Neurotoxicidad por exposición a microcistinas y cilindrospermopsina

NEUROTOXICIDAD POR EXPOSICIÓN A MICROCISTINAS Y CILINDROSPERMOPSINA Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Grado en Farmacia Álvaro Díaz Ballesta Universidad de Sevilla Facultad de Farmacia Grado en Farmacia Trabajo Fin de Grado NEUROTOXICIDAD POR EXPOSICIÓN A MICROCISTINAS Y CILINDROSPERMOPSINA Facultad de Farmacia, Sevilla. 4 de julio 2016 Álvaro Díaz Ballesta Dpto. Nutrición y Bromatología, Toxicología y Medicina Legal Área de Toxicología Tutores Dr. Daniel Gutiérrez Praena Dra. Remedios Guzmán Guillén Trabajo de Revisión Bibliográfica -1- ÍNDICE Resumen 3 1. Introducción 4 1.1. Cianotoxinas 5 1.1.1. Microcistinas 6 1.1.2. Cilindrospermopsina 8 1.2. Vías de exposición a cianotoxinas 10 1.3. Efectos por exposición a cianotoxinas 10 2. Objetivos 10 3. Metodología 11 4. Resultados y discusión 12 4.1 Neurotoxicidad de las microcistinas 15 4.2. Neurotoxicidad de la cilindrospermopsina 19 4.3 Neurotoxicidad conjunta de microcistinas y cilindrospermopsina 23 5. Conclusiones 24 Bibliografía 25 -2- ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Floración cianobacteriana en forma de película en la superficie que evita la oxigenación del agua 5 Figura 2: Estructura general de las microcistinas 7 Figura 3: Estructuras de las cilindrospermopsinas 9 Figura 4: Representación gráfica de los resultados de las bases de datos 11 Figura 5: Imagen de la transmisión del impulso nervioso 13 Figura 6: Imagen de los canales iónicos 13 Figura 7: Principales dianas del SNC 14 Figura 8: Comparación estructural de hepatotoxina y neurotoxina 20 Figura 9: Compuestos guanidínicos procedentes de cianobacterias 22 -3- Resumen Las cianobacterias son bacterias fotosintéticas cuya distribución está ampliamente extendida. Presentes en diversos tipos de medios, incluidos suelos, agua de mar, y de forma destacada, en medios dulceacuícolas, estas cianobacterias pueden crecer o proliferar en diversos entornos, pero frecuentemente en aquellos que han sufrido la influencia del ser humano, entre las cuales cabe destacar la eutrofización de las aguas por enriquecimiento de estas y por aumentar el tiempo de exposición a la luz solar y su estancación. Muchas especies de cianobacterias tienen la capacidad de producir en su metabolismo sustancias tóxicas (cianotoxinas) que ejercen sus efectos en multitud de organismos, desde plantas y animales hasta los humanos. Las cianotoxinas, en especial las microcistinas (MCs) y la cilindrospermopsina (CYN), pueden alcanzar concentraciones que entrañen riesgos para la salud al entrar en contacto con ellas directa o indirectamente. Estas cianotoxinas provocan daños en diferentes órganos y tejidos, actuando como hepatotoxinas, citotoxinas, neurotoxinas o dermatotoxinas, entre otras. Aunque las MCs son ampliamente conocidas como hepatotoxinas y la cilindrospermopsina como una citotoxina, también se han observado efectos neurotóxicos por exposición a dichas toxinas. Las MCs inducen estrés oxidativo a nivel cerebral, hiperfosforilación e inhibición de la actividad proteín fosfatasa y cambios en el comportamiento y la actividad de peces, entre otras. Por contraposición, la neurotoxicidad de la CYN aún no está completamente estudiada, pero se ha demostrado que aumenta el estrés oxidativo y la peroxidación lipídica, inhibe la actividad acetilcolinesterasa e induce diferentes alteraciones histopatológicas en cerebro de diversos organismos acuáticos. Así, el objetivo de la presente revisión bibliográfica es describir el potencial neurotóxico de MCs y CYN en líneas celulares y diferentes modelos animales. Palabras clave: cianobacterias, cianotoxinas, microcistinas, microcistina-LR, cilindrospermopsina, neurotoxicidad -4- 1. Introducción Las cianobacterias son un grupo de bacterias Gram negativas, antiguamente denominadas "algas verde-azuladas", que crecen en aguas eutrofizadas (Woese, 2002; Herrero y Flores, 2008). Estas cianobacterias son capaces de crear floraciones, crecimientos explosivos por la multiplicación de las cianobacterias producto del aumento de la concentración de nutrientes, las cuales son cada vez más frecuentes debido a la contaminación de las aguas en todo el planeta. Este deterioro del agua se produce por el aumento de nutrientes, entre ellos fósforo y nitrógeno, provenientes principalmente de aguas residuales que no han sido tratadas correctamente, y residuos de la industria agrícola y ganadera (Briand y cols; 2003). Dichas floraciones se encuentran principalmente en aguas tropicales y subtropicales (Hawkins y cols., 1985; Hayman, 1992), si bien hoy día pueden encontrarse en reservorios de agua por todo el mundo, desde la tundra ártica hasta desiertos (Chorus y Bartram, 1999; Doyle, 2006; Chatziefthimiou y cols., 2016). Las cianobacterias poseen una serie de características que les aportan ciertas ventajas competitivas: en condiciones de poca luz, pueden mantener una tasa de crecimiento superior al resto de organismos fitoplanctónicos presentes (Chorus y Bartram, 1999); poseen vesículas gaseosas con las que regulan su flotabilidad y poder posicionarse donde la disponibilidad de luz y nutrientes sea óptima (Walsby y cols., 1989); poseen gránulos de reservas de fosfato y tienen poco requerimiento de nitrógeno. También influyen el pH y la temperatura, siendo las más idóneas entre los 20ºC y 30ºC, y un pH básico o neutro. Por esta razón, las épocas en las cuales estas floraciones se dan con mayor frecuencia son verano y otoño. Las floraciones de cianobacterias producen numerosos efectos secundarios tales como anoxia en el área de crecimiento al formar una película en la capa superior evitando así la oxigenación del agua (Fig. 1), ocasionando la muerte de algunos organismos acuáticos, la síntesis de sustancias que producen un olor y sabor desagradables, y principalmente la síntesis de cianotoxinas (Duy y cols., 2000; de Figuereido y cols., 2004). -5- Figura 1: Floración cianobacteriana en forma de película en la superficie del agua que evita la oxigenación del agua. 1.1. Cianotoxinas Las cianotoxinas pueden clasificarse atendiendo a los órganos o sistemas donde ejercen sus efectos tóxicos: 1. Hepatotoxinas: su acción principal se produce en el hígado. Hay dos familias principales de cianotoxinas que afectan al hígado: a) Microcistinas: producidas por un gran número de géneros, entre los que destaca Microcystis, Anabaena, Planktothrix y Oscillatoria. Son las que mayor relevancia tienen a la hora de hablar de intoxicaciones en animales y humanos. b) Nodularinas: producidas por el género Nodularia. Son péptidos cíclicos que inhiben las fosfatasas de proteínas serina y treonina (PP1 y PP2A), son precursores de tumores e inducen estrés oxidativo y apoptosis (Florczyk y cols., 2014). 2. Citotoxinas: pueden ejercer su acción sobre cualquier célula del organismo. Destaca principalmente la cilindrospermopsina (CYN). Producida por Cylindrospermopsis raciborskii y Chrysosporum ovalisporum (denominada antiguamente Aphanizomenon ovalisporum), entre otras. 3. Neurotoxinas: ejercen su efecto tóxico sobre el sistema neuromuscular. Entre ellas se encuentran anatoxina-a (ATX-a) y anatoxina-a(s), producidas por diferentes especies de cianobacterias de los géneros Anabaena, Microcystis y Oscillatoria, así como la saxitoxina, producida por dinofagelados marinos, -6- aunque también la producen cianobacterias como Aphanizomenon flosaquae, Anabaena circinalis y Planktothrix spp. La anatoxina-a es un alcaloide bicíclico que actúa como agonista potente de los receptores nicotínicos musculares y neuronales, produce despolarización en la membrana y desensibilización (Carneiro y cols., 2015). La anatoxina-a(s) es un éster cíclico de N- hidroxiguanina, cuya acción es la inhibición irreversible de la acetilcolinesterasa (AChE), enzima que cataliza a acetilcolina (ACh) (Molica y cols., 2005; Carneiro y cols., 2015). 4. Dermatotoxinas: destacan lyngbyatoxina A y aplysiatoxina, ambas producidas por diferentes especies de cianobacterias como los géneros Lyngbya y Oscillatoria. Las primeras intoxicaciones humanas por consumo de agua contaminada con cepas tóxicas de cianobacterias fueron descritas en Australia, Inglaterra, China y Sudáfrica (WHO, 2003). El episodio más grave ocurrido fue en Brasil en el año 1996, donde murieron más de 50 pacientes sometidos a hemodiálisis en los que el agua utilizada estaba contaminada por cianotoxinas, concretamente con microcistina-LR (MC-LR) (Jochimsen y cols., 1998). 1.1.1. Microcistinas Las microcistinas (MCs) son el grupo de cianotoxinas más extendido. En su mayoría están producidas por los géneros Anabaena, Anabaenopsis, Hapalosiphon, Microcystis, Nostoc, Oscillatoria, y Planktothrix (Prieto y cols., 2007). Son heptapéptidos cíclicos que contienen tanto aminoácidos proteicos como no proteicos. Además poseen un aminoácido en posición C20 hidrofóbico conocido como Adda (3- amino-9-metoxi-10-fenil-2,6,8-trimetil-deca-4,6-ácido dienoíco) (Fig. 2). -7- Posición 4 Posición 2 MC-LR Arginina Leucina MC-RR Arginina Arginina MC-YR Arginina Tirosina Figura 2: Estructura general de las microcistinas. Adaptado de Chorus y Bratram, 1999. El aminoácido Adda es considerado el principal responsable de la toxicidad de las MCs ya que se une covalentemente al residuo de cisteína de la PP1 y PP2, produciendo su inhibición (Songs y cols., 2006). Existen más de 100 variantes de MCs, derivadas de diferentes modificaciones estructurales de los L-aminoácidos en las posiciones 2 y 4, siendo la más común la microcistina-LR (MC-LR), con un residuo de leucina (L) en la posición 2 y de arginina (R) en la posición 4 (Singh y cols., 2015). Otras variantes son la MC-RR, con las posiciones 2 y 4 ocupadas por residuos de arginina (R), y la MC-YR con un residuo de tirosina (Y) en la posición 2 y arginina (R) en la 4 (Fig. 2). Además, pueden sufrir hidroxilaciones, metilaciones y epimerizaciones que dan lugar a diferentes isoformas (Neilan y cols., 1999). Una misma cepa productora puede producir, además, más de una variante de MC a la vez, siendo más frecuentemente encontradas en el interior celular. De entre las MCs citadas anteriormente, la MC-LR es la más tóxica y la más ampliamente estudiada (Sivonen y Jones, 1999). Después de ser ingerida, la MC-LR se transporta a través del íleon hacia el torrente sanguíneo (Falconer y cols., 1992) por donde llega al hígado, donde se concentra. Ahí atraviesa la membrana celular del -14- Figura 7: Principales dianas del sistema nervioso central de las cianotoxinas (ilustradas como círculos verdes). a) Barrera hematoencefálica; b) Canales iónicos; c) Sinapsis. Tomado de Florczyk y cols. (2014). La neurotoxicidad de las saxitoxinas radica en el bloqueo de los canales iónicos de sodio en la membrana celular del axón del nervio (van Apeldoorn y cols., 2007). Además, también se ha observado que estas toxinas pueden bloquear los canales de calcio (Su y cols., 2004). Los canales de sodio y de calcio están significativamente coordinados en la regulación de las vías de transducción de señales, incluyendo entre estas, la apoptosis y el ciclo celular, por lo que las saxitoxinas pueden afectar a los organismos a estos niveles (Belkacemi y cols., 2005). Las saxitoxinas también pueden afectar a las células lisas del músculo cardíaco al influir en los canales de potasio, lo que a su vez conduce a la alteración en el flujo de iones de la célula, conllevando a la alteración de la homeostasis celular (Wang y cols., 2003). La anatoxina-a y la homoanatoxina-a son potentes agonistas de los receptores nicotínicos neuronal y muscular de ACh (Aráoz y cols., 2010). La anatoxina-a es un falso neurotransmisor que, al no ser degradado por la AChE, interactúa con el receptor nicotínico de manera continua, de forma que el canal permanece activo, lo que provoca un flujo constante de iones de sodio a las células, provocando la despolarización de la membrana (Valério y cols., 2010). Además, es capaz de inhibir de manera irreversible a la AChE y provocar así el aumento de la concentración de la ACh en el espacio sináptico, lo que tiene como consecuencia una estimulación continua del sistema neuronal (Molica y cols., 2005). La homoanatoxina-a aumenta la liberación de -15- ACh desde los nervios colinérgicos periféricos al provocar la apertura de canales neuronales endógenos dependientes de calcio de tipo L (Aas y cols., 1996; Lilleheil y cols., 1997). Las nodularinas (NODs) requieren un transporte activo a través de la membrana celular, también pueden atravesar la barrera hematoencefálica usando, entre otros, un transportador Oatp/OATP (Feurstein y cols., 2010) o incluso algunos transportadores aún desconocidos. Los OATPs son miembros de la familia transportadora de solutos aniónicos orgánicos (SLCO). Estos SLCO median en la captación de una amplia diversidad de compuestos anfipáticos orgánicos como sales biliares, péptidos aniónicos, esteroides conjugados, hormona tiroidea y también ciertos medicamentos y xenobióticos (Florczyk y cols., 2014). Estos transportadores son independientes de los iones de sodio (Hagenbuch y Meier, 2004). Es conocido que algunos transportadores de iones orgánicos se expresan en diversos tejidos y otros se producen en un sólo tipo de órgano, como por ejemplo en el hígado y el cerebro (Fischer y cols., 2005). Se pensaba que el transportador orgánico Oatp1b2 era específica del hígado de ratas y ratones pero un estudio demostró que sus transcripciones, así como las proteínas, se encontraban presentes en el cerebro (Fischer y cols., 2005). Se ha demostrado la expresión de cinco Oatps específicos de MCs en el ARNm en cerebro de roedores murinos, demostrando que están implicadas en la captación neuronal de MCs (Feurstein y cols., 2009, 2010). 4.1. Neurotoxicidad de las microcistinas Al igual que las NODs, con quienes comparten parecido estructural, las MCs requieren un transporte activo para atravesar la membrana celular. El potencial neurotóxico de las diferentes variantes de MCs depende de la expresión y funcionalidad de los sistemas de transporte Oatps/OATPs en la barrera hematoencefálica (Feurstein y cols., 2010). Entre los efectos neurotóxicos que se han observado en peces expuestos a MCs, se encuentran cambios en el comportamiento y la actividad (Baganz y cols., 1998, 2004; Cazenave y cols., 2008; Kist y cols., 2011). -16- Dos especies de peces, Danio rerio (pez cebra) y Leucaspius delineatus, expuestas a un rango de concentraciones de 0,5-50 µg L-1 MC-LR, sufrieron una reducción significativa de la locomoción durante el día a concentraciones altas, mientras que la concentración más baja causó un aumento de la movilidad de los peces (Baganz y cols., 1998, 2004). Además, Los resultados mostraron diferencias en la actividad nocturna de ambas especies, viéndose reducida en Danio rerio tanto a las concentraciones más altas como las más bajas, y aumentadas en Leucaspius delineatusa a las concentraciones más bajas. Además, los autores también encontraron que Leucaspius delineatus era significativamente más sensible a MC-LR, es decir, sufría los efectos de la toxina antes y durante más tiempo en comparación con Danio rerio. Estos resultados demuestran que las MCs son capaces de alterar los comportamientos y ritmos circadianos. Por otra parte, Cazenave y cols. (2008) estudiaron el impacto de MC-RR en el pez Jenynsia multidentata, demostrando una mayor actividad nocturna a las dosis más bajas (0,01 µg g-1), mientras que a dosis más elevadas (1 µg g-1) no se observaron cambios significativos de la actividad natatoria. Estos cambios propusieron que la hiperactividad observada podría ser indicativa del estrés al que se encontraba sometido el pez, siendo esta hiperactividad un biomarcador de dicha toxicidad. Un estudio realizado por Wang y cols. (2010a) mostró una sorprendente acumulación de MC-LR y una mejora en la actividad de la PP a nivel cerebral en Danio rerio después de 30 días de exposición a concentraciones entre 2 µg L-1 y 20 µg L-1. Los autores sugieren que la neurotoxicidad crónica de MC-LR podría inducir estrés oxidativo mediado por ERO y alterar las vías endocrinas de señalización, además de activar la vía de las PPs a través de la regulación por incremento de la PP2C en el cerebro del pez cebra. En concreto podría tratarse de una regulación positiva de PP2Cα2 tras la exposición a 2 μg L-1 de MC-LR. No obstante, dosis letales (20 μg L-1) de MC-LR inhibieron la actividad de la PP (Wang y cols., 2010a). La sobreexpresión de la PP2Cα2 conduce a la inhibición del ciclo celular en las fases G2/M, lo que inhibe la división celular, y a la apoptosis por medio de la vía de activación de la proteín quinasa p53 (Ofek y cols., 2003). La sobreexpresión de la PP2Cα2 podría estar involucrada en la interrupción de la vía de las proteín quinasas AMPK y MAPK, lo que produce una -17- inhibición en la regulación del balance energético celular. Sin embargo, podría tratarse de un efecto compensatorio por parte de las células en respuesta al ataque de la toxina (Wang y cols., 2010b). Además, esta exposición en el estudio de Wang y cols. (2010a) dio lugar a la alteración de los niveles de diferentes proteínas implicadas en el ensamblaje del citoesqueleto, transducción de señales, degradación proteica, metabolismo, transporte, apoptosis y traducción del ADN, además de otros trastornos en el citoesqueleto por la acumulación de tubulina plegable cofactor B (TFCB por sus siglas en inglés). La acumulación de dicha proteína produce una despolimerización en los microtúbulos, inhibición del crecimiento, daño en el axón, y en consecuencia, un importante deterioro neuronal (López-Fanarraga y cols., 2007). Los cambios en el citoesqueleto resultan en la pérdida de la estructura celular y además se crean obstáculos en la mitosis (Mezhoud y cols., 2008). Estas respuestas indican que la neurotoxicidad de la MC-LR en los peces es compleja y diversa, e involucra varias vías moleculares. En el trabajo realizado por Wang y cols. (2010b) se observó un cambio en el proteoma del cerebro del pez cebra después de su exposición a MC-LR; asimismo también observaron que podría reducir los niveles de proteína Ywhai (perteneciente a la familia 14-3-3, un adaptador proteico específico de fosfoserina, que se une a la proteína Bad y previene la apoptosis). El descenso en la regulación de la proteína Ywhai produciría una liberación de proteína Bad fosforilada en el citoplasma, induciendo así una actividad pro-apoptótica. Por otra parte, la exposición del nematodo Caenorhabditis elegans a MC-LR produjo cambios en la locomoción (Ju y cols., 2013). Estos autores encontraron pérdida neuronal y cambios morfológicos neuronales en las neuronas GABAérgicas, que tienen como neurotransmisor el GABA, cuya principal función es la inhibición de la excitabilidad neuronal del sistema nervioso, por lo que cambios en las neuronas GABAérgicas producirían una inhibición de la disminución de la excitación del sistema nervioso. No obstante, no observaron cambios en las neuronas colinérgicas, serotoninérgicas, dopaminérgicas o glutaminérgicas. Estos resultados mostraron una -18- potente neurotoxicidad de MC-LR, sugiriendo el diseño y planificación de nuevos estudios sobre la neurotoxicidad de las MCs. La prueba experimental que demuestre que las MCs son realmente capaces de causar efectos adversos en las neuronas puede provenir de estudios a nivel proteómico (Ju y cols., 2013). El control de los biomarcadores de estrés oxidativo en los tejidos afectados son indispensables para indicar la complejidad de los efectos neurotóxicos producidos por las MCs (Ju y cols., 2013). Chen y cols. (2006) demostraron que la MC-LR afecta especialmente a la aldehído deshidrogenasa mitocondrial 2 (ALDH2) en cultivos celulares de hígado humano. De esta manera, en un ensayo posterior sobre D. rerio se observó una notable disminución en la expresión de la misma enzima (ALDH2) en el cerebro, lo cual coincidía con la expresión de la ALDH 9A1a (Wang y cols., 2010a). Estos daños provocan una disminución del metabolismo de los aldehídos, que es un claro indicador de daño en el ADN, inactivación enzimática o modificación proteica (Lindhal, 1992; O'Brien y cols., 2005). Se han identificado seis proteínas diferentes en el hipocampo de ratas inducidas por MC-LR y que están implicadas, junto con la toxina, en el estrés oxidativo y en la respuesta apoptótica: proteína ácida fibrilar glial (GFAP), proteína de choque térmico (Hsp75), peroxirredoxina 2 (Prdx2), superóxido dismutasa (SOD) y fosfoproteína inducida por estrés (Stip1) (Li y cols., 2012). Los sistemas de defensa frente a ERO comprenden la inducción de estos marcadores (Hsp75, SOD y Prdx2). Posteriormente, los mismos autores demostraron la inducción de septina-5, internexina-a y sinucleína-a, conocidas por estar relacionadas con patologías neurodegenerativas y que podrían estar implicadas en la progresión del Alzheimer (Son y cols., 2005). Por otra parte, Wang y cols. (2010a) demostraron que la isquemia transitoria en los cerebros de jerbo (Dipus saggita) disminuyó la expresión de ARNm de la betaactina, debido al estrés oxidativo causado por MC-LR, coincidiendo con otros estudios que consideran la actina como objetivo directo de las modificaciones oxidativas (Fiaschi y cols., 2006; Lassing y cols., 2007). La beta-actina es una proteína mayoritaria de los filamentos de actina, presente en las áreas sinápticas donde desempeña un -19- papel importante en la adhesión celular, el crecimiento de neuritas (células nerviosas inmaduras) y la formación de sinapsis, además de estar involucrada en la liberación de neurotransmisores en el espacio sináptico (Asanuma y cols., 1993; Sobue y Kanda, 1989). Esto demuestra que la disminución de los niveles de ARNm de beta-actina provoca estrés oxidativo, alteraciones del citoesqueleto o, incluso, muerte neuronal (Asanuma y cols., 1993). Li y cols. (2012) demostraron que la MC-LR hiperfosforila a la proteína tau, la principal proteína de los microtúbulos neuronales asociados con el ensamblaje, la estabilización y el mantenimiento de la morfología normal de los microtúbulos axonales (Goode y cols., 1997). Los estudios han demostrado que la PP está involucrada en la regulación de la fosforilación de la proteína tau (Feurstein y cols., 2011). La inhibición de la actividad de la PP en las neuronas conlleva una hiperfosforilación y agregación de la proteína tau, provocando daños neuronales degenerativos y apoptosis, daño neuronal muy similar a los observados en el cerebro de pacientes con Alzheimer (Li y cols., 2012). Estos mismos autores también observaron deterioro de la memoria y de la función cognitiva en ratas expuestas a la MC-LR, deterioro que también se asocia con la enfermedad del Alzheimer como resultado de la inhibición de la PP. Como resumen de los efectos neurotóxicos de las MCs, se puede destacar que son capaces de provocar cambios conductuales importantes, pérdida neuronal y cambios morfológicos severos. Producen inducción de estrés oxidativo e importantes cambios en el citoesqueleto, influyen en la actividad PP, producen hiperfosforilación de la proteína Tau y perturban la producción de energía y el metabolismo de los ácidos orgánicos. 4.2. Neurotoxicidad de la cilindrospermopsina Aunque la CYN tiene un conocido efecto citotóxico, pocos son los trabajos donde se demuestra su actividad neurotóxica concretamente. -20- Un estudio llevado a cabo por Kiss y cols. (2002) sobre neuronas de dos especies de caracoles, Helix pomatia y Lymnaea stagnalis, demostró que tras exposición a CYN, había una notable disminución de la respuesta neuronal a la ACh, lo que disminuye la actividad del sistema nervioso. Estos datos no son de extrañar, ya que en cuanto a estructura química, la CYN está más relacionada con las neurotoxinas (saxitoxina), ya que presenta una mayor semejanza estructural con éstas que con las hepatotoxinas (MC-LR), como puede destacarse, por ejemplo, en la presencia de un núcleo de acetato guanidínico tanto en la CYN como en la saxitoxina, que como se verá posteriormente, está presente en las primeras etapas de la síntesis de algunas cianotoxinas neurotóxicas (Kiss y cols., 2002) (Fig. 8). Figura 8: Comparación estructural de la CYN entre 2 compuestos: una hepatotoxina (MC-LR) y una neurotoxina (saxitoxina). Adaptado de Florczyk y cols. (2014) Otro estudio demostró que los caimanes encontrados en el lago Griffin (Florida) durante una floración de C. raciborskii presentaban una respuesta clínica deprimida, reducción en la velocidad de la conducción nerviosa, degeneración axonal y necrosis en el mesencéfalo (Schoeb y cols., 2002). Posteriormente, Zagatto y cols. (2012) estudiaron el efecto neurotóxico tras una inyección intraperitoneal del extracto de C. raciborskii en ratones de laboratorio. Dosis de 50 mg kg-1 revelaron síntomas típicos de neurotoxicidad como temblores, ataxia, convulsiones y muerte por parada respiratoria en 1 ó 2 minutos. Además, -21- efectos de toxicidad aguda y crónica se observaron en Daphnia similis y Ceriodaphnia dubia, como inmovilización y reducción de la condición física, respectivamente; se observó toxicidad crónica en larvas de Danio rerio (Zagatto y cols., 2012). El trabajo realizado por Saker y cols. (2003) mostró síntomas neurológicos en ratones al inyectar un extracto de C. raciborskii por vía intraperitoneal (1337-1572 mg kg-1). Se observaron síntomas como piloerección, letargia y dificultades respiratorias que conducían a la muerte en un máximo de 24 horas tras su exposición. Por otro lado, Guzmán-Guillén y cols. (2015) demostraron que los peces tilapia (Oreochromis niloticus) expuestos a CYN presentaban neurotoxicidad por inhibición de la AChE y aumento en los niveles de LPO en cerebro. Más concretamente, se observó una inhibición de la actividad de la AChE del 35% y un incremento del 71% en la LPO después de una exposición a la toxina de 14 días. En este sentido, cuando se analizó el cerebro de los peces, se detectó la toxina en el 100% de las muestras analizadas en un rango de concentraciones de 0,83 a 5,48 ng/g, no obstante, no se observaron cambios macroscópicos que indicasen algún tipo de patología. Sin embargo, cuando las muestras de cerebro se estudiaron al microscopio óptico y electrónico se observaron procesos degenerativos e indicios de necrosis. Al microscopio óptico se observaron pequeñas neuronas necróticas y basófilos con bordes irregulares, además de procesos hiperémicos y hemorrágicos. La observación al microscopio electrónico del cerebro reveló alteraciones en el núcleo y el citoplasma de las neuronas, que muestran una densificación de la cromatina y vacuolas con bordes irregulares en el núcleo. La matriz citoplasmática aparece densificada, homogénea, oscura y con una fuerte vacuolización de todos los orgánulos membranosos. El neuropilo también mostró modificaciones vasculares, procesos hiperémicos, edema y microhemorragias. El guanidinoacetato (GAA) es un compuesto estudiado por su implicación como intermediario en la síntesis de CYN, además puede afectar al sistema nervioso e inducir hiperhomocisteinemia, siendo un factor de riesgo cardiovascular (Barón-Sola y cols., 2015). La toxicidad del GAA ha sido atribuida a su capacidad de aumentar el número de ERO en diversos tejidos y la inhibición de la AchE en el córtex cerebral del gato común (Felis silvestris catus) (Mori y cols., 1996; Zugno y cols, 2008). De esta -22- manera, el sistema nervioso queda especialmente afectado por todas estas alteraciones. Además, el GAA actúa como un agonista de los receptores GABAA neuronales y puede causar disfunción en las neuronas del globo pálido (Neu y cols., 2002). Aunque los diferentes pasos implicados en la biosíntesis de CYN no están totalmente esclarecidos aún, hay evidencias genéticas y bioquímicas que indican que el GAA se forma en la primera etapa de la ruta metabólica debido a la actividad de una amidinotransferasa (Burgoyne y cols., 2000). Figura 9: Ejemplos de compuestos guanidínicos sintetizados por cianobacterias. Adaptado de Barón-Sola y cols. (2015). Barón-sola y cols. (2015) analizaron y compararon el contenido de GAA en cultivos de diversos tipos de cianobacterias, tanto productoras como no productoras de CYN. Los resultados obtenidos mostraron que el GAA se acumuló en todas las cepas estudiadas. Estos resultados mostraron la posibilidad de que el GAA contribuye a la toxicidad de las cianobacterias, y podría ser la causa de una mayor toxicidad en los extractos de cianobacterias en comparación con las cianotoxinas de manera aislada. Si el GAA contribuye a la toxicidad de las cianobacterias, y forma parte de la síntesis de la CYN, es posible que esta también exerte efectos neurotóxicos similares -23- debido a las similitudes estructurales (Fig. 9). No obstante, no hay suficientes estudios que enfoquen al GAA como potenciador de la neurotoxicidad de la CYN. Por lo tanto, como resumen de la neurotoxicidad de las CYN se destaca su capacidad de inhibir la actividad AchE, de aumentar la LPO y de inducir cambios histopatológicos importantes, como necrosis, procesos hiperémicos y microhemorrágicos. Aunque actualmente existe cierta controversia sobre la neurotoxicidad de la CYN (Poniedziałek y cols., 2012) se deberían llevar a cabo más estudios en esta área para confirmar los efectos de la toxina a este nivel, de manera que la neurotoxicidad de la CYN no se puede excluir. 4.3. Neurotoxicidad conjunta de microcistinas y cilindrospermopsina Aunque la mayoría de estudios referentes a los efectos tóxicos de las cianotoxinas se han llevado a cabo con exposiciones a las toxinas individuales, generalmente estas cianotoxinas no se encuentran aisladas en el entorno, ya que en los medios acuáticos donde proliferan las cianobacterias suelen concurrir varios tipos de especies productoras de diferentes toxinas (Florczyk y cols., 2014). Este hecho puede hacer variar la naturaleza y magnitud de los efectos en los organismos expuestos a las mismas, incluso producir un efecto sinérgico (Takser y cols., 2016). Recientemente, Takser y cols. (2016) estudiaron los efectos, individualmente y en mezcla, de CYN, MC-LR y ATX-a, así como de la neurotoxina Beta-N-metilamino-L- alanina (BMAA), en la línea celular de murino RAW246.7. Observaron que la mezcla de CYN, MC-LR y ATX-a era más tóxica a nivel neuronal que la BMAA. Los resultados de este trabajo sugieren que la CYN tiene un potencial neuroinflamatorio importante, y que una mezcla de CYN, MC-LR y ATX-a es de 3 a 15 más potente en la inducción de apoptosis que estas toxinas de manera individual. La línea celular RAW246.7 ha sido propuesta como modelo de resultados inflamatorios de la neurodegeneración (Khono y cols., 2011; Collin-Osdoby y Osdoby, 2012), así como también han sido usadas las células BV-2 microgliales en estudios neuroinflamatorios (Henn y cols., 2009; Nelson y -30- Gutiérrez-Praena D, Jos A, Pichardo S, Cameán AM. 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