Caracterización de biomarcadores moleculares de resistencia y sensibilidad a terapia neoadyuvante en cáncer de mama HER2 positivo

1 Universidad de Sevilla Facultad de Medicina CARACTERIZACIÓN DE BIOMARCADORES MOLECULARES DE RESISTENCIA Y SENSIBILIDAD A TERAPIA NEOADYUVANTE EN CÁNCER DE MAMA HER2 POSITIVO Ana Gil Torralvo Sevilla 2024 2 Universidad de Sevilla Facultad de Medicina CARACTERIZACIÓN DE BIOMARCADORES MOLECULARES DE RESISTENCIA Y SENSIBILIDAD A TERAPIA NEOADYUVANTE EN CÁNCER DE MAMA HER2 POSITIVO Memoria para optar al grado de doctor presentada por Ana Gil Torralvo Directores: Francisco Javier Salvador Bofill Carmen Garrigós Vacas Sevilla 2024 3 AGRADECIMIENTOS Quiero expresar mi más sincero agradecimiento a todas las personas que han contribuido y me han apoyado durante la realización de esta tesis. En primer lugar, agradezco profundamente a mi director, Javier Salvador; directora, Carmen Garrigós, y tutor Manuel Romero, por su constante guía, apoyo y valiosos consejos a lo largo de este proceso. Su dedicación y conocimiento han sido fundamentales para el desarrollo de este trabajo. Quiero expresar mi más profundo agradecimiento a todas las pacientes con cáncer de mama cuyas muestras han sido fundamentales para la realización de este estudio. Su generosidad y valentía en momentos de gran dificultad no solo han permitido el avance de la investigación científica, sino que también han sido un ejemplo de coraje y resiliencia para todos nosotros. A todos y cada uno de mis compañeros del laboratorio 216, especialmente a María Ángeles y Sonia, por su compromiso e implicación y su acogida desde el principio en el laboratorio. Agradezco también a mis compañeros de oncología del Hospital Virgen del Rocío, quienes son un ejemplo de empatía, trabajo y vocación y una fuente de inspiración para mí y a muchos de mis compañeros también los considero amigos. Mención especial para mis compañeros del equipo de cáncer de mama a los cuales admiro, por acogerme, ayudarme y enseñarme con tanta generosidad. Su apoyo y sus conocimientos han sido esenciales en mi formación en este tipo de tumor. A los médicos internos residentes del Hospital Virgen del Rocío cuyo entusiasmo y energía incentivan mi motivación y mi vocación. Al equipo de oncología del Hospital de Valme, gracias por enseñarme y formarme como oncóloga, contribuyendo a mi desarrollo profesional y personal, enseñándome no solo los aspectos técnicos y científicos, sino también demostrando una calidad humana excepcional. Siempre los consideraré amigos. También quiero agradecer a los residentes con los que compartí formación; juntos hemos trabajado siempre desde el cariño y el trabajo en equipo, creando un ambiente de aprendizaje y apoyo. Extiendo mi gratitud al servicio de oncología de los hospitales de Córdoba y Málaga, IBIMA e IMIBIC, por su colaboración en la provisión de muestras, lo que ha sido crucial para la realización de este trabajo, así como al equipo de biobanco del Hospital Virgen del Rocío. 4 A mis profesores de Oncología médica del Hospital Clínico de Madrid, por su ayuda en mi Trabajo de Fin de Máster y por su enseñanza en mi primera toma de contacto con la especialidad. A mis padres, Carmen y Felipe, por su incansable esfuerzo durante toda mi carrera y por apoyarme incondicionalmente en todas mis decisiones. Son mi fuente de inspiración. A mis hermanos, Carmen y Miguel, por estar siempre a mi lado, brindándome su apoyo y enseñándome el valor del esfuerzo y la resiliencia. Admiro su inteligencia y su manera de afrontar retos y adversidades. A mi sobrino, Felipe, cuya presencia es una alegría constante, por todo su cariño. A Daniel, por su paciencia y comprensión a lo largo de todo este proceso. Su perspectiva equilibrada me ayuda siempre a ver las cosas de manera diferente y con una actitud positiva. Su apoyo ha sido esencial en esta etapa, y no podría haberlo hecho sin él. A mis amigas de la infancia, "las que faltaban", por confiar en mí siempre y por levantarme la moral y la autoestima en los momentos difíciles. A mis amigos de la carrera y a todos los amigos que he ganado desde que llegué a Sevilla, por estar siempre a mi lado y mantener nuestra amistad a pesar de estar en diferentes hospitales o ciudades. Su compañía y apoyo han sido esenciales para mí. Finalmente, agradezco a todas las personas que de alguna manera contribuyeron a la realización de esta tesis. 5 ABREVIATURAS AC - Doxorubicina Ciclofosfamida ADN - Ácido Desoxirribonucleico ADNc - ADN complementario ADNtc - ADN tumoral circulante AJCC - American Joint Committee on Cancer ALT - Alanina Aminotransferasa ARN - Ácido Ribonucleico ARNm - ARN mensajero AST - Aspartato Aminotransferasa AUC - Área bajo la curva BAG – Biopsia con aguja gruesa BAV – Biopsia asistida por vacío BRCA - Genes BRCA BSGC – Biopsia selectiva ganglio centinela CC - Cirugía conservadora CEM - Mamografía con realce por contraste CK19 - Citoqueratina 19 CM - Cáncer de mama cTNM - Clasificación TNM clínica DAVID - Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery ddAC - Antraciclinas dosis densas DHT - Dihidrotestosterona EC - Epirrubicina Ciclofosfamida 6 ECOG - Eastern Cooperative Oncology Group EMA - Agencia Europea del Medicamento ESMO - European Society for Medical Oncology FAC - Fluorouracilo, Doxorubicina, Ciclofosfamida FA - Fosfatasa alcalina FDR - Tasa de Falsos Descubrimientos (False Discovery Rate) FEC100 - Fluorouracilo, Epirrubicina, Ciclofosfamida FEC50 - Fluorouracilo, Epirrubicina, Ciclofosfamida FISH/SISH - Hibridación Fluorescente in Situ / Hibridación de Plata in Situ FS - Fluorouracilo, Estreptozocina GC – Ganglio centinela GEICAM - Grupo Español de Investigación en Cáncer de Mama GGT - Gamma-glutamiltransferasa HER2 - Receptor 2 del Factor de Crecimiento Epidérmico Humano HR - Razón de riesgo (Hazard Ratio) IA - Inhibidores de la aromatasa IC - Intervalo de confianza IHQ - Inmunohistoquímica ITC - Células tumorales aisladas KEGG - Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes LHRH - Hormona liberadora de hormona luteinizante LncRNA - ARN largo no codificantes OSNA - Amplificación de ácido nucleico en un solo paso PAM50 - Predictor Analysis of Microarray 50 PCA - Análisis de Componentes Principales PET-TC - Tomografía por emisión de positrones - Tomografía computarizada 7 PIK3CA - Mutaciones en subunidad catalítica alfa de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3cinasa qPCR - PCR cuantitativa a tiempo real RCB - Carga tumoral residual RCp - Respuesta completa patológica RE - Receptor de estrógeno ROC - Característica operativa del receptor RP - Receptor de progesterona RRHH – Receptores hormonales RT - Radioterapia RT-IVT - Retrotranscripción - Transcripción in vitro RT-PCR - PCR de retrotranscripción SEOM - Sociedad Española de Oncología Médica SG - Supervivencia Globa SLE - Supervivencia libre de enfermedad SLEi - SLE invasiva SNE - Carcinoma de mama invasivo subtipo no especial. SOLTI - Grupo en investigación clínica del cáncer en España TAC - Tomografía Axial Computarizada TAC control - Transcriptome Analysis Console control TC – Ciclofosfamida y taxanos TE – Solución tampón TIL - Linfocitos infiltrantes de tumores TNM - Clasificación de Tumores, Nódulos y Metástasis Tx - Tratamiento con Docetaxel UDP - Uridina Difosfato 8 UGT - Glucuronosiltransferasa wP - Paclitaxel semanal μL - Microlitro ºC - Grados Celsius 9 RESUMEN Introducción Lograr una respuesta patológica completa después del tratamiento neoadyuvante en tumores con sobreexpresión del receptor 2 del Factor de Crecimiento Epidérmico Humano (HER2 positivos) mejora la supervivencia del paciente, ofreciendo hasta un 92% de reducción en el riesgo de mortalidad. Sin embargo, es crucial identificar y validar biomarcadores capaces de predecir la respuesta al tratamiento neoadyuvante en el cáncer de mama (CM) HER2 positivo, avanzando hacia una medicina más personalizada. Este enfoque permitiría la identificación previa al tratamiento de pacientes con probabilidad de responder a terapias específicas, facilitando así estrategias de tratamiento dirigidas. Nuestro estudio tiene como objetivo identificar posibles biomarcadores moleculares predictivos de la respuesta al tratamiento neoadyuvante a través del análisis de expresión génica diferencial de muestras de tejido de pacientes con CM HER2 positivo y receptores hormonales (RRHH) negativos. Materiales y métodos Realizamos nuestra investigación utilizando ARN extraído de muestras de tejido embebido en parafina de dos cohortes independientes de mujeres con CM HER2 positivo, RRHH negativos, localizado o localmente avanzado, que recibieron tratamiento neoadyuvante en varios hospitales de Andalucía (España). Las pacientes recibieron tratamiento quimioterápico estándar con taxanos y/o antraciclinas y tratamiento dirigido anti-HER2 como trastuzumab y pertuzumab. Además, fueron estratificadas en respondedoras (alcanzando una respuesta completa patológica, RCp) y no respondedoras. La hibridación inicial de ARN de la cohorte 1 se realizó utilizando microarray Clariom D para identificar transcritos expresados diferencialmente entre respondedoras y no respondedoras. Se analizaron los patrones de expresión génica, incluyendo genes, exones, variantes de empalme y vías relacionadas involucradas en la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante, utilizando la Consola de Análisis del Transcriptoma (TAC control). Los transcritos seleccionados de la cohorte 1 fueron luego validados mediante PCR cuantitativa (qPCR) en una cohorte independiente. Resultados Las características clínicas y patológicas de las cohortes demostraron homogeneidad, asegurando la validez de las comparaciones. Se observó una prevalencia significativamente menor de obesidad en la cohorte 1. No se detectaron diferencias significativas en las características tumorales entre las cohortes, excepto en la 16 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Características genómicas, clínicas y proteómicas dominantes de subtipos.. ........................................................................................................................................ 29 Tabla 2. Subtipos subrogados en cáncer de mama..................................................... 29 Tabla 3. Correlación entre subtipos basados en IHQ y subtipos intrínsecos en base a PAM50.. .......................................................................................................................... 30 Tabla 4. TNM 8ª edición de American Joint Committe on Cancer (AJCC). ............... 34 Tabla 5. Estadiaje 8 ª edición American Joint Committe on Cancer (AJCC). ............. 37 Tabla 6. Características clínicas y analíticas de las cohortes 1 y 2 y comparación entre ambas. .................................................................................................................. 71 Tabla 7. Características tumorales de la cohorte 1 y 2 y comparación entre ambas ........................................................................................................................................ 72 Tabla 8. Tratamiento recibido, toxicidad y respuesta a tratamiento en cohorte 1 y 2 y comparación entre ambas. ........................................................................................ 73 Tabla 9. Relación entre RCp y determinadas características clínico-patológicas y tratamientos de las cohortes 1 y 2 .............................................................................. 75 Tabla 10. Relación entre la toxicidad 3-4 y los diferentes tratamientos en cohortes estudiadas ...................................................................................................................... 81 Tabla 11. Análisis de enriquecimiento de función de los genes expresados en cohorte 1. ....................................................................................................................... 93 17 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Incidencia mundial de cáncer. ......................................................................... 20 Figura 2. Incidencia de cáncer en España ....................................................................... 21 Figura 3. Evolución temporal de la mortalidad estandarizada por tumores en mujeres en España) ...................................................................................................................... 22 Figura 4. Supervivencia global y supervivencia libre de recaída para subtipos de tumores basados en expresión génica. .......................................................................... 39 Figura 5. Algoritmo de tratamiento de cáncer de mama precoz. ................................... 43 Figura 6. Algoritmo de tratamiento de cáncer de mama precoz. ................................... 48 Figura 7. Tasa de respuesta completa patológica tras tratamiento neoadyuvante en función del subtipo tumoral. .......................................................................................... 54 Figura 8. Diseño del estudio. ......................................................................................... 61 Figura 9. Proceso de Hibridación…………………………………………………………………………..……63 Figura 10. Diagrama de flujo del número de pacientes incluidas, centro de origen y tiempo de recogida de muestras en las cohortes estudiadas. ....................................... 70 Figura 11. Representación gráfica de la relación entre RCp y características clínicopatológicas y tratamientos de la cohorte 1. ................................................................... 78 Figura 12. Representación gráfica de la relación entre RCp y características clínicopatológicas y tratamientos de la cohorte 2. ................................................................... 80 Figura 13. Representación gráfica de la relación entre tratamientos y la toxicidad grado 3-4 de las cohorte 1. ...................................................................................................... 82 Figura 14. Representación gráfica de la relación entre tratamientos y la toxicidad grado 3-4 de la cohorte 2………………………………………………………………………………………………….….82 Figura 15. SLE en todas pacientes (Cohorte 1 + cohorte 2) ............................................ 83 Figura 16. SLE en la cohorte 1 de pacientes………………………………………………………………..83 Figura 17. SLE en la cohorte 2 de pacientes ................................................................... 84 Figura 18. SG en todas las pacientes (Cohorte 1 + cohorte 2)........................................ 85 Figura 19. SG en la cohorte 2 de pacientes .................................................................... 86 Figura 20. SLE en pacientes con RCp y No RCp en cohorte 1 de pacientes. ................... 87 Figura 21. SLE en pacientes con RCp y NO RCp en cohorte 2 de pacientes ................... 87 Figura 22. SG en pacientes con RCp y NO RCp en cohorte 2 de pacientes .................... 88 Figura 23. PCA Mapping ................................................................................................. 89 Figura 24. Transcritos expresados diferencialmente en microarray. .............................. 90 18 Figura 25. Análisis de categorización funcional de microarray cohorte 1 ...................... 91 Figura 26. Genes codificantes en el microarray de cohorte 1. ....................................... 92 Figura 27. Mapa de calor de genes codificantes de la cohorte 1 de pacientes .............. 92 Figura 28. Análisis de enriquecimiento de función en la cohorte 1 de pacientes. ......... 94 Figura 29. Gáfico volcán ( Volcano plot ) de genes codificantes de la cohorte 1 de pacientes ......................................................................................................................... 95 Figura 30. Relación entre la expresión de UGT2B10 y respuesta completa en cohorte 1. Fold-Change=2,21 ........................................................................................................... 96 Figura 31. Relación entre la expresión de UGT2B17 y respuesta completa en cohorte 1. Fold-Change=1,65 ........................................................................................................... 96 Figura 32. Relación entre la expresión de UGT2B28 y respuesta completa en cohorte 1. Fold-change=3,83 ........................................................................................................... 97 Figura 33. Curva ROC de la expresión diferencial del gen UGT2B10 y respuesta completa en cohorte 1.................................................................................................... 98 Figura 34. Curva ROC de la expresión diferencial del gen UGT2B17 y respuesta completa en cohorte 1.................................................................................................... 98 Figura 35. Curva ROC de la expresión diferencial del gen UGT2B28 y respuesta completa en cohorte 1.................................................................................................... 99 Figura 36. Relación entre la expresión de UGT2B10 y respuesta completa en cohorte 2. ...................................................................................................................................... 100 Figura 37. Relación entre la expresión se UGT2B17 y respuesta completa en pacientes de cohorte 2 .................................................................................................................. 100 Figura 38. Relación entre la expresión se UGT2B28 y respuesta completa en pacientes de cohorte 2 .................................................................................................................. 101 Figura 39. Relación entre la expresión de UGT2B10 y respuesta completa en pacientes de cohorte 2 tratados con antraciclinas. ...................................................................... 102 Figura 40. Relación entre la expresión de UGT2B17 y respuesta completa en pacientes de cohorte 2 tratados con antraciclinas. ...................................................................... 102 Figura 41. Relación entre la expresión de UGT2B28 y respuesta completa en pacientes de cohorte 2 tratados con antraciclinas. ...................................................................... 103 Figura 42. Curva ROC de la expresión diferencial del gen UGT2B17 y respuesta completa en cohorte 2.................................................................................................. 103 Figura 43. Curva ROC de la expresión diferencial del gen UGT2B28 y respuesta completa en cohorte 2. ................................................................................................ 104 19 Figura 44. sobreexpresión de los genes seleccionados y alteración hepática en cohorte 1 .................................................................................................................................... 106 Figura 45. sobreexpresión de los genes seleccionados y obesidad en cohorte 1 ........ 107 Figura 46. sobreexpresión de los genes seleccionados y ki67 en cohorte 1 ................ 109 Figura 47. sobreexpresión de los genes seleccionados y toxicidad en cohorte 1 ........ 110 Figura 48. sobreexpresión de los genes seleccionados y obesidad en cohorte 2 ........ 112 Figura 49. sobreexpresión de los genes seleccionados y ki67 en cohorte 2 ................ 113 Figura 50 sobreexpresión de los genes seleccionados y toxicidad en cohorte 2 ......... 115 Figura 51. Estructura genética de UGT2 en humanos .................................................. 122 20 1. ANTECEDENTES E INTRODUCCIÓN 1.1 Epidemiología del cáncer de mama El CM es a nivel mundial el tumor con mayor incidencia y la principal causa de muerte por cáncer en mujeres. Su incidencia varía en función del sexo (es 100 veces más frecuente en mujeres que en hombres) y de la región geográfica (siendo más frecuente en Europa, Australia y América del norte) (1). Se estima que en España en el año 2024 el número de cánceres diagnosticados alcanzará los 286.664 casos según REDECAN (Red Española de Registros de Cáncer) lo que supone un ligero incremento con respecto a años previos, si bien la realidad puede que sea diferente ya que en estas estimaciones no se incluyen los posibles efectos de la pandemia de la Covid-19 (figura 1). El motivo de dicha incidencia se debe a varios factores entre los cuales se encuentran la mejora en las técnicas de detección temprana de los diferentes tumores, así como el aumento de la esperanza de vida (2). El cáncer más frecuentemente diagnosticado en mujeres en España en 2024 será el de mama (36.395) con una probabilidad estimada de desarrollar CM 1 cada 8 mujeres (3). Figura 1. Incidencia mundial de cáncer. Fuente: “Las cifras del cáncer en España” .2024. SEOM. 21 Figura 2. Incidencia de cáncer en España. Fuente: “las cifras del cáncer en España”. 2024. SEOM. N= número de casos. Además, el CM es la primera causa de muerte en mujeres en España con 6.677 fallecimientos en 2022, si bien a pesar del incremento la mortalidad por cáncer en España ha experimentado un fuerte descenso en las últimas décadas lo que se debe las mejoras en prevención, detección precoz y a los avances terapéuticos como podemos ver en figura 2 (3,4). 22 Figura 3. Evolución temporal de la mortalidad estandarizada por tumores en mujeres en España. Fuente: “las cifras del cáncer en España”. 2024. SEOM. 1.2 Diagnóstico, clasificación y estadiaje de cáncer de mama 1.2.1 Diagnóstico de cáncer de mama El diagnóstico del CM se puede realizar de varias maneras, incluida la palpación de un nódulo durante un examen físico o a través de técnicas de cribado en mujeres asintomáticas. La mayor parte de las pacientes en países con programa de cribado de CM se diagnostican a partir de mamografías estando asintomáticas. La mamografía de control es la prueba indicada a realizar en el programa de cribado de CM, gracias a la cual se estima una reducción relativa de mortalidad por dicho cáncer en torno al 20% en mujeres de entre 50 y 70 años. La Comisión Europea sobre el CM (ECIBCE) recomienda la mamografía bianual de cribado para mujeres de 50 a 69 años mientras que la evidencia de la efectividad en mujeres de 40 a 49 años es más limitada. No hay consenso sobre el uso de la ecografía como método de detección complementario y en mujeres con CM familiar se recomienda la resonancia magnética (RM) en combinación con la mamografía de forma anual para detección precoz sin clara repercusión en términos de mortalidad. En la actualidad, técnicas de imagen como la mamografía, ecografía y RM conforman la primera línea de detección ante la sospecha de CM (5-9). 23 La presentación clínica más frecuente es la autopalpación de un nódulo indurado en la mama si bien otros síntomas menos frecuentes pueden ser la palpación de ganglios axilares o supraclaviculares, cambios en el tamaño de la mama o de la piel (ulceración o engrosamiento) o la retracción del pezón (5, 10). Ante la sospecha de CM es importante realizar un diagnóstico preciso de la extensión inicial de la enfermedad ya que esto puede ser determinante en el abordaje terapéutico. Es importante destacar la importancia de los comités multidisciplinares a la hora de realizar un diagnóstico adecuado de forma coordinada y para la toma de decisiones de tratamiento (5,10). Para el estudio inicial se llevarán a cabo las siguientes pruebas radiológicas: en primer lugar, la mamografía bilateral (ya sea la de cribado o diagnóstica por sospecha clínica) y ecografía de mamas y ganglios linfáticos axilares. Otra prueba para realizar sería la RM que es el método más sensible para la estadificación del CM, pero los hallazgos adicionales deben confirmarse histológicamente debido a la alta tasa de falsos positivos. La realización de RM es de especial interés ante CM primario oculto, enfermedad de Paget del pezón, carcinoma lobulillar, lesiones multifocales y multicéntricas, pacientes con mutación en BRCA, alta densidad mamaria o en aquellos casos en los que se reciba tratamiento neoadyuvante (10,11). En los últimos años ha tomado especial relevancia la mamografía con realce por contraste (CEM, por sus siglas en inglés), una técnica de imagen útil en la detección y evaluación del CM. Sin embargo, si puede sustituir completamente a la RM de mama es un tema de debate aún, ya que, si bien tiene una sensibilidad y especificidad similar a la RM, ésta sigue siendo gold estándar por mayor evidencia en estadiaje y monitorización al tratamiento neoadyuvante. Por otro lado, en determinadas situaciones CEM puede ser útil por su menor coste y mejor accesibilidad o en casos en los que RM está contraindicada (12). También recientemente han surgido numerosos estudios sobre la técnica de la tomosíntesis (técnica radiológica que consiste en la fusión de la mamografía digital 2D y la tomografía obteniendo imágenes en 3D) ofreciendo ventajas sobre la mamografía convencional, especialmente en poblaciones específicas como mujeres con tejido mamario denso. Sin embargo, su uso no está estandarizado y tiene como contras la exposición a radiación y el coste de la prueba (13). El siguiente paso en el proceso diagnóstico del paciente debe ser la toma de biopsia que debe realizarse antes de ningún tratamiento. La biopsia con aguja gruesa (BAG) 14-18G o la biopsia asistida por vacío (BAV) de la lesión sospechosa son el método de elección. En ambos casos se pueden determinar en la muestra RRHH y HER2 y otros biomarcadores. Habitualmente la toma de muestra suele guiarse por ecografía, pero en determinadas situaciones pueden usarse la biopsia guiada por estereotaxia o biopsia guiada por RM. Se recomienda un marcador radio-opaco sobre todo en caso de 24 candidatas a quimioterapia preoperatoria y en caso de sospecha de infiltración de la piel se puede precisar de toma de biopsia cutánea para confirmarlo (14,15). Se recomienda la aspiración con aguja fina (PAAF) o BAG de los ganglios linfáticos sospechosos con marcaje de la adenopatía si la paciente va a recibir tratamiento neoadyuvante (15). Tras la toma de muestra se debe realizar un informe de la biopsia diagnóstica que nos indique: -Tipo histológico: según clasificación de la organización mundial de la salud (OMS) de 2012. -Grado histológico de Nottingham: Clasifica al tumor en 3 categorías que son bien, moderada o pobremente diferenciado (grado 1, 2 y 3) según un método semicuantitativo (Bloom-Richardson modificado) en el que se valoran tres parámetros: la formación de túbulos y estructuras glandulares, el pleomorfismo nuclear y el contaje de mitosis. Se establece una escala de tres valores en cada uno de estos parámetros y así, un tumor que obtenga de 3 a 5 puntos se considera bien diferenciado, moderadamente diferenciado si obtiene de 6 a 7 puntos y pobremente diferenciado si obtiene entre 8 y 9 puntos. -Citoqueratina 19 (CK19). -Invasión linfovascular. -Presencia de carcinoma in situ asociado. -Receptor de estrógenos y de progesterona: se debe estimar el porcentaje de núcleos teñidos (positivos) y la intensidad de la tinción (5,10,16). -Marcadores de proliferación: Ki-67: es un marcador que se emplea para valorar de forma cuantitativa el índice de proliferación celular de la neoplasia. Dada la alta variabilidad entre observadores en la determinación de Ki-67, es importante tener cuidado al usar Ki67 para informar el proceso de toma de decisiones (17). -HER2: El Her2/neu, conocido también como ERBB2, es un protooncogén localizado en el brazo largo del cromosoma 17. Se ha convertido en un importante marcador y diana del CM. El patólogo puede determinar el estatus del gen Her2 (amplificado o no) en el tejido mediante la evaluación de la expresión de la proteína en la membrana de las células tumorales por inmunohistoquímica (IHQ) o mediante la evaluación del número de copias del gen HER2 utilizando hibridación in situ (FISH). Por IHQ, puede ser negativo (0 o 1+) dudoso (2+) o positivo (3+). En los casos dudosos está indicado usar FISH/SISH. La evaluación de HER2 sigue siendo crucial, y las guías recientes enfatizan la importancia de seguir los criterios establecidos sin cambiar a categorías 25 interpretativas como "HER2 Low" debido a la falta de evidencia que distinga predictivamente estas categorías actualmente (18). A pesar de los consensos entre patólogos para las determinaciones IHQ, en la práctica clínica habitual se esperan discrepancias entre laboratorios (19). Se recomienda si es posible una biopsia del tumor de todos los pacientes con recaída de CM para volver a examinar el los RRHH y HER2 ya que la discordancia de estos marcadores entre el tumor primario y la neoplasia metastásica puede ser clínicamente significativa, con tasa de cambios hasta del 53% en tumores primarios HR+/HER2+ y con pérdidas de RRHH y HER2 en 43% y 14% de los casos, respectivamente (20). Para completar el estadiaje de CM es preciso descartar metástasis a distancia ya que aproximadamente en el 5% de las pacientes presentan metástasis al diagnóstico. El estudio de extensión debe adaptarse al estadiaje locorregional y la sospecha clínica. Cuando la enfermedad se detecta en estadio III o cuando los signos o síntomas o los valores de laboratorio sugieren sospecha de metástasis, se debe realizar un estudio más extenso con TAC de tórax, abdomen y gammagrafía ósea (5,10,16). La tomografía por emisión de positrones (PET-TC) también se recomienda para la estadificación inicial de CM localmente avanzado o en el contexto del tratamiento neoadyuvante (21). 1.2.2 Clasificación de cáncer de mama El carcinoma de mama es una enfermedad heterogénea clasificada en diferentes subtipos clínico-patológicos y moleculares cada uno de ellos con diferente comportamiento biológico, historia natural y respuesta al tratamiento. Se conoce que dentro de las células que conforman un mismo tumor, se pueden encontrar diferencias a nivel genético, epigenético, transcriptómico y proteómico (heterogeneidad intratumoral), que confieren diferentes características a las células tumorales, afectando desde a biomarcadores, como al metabolismo, al ciclo celular y a diferentes procesos celulares como la transición epitelio-mesénquima (22). Tradicionalmente la clasificación del CM se ha realizado habitualmente en base a características histopatológicas del tumor como el subtipo histológico, grado, tamaño tumoral, afectación ganglionar o invasión linfovascular. Con los desarrollos tecnológicos y analíticos en biología molecular y proteómica, hemos avanzado en el conocimiento del CM, permitiéndonos así su clasificación en función de características biológicas, clínicas y pronósticas diferentes. 1.2.2.1 Clasificación anatomo-patológica La mayor parte de los tumores de mama se originan en la glándula mamaria (formada por lobulillos y conductos galactóforos). Estos cánceres son de origen epitelial y se 32 T4b: ulceración y/o nódulos satélites ipsilaterales y/o edema (incluyendo piel de naranja) de la piel, que no cumplen los criterios de carcinoma inflamatorio. T4c: ambos (T4a y T4b). T4d: carcinoma inflamatorio. Ganglios linfáticos regionales (N) clínico cNx Los ganglios linfáticos regionales no se pueden evaluar (p. ej., extirpados previamente). cN0 Sin metástasis en los ganglios linfáticos regionales (ni por imágenes ni por examen clínico). cN1 Metástasis a ganglios linfáticos axilares móviles ipsilaterales de nivel I, II. cN2 (metástasis a los ganglios linfáticos axilares ipsilaterales de nivel I, II que están clínicamente fijos o enmarañados; o en ganglios mamarios internos) cN2a – Metástasis a ganglios linfáticos axilares ipsilaterales de nivel I, II fijados entre sí (enmarañados) o a otras estructuras. cN2b – metástasis sólo en los ganglios mamarios internos ipsilaterales y en ausencia de metástasis en los ganglios axilares clínicamente evidentes. cN3 (metástasis en ganglios linfáticos infraclaviculares ipsilaterales (axilares de nivel III) con o sin afectación de ganglios linfáticos axilares de nivel I, II; o en ganglios linfáticos mamarios internos ipsilaterales con metástasis en los ganglios linfáticos axilares de nivel I, II clínicamente evidentes; o metástasis en ganglios linfáticos supraclaviculares ipsilaterales con o sin afectación de los ganglios linfáticos axilares o mamarios internos). cN3a – metástasis en ganglio(s) linfático(s) infraclavicular(es) ipsilateral(es). cN3b – metástasis a los ganglios linfáticos mamarios internos ipsilaterales y a los ganglios linfáticos axilares. cN3c – metástasis en ganglio(s) linfático(s) supraclavicular(es) ipsilateral(es). Ganglios linfáticos regionales (N) patológico pNX los ganglios linfáticos regionales no se pueden evaluar (p. ej., extirpados previamente o no extirpados para estudio patológico) pN0 (sin metástasis en los ganglios linfáticos regionales) pN0 – no se identificaron metástasis en los ganglios linfáticos regionales o solo células tumorales aisladas (ITC). pN0(i+) – células malignas en ganglios linfáticos regionales de no más de 0,2 mm (detectadas 33 mediante tinción con hematoxilina y eosina [H&E] o inmunohistoquímica [IHC], incluidas las ITC). pN0(mol+) – hallazgos moleculares positivos (reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa [RT-PCR]), pero no se detectaron metástasis en los ganglios linfáticos regionales mediante histología o IHC. pN1 (micrometástasis o metástasis en uno a tres ganglios linfáticos axilares y/o ganglios mamarios internos clínicamente negativos con micro o macrometástasis detectadas mediante biopsia del ganglio linfático centinela) pN1mi – Micrometástasis (aproximadamente 200 células, mayores de 0,2mm, pero ninguna mayor de 2,0mm). pN1a – metástasis en uno a tres ganglios linfáticos axilares, con al menos una metástasis mayor de 2,0mm. pN1b – Metástasis en ganglios centinela mamarios internos ipsilaterales, excluyendo TIC. pN1c – pN1a y pN1b combinados. pN2 (metástasis en cuatro a nueve ganglios linfáticos axilares o ganglios linfáticos mamarios internos ipsilaterales positivos mediante imágenes en ausencia de metástasis en los ganglios linfáticos axilares). pN2a – metástasis en cuatro a nueve ganglios linfáticos axilares (al menos un depósito tumoral mayor de 2,0mm). pN2b – Metástasis sólo en ganglios mamarios internos clínicamente detectados con o sin confirmación microscópica; con ganglios axilares patológicamente negativos. pN3 ( Metástasis en 10 o más ganglios linfáticos axilares; o en ganglios linfáticos infraclaviculares (axilares de nivel III); o en ganglios linfáticos mamarios internos ipsilaterales mediante imágenes en presencia de uno o más ganglios linfáticos axilares de nivel I, II positivos; o en más de tres ganglios linfáticos axilares y en ganglios linfáticos mamarios internos con micrometástasis o macrometástasis detectadas mediante biopsia del ganglio linfático centinela pero no detectadas clínicamente; o en ganglios linfáticos supraclaviculares ipsilaterales). pN3a – Metástasis en 10 o más ganglios linfáticos axilares (al menos un depósito tumoral mayor de 2,0mm); o metástasis a los ganglios infraclaviculares (linfáticos axilares de nivel III). pN3b – pN1a o pN2a en presencia de cN2b (nódulos mamarios internos positivos por imagen); o pN2a en presencia de pN1b. pN3c – Metástasis en ganglios linfáticos supraclaviculares ipsilaterales. Metástasis a distancia (M) M0 (no hay evidencia clínica o radiográfica de metástasis a distancia) cM0(i+): no hay evidencia clínica o radiográfica de metástasis a distancia, pero hay depósitos de células tumorales detectadas molecular o microscópicamente que no superan los 0,2mm en la sangre circulante, la médula ósea u otro 34 tejido ganglionar no regional en un paciente sin síntomas o signos de metástasis. M1 (si la enfermedad cM1 se confirma mediante biopsia, entonces se debe utilizar pM1). Metástasis detectables a distancia determinadas por medios clínicos y radiográficos clásicos y/o metástasis histológicamente comprobadas de más de 0,2mm. Tabla 4. TNM 8ª edición de American Joint Committe on Cancer (AJCC). TNM Grado RE RP HER2 Estadio TNM Tis N0 M0 Cualquier Cualquier Cualquier Cualquier 0 T1N0M0 T0N1miM0 T1N1mi M0 G1 Positivo Positivo Positivo IA Negativo IA Negativo Positivo IA Negativo IA Negativo Positivo Positivo IA Negativo IA Negativo Positivo I A Negativo IB T1N0M0 T0N1miM0 T1N1mi M0 G2 Positivo Positivo Positivo IA Negativo IA Negativo Positivo IA Negativo IA Negativo Positivo Positivo IA Negativo IA Negativo Positivo IA Negativo IB T1N0M0 T0N1miM0 T1N1miM0 G3 Positivo Positivo Positivo IA Negativo IA Negativo Positivo IA Negativo IA Negativo Positivo Positivo IA Negativo IB Negativo Positivo IB Negativo IB 35 TNM Grado RE RP HER2 Estadio TNM T0N1M0 T1N1M0 T2N0M0 G1 Positivo Positivo Positivo IB Negativo IIA Negativo Positivo IIA Negativo IIA Negativo Positivo Positivo IB Negativo IIA Negativo Positivo IIA Negativo IIA T0N1M0 T1N1M0 T2 N0 M0 G2 Positivo Positivo Positivo IB Negativo IIA Negativo Positivo IIA Negativo IIA Negativo Positivo Positivo IB Negativo IIA Negativo Positivo IIA Negativo IIB T0N1M0 T1N1M0 T2N0M0 G3 Positivo Positivo Positivo IB Negativo IIA Negativo Positivo IIA Negativo IIA Negativo Positivo Positivo IIA Negativo IIB Negativo Positivo IIB Negativo IIB T2N1M0 T3N0M0 G1 Positivo Positivo Positivo IB Negativo IIA Negativo Positivo IIA Negativo IIB Negativo Positivo Positivo IIA Negativo IIB Negativo Positivo IIB Negativo IIB T2N1M0 T3N0M0 G2 Positivo Positivo Positivo IB Negativo IIA 36 TNM Grado RE RP HER2 Estadio TNM Negativo Positivo IIA Negativo IIB Negativo Positivo Positivo IIA Negativo IIB Negativo Positivo IIB Negativo IIIB T2N1M0 T3N0M0 G3 Positivo Positivo Positivo IB Negativo IIB Negativo Positivo IIB Negativo IIB Negativo Positivo Positivo IIB Negativo IIIA Negativo Positivo IIIA Negativo IIIB T0N2M0 T1N2M0 T2N2M0 T3N1M0 T3N2M0 G1 Positivo Positivo Positivo IIA Negativo IIIA Negativo Positivo IIIA Negativo IIIA Negativo Positivo Positivo IIA Negativo IIIA Negativo Positivo IIIA Negativo IIIB T0N2M0 T1N2M0 T2N2M0 T3N1M0 T3N2M0 G2 Positivo Positivo Positivo IIA Negativo IIIA Negativo Positivo IIIA Negativo IIIA Negativo Positivo Positivo IIA Negativo IIIA Negativo Positivo IIIA Negativo IIIB T0N2M0 T1N2M0 T2N2M0 T3N1M0 T3N2M0 G3 Positivo Positivo Positivo IIB Negativo IIIA Negativo Positivo IIIA Negativo IIIA 37 TNM Grado RE RP HER2 Estadio TNM Negativo Positivo Positivo IIIA Negativo IIIB Negativo Positivo IIIB Negativo IIIC T4N0M0 T4N1M0 T4N2M0 Cualquier T N3 M0 G1 Positivo Positivo Positivo IIIA Negativo IIIB Negativo Positivo IIIB Negativo IIIB Negativo Positivo Positivo IIIB Negativo IIIB Negativo Positivo IIIB Negativo IIIC T4N0M0 T4N1M0 T4N2M0 Cualquier T N3 M0 G2 Positivo Positivo Positivo IIIA Negativo IIIB Negativo Positivo IIIB Negativo IIIB Negativo Positivo Positivo IIIB Negativo IIIB Negativo Positivo IIIB Negativo IIIC T4N0M0 T4N1M0 T4N2M0 Cualquier T N3 M0 G3 Positivo Positivo Positivo IIIB Negativo IIIB Negativo Positivo IIIB Negativo IIIB Negativo Positivo Positivo IIIB Negativo IIIC Negativo Positivo IIIC Negativo IIIC Cualquier T N M1 Cualquier Cualquier Cualquier Cualquier IV Tabla 5. Estadiaje 8 ª edición American Joint Committe on Cancer (AJCC). 38 1.3 Factores pronósticos y predictivos de cáncer de mama Un factor pronóstico es una medida de la evolución de la enfermedad de forma independiente al tratamiento mientras que el factor predictivo mide la probabilidad de respuesta a un tratamiento. En CM varios factores pueden ser tanto pronósticos como predictivos. Los factores pronósticos y predictivos pueden tener validez en la práctica clínica para ello deben tener validez analítica (precisos y reproducibles) validez clínica (permiten diferenciar grupos) y utilidad en la clínica (usarlo aporta beneficio clínico con respecto a no usarlo) (37). 1.3.1 Factores pronósticos Los factores pronósticos pueden ser clínicos, patológicos o moleculares /genómicos. En cuanto a los factores clínicos destacan la edad (tanto la edad más temprana como la más avanzada en el momento del diagnóstico se asocia con un peor pronóstico en términos SG y SLP), la raza (mujeres afroamericanas presentan mayor mortalidad por CM, el consumo de tabaco (fumar se relaciona con una mayor mortalidad por CM y dejar de fumar tras el diagnóstico puede mejorar el pronóstico de las pacientes) (38-40). Los factores patológicos pronósticos más relevantes son los siguientes: Tamaño del tumor (a mayor tamaño del tumor primario de la mama peor pronóstico, siendo esto un factor independiente de la afectación ganglionar) (41), afectación de ganglios locorregionales macrometástasica (la afectación ganglionar presentar peor pronóstico aun con tumores de pequeño tamaño) (42-43) y la afectación metastásica que también es factor de mal pronóstico (44). De forma global el estadiaje TNM también es un factor de pronóstico. En estadios precoces en la 8ª edición de TNM las tasas de supervivencia libre de enfermedad (SLE) a cinco años para la enfermedad en estadio I, 98 a 100 por ciento, en estadio II, del 85 al 98 por ciento y para la enfermedad en estadio III, aproximadamente del 70 al 95 por ciento (35,36). Receptores hormonales: la expresión de RE y RP generalmente se asocia con mejor pronóstico. La positividad o no para RP es un factor pronóstico independiente del RE ya que la ausencia de positividad de RP se asocia a un peor pronóstico de forma independiente (45). Sobreexpresión de HER2: es un marcador de mal pronóstico en cualquier estadio de la enfermedad. Dentro de la enfermedad HER2 se ha observado que la enfermedad con RRHH positivos se asociaba de forma estadísticamente significativa con un aumento aproximado del 40% de la SLE y la SG, en comparación con la enfermedad con RRHH negativos (46). 39 Otros factores patológicos son el grado histológico, que es un factor pronóstico independiente; la invasión vasculo-linfática, cuya presencia puede influir negativamente en el pronóstico del CM y su impacto exacto puede variar dependiendo de la presencia de otros indicadores pronósticos y la expresión de Ki-67, siendo un factor de mal pronóstico independiente cuando está elevada (47-49). Linfocitos infiltrantes de tumores (TILs) son un factor de pronóstico adverso para la supervivencia en el CM luminal y un factor de buen pronóstico en términos de supervivencia para tumores HER2 positivos y triples negativos (50). Con respecto a los factores moleculares sabemos que el pronóstico varía en función del tipo molecular de tal modo que dentro del CM luminal A es el subtipo más común y, en general, conlleva mejor pronóstico de todos los subtipos de CM mientras que los tumores basales like y HER2 enriched son de peor pronóstico (25). Figura 4. Supervivencia global y supervivencia libre de recaída para subtipos de tumores basados en expresión génica. Fuente: Sorlie T et al, 2001. Proc Natl Acad Sci U S A. Más recientes son las plataformas genómicas, las cuales surgieron a raíz de la aparición de perfiles de expresión génica permitiendo en pacientes intervenidas de CM identificar aquellos tumores que son de buen pronóstico y ayudando a tomar decisiones en base sobre su tratamiento adyuvante en el entorno de la enfermedad luminal. Existen varias plataformas validadas actualmente que tienen valor pronóstico. Las plataformas validadas actualmente son: Recurrence Score (RS) Oncotype DX®, EndoPredict®, Predictor Analysis of Microarray 50 (Prosigna™/PAM50), Breast Cancer Index (Índice de cáncer de mama o BCI) y Mammaprint® (51). En 2020 se publicaron primeros datos en relacion a una nueva plataforma pronóstica y predictiva en este caso dirigida a tumores HER2 positivo en estadio temprano. Se trata de la plataforma HER2DX la cual integra datos clínicos, como tamaño tumoral o afectación ganglionar, con datos genómicos como niveles de expresión de ARN de 27 genes relacionados con procesos biológicos de CM HER2 de 4 procesos biológicos. Estos procesos son: infiltración inmunitaria mediante 14 genes seleccionados que previamente han demostrado un fuerte valor pronóstico: CD27, CD79A, HLA-C, IGJ, 40 IGKC, IGL, IGLV3-25, IL2RG, CXCL8, LAX1, NTN3, PIM2, POU2AF1 y TNFRSF 17; proliferación de células tumorales a través de los genes: EXO1, ASPM, NEK2 y KIF23; diferenciación luminal con los genes: BCL2, DNAJC12, AGR3, AFF3 y ESR1 y expresión de HER2 mediante genes ubicados en cromosoma 17q11-12: ERBB2, GRB7, STARD3 y TCAP. A partir de ellos se genera un algoritmo que divide a las pacientes en grupos de bajo o alto riesgo (puntuación <50 y de ≥50 respectivamente), lo cual ha demostrado proporcionar información tanto en el pronóstico (supervivencia a largo plazo) de la paciente como en la sensibilidad al tratamiento quimioterápico y anti-HER2 neoadyuvante (probabilidad de alcanzar una respuesta completa patológica, RCp). Esta plataforma proporciona estimaciones del riesgo de recurrencia y de la probabilidad de lograr una RCp en este grupo de pacientes lo que puede ayudarnos a tomar decisiones en la práctica clínica para la desescalada/escalada de tratamientos en este grupo de pacientes (52). En la enfermedad metastásica son factores pronósticos las células tumorales circulantes (CTC), cuya presencia en la sangre periférica de mujeres con CM se ha asociado con un peor pronóstico (53) o el ADN tumoral circulante (ctDNA) ya que, niveles altos de ctDNA en pacientes con CM metastásico parece mostrar que tienen un aumento en el riesgo de muerte en comparación con los pacientes con niveles bajos (54). También la mutación en PIK3CA, mutado en el 20-40% del CM se considera un factor de pronóstico negativo independiente y se correlaciona con un peor pronóstico (p=0,007). Además, los pacientes con una mutación PIK3CA y sobreexpresión de HER2 tienen tasas más bajas de respuesta completa patológica (RCp) (55,56). 1.3.2 Factores predictivos Los factores predictivos pueden permitir la selección adecuada de pacientes para tratamientos específicos, evitando así el sobretratamiento en otros. Entre los factores predictivos en el CM se destacan los siguientes: • Positividad para el RE: Este es un factor predictivo tanto en enfermedad localizada como metastásica. Las mutaciones en ESR1 del receptor de estrógeno (RE), que pueden detectarse en el 30-50% de pacientes con progresión tras inhibidores de aromatasa, son un factor predictivo adverso para la respuesta a la terapia endocrina en el entorno metastásico (57,58). • Sobreexpresión de HER2: La sobreexpresión de HER2 es un factor predictivo de respuesta a tratamientos anti-HER2 tanto en tumores primarios como metastásicos (59-64). El subtipo intrínseco por sí solo no puede reemplazar la evaluación histopatológica convencional del estado de HER2, ya que muchos tumores clasificados como luminal A o luminal B se beneficiarán del trastuzumab adyuvante si hay sobreexpresión de HER2. Sin embargo, algunos estudios sugieren que, entre los tumores que sobreexpresan HER2, la evaluación del 41 subtipo intrínseco puede influir en el tratamiento, particularmente respecto a tratamientos diferentes para aquellos tumores intrínsecamente basales que sobreexpresan HER2 (65). • Plataforma Oncotype DX®: En tumores luminales, Oncotype DX® puede ayudar a determinar quién debe someterse a quimioterapia adyuvante tras la cirugía inicial, tanto en pacientes sin ganglios como en aquellos con ganglios positivos (66-68). • Plataforma Prosigna™: Hay datos preliminares en enfermedad HER2 que sugieren que Prosigna™ puede tener un papel predictivo para ciertos tipos de terapias anti-HER2 en el entorno metastásico. Un estudio retrospectivo mostró que pacientes con fenotipo luminal sin sobreexpresión de HER2, pero PAM50 HER2 enriched, tuvieron mayor SLP al añadir lapatinib al tratamiento hormonal. • Plataforma HER2DX: HER2DX tiene valor predictivo de respuesta a tratamiento quimioterápico y dirigido a HER2 en el entorno precoz (52). • TILs: Estudios observacionales indican que una mayor cantidad de TILs se asocia con una mayor posibilidad RCp tras tratamiento neoadyuvante en CM HER2 y triple negativo (69). • Expresión del Ligando 1 de Muerte Celular Programada (PD-L1): La expresión de PD-L1 puede predecir el beneficio de añadir pembrolizumab a la quimioterapia en CM triple negativo metastásico (70). • Mutaciones en PIK3CA: Se ha demostrado un beneficio en SLP al añadir alpelisib, un inhibidor alfa específico de PIK3CA, al fulvestrant en CMM RRHH positivos HER2 negativos. Sin embargo, en HER2 sobreexpresado, la presencia de una mutación en PIK3CA no niega el efecto beneficioso de las terapias dirigidas a HER2, ya que no hay diferencias en el resultado a largo plazo, en la SLE ni en la supervivencia global (SG) (55, 56, 71, 72). • Mutación en BRCA de Línea Germinal: Los pacientes con mutación germinal en BRCA pueden beneficiarse, en el entorno metastásico y adyuvante de tumores no HER2, de los inhibidores orales de la ADP-ribosa polimerasa (iPARP) (73-75). 1.4 Cáncer de mama precoz La mayoría de los pacientes con CM en países desarrollados se diagnostican en estadios iniciales de la enfermedad, es decir, solo el 5% de los pacientes tendrán al diagnóstico enfermedad metastásica (estadio IV). Podemos dividir a esta mayor parte de los pacientes en pacientes con CM precoz (estarían incluidas las pacientes con estadio I, IIA, o algunos pacientes con estadio IIB, T2 N1) y CM en localmente avanzado (algunos pacientes con estadio IIB, T3 N0 y pacientes con estadio IIIA-IIIC). El abordaje de estas pacientes debe llevarse a cabo en centros especializados (con la posibilidad de derivar a las pacientes a cirugía plástica, psicólogos, fisioterapeutas y 48 ¹ Hormonoterapia 5 años mínimo y si alto riesgo valorar de 7-10 años. Premenopáusicas: tamoxifeno. Si alto riesgo análogos LHRH (Hormona liberadora de hormona luteinizante) + tamoxifeno o IA. Postmenopáusicas: IA o secuenciación con tamoxifeno seguido de IA; Considerar bifosfonatos si castración en premenopáusicas o en postmenopáusicas ² Tratamiento quimioterápico para luminal A/ B: antraciclinas y taxanos / Si Docetaxel y ciclofosfamida si baja carga tumoral pN0-1) ³ Agregar en tumores luminales inhibidor de ciclina (abemaciclib si N2 o N1 con T>5 cm y/o G3; Agregar olaparib si mutación germinal en BCRA y criterios de riesgo Olympia para luminales. ⁴ Tratamiento quimioterápico para triple negativo (QT neoadyuvante en triple negativo: carboplatino + taxanos + antraciclinas + pembrolizumab (si más de 2 cm se añade inmunoterapia con pembrolizumab) / QT adyuvante+ taxanos +/-carboplatino + antraciclinas. ⁵ Tratamiento para HER2 positivo taxanos +pertuzumab +trastuzumab + antraciclinas o taxanos+ carboplatino+ pertuzumab + trastuzumab. ⁶ Tratamiento con paclitaxel x 12 semanas + trastuzumab. Figura 6. Algoritmo de tratamiento de cáncer de mama precoz. Fuente: ESMO guidelines. Cardoso F. et al. 2019. 1.4.3.2 Tratamiento adyuvante en cáncer de mama Terapia adyuvante sistémica: Tiene como objetivo disminuir el riesgo de recaída de la enfermedad ya sea a nivel local o a distancia y con ello aumentar SLE y SG (100). Para la elección del mejor tratamiento adyuvante nos basamos en las características de cada paciente junto con estimaciones del riesgo de recaída de la enfermedad en base a los factores clásicos (tumor, TNM, grado o fenotipo) y más recientemente en base a las plataformas genómicas (66-68, 101,102) o calculadores de riesgo beneficio (como PREDICT Plus o Adjuvant) que pueden ayudarnos a valorar el riesgo de recurrencia y el beneficio potencial de los tratamientos sistémico (103-104). 49 Los tratamientos adyuvantes pueden ser quimioterápico, endocrino o tratamientos dirigidos. Quimioterapia En la evolución del tratamiento quimioterápico del CM adyuvante se han pasado de las monoterapias iniciales a las poliquimioterapias. Los regímenes de primera generación (CMFx6, ACx4 o FEC50x6) demostraron una reducción de la mortalidad por CM comparada con no realizar terapia adyuvante de hasta el 35%, los de segunda generación (FEC100x6, CAF/FACx6, ACx4-Tx4 o TCx4, ECx4-CMFx4) redujeron hasta el 20% la mortalidad comparados con los de primera incorporando las antraciclinas y taxanos como fármacos clave en el tratamiento adyuvante del CM, y otro 20% añadieron los de 3 generación con respecto a la segunda (FECx4-Tx3 FECx4-wPx8, ddACx4-Tx4, ACx4wP,ACx4-docetaxel). Actualmente se considera el 5-fluorouracilo (5-FU) puede eliminarse de los regímenes basados en antraciclinas porque no agrega eficacia y aumenta la toxicidad. Los regímenes basados en taxanos que no contienen antraciclinas, como 4 ciclos de docetaxel y ciclofosfamida (TC), se pueden usar como una alternativa a los 4 ciclos de quimioterapia a base de antraciclinas en casos en que estas últimas no puedan utilizarse. La supresión ovárica se planteará como protección de la función ovárica en pacientes con deseos genésicos que van a recibir quimioterapia. Se puede plantear también esquemas con dosis densas en tumores de alto riesgo (105-107). Terapia endocrina Además de la quimioterapia adyuvante cuyo tratamiento dependerá del riesgo de recaída del individuo, todos los pacientes que tengan RE y/o RP positivos independientemente de la expresión de HER2 son candidatos a tratamiento endocrino adyuvante. En mujeres premenopáusicas de bajo riesgo el tamoxifeno durante 5 años es el tratamiento endocrino adyuvante más ampliamente establecido. Se puede considerar administrar tamoxifeno hasta los 10 años en tumores de alto riesgo, a expensas de mayor toxicidad. Otra maniobra hormonal aceptada en mujeres premenopáusicas es la supresión ovárica (con análogos de LHRH). Los estudios TEXT y SOFT han sido claves para evaluar esta estrategia. Se aconseja la supresión ovárica en pacientes que requieran quimioterapia y que recuperen la menstruación (en particular en el primer año, pero aceptable en los 2 primeros años). Así mismo puede sustituirse el tamoxifeno por un IA en las pacientes de alto riesgo junto con supresión ovárica, sin embargo, el papel de la supresión ovárica en pacientes <35 años que no requieren quimioterapia no está claro. Para pacientes que durante los primeros 2 a 5 años de tamoxifeno pasan a ser menopáusicas se debe considerar un cambio a un inhibidor de la aromatasa (IA) y en 50 aquellas pacientes de alto riesgo (N positivos o T3-T4) se puede plantear hormonoterapia extendida más allá de los 5 años. En mujeres postmenopáusicas se ha comprobado que los IA de tercera generación (letrozol, anastrozol o exemestano) tienen una eficacia superior al tamoxifeno, tal y como se concluye de los datos de un metaanálisis publicado en 2015 en el que se usaron datos de 31290 pacientes de 9 estudios (108-110). A la hora de establecer un tratamiento hormonal extendido más de 5 años hay que tener en cuenta dos escenarios; por un lado, pacientes que hayan recibido tamoxifeno inicial, en los estudios ATLAS y aTTom se concluyó que continuar con tamoxifeno hasta los 10 años reduce el riesgo de recidiva y mortalidad por CM con un beneficio absoluto en torno a 2.8%. Además, en el estudio MA 17 se comprobó un beneficio de cambiar a letrozol y continuar durante 5 años más con una mejoría en la SLE y SG. Por otro lado, en las pacientes que han recibido un IA durante 5 años, continuar con un IA durante 5 años más no ha demostrado un beneficio concluyente en los estudios NSABP-B42 e IDEAL (108-110). En los pacientes varones, el tamoxifeno es la terapia estándar. No deben usarse IA solos; en caso de ser necesarios, deben usarse con un análogo de LHRH (111). En los últimos años se han realizado varios estudios en adyuvancia con inhibidores de ciclinas CDK4/6 (palbociclib, ribociclib y abemaciclib) junto con tratamiento endocrino en pacientes de alto riesgo de recaída tras tratamiento con quimioterapia. En la actualidad solo está indicado, en este sentido, abemaciclib durante dos años junto con IA (más análogo de LHRH en varones o mujeres premenopáusicas) en pacientes de alto riesgo definidas como: tumores ≥ 4, ganglios positivos o con 1-3 ganglios y tamaño del tumor > 5 cm o grado histológico 3 (112). En los pacientes con CM luminal intervenidos, la elección de recibir quimioterapia o no quimioterapia viene determinada por el riesgo clínico y genómico de las pacientes. Así, podemos establecer que las pacientes candidatas a quimioterapia son aquellas con tumores T3-4 ycon compromiso axilar N2-3. Otros factores como Ki 67 alto, bajo nivel de RRHH o estado menopáusico también hay que tenerlos en cuenta, así como la puntuación genómica determinada por las diferentes plataformas de riesgo genómico. Para tumores de bajo riesgo (pT1a o b, ganglio negativo, grado bajo, RE alto) no están indicadas las plataformas genónimas, ya que serán candidatas para recibir tratamiento hormonal y para pacientes premenopáusicas con ganglios metastásicos o postmenopáusicas con > 3 ganglios metastásicos tampoco, ya que serán candidatas a recibir quimioterapia. Para pacientes premenopáusicas, así como para postmenopáusicas con afectación de 1 a 3 ganglios se recomienda la plataforma Oncotype Dx, por los resultados obtenidos en el el estudio TailorX y Rxsponder, respectivamente. Las plataformas Oncotype DX, 51 MammaPrint, EndoPredict o Prosigna pueden realizarse en el caso de pacientes posmenopáusicas sin afectación ganglionar (5, 10, 16, 63-65, 99,101). Terapia dirigida En tumores HER2 positivos, el tratamiento con trastuzumab adyuvante añadido a la quimioterapia (antraciclinas y taxanos) ha demostrado reducir aproximadamente a la mitad el riesgo de recurrencia y mortalidad, en comparación con quimioterapia solo, lo que se traduce en una mejora absoluta del 10 % en la SLE y un aumento del 9 % en la SG a 10 años. Esto se demostró por vez primera en 5 ensayos clínicos aleatorizados (HERA, BCIRG 006, FinHer, NSABP B-31, NCCTG N9831). En base a lo previo se recomienda trastuzumab adyuvante en todos los tumores con un tamaño tumoral > 1 cm independientemente del estado ganglionar (113,114). Un esquema de uso actual en adyuvancia de tumores HER2 positivos es el tratamiento con paclitaxel semanal durante 12 semanas y trastuzumab durante 1 año. El uso de este tratamiento tiene como base los datos publicados por Tolaney S. et al. que incluía tumores de máximo 3 cm y N0. La SLEi a los 3 años fue de 98.7% con toxicidad aceptable por lo que dicho esquema se considera en la adyuvancia de pacientes con CM precoz de bajo riesgo (T< 2cm sin afectación ganglionar) (115). En el entorno adyuvante a partir de ensayo Aphinity la adición de pertuzumab al trastuzumab con quimioterapia resultó en un beneficio del 0,9 % en la SLE invasiva (SLEi) en la población por intención de tratar y un mayor beneficio (2,5%) en la población de alto riesgo (definida como N-positiva o ER-negativa), por lo que es una opción en pacientes de alto riesgo (aunque está aprobada por Agencia Europea del Medicamento (EMA) pero no está disponible en España) (116). Además, un año de neratinib adyuvante tras finalizar el tratamiento anti HER2 mejora la SLEi en pacientes con CM HER2 positivo siendo el beneficio mayor en pacientes con enfermedad con RRHH positivos por lo que la EMA ha dado su indicación en este grupo de pacientes, sin embargo, en España se restringe a aquellos que no hayan podido completar la adyuvancia (117) En el sentido de escalada - desescalada de tratamiento en este grupo de pacientes puede ser útil la plataforma HER2DX. (52). El tiempo de duración del tratamiento con trastuzumab es de 1 año y aunque en varios ensayos ha intentado probarse el beneficio de tratamiento extendido o menos tiempo de tratamiento solo ha podido demostrarse la no inferioridad (118,119). En tumores con mutación en BRCA1 o BRCA2 a partir de los datos del ensayo Olympia se demostró que olaparib adyuvante durante 1 año mejora SG y SLE en pacientes con CM triple negativo o luminales de alto riesgo incluyéndose también pacientes que hayan recibido tratamiento neoadyuvante sin RCp con características de alto riesgo (120,121).0 52 1.4.3.3 Tratamiento neoadyuvante en cáncer de mama. El tratamiento neoadyuvante en CM se refiere a la administración de terapias sistémicas antes de la cirugía principal para el tumor. El origen del tratamiento neoadyuvante se remonta a los años 1970-1980 con la intención de convertir tumores inoperables en operables y en los estudios realizados en dicha época se comprobó que este tratamiento mejoraba la tasa de cirugías conservadoras sin perjudicar en la supervivencia de las pacientes con respecto al tratamiento adyuvante (122). Varios estudios han demostrado que en términos de supervivencia el tratamiento neoadyuvante fue similar al tratamiento adyuvante como los estudios NSABP-B18 o B27(123). El metaanálisis del EBCTCG estudió a 4.500 pacientes incluidas en 10 ensayos clínicos. El seguimiento a largo plazo de estas pacientes se confirma que no hay diferencias significativas en cuanto a recaídas a distancia, mortalidad por CM o por cualquier causa entre ambas modalidades de tratamiento (124). Con la evolución de los años se comprobó que los pacientes que recibían tratamiento neoadyuvante tenían mejores resultados a largo plazo hasta instaurarse en las guías clínicas en el manejo de CM temprano (5,10,16). Podemos definir los siguientes objetivos de la terapia neoadyuvante en CM (122-124): -Reducir la extensión de la enfermedad en la mama y/o los ganglios linfáticos regionales (estadio) permitiendo así una cirugía más conservadora tanto en la mama como a nivel axilar y con ello mejorar los resultados estéticos y reducir complicaciones como linfedema. También permite hacer una cirugía planificada adecuadamente incluso con más datos disponibles como los resultados de pruebas genéticas que pueden influir en decisiones sobre la reconstrucción posterior, por ejemplo. -Información sobre la eficacia del tratamiento (test in vivo de la sensibilidad al mismo) de forma temprana y, en función de la respuesta al tratamiento, se puede también personalizar el tratamiento adyuvante posterior. - Tratar la enfermedad micrometastásica reduciendo así el riesgo de recurrencias a largo plazo. - Alcanzar, si es posible, una RCp ya que esto se ha asociado a una mayor supervivencia. Las pacientes con una RCp pueden tener una reducción del riesgo de recurrencia de hasta de un 56% y del riesgo de muerte en un 41% en comparación con quien no la alcanza. - Respuesta completa patológica La definición de RCp indica la ausencia de enfermedad invasiva residual en la mama y la ausencia de enfermedad medible en cualquiera de los ganglios axilares muestreados (ypT0/is ypN0) (125). Una vez recibido el tratamiento neoadyuvante, tras la cirugía se realiza una evaluación patológica de la mama y los ganglios axilares para determinar la presencia y el alcance 53 de la enfermedad invasiva residual después de completar el tratamiento neoadyuvante. Esta evaluación implica por un lado un examen macroscópico de la pieza quirúrgica para identificar áreas de posible tumor residual y por otro un examen microscópico en el que se tiñen las muestras y se observa al microscopio la presencia de tumor invasivo. Existen diferentes sistemas de clasificación de RCp (126): -Sistema de clasificación de Miller-Payne: basado en una comparación directa de las muestras de biopsia previas al tratamiento y las muestras quirúrgicas post-tratamiento. Se divide en cinco grados, desde ninguna reducción en el tamaño del tumor (Grado 1) hasta la ausencia total de células tumorales (Grado 5) (127). -Sistema de clasificación Residual Cancer Burden (RCB): combina el tamaño del tumor residual, la proporción de tejido tumoral que es estroma reactivo y la afectación de los ganglios linfáticos para clasificar a los pacientes en RCB-0 (pCR), RCB-I (enfermedad residual mínima), RCB-II (enfermedad residual moderada) o RCB-III (enfermedad residual extensa) (128). En un estudio con 5161 pacientes de 2021 se ha demostrado que la carga tumoral residual (RCB) predice la supervivencia libre de eventos en todos los pacientes y también por subtipos tumorales. En estudios previos se habían encontrado pocas diferencias en el pronóstico entre los pacientes que lograron pCR y aquellos con enfermedad residual mínima (RCB-I) pero en este estudio hubo diferencia entre estos grupos, excepto entre pacientes con RRHH positivos/HER2 negativos (129). En general para los pacientes que no alcanzan RCp no se realizan de nuevo marcadores IHQ como RRHH y HER2 ya que, a pesar de que hay datos que muestran discordancia en los RRHH y HER2 de la biopsia tumoral inicial y el tejido quirúrgico, no se sabe si se trata de un efecto de muestreo o de una modulación de la expresión como resultado directo del tratamiento neoadyuvante y no hay evidencia de que las decisiones de tratamiento adyuvante (postoperatorio) deban estar influenciadas por el estado de los receptores después de la terapia neoadyuvante. Los análisis GBG y AGO-B demuestran que cuanto más restrictiva es la definición de RCp mejor discrimina entre los pacientes de pronóstico favorable y desfavorable (130,131). En el metaanálisis CTNeoBC de Cortázar et al. se incluyeron un total de 11.955 pacientes y se evidenció que alcanzar la RCp en la mama y la axila (ypT0 ypN0 o ypT0/is ypN0) se relaciona con una mejor SG en comparación con una RCp en la mama sola. Además, la RCp puede variar según los subtipos, siendo en los pacientes con tumores HER2-positivo o triple negativo donde se alcanzaban unas tasas más altas de RCp. Cuando se logró una RCp, el riesgo de muerte se redujo en un 84 % para TNBC, 92 % para CM HER2 positivo/receptor de hormonas negativo tratado con trastuzumab y 71 % para CM grado 3 con receptor de hormonas positivo/HER2 negativo (132). Dentro de las pacientes HER2 positivo de manera independientemente del régimen, las pacientes con tumores RRHH negativos alcanzan mayor porcentaje de respuestas completas patológicas que aquellas con RRHH positivos como se observó en el estudio NeoSPhere (133). 54 Figura 7. Tasa de respuesta completa patológica tras tratamiento neoadyuvante en función del subtipo tumoral. Fuente: Cortázar et al. 2014. - Indicaciones del tratamiento neoadyuvante El tratamiento neoadyuvante en el CM debe ser individualizado, tomando en cuenta el subtipo del tumor, el tamaño, la afectación nodal y otros factores clínicos y patológicos y debería tomarse la decisión dentro de un comité multidisciplinar. Durante el tratamiento neoadyuvante se recomienda evaluar la respuesta tumoral de forma clínica y en caso de sospecharse progresión de la enfermedad debe recurrirse a un estudio de imagen. Una vez finalizado el tratamiento se debe hacer también un control radiológico de cara a plantear la intervención quirúrgica de manera óptima en el plazo de 3-6 semanas tras finalizarlo (5,10). En términos generales las indicaciones de tratamiento neoadyuvante serían (5,10): - Pacientes con tumores localmente avanzados o inoperables (incluye tumores T3-4 cualquier N, N2-3 cualquier T y carcinomas inflamatorios). - Pacientes con tumores operables con un subtipo asociado a alta probabilidad de respuesta al tratamiento con quimioterapia preoperatoria (triple negativo, HER2, alto grado de proliferación). - Pacientes con contraindicaciones temporales para la cirugía en el momento del diagnóstico que puedan resolverse posteriormente y permitan el abordaje local como, por ejemplo, en el embarazo. - Pacientes con tumores operables en las que no es posible de entrada tratamiento conservador o con márgenes libres por la relación entre el tamaño del tumor y la mama. De especial interés a valorar en comité de tumores son los tumores con extenso componente in situ, cuando la extensión del componente invasivo no está bien definida o el tumor es multicéntrico /multifocal. La terapia hormonal neoadyuvante solo debe valorarse en casos individualizados inicialmente para pacientes no candidatas a 55 quimioterapia o ancianas, siendo actualmente un tratamiento dentro de múltiples ensayos clínicos, ya sea solo o con inhibidores de ciclinas. - Tratamiento neoadyuvante en tumores HER2 positivo Los regímenes farmacológicos utilizados en el entorno preoperatorio son similares a los que se pautan en el entorno adyuvante para cada subtipo tumoral. Actualmente el esquema general se basa en quimioterapia junto con trastuzumab y pertuzumab. El primer estudio que demostró beneficio de añadir tratamiento antiHER2 en neoadyuvancia a la quimioterapia fue de la mano de Buzdar et al. que demostraron una mejoría significativa en el porcentaje de RCp asociando al tratamiento Trastuzumab (65.2% vs 26.3) (134). En el estudio NOAH se mostró un incremento en RCp de 19 a 38% y esta mejora en la RCp se tradujo en un beneficio en la SLE para estas pacientes (135). El uso de pertuzumab en neoadyuvancia se sustentó inicialmente en dos ensayos clínicos fase II, con un número limitado de pacientes NeosPhere (133) y Tryphaena (136). Sólo NeosPhere incluyó un brazo comparativo que permitía conocer la aportación en resultados de eficacia de la adición de pertuzumab en este contexto terapéutico. El estudio Tryphaena incluyó pertuzumab en los tres brazos de tratamiento, por lo que no pudo orientarnos en el conocimiento de la eficacia añadida con el uso de pertuzumab. El estudio Neosphere se diseñó para encontrar la diferencia en respuesta patológica completa (RPc) entre los grupos de tratamiento. El uso de pertuzumab asociado a trastuzumab y docetaxel incrementó la tasa de RCp un 17% (IC95%, 4% a 29%), o lo que es lo mismo, la ganancia de una RCp por cada 6 pacientes tratados con la adición de pertuzumab. Este resultado fue mejor en el subgrupo de pacientes con RRHH negativos. En estas pacientes la diferencia en la tasa de respuesta entre los grupos se incrementó hasta un 24-26%. La tasa de RCp fue del 29% en el grupo de tratamiento con docetaxel más trastuzumab y del 46% en el grupo de pertuzumab trastuzumab y docetaxel. Sin embargo, en el análisis a 5 años del seguimiento de NeosPhere no encontró diferencia en ningún resultado de supervivencia, ni libre de progresión, ni SG. La proporción de pacientes supervivientes a los 5 años es del 86% con el uso de pertuzumab y del 81% sin éste (133, 136). También encontramos estudios con lapatinib en el entorno de la neoadyuvancia, en el ensayo clínico NeoALTTO se administraron 6 semanas de tratamiento antiHER2 (trastuzumab, lapatinib o trastuzumab más lapatinib) seguidos de 12 semanas de la mima terapia frente a HER2 combinada con paclitaxel. El brazo que incluyó tratamiento combinado con trastuzumab y lapatinib se asoció a mayor porcentaje de respuestas completas patológicas que los otros dos tratamientos (137). Sin embargo, otros estudios posteriores (NSABP B-41) no han podido confirmar el beneficio de lapatinib y por este motivo no está indicado en el tratamiento del CM precoz HER2 positivo (138). El estudio KRISTINE en el que pacientes con CM precoz fueron randomizadas a recibir pertuzumab 56 + trastuzumab + carboplatino + docetaxel versus T-DM1 + pertuzumab, siendo el porcentaje de respuestas completas patológicas inferior en el grupo de T-DM1 (139). Recientemente se investiga también la desescalada de en CM HER2 positivo dada las importantes tasas de curación debido, en parte, a la mejora de las terapias dirigidas frente a HER2. Un ejemplo de ello es el estudio PHERGain 1, en el que los participantes del estudio recibieron trastuzumab y pertuzumab sin quimioterapia evaluando la respuesta mediante PET-TC después de dos ciclos de tratamiento. En caso de RC metabólica continuaban tratamiento sin quimioterapia. Los resultados preliminares del PHERGain 1 son prometedores, mostrando que una proporción significativa de pacientes alcanzó una RCp solo con terapia dirigida. Estos resultados sugieren que es posible reducir el uso de quimioterapia en ciertos subgrupos de pacientes con CM HER2 positivo, manteniendo altas tasas de respuesta y potencialmente mejorando la supervivencia con calidad de vida (140). Otro ejemplo de ello son los ensayos clínicos en marcha con el fármaco trastuzumab deruxtecan (un anticuerpo conjugado dirigido a HER2) con datos prometedores en el entorno neoadyuvante como por ejemplo el estudio SHAMROCK (141). - Adyuvancia tras neoadyuvancia Tras el tratamiento neoadyuvante la caracterización más en profundidad de la enfermedad residual y del microambiente tumoral acompañante puede ser clave en la identificación de biomarcadores que orienten la toma de decisiones sobre potenciales terapias posteriores. Actualmente los tratamientos a destacar tras el tratamiento neoadyuvante en la enfermedad HER2 dependen del grado de RCp. En pacientes que han alcanzado la RCp después del tratamiento neoadyuvante, el tratamiento adyuvante suele ser trastuzumab solo o en combinación con pertuzumab, completando un año de terapia. La evidencia de ensayos clínicos, como el estudio Aphinity, ha mostrado beneficios en términos de SLE con la adición de pertuzumab en ciertos subgrupos de pacientes, aunque el beneficio es más pronunciado en aquellos con enfermedad nodal positiva al inicio del tratamiento (142). Respecto a las pacientes que no han alcanzado RCp, en el ensayo clínico KATHERINE se incluyeron pacientes HER2 positivo y enfermedad residual invasiva en mama o axila tras haber recibido un tratamiento neoadyuvante que incluía taxanos (con o sin antraciclinas) y trastuzumab. Las pacientes fueron randomizadas a recibir 14 ciclos de trastuzumab o T-DM1 adyuvante. La SLEi a 3 años fue significativamente mejor en las pacientes tratadas con T-DM1 que en aquellas que recibieron trastuzumab (88.3% vs 77.0%; HR 0.5, p < 0.001) (143). Continuar con trastuzumab y pertuzumab puede ser una opción para pacientes que no han recibido pertuzumab como parte de su terapia neoadyuvante, basándose en evidencia de beneficio en ciertos subgrupos de pacientes como enfermedad ganglionar al inicio o gran carga tumoral residual (136, 139). 57 1.5 Biomarcadores moleculares de RCp en cáncer de mama. Además de los marcadores inmunohistoquímicos /subtipos tumorales cuya expresión en el tumor puede predecir una mayor o menor respuesta al tratamiento neoadyuvante en CM, el interés que despierta este escenario ha llevado a la búsqueda de otros biomarcadores moleculares que nos ayuden a saber que pacientes o tumores presentaran una mejor respuesta al tratamiento neoadyuvante en CM. Si bien hay que tener en cuenta que el CM es heterogéneo y, por lo tanto, la presencia o ausencia de una alteración genética particular puede no ser causa única de la mejor o peor respuesta a un tratamiento concreto. Determinadas alteraciones en genes como BRCA1 y BRCA2 en CM han mostrado una mayor tasa de pCR después de la quimioterapia neoadyuvante cuando se incluyen agentes basados en platino (144). También se ha demostrado que las pacientes con sobreexpresión o amplificación de otro gen, el TOP2A, que codifica una enzima fundamental para el ADN y cuya función es inhibida por antraciclinas provocando rotura en ADN presentan una mejor respuesta a antraciclinas alcanzando una mayor tasa de RCp (145). Asímismo hay datos publicados que muestran que mutaciones en TP53 (el cual promueve apoptosis en caso de daño de ADN) pueden predecir mayor agresividad de tumor y algunas mutaciones también se han relacionado con mayores tasas de RCp (146). Otros genes más desconocidos también han sido estudiados en este sentido como son SLFN11 (Schlafen 11) que se ha relacionado con la sensibilidad a los agentes de platino en el CM y otros con mayores tasas de respuesta en el contexto neoadyuvante, las variantes genéticas en GSTP1 que codifica enzima glutatión S-transferasa pi 1 (involucrada en la detoxificación celular) que pueden influir en la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante o BAG1, co-chaperona que interactúa con el receptor de estrógeno y podría estar relacionada con la resistencia al tratamiento neoadyuvante en CM (147-149). Algunos microARNs y ARNs largos no codificantes (lncRNAs) también han sido investigados como posibles marcadores predictivos de respuesta a la terapia neoadyuvante. Por ejemplo, el microARN como miR-2 y miR-21, cuya sobreexpresión antes del tratamiento neoadyuvante se ha relacionado con menos probabilidad de alcanzar RCp. También altos niveles de miR-210 (relacionado con hipoxia tumoral) han sido asociados con una mejor respuesta a la quimioterapia neoadyuvante en algunos estudios, posiblemente debido a su relación con la hipoxia tumoral. Otro microARN, miR200c se ha postulado como predictor de respuesta al tratamiento neoadyuvante en CM triple negativo (150). También hay publicados datos de la relación entre lncRNAs con la respuesta al tratamiento neoadyuvante en CM. Por ejemplo, niveles altos del lncRNA HOTAIR antes del tratamiento se han asociado con una menor probabilidad de RCp. Valores altos de 64 (lncARN), en un experimento de tres días de duración. Esta técnica facilitó la identificación de biomarcadores a partir de más de 540.000 transcripciones de bases de datos públicas, permitiendo la detección confiable de genes, exones y eventos de splicing alternativo que resultan en isoformas de ARN codificante y lncARN. Los datos se analizaron con software diseñado para visualizar los patrones de expresión global de genes, exones, vías y eventos de splicing alternativo. Las muestras de la cohorte 1 se etiquetaron y se hibridaron empleando el microarray Clariom D pico Array (Affymetrix, Santa Clara CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se partió de 30 ng de ARN para sintetizar el ADN de doble hebra (cDNA) y el ARN complementario (cRNA), procediendo posteriormente a la hibridación del ADN biotinilado. Este proceso se ilustra en la figura 9. Figura 9. Proceso de Hibridación. Fuente: protocolo de Microarray Clariom D pico Array (Affimetrix) Inicialmente, se llevó a cabo la síntesis de la primera cadena de ADNc mediante un procedimiento de transcripción inversa, donde el ARN total se cebó con cebadores que contenían una secuencia del promotor T7, sintetizando ADNc monocatenario con la secuencia del promotor T7 en el extremo 5'. Posteriormente, se preparó para la síntesis de ADNc bicatenario añadiendo el adaptador 3' al ADNc monocatenario, que sirvió como plantilla para la síntesis en una reacción de amplificación previa a la transcripción in vitro, utilizando ADN polimerasa y RNasa H para degradar el ARN y sintetizar simultáneamente el ADNc monocatenario con el adaptador 3'. 65 Se procedió a la síntesis de ADNc de doble cadena, convirtiendo el ADNc monocatenario en bicatenario, que actuó como plantilla para la transcripción in vitro con la Taq ADN Polimerasa y cebadores específicos. Posteriormente, se sintetizó ARNc por transcripción in vitro del ADNc de doble cadena usando la ARN polimerasa T7, amplificando el ARN antisentido (ARN complementario o ARNc). El ARNc se purificó para eliminar enzimas, sales, fosfatos inorgánicos y nucleótidos no incorporados, preparándolo para la síntesis de ADNc monocatenario de segundo ciclo mediante la transcripción inversa del ARNc, utilizando cebadores de 2º ciclo. Este ADNc de la hebra sentido contenía dUTP en una proporción fija en relación con el dTTP. Posteriormente, el ARN se hidrolizó con RNasa H, dejando un ADNc monocatenario que se purificó para eliminar enzimas, sales y dNTPs no incorporados. El último paso antes de la hibridación implicó la fragmentación y etiquetado del ADNc monocatenario purificado, fragmentándolo con uracilo-ADN glicosilasa (UDG) y endonucleasa apurínica/apirimidínica 1 (APE 1) en los residuos de dUTP no naturales y marcándolo con la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) mediante la utilización de un reactivo de etiquetado de ADN unido covalentemente a la biotina. La hibridación y análisis se realizaron mediante el TAC control: el cDNA biotinilado se hibridó durante 16 horas en un horno de hibridación Affymetrix GeneChip 645 a 45°C. Las matrices se tiñeron utilizando GeneChip Fluidics Station 450 y el chip se escaneó con el escáner GeneChip™ 3000. Los archivos. CEL de Affymetrix Clariom D con datos de intensidad se normalizaron para producir valores de expresión de señal a nivel de sonda y, mediante el software del Transcriptome Analysis Console se analizó el patrón de expresión de genes, exones, variantes de splicing y vías metabólicas relacionadas. Se establecieron filtros para identificar transcritos con expresión diferencial entre respondedoras y no respondedoras a tratamiento neoadyuvante, considerando un logaritmo del cambio de expresión (fold change) mayor a 1.5 o menor a -1.5 y un p-valor menor de 0.05. 4.6 Identificación de transcritos candidatos a ser biomarcadores Se identificaron los transcritos candidatos a ser biomarcadores dentro de aquellos que cumplieron con los filtros previamente establecidos y se seleccionaron aquellos transcritos codificantes para realizar posteriormente un análisis de enriquecimiento sobre las funciones biológicas, las vías de señalización y otros aspectos relevantes. Para ello se utilizó en este caso la herramienta DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery), la cual a partir de la lista de genes permitió analizar los resultados de estudios de expresión génica, como los obtenidos mediante microarray o Secuenciación de Nueva Generación (NGS), facilitando el análisis de enriquecimiento funcional que ayuda a identificar qué funciones biológicas o vías están representadas en 66 un conjunto de genes. Para llevar a cabo este análisis en primer lugar se accedió a la página web de DAVID (david.ncifcrf.gov) y se introdujo la lista de genes seleccionada mediante la simbología oficial y estableciendo la especie Homo sapiens previamente. Una vez cargada la lista de genes se realizó el análisis a través de la base de datos KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), la cual integra información genómica, química y de sistemas biológicos. Las vías de KEGG son mapas de rutas metabólicas y de señalización celular que representan conocimientos actuales sobre la biología molecular. Los resultados obtenidos se presentaron en tablas que muestran los términos de función biológica, vías o dominios que estaban estadísticamente enriquecidos en la lista de genes. Se estableció como filtro un FDR (False Discovery Rate) 0.05 y un p-valor <0.05. Finalmente, para los genes seleccionados en el análisis de enriquecimiento funcional, se llevó a cabo una revisión bibliográfica en la base de datos científica PubMed. Esto se realizó con el fin de actualizar y profundizar en el conocimiento sobre el estado actual de las investigaciones publicadas relacionadas con el CM. 4.7 Análisis de expresión de genes seleccionados mediante qRTPCR en una cohorte independiente Se normalizó la muestra antes de iniciar el proceso de retrotranscripción en la cohorte 2 de pacientes, ajustando la concentración a un nivel deseado mediante la dilución o concentración de la muestra con agua destilada para homogeneizar la concentración de ARN en todas las muestras partiendo de un volumen inicial de 10 μL para alcanzar 10 mL finales. El análisis de expresión se realizó en tres pasos: 1. Retrotranscripción: Se utilizó el kit High capacity cDNA reverse transcription de Applied Biosystems, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se preparó una mezcla denominada Mix RT para cada muestra, conteniendo 10 μL en total con componentes específicos. Esta mezcla se reservó en hielo mientras se preparaba. Se añadieron 10 μL de Mix RT en cada pocillo de una placa de reacción de 96 pocillos o tubo individual, junto con 10 μL del volumen de cada muestra normalizada, mezclando adecuadamente. La placa se selló, se centrifugó para eliminar burbujas de aire y se colocó en hielo antes de cargarla en el termociclador para incubación bajo condiciones específicas. 2. Preamplificación del cDNA: Se empleó TaqMan PreAmp Master Mix de Applied Biosystems, mezclando 12.5 μL de la muestra de cDNA con 50 μL de la solución TaqMan PreAmp Master Mix y 12.5 μL de sondas de interés en solución tampón TE. Esta mezcla se incubó en un termociclador siguiendo un protocolo determinado para preamplificar el cDNA. 3. Amplificación por PCR en tiempo real: Se utilizó la ADN polimerasa del TaqMan® Universal PCR Master Mix para amplificar 2 μL de ADNc diana, usando secuencias 67 específicas y una sonda TaqMan® Gene Expression Assay. Se realizaron tres réplicas para cada muestra y sonda, usando un control con agua libre de nucleasas para cada placa y un gen de referencia (B2M en nuestro caso concreto). La mezcla para cada pocillo de la placa incluyó 2 μL del producto de muestra preamplificado y los componentes restantes del Mix RT-PCR. Tras preparar la mezcla, se centrifugaron brevemente los tubos y se cargó la placa en el sistema de PCR en tiempo real para su ejecución. Las muestras se procesaron y analizaron bajo un protocolo específico. A partir de lo anterior se obtuvo cada muestra y un ciclo umbral (Ct) para cada muestra, así como para el gen de referencia (B2M). Posteriormente se utilizó la fórmula del ΔCt (delta Ct) para comparar niveles de expresión génica entre muestras, la cual se centró en la diferencia de los Ct entre el gen de interés y el gen de referencia (en este caso, B2M) dentro de la misma muestra. 4.8 Análisis estadístico 4.8.1 Análisis descriptivo y comparación de las características ClínicoPatológicas y Respuesta al Tratamiento. Se realizó un análisis estadístico descriptivo de las cohortes 1 y 2 de pacientes utilizando los paquetes estadísticos SPSS versión 28 y R 4.1.1. El enfoque se centró en las características clínicas de las pacientes, del tumor y del tratamiento recibido. En primer lugar, se emplearon métodos descriptivos para analizar las variables continuas y categóricas en ambas cohortes. Se utilizaron medidas de tendencia central y dispersión para las variables continuas, como la edad de las pacientes, y frecuencias relativas y absolutas para las variables categóricas, como el estado menopáusico o la incidencia de toxicidad. En segundo lugar, se compararon exhaustivamente las características clínicas, tumorales y de tratamientos entre las dos cohortes de pacientes. Para las variables continuas como la edad, se aplicó la prueba de t de Student para determinar diferencias significativas en los promedios entre las cohortes. Para variables continuas no paramétricas, como el porcentaje de expresión de Ki67, se utilizó la prueba U de Mann-Whitney, ideal para comparar medianas en distribuciones que no siguen una distribución normal. El análisis de variables categóricas, como obesidad, estado menopáusico, estado funcional según la escala ECOG (Eastern Cooperative Oncology Group), alteraciones en la analítica hepática, histología, grado tumoral, clasificación TNM, RCp, grado de respuesta, tratamientos administrados, toxicidad atribuida a los tratamientos y discontinuación del tratamiento, se realizó mediante la prueba de Chi cuadrado. Esta prueba permitió evaluar la independencia entre las variables categóricas y la pertenencia a una u otra cohorte. 68 Además, se llevó a cabo un análisis de la relación entre la RCp y las características clínicopatológicas de las pacientes, así como de los tratamientos recibidos en ambas cohortes. También se examinó la relación entre la toxicidad y los diferentes tratamientos administrados en las cohortes 1 y 2 de forma independiente, utilizando nuevamente la prueba de Chi cuadrado para evaluar la asociación entre estas variables. 4.8.2 Análisis de supervivencia Se llevó a cabo un análisis detallado de la SLE y SG dentro de las dos cohortes de pacientes. Esta evaluación se realizó tanto de manera global en cada cohorte como específicamente entre subgrupos definidos por su condición de respondedoras y no respondedoras al tratamiento. Este enfoque permitió una comparación exhaustiva del impacto del tratamiento en la evolución clínica de las pacientes. Para el análisis de supervivencia, se utilizó el método de Kaplan-Meier. Este método es adecuado para manejar datos censurados, es decir, pacientes que se pierden durante el seguimiento o no experimentan el evento de interés durante el estudio. Se generaron curvas de supervivencia para cada cohorte y para los subgrupos de respondedoras y no respondedoras. Además, para evaluar las diferencias estadísticas en las curvas de supervivencia entre los grupos comparados (respondedoras vs. no respondedoras), se aplicó la prueba log-rank. Esta prueba proporciona un valor de p que indica si las diferencias observadas en la supervivencia entre los grupos son estadísticamente significativas, considerando el tiempo hasta el evento o el final del seguimiento. 4.8.3 Análisis de la relación entre la sobreexpresión de los genes seleccionados y características clínicas en las 2 cohortes. En este estudio, se realizó un análisis exhaustivo para investigar la relación entre la sobreexpresión de genes específicos y diversas características clínicas en dos cohortes de pacientes. Esta evaluación se llevó a cabo de manera independiente para cada cohorte. Inicialmente, se procedió a verificar la distribución normal de las variables en estudio mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Este paso preliminar fue crucial para seleccionar el enfoque estadístico adecuado en el análisis de los datos. En los casos donde las variables no seguían una distribución normal, se optó por utilizar la prueba U de Mann-Whitney. Esta prueba comparó la expresión de los genes seleccionados con variables clínicas de interés, como la RCp, niveles elevados de Ki67, alteraciones en la analítica hepática, obesidad y toxicidad atribuible a los tratamientos recibidos. Este enfoque permitió 69 evaluar si existía una asociación estadísticamente significativa entre la sobreexpresión de los genes de interés y estas características clínicas específicas. 4.8.4 Análisis curvas ROC Para investigar el potencial de los genes seleccionados como biomarcadores predictivos de una RCp, se empleó el análisis de curvas ROC. Este método permitió cuantificar la precisión de la expresión génica en predecir los resultados del tratamiento mediante el cálculo AUC. Se consideró un valor de AUC superior a 0.80 como indicativo de una buena capacidad predictiva, basándose en criterios estándar de interpretación. 4.9 Aspectos éticos. El proyecto fue presentado al Comité Ético de Investigación Clínica (CEIC) del Hospital Universitario Virgen del Rocío, junto con el formulario de consentimiento informado y otros documentos relevantes. Las muestras de otros hospitales contaban con el consentimiento del comité autonómico conforme a la normativa española aplicable. Para el manejo de las muestras, se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes bajo seguimiento activo, y se realizaron esfuerzos adicionales para obtenerlo de familiares en caso de fallecimiento del paciente o dificultades para localizarlos. Las muestras de tejido neoplásico fueron recogidas durante la actividad asistencial de hospitales específicos, asegurando prácticas éticas en la recogida del material y anonimización de las muestras y los datos. El proyecto se adhirió a los principios éticos establecidos en la Declaración de Helsinki y cumplió con la Ley 14/2007 de Investigación Biomédica en lo relativo a la obtención y uso de muestras, garantizando la trazabilidad de los tejidos y respetando el deber de confidencialidad. Además, se siguieron las normativas de protección de datos, asegurando la confidencialidad de la información y utilizando los datos exclusivamente para los fines del estudio, manteniendo la información de los participantes disociada y codificada 70 5. RESULTADOS 5.1 Características clínico-patológicas, tratamiento recibido y respuesta al tratamiento en las cohortes analizadas El presente estudio se realizó con 2 cohortes de pacientes independientes tratadas en 3 centros hospitalarios de Andalucía. Todas las pacientes eran mujeres, con diagnóstico de CM localizado o localmente avanzado (TNM 8ª ed. AJCC) HER2 positivo y RRHH negativos que recibieron tratamiento neoadyuvante. El diagrama de flujo presentado a continuación detalla la inclusión de pacientes en nuestro estudio, desglosando el total por cohortes, e indica la distribución de las pacientes según la obtención de una RCp o su ausencia. Además, especifica el periodo durante el cual se recolectaron las muestras y el hospital donde las pacientes fueron tratadas. Figura 10. Diagrama de flujo del número de pacientes incluidas, centro de origen y tiempo de recogida de muestras en las cohortes estudiadas. Fuente: elaboración propia. En el estudio, se recopilaron una serie de datos clínicos y tumorales relevantes de todas las pacientes pertenecientes a ambas cohortes. Estos datos incluyeron la edad, el estado funcional según la escala ECOG, el estado menopáusico, y la presencia de obesidad (definida por un IMC ≥ 30). También se recolectaron características específicas del tumor, como el subtipo histológico, la expresión de Ki67, el grado histológico, y la clasificación TNM clínica. Además, se registraron parámetros analíticos, como la existencia de alteraciones hepáticas basales (GGT, FA, AST o ALT), el tipo de tratamiento oncológico administrado, la toxicidad relacionada con el tratamiento, la respuesta a este y la clasificación TNM patológica. Posteriormente, se llevó a cabo un análisis para explorar la relación entre estas características y la asignación de las pacientes a una de las dos cohortes del estudio, con el objetivo de determinar si existía una asociación significativa entre las variables recogidas y la inclusión en una u otra cohorte. Los resultados de este análisis se resumen a continuación en las tablas 6,7 y 8. 71 No se encontraron diferencias significativas en la comparación de estas características y las cohortes 1 y 2 salvo en la obesidad y en el subtipo histológico. Características clínicas Cohorte 1 Cohorte 2 Comparación Test P-valor N (%) N (%) Edad Mediana 63 años Rango 33-70 años Mediana 56 años Rango 38-81 años Test T-Student P-valor=0.432 ECOG al inicio ECOG 0 13 (100%) ECOG 0 38 (95%) Test Chi cuadrado P-valor= 0.411 ECOG 1 0 ECOG 1 2 (5%) Estado menopáusico Premenopáusicas 2 (15.4%) Premenopáusicas 13 (32.5%) Test Chi cuadrado P-valor=0.234 Menopáusicas 11 (84.6%) Menopáusicas 27 (67.5%) Obesidad IMC ≥ 30 4 (30.8%) IMC ≥ 30 27 (67.5%) Test Chi cuadrado P-valor=0.020 IMC < 30 9 (69.2%) IMC < 30 13 (32.5%) Alteración hepática basal Alterada 0 Alterada 0 Test NA P-valor NA Normal 13 (100%) Normal 13 (32.5%) No recogida 0 NO recogida 27 (67.5%) Tabla 6. Características clínicas y analíticas de las cohortes 1 y 2 y comparación entre ambas. Fuente: elaboración propia. N=número de pacientes. 72 Características tumorales Cohorte 1 Cohorte 2 Comparación Test P-valor N (%) N (%) TNM clínico IA 0 IA 1 (1.9%) Test Chi cuadrado P-valor=0.145 IIA 2 (15.4%) IIA 7 (17.5%) IIB 3 (23.1%) IIB 13 (32.5%) IIIA 8 (61.5%) IIIA 11 (27.5%) IIIB 0 IIIB 7 (17.5%) IIIC 0 IIIC 1 (2.5%) Subtipo histológico Infiltrante sin especificar 4 (30.8%) Infiltrante sin especificar 26 (65%) Test Chi cuadrado P-valor= 0.047 Ductal SNE 9 (69.2%) Ductal SNE 11 (27.51%) Lobulillar 0 Lobulillar 1 (2.5%) Apocrino 0 Apocrino 2 (5%) Grado No especificado 13 (100%) No especificado 18 (45%) Test NA P-valor NA G2 0 G2 5 (12.5%) G3 0 G3 17 42.5%) Método determina HER2 HER2 +++ 12 (92.3%) HER2 +++ 35 (87.5%) Test Chi cuadrado P-valor =0.635 HER2++(amplif) 1 (7.7%) HER2++(amplif) 5 (12.5%) Ki67 ≥50% 8 (61.5% ≥50% 25 (64.1) Test Chi cuadrado P-valor=0.868 <50% 5 (38.5%) <50% 15 (37.5%) Tabla 7. características tumorales de la cohorte 1 y 2 y comparación entre ambas. Fuente: elaboración propia. NA =no aplica; N= número de pacientes. 73 Tratamiento recibido y respuesta Cohorte 1 Cohorte 2 Comparación Test P-valor N (%) N (%) Tratamiento recibido Antraciclinas taxanos trastuzumab 8 (61.5%) Antraciclinas taxanos trastuzumab 8 (20%) Test NA P-valor NA Taxanos trastuzumab 5 (38.5%) Taxanos trastuzumab 0 Antraciclinas taxanos trastuzumab pertuzumab 0 Antraciclinas taxanos trastuzumab pertuzumab 29 (72.5%) Taxanos pertuzumab trastuzumab 0 Taxanos pertuzumab trastuzumab 3 (7.5%) Toxicidad 3 o 4 Si 2 (15.4%) Si 3 (7.5%) Test Chi cuadrado P-valor= 0.398 No 11 (84.6%) No 37 (92.5%) Discontinuación del tratamiento Si 0 Si 0 Test NA P-valor NA No 13 (100%) No 40 (100%) Respuesta completa patológica Si 9 (69.2%) Si 24 (60%) Test Chi cuadrado P-valor= 0.551 No 4 (30.8%) No 16 (40%) Grado de respuesta (RCB) RCp 9 (69.2%) RCp 24 (60%) Test Chi cuadrado P-valor=0.426 RCB I 0 RCB I 7 (17.5%) RCB II 3 (23.1%) RCB II 6 (15%) RCB III 1 (7.7%) RCB III 3 (7.5%) TNM patológico RCp 9 (69.2%) RCp 24 (60%) Test Chi cuadrado P-valor=0.257 Estadio I 1 (7.7%) Estadio I 10 (25.6%) Estadio II 1 (7.7%) Estadio II 4 (10.3%) Estadio III 2 (15.4%) Estadio III 1 (2.6%) Tabla 8. Tratamiento recibido, toxicidad y respuesta a tratamiento en cohorte 1 y 2 y comparación entre ambas. Fuente: elaboración propia. N=número de pacientes. 80 P-valor = 0.048 Pvalor = 0.320 Figura 12. Representación gráfica de la relación entre RCp y características clínico-patológicas y tratamientos de la cohorte 2. Fuente: elaboración propia. 81 5.3 Relación entre la toxicidad y los diferentes tratamientos en las cohortes analizadas Se analizó la relación entre la variedad de tratamientos administrados y la incidencia de toxicidad grado 3-4 en ambas cohortes de pacientes estudiadas. Los datos obtenidos se consolidan en la Tabla 10 y su correspondiente ilustración gráfica se puede observar en la figura 13. En esta evaluación, no se detectaron variaciones estadísticamente significativas en términos de toxicidad entre los diferentes tratamientos en la cohorte 1 pero sí en la cohorte 2. Cohorte 1 Tratamientos recibidos Toxicidad P-valor Si (N-%) No(N-%) Tratamientos recibidos Antraciclinas taxanos trastuzumab 5 (55.6%) 3 (75%) P-valor= 0.50 Taxanos trastuzumab 4 (44.4%) 1 (25%) Cohorte 2 Tratamientos recibidos Toxicidad P-valor Tratamientos recibidos Antraciclinas taxanos trastuzumab 2 (8.3%) 6 (37.5%) P-valor=0.048 Antraciclinas taxanos trastuzumab pertuzumab 20 (83.3%) 9 (56.3%) Taxanos trastuzumab pertuzumab 2 (6.3%) 1 (8.3%) Tabla 10. Relación entre la toxicidad 3-4 y los diferentes tratamientos en cohortes estudiadas.Fuente: elaboración propia. 82 Cohorte 1 P-valor = 0.50 Figura 13. Representación gráfica de la relación entre tratamientos y la toxicidad grado 3 y 4 de la cohorte 1. Fuente: elaboración propia. Cohorte 2 P-valor = 0.048 Figura 14. Representación gráfica de la relacIón entre tratamientos y la toxicidad grado 3 y 4 de la cohorte 2. Fuente: elaboración propia. 83 5.4 Supervivencia libre de enfermedad y supervivencia global en ambas cohortes de pacientes analizadas Inicialmente se evaluó la SLE y la SG en el global de las pacientes y en las dos cohortes de pacientes por separado. Las pacientes fueron seguidas desde el inicio de su tratamiento hasta el final del período de estudio, la fecha de fallecimiento, o hasta que se perdiera el seguimiento, lo que ocurriera primero. En el análisis de SLE en el global de las pacientes (cohorte 1 + cohorte 2) estudiadas no se alcanzó la mediana de SLE, lo que significa que aún no se ha determinado un punto en el tiempo en el cual el 50% de las pacientes hayan presentado una recaída. La SLE global es del 70.9%, indicando que el 70.9% de las pacientes permanecieron libres de progresión durante el período de seguimiento. En la cohorte 1, la media de SLE fue de 12.7 años y la tasa de SLE en esta cohorte fue del 84.6%, lo que indica que el 84.6% de las pacientes no tuvieron recaídas durante el período de seguimiento. En la cohorte 2, la mediana de SLE fue de 8 años (IC 95%: 3.041 - 12.959), la tasa de SLE en la cohorte 2 fue del 41.5%. La SLE se representa en las figuras 15,16 y 17. Figura 15. SLE en todas pacientes (Cohorte 1 + cohorte 2). Fuente: elaboración propia. 84 Figura 16. SLE en la cohorte 1 de pacientes. Fuente: elaboración propia. Figura 17. SLE en la cohorte 2 de pacientes. Fuente: elaboración propia. 85 La SG para el grupo total de pacientes fue del 65.5%, es decir, el 65.5% de los pacientes sobrevivieron durante el período de seguimiento. En este análisis global, no se alcanzó la mediana de supervivencia, lo que indica que aún no se ha determinado el tiempo en el que el 50% de los pacientes han fallecido. En la cohorte 1, no se registraron fallecimientos durante el estudio. Debido a la ausencia de eventos de interés (es decir, fallecimientos), no se pudieron calcular ni representar las curvas de SG para esta cohorte. En la cohorte 2, la mediana de SG fue de 9 años y a tasa de SG fue del 39.2%. Las figuras 18 y 19 representan SG en el global de las pacientes y en las pacientes de la cohorte 2 respectivamente. Figura 18. SG en todas las pacientes (Cohorte 1 + cohorte 2). Fuente: elaboración propia. 86 Figura 19. SG en la cohorte 2 de pacientes. Fuente: elaboración propia. Se analizaron la SLE y la SG en función de si las pacientes fueron respondedoras (RCp) o no respondedoras, en ambas cohortes por separado. En la cohorte 1 se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las pacientes respondedoras y no respondedoras en términos de SLE. Las pacientes no respondedoras tuvieron una tasa de SLE del 50%, con un valor p de 0.027, lo que indica que la diferencia es estadísticamente significativa. Es decir, las pacientes que no respondieron al tratamiento tuvieron una menor SLE en comparación con las respondedoras. Además, no se registraron recaídas en las pacientes respondedoras durante el estudio, por lo que no se pudo calcular una mediana de SLE para esta cohorte. En la cohorte 2 la mediana de SLE para las pacientes con RCp fue de 8 años. Esto significa que la mitad de estas pacientes experimentaron una recaída dentro de los primeros 8 años. La tasa de SLE en este subgrupo fue del 45.7%. Las pacientes no respondedoras también tuvieron una mediana de SLE de 8 años, pero su tasa de SLE fue del 34.6%. Sin embargo, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las curvas de SLE para respondedoras y no respondedoras en esta cohorte, con un valor p de 0.188. Las curvas de SLE para estas cohortes y subgrupos se representan en las figuras 20 y 21. 87 Figura 20. SLE en pacientes con RCp y No RCp en cohorte 1 de pacientes. Fuente: elaboración propia. Figura 21. SLE en pacientes con RCp y NO RCp en cohorte 2 de pacientes. Fuente: elaboración propia. 88 En la cohorte 1, no se registraron fallecimientos durante el período de seguimiento. Debido a la falta de eventos (exitus), no fue posible calcular ni representar la curva de SG para esta cohorte. En la cohorte 2 La mediana de SG para las pacientes con RCp fue de 9 años y la tasa de SG en este grupo fue del 39.2%. Por otra parte, la mediana de SG para las pacientes no respondedoras fue de 10 años y La tasa de SG en este grupo fue del 34.6% durante el periodo de seguimiento. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las curvas de SG para pacientes respondedoras y no respondedoras en la cohorte 2, con un valor p de 0.785, lo que sugiere que las diferencias en la SG entre estos grupos no son estadísticamente significativas. La curva de SG en la cohorte 2 se muestra en la figura 22. Figura 22. SG en pacientes con RCp y NO RCp en cohorte 2 de pacientes. Fuente: elaboración propia. 89 5.5 Transcritos diferencialmente expresados en la cohorte 1 La identificación diferencial de expresión de ARN en la cohorte 1 de pacientes entre las pacientes respondedoras (RCp) y no respondedoras (No RCp) se realizó mediante microarray. En la figura 23 se representa un mapa de Análisis de Componentes Principales (PCA), una técnica estadística utilizada para resumir y visualizar la variabilidad y las relaciones inherentes en un conjunto de datos de alta dimensión la cual transforma los datos originales en un nuevo conjunto de variables, denominadas componentes principales, que son ortogonales entre sí y capturan la máxima variabilidad posible en el conjunto de datos. Este mapa de PCA ilustra la distribución espacial de los pacientes en nuestro estudio, agrupados como respondedoras (RCp) y no respondedoras (No RCp) basado en sus perfiles de expresión génica. Cada punto en el mapa representa un paciente. La interpretación del mapa PCA nos permite apreciar las agrupaciones naturales dentro de los datos, sugiriendo patrones de expresión génica que diferencian a respondedoras de no respondedoras. Su objetivo es reducir la dimensionalidad de los datos a unas pocas componentes que capturan las tendencias más importantes, facilitando la visualización y la interpretación de los patrones de expresión génica y las diferencias entre grupos. Figura 23. PCA Mapping 40.1%: Este valor indica que PCA 1, PCA 2, y PCA 3 captura el 40.1% de la variabilidad total de los datos de microarray. Es una medida de cuánta información (variabilidad) se ha condensado en estas componentes principales. PCA 1 (la dirección a lo largo de la cual los datos están más dispersos) 15.1%; PCA 2 (es la dirección de máxima varianza que es ortogonal, independiente) 13.8%; PCA 3 (representa la siguiente dirección de máxima varianza) 11.2%. Fuente: TAC control. 96 En los 3 genes, UGT2B10, UGT2B17 y UGT2B28, se encontró una mayor sobreexpresión del gen en no respondedoras con respecto a respondedoras. En el caso de UGT2B10 el p-valor era de 0.0189 y FC de 2.21; Para el gen UGT2B17 el p-valor era del 0.0110 y FC de 1,65 y en el caso de UGT2B28 el p-valor era de 0.0293 y el FC de 3.83 Representamos gráficamente la relación entre la expresión de los genes seleccionados con respecto a las pacientes respondedoras y no respondedoras en las figuras 30, 31 y 32. Figura 30. Relación entre la expresión de UGT2B10 y respuesta completa en cohorte 1. Fold-Change=2.21 . Fuente: elaboración propia. Figura 31. Relación entre la expresión de UGT2B17 y respuesta completa en cohorte 1. FoldChange=1.65. Fuente: elaboración propia. 97 Figura 32. Relación entre la expresión de UGT2B28 y respuesta completa en cohorte 1. Fold-change=3.83 Fuente: elaboración propia. 5.8 Valor predictivo de los genes seleccionados a ser potenciales biomarcadores de respuesta a tratamiento neoadyuvante en la cohorte 1 Se realizaron curvas ROC para determinar si los genes diferencialmente expresados seleccionados previamente podrían ser potenciales biomarcadores de respuesta a tratamiento neoadyuvante en pacientes con CM HER2 y RRHH negativos. En la cohorte 1 de pacientes el AUC fue > 0.80 para los genes UGT2B10 y UGT2B17; sin embargo, fue menor de 0.80 en el caso de UGT2B28 (AUC 0.694) Las curvas ROC se representan en las figuras 33,34 y 35 respectivamente. 98 Curva ROC UGT2B10 cohorte 1 Figura 33. Curva ROC de la expresión diferencial del gen UGT2B10 y respuesta completa en cohorte 1. Fuente: elaboración propia. Curva ROC UGT2B17 cohorte 1 Figura 34. Curva ROC de la expresión diferencial del gen UGT2B17 y respuesta completa en cohorte 1. Fuente: elaboración propia. 99 Curva ROC UGT2B28cohorte 1 Figura 35. Curva ROC de la expresión diferencial del gen UGT2B28 y respuesta completa en cohorte 1. Fuente: elaboración propia. 5.9 Relación entre RCp y expresión de genes seleccionados en una cohorte independiente de pacientes Se realizó análisis qPCR en una cohorte independiente de validación (cohorte 2) centrándose en aquellos genes seleccionados en la cohorte 1, UGT2B10, UGT2B17 y UGT2B28 y se comparó su expresión relativa entre las pacientes RCp y No RCp. En esta cohorte de pacientes hubo una mayor expresión de los 3 genes en pacientes no respondedoras con respecto a respondedoras, siendo estadísticamente significativa para los genes UGT2B17 (p-valor = 0.0235) y UGT2B28 (0.0463), aunque no lo fue en el caso del UGT2B10 (p-valor = 0.5353). Los resultados se representan en las figuras 36,37 y 38 100 Figura 36. Relación entre la expresión de UGT2B10 y respuesta completa en cohorte 2. Fuente: elaboración propia. Figura 37. Relación entre la expresión se UGT2B17 y respuesta completa en pacientes de cohorte 2. Fuente: elaboración propia. 101 Figura 38. Relación entre la expresión se UGT2B28 y respuesta completa en pacientes de cohorte 2. Fuente: elaboración propia. 5.10 Relación entre RCp y expresión de genes seleccionados en una cohorte independiente de pacientes tratadas con antraciclinas Se volvieron a analizar los datos de expresión de la cohorte 2 de pacientes excluyendo los datos de pacientes que no habían sido tratadas con antraciclinas, buscando así homogeneizar la muestra con respecto al tratamiento recibido y evaluar de manera más precisa la expresión genética diferencial. Los resultados obtenidos confirmaron que la significación estadística se mantenía para UGT2B17 (p-valor = 0.0301) y UGT2B28 (p-valor = 0.0337) mientras que para UGT2B10 se continuó sin alcanzar la significación estadística (p-valor = 0.559) Se representan estos resultados en las figuras 39,40 y 41. 102 Figura 39. Relación entre la expresión de UGT2B10 y respuesta completa en pacientes de cohorte 2 tratados con antraciclinas. Fuente: elaboración propia. Figura 40. Relación entre la expresión de UGT2B17 y respuesta completa en pacientes de cohorte 2 tratados con antraciclinas. Fuente: elaboración propia. 103 Figura 41. Relación entre la expresión de UGT2B28 y respuesta completa en pacientes de cohorte 2 tratados con antraciclinas. Fuente: elaboración propia. 5.11 Valor predictivo de los genes seleccionados a ser potenciales biomarcadores de respuesta a tratamiento neoadyuvante Se llevó a cabo análisis de curvas ROC para explorar la capacidad predictiva de los genes UGT2B17 y UGT2B28 en la cohorte 2 de pacientes. En ninguno de los casos se alcanzó un AUC > 0.80. Las figuras 42 y 43 representan las curvas ROC de estos genes de la cohorte 2. Curva ROC UGT2B17 cohorte 2 Figura 42. Curva ROC de la expresión diferencial del gen UGT2B17 y respuesta completa en cohorte 2. Fuente: elaboración propia. 104 Curva ROC UGT2B28 cohorte 2 Figura 43. Curva ROC de la expresión diferencial del gen UGT2B28 y respuesta completa en cohorte 2. Fuente: elaboración propia. 5.12 Relación entre la sobreexpresión de los genes seleccionados y características clínico-patológicas y relacionados con el tratamiento recibido en cohorte 1 y 2 Por otra parte, se procedió a una evaluación de la asociación entre la expresión de los genes UGT2B10, UGT2B15 y UGT2B17 y una serie de características en las cohortes 1 y 2 tales como la alteración hepática basal, la incidencia de toxicidad de grado 3-4, la presencia de obesidad y niveles elevados de Ki67, dada su posible relevancia para la modulación de la expresión génica. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en ninguna de las correlaciones examinadas. No se pudo determinar en cohorte 2 la relación entre la alteración hepática y la expresión de los genes porque todas las pacientes en las que pudieron recogerse parámetros analíticos no los tenían alterados. En las figuras de la 44 a la 47 se muestran los resultados obtenidos en la cohorte 1 de pacientes y de la 48 a la 50 los obtenidos en la cohorte 2. 105 Cohorte 1 Alteración analítica hepática Expresión de UGT2B10 P-valor= 0.198 Expresión de UGT2B17 P-valor= 0.604 112 Expresión de UGT2B28 P-valor= 0.690 Figura 48. Sobreexpresión de los genes seleccionados y obesidad en cohorte 2. Fuente: elaboración propia. Ki67 (%) Expresión de UGT2B10 P-valor= 0.178 113 Expresión de UGT2B17 P-valor= 1 Expresión de UGT2B28 P-valor= 0.754 Figura 49. Sobreexpresión de los genes seleccionados y ki67 en cohorte 2. Fuente: elaboración propia. 114 Toxicidad grado 3-4 Expresión de UGT2B10 P-valor= 0.190 Expresión de UGT2B17 P-valor= 0.583 115 Expresión de UGT2B28 P-valor= 0.862 Figura 50. Sobreexpresión de los genes seleccionados y toxicidad en cohorte 2. Fuente: elaboración propia. 116 6. DISCUSIÓN La identificación de biomarcadores para predecir la respuesta al tratamiento neoadyuvante representa un avance crucial hacia una medicina personalizada en el CM. Es por ello por lo que este proyecto se ha enfocado con énfasis en la búsqueda de biomarcadores de respuesta en CM, centrándonos en el subgrupo HER2 positivo con RRHH negativos. Aunque el tratamiento neoadyuvante ha mostrado eficacia comparable a la terapia adyuvante en el CM en etapas tempranas, su valor predictivo en términos de supervivencia y reducción del riesgo de recurrencia y mortalidad destaca particularmente cuando se logra una RCp (124,125,133). Estudios han evidenciado que la RCp varía significativamente entre subtipos tumorales, siendo particularmente alta en tumores HER2-positivos o triples negativos. En estos casos, alcanzar una RCp se asocia con una notable disminución en el riesgo de muerte, subrayando la importancia de determinar los factores predictivos de respuesta al tratamiento (133). Sin embargo, la predicción efectiva de qué pacientes responderán favorablemente al tratamiento neoadyuvante sigue siendo un desafío en la práctica clínica. Con todo ello, decidimos centrar este estudio en la identificación y validación de biomarcadores específicos que faciliten la predicción de la respuesta al tratamiento neoadyuvante, abriendo el camino hacia tratamientos más dirigidos y efectivos para pacientes con este subtipo de CM. En el análisis comparativo de las características clínicas entre las dos cohortes, se observó una homogeneidad significativa en la mayoría de las variables, incluyendo edad, estado menopáusico y el estado funcional según la escala ECOG, lo cual sugiere que las cohortes están bien balanceadas en términos de condiciones clínicas generales. Esta uniformidad refuerza la validez de nuestras comparaciones subsiguientes al minimizar las variaciones basadas en estas características. Sin embargo, se identificó una diferencia significativa en la prevalencia de obesidad entre las cohortes. La mayor prevalencia de obesidad en la cohorte 2 (67,5%) en comparación con la cohorte 1 (30,8%) no se relaciona con la asociación reportada en la literatura entre obesidad y menopausia, ya que en la cohorte 1 hay un mayor porcentaje de pacientes postmenopáusicas (84,6%) respecto a la cohorte 2 (67,5%). Este hallazgo sugiere que otros factores, como el estilo de vida (sedentarismo o alimentación), que no fueron recogidos en nuestro estudio, podrían estar influyendo en esta diferencia (156). Respecto al estadio TNM y las características tumorales, no se encontraron diferencias significativas entre las cohortes, excepto en el subtipo histológico. La ausencia de especificación entre CM infiltrante sin otra especificación en varias de las biopsias de la cohorte 2, que era una cohorte multicéntrica, podría reflejar variaciones en los informes 117 anatomopatológicos llevados a cabo entre los centros, así como los cambios en dichos protocolos a lo largo de los años. Esta limitación en la clasificación histológica podría influir en la interpretación del subtipo predominante en nuestra muestra y pone de manifiesto la importancia de una caracterización histológica estandarizada para futuros análisis comparativos. La falta de datos sobre el grado histológico en la cohorte 1, debido a la no medición de este parámetro en biopsias iniciales en nuestro centro, resalta una limitación metodológica que podría ser relevante para la interpretación de la agresividad tumoral y las decisiones terapéuticas. Aunque no hubo diferencias significativas en el estadio TNM, la cohorte 1 presentaba un mayor porcentaje de pacientes con tumores en estadio IIIA. Esto puede deberse a que la cohorte 1 incluye muestras de pacientes que recibieron tratamiento en un período más antiguo, mientras que la cohorte 2 comprende pacientes tratadas más recientemente. En la actualidad, la evolución de la oncología clínica ha llevado a incluir a pacientes con estadios tumorales más precoces en el tratamiento neoadyuvante (157). En el análisis comparativo de las estrategias de tratamiento entre las dos cohortes de pacientes con CM HER2 positivo, se observaron diferencias en la administración de pertuzumab, condicionadas por el año de aprobación del fármaco y el período de diagnóstico de las pacientes, que abarcó desde 2008 hasta 2022. Este rango de 15 años implicó variaciones en las opciones terapéuticas disponibles, especialmente en lo que respecta al uso de pertuzumab, cuya incorporación a la práctica clínica ha sido progresiva. Cabe destacar que todos los casos recibieron tratamiento neoadyuvante con trastuzumab, y aquellos pacientes excluidos de la terapia con antraciclinas presentaban contraindicaciones específicas, como edad avanzada, comorbilidades cardiacas o exposición previa a antraciclinas por otras neoplasias. La evaluación de la toxicidad asociada a los regímenes quimioterapéuticos y al tratamiento de doble bloqueo reveló incidencias bajas de eventos adversos de grado 34, incluso menores a las reportadas en ensayos clínicos previos que emplearon esquemas terapéuticos similares. Este hallazgo sugiere un manejo efectivo de la toxicidad por parte de los profesionales médicos, posiblemente gracias a una identificación y tratamiento precoz de los efectos adversos (134). Por otra parte, las tasas de RCp observadas en nuestro estudio no se alinean con las reportadas en la literatura, lo que podría deberse a la selección de pacientes previa al estudio en cuanto a RCp. La limitada disponibilidad de muestras de parafina nos obligó a seleccionar un número equilibrado de muestras de respondedores y no respondedores desde nuestro biobanco. Además, en la cohorte 2 (multicéntrica) se incluyeron muestras de pacientes partiendo de que hubieran presentado RCp o no para hacer cohortes equilibradas. Por lo tanto, cabía esperar la ausencia de una diferencia estadísticamente significativa en este sentido. 118 En la cohorte 1, no se observaron diferencias significativas en la RCp en relación con los tratamientos administrados, incluyendo aquellos regímenes sin antraciclinas. De forma similar, tampoco hubo diferencia en cuanto a niveles de Ki-67 (igual o mayor del 50% y menos del 50%). Por otro lado, la cohorte 2, caracterizada por una mayor cantidad de pacientes, permitió identificar diferencias significativas que refuerzan nuestra comprensión de los factores asociados con una mejor respuesta al tratamiento. Notablemente, se encontró que tanto el tratamiento de doble bloqueo como un mayor grado histológico estaban significativamente asociados con una mayor incidencia de RCp. Estos hallazgos concuerdan con la literatura existente, sugiriendo que los regímenes de tratamiento con doble bloqueo antiHER2 y las características agresivas del tumor pueden ser predictores de una respuesta favorable a la terapia neoadyuvante (133, 137). Sin embargo, fuera de estos factores, no se detectaron otras diferencias estadísticamente significativas en ninguna de las variables adicionales examinadas. Este resultado subraya la complejidad de predecir la RCp basándose en características clínicas y tumorales aisladas, y destaca la importancia de un enfoque multifactorial para la toma de decisiones terapéuticas y la búsqueda de nuevos biomarcadores. En cuanto a la toxicidad relacionada con los diferentes tratamientos, en la cohorte 1 de pacientes no se observaron diferencias significativas en la toxicidad entre los distintos tratamientos, probablemente debido al tamaño más pequeño de la muestra (N más pequeña). Sin embargo, en la cohorte 2 de pacientes, se evidenció que el esquema combinado de antraciclinas, taxanos, pertuzumab y trastuzumab condujo a un incremento en la toxicidad reportada. Este aumento en la toxicidad asociado al régimen de doble bloqueo es coherente con lo reportado en la literatura, donde se reconoce que la combinación de terapias dirigidas y quimioterapia convencional puede intensificar la aparición de efectos adversos debido a su acción sinérgica (158). Los eventos adversos de grado 3-4 más frecuentemente asociados con este esquema incluyen, pero no se limitan a, neutropenia, cardiotoxicidad y eventos gastrointestinales severos. La inclusión de antraciclinas y taxanos, conocidos por su perfil de toxicidad, junto con pertuzumab y trastuzumab, que pueden exacerbar la cardiotoxicidad, podría explicar la mayor incidencia de eventos adversos graves observados en esta cohorte de pacientes, fundamentalmente diarrea grado 3 y cardiotoxicidad reversible y asintomática (reducción subclínica de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo) (159). En términos de SLE y SG nuestros resultados muestran variaciones significativas entre las dos cohortes de pacientes. Es importante destacar que nuestras pacientes se seleccionaron en base a su respuesta inicial al tratamiento, dividiéndolas en respondedoras y no respondedoras. Esta selección previa introduce un sesgo considerable en la interpretación de los datos de supervivencia, ya que las diferencias en supervivencia pueden no ser valorables de manera objetiva bajo estas condiciones. 119 La evidencia sugiere que una mayor tasa de RCp se asocia con una mejor supervivencia a largo plazo (132). Sin embargo, aunque tanto la cohorte 1 como la cohorte 2 se seleccionaron en base a la RCp y estaban equilibradas en ese sentido, la cohorte 1 tenía solo 4 pacientes no respondedoras y 9 respondedoras, mientras que la cohorte 2 incluía 24 pacientes respondedoras y 16 no respondedoras. Esta disparidad en la distribución de las pacientes podría sesgar los resultados de supervivencia, dificultando una comparación justa y precisa entre las cohortes. En el análisis de SLE y SG del conjunto global de pacientes, no se alcanzó la mediana de supervivencia. Específicamente en la cohorte 1 no se alcanzó la mediana de SLE ni SG, esta última debido a la ausencia de fallecimientos, lo que destaca una alta tasa de supervivencia y pocas recaídas a lo largo del período de seguimiento de más de 10 años. En contraste, la cohorte 2 presentó una mediana de SLE de 8 años, con una SLE del 41.5%, y una mediana de SG de 9 años. La comparación entre pacientes respondedoras y no respondedoras dentro de cada cohorte revela más sobre la influencia de la respuesta al tratamiento en los resultados de supervivencia. En la cohorte 1, se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la SLE entre pacientes respondedoras y no respondedoras (p-valor de 0.027). La SLE fue del 50% en no respondedoras y no hubo recaídas en pacientes con RCp. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la cohorte 1 incluyó solo un pequeño número de pacientes no respondedoras, lo que podría haber influido en los resultados En la cohorte 2, la mediana de SLE para pacientes con RCp fue de 8 años, con una SLE del 45.7%, mientras que las no respondedoras tuvieron una SLE del 34.6%, sin diferencias significativas en la SLE para pacientes con RCp (p-valor = 0.188). Aunque la distribución en esta cohorte fue más equilibrada, el sesgo de selección sigue presente. Respecto a la SG, en la cohorte 1 no se pudo calcular la curva de supervivencia debido a la ausencia de eventos (fallecimientos). En la cohorte 2, la mediana de SG para pacientes con RCp fue de 9 años, mientras que para las no respondedoras fue de 10 años, sin diferencias significativas en la SG para pacientes con RCp (p-valor = 0.785). Tras realizarse el microarray en las pacientes de la cohorte 1 se comparó inicialmente mediante PCA la variabilidad total de nuestros datos, el cual capturó el 40.1% de la variabilidad total, siendo este resultado significativo dado el alto grado de complejidad y la amplia variabilidad genética presentes en los perfiles de expresión génica de pacientes con cáncer. La utilidad del PCA en nuestro análisis destaca por su capacidad para apuntar a los genes cuya expresión varía significativamente entre grupos con diferentes respuestas al tratamiento ya que PCA1 y PCA3 encuentra fundamentalmente en la mayor parte de las pacientes respondedoras, lo que no ocurre con las no respondedoras de forma general (PCA 1 es la dirección a lo largo de la cual los datos están más dispersos y PCA 3 representa la siguiente dirección de máxima varianza). 120 En nuestro estudio, se realizó un análisis de categorización funcional para los 6251 transcritos identificados que mostraron expresión diferencial entre pacientes respondedores y no respondedores al tratamiento neoadyuvante. De estos transcritos, 3367 estaban sobreexpresados y 2884 infraexpresados en las pacientes no respondedoras en comparación con las respondedoras. Este análisis de categorización funcional es crucial, ya que permite clasificar los transcritos según su función biológica o características moleculares, facilitando así la identificación de las vías biológicas potencialmente alteradas que podrían influir en las diferencias en la respuesta al tratamiento y por lo tanto puede facilitar la selección adecuada de un potencial biomarcador de respuesta a tratamiento neoadyuvante. La decisión de centrarse en los transcritos codificantes (que representaron el 6.8% y 5.77% de los transcritos sobreexpresados e infraexpresados respectivamente) en detrimento de otros tipos de transcritos como los no codificantes, se basa en varias consideraciones (160,161): • Los genes codificantes fueron seleccionados por su capacidad para codificar proteínas que son esenciales para numerosas funciones celulares y son dianas habituales de tratamientos. Esta selección se basa en la posibilidad de identificar cambios en la expresión de proteínas que pueden desempeñar un papel causal en la patogénesis del cáncer o en la respuesta a los tratamientos. • Por otro lado, los genes codificantes son menos complejos para validar en estudios experimentales. Así mismo se descartaron otros transcritos para nuestro análisis por diferentes circunstancias (160,161): • Con respecto a los transcritos identificados como parte de complejos múltiples, (que representan el mayor porcentaje de nuestros transcritos) a menudo representan conjuntos de genes que pueden participar en varias funciones celulares a la vez, lo que puede complicar la interpretación de su rol específico en la patogénesis del cáncer y pueden incluir conjuntos de genes codificantes y no codificantes, lo que dificulta la determinación de qué componente del complejo está contribuyendo a los cambios observados en la expresión. • Los transcritos no codificantes, los cuales pueden incluir también, se sabe que desempeñan papeles críticos en la regulación de la expresión génica y están implicados en el cáncer, pero la complejidad en la interpretación de su función específica motivó nuestra decisión de excluirlos en esta fase del análisis. • Otros transcritos como los pseudogenes, precursores de microARN, y RNAs ribosomales, aunque importantes en la regulación y mantenimiento de la función celular, fueron excluidos de este análisis inicial debido a la dificultad en la aplicación 121 directa de los hallazgos a estrategias terapéuticas, ya que suelen estar implicados en mecanismos reguladores. Se realizó un análisis de enriquecimiento de función en nuestro estudio con la intención de que los datos de microarray se interpretarán de una forma más contextualizada, ya que partíamos de un gran volumen de datos de expresión génica (162) de tal forma que al identificar conjuntos de genes que participan en rutas biológicas específicas pudiéramos encontrar alteraciones genéticas subyacentes en la respuesta al tratamiento neoadyuvante en nuestro subtipo tumoral de CM. El análisis de enriquecimiento funcional realizado en nuestro estudio identificó que los genes UGT2B10, UGT2B17, y UGT2B28 estaban involucrados en varias rutas metabólicas críticas, lo que podría indicar su posible papel en la patogénesis del CM y en la variabilidad de la respuesta al tratamiento neoadyuvante. Las diferentes rutas metabólicas en las que estos genes participaban podrían estar en relación con la patogénesis del CM o la respuesta a tratamientos. En primer lugar, el metabolismo del ácido ascórbico y aldarato, implicados en la protección antioxidante y detoxificación, elementos clave en la prevención del daño celular y el cáncer (163). La segunda vía estaba relacionada con conversiones de pentosas y gluconatos, incluyendo el metabolismo de la glucosa, pudiendo influir en la proliferación y crecimiento celular (164). Además, la alteración del metabolismo de la vía de las porfirinas puede llevar a la acumulación de éstas y a su vez contribuir al estrés oxidativo, daño celular y carcinogénesis. (165) Otra vía implicada es la formación de aductos de ADN. Estos se producen cuando compuestos carcinógenos se unen al ADN. Los genes que participan en la detoxificación pueden influir en la formación de estos aductos (166). También están implicados los genes UGT2B10, UGT2B17 y UGT2B28 en el metabolismo del citocromo P450 (metabolismo de fármacos y xenobióticos). La alteración de esta vía puede dar lugar a la formación de carcinógenos o dar lugar a resistencias a quimioterapia (167-169). Incluso se ha comprobado que la activación de receptores celulares por genes UGT de forma anormal también puede dar lugar a procesos de carcinogénesis (170). La última vía implicada es la biosíntesis de hormonas esteroideas, cuya alteración también puede influir en la carcinogénesis, en este caso fundamentalmente en tumores hormonodependientes (171). La familia de genes UGT2B pertenece a la superfamilia de genes que codifica para las enzimas UDP-glucuronosiltransferasas. Estas enzimas tienen un papel esencial en la fase II del metabolismo y la eliminación de esteroides, bilirrubina, hormonas, medicamentos y otros xenobióticos y se localizan en la región 4q13 del cromosoma 4 en humanos (172). Estas enzimas UDP-glucuronosiltransferasas se añaden un grupo glucurónico a compuestos lipofílicos, lo que facilita su solubilidad en agua y, por lo tanto, su excreción 128 impactar en los resultados de la qPCR. A pesar de optimizar los métodos de extracción de ARN y realizar preamplificaciones específicas para mejorar la sensibilidad de las mediciones de expresión génica, estas limitaciones podrían haber influenciado algunos de nuestros hallazgos, incluida la falta de significación estadística de UGT2B10 en la cohorte 2 de pacientes. Además, es importante destacar que no se realiza rutinariamente la determinación IHQ de receptores de andrógenos en pacientes con CM. Esta información podría ser relevante en nuestro estudio, dado que UGT2B17 está asociado con la glucuronización de receptores de andrógenos en cáncer de próstata. Esta interacción podría influir en la expresión de respondedoras y no respondedoras al tratamiento neoadyuvante. Sin embargo, no se pudo determinar esta relación en nuestras pacientes debido a la variedad en la procedencia y el procesamiento de las muestras de parafina, especialmente en la cohorte 2. Las muestras fueron recibidas de diferentes centros y utilizadas directamente para la extracción de ARN, lo que limitó la disponibilidad de muestra adicional para la determinación de receptores de andrógenos. Además, los cortes mínimos de parafina proporcionados por el biobanco de nuestro centro no permitieron llevar a cabo esta determinación. Por último, hay que destacar que no hemos podido realizar una comparación directa con la plataforma HER2DX, una herramienta comercializada recientemente para tumores HER2 positivos en estadio temprano. Publicada en 2022 y basada en datos de más de 1000 pacientes, HER2DX integra datos clínicos, como el tamaño tumoral y la afectación ganglionar, con datos genómicos que incluyen los niveles de expresión de ARN de 27 genes relacionados con cuatro procesos biológicos específicos del CM HER2: infiltración inmunitaria, proliferación de células tumorales, diferenciación luminal y expresión de HER2. La plataforma HER2DX utiliza un algoritmo que clasifica a las pacientes en grupos de bajo o alto riesgo basado en una puntuación derivada de estos 27 genes, proporcionando información pronóstica sobre la supervivencia a largo plazo y la sensibilidad al tratamiento quimioterápico y anti-HER2 neoadyuvante. Sin embargo, debido a que nuestro estudio no empleó la misma metodología y no contamos con los umbrales comparativos específicos establecidos por HER2DX, no es posible realizar comparaciones directas entre los genes y los resultados de ambas plataformas. La falta de estandarización en los umbrales y en la metodología de clasificación limita la aplicabilidad directa de nuestros hallazgos en el contexto de la plataforma HER2DX y subraya la necesidad de integrar enfoques moleculares y clínicos más detallados en estudios futuros para mejorar la precisión y la comparabilidad de los resultados. Estas limitaciones enfatizan la necesidad de estrategias mejoradas para la conservación y extracción de ARN y subrayan la importancia de colaboraciones más amplias entre instituciones para facilitar el acceso a un mayor número de muestras clínicas. La 129 implementación de estas mejoras podría ayudar a superar los desafíos encontrados y proporcionar resultados más robustos y generalizables en futuras investigaciones. Por tanto, nuestro estudio sugiere la viabilidad de UGT2B17 como biomarcador potencial para predecir la respuesta al tratamiento neoadyuvante en CM, aunque se requieren más investigaciones para validar completamente este potencial y entender las implicaciones clínicas de su sobreexpresión. 130 7. CONCLUSIONES 1. En nuestro análisis de expresión génica se identificaron los genes UGT2B10, UGT2B17 y UGT2B28 como potenciales biomarcadores para predecir la respuesta al tratamiento neoadyuvante en pacientes con CM HER2+ RRHH negativos. 1.1 Se encontraron 6251 transcritos con expresión diferencial entre respondedoras y no respondedoras, destacándose 128 genes codificantes, con 44 sobreexpresados y 84 infraexpresados en las pacientes no respondedoras. 1.2 El análisis de enriquecimiento funcional reveló la participación de UGT2B10, UGT2B17 y UGT2B28 en rutas metabólicas críticas, sugiriendo su potencial modulador en la eficacia del tratamiento neoadyuvante. 2. En la cohorte 2, se evidenció una mayor sobreexpresión de UGT2B17 y UGT2B28 en pacientes no respondedoras al tratamiento neoadyuvante. 2.1 Aunque la curva ROC de UGT2B17 mostró un AUC prometedora (AUC = 0.699) como biomarcador potencial, se requieren estudios adicionales para validar su utilidad clínica. 2.2 UGT2B17 podría estar involucrado en la metabolización de antraciclinas, sugiriendo un posible papel en la respuesta al tratamiento en pacientes con CM HER2 positivo y RRHH negativos. 3. Las cohortes de pacientes con cáncer de mama HER2+ RRHH negativos tratadas con neoadyuvancia mostraron homogeneidad en características clínicas y patológicas a excepción de la prevalencia de obesidad en la cohorte 2 en comparación con la 1 lo que sugiere que factores como el estilo de vida podrían estar influyendo en esta diferencia, más allá de la menopausia. 3.1 Las tasas de RCp no mostraron diferencias significativas entre las cohortes debido a la selección equilibrada de pacientes respondedoras y no respondedoras. En la cohorte 2 el doble bloqueo y un mayor grado histológico se asociaron con una mayor incidencia de RCp. 3.2 La cohorte 1 presentó mejores resultados de SLE y SG en comparación con la cohorte 2, aunque no de forma significativa, lo cual puede deberse al sesgo en la selección de las pacientes. 3.3 La falta de diferencias significativas relacionadas con factores como la alteración hepática basal, obesidad y niveles de Ki67 sugiere que éstos no influyen de manera significativa en la expresión de los genes analizados en las cohortes estudiadas. 131 8. BIBLIOGRAFÍA 1. Sung PH, Ferlay J, Siegel RL, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;68(6):1–41. 2. REDECAN. Red Española de Registros de Cáncer. [último acceso el 08/01/2024]. Disponible en: https:// www.redecan.org 3. Sociedad Española de Oncología Médica (SEOM). 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