale a 7.1 Kcals), con un valor superior a lo que aportan los hidratos de carbono y las proteínas, y que se estima, puede representar un 50% de la energía calórica ingerida diariamente por los alcohólicos (Maillot y cols., 2001; Lieber, 2005). A su vez, la malnutrición secundaria ocurre cuando, a pesar de ingerir alimentos de manera adecuada, el consumo excesivo de alcohol interfiere con su absorción intestinal, mermando, de este modo, la biodisponibilidad de los nutrientes pues modifica morfológica y bioquímicamente, la mucosa intestinal (Bode y Bode, 2003; Lieber, 2003; Foster y Marriott, 2006). Además, otros investigadores consideran que el alcohol per se contribuye a la disminución de Se en el organismo, independientemente del estado nutricional del sujeto. Así, en un estudio realizado por nuestro grupo de investigación, en ratas sometidas a alcohol y en ratas que ingerían una dieta isocalórica, se verificó una redistribución diferente de los niveles de Se en suero e hígado, por lo que se pudo deducir que el consumo de alcohol crónico per se, y no sólo la malnutrición, altera la Antecedentes Bibliográficos 30 distribución de este micronutriente (Ojeda y cols., 2009). A su vez, en un estudio llevado a cabo en pacientes con enfermedad hepática alcohólica, cuya dieta era rigurosamente controlada, no se encontró una asociación entre la ingesta de nutrientes y los niveles reducidos de Se (Bergheim y cols., 2003). Probablemente, uno de los mecanismos por los cuales el alcohol actúa sobre la homeostasis del Se, es por su metabolismo oxidativo, pues al generar ERO el organismo consume Se para sintetizar la enzima antioxidante GPx. Esto concuerda con lo encontrado por diversos autores, que observaron en pacientes alcohólicos una disminución de la actividad de la GPx en el suero (Peng y cols., 2005; Huang y cols., 2009). Además, se ha verificado una disminución de los niveles de Se en suero tras el consumo crónico de alcohol (González-Reimers y cols., 2009). Sin embargo, muy pocos trabajos han analizado ambos parámetros a la vez. En concreto, algunos autores, miden la actividad de la GPx en suero, eritrocitos o sangre total como marcadores del estado nutricional de Se en el organismo (Boosalis, 2008; Stefanowicz, 2013). Otro mecanismo bien constatado y aceptado es que el alcohol deteriora la función hepática. La presencia de daño hepático empeoraría la síntesis de selenoproteínas, como la selenoproteína P -un importante transportador de Se desde el hígado hacia otros tejidoslo que acarrearía un déficit de este elemento en el organismo. Además, la vía de transulfuración necesaria para que el Se, en forma de selenometionina, esté disponible para la síntesis de selenoproteínas, también podría verse afectada (Czuczejko y cols., 2003). Curiosamente, en estudios animales, llevados a cabo en ratas, se verificó que un déficit de este micronutriente generaba necrosis en los hepatocitos, de manera similar a lo observado en humanos con un consumo excesivo de alcohol (Simonoff y Simonoff, 1991; Navarro-Alarcón y cols., 2000). 3. ALCOHOL Y DAÑO HEPÁTICO El alcohol es uno de los mayores responsables de la mortalidad por daño hepático en los Estados Unidos y en diversos países de Europa (Medici y Halsted, 2013). El espectro clínico de la enfermedad hepática alcohólica (EHA) abarca distintas categorías: hígado graso, hepatitis alcohólica y cirrosis (Conde de la Rosa y cols., 2008). Se estima que el 90% de los grandes consumidores de alcohol (más de 60 g/día) presentan Antecedentes Bibliográficos 31 evidencias de hígado graso, mientras que solo 10-35% desarrollan hepatitis alcohólica y 5-15% cirrosis (McCullough y cols., 2011). Eventualmente, la cirrosis puede llevar al desarrollo de carcinoma hepatocelular (De Minicis y Brenner, 2008). El hígado graso o esteatosis hepática es la primera respuesta del hígado al abuso de alcohol y se caracteriza por la acumulación de grasa, en su mayoría triglicéridos, fosfolípidos y ésteres de colesterol, en los hepatocitos. La exposición al alcohol, de forma directa o indirecta, regula el metabolismo de los lípidos, estimulando la lipogénesis e inhibiendo la oxidación de ácidos grasos (Gao y Bataller, 2011). Tal como hemos comentado anteriormente el incremento de la ratio NADH/NAD+, por el metabolismo oxidativo del etanol, contribuye a esta situación. Por otro lado, el alcohol promueve el metabolismo lipídico inhibiendo el receptor activado proliferador de peroxisoma (PPAR-α) y la adenosina monofosfato cinasa, y estimula la proteína 1 de unión al elemento regulador del esterol (SREBP1). Simultáneamente, todas estas vías llevan a una remodelación en el metabolismo de las grasas a nivel hepático, que se traduce en un acúmulo excesivo de lípidos en los hepatocitos. La esteatosis hepática es reversible con la abstinencia. Los individuos que continúan con el consumo de alcohol, de manera excesiva, pueden presentar formas más graves de EHA, como hepatitis alcohólica y cirrosis (Suh y Jeong, 2011; Zhu y cols., 2012). La hepatitis alcohólica se caracteriza, principalmente, por la inflamación y necrosis. Histológicamente hay presencia de esteatosis, necrosis, apoptosis, infiltración leucocitaria y fibrosis perisinusoidal-pericelular en los hepatocitos (Stewart y cols., 2001; Gao y Bataller, 2011). La desregulación de las respuestas inflamatorias, por los mecanismos ya referidos, parece contribuir a la necrosis hepática. Añadiendo a esto, que la acumulación de lípidos promueve la inflamación. La progresión de estos procesos nocivos puede, eventualmente, desencadenar una excesiva acumulación de colágeno en la matriz extracelular, generando cirrosis (Zhu y cols., 2012). Diversos factores de riesgo contribuyen al desarrollo y a la progresión de la EHA. Aunque la cantidad, la duración y la frecuencia de consumo jueguen un papel importante, propiciando el daño hepático, no todos los individuos con un patrón exagerado de ingestión de alcohol desarrollan EHA o sus formas más graves (Tan y Antecedentes Bibliográficos 32 cols., 2009). Actualmente, se sabe que factores como el sexo, la raza, la etnia, la herencia genética, los polimorfismos a nivel de genes, la malnutrición, la obesidad y la presencia de infecciones crónicas virales, entre otros, influyen en la génesis y en la progresión de la EHA (O`Shea y cols., 2010). El daño hepático se produce a través de diversas vías interrelacionadas, entre las cuales se encuentra el metabolismo del etanol, que genera, principalmente, acetaldehído, un exceso de NADH y ERO, tal como comentamos en el apartado 2.1.4. También es conocido, que el etanol provoca cambios en la flora intestinal originando un incremento de microorganismos aerobios y anaerobios, y en especial de microorganismos Gramnegativos. Este hecho junto con la formación de acetaldehído – uno de los metabolitos del etanol – incrementan la permeabilidad intestinal (Ajakaiye y cols., 2011; Dhanda y cols., 2012). La endotoxina lipopolisacárido (LPS), presente en la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, en condiciones normales, penetra en la mucosa intestinal en cantidades pequeñas, y seguidamente, tras pasar a la circulación portal, es inactivada en el hígado (Szabo y Bala, 2010). Sin embargo, ante la ingesta crónica de alcohol se verifica un incremento en la translocación de la endotoxina que entra en la circulación portal unida a una proteína de unión de LPS (LBP). Este enlace permite que el LPS se una a los receptores de membrana CD14 y TLR4 presentes en las células de Kupffer (los macrófagos residentes en el hígado), activándolas (Lucey y cols., 2009; Mathurin y Lucey, 2012). La activación de las células de Kuppfer lleva a la estimulación del factor de transcripción nuclear NFkB, que a su vez, desencadena la generación de citoquinas pro-inflamatorias, como el factor de necrosis tumoral (TNF-α) y la interleuquina 1, además de quimiocinas y ERO (Nagata y cols., 2007; Byun y Jeong, 2010). Esta situación induce necrosis y apoptosis en los hepatocitos produciendo daño hepático (Tilg y cols., 2011). Además, el LPS puede promover la activación de las células estrelladas hepáticas, favoreciendo el desarrollo de fibrosis, y de las células sinusoidales hepáticas que liberan mediadores inflamatorios que potencian el daño hepático (Bautista, 2000; Seth y cols., 2010) (Figura 7). También el sistema inmune parece influir en el desarrollo del daño hepático. Como hemos mencionado anteriormente, el metabolismo del etanol puede formar aductos que ejercen el papel de neoantígenos. Estos activan la respuesta inmune adquirida, Antecedentes Bibliográficos 33 desencadenando la producción de linfocitos T y B que se infiltran en el hígado y estimulan la secreción de citoquinas pro-inflamatorias (De Minicis y Brenner 2008; Gao y Bataller, 2011). Por otra parte, se sabe que el alcohol lleva a un almacenamiento exacerbado de hierro en el organismo. Este hecho es comprobado por los elevados índices de hierro sérico (saturación de transferrina, ferritina) y por la alta concentración de este elemento en el hígado de pacientes con EHA (Ji, 2012). Incluso, personas con un ligero o moderado consumo de alcohol exhiben un incremento del hierro almacenado (Ioannou y cols., 2004). Figura 7 . Papel del sistema inmune innato en el daño hepático asociado al alcohol (Mandrekar y Szabo, 2009). Antecedentes Bibliográficos 40 4.2. MODELOS DE “BINGE DRINKING” Normalmente se consideran dos tipos de modelos: humanos y animales. Los pocos modelos humanos referidos en la literatura se basan en el consumo de bebidas alcohólicas que contienen etanol destilado o vino. Tales modelos se consideran fisiológicos, teniendo en cuenta el modo de administración, y logran niveles de alcohol en sangre significativos. En la mayoría se verifica un control riguroso de las cantidades de alcohol a utilizar, teniendo en consideración el peso corporal, la edad y género de los participantes, y de los grupos placebo y control utilizados en los diseños experimentales. Una parte considerable de estos estudios contempla como período de ingesta las dos horas de consumo referidas en la definición de “binge drinking” propuesta por el National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism de los Estados Unidos. Figura 10. Posibles efectos provocados por el “binge drinking”. Antecedentes Bibliográficos 41 Uno de los principales inconvenientes en la utilización de estos modelos se halla en las cuestiones éticas que plantean, ya que no es aceptable que los seres humanos sean expuestos a períodos largos de ingesta de alcohol, aunque, a menudo, se verifiquen en la vida real y, fundamentalmente, entre los adolescentes (Dolganiuc y Szabo, 2009). Por otro lado, los modelos animales involucrados en la investigación de los efectos del alcohol utilizan primates, cerdos, perros, ratones, ratas o conejos. Los modelos de roedores (ratas y ratones) son los más usados debido a diversos factores, entre los cuales se incluyen un fondo genético relativamente bien definido, la capacidad de generar resultados en un corto periodo de tiempo, la facilidad de manejo y transporte, y su bajo costo. Una de las principales limitaciones de estos modelos, es la dificultad de duplicar con rigor este tipo de comportamiento humano y todas las consecuencias que este patrón de consumo de alcohol produce (Ponnappa y Rubin, 2000; Dolganiuc y Szabo, 2009). Los modelos animales de intoxicación aguda han sido desarrollados para mimetizar el fenómeno de “binge drinking” (Karinch y cols., 2008). Entre ellos, están los que imitan un solo episodio de “binge drinking” y los que representan episodios repetidos de “binge drinking” alternados con periodos de abstinencia. Este último ha sido el elegido en el diseño experimental de este trabajo, pues se asemeja más a los hábitos de consumo de los adolescentes españoles. Los modelos de alcoholización más utilizados, en ratas y ratones, para reproducir el “binge drinking”, repetido o no, se pueden dividir en 2 grupos, de acuerdo con el tipo de administración: parental u oral. 4.2.1. Modelos animales de “binge drinking” administrado por vía parental Entre los modelos que utilizan esta vía de administración, destacan: Antecedentes Bibliográficos 42 4.2.1.1. Inyección intraperitoneal En este modelo, el alcohol, generalmente al 20%, es administrado directamente con una jeringa en la zona intraperitoneal. Todos los animales, durante el tratamiento, tienen libre acceso a comida y agua. El grupo control recibe un volumen equivalente de agua o solución salina. El nivel máximo de alcohol en la sangre va a depender de la cantidad de alcohol inyectada, de la especie y de la edad de los animales utilizados. Es relativamente fácil de ejecutar y permite controlar con rigor la cantidad de alcohol administrada. El principal inconveniente de esta técnica es que no puede ser considerado un modelo fisiológico y además, induce estrés en los animales involucrados (Plackett y Kovacs, 2008; D’Souza El Guindy y cols., 2010). 4.2.1.2. Inyección intravenosa Este método se basa en la administración de alcohol a través de una inyección intravenosa tipo bolus, seguida de una infusión continua a través de un catéter colocado normalmente en la vena yugular o femoral. Esta infusión permite la manutención de los niveles de alcohol en sangre, de manera constante, durante todo el periodo experimental. En este modelo, el grupo control recibe un volumen igual de solución salina. Todos los animales son alimentados ad libitum con comida y agua. Esta técnica comparte los inconvenientes del modelo descrito anteriormente y además, requiere la anestesia previa de los animales así como un estricto control de las condiciones de asepsia. En relación a los otros métodos, tiene como aspecto positivo la rapidez con la cual se obtiene el nivel máximo deseado de alcohol en sangre (D’Souza El Guindy y cols., 2010). 4.2.1.3. Infusión intragástrica El etanol es administrado por medio de una cánula intragástrica implantada quirúrgicamente. Este procedimiento posibilita la obtención de niveles elevados de alcohol en la sangre y, el control total del etanol consumido. Entre las desventajas, este método exige la presencia de personal con experiencia quirúrgica durante la inserción Antecedentes Bibliográficos 43 de la cánula y una monitorización. Además, es laborioso y no puede ser considerado fisiológico (French, 2001; Tsukamoto y cols., 2008). 4.2.2. Modelos animales de “binge drinking” administrado por vía oral Entre los modelos que utilizan esta vía cabe resaltar: 4.2.2.1. Gavage En este modelo, el alcohol es administrado directamente en el estómago, a través de una aguja curva de punta roma conectada a una jeringa o por medio de un tubo pediátrico de alimentación infantil. Este método mimetiza mejor el “binge drinking” que los descritos anteriormente, sin embargo no deja de ser una técnica invasiva, así, si no se ejecuta correctamente, puede provocar daños en el sistema gastrointestinal superior y probablemente, inducir mayor estrés que los anteriores (D’Souza El Guindy y cols., 2010; Brandon-Warner y cols., 2012). 4.2.2.2. Consumo nocturno Es conocido que la mayoría de los roedores ingieren su comida y agua diaria durante la fase nocturna de su ciclo circadiano. Por otro parte, cuando el etanol es la única bebida disponible, su ingesta se produce, fundamentalmente, al inicio del periodo nocturno, de manera que la concentración de alcohol en la sangre sigue las variaciones circadianas. De acuerdo con estas premisas, el típico modelo de consumo nocturno de alcohol propone cambiar la botella de agua por otra que contenga etanol, generalmente al 20% (v/v), en las dos o tres primeras horas del ciclo nocturno y durante tres días. En el cuarto día, se realiza el mismo procedimiento, con la excepción que la botella de etanol permanece en la jaula durante cuatro horas. Este modelo de administración se considera aceptable para reproducir el “binge drinking” dado que permite la obtención de concentraciones significativas de alcohol en la sangre en un periodo relativamente corto. Además, no requiere ningún tipo de entrenamiento o exposición previa, ni adicción de edulcorantes. Antecedentes Bibliográficos 44 La principal desventaja de esta técnica es que ninguna otra opción es ofrecida, de manera que los animales, que no están sujetos a una privación de fluidos significativa a nivel fisiológico, pueden optar por no beber durante la exposición al alcohol. De hecho, hay diversos genotipos que beben muy poco en estos ensayos y por ello es complicado alcanzar niveles de alcohol en sangre de 0.8 g/L (Crabbe y cols., 2011; BarkleyLevenson y Crabbe 2012; Sprow y Thiele 2012). 4.2.2.3. Modelo de 2 botellas (acceso intermitente de etanol) Entre los diferentes modelos preclínicos de “binge drinking”, este es uno de los que permite obtener niveles elevados de alcohol en la sangre en un corto período de tiempo. Los animales tienen acceso a una botella con solución de etanol al 20% (v/v), durante 24 horas, en días alternos, y normalmente durante tres días por semana. A lo largo de toda la semana tienen acceso a agua que puede consumir ad libitum. Este modelo induce a la ingesta paulatina de grandes cantidades de etanol, imitando el fenómeno de dependencia que se ha asociado recientemente a este tipo de consumo, pero para ello, necesita largo tiempo de exposición, lo que puede suscitar dudas sobre si este es el modelo más adecuado para imitar el comportamiento humano del “binge drinking”. Por otra parte, como los animales tienen acceso permanente al consumo de agua, este modelo exige cepas específicas para que se alcancen los niveles de alcohol en sangre exigidos en la definición de “binge drinking” (Hwa y cols., 2011; Sprow y Thiele, 2012). 4.3. “BINGE DRINKING” Y BALANCE OXIDATIVO El patrón de consumo tipo “binge drinking” interfiere en el equilibrio oxidativo, principalmente, como consecuencia del metabolismo del etanol (ver apartado 2.1.4.). En líneas generales, a nivel mitocondrial se produce un incremento en la formación de ERO y se verifica un déficit de GSH, lo que conduce a una disfunción en la mitocondria (Mathurin y Deltenre, 2009; Mansouri y cols., 2010). Además, hay que destacar alteraciones en la actividad de diferentes enzimas antioxidantes así como un incremento en la peroxidación lipídica. Antecedentes Bibliográficos 45 A continuación se describen, sucintamente, la mayoría de los trabajos existentes en esta área, de acuerdo con la definición general de “binge drinking”, independientemente de la vía de administración adoptada, y en distintos tejidos: 1) Masini y cols. (1994) encontraron una disminución significativa en los niveles de GSH hepático en ratas adultas Wistar (200-250 g), a las cuales se les administró una única dosis de etanol al 20% (3.5 g/Kg) por vía intraperitoneal. 2) Altomare y cols. (1996) constataron una reducción significativa de los niveles de GSH y un incremento significativo de los niveles de MDA y grupos carbonilo en el páncreas de ratas adultas Sprague-Dawley (180-200 g), sometidas a una sola administración de etanol al 25% (4 g/Kg). En este procedimiento se utilizó la técnica de gavage. 3) Husain y Somani (1997) verificaron una disminución significativa de la actividad de las enzimas antioxidantes SOD, CAT y GR, y un aumento significativo de los niveles de MDA, en el hígado de ratas adultas Fisher 344, a las cuales, previamente, se había administrado una única dosis de 1.6 g/Kg de etanol al 20% por intubación orogástrica. 4) Schlorff y cols. (1999) observaron, tras la administración, en ratas adultas Fisher 344, de etanol a diversas dosis (2, 4 y 6 g/Kg), en una única sesión y por intubación orogástrica, alteraciones significativas en la actividad de la GR y de la SOD en plasma, así como un incremento en los niveles de MDA. 5) En 2002, Zhou y cols. encontraron una disminución de las ratios NAD+/NADH y GSH/GSSG y un incremento de la actividad de la isoforma CYP2E1 y de los niveles del anión superóxido (O2-), junto con peroxidación lipídica y oxidación de proteínas, en el hígado de ratones adultos normales (9 semanas), a los cuales se administró tres dosis de etanol al 25% (5 g/Kg cada 12 horas) mediante gavage. Antecedentes Bibliográficos 46 6) Kim y cols. (2008) encontraron un déficit en los niveles hepáticos de GSH y un aumento de MDA, en una investigación desarrollada en ratones adultos C57BL/6 que recibieron etanol al 50% (5 g/Kg cada 12 horas) por vía oral, en un total de tres dosis. 7) Artun y cols. (2010) utilizando ratas adultas Wistar sometidas a un tratamiento con tres dosis de etanol al 33% (5 g/Kg cada 12 horas), por vía oral, identificaron en el hígado, un incremento significativo de los niveles de MDA y una reducción significativa en los niveles de GSH, vitamina C y vitamina E, así como en la actividad de la enzima antioxidante GPx. 8) Más recientemente, en 2012, Kalaz y cols. utilizando ratas adultas SpragueDawley, a las cuales administraron tres dosis de etanol al 40% (5 g/Kg cada 12 horas), por gavage, comprobaron la existencia de alteraciones en la actividad de diversas enzimas antioxidantes, así como un aumento significativo de los niveles de MDA en el corazón. 4.4. “BINGE DRINKING” Y DAÑO HEPÁTICO La repercusión del consumo crónico del alcohol sobre el hígado es bien conocida y ampliamente descrita por los investigadores. Sin embargo, los efectos nocivos del “binge drinking” a nivel hepático están siendo recientemente elucidados, existiendo estudios parciales sobre diferentes mecanismos implicados. Así, aunque el “binge drinking” está bien asociado a problemas sociales y de salud pública, todavía no se conocen bien las consecuencias que este patrón de consumo de alcohol puede desencadenar en el hígado. Por tanto, ya que el hígado es el principal órgano donde el alcohol es metabolizado y puesto que el fenómeno “binge drinking” parece estar muy difundido actualmente entre los jóvenes adultos de todo el mundo, sería de interés analizar en profundidad los diferentes mecanismos implicados en el desarrollo del daño hepático (Waszkiewicz y cols., 2009). En modelos animales una dosis aguda de etanol, es decir, un episodio aislado de “binge drinking”, provoca un aumento de la permeabilidad intestinal, llevando a un incremento de los niveles de la endotoxina lipopolisacárido en la circulación portal Antecedentes Bibliográficos 47 (Mathurin y cols., 2000; Massey y Arteel, 2012). Además, el “binge drinking” genera un aumento de los niveles de oxido nítrico en suero, lo que juega un papel importante en la regulación de la presión en la vena porta, regulada en parte por la endotoxina (Oekonomaki y cols., 2004). Estos cambios que se verifican a nivel intestinal per se sensibilizan las células hepáticas frente a los efectos nocivos ocasionados por los productos resultantes del metabolismo oxidativo del etanol (Mathurin y Deltenre, 2009). Como hemos mencionado anteriormente, el “binge drinking” lleva a una depleción del GSH mitocondrial, lo que además de incrementar el estrés oxidativo puede comprometer la función mitocondrial. A su vez, el estrés oxidativo resultante del “binge drinking” conduce a una degradación del DNA hepático mitocondrial (Mansouri y cols., 2001). También se ha podido demostrar que los modelos que reproducen este tipo de ingesta alcohólica desencadenan la inducción de la isoforma CYP2E1, provocan esteatosis microvesicular junto con necrosis en el hígado y originan un aumento de las transaminasas séricas (Artun y cols., 2010). Además, se postula que el “binge drinking” puede desencadenar apoptosis hepática a través del incremento de la expresión de Fas, un conocido receptor de muerte celular, y por el aumento de la liberación del citocromo c (Zhou y cols., 2001; Wang y Cederbaum, 2007). Estas moléculas ponen en marcha una cascada de enzimas específicas, llamadas caspasas, que conducen a la muerte celular (Conde de la Rosa y cols., 2008). Por otra parte, es importante destacar que la susceptibilidad de las células hepáticas a este tipo de consumo difiere de acuerdo con el tipo de célula. Así, las células del endotelio sinusoidal parecen ser las primeras afectadas, antes incluso que las células parenquimatosas. El “binge drinking” hace vulnerables a las células del endotelio sinusoidal ya que activa la isoforma CYP2E1 y reduce el GSH. La toxicidad generada en estas células deteriora la microcirculación hepática, induciendo lesión isquémica en las células parenquimatosas (Zhong y cols., 1999; McCuskey y cols., 2005). Estudios realizados en roedores indican que episodios repetidos de “binge drinking” ocasionan un mayor daño hepático que una sola sesión de “binge drinking”. A título de ejemplo, se ha observado que los efectos perniciosos resultantes de este tipo de comportamiento en las células del endotelio sinusoidal, se amplifican después de varios Antecedentes Bibliográficos 48 episodios (McCuskey y cols., 2005). Por otra parte, se ha constatado, que tras una sesión de “binge drinking”, las células de Kupffer presentan, inicialmente, tolerancia a la acción de la endotoxina lipopolisacárido, pero desarrollan posteriormente, una fuerte sensibilización debida, en parte, a un aumento de los receptores CD14 en las células de Kupffer (Enomoto y cols., 1998). Por otro lado, ante una intoxicación aguda de etanol, se verifica un rápido incremento en la síntesis del DNA mitocondrial, contraria a la depleción que sigue a este tipo de conducta. Sin embargo, tras repetidos episodios de “binge drinking”, este mecanismo protector queda comprometido. Parece ser que el estrés oxidativo y la peroxidación lipídica resultantes de la activación paulatina de la CYP2E1 contribuyen a ello, ya que el incremento gradual de los productos resultantes de la peroxidación lipídica impide la normal reparación del DNA mitocondrial, contribuyendo, de este modo, a un déficit significativo del DNA mitocondrial hepático (Cahill y cols., 2002; Demeilliers y cols., 2002). El consumo de alcohol en la forma de “binge drinking” también puede provocar esteatosis por un aumento de la resistencia hepática a la insulina. Se postula que la proteína kinasa C-epsilon (PKCε) es una molécula que inhibe la fosforilación del residuo tirosina en el sustrato del receptor de insulina-2 (IRS-2), y por lo tanto, afecta la señalización hepática de la insulina. Por otra parte, tras este tipo de ingesta alcohólica, se ha verificado un significativo incremento de ácidos grasos libres no esterificados. Esto, a su vez, conduce a un aumento de la producción de diacilgliceroles (DAG), por medio de la vía del triacilglicerol. Los DAG formados activarían el PKCε, lo cual exacerbaría la acumulación hepática de lípidos al inducir insulino-resistencia (Kaiser y cols., 2009). El inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1) es una proteína de fase aguda que, normalmente, se expresa en los adipocitos y en las células endoteliales, sin embargo, parece tener una fuerte presencia en casi todas las células como respuesta al estrés. El PAI-1 inhibe el activador tisular del plasminógeno (tPA) y la uroquinasa (uPA) (ambos activadores del plasminógeno), jugando de este modo un papel crucial en el metabolismo de la fibrina, al inhibir la fibrinólisis (Massey y Arteel, 2012; Shukla y Antecedentes Bibliográficos 49 cols., 2013). La activación del PAI-1 detectada durante el “binge drinking” también puede ser considerada un mecanismo potencial de daño hepático. Así, estudios recientes sugieren que el PAI-1 puede contribuir al desarrollo de diversas fases de la enfermedad hepática alcohólica (esteatosis, esteatohepatitis y fibrosis) ya que interfiere en la síntesis de las lipoproteínas de muy baja densidad, favoreciendo el estado de esteatosis. Aunque el estado de esteatosis es reversible con la abstinencia, la acumulación de grasa hace que las células hepáticas sean más sensibles a otros estímulos nocivos, como es el caso de una endotoxemia significativa, propiciando un daño superior, denominado esteatohepatitis. El bloqueo de la fibrinólisis inducida por el PAI-1 y, la consecuente acumulación de fibrina, parece contribuir al desarrollo de la inflamación hepática que se verifica ante estos estímulos. Por otro lado, la influencia de PAI-1 en el estado de fibrosis, es todavía poco clara, dado que esta proteína parece desempeñar un doble papel en este proceso. Parece ser que esta proteína tiene además una función protectora que contribuye a la regeneración de las células hepáticas dañadas, probablemente, por inhibición de las colagenasas intersticiales durante las etapas tempranas de la fibrosis (Beier y Arteel, 2012). En el ámbito epidemiológico hay datos que sugieren un incremento en la incidencia de cirrosis en países con una cultura de “binge drinking”. Como consecuencia, se ha detectado un aumento de la mortalidad por cirrosis en este tipo de países (Mathurin y Deltenre, 2009). Finalmente, teniendo en cuenta que tras altas dosis de alcohol, la isoforma CYP2E1 (enzima especialmente oxidante) está inducida para metabolizar el alcohol a nivel hepático, y que existe una disminución de GSH y un aumento de MDA, sería interesante analizar el balance oxidativo y su relación con el daño hepático, especialmente durante la adolescencia. II-HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipótesis y Objetivos 59 II-HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Existe una gran parte de adolescentes y jóvenes adultos que consumen alcohol de manera excesiva en períodos discontinuos (patrón de consumo tipo botellón). A pesar de su interés sanitario y económico, los actuales modelos animales que reproducen esta administración, probablemente, no transmiten la información más exacta sobre las consecuencias de este consumo, pues en su mayoría son modelos poco fisiológicos basados en la administración de alcohol por vía intraperitoneal, que evitan el primer metabolismo del alcohol a nivel gástrico, y sus efectos sobre el sistema digestivo, además de generar estrés adicional. Por otro lado, el Se, un nanoelemento potencialmente antioxidante, por formar parte del centro activo de la familia de las enzimas antioxidantes GPxs, se ha visto modificado tras el consumo crónico de alcohol, probablemente, por la acción prooxidante de esta droga y la malnutrición que genera. Instigados por este contexto, suponemos que según la vía de administración del alcohol, en ratas, podríamos encontrar diferentes efectos sobre los niveles de Se y, por tanto, sobre los sistemas de defensa antioxidante en suero e hígado, aún cuando sea un consumo agudo y discontinuo. Además, puesto que el Se es un componente importante de las selenoproteínas hepáticas, probablemente encontremos alteraciones en la expresión de estas selenoproteínas, y por tanto en sus acciones biológicas. Por otro lado, al tener difícil el acceso a muestras biológicas de adolescentes afectados por el “efecto botellón”, y habiendo obtenido muestras de pacientes alcohólicos crónicos, con y sin daño hepático, pensamos que los niveles séricos de Se y de GPx, así como el estado oxidativo en estos pacientes, podría servir como marcador de diagnóstico de este consumo, ya que en pacientes con daño hepático de etiología no alcohólica, también se ha encontrado una disminución de los niveles de Se en suero. Hipótesis y Objetivos 60 Los objetivos prioritarios en ratas son: 1) Desarrollar un nuevo modelo experimental de administración alcohólica, por vía oral, que pueda reproducir de forma más fisiológica el patrón de consumo tipo “botellón”, caracterizarlo y compararlo con el método existente de administración alcohólica por inyección intraperitoneal. 2) Analizar en ambos modelos, los efectos del consumo agudo y discontinuo de alcohol sobre: ● El balance oxidativo a través de las enzimas antioxidantes (GPx, GR, SOD y CAT) en suero y/o hígado; ● La oxidación de diferentes biomoléculas, como los lípidos, las proteínas y el DNA; ● La homeostasis/biodisponibilidad del Se en la expresión de selenoproteínas hepáticas. Los objetivos prioritarios en humanos son: 1) Analizar los niveles de Se en pacientes alcohólicos crónicos con o sin daño hepático, con el fin de observar si este nanoelemento sirve como marcador diferenciador de ambas situaciones. 2) Relacionar los niveles de Se en suero con la actividad antioxidante estudiando las enzimas antioxidantes GPx, GR, SOD y la oxidación de lípidos y proteínas. IIIMATERIAL Y MÉTODOS Material y Métodos 63 IIIMATERIAL Y MÉTODOS 1. DISEÑO EXPERIMENTAL - ANIMALES Para la realización del trabajo los animales (ratas) se distribuyeron, de manera aleatoria, en cuatro grupos experimentales denominados grupo control oral (CO), grupo alcohol oral (AO), grupo control intraperitoneal (CIP) y grupo alcohol intraperitoneal (AIP). Las condiciones experimentales de cada grupo fueron: a) CO: alimentado ad libitum con comida y agua; b) AO: alimentado ad libitum con comida y agua o alcohol al 20% (v/v) en el agua de bebida, tres días en semana; c) CIP: alimentado ad libitum con comida y agua y que recibirá, en los días correspondientes, una inyección intraperitoneal de solución salina; d) AIP: alimentado ad libitum con comida y agua y que recibirá, en los días correspondientes, una inyección intraperitoneal de etanol (3 g/Kg). Figur a 13. Condiciones experimentales y métodos de alcoholización. Material y Métodos 64 1.1. Animales y condiciones experimentales Se utilizaron 60 ratas de la raza Wistar procedentes del Centro de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla. Una vez aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Sevilla los protocolos de manejo, cuidado y sacrificio de los animales a utilizar, las ratas, de 28 días, fueron distribuidas en varias jaulas de plástico, con libre acceso a la comida y a la bebida, teniendo en consideración su grupo de procedencia. Las jaulas se alojaron en una habitación del Animalario de la Facultad de Farmacia, aireada y termorregulada a 22-23ºC, con fotoperiodos controlados de 12h (de 9:00 a.m. a 21:00 p.m.). Los animales estuvieron en estas condiciones durante el periodo que correspondía a su etapa adolescente (tres semanas) y hasta el momento en que fueron sacrificados. Antes del sacrificio, las ratas permanecieron en período de ayuno de 12 horas. 1.1.1. Dieta utilizada La alimentación suministrada a los animales consistió en una dieta básica semisintética (Harlan Laboratorios) que cubría todas las necesidades nutricionales y energéticas. 1.1.2. Métodos de alcoholización El método de alcoholización que se utilizó para el grupo alcohol intraperitoneal (AIP) tuvo como base la administración por vía intraperitoneal, tres días por semana y durante tres semanas, de etanol (3 g/Kg) en solución salina al 20% (v/v) (Callaci y cols., 2010). Al grupo control intraperitoneal (CIP) se le inyectó solución salina, durante el mismo período de tiempo, en un volumen similar a las ratas del grupo AI. Por otro lado, al grupo alcohol oral (AO) se le administró etanol al 20% (v/v) en el agua de bebida ad libitum, tres días en semana y durante un período de tres semanas con la finalidad de simular un patrón de bebida tipo “binge drinking” más fisiológico durante la etapa adolescente (Figura 13). Material y Métodos 65 1.1.3. Estudio nutricional Diariamente y durante las tres semanas de tratamiento, se determinó la ingesta líquida (ml/día) y la ingesta sólida (g/día), por diferencia de volumen de líquido en los biberones y por diferencia entre el pienso colocado y el residuo sobrante utilizando una balanza analítica (COBOS D-2000-SX, de 0.1 g de precisión). La ingesta de selenio (µg/día) se calculó a partir de los datos de la ingesta sólida, teniendo en cuenta el selenio presente en la dieta (0.23 mg/Kg). Las calorías diarias aportadas por la dieta sólida y por la bebida de alcohol se calcularon a partir de los datos de ingesta sólida (3.96 Kcal/g pienso ingerido) y líquida (7.1 Kcal/g alcohol ingerido), utilizando las tablas de conversión de Veale y Myers (1968). 1.1.4. Estudio macroscópico Para controlar el desarrollo de los animales, desde el comienzo del tratamiento hasta el día del sacrificio, las ratas se pesaron diariamente utilizando una balanza analítica (COBOS D-2000-SX de 0.1 g de precisión). Para evitar diferencias debidas al ritmo circadiano, el análisis se efectuó siempre por la mañana, entre las 9:00 – 10:00 a.m. Una vez concluida la adolescencia, y por tanto, el periodo experimental, los animales se pesaron antes de ser sacrificados y, tras ser anestesiados como se explica en el apartado 1.2.1., se procedió a la extracción y pesado del hígado. Además se determinó el desarrollo proporcional del hígado con respecto al peso de cada animal según la formula del índice organosomático (IOS). En la Tabla 2 se representan las mediciones hechas a cada uno de los parámetros referenciados: Parámetros Indicador de Medida Peso total corporal g Peso del órgano g Índice organosomático (IOS) (Peso del órgano/Peso total)*100 Tabla 2. Parámetros morfológicos. Material y Métodos 72 3. DETERMINACIONES ANALÍTICAS 3.1. Determinación de la concentración total de proteínas Para expresar la actividad de las enzimas antioxidantes como actividades específicas (U/mg de proteína) así como para poder cuantificar las distintas proteínas por western blotting, determinamos las proteínas totales en el suero y en el homogeneizado de hígado. Fundamento: La determinación de proteínas se lleva acabo según el método descrito por Lowry (Lowry y cols. 1951). En este método se hacen reaccionar las proteínas con el reactivo Folin-Ciocalteau, lo que origina un complejo coloreado. El color se forma debido a la reacción del Cu2+ con las proteínas en medio alcalino, y por la reducción del fosfomolibdato por la tirosina y el triptófano presentes en las proteínas. La intensidad del color depende de la cantidad de estos aminoácidos aromáticos. a. Reactivo A: Na2CO3 2% (p/v) en NaOH 0.1 M. b. Reactivo B: CuSO4.5H2O 1% (p/v). c. Reactivo C: Tartrato de sodio potasio 2.7% (p/v). d. Reactivo D: 1.5 ml de reactivo B y 1.5 ml de reactivo C en 150 ml de reactivo A. e. Reactivo E: Reactivo de Folin-Ciocalteau diluido en agua bidestilada (1:1 v/v). Los reactivos D y E deben prepararse en el momento del uso. Procedimiento: La técnica consiste en elaborar una curva patrón a partir de la cual, conociendo las concentraciones de los estándares y midiendo sus absorbancias, podemos calcular las concentraciones de las muestras a través de su medida de absorbancia. Para ello, se prepara una solución madre de albúmina bovina de concentración igual a 1 mg/ml, a partir de la cual se preparan cuatro soluciones estándares cuyas concentraciones son: P1: 0.1 mg/ml, P2: 0.05 mg/ml, P3: 0.025 mg/ml y P4: 0.0125 mg/ml. Material y Métodos 73 A continuación, en tubos de ensayo se mezclan 5 ml de reactivo D con: 1 ml de suero en el caso de las muestras (diluido con agua bidestilada 1/1000, para las enzimas antioxidantes) o 1 ml de homogeneizado de hígado de ratas (diluido con agua bidestilada 1/500, para las enzimas antioxidantes y 1/300 para la determinación de la presencia de proteínas por western blotting), 1 ml de estándares en el caso de los patrones o 1 ml de agua bidestilada en el caso del blanco, y se dejan reposar durante 1520 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, se añaden 0.5 ml de reactivo E a los tubos, se agitan y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se procede a la lectura de las absorbancias frente al blanco en espectrofotómetro a 750 nm. Cálculos: La concentración de proteínas totales en las muestras se calcula utilizando la curva patrón de albúmina de concentraciones conocidas. Tanto las muestras como la curva se analizan por duplicado. 3.2. Determinación de alcohol en orina de ratas Fundamento: La alcohol deshidrogenasa (ADH) cataliza la oxidación de alcohol a acetaldehído con reducción simultánea del nicotinamín adenín dinucleótido (NAD). El aumento de absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la concentración de alcohol en la muestra. ADH Etanol + NAD Acetaldehído + NADH Reactivos: a. Vial NAD-ADH (SIGMA). b. Tampón glicina 0.5M, pH 9 (SIGMA). Procedimiento: Un día antes de la determinación, se colocan las ratas en jaulas metabólicas, en ayuno, y teniendo libre acceso a la bebida, para recoger la orina durante Material y Métodos 74 f = (VTR x Pm) / ( ε NADH x Vm x L) Alcohol (mg/dl) = A340 x f un periodo de 24 horas en envases que previamente contenían 1 ml de tolueno, a fin de evitar la evaporación del alcohol. En el día de la determinación se añadió 3 ml del reactivo NAD-ADH, resuspendido en tampón glicina 0.5M, pH 9, en cada uno de los tubos, y 0.01 ml de muestra o de agua bidestilada en el caso del blanco. La mezcla resultante se agitó cuidadosamente y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Enseguida se transfirieron las soluciones a las cubetas y se midió a 340 nm (A340). Cálculos: El valor de A340 lo multiplicamos por un factor “f”, con objetivo de obtener la concentración de alcohol (mg/dl), donde: Siendo: VTR: Volumen total de reacción. Pm: Peso molecular del etanol. εNADH: coeficiente de absorción para el NADPH, cuyo valor es 6.22 mM-1 cm-1. Vm: Volumen de muestra (ml). L: Trayectoria del haz de luz en la cubeta (cm). Posteriormente, se calculó la cantidad excretada en mg multiplicando la concentración de alcohol por el volumen de orina. 3.3. Determinación de selenio en suero, hígado, heces y orina La determinación de selenio en suero se realizó utilizando un espectrofotómetro de absorción atómica PERKIN ELMER (Aanalyst 800) con cámara de grafito (Figura 14). Material y Métodos 75 Fundamento: El método se basa en el proceso de absorción atómica, en el que los átomos presentes en la muestra absorben energía luminosa a una longitud de onda específica para cada elemento, pasando a un estado excitado. Mediante el uso de lámparas de cátodo hueco especiales (EDL-PERKIN ELMER) es posible medir la cantidad de luz absorbida durante este proceso, que es proporcional a la cantidad de átomos presentes en la muestra, lo que permite la determinación cuantitativa del elemento estudiado. La determinación de selenio por absorción atómica requiere el uso de modificadores de matriz, concretamente sales de paladio y magnesio, que hacen al analito más estable y evitan pérdidas por volatilización debido a las altas temperaturas a las que se somete al elemento en esta técnica. Tratamiento de las muestras: Las muestras se descongelaron a la temperatura ambiente. El hígado y las heces se sometieron a una temperatura de 110ºC durante 48 horas en una estufa (P SELECTA 210) para su desecación completa. El extracto seco obtenido se pesó y comenzó el proceso de digestión húmeda, en un baño de arena caliente (OVAN). Para ello se añadió ácido nítrico (HNO3-65%, PANREAC) (1ml / 0.1 g de tejido seco), dejándolo actuar durante cerca de 72 horas, a una temperatura de 120ºC hasta conseguir que la tonalidad tornase de un color pardo hasta un amarillo. A continuación, se añadió ácido perclórico (HClO4-70%, PANREAC) (0.05 ml/ 0.1g de tejido seco) y se dejó enfriar. Por fin, se añadió ácido clorhídrico (HCl-6N, PANREAC) (0.5 ml/10 ml de muestra). Figura 14 . Espectrofotómetro PERKIN ELMER (Aanalyst 800). Material y Métodos 76 El suero se diluyó con ácido nítrico (0.2% v/v) (dilución 1/5), añadiendo, a continuación una alícuota de 20 µl de Triton X-100 (0.2% v/v), y la orina se utilizó en su estado puro. Procedimiento: A partir de una solución estándar de selenio de 1000 mg/L se preparan siete soluciones patrones de distintas concentraciones, con las que se elabora una curva patrón. Las concentraciones se eligen de acuerdo con el rango lineal observado para el elemento y son las siguientes (µg/L): P1=10; P2=25; P3=50; P4=75; P5=100; P6=125; P7=150. Antes de realizar la determinación, se le añadió a los estándares y a las muestras problema (suero, hígado, heces y orina) los modificadores de matriz de paladio y magnesio, de forma que los 20 µl de mezcla final que se inyectaron en el aparato contenían 5 µg de Pd y 3 µg de Mg. Posteriormente, se procedió a la lectura. Reactivos: a. Solución estándar de selenio………………………….1000 mg/L b. Solución Triton X-100…………………………...……0.2 % v/v c. Solución ácido nítrico (HNO3)………………………..0.2 % v/v d. Modificador de matriz de paladio (Pd(NO3)2)………..…...10 g/L e. Modificador de matriz de magnesio (Mg(NO3)2)………....10 g/L Cálculos: La concentración de selenio en suero y orina se calculó utilizando los valores obtenidos en la recta de calibrado y multiplicando el suero por el factor de dilución 5. La cantidad de selenio en orina se determinó multiplicando la concentración obtenida por el volumen excretado en 24 horas. La concentración de selenio en hígado y heces se calculó teniendo en consideración los valores resultantes de la recta de calibrado y se expresaron en µg Se/g de tejido seco. La cantidad de selenio en heces se determinó de la misma manera que en la orina. Material y Métodos 77 2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O 3.4. Determinaciones enzimáticas y de biomoléculas 3.4.1. Determinación de la actividad glutatión peroxidasa Fundamento: La enzima glutatión peroxidasa cataliza la reducción de los peróxidos orgánicos y del peróxido de hidrógeno en una reacción en que interviene el glutatión. La actividad de esta enzima se determinó según el método descrito por Lawrence y Burk (1976) ligeramente modificado. En este método, el glutatión oxidado (GSSG) formado por la acción de la enzima glutatión peroxidasa (GPx) se acopla a la reacción que cataliza la glutatión reductasa (GR), midiendo la disminución de absorbancia a 340 nm como consecuencia de la oxidación del NADPH. Los reactivos empleados en este método se encuentran en la Tabla 6. GSSG + NADPH + H+ 2GSH + NADP+ Reactivo Concentración Tampón fosfato potásico (TPK) (pH = 7.4, a 4ºC) 250 mM Solución EDTA (en tampón TPK) (SIGMA) 10 mM Solución azida (NaN3) (SIGMA) 10 mM Solución NADPH (en NaHCO3 al 0.75% p/v) (SIGMA) 2 mM Solución GR (en tampón TPK) (SIGMA) 10 U Solución peróxido de hidrógeno (FORET) 2.5 mM Solución glutatión reducido (SIGMA) 10 mM Tabla 6. Reactivos utilizados en la determinaci ón de la GPx. GPx GR Material y Métodos 78 Procedimiento: En una microcubeta de 1.5 ml de capacidad, se añaden 300 µl de TPK, 100 µl de EDTA, 100 µl de NaN3, 100 µl de NADPH, 100 µl de GSH, 100 µl de GR y 100µl de suero diluido en agua bidestilada (dilución 1/10) en ratas o 100 µl de homogeneizado de hígado de ratas (dilución 1/40). Después de incubar las muestras durante 5 minutos a temperatura ambiente, se inicia la reacción con la adicción de 100 µl de H2O2 y se determina la actividad GPx siguiendo espectrofotométricamente la disminución de la absorbancia a 340 nm durante 3 minutos. Las muestras problema se midieron frente al blanco, que se trató de la misma manera y que contenían agua bidestilada (200 µl) en lugar de peróxido hidrógeno, para evitar el comienzo de la reacción. Cálculos: La actividad de la enzima glutatión peroxidasa se calcula según la fórmula: Donde: mU = nmol/minuto. ΔA(min) = incremento de absorbancia de la muestra por minuto, valor absoluto. Vf = volumen final en ml en la microcubeta. ε = coeficiente de absorción para el NADPH, cuyo valor es 6.22 mM-1 cm-1. d = paso de luz de la cubeta, 1 cm. Vm = volumen de muestra (homogeneizado diluido) en ml en la cubeta. C = concentración de proteínas de la muestra (mg proteína/ml). D = dilución del homogeneizado. 3.4.2. Determinación de la actividad glutatión reductasa Fundamento: La glutatión reductasa (GR) es una enzima dependiente de nicotinamín adenín fosfato reducido (NADPH), que cataliza la reducción del glutatión oxidado (GSSG) a glutatión reducido (GSH). mU/mg proteína = [ΔA(min) · Vf · 10 3 / ε · d · Vm · C] · D Material y Métodos 79 GR GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP+ La determinación de la actividad glutatión reductasa se realizó según el método espectrofotométrico descrito por Worthington y Rosemeyer (1974) ligeramente modificado, donde se mide la disminución de absorbancia a 340 nm debida a la oxidación del NADPH. Los reactivos utilizados se pueden observar en la Tabla 7. Reactivo Concentración Tampón fosfato potásico (TPK) (pH = 7.4, a 4ºC) 0.066 M Solución cloruro potásico (ACOFARMA) 2 M Solución EDTA (en tampón TPK) (SIGMA) 10 mM Solución glutatión oxidado GSSG (SIGMA) 10 mM Solución NADPH (en NaHCO3 al 0.1% p/v) (SIGMA) 1 mM Procedimiento: Para la determinación en suero, se mezclaron en una microcubeta: 540 µl (en el caso de las muestras de ratas) o 560 µl (en el caso de las muestras humanas) de tampón fosfato, 100 µl de KCl, 100 µl de EDTA, 100 µl de GSSG y 100 µl de NADPH. Tras 2 minutos de incubación a temperatura ambiente, la reacción se inició añadiendo 60 o 40 µl de suero puro, y se siguió la disminución de absorbancia a 340 nm durante 3 minutos. Todas las muestras problema se midieron frente al blanco, que se procesó de la misma forma aunque contenía tampón TPK en lugar del suero. Para la determinación en homogeneizado de hígado de ratas, se añadieron en una microcubeta: 590 µl de tampón fosfato, 100 µl de KCl, 100 µl de EDTA, 100 µl de GSSG y 100 µl de NADPH. Después de 2 minutos de incubación a temperatura ambiente, la reacción se inició adicionando 10 µl de homogeneizado puro, y se aguardó Tabla 7. Reactivos utilizados en la determinación de la GR. Material y Métodos 80 la disminución de absorbancia a 340 nm durante 3 minutos. Todas las muestras problema se midieron frente al blanco, que se preparó de la misma manera aunque contenía TPK en lugar del homogeneizado. Cálculos: La actividad de la enzima glutatión reductasa se obtiene por medio del siguiente cálculo: Donde: mU = nmol/minuto. ΔA(min) = incremento de absorbancia de la muestra por minuto, valor absoluto. Vf = volumen final en ml en la microcubeta. ε = coeficiente de absorción para el NADPH, cuyo valor es 6.22 mM-1 cm-1. d = paso de luz de la cubeta, 1 cm. Vm = volumen de muestra (homogeneizado) en ml en la cubeta. C = concentración de proteínas de la muestra (mg proteína/ml). 3.4.3. Determinación de la actividad superóxido dismutasa Fundamento: La enzima superóxido dismutasa (SOD) está encargada de la formación de H2O2 y O2 a partir del radical superóxido. 2 O2ˉ + 2 H H2O2 + O2 La actividad SOD se ensaya siguiendo el método descrito por Fridovich (1985), parcialmente modificado, en el que se utiliza el sistema xantina/xantina oxidasa para mU/mg = [ΔA(min) · Vf · 10 3 / ε · d · Vm · C] SOD Material y Métodos 81 generar radicales superóxido (O2ˉ). El radical superóxido es capaz de reducir el citocromo c. Esta reducción es inhibida por la enzima SOD, que compite por los radicales superóxidos y los “secuestra” llevando a cabo su dismutación. Por ello, según este método, el grado de inhibición en la reacción de reducción del citocromo c es un indicador de la actividad de la superóxido dismutasa. Los reactivos utilizados en este método se encuentran detallados en la Tabla 8. Reactivo Concentración Tampón fosfato potásico (TPK) K2HPO4 / KH2 PO4 (pH = 7.8 a 4ºC) c/DTPA 0.066 M Solución xantina (SIGMA) 0.5 mM Solución citocromo c (SIGMA) 100 µM Solución cianuro sódico (NaCN) (PANREAC) 0.5 mM Solución catalasa (SIGMA) 10 U Solución xantina oxidasa (SIGMA) 25 U Procedimiento: En una microcubeta se depositaron todos los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción, excepto la xantina oxidasa: 490 µl de TPK, 200 µl de xantina, 200 µl de citocromo c, 100 µl de NaCN, 100 µl de catalasa y 10 µl de muestra (suero/hígado). A continuación, se inició la reacción adicionando 10µl de xantina oxidasa, y se observó el aumento de absorbancia a 550 nm durante 3 minutos, debido a la reducción del citocromo c. Para medir la reducción neta del citocromo c (es decir, en ausencia de SOD), se realizó una medida de referencia que se procesó de la misma forma pero no contenía muestra, de forma que se produjo la reducción del citocromo c debida a la acción de los radicales superóxidos formados por el sistema xantina/xantina oxidasa. En las muestras, como se ha explicado anteriormente, la SOD competió con el citocromo c por los radicales superóxido, de forma que hubo una inhibición de la reducción del mismo. Se Tabla 8. Reactivos utilizados en la determinación de la SOD. Material y Métodos 88 2. Aislamiento de linfocitos: Se prepararon 2 tandas de 2 eppendorfs por muestra con 950 µl PBS 1X en la 1ª tanda y 900 µl en la 2ª y se mantuvieron a 4ºC hasta su uso. Mientras se manipularon las muestras se conservaron en un recipiente con hielo. Enseguida se tomaron 50 µl de sangre periférica de la vena caudal y se completaron hasta 1 ml con PBS, en la primera tanda. En el fondo del eppendorf se depositaron 100 µl de Histopaque y se centrifugaron a 200 g durante 3 minutos a 4ºC. Se obtuvo una fase rosa que se tomó con una pipeta de 100 µl y se resuspendió en la 2ª tanda de eppendorfs de PBS 1X hasta 1ml, para eliminar el Histopaque que resultó tóxico para la célula. Por fin, se centrifugaron a 200 g durante 3 minutos a 4ºC, de forma que se obtuvieron los linfocitos aislados. 3. Embeber las células en agarosa: Se depositaron 85 µl de agarosa HMP al 1% en PBS (50 mg agarosa/5 ml PBS 1X) para que se pudiesen obtener 2 geles por porta y muestra. Se colocó un cubreobjetos en cada gel y se dejó en la nevera a 4ºC durante 5 minutos para que solidificase esta capa de agarosa donde se depositaron las células. Se retiraron los cubres después de la solidificación. Los linfocitos previamente aislados, en el paso anterior, se resuspendieron en 85 µl agarosa LMP al 1% en PBS 1X, a 37-38ºC. Se depositaron 85 µl, en cada gel, sobre la capa de agarosa HMP que se elaboró en el primer paso. Enseguida se llevó de nuevo a la nevera a 4ºC durante 5 minutos para que solidificase y tras este periodo se retiraron los cubres. 4. Lisis (1hora mínimo): Se preparó la solución de trabajo. Para eso añadimos 2.5 ml de Triton X a 250 ml de solución de lisis (4ºC). Se colocaron los portaobjetos en una cestilla dentro de una cubeta con esta solución durante al menos 1 hora, con lo cual se consiguió que se desestructurasen las membranas plasmáticas, y así se quedase al descubierto el nucleoide con el material genético, donde se evaluó el posible daño. Material y Métodos 89 5. Tratamiento alcalino: La solución de electroforesis (solución alcalina) se colocó durante 40 min en la cubeta a 4ºC, completando hasta 8 porta ordenados linealmente y equidistantes a las paredes de la cubeta y bien apoyados en la base. Es importante equilibrar la cubeta (2-3 portas en la base). 6. Electroforesis: A 4ºC se ajustó el programa a 45V a 300 mA durante 30 minutos. 7. Neutralización: Se efectuaron 3 lavados de 5 minutos con tampón de neutralización conservado a 4ºC, frenando así el ataque básico. Se añadieron la solución a la cubeta y se introdujo la cestilla. Por fin, se escurrió bien al acabar el último lavado. 8. Tinción fluorescente: Se tiñó cada gel con 20 µl de una solución fluorescente DAPI (5µg/ml), 4,6 – diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro, y se observó la preparación en un microscopio de fluorescencia Leica DMLS (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). 9. Cuantificación: Se contabilizaron 100 comets por cada gel, encuadrándolos dentro de cada una de las 5 clases de Comet posibles (0 para ausencia de daño y 4 para un daño máximo) (Figura 15). Una mayor cantidad de fragmentos de DNA en la cola indicaba un mayor daño en esta biomolécula. Todavía, para un análisis más fiable se utilizó una cámara Hitachi empleando el software para imágenes Kinetic Imaging Komet 5.5 (Kinetic Imaging Ltd, Liverpool, UK), que nos permitió usar los siguientes parámetros para la cuantificación del daño en el DNA: el porcentaje de fluorescencia en la cola del comet (representando la fracción de DNA en la misma), porcentaje de DNA en la cabeza (representando la fracción del material genético en la misma) y el Olive Tail Moment (que se define como Material y Métodos 90 el producto de la longitud de la cola del comet y la fracción de DNA en la misma, OTM = [Media de la cola-Media de la cabeza] x % de DNA en cola /100). 3.5. Análisis de expresión de las proteínas GPx-1, GPx-4 y selenoproteína P Los niveles de expresión de la GPx-1, GPx-4 y selenoproteína P (SelP) fueron determinados por medio de la técnica de inmunodetección de proteínas o Western Blotting por el método de Laemmli (1970), que se utiliza para identificar y localizar proteínas en base a su capacidad para unirse a anticuerpos específicos, además de proporcionar información acerca del tamaño de la proteína de interés mediante la transferencia de macromoléculas biológicas desde un gel hasta una membrana y su posterior detección en la superficie de la misma. Este proceso es necesario ya que todas estas macromoléculas están embebidas dentro de la matriz que forma el gel, lo que imposibilita realizar su detección, mientras que en la membrana, se hallan accesibles al estar adheridas sobre la superficie de la misma. En la Tabla 12 se encuentran las características de los anticuerpos y las diluciones usadas en cada determinación: Fi gura 15 . Tipos de Comet. Material y Métodos 91 3.5.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS: SDS-PAGE Fundamento: La separación de las proteínas teniendo en consideración su masa molecular se efectuó por medio de electroforesis en geles de poliacrilamida. Los geles de poliacrilamida se obtienen, de manera general, por la polimerización de moléculas de acrilamida y N, N´-metilén-bisacrilamida, disueltas en un tampón adecuado. Para eso, requieren la acción de un polimerizador, que suele ser el persulfato amónico (APS). Al disolverse en agua, origina radicales libres, que a su vez inducen la formación de diversos radicales libres en la acrilamida, favoreciendo de esta manera su polimerización. La gelificación se consigue mediante la formación de enlaces cruzados Anticuerpo Clasificación y peso molecular Dilución Variante Referencia comercial GPx 1 Primario (23 kDa) 1:10000 IgG policlonal en conejo (SC-30147) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY GPx 4 Primario (21 kDa) 1:5000 IgG policlonal en conejo (SC-50497) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY SelP Primario (57 kDa) 1:20000 IgG policlonal en conejo (SC-30162) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY Anti-rabbit IgG Secundario GPx11:5000 GPx41:10000 Sel P1:20000 Anti-IgG en conejo (SC-2030) SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY Anti-β-Actina (Mouse IgG1) Primario (42 kDa) 1:20000 IgG1 monoclonal en ratón (A5441) SIGMA Anti-Mouse IgG1 Secundario 1:8000 Anti-IgG1 monoclonal en ratón (A9044) SIGMA Tabla 12. Características generales de los anticuerpos usados en la inmunodetección. Material y Métodos 92 en la presencia de la bisacrilamida. Así, se obtiene una malla de cadenas de poliacrilamida. A este proceso de polimerización también se añade tetrametilén diamina (TEMED), que es un estabilizador de los radicales libres. La separación de proteínas por electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) es función de su carga y de su forma, y esta última depende del plegamiento de la proteína. Los detergentes son moléculas anfipáticas, o sea con zonas apolares y con zonas cargadas, y pueden desnaturalizar las proteínas (romper el plegamiento) al asociarse con las zonas hidrofóbicas de éstas, haciendo que todas las proteínas presenten la misma forma y también una densidad de carga muy similar. El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente que se une fuertemente a las proteínas, desnaturalizándolas e induciéndolas a adoptar una forma cilíndrica. Es conocido que el SDS se une en una proporción de aproximadamente 1,4 g de SDS por 1 g de proteína, lo que proporciona una relación carga/masa muy uniforme para las mayor parte de las proteínas que se le unen. El tratamiento simultáneo con un agente reductor de puentes disulfuro, como el 2-mercaptoetanol, asegura al experimentador que la proteína está completamente desnaturalizada antes de ser cargada en el gel, garantizando que corre de manera uniforme. Para controlar visualmente el avance de la proteína en la electroforesis y evitar que sobrepase el extremo del gel, se emplea un colorante como el azul de bromofenol. Procedimiento: (1) Previamente a la carga de las muestras, en un tubo de eppendorf de 1.5 ml se pipeteó el volumen necesario de muestra para la cantidad de proteína que queríamos cargar (100 µg) y se llevó hasta el volumen deseado con tampón de carga, con el objetivo de pipetear el mismo volumen y la misma cantidad para todas las muestras. A continuación, las muestras se incubaron a 95ºC durante 5 minutos, para desnaturalizar las proteínas. (2) Enseguida, se prepararon los geles: separador y concentrador. La separación se verificó en el gel separador, donde la migración es condicionada por la carga y el tamaño molecular de las partículas. Para la GPx-1 y GPx-4 se utilizó un gel separador que contenía un 12% de acrilamida. En relación a la selenoproteína P se usó un gel de separación cuya composición poseía un 8% de acrilamida. En el concentrador, las muestras se concentraron en una zona muy estrecha, permitiendo que las proteínas se alineasen. Los componentes empleados en los geles se encuentran descritos en las Tablas 13, 14 y 15. Material y Métodos 93 Reactivo Cantidades empleadas en gel 12% Agua bidestilada 3.3 ml Acrilamida-bisacrilamida 30% (BIO-RAD) 4 ml Tris (SIGMA)1.5 M a pH 8.8 2.5 ml Dodecil sulfato de sodio (SDS) (SIGMA) al 10% (p/v) en agua destilada 100 µl Persulfato amónico (APS) (SIGMA) al 10% (p/v) en agua destilada 100 µl TEMED (BIO-RAD) 5 µl Reactivo Cantidades empleadas en gel 8% Agua bidestilada 4.6 ml Acrilamida-bisacrilamida 30% (BIO-RAD) 2.7 ml Tris (SIGMA)1.5 M a pH 8.8 2.5 ml Dodecil sulfato de sodio (SDS) (SIGMA) al 10% (p/v) en agua destilada 100 µl Persulfato amónico (APS) (SIGMA) al 10% (p/v) en agua destilada 100 µl TEMED (BIO-RAD) 6 µl Tabla 13. Componentes del gel separador para la GPx1 y GPX-4. Tabla 14. Componentes del gel separador para la selenoproteína P. Material y Métodos 94 Reactivo Cantidades Agua bidestilada 5.5 ml Acrilamida-bisacrilamida 30% (BIO-RAD) 1.3 ml Tris (SIGMA)1.5 M a pH 8.8 1 ml Dodecil sulfato de sodio (SDS) (SIGMA) al 10% (p/v) en agua destilada 80 µl Persulfato amónico (APS) (SIGMA) al 10% (p/v) en agua destilada 80 µl TEMED (BIO-RAD) 8 µl La composición del tampón de carga y del tampón de electroforesis se puede observar en las Tablas 16 y 17. Reactivo Concentración Tris (SIGMA) a pH 6.8 1M Glicerol (PANREAC) 0.1% (p/v) Dodecil sulfato de sodio (SDS) (SIGMA) 10% (p/v) Azul de Bromofenol (SIGMA) 2% (v/v) 2-mercaptoetanol (BIO-RAD) 5% (v/v) Reactivo Concentración Tris (SIGMA) 250 mM Glicina (SIGMA) 1.92 M Dodecil sulfato de sodio (SDS) (SIGMA) 1% (p/v) Tabla 15. Reactivos utilizados para el gel concentrador. Tabla 16. Componentes del tampón de carga. Tabla 17. Componentes del tampón de electroforesis. Material y Métodos 95 Una vez preparado el gel separador, se vertió entre los dos vidrios de un equipo de BIO-RAD LABORATORIES para Western Blotting. Para que la superficie del gel quedase plana y se evitase la entrada de oxígeno atmosférico, se añadió agua bidestilada entre los vidrios. Cuando el gel polimerizó (aproximadamente en 25-30 minutos), se eliminó el agua bidestilada, se vertió el gel concentrador y se introdujo un peine evitando la formación de burbujas. Este último se retiró con cuidado tras la polimerización del gel (después de 30 minutos). Enseguida, se montó el equipo de electroforesis y se llenó la cubeta con tampón de electroforesis diluido (1/10) en agua bidestilada. Se cargaron las muestras en los pocillos, así como el marcador de peso molecular (Prestained Protein Molecular Weight Marker 26612THERMO SCIENTIFIC) con ayuda de una pipeta y se conectó la cubeta a una fuente de voltaje. Se aplicó una intensidad de 150 V con un regulador de voltaje (PowerPacTM Basic – BIO-RAD), hasta que el frente de las muestras alcanzó el extremo final del gel. 3.5.2. Transferencia de proteínas Fundamento: Esta técnica permite que las proteínas separadas por electroforesis sean accesibles a la detección por anticuerpos, dado que las proteínas se quedan fuertemente adheridas a la superficie de una membrana, generalmente de nitrocelulosa. En la Tabla 18 se pueden encontrar los reactivos del tampón de transferencia. Reactivo Concentración Tris (SIGMA) 20 mM Glicina (SIGMA) 192 mM Metanol (PANREAC) 20% (v/v) Procedimiento: Se recortó un rectángulo de membrana de nitrocelulosa (BIO-RAD) y dos de papel de Whatman, ambos ligeramente mayores que el gel, y se sumergieron en tampón de transferencia, en simultáneo con dos almohadillas de esponja. Se realizó el montaje de transferencia en un cassette adecuado para el efecto, siguiendo el orden: tapa negra, almohadilla de esponja, papel de Whatman, gel, membrana, papel de Whatman, almohadilla de esponja y tapa transparente. Al mismo tiempo se aplicó presión para Tabla 18. Componentes del tampón de transferencia. Material y Métodos 96 evitar la formación de burbujas entre el gel y la membrana. Este cassette se colocó en la cubeta de transferencia, conjuntamente con una barra magnética y una bolsa de hielo y se llenó la cubeta con tampón de transferencia hasta el nivel indicado. Por fin, se conectó a una fuente de voltaje y se aplicó una intensidad de 100 V durante una hora. 3.5.3. Inmunodetección Fundamento: La inmunodetección puede ser indirecta o directa. La inmunodetección indirecta se basa en un procedimiento en el cual se emplea un anticuerpo específico para localizar la proteína que quiere estudiarse (anticuerpo primario) y un segundo anticuerpo (anticuerpo secundario) contra las inmunoglobulinas de la especie en la que se ha obtenido el anticuerpo primario. El anticuerpo secundario posee alguna marca capaz de producir una señal detectable. Este es el método más comúnmente empleado y también lo que se utilizó en nuestro estudio. La composición de los reactivos utilizados se encuentra en la Tabla 19. Reactivo Concentración Solución TBST: Tris (SIGMA) NaCl (ACOFARMA) Tween 20 (SIGMA) 10 mM 100 mM 0.1% (v/v) Solución de bloqueo y de dilución de anticuerpos (BIO-RAD) 3% (p/v) disuelta en TBST Solución de Ponceau S en 5% de ácido acético (SIGMA) 0.1% (p/v) Procedimiento: Una vez efectuada la transferencia se comprobó la eficacia de la misma. Para eso, en un recipiente plástico, se tiñó la membrana con el colorante de Ponceau, durante breves instantes, y seguidamente se lavó cuidadosamente con agua bidestilada. Tras este paso, se introdujo la membrana en una solución de bloqueo, de forma que quedase completamente cubierta y se dejó incubando a temperatura Tabla 19. Reactivos utilizados en la inmunodetección. Material y Métodos 97 ambiente, durante una hora en agitación orbital a 50 r.p.m. (aparato Orbit 1000LABNET). Finalizado el bloqueo de la membrana, ésta se incubó con el anticuerpo primario específico, diluido en solución de bloqueo, durante toda la noche a 4ºC en el agitador orbital (ver diluciones en la tabla 19). Terminada la incubación, se realizaron ocho lavados con TBST de tres minutos cada uno. El anticuerpo secundario se preparó de la misma forma que el primario con las diluciones específicas detalladas en la tabla. Este se dejó incubando una hora a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, se hacen los mismos lavados efectuados con el anticuerpo primario. 3.5.4. Revelado Fundamento: En nuestro experimento se utilizó el proceso de quimioluminiscencia. Este se basa en la emisión de energía en forma de luz a partir de una sustancia, como consecuencia de una reacción química. Para este efecto es común la utilización de un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano, actuando esta como catalizadora de la reacción. Los materiales empleados en esta fase se hallan descritos en la Tabla 20. Materiales Cassette de exposición Películas de alta sensibilidad (KODAK) Revelador y Fijador (KODAK) Detector de quimioluminiscencia (ADVANSTA - WesternBrightTM Quantum) Procedimiento: En una habitación oscura, la membrana se incubó durante dos minutos con el líquido detector de quimioluminiscencia. Seguidamente se retiró el exceso de detector y se colocó la membrana en el interior del cassette y se expuso frente a la película fotográfica, durante breves minutos. Por fin, se introdujo la película en recipientes que contenían la solución reveladora, el agua y la solución fijadora y se dejó secar a temperatura ambiente. Los resultados obtenidos se analizaron por densitometría Ta bla 20. Materiales usados durante el revelado. Resultados y Discusión 104 ●●●,■■ 0 1 2 3 4 5 6 CO AO CIP AIP (g/d) 1.1.2. Estudio de la ingesta sólida Al estudiar la ingesta sólida durante el periodo experimental, el grupo AO presentó una ingesta significativamente menor en comparación a los grupos CO y AIP (Figura 17). Durante los periodos de tratamiento se encontró que los modelos de ingesta aguda de alcohol utilizados producían una alteración en la función motora lo que disminuyó el número de veces que los animales accedían al comedero. Así, en el modelo oral de consumo de alcohol tipo “binge drinking”, se afectó la función motora y el apetito de las ratas, mientras que en el modelo intraperitoneal de “binge drinking” solo se modificó la función motora durante unas 6 horas tras la inyección. White y cols. (2002) demostraron que el consumo agudo de alcohol (2 o 3 g/Kg) altera la función motora en las ratas adolescentes, prácticamente desde el inicio del tratamiento, dificultando seriamente el acceso a la comida. Por otra parte, cuando el consumo de alcohol es superior al 16% del total de la energía ingerida en la dieta, hay una disminución en el porcentaje de energía derivada de las proteínas, las grasas y los hidratos de carbono, y la calidad nutricional de la dieta disminuye junto con el peso corporal (Hillers y Massey, 1985). Esto ocurre en el grupo AO, donde el porcentaje de Los resultados se expre san como la media ± ESM. Significación estadística: CO vs AO: ●●● p < 0.001; AO vs AIP: ■■ p < 0.01. Figura 16. Incremento de peso durante todo el período experimental (g/d) Resultados y Discusión 105 calorías consumidas en forma de alcohol supone alrededor del 22% de la energía total, probablemente como consecuencia del patrón de consumo de alcohol que realizaban estas ratas durante 24 horas al día y tres días, consecutivos, por semana. Este hecho no se produjo en las ratas adolescentes del grupo AIP, debido a que la cantidad de alcohol que recibieron, por la inyección intraperitoneal, fue menor, y no afectó a la ingesta. ●,■ 0 3 6 9 12 15 18 21 CO AO CIP AIP (g/d) 1.1.3. Estudio de la ingesta líquida La ingesta líquida durante el período experimental fue significativamente inferior (p<0.01) en el grupo AO y AIP en comparación con sus respectivos controles (CO y CIP) (Figura 18). Diversos estudios han descrito, utilizando ratas alcohol-preferentes (P) o que consumen grandes cantidades de alcohol que el etanol puede disminuir la ingesta de agua (Bell y cols., 2006; Gonçalves de Orange y cols., 2009). Parece ser que la vía de administración o la concentración de alcohol utilizada, pueden ejercer efectos adversos en la función adrenal, la cual está involucrada fisiológicamente en el consumo de agua y en su absorción por el riñón (Rivier, 1996). En este estudio, el consumo de alcohol en forma de “binge drinking” produjo una menor ingesta líquida a lo largo del periodo experimental, cuantitativamente similar en ambos grupos, aunque no Figura 17. Ingesta sólida durante todo el período experimental (g/d) Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: CO vs AO: ● p<0.05; AO vs AIP: ■ p<0.05. Resultados y Discusión 106 cualitativamente. Así, las ratas adolescentes que seguían el modelo oral de “binge drinking” ingerían alrededor de 10 mL/d de alcohol al 20% (v/v) durante los días de tratamiento, con un patrón de consumo diferente a lo largo del día, teniendo una ingesta máxima de 2.7 a 3.5 mL durante la primera hora del ciclo nocturno, momento en el que se alcanzaron 0.08 mg/dL de alcohol en la sangre. Sin embargo, en los periodos de descanso, estas ratas ingerían la misma cantidad de agua que las del grupo CO, principalmente, debido a que el efecto aversivo del etanol, en el agua, desaparecía. Por otra parte, en el modelo intraperitoneal utilizado, se inyectaron 3 g/Kg/d de alcohol (20% v/v) durante los días de tratamiento, alcanzando alrededor de 0.2 mg/dL de alcohol en sangre. Como consecuencia de ello, las ratas del grupo AIP ingirieron menos agua durante todo el periodo experimental. ●● 0 5 10 15 20 25 30 CO AO CIP AIP (mL/d) ○○ 1.1.4. Estudio de la ingesta calórica Como se observa en la Figura 19, la ingesta calórica no mostró diferencias significativas entre los grupos estudiados, a pesar de que la ingesta sólida fue significativamente inferior en el grupo AO en relación a los grupos CO y AIP. Esto podría ser debido a que en el grupo AO, el aporte calórico resultante provenía del sumatorio de las calorías que proporcionaban la ingesta sólida y las que aportaban el alcohol ingerido por vía oral. Así, a pesar de que el modelo oral de “binge drinking” Figura 18. Ingesta líquida durante todo el período experimental (mL/d) Los resultados se expre san como la media ± ESM. S ignificación estadística: CO vs AO: ●● p<0.01; CIP vs AIP: ○○ p<0.01. Resultados y Discusión 107 propuesto disminuyó el aporte energético proveniente de la dieta sólida, las calorías aportadas por el consumo de alcohol, durante los días de tratamiento (alrededor de 10.8 Kcal/rata/d), equilibraron el balance energético. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 CO AO CIP AIP (Kcal totales) 1.1.5. Estudio de la homeostasis del selenio La ingesta de Se en el grupo AO fue significativamente menor (p<0.05) que la observada en los grupos CO y AIP, lo que parece estar en consonancia con la menor ingesta sólida encontrada por parte de este grupo, como se refleja en la Figura 17. Con respecto a la absorción aparente de Se (CDA), esta fue similar en todos los grupos estudiados, por lo que no estaría influenciada ni por el consumo de alcohol ni por la cantidad de Se ingerida a través de la dieta. Sin embargo, se observó una menor retención (balance aparente) de este micronutriente en el grupo AO con respecto al resto de los grupos, lo que está de acuerdo con su menor ingesta. La excreción de Se, en las heces y en la orina de los grupos AO y AIP, mostró una reducción significativa con respecto a sus respectivos controles. Estos hallazgos pueden indicar un posible intento homeostático del organismo para retener el Se frente al consumo agudo de alcohol. Cabe destacar que cuando la ingesta de Se es baja, como ocurre en el grupo AO, las cantidades eliminadas por orina y heces presentan una magnitud similar, aunque la excreción urinaria sea la principal vía de eliminación de este elemento (Daniels, 1996; Los r esultados se expresan como la media ± ESM. Figura 19. Ingesta calórica durante todo el período experimental (Kcal totales) Resultados y Discusión 108 Pedrosa y cols., 2012). Por último, los valores significativamente disminuidos de Se en orina, en el grupo AO (p<0.001), con respecto al grupo AIP, podrían explicarse, posiblemente, por una mayor depleción de este nutriente en el organismo de las ratas expuestas al modelo oral de “binge drinking”. Tabla 21. Valores indicativos de la homeostasis del Selenio Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: CO vs AO: ● p<0.05, ●● p<0.01, ●●● p<0.001; AO vs AIP: ■ p<0.05, ■■■ p<0.001; CIP vs AIP: ○ p<0.05, ○○○ p< 0.001. C.D.A.- coeficiente de digestabilidad aparente. 1.2. Determinación de alcohol en orina La excreción de alcohol a través de la orina es un proceso de primer orden, que implica que la cantidad de alcohol aclarada de la sangre es directamente proporcional a su concentración en sangre (Jones, 1990). En este contexto, determinamos la cantidad de alcohol presente en la orina de las ratas adolescentes expuestas a “binge drinking” de manera oral o mediante inyección intraperitoneal. Como se observa en la Figura 20, la cantidad de alcohol presente en la orina, acumulada en las últimas 24 horas de tratamiento, no mostró diferencia significativa entre los grupos AO y AIP. Posiblemente, el grupo AIP excreta la mayor cantidad de alcohol, en pocas horas, tras el tratamiento, en función de la concentración de alcohol que presenta en la sangre. Sin embargo, en el grupo AO el aclaramiento de esta sustancia tuvo lugar durante todo el día, en función de la ingesta líquida de las ratas, y una vez que experimentaba el primer paso de metabolización en el estómago. De esta manera, la cantidad de alcohol Parámetros CO (n=8) AO (n=8) CIP (n=8) AIP (n=8) Se ingerido (µg/día) 3.40 ± 0.2 2.72 ± 0.1 ●, ■ 3.76 ± 0.2 3.49 ± 0.2 C.D.A. (%) 96 ± 6.3 97 ± 7.0 97 ± 6.2 98 ± 6.9 Balance aparente de Se (µg/día) 2.90 ± 0.11 2.55 ± 0.09 ●●, ■ 3.2 ± 0.13 3.22 ± 0.23 Se en heces (ng/día) 121 ± 7 81 ± 6 ●● 112 ± 7 81 ± 5 ○ Se en orina (ng/día) 380 ± 15 80 ± 7 ●●●, ■■■ 440 ± 24 180 ± 10 ○○○ Resultados y Discusión 109 excretada por ambos grupos se equiparó, por lo que se podría suponer, teniendo en cuenta los valores similares de creatinina encontrados en el suero (Tabla 22), que al final del tratamiento, ambos grupos tuvieron cantidades muy similares de alcohol en su sangre. 0 1 2 3 4 5 6 AO AIP Alcohol en orina (mg) 1.3. Estudios en suero y sangre 1.3.1. Parámetros bioquímicos La exposición al alcohol en las ratas que seguían el modelo de consumo tipo “binge drinking” oral y/o intraperitoneal, produjo cambios en su perfil bioquímico. Así, como se muestra en la Tabla 22, determinados parámetros bioquímicos como la glucosa, los triglicéridos, las enzimas aspartato-aminotransferasa (AST) y alanino-aminotransferasa (ALT) y la bilirrubina total se encontraron aumentados significativamente en los grupos AO y AIP, en relación a los grupos CO y CIP, respectivamente. Los resultados se expresan como la media ± ESM. Figura 20. Cantidad de alcohol excretado en orina (mg) durante 24 h después del último tratamiento Resultados y Discusión 110 Tabla 22. Análisis bioquímicos de las ratas CO (n=8) AO (n=8) CIP (n=8) AIP (n=8) Fosfatasa alcalina (U/L) 536 ± 30.5 587 ± 49.9 533 ± 52.5 590 ± 45.4 Colesterol (mg/dL) 95 ± 8.6 96 ± 7.7 90 ± 3.1 96 ± 4.7 Creatinina (mg/dL) 0.27 ± 0.007 0.27 ± 0.006 0.29 ± 0.011 0.30 ± 0.025 Glucosa (mg/dL) 146 ± 7.0 172 ± 8.0 ● 156 ± 9.1 189 ± 7.5 ○ AST (U/L) 127 ± 5.4 198 ± 8.9 ●●● 120 ± 3.9 208 ± 15.5 ○○○ ALT (U/L) 42 ± 2.7 52 ± 1.5 ●● 38 ± 0.9 51 ± 2.4 ○○○ Bilirrubina total (mg/dL) 0.52 ± 0.039 0.64 ± 0.032 ● 0.56 ± 0.034 0.69 ± 0.041 ○ Triglicéridos (mg/dL) 70 ± 3.0 80 ± 3.4 ● 66 ± 1.7 91 ± 6. 0 ○○ Urea (mg/dL) 53 ± 2.4 53 ± 1.7 53 ± 4.6 53 ± 3.6 Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: CO vs AO: ● p< 0.05, ●● p< 0.01, ●●● p< 0.001; CIP vs AIP: ○ p< 0.05, ○○ p< 0.01, ○○○ p< 0.001. En un estudio llevado a cabo por Lee (2012) se encontró una correlación entre el consumo de alcohol en la forma de “binge drinking” y los niveles de glucosa y triglicéridos, en hombres y en mujeres coreanas. Este autor detectó que una mayor frecuencia de este patrón de consumo se asociaba a una mayor prevalencia de síndrome metabólico en ambos sexos. Recientemente, Lindtner y cols. (2013) han desarrollado un estudio para determinar los efectos del “binge drinking” sobre la homeostasis de la glucosa y la actividad de la insulina, administrando, diariamente, durante tres días consecutivos, 3 g/Kg de etanol por vía intraperitoneal, en ratas Sprague-Dawley. Estos investigadores observaron que las ratas presentaban un incremento de los niveles de glucosa en sangre y una mayor expresión de la proteína tirosina fosfatasa 1B (PTP1B), proteína inhibidora en la vía de señalización de la insulina, por lo que concluían que el “binge drinking” disminuye la tolerancia a la glucosa e induce resistencia sistémica a la insulina, incrementado el riesgo de desarrollar diabetes mellitus tipo 2. Incluso, cuando las concentraciones de alcohol en la sangre de estas ratas eran prácticamente indetectables ambos fenómenos se mantenían. Así, teniendo en cuenta estos datos, se podía sugerir que el aumento de glucosa encontrado en los grupos AO y AIP, en nuestro estudio, podía ser el resultado de un desequilibrio homeostático en la glucosa y de un Resultados y Discusión 111 aumento en la resistencia a la insulina. Cabe destacar que previamente a la selección de la vía de administración a utilizar, Lindtner y cols. (2013) comprobaron que no existían diferencias en los estudios de la homeostasis de la glucosa y la actividad de la insulina cuando el etanol era administrado por vía oral gavage o intraperitoneal, por lo que adoptaron la última forma de administración por comodidad técnica. Curiosamente, en nuestra investigación tampoco se encontraron diferencias significativas en los niveles de glucosa entre los grupos AO y AIP. Por otro lado, es conocido que la ingesta de alcohol puede promover un aumento en la síntesis y acumulación de triglicéridos hepáticos, bien a través de la PKCε activada o bien, por la inhibición del PPAR-α y la estimulación de la SREBP1 (Kaiser y cols., 2009; Suh y Jeong, 2011). Una vez acumulados en el hígado, los triglicéridos son transportados a la sangre a través de la apoliproteína B, que se ensambla a ellos, favoreciendo su secreción y por tanto, su aumento en la sangre. El análisis de las concentraciones séricas de las enzimas aminotransferasas puede ser una herramienta valiosa como índice de la lesión hepatocelular. En los grupos AO y AIP se observó un incremento significativo de la AST y de la ALT en comparación a los valores controles, lo que parece indicar que el patrón de consumo alcohólico tipo “binge drinking”, independientemente de la vía de administración, puede afectar la integridad hepática. En este contexto, Artun y cols. (2010) utilizando ratas adultas Wistar sometidas a un tratamiento con tres dosis de alcohol al 33% (5 g/Kg cada 12 horas), por vía oral, observaron un incremento significativo en la actividad sérica de la AST y de la ALT. Paralelamente, estos investigadores detectaron la presencia de esteatosis en el hígado de estos animales. En 2012, Kalaz y cols. utilizando ratas Sprague-Dawley, a las cuales administraron tres dosis de etanol al 40% (5 g/Kg cada 12 horas), por gavage, identificaron un aumento de AST al final del tratamiento. Además, Leung y cols. (2012) detectaron resultados similares, en ratones normales, sometidos a un tratamiento con dos dosis de etanol (6 g/Kg cada 12 horas) utilizando la misma vía de administración. La bilirrubina es un producto resultante del catabolismo de la hemoglobina, la cual es captada por el hígado y conjugada, siendo, posteriormente, excretada en la bilis. Un incremento de bilirrubina puede indicar un trastorno hepático o extrahepático. Numerosos estudios indican que el consumo crónico o agudo de alcohol lleva a una Resultados y Discusión 112 elevación de los niveles de bilirrubina en la sangre (Vendemiale y Lieber, 1984, Lu y cols., 2007). Nuestros resultados concuerdan con estas investigaciones, no existiendo diferencias significativas según la vía de administración. 1.3.2. Estudio del estrés oxidativo en suero Como se mencionó en los antecedentes, el consumo de alcohol en forma de “binge drinking”, en animales adultos, influye sobre el equilibrio oxidativo, alterando los mecanismos de defensa antioxidante endógenos (Schlorff y cols., 1999). Por otra parte, ha sido establecido que el consumo crónico de alcohol además de influir sobre las enzimas antioxidantes, altera los niveles de Se, un elemento con marcadas propiedades antioxidantes, en animales y humanos (González-Reimers y cols., 2009; Ojeda y cols., 2009). Sin embargo, hay pocos estudios sobre el efecto que el consumo de alcohol tipo “binge drinking” durante la adolescencia produce en el balance oxidativo y menos aún, sobre los niveles de Se. Por todo esto pretendemos determinar los niveles de Se, la actividad de las enzimas antioxidantes GPx y GR, así como distintos biomarcadores del estrés oxidativo en el suero, con el fin de conocer, de forma general, el estado oxidativo de las ratas adolescentes objeto de este estudio. ●● ○ 0 50 100 150 200 250 300 CO AO CIP AIP Se (µg/L) Los resultados se expre san como la media ± ESM. Significación estadística: CO vs AO: ●● p<0.01; CIP vs AIP: ○ p<0.05. Figura 21. Niveles de selenio (µg/L) en el suero Resultados y Discusión 113 En esta investigación se encontró una disminución significativa de los niveles de Se en el suero de los grupos que consumen alcohol, frente a sus respectivos controles (Figura 21). La explicación podría residir en el propio metabolismo del alcohol, ya que genera una serie de productos tóxicos que, en el hígado, interfieren con la síntesis de diferentes selenoproteínas, tales como la selenoproteína P, principal transportador del Se en el plasma, así como de otras proteínas transportadoras de Se como la albúmina (Gao y cols., 2004). Además, se ha demostrado que el consumo agudo y crónico de alcohol por vía oral altera la mucosa intestinal, produciendo una menor absorción de los nutrientes (Bode y Bode, 2003). En nuestro caso podría suceder en las ratas del grupo AO, que además, ingieren menos cantidad de este micronutriente, encontrándose mayor diferencia con su respectivo control que en la vía intraperitoneal. ●● ○ 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 CO AO CIP AIP GPx (mU/mg proteína) Al estudiar la actividad de la enzima antioxidante GPx en suero, se encontró que ésta mostraba una actividad reducida en los grupos expuestos al alcohol, con respecto a los grupos controles (Figura 22). Este hallazgo podría explicarse por la disminución detectada en los niveles de Se en el suero de estas ratas, dado que el Se forma parte del sitio activo de esta enzima (Negro, 2008). Se ha establecido que la principal isoforma de la familia de la GPx presente en el plasma es la GPx3, la cual, tras su formación en los túbulos renales, es liberada al plasma y constituye, junto con la SelP, el 97% de todo el Se plasmático (Olson y cols., 2010). Queda así patente, mediante esta investigación, que Los resultados se expre san como la media ± ESM. S ignificación estadística: CO vs AO: ●● p<0.01; CIP vs AIP: ○ p<0.05. Figura 22. Actividad de la GPx (mU/mg proteína) en el suero Resultados y Discusión 120 1.4.1. Análisis macromorfológico del hígado Como se observa en la Figura 28, no existieron diferencias significativas en el índice organosomático del hígado entre los diferentes grupos estudiados. Estos resultados concuerdan con la investigación desarrollada por Carmiel-Haggai y cols. (2003), que utilizando ratas Fa/? Zucher, a las cuales habían administrado etanol al 35% (4 g/Kg cada 12h) durante tres días por vía gavage, encontraron que no se producían diferencias significativas en el índice organosomático de este órgano en comparación al grupo control que recibió solución salina por la misma vía. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 CO AO CIP AIP (%) La administración crónica de alcohol produce resultados muy diferentes al modelo empleado en este trabajo al generar hepatomegalia e incrementar el índice organosomático del hígado (Okuno F y cols., 1991; Saravanan y Nalini, 2007). Los resultados obtenidos en este estudio sugieren que el consumo de alcohol tipo “binge drinking” no afecta a la masa hepática y que, probablemente, sea necesario un mayor tiempo de tratamiento con alcohol para que se verifiquen cambios en este parámetro. Los resultados se expre san como la media ± ESM. Figura 28. Índice organosomático. Hígado (%) Resultados y Discusión 121 1.4.2. Balance antioxidante y marcadores del estrés oxidativo Al estudiar los niveles de Se hepáticos se pudo observar que existía una disminución significativa (p<0.05) en los grupos expuestos al alcohol en comparación a sus respectivos controles (Figura 29). Houze y cols. (1991) identificaron también una disminución similar de los niveles de Se en el hígado de ratas Sprague-Dawley, a las cuales administraron una dosis de etanol (50 mmol/Kg) por vía intraperitoneal. ○ ● 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 CO AO CIP AIP Se (µg/L) La depleción de Se encontrada en el hígado de estos animales podría producirse, en parte, como consecuencia del metabolismo oxidativo del etanol, ya que como se mencionó anteriormente, los productos tóxicos formados, como los radicales libres y las ERO, podrían interferir en el propio metabolismo del Se alterando la formación de las distintas selenoproteínas hepáticas, proteínas mediante las cuales el Se se almacena en el hígado. Por otro lado, a pesar de la disminución en la ingesta de nutrientes y, por tanto, de Se que se verificó en el grupo AO, no existieron diferencias significativas con respecto al grupo AI. Por tanto, parece que los depósitos de Se hepático se alteran, principalmente, por efecto directo de la exposición al alcohol más que por el déficit nutricional que acarrea su consumo oral, así en ambos modelos existen cantidades similares de Se para sintetizar las selenoproteínas. Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: CO vs AO: ● p<0.05; CIP vs AIP: ○ p<0.05. Figura 29. Niveles de selenio (µg/L) en el hígado Figura 29. Niveles de selenio (µg/L) en el hígado Resultados y Discusión 122 A continuación, al estudiar la capacidad antioxidante de las distintas enzimas hepáticas se pudo observar una disminución significativa (p<0.05) en la actividad de la principal selenoproteína hepática con función antioxidante, la GPx, en los grupos expuestos al alcohol con respecto a sus controles (Figura 30). Estos resultados están en consonancia con Artun y cols. (2010), quienes utilizando ratas adultas Wistar sometidas a un tratamiento con tres dosis de alcohol al 33% (5 g/Kg cada 12 horas), por vía oral, observaron una disminución significativa en la actividad hepática de la GPx. ○ ● 0 20 40 60 80 100 120 CO AO CIP AIP GPx (mU/mg proteína) La reducción de esta actividad antioxidante está en consonancia con los niveles de Se encontrados en el hígado, algo esperable, pues el Se, en forma de selenocisteína, forma parte del núcleo activo de esta enzima. Así, las diferentes vías de administración de alcohol utilizadas parecen alterar por igual la actividad de esta enzima. Respecto a la actividad de la GR, no se encontraron diferencias significativas entre los diferentes grupos estudiados (Figura 31). Probablemente, en el hígado esta enzima no está alterada por este tipo de consumo de alcohol, ya que, como se mencionó en el apartado anterior, la GR se encarga de reciclar el GSSG oxidado por acción de la GPx, disminuida en estos grupos, por lo que no sería necesaria una sobreactivación de la GR. Los result ados se expresan como la media ± ESM. S ignificación estadística: CO vs AO: ● p<0.05; CIP vs AIP: ○ p<0.05. Figura 30. Actividad de la GPx (mU/mg proteína) en el hígado Resultados y Discusión 123 A diferencia de lo que sucede en suero, donde la GPx y la GR están disminuidas, la actividad constante de la GR podría deberse a unos niveles superiores de NADPH en el hígado respecto al suero, puesto que en este tejido la acción oxidativa directa del alcohol requiere de este cofactor. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 CO AO CIP AIP GR (mU/mg proteína) También se determinó la actividad de la enzima SOD, considerada la primera línea de defensa antioxidante contra los radicales libres (Shah y cols., 2013). Como se muestra en la Figura 32, la actividad de esta enzima aumentó significativamente en los grupos CIP y AIP en comparación a los grupos del modelo oral, no encontrándose ninguna diferencia como consecuencia de la exposición al alcohol en el grupo AIP. Estos resultados sugieren que la vía de administración intraperitoneal estimula la actuación de la SOD como un mecanismo de defensa compensatorio frente al estrés oxidativo provocado por la inyección, ya que, como se mencionó en los antecedentes, la técnica de administración intraperitoneal, per se, puede ser una fuente de estrés (D’Souza El Guindy y cols., 2010). Sin embargo, el consumo de alcohol tipo “binge drinking” no altera el funcionamiento de esta enzima. Los resultados se expre san como la media ± ESM. Figura 31. Actividad de la GR (mU/mg proteína) en el hígado Resultados y Discusión 124 □ ■ 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 CO AO CIP AIP SOD (U/mg proteína) Bajo estas condiciones experimentales, se determinó la actividad de la CAT. Como se observa en la Figura 33, se verificó un incremento significativo (p<0.05) en la actividad de esta enzima en los AO y AIP en comparación con sus controles. También se constató que la actividad de la CAT era significativamente mayor en el grupo CIP y AIP que en los respectivos grupos del modelo oral (CO vs CIP: p<0.001; AO vs AIP: p<0.05). □□□ ●,■ ○ 0 50 100 150 200 250 300 CO AO CIP AIP CAT (U/mg proteína) Los resultados se expresan como la media ± ESM. S ignificación estadística: CO vs CIP: □ p<0.05; AO vs AIP: ■ p<0.05. Figura 32. Actividad de la SOD (U/mg proteína) en el hígado Figura 33. Actividad de la CAT (U/mg proteína) en el hígado Los resultados se expresan como la media ± ESM. S ignificación estadística: CO vs AO: ● p<0.05; CO vs CIP: □□□ p<0.001; AO vs AIP: ■ p<0.05; CIP vs AIP: ○ p<0.05. Resultados y Discusión 125 La enzima CAT lleva a cabo la reducción de H2O2 hasta H2O y O2, pero también participa en el metabolismo oxidativo del alcohol, aunque tiene un papel muy leve durante un consumo moderado. Sin embargo, ante concentraciones elevadas de alcohol se produce la inducción de esta enzima, interviniendo de manera más relevante en el metabolismo de esta droga (Scott y cols., 2000). El incremento observado en la actividad de la CAT de los grupos AO y AIP puede ser, por tanto, consecuencia de la inducción producida por el consumo elevado de alcohol en forma de “binge drinking”, y además, de la presencia de H2O2, pues como se mencionó anteriormente, la inducción de CYP2E1, a dosis elevadas de alcohol, conlleva a la formación de una mayor cantidad de H2O2. El H2O2 necesario para la actuación de la CAT puede proceder, además de la activación de la enzima SOD y del CYP2E1, de muy diversas fuentes, entre las cuales se incluyen la NADPH oxidasa y la xantina oxidasa, así como, por la oxidación de ácidos grasos en los peroxisomas (Bradford, 2007; Comporti y cols., 2010). En estudios preliminares, realizados en este laboratorio, se ha observado un aumento de NADPH oxidasa en los grupos CIP y AIP, que recibían solución salina y alcohol por vía intraperitoneal. Por tanto, el exceso de H2O2 generado por esta enzima, junto al generado por la SOD (también incrementada en los grupos de tratamiento intraperitoneal), podrían explicar la mayor actividad encontrada en los grupos sometidos a la inyección intraperitoneal en comparación con sus respectivos grupos en el modelo oral. En base a los resultados obtenidos en esta investigación, se podría sugerir que la vía de administración utilizada para simular el consumo de alcohol tipo “binge drinking” juega un papel muy importante en la activación de las enzimas SOD y CAT, incluso en ausencia de alcohol. Así, se ha demostrado que la inyección intraperitoneal provoca un estrés (oxidativo) en estos animales que exige una sobreactivación de la CAT y SOD para mantener el equilibrio redox en el interior de las células hepáticas. La mayor actividad encontrada para la SOD y para la CAT en el grupo CIP en comparación al grupo CO, corrobora este argumento. Resultados y Discusión 126 Posteriormente, se calcularon las ratios GPx/SOD y CAT/SOD con el fin de conocer la capacidad defensiva del hígado para hacer frente al estrés oxidativo provocado por el H2O2 y el alcohol (Kartvelishvili y cols., 2004). Como se puede observar, en la Figura 34, la relación GPx/SOD está disminuida significativamente (p<0.05) en los grupos sometidos al consumo agudo de alcohol en comparación a sus controles. Estos resultados nos permiten sugerir que la enzima GPx no está actuando de forma adecuada, por lo que es incapaz de descomponer eficazmente el H2O2 originado por la exposición al alcohol. Por tanto, es probable, que como consecuencia de la alteración producida en la capacidad antioxidante de esta enzima se esté promoviendo la oxidación en las biomoléculas hepáticas. Este hecho es debido, en parte, a la depleción hepática de Se encontrada en estos animales, pero también a la alta dosis de alcohol a la que están expuestos, que induce a la isoforma CYP2E1, generando mayor cantidad de ERO (Zhou y cols., 2002; Cederbaum, 2006). Entre estas se incluyen el H2O2, sustrato de la GPx, pero que a altas concentraciones satura a la enzima (Barja de Quiroga, 1997; Góth, 2006; Huang y cols., 2009). ○ ● 0 400 800 1200 1600 2000 2400 2800 CO AO CIP AIP GPx/SOD Figura 34. Ratio GPx/SOD en el hígado Los resultados se e xpresan como la media ± ESM. S ignificación estadística: CO vs AO: ● p<0.05; CIP vs AIP: ○ p<0.05. Resultados y Discusión 127 Al calcular el cociente CAT/SOD en el hígado de los diferentes grupos (Figura 35) observamos un menor valor en el grupo CO con respecto al resto de los grupos, indicando que tanto la exposición al alcohol (CO vs AO: p<0.05) como la vía de administración intraperitoneal (CO vs CIP: p<0.05) ponen en marcha el sistema antioxidante CAT/SOD con el fin de descomponer el H2O2 formado y hacer frente al estrés oxidativo originado por el consumo de alcohol tipo “binge drinking” y por la inyección intraperitoneal, aunque no en todos los casos fue conseguido, como veremos al analizar la oxidación que presentan los lípidos y las proteínas hepáticas. ●□ 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 CO AO CIP AIP CAT/SOD Al determinar el estado oxidativo que presentaban las células hepáticas se pudo observar que los niveles del marcador de la peroxidación lipídica (MDA) estaban significativamente aumentados (p<0.001) en los grupos expuestos al alcohol en comparación a sus respectivos controles (Figura 36), no existiendo diferencias significativas entre los grupos controles. Los resultados se expresan como la media ± ESM. S ignificación estadística: CO vs AO: ● p<0.05; CO vs CIP: □ p<0.05. Figura 35. Ratio CAT/SOD en el hígado Resultados y Discusión 128 ●●● ○○○ 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 CO AO CIP AIP MDA (moles/mg proteína) La peroxidación lipídica en el hígado asociada a este tipo de consumo de alcohol, ha sido descrita en numerosos estudios, siempre en animales adultos (Husain y Somani, 1997; Zhou y cols., 2002; Kim y cols., 2008; Artun y cols., 2010; Yang y cols., 2012). Debido al proceso metabólico del alcohol, y a la activación de la isoforma CYP2E1, se produce, en el hígado, acetaldehído y una gran cantidad de ERO que inician la peroxidación lipídica. Por otro lado, la depleción de sustancias con propiedades antioxidantes, como el Se, que forma parte de la enzima GPx, también parece contribuir en este proceso oxidativo, disminuyendo la actividad de esta enzima (Soudani y cols., 2011). Así, independientemente de la vía utilizada para la administración de alcohol, se produce la misma cantidad de oxidación lipídica en ambos modelos, no afectando, en este caso, las distintas actividades de CAT y SOD, encontradas en los grupos expuestos al alcohol. Respecto a los controles, el aumento de la SOD y CAT, provocado por la inyección intraperitoneal, quedó compensado no existiendo oxidación lipídica en las ratas CIP. En la Figura 37 se puede observar que los grupos carbonilo, indicadores del grado de oxidación de las proteínas, estaban significativamente aumentados en el grupo AO (p<0.01) y AIP (p<0.001) en comparación con sus respectivos controles. Además, se verificó que estos grupos carbonilo eran significativamente inferiores en el grupo AO Los resultados se expre san como la media ± ESM. S ignificación estadística: CO vs AO: ●●● p<0.001; CIP vs AIP: ○○○ p<0.001. Figura 36. Niveles de MDA (moles/mg proteína) en el hígado Resultados y Discusión 129 que en el AIP (p<0.01). Trabajos previos han revelado resultados similares siempre en ratas adultas. Así, Vendemiale y cols. (1998) detectaron un incremento significativo de los grupos carbonilo en el hígado, mediante una investigación desarrollada en ratas Sprague-Dawley adultas, que recibieron una única dosis de etanol al 25% (4 g/Kg) por gavage. Posteriormente, Zhou y cols., (2002) identificaron un aumento del mismo parámetro en el hígado de ratones adultos normales (9 semanas), los cuales habían sido sometidos a tres dosis de etanol al 25% (5 g/Kg cada 12 horas), también mediante la técnica de gavage. ○○○ ●●,■■ 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 CO AO CIP AIP GC (nmoles/mg proteína) En nuestra investigación, queda patente que el consumo agudo de alcohol provoca un desequilibrio antioxidante que contribuye a la oxidación de las proteínas de los grupos AO y AIP. Es conocido que las proteínas son una diana importante del ataque oxidativo, dado que las ERO pueden oxidar los residuos aminoacídicos, romper enlaces peptídicos, aumentar la fragmentación y la susceptibilidad a la degradación proteolítica (GonzálezTorres y cols., 2000; Bailey y cols., 2001). Además, estas modificaciones pueden ser, potencialmente, mucho más importantes que el daño oxidativo generado en los lípidos, ya que afectan a una amplia variedad de funciones celulares como los mecanismos de transducción de señales y la actuación de receptores, transportadores y sistemas enzimáticos (Kapaki y cols., 2007). Los resultad os se expre san como la media ± ESM. S ignificación estadística: CO vs AO: ●● p<0.01; AO vs AIP: ■■ p<0.01; CIP vs AIP: ○○○ p<0.001. Figura 37. Niveles de grupos carbonilo (nmoles/mg proteína) en el hígado Resultados y Discusión 136 estudiados. Nuestros resultados están de acuerdo con Das y cols. (2011) que encontraron datos similares al comparar el perfil hematológico que presentaban pacientes con enfermedad hepática no alcohólica y pacientes con daño hepático alcohólico. Estos autores proponían el examen hematológico, sobre todo el recuento de plaquetas, como una herramienta útil para identificar a los pacientes alcohólicos con daño hepático, pues estas células disminuyen drásticamente en estos individuos. Tabla 24. Análisis hematológicos. C (n=50) A (n=44) H (n=32) AH (n=31) Leucocitos (K/µL) 5.8±0.3 [4.6-10.2] 6.3±0.4 [4.4-10.10] 7.6±0.7 b [5.75-9.45] 7.0±0.5 c [5.8-8.9] Hematíes (M/µL) 5.3±0.3 [4.04-6.13] 4.2±0.2 aa [2.24-5.47] 4.1±0.2 b [3.63-5.08] 3.8±0.2 cc [2.86-4.32] Hemoglobina (g/dL) 15.3±0.6 [12.2-18.1] 12.5±0.5 aa [7.2-16.4] 13.2±0.4 b [12.1-14.5] 13.3±0.4 c [10.7-15.5] Hematocrito (%) 44.2±3.1 [37.7-53.7] 36.9±1.6 a [21.3-47.4] 38.9±1.7 [35.1-44.9] 39.3 ± 2.7 [31.4-46.8] Plaquetas (K/µL) 312.3 ± 21.5 [142-424] 188.7 ± 15.3 aaa [70-350] 204.5 ± 9.6 bbb,■■■ [180-245] 123.7 ± 9.1 ccc,▲▲ [88-148] Los resultados se expresan como la media ± ESM, analisados por t-Student y como un rango. Grupos: C: control, A: pacientes alcohólicos crónicos sin daño hepático, H: pacientes con daño hepático no alcohólico, AH: pacientes alcohólicos crónicos con daño hepático. Significación estadística: C vs A: a p<0.05, aa p<0.01, aaa p<0.001; C vs H: b p<0.05, bbb p<0.001; C vs AH: c p<0.05,cc p<0.01, ccc p<0.001; A vs AH: ▲▲ p<0.01; H vs AH: ■■■ p<0.001. 2.1.2. Estrés oxidativo En la Figura 42 se observa una disminución significativa (p<0.001) de los niveles de Se en el suero de los pacientes alcohólicos crónicos (A) y en los pacientes con daño hepático no alcohólico (H). Esta reducción también tuvo lugar en los pacientes del grupo AH, siendo la disminución aún mayor que en los otros grupos (p<0.001). Resultados y Discusión 137 ccc,▲▲▲ aaa bbb,■■■ 0 20 40 60 80 100 120 C A H AH Se (µg/L) Otros investigadores también han encontrado un descenso significativo de los niveles de Se en el suero de pacientes alcohólicos y en pacientes afectados por la enfermedad hepática (Thuluvath y Triger, 1992; Guarini y cols., 1998; González-Reimers y cols., 2008). En este estudio, además queda de manifiesto, al medir simultáneamente los grupos A, H y AH, que en el grupo AH debido, en parte, al abuso crónico del alcohol, pero además, a la enfermedad hepática, existe una mayor disminución de Se sérico; pues ambas situaciones están asociadas a una reducción de los niveles de Se, como se comentó ampliamente en el apartado 2.3.3. de los Antecedentes. En base a los datos obtenidos en esta investigación, y al hecho de que probablemente, el daño hepático empeora la síntesis de las selenoproteínas, como la selenoproteína P (un importante transportador de Se) y de otras proteínas que contienen Se, como la albumina (Czuczejko y cols., 2003; Burk y Hill, 2005); se podía sugerir que tanto el consumo crónico de alcohol como la enfermedad hepática contribuyen a disminuir los niveles de Se, provocando un descenso muy evidente en el grupo de pacientes alcohólicos con daño hepático (AH), por lo que se podría proponer el déficit de Se, encontrado en el suero, como un potencial marcador de la enfermedad hepática alcohólica. Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: C vs A: aaa p<0.001; C vs H: bbb p<0.001; C vs AH: ccc p<0.001; A vs AH: ▲▲▲ p<0.001; H vs AH: ■■■ p<0.001. Figura 42. Niveles de selenio (µg/L) en el suero Resultados y Discusión 138 ccc,▲▲ bbb,■■ aaa 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 C A H AH GPx (mU/mg proteína) cc bbb,■ aaa,● 0 0.4 0.8 1.2 C A H AH GR (mU/mg proteína) a■■■ ccc,▲ 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 C A H AH GR/GPx Figura 43. Actividad de la GPx y de la GR en suero y su ratio GR/GPx Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: C vs A: a p<0.05, aaa p<0.001; C vs H: bbb p<0.001; C vs AH: cc p<0.01, ccc p<0.001; A vs H: ● p<0.05; A vs AH: ▲ p<0.05, ▲▲ p<0.01; H vs AH: ■ p<0.05, ■■ p<0.01,■■■ p<0.001. Resultados y Discusión 139 Como se observa en la Figura 43, la actividad de la GPx estuvo significativamente reducida en el grupo de pacientes alcohólicos crónicos (C vs A p<0.001) y en el grupo de pacientes con daño hepático no alcohólico (C vs H p<0.001), siendo aún menor en el grupo de pacientes alcohólicos crónicos con daño hepático alcohólico (AH), con una diferencia significativa (p<0.01) en relación a los grupos A y H. Por otro lado, el grupo H presentó la menor actividad para la enzima GR, la cual también disminuyó en los grupos A y AH. Cuando se analizó la relación GR/GPx, no se encontraron diferencias significativas entre los grupo C y H. No obstante, los grupos de pacientes alcohólicos (A y AH) tenían valores aumentados en comparación al grupo C (C vs A: p<0.05, y C vs AH: p<0.001), siendo mayor en el grupo AH. Las alteraciones encontradas en la actividad de la GPx están en consonancia con los niveles de Se observados en cada uno de los grupos estudiados, manifestando que existe una relación entre el estado de Se y la actividad de esta enzima antioxidante, de manera que fue el grupo AH el que presentó el menor poder antioxidante. Paralelamente, la actividad de la enzima GR también disminuyó en los grupos A, AH y H, probablemente, como consecuencia de su asociación con la GPx. Como ya se ha comentado, la reducción en la actividad de la GPx provoca una menor necesidad de GSH, lo que conlleva a una menor actividad en la GR. En este apartado también se estudió la ratio GR/GPx con objeto de evaluar la capacidad compensatoria necesaria para mantener el equilibrio redox y hacer frente al estrés oxidativo provocado como consecuencia de las alteraciones en estas enzimas. Al analizar este parámetro detectamos que los grupos de pacientes alcohólicos (A y AH), y de forma especial, los pacientes alcohólicos con daño hepático (AH), combatían el estrés oxidativo puesto que tenían una ratio mayor a la presentada en el grupo C. Sin embargo, este mecanismo de compensación no parecía ser eficiente ya que, como veremos más adelante, estos grupos presentaron una elevada oxidación en los lípidos y las proteínas del suero. Por el contrario, el grupo con daño hepático no alcohólico (H), que presentó una reducción en la actividad de ambas enzimas, tuvo una ratio GR/GPx similar a la del grupo C, por lo que se podía sugerir que ambas enzimas estaban equilibradas y, por tanto, el desequilibrio oxidativo en este grupo no era tan acentuado como en los grupos A y AH. Resultados y Discusión 140 De acuerdo con la Figura 44, la actividad de la enzima SOD estuvo significativamente disminuida en todos los grupos experimentales, con respecto al grupo control (p<0.001). La reducción de la actividad de la SOD en el grupo de pacientes alcohólicos crónicos (A) y en el grupo de pacientes alcohólicos crónicos con daño hepático (AH) también fue significativa en comparación al grupo de pacientes con daño hepático no alcohólico (p<0.001). Estos datos concuerdan con Nalini y cols. (1999), quienes encontraron una disminución en la actividad de la SOD en pacientes con cirrosis alcohólica con respecto a un grupo de pacientes cirróticos con etiología no alcohólica. Posteriormente, Peng y cols. (2005) y Huang y cols. (2009), observaron que en alcohólicos crónicos, sin evidencia clínica de cirrosis, la actividad de la SOD estaba significativamente disminuida en el suero con respecto al grupo control. Estos datos, junto con la ratio GR/GPx equilibrada, indican que el balance oxidativo en pacientes con daño hepático no alcohólico difiere significativamente del encontrado en los grupos que consumen alcohol (A y AH), de manera que el perfil antioxidante podría ser utilizado para comprender la enfermedad hepática no alcohólica, al actuar como marcador para el diagnóstico de esta patología. bbb,■■■ aaa,●●● ccc 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014 C A H AH SOD (U/mg proteína) A pesar de la controversia sobre la actividad de las distintas enzimas antioxidantes en pacientes con enfermedad alcohólica hepática en la literatura consultada, nuestros resultados están en consonancia con la reciente revisión de Zhu y cols. (2012), quienes Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: C vs A: aaa p<0.001; C vs H: bbb p<0.001; C vs AH: ccc p<0.001; A vs H: ●●● p<0.001; H vs AH: ■■■ p<0.001. Figura 44. Actividad de la SOD (U/mg proteína) en el suero Resultados y Discusión 141 observaron una disminución en la actividad de la GPx y de la SOD de pacientes con diferentes tipos de enfermedad hepática. También Zhu y cols. (2012), en su trabajo, describen que el consumo crónico de alcohol desencadenó una reducción de las defensas antioxidantes en el hígado y en la sangre. Los niveles de MDA (marcador de la peroxidación lipídica) se encontraron significativamente aumentados en los grupos A y AH en relación al grupo de los pacientes con daño hepático no alcohólico (H) (p<0.001), y este incremento fue incluso mayor en el grupo AH que en el grupo A (p<0.05) (Figura 45). ccc,▲ ■■■ aaa,●●● 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 C A H AH MDA (moles/mg proteína) Posteriormente, al estudiar el grado de oxidación en las proteínas se detectó que, en todos los grupos experimentales, los niveles de los grupos carbonilo eran más elevados que en el grupo C (p<0.001) y superiores en los grupos de pacientes alcohólicos (A y AH), siendo mayores en el grupo AH que en el grupo A (p<0.05) (Figura 46). Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: C vs A: aaa p<0.001; C vs AH: ccc p<0.001; A vs H: ●●● p<0.001; A vs AH: ▲ p<0.05; H vs AH: ■■■ p<0.001. Figura 45. Niveles de MDA (moles/mg proteína) en el suero Resultados y Discusión 142 aaa bbb,■■■ ccc,▲ 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 2.8 3.2 3.6 4 C A H AH GC (nmoles/mg proteína) Nuestros resultados coinciden con otros investigadores que estudiaron la oxidación de estas biomoléculas en circunstancias similares. Así, Mutlu-Türkoglu y cols. (2000) observaron un incremento de los niveles de MDA y de grupos carbonilo en pacientes alcohólicos crónicos. A su vez, Loguercio y Federico, en 2003, encontraron un aumento de estos parámetros en pacientes alcohólicos crónicos con cirrosis. En este estudio hay que destacar que los niveles de MDA únicamente estuvieron elevados en los grupos de pacientes alcohólicos (A y AH), por lo que podemos deducir que el alcohol es una droga con una alta capacidad oxidativa que provoca la oxidación de los lípidos. Estos resultados concuerdan con los estudios llevados a cabo por Tuma (2002) y Zhu y cols. (2012), que defienden que el alcohol provoca daño aumentando la oxidación de los lípidos. Por todo ello, según esta memoria, se podría proponer a la determinación del MDA como una herramienta para identificar la enfermedad alcohólica. Además, el consumo crónico de alcohol induce, en el hígado, a la isoforma CYP2E1, que aumenta unas 15-20 veces, incrementando el estrés oxidativo y activando el sistema inmune, lo que repercute en un aumento de los niveles de MDA (O`Shea y cols., 2010; Zhu y cols., 2012). Este hecho, junto con la formación de aductos de Los resultados se expresan como la media ± ESM. Significación estadística: C vs A: aaa p<0.001; C vs H: bbb p<0.001; C vs AH: ccc p<0.001; A vs AH: ▲ p<0.05; H vs AH: ■■■ p<0.001. Figura 46. Niveles de grupos carbonilo (nmoles/mg proteína) en el suero Resultados y Discusión 143 proteínas producidos por el acetaldehído durante el metabolismo oxidativo del alcohol, favorece la muerte de los hepatocitos (Tuma, 2002) y por tanto, provoca daño hepático. Por otra parte, ya que los niveles de MDA se correlacionan con el daño hepático inducido por el alcohol, se podría utilizar esta determinación como un factor discriminador frente a otras enfermedades hepáticas no alcohólicas. Masalkar y Abhang, en 2005, comprobaron que las concentraciones de MDA en suero aumentaban de forma significativa, en función a la severidad de la enfermedad hepática alcohólica. En base a esta información, y de acuerdo con los niveles de MDA, que estuvieron particularmente elevados en los grupos de pacientes alcohólicos (A y AH), mientras que los niveles de Se fueron especialmente reducidos en el grupo AH, se calculó la ratio Se/MDA. Así, en comparación al grupo C, la relación Se/MDA disminuyó alrededor del 40% en el grupo de los pacientes con daño hepático no alcohólico (H), un 67% en el grupo de pacientes alcohólicos crónicos (A) y un 83% en el grupo de pacientes alcohólicos crónicos con daño hepático alcohólico (AH) (Figura 47). De acuerdo con estos resultados, se podía concluir que la determinación de la ratio Se/MDA podría ser utilizada como herramienta para diferenciar la etiología del daño alcohólico hepático frente a otras hepatopatías, y de la evolución de los pacientes alcohólicos crónicos hacia una complicación hepática. 100 61.2 16.8 33.3 0 20 40 60 80 100 120 C A H AH Se/MDA (%) Los resultados se expresan como la media ± ESM en %. Figura 47. Ratio Se/MDA en el suero Resultados y Discusión 144 Así, los distintos marcadores oxidativos, expuestos a lo largo de esta sección, podrían ser utilizados con fines diagnósticos. Al mismo tiempo, que, podrían servir como diana para distintos agentes terapéuticos, como el Se. La suplementación con Se podría ser beneficiosa en la prevención de enfermedades hepáticas y/o en la progresión de enfermedades alcohólicas, puesto que podría restablecer la actividad de enzimas antioxidantes en suero como la GPx. Así en estudios con animales de experimentación, se ha observado que dicho aporte extra de Se actúa sobre el suero y el hígado, incrementando la actividad y la expresión de la GPx-1, protegiendo de la oxidación a distintas biomoléculas, al mismo tiempo que restablece los niveles de Se deplecionados en el organismo de ratas expuestas a un consumo crónico de alcohol (Ojeda y cols., 2009; Jotty y cols., 2013). De hecho, varios estudios realizados en animales y, recientemente, en humanos, han desarrollado distintas dietas suplementadas con Se u otros antioxidantes con el fin de mejorar la cirrosis hepática (Zhang y cols., 1996; Zhang y cols., 2007; Kazi y cols., 2012). Sería interesante plantear en un futuro un estudio de suplementación con Se simultáneo sobre los grupos de pacientes con los que hemos trabajado. V-CONCLUSIONES