Papel de la microglía en la patogenia de enfermedades neurodegenerativas

FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Trabajo de Fin de Grado “PAPEL DE LA MICROGLÍA EN LA PATOGENIA DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS” SARA HERNÁNDEZ GONZÁLEZ 1 TRABAJO FIN DE GRADO Grado en Farmacia “PAPEL DE LA MICROGLÍA EN LA PATOGENIA DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS” -Trabajo de Revisión Bibliográfica- Sara Hernández González Facultad de Farmacia, Sevilla Julio de 2019 Tutor José Luis Venero Dpto. Bioquímica y Biología Molecular UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE FARMACIA 2 Resumen: La microglía son las células del sistema nervioso central encargadas del mantenimiento de la inmunidad innata, las respuestas de defensa y la correcta conexión sináptica y, por lo tanto, su normal funcionamiento conduce a una homeostasis neuronal. Este estado homeostático se ve alterado tanto en el envejecimiento como en ciertas patologías neurodegenerativas, en las cuales las células de la microglía experimentan una activación que conlleva una excesiva inflamación y con ello la aparición de neurotoxicidad. En estas patologías, como son Alzheimer, Parkinson o Esclerosis Múltiple, donde se llega a observar en ciertos casos la supresión o mutación de genes que codifican para factores de transcripción reguladores de la homeostasis, el fenotipo transcripcional cambia y las células de la microglía expresan en su superficie unas proteínas receptoras específicas. Estos receptores de superficie reconocerán ligandos para dar pie a unas rutas cuyo desenlace será la neuroinflamación y, con ello, el avance desfavorable de estas enfermedades que en la actualidad carecen de tratamiento curativo. Aunque la microglía no sea el principal desencadenante de estas patologías, juega un papel importante en el desarrollo progresivo de la patogenia de estas, lo que lleva a pensar que el posible tratamiento terapéutico pueda estar relacionado con ella. Profundizar en las características que diferencian a la microglía en la salud de aquella en estado patológico y conocer los mecanismos moleculares por los que se producen dichas alteraciones son la base o el primero de los pasos del desarrollo de un potencial tratamiento farmacológico que centre su objetivo en las células de la microglía como diana, modificando o frenando así el transcurso de la enfermedad. Palabras clave: microglía, neurodegeneración, inflamación, fenotipo transcripcional, homeostasis, sistema nervioso central 3 Indice 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 4 2. OBJETIVOS DE LA REVISIÓN .......................................................................................... 4 3. METODOLOGÍA ............................................................................................................ 5 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................... 5 4.1 La microglía. Características y funciones. ........................................................................... 5 4.2 Fenotipos adquiridos por la microglía ................................................................................ 6 4.3 Receptores presentes en la microglía ................................................................................ 8 4.4 Rutas/marcadores de regulación de la activación de la microglía ................................... 11 4.5 Patologías en las que interviene la microglía ................................................................... 14 4.5.1 Alzheimer ............................................................................................................ 14 4.5.2 Parkinson ............................................................................................................. 16 4.5.3 Esclerosis Lateral Amiotrófica ............................................................................. 17 4.5.4 Esclerosis múltiple ............................................................................................... 17 4.6 Microglía con fenotipo DAM ............................................................................................ 18 4.6.1 Ruta de señalización TREM2-Apo E ........................................................................... 19 4.7 Microglía como diana para tratamiento .......................................................................... 21 4.7.1 Moléculas utilizadas .................................................................................................. 22 4.7.2 Biomarcadores .......................................................................................................... 23 5. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 24 6. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 25 4 1. INTRODUCCIÓN A partir del siglo XX y gracias a los avances científico-técnicos acontecidos hasta el día de hoy, la esperanza de vida humana ha aumentado considerablemente, aunque siguen existiendo limitaciones. Una de las causas de mortalidad que ha aumentado, así como su prevalencia e incidencia, con la consecuencia de un gran impacto económico y social son las enfermedades neurodegenerativas. Tras largos períodos de investigación, el origen biológico de las enfermedades neurodegenerativas sigue siendo en su mayor parte desconocido, propiciando que estas sean incurables y que los fármacos o terapias que existen frente a ellas sean únicamente para prevenir o frenar su aparición y alargar la supervivencia y calidad de vida. Para poder enfrentarnos a estas, es necesario analizar los factores que intervienen en las mismas. La microglía, como encargada de la inmunidad innata del SNC, juega un papel importante en la patogenia de este tipo de enfermedades en las cuales se ve afectada, adoptando un fenotipo distinto a aquel en condiciones fisiológicas. Por ello, la actividad de la microglía, sus correspondientes factores de transcripción y multitud de genes que modulan su actividad (receptores, factores de complemento, interleucinas) están siendo objeto principal de estudio tanto en la salud como en el contexto de la neurodegeneración, propiciando un conocimiento mayor de esta y abriendo camino a una potencial intervención terapéutica que frene el desarrollo de este tipo de patologías del sistema nervioso central. 2. OBJETIVOS DE LA REVISIÓN Con esta revisión se persigue describir las funciones de la microglía en estado de homeostasis y describir los fenómenos que llevan a su desregulación, presente en las principales patologías neurodegenerativas. Además, pretende analizar cómo se regula la firma de la microglía en la enfermedad a través de los cambios en los niveles de sus principales factores de transcripción, que regulan los niveles de expresión de citosinas (como interleucinas), quimiocinas proinflamatorias, factores estimulantes de colonias, receptores de superficie para ligandos proinflamatorios (como TREM2, receptores Scavenger, receptores tipo Toll), inflamasomas, moléculas asociadas a complemento, especies reactivas de oxígeno o nucleótidos proinflamatorios, entre otros, encargados de provocar neuroinflamación. Por último, la parte final de la revisión concluye proponiendo un posible uso de la microglía como diana de tratamientos farmacológicos en las distintas fases de las enfermedades neurodegenerativas, en las cuales aumentar la actividad o inhibir la microglía repercute de forma favorable a frenar el desarrollo de la patología. 5 3. METODOLOGÍA Se ha recogido información de la base de datos bibliográfica especializada en el campo de la salud, PubMed (NCBI), de donde se han obtenido tanto artículos científicos experimentales como las revisiones en las cuales se basa este TFG. Se trata de un conjunto de revisiones en inglés de entre los años 2012 y 2018, publicadas en revistas científicas tales como Nature Neuroscience, Trends in Molecular Medicine, Nature Medicine, The Journal of Clinical Investigation, Immunity o Cell, entre otras. Para obtener los textos completos se ha utilizado la oferta biliográfica brindada por la Universidad de Sevilla (bib.us.es). 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 La microglía. Características y funciones. La microglía es el conjunto de células primarias de inmunidad innata del SNC que aparecen en el estado embrionario y se va renovando a lo largo de la vida adulta. Se origina en el saco embrionario, en el mesodermo, y se genera a partir de las células hematopoyéticas (Butovsky y Weiner, 2018). En condiciones fisiológicas se encarga de la defensa, la respuesta inmune y el mantenimiento de la homeostasis del SNC (Shen et al., 2018). Desde el comienzo de la vida del ser humano actúa como modelador del SNC, redefiniendo la red de sinapsis y las conexiones cerebrales. Esto lo realiza fagocitando axones y conexiones sinápticas erróneas, contribuyendo al desarrollo del cerebro dando forma a los circuitos neuronales. Su función es la de un macrófago tisular, fagocitando también células apoptóticas. Por ello las células de la microglía expresan numerosos y diferentes factores estimulantes de macrófagos, que también son expresados por las demás células inmunitarias. La discrepancia está en que estas últimas lo hacen en cantidades distintas, lo que nos permite diferenciar cuál de ellos está actuando según el nivel de expresión de cada factor (Butovsky y Weiner, 2018). También se puede reconocer o distinguir de las demás por su unión a anticuerpos específicos. La microglía, además, contribuye al desarrollo de los oligodendrocitos, las células que mielinizan los axones en el sistema nervioso central (Butovsky y Weiner, 2018). Diversos estudios concluyen que la microglía secreta factores tróficos solubles para incrementar la proliferación neuronal y promover la diferenciación neuronal in vitro, promoviendo así que se dé de forma favorable tanto la neurogénesis como la oligodendrogénesis (Hagemeyer et al., 2017). 6 El papel de la microglía en condiciones fisiológicas no es del todo conocido, sin embargo, el estudio de su desregulación está aportando conocimiento mediante el análisis de su papel durante el desarrollo de patologías cerebrales. 4.2 Fenotipos adquiridos por la microglía La microglía mantiene la homeostasis en el cerebro en condiciones fisiológicas, y conduce a la fagocitosis y media una respuesta neuroinflamatoria de reparación del tejido ante el daño cerebral. Cuando está expuesta a patógenos se polariza a un fenotipo proinflamatorio y libera factores inflamatorios para defenderse de la infección. También actúa facilitando el reclutamiento de monocitos al SNC. Por todo ello, podría decirse que en condiciones de salud la microglía tiene un perfil transcripcional específico y una expresión de proteínas de superficie diferente a aquel que expresa en la enfermedad o con el envejecimiento. (Butovsky y Weiner, 2018). Cuando comenzaron los primeros estudios de la microglía, esta se clasificaba fenotípicamente según la expresión de citoquinas y células de superficie en dos perfiles (figura 1): M1: fenotipo proinflamatorio o neurotóxico. Estimulado por lipopolisacáridos o interferón gamma in vitro y asociado a la producción de factores inflamatorios incluyendo IL-1β, TNF-α y óxido nítrico. M2: fenotipo antiinflamatorio. Estimulado por IL-4 ó IL-13, conduciendo a la producción de factores como IL-10 y arginasa-1 que promueven la remodelación del tejido. También se produce la liberación del factor de crecimiento o citoquina TGF-β, con un papel inmunitario homeostático importante por su función inmunosupresora y antiinflamatoria. Este fenotipo antiinflamatorio se subdivide en M2a, M2b y M2c según su mecanismo de activación (Walker y Lue, 2015). Estos estados de polarización se encuentran detallados en la figura 1, junto con los marcadores tanto solubles como de superficie que expresa la microglía en cada uno de dichos fenotipos. 7 Figura 1. Posibles marcadores de fenotipo microglial del sistema nervioso central. Esquema que ilustra los distintos marcadores o indicadores que podrían ser usados para identificar los diferentes fenotipos en el cerebro humano. Los datos muestran marcadores obtenidos de más de un estudio. Se incluyen marcadores cuya función sugiere su polaridad (ejemplo: C200R, CD33 y TREM2) pero sus datos no han sido publicados en microglía humana. Ligando de quimiocina CCL, receptor de CD200 CD200R, receptor de factor estimulante de colonias 1 CSF-1R, molécula adaptadora de unión a calcio ionizado IBA1, interferón gamma IFN-γ, interleuquina IL, lipopolisacárido LPS, factor de crecimiento transformante TGF, factor de necrosis tumoral TNF, receptor activador 2 expresado en células mieloides TREM2. (Adaptación de Walker y Lue, 2015) Dicho esto, es necesario aclarar que el modelo de clasificación M1/M2 es únicamente orientativo, ya que está basado en la polarización de los macrófagos periféricos y que actualmente no refleja de forma exacta la activación de la microglía, pudiendo resultar demasiado simple para explicar los diferentes estados de polarización complejos que esta adquiere in vivo (Shen et al., 2018). Para hablar de estos modelos de activación será más correcto referirse, por ejemplo, al término DAM microglía (microglía asociada a enfermedad) o 8 al fenotipo MGnD “fenotipo de microglía neurodegenerativa”, que definiremos posteriormente. 4.3 Receptores presentes en la microglía La microglía posee ciertos receptores para detectar el daño neuronal. El glutamato, por ejemplo, es abundante en el tejido neuronal y es de los principales neurotransmisores. En situaciones patológicas, el receptor de glutamato puede estar sobreactivado causando daño neuronal o excitotoxicidad. Lo mismo ocurre en estado patológico con el ATP cuando se libera de forma excesiva por parte de las células dañadas (Shen et al., 2018). Esto se traduce como señal de peligro en el cerebro, haciendo a las neuronas más susceptibles a la lesión, induciendo una respuesta neuroinflamatoria y promoviendo el reclutamiento de células de microglía y astrogliosis. Otro ejemplo es la adenosina, que actuando sobre su correspondiente receptor en la microglía (A2AR) favorece el estado ameboide de la misma, participando en la reactividad de esta y por lo tanto en la neuroinflamación (Shen et al, 2018) Los receptores principales que se han observado o cuyo número ha incrementado en la microglía activada son (Doens y Fernández, 2014): - Receptores Scavenger (SRs). Participan en la adhesión celular y en la internalización de ligandos lipoproteicos. En la microglía del SNC se describen dos tipos: Los de clase A (SR-A) en sus tres isoformas y los de clase B tipo 2 también conocido como CD36. Ambos están muy asociados a la patogénesis del Alzheimer ya que son capaces de anclarse e internalizar los péptidos β-amiloide provocando la respuesta inflamatoria. - Receptores tipo Toll (TLRs, con tipos del 1 al 9). Reconocen patrones moleculares asociados a daño y a patógenos. La activación de estos receptores desencadena rutas de señalización que conducen a la producción de mediadores proinflamatorios como citoquinas, óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno. Son cruciales como primera línea de defensa contra moléculas tanto endógenas como exógenas y todos los tipos se han asociado a microglía en estado activado y a neurotoxicidad. Los estudios demuestran que, aunque provocan una inflamación como respuesta provocando efectos neurotóxicos, juegan un papel neuroprotector beneficioso en la enfermedad de Alzheimer contribuyendo a la eliminación de la placa β-amiloide. Esto último se refleja en diversos estudios. En uno de ellos in vitro, la estimulación de las células de la microglía con ligandos de TLR4 como lipopolisacáridos demostraba un incremento en la fagocitosis de péptido β-amiloide (Kazuki et at, 2018). Además, ratones con déficit de respuesta a lipopolisacárido mediada por TLR4 (TLR4 Lps-d) mostraban un aumento 15 coinciden con una disminución de genes de homeostasis de la microglía, entre los que destacan P2ry12, P2ry13, CX3CR1, CD33 y Tmem119. Además, DAM incrementa la expresión de genes involucrados en las rutas lisosomales y fagocíticas, incluyendo algunos factores de riesgo conocidos para Alzheimer como ApoE, Ctsd, Lpl, Tyrobp y TREM-2. Dado que esta microglía DAM solo se ha detectado en regiones afectadas en pacientes o en modelos de ratones con dichas patologías, lleva a pensar que este fenotipo es una respuesta del SNC a la patología, sin importar la etiología de esta. En la enfermedad de Alzheimer, la activación de la microglía asociada a placas β-amiloides ocurre en dos fases: la transición de la microglía homeostática a fase 1 DAM (de manera TREM-2 independiente), seguida de la transición a fase 2 DAM (de forma TREM-2 dependiente). Este proceso de activación ocurre cuando se detectan señales de daño neurodegenerativo o patrones moleculares denominados NAMPs (neurodegenerationassociated molecular patterns o patrones moleculares asociados a neurodegeneración), los cuales son reconocidos por los receptores de la microglía, convirtiéndose esta en una microglía asociada a enfermedad cuya función es contener y eliminar el daño. Algunos ejemplos de estos NAMPs pueden ser moléculas dañinas presentes en cuerpos apoptóticos de células neuronales en proceso de muerte, restos de mielina, productos de degradación de lípidos o agregados extracelulares de proteínas típicos en patologías neurodegenerativas (placas β-amiloides) entre otros. Por lo tanto, conociendo esto, se puede afirmar que la microglía DAM aparece en patologías como ELA, Alzheimer, el envejecimiento y la desmielinización. Para asegurar esta teoría se utilizaron modelos de ratones sanos en los que se inyectó neuronas apoptóticas. Esto desencadenó una respuesta fagocítica de emergencia por parte de la microglía, que se unía a los restos de las células y las fagocitaba, mostrando cambios transcripcionales idénticos a los de las células DAM (Butovsky y Weiner, 2018). En estos ensayos in vivo, además, se demuestra que TREM2 es un receptor esencial en la inducción del fenotipo DAM ante mielina dañada. Sin embargo, la microglía DAM, aunque está presente en las patologías neurodegenerativas enumeradas, no puede afirmarse con certeza que tenga un papel perjudicial en dicha enfermedad. Hay hallazgos que ponen de manifiesto de forma más clara que TREM2 y la microglía asociada a enfermedad juegan papeles adicionales en la neurodegeneración, además de la fagocitosis de proteínas mal plegadas. Prueba de ello es un estudio en el cual se inyectan neuronas apoptóticas a ratones deficientes en TREM2 anulando prolongadamente la inducción del fenotipo DAM. Sin embargo, esto no frenó de ninguna forma la actividad fagocítica de la microglía que se encontraba rodeando la zona de inyección (Krasemann et al., 2017). De forma 16 similar, se comprueba que la microglía deficiente en TREM2 fagocitaba las células apoptóticas de forma tan eficiente como lo hace una microglía sin este déficit in vitro (Wang et al., 2015). Todo lo mencionado hace que se piense en las células de la microglía como diana terapéutica en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Distintas observaciones concluyen que potenciar la actividad DAM en estados tempranos de enfermedad, o de manera preventiva antes de que la enfermedad aparezca, puede presentar una estrategia eficaz para desterrar cualquier señal de neurodegeneración tan pronto como esta aparezca. El efecto de la presencia de DAM en estadíos más tardíos de la enfermedad neurodegenerativa necesita ser estudiado de manera más profunda en modelos de animales que reflejen de forma más exacta o representativa las enfermedades humanas (Deczkowska et al., 2018). 4.5.2 Parkinson Se trata de una patología caracterizada por una progresiva degeneración de neuronas dopaminérgicas en la sustancia nigra del SNC y patología Lewy. La proteína α-sinucleína mal plegada se vuelve insoluble y se agrega para formar inclusiones intracelulares en los cuerpos celulares neuronales, denominados cuerpos de Lewy. Todo ello ocurre en un ambiente de inflamación cerebral (Garretti et al., 2019). Aunque faltan por realizar más estudios, se observa que la microglía activada es prominente en modelos de ratones y humanos con Parkinson. Esta activación incluye la expresión del receptor AXL asociado con la microglía. La activación de la microglía parece que se produce vía TAM dependiente, cuyo mecanismo es desfavorable en ratones. TYRO 3, AXL y MER (TAM) son receptores de tirosina quinasa activados por ligandos endógenos, la proteína S (reguladora de la coagulación) y la proteína GAS6 (estimuladora de la proliferación celular), asociados a la vía de señalización que media la respuesta inflamatoria (Tsou et al., 2014). Su función es el control de la estimulación excesiva y el restablecimiento de la homeostasis mediante la inhibición de los receptores tipo Toll proinflamatorios (Malawista et al., 2016). Inicia rutas de transducción de señales que promueven la activación de las células de la microglía, su supervivencia y la fagocitosis (Yeh et al., 2017). De manera similar a lo que ocurre en el Alzheimer, la microglía internaliza y degrada la αsinucleína para eliminarla, pero un defecto en este proceso lleva a la acumulación de αsinucleína extracelular. La microglía se acumula alrededor de los depósitos de alfa-sinucleína y se vuelve proinflamatoria de manera dependiente de los mismos receptores que se unen a la placa β-amiloide, como son CD36 y TLR2 (Kickman et al., 2018) 17 La activación de la microglía en humanos ha sido demostrada por PET y ha sido comprobado que una activación de microglía dependiente de α-sinucleína puede estar relacionada con cambios en el microbioma de modelos de animales y humanos (Butovsky y Weiner, 2018). 4.5.3 Esclerosis Lateral Amiotrófica La enfermedad de ELA se produce por la mutación de diversos genes como SOD1, lo que genera una pérdida de neuronas motoras. Mediante PET se ha observado que la microglía, expresando marcadores proinflamatorios, se sitúa cerca de las neuronas afectadas. La expresión de las mutaciones de SOD1 en la microglía aceleran la enfermedad instaurada, y la activación de la microglía exacerba la muerte de las neuronas motoras. En esta enfermedad, la expresión de la mutación en SOD1 en la microglía interrumpe la regulación de la enzima NADPH oxidasa, provocando una producción neurotóxica excesiva de superóxido. Esto es detectado por la microglía de la misma forma que detecta placa β-amiloide (Alzheimer) o αsinucleína (Parkinson) a través de receptores Toll-like y Scavenger (TLRs y SRs) entre otros, haciéndolo proinflamatorio. Estos descubrimientos sugieren que las dos funciones principales de la microglía alteradas en ELA incluyen la detección de estímulos exógenos y señales de peligro, así como la respuesta del hospedador. Los estudios sugieren que la microglía cambia su fenotipo durante el progreso de la enfermedad, ya que la microglía aislada de ratones con mutación en SOD1 al comienzo de la enfermedad era neuroprotectora, al contrario que la aislada en el estado final de la enfermedad (Kickman et al., 2018). 4.5.4 Esclerosis múltiple Es una enfermedad inflamatoria del SNC en la cual la desmielinización y la neurodegeneración se ha ligado de forma importante a la activación de la microglía. La microglía activada daña los oligodendrocitos a través de diferentes mecanismos incluyendo la secreción de citoquinas proinflamatorias como IL-1, IL-6, TNF-α e IFN-γ, la activación fagocítica y la presentación de antígenos vía CMH clase II a células T CD4+. También se causa daño directo a las neuronas debido a la producción por parte de la microglía de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, induciendo disfunción mitocondrial (Correale et al., 2017). Para demostrar estas afirmaciones de forma experimental se realizan estudios experimentales de encefalomielitis autoinmune (EAE) en los que se utilizan modelos de ratones con inflamación cerebral para estudiar enfermedades desmielinizantes humanas del SNC. En ellos, se observa que los modelos de ratones con Esclerosis Múltiple presentan una microglía con 18 fenotipo transcripcional similar a los observados en los modelos de ELA y Alzheimer, el cual podría contribuir a la enfermedad (Krasemann et al., 2017). En el modelo de ratón de esta patología, la microglía secreta proteasas, citoquinas proinflamatorias (como CCL2), ROS y RNS, y reclutan linfocitos T reactivos causando toxicidad a las neuronas y a los precursores oligodendrocíticos. También contribuye a la cascada inflamatoria la activación de astrocitos (Hickman et al., 2018). En la Esclerosis Múltiple en humanos, la microglía pierde la expresión del marcador homeostático P2RY12, y adopta un fenotipo proinflamatorio que incluye la expresión de marcadores relacionados con la fagocitosis (CD68 o “macrosialina”), presentadores de antígenos (moléculas MHC de clase I y II y antígeno CD68 activador de linfocitos T) y proteínas relacionadas con la producción de especies reactivas de oxígeno (CYBA) (Butovsky y Weiner, 2018). 4.6 Microglía con fenotipo DAM Para comprobar si existían patrones comunes o similares en la microglía observada en las distintas patologías anteriores se procedió a analizar el transcriptoma microglial en modelos de ratón tanto en el envejecimiento como en ELA, Alzheimer y Esclerosis Múltiple (Krasemann et al., 2017). En todos estos modelos de patología se encuentran signos comunes que se asocian a neurodegeneración, y es a partir de entonces cuando se comienza a utilizar el término de “fenotipo MGnD” o “fenotipo de microglía neurodegenerativa”, siendo este muy similar a aquel fenotipo DAM encontrado en los modelos de Alzheimer (Keren-Shaul et al., 2017). Este fenotipo se caracteriza por la inducción de genes relacionados con la señalización de ApoE (proinflamación) y la supresión de la señalización de TGFβ (antiinflamación)(Figura 5). Se observa que, en esta microglía asociada a las respectivas patologías, algunos genes homeostáticos se suprimieron, incluyendo aquellos que codificaban para reguladores de la transcripción Mef2a, Mafb, Sall1 y la proteína 1 de respuesta temprana de crecimiento (Egr1). Además, se incrementó la expresión de genes que codificaban para factores de transcripción como Bhlhe40, Tfec, Ets2 y Atf3 (Krasemann et al., 2017). Otro estudio analizó células mieloides del SNC de ratones con neurodegeneración y se identificó un set de genes coregulados asociados con la enfermedad neurodegenerativa que fue igualmente observado en cerebros humanos de Alzheimer (Friedman et al., 2018). Muchos de estos genes coinciden con el fenotipo de la microglía MGnD, o microglía DAM, término con el que se la denomina finalmente. 19 4.6.1 Ruta de señalización TREM2-Apo E En este momento surge una pregunta principal, que lleva a cuestionarse cómo se regula el perfil de señalización de la microglía en la enfermedad. La microglía en el envejecimiento y en la neurodegeneración cambia su fenotipo y su función, pero se desconocen los mecanismos moleculares responsables de ello (Krasemann et al., 2017). A pesar de ello, cuando en los ensayos ya mencionados con ratones se produce la fagocitosis de neuronas apoptóticas (Butovsky y Weiner, 2018), se observa que el cambio de fenotipo homeostático a microglía DAM es regulado por la activación de TREM2-ApoE vía fosfatidilserina expresada en neuronas apoptóticas (Figura 5). Figura 5. El perfil de la microglía homeostática M0-tolerogénica se convierte en MGnD- neurodegenerativo o DAM. Las neuronas apoptóticas o dañadas (susceptibles de ser fagocitadas por la microglía) expresan fosfatidilserina, que será reconocida por TREM2. Este receptor induce la expresión de la apolipoproteína ApoE, que suprime la expresión de los principales factores de transcripción de la microglía homeostática (Mef2a, Mafb, Sall1, Pu.1) así como la expresión de la señalización TGF-β antiinflamatoria. Se incrementa la producción de miR-155 y con ello la expresión de genes que codificaban para factores de transcripción como Bhlhe40 (marcador neurodegenerativo). (Adaptación de Krasemann et al., 2017) 20 Por tanto, TREM2 es una molécula microglial importante, que demuestra que está involucrada en la regulación de las características de la microglía en la enfermedad (Butovsky y Weiner, 2018). TREM2, como se ha mencionado en apartados anteriores, es un receptor de superficie de la microglía que detecta lípidos asociados a daño. Este interacciona con la proteína TYROBP, también conocida como DAP12, para iniciar rutas de transducción de señales que promueven la activación de las células de la microglía, la fagocitosis y la supervivencia de la microglía. (Butovsky y Weiner, 2018). Estudios de TREM2 realizados concluyen que una variante rara del gen que codifica para TREM2 (mutación R47H) multiplicaba por 4 el riesgo del Alzheimer, y lo mismo ocurría para ApoE, el factor genético de riesgo mayor en Alzheimer tardío (Yeh et al., 2017). Otra enfermedad relacionada con mutaciones y pérdida de función de TREM2 es la enfermedad de Nasu-Hakola (osteodisplasia poliquística pseudomembranosa con leucoencefalopatía), endémica en Finlandia y Japón (Klünemann et al., 2005) Esto se debe a que TREM2 regula la diferenciación de los osteoclastos y la remodelación del hueso. Mutaciones homocigóticas o deleciones de TREM2 también se relacionan con demencia frontotemporal (Guerreiro et al., 2013). Variaciones heterocigóticas de TREM2 se han relacionado con casos de demencia frontotemporal, Parkinson y ELA. Sin embargo, todas ellas necesitan todavía ser confirmadas por más estudios, ya que no está claro si las mutaciones heterocigóticas de TREM2 desencadenan más patologías además de Alzheimer (Yeh et al., 2017). Se estudiaron en modelos de ratones con Alzheimer los efectos del déficit de TREM2 en los estados temprano y avanzado de la enfermedad. El déficit de TREM2 mejoraba la patología amiloide en estados tempranos, pero la empeoraba en estados avanzados, sugiriendo que TREM2 jugaba papeles distintos según el periodo de la enfermedad (Jay et al., 2017). Se encontró que TREM2 también afectaba al metabolismo de la microglía: pacientes con Alzheimer portadores de variaciones de TREM2 con riesgo o ratones con déficit de este receptor tienen abundantes vesículas autofágicas en su microglía (Ulland et al., 2017). Aunque no está totalmente claro cómo TREM2 regula la señalización fenotípica de la microglía, se sabe que reconoce la fosfatidilserina en la superficie de células apoptóticas o dañadas y que inicia la señalización de ApoE (Krasemann et al., 2017). ApoE es un ligando para TREM2 en la microglía. Este se une a neuronas apoptóticas y aumenta la fagocitosis de neuronas por la microglía mediada por TREM2 (Atagi et al., 2015). ApoE también suprime la expresión de los principales factores de transcripción de la microglía homeostática (Krasemann et al., 2017). Además, la 21 eliminación genética de ApoE en la microglía MGnD recupera las propiedades homeostáticas de forma celular-autónoma. Esto sugiere que poner como diana genéticamente a TREM2 suprime la ruta ApoE y restaura la homeostasis de la microglía en ratones con Alzheimer y SOD1 (Krasemann et al., 2017). En el modelo tau de neurodegeneración, la eliminación genética de ApoE o TREM2 también detiene la neurodegeneración, demostrando que esta ruta regula negativamente la propiedad homeostática (Shi et al., 2017). Aunque todo ello pueda llevar a la conclusión de la necesidad de modular TREM2 como tratamiento a largo plazo, se necesita investigación adicional para detectar posibles efectos adversos que puedan surgir de la inhibición de este receptor en otras células mieloides, como los osteoclastos (Yeh et al., 2017) 4.7 Microglía como diana para tratamiento Como se ha descrito a lo largo de los apartados anteriores, las funciones normales de la microglía incluyen la fagocitosis, la apoptosis o modelado sináptico, la quimiotaxis y la regulación de la neurogénesis e inmunidad del sistema nervioso central. Por esta importancia de la microglía en las funciones cerebrales, el potencial terapéutico de la microglía como diana es muy amplio, incluyendo enfermedades desarrolladas como autismo, enfermedades adquiridas como esclerosis múltiple y enfermedades genéticas y neurodegenerativas como Alzheimer, Parkinson y ELA. Como la microglía son células residentes del sistema nervioso que son independientes de las células mieloides periféricas (las cuales migran al cerebro desde la periferia), para actuar sobre la microglía como diana se debe actuar específicamente sobre el sistema nervioso central (Butovsky y Weiner, 2018). De forma general, el objetivo de la terapia dirigida a la microglía sería mantener la función homeostática de esta y restringir o inhibir la microglía inflamatoria o promotora de enfermedad, como aquella que muestra perfil transcripcional DAM. Así, lo que se pensaría adecuado sería diseñar moléculas agonistas de aquellos ligandos o receptores endógenos que favorecen la señal homeostática y antagonizar aquellas que deriven a DAM. A medida que se amplían las bases del conocimiento sobre este tema comienzan a emerger una serie de dianas moleculares microgliales específicas. Aquellas dianas cuya función se debería potenciar son miR-124, TGF-β, MERKT, CX3CR1, P2RY12, MEF2C, SALL1 y MAFB. Por el contrario, las dianas terapéuticas a antagonizar incluyen TREM2, ApoE4, AXL, CSF1R, complemento C3, miR-155 y SPP1. (Butovsky y Weiner, 2018). Como ya hemos comentado, algunas moléculas como TREM2 pueden ser beneficiosas o perjudiciales dependiendo de la 22 fase de la enfermedad, algo que hay que tener en cuenta a la hora de utilizarlas como objetivo en humanos. Estudios recientes que han usado un anticuerpo anti-CSF1R y PLX3397 para bloquear CSF1R sugieren que la inhibición de este factor causa la disminución de la microglía (Elmore et al., 2014). El tratamiento con PLX5622, que también dirige a la diana CSF1R, prevenía la asociación de la microglía con las placas amiloides y mejoraba la cognición en el modelo de ratón 3xTg-AD con Alzheimer (Dagher et al., 2015). De forma similar, un inhibidor oral de la tirosina quinasa (GW2580) inhibía CSF1R en el modelo del ratón APP/PA1 con Alzheimer, lo que reducía la proliferación de la microglía y el perfil inflamatorio de esta (Olmos-Alonso et al., 2016). La elección de CSF1R como diana farmacológica en este estudio también mejoró la cognición y previno la degeneración sináptica. Por lo tanto, estos estudios apoyan el potencial de las estrategias inhibidoras de CSF1R como tratamiento del Alzheimer. Los receptores de tirosina quinasa TAM (Tyro3, Axl y Mer) están involucrados en múltiples aspectos de la fisiología de la microglía. Como hemos descrito anteriormente, estos receptores de tirosina quinasa se encargan de regular las funciones de esta y por lo tanto están relacionados con la exhibición del fenotipo DAM, lo que los convierte en potenciales dianas para la intervención terapéutica. De forma experimental se ha demostrado que los animales con déficit de Mer y Axl acumulan células apoptóticas (Fourgeaud et al., 2016) 4.7.1 Moléculas utilizadas Para usar la microglía como diana serán necesarias moléculas fáciles de sintetizar que puedan actuar sobre su superficie, siendo los más comunes los anticuerpos específicos. Estos se unirán específicamente a moléculas presentes en la microglía para bloquearla. Los investigadores se encuentran actualmente desarrollando un anticuerpo contra ApoE4 (Liao et al., 2014), así como uno contra TREM2 (Piccio et al., 2007). Otro acercamiento incluye microRNAs. miR-155 se ha asociado con la microglía inflamatoria y es un conductor principal de la inflamación en la inmunidad innata. Inhibir selectivamente miR-155 en la microglía ha demostrado ser beneficioso para frenar la patología en modelos de ELA (Koval et al., 2013) y está siendo perseguido actualmente como posible estrategia terapéutica. De acuerdo con esto, en la microglía DAM de ratones ApoE+, la expresión de miR- 155 fue suprimida (Krasemann et al., 2017). Otros microRNAs tienen función antiinflamatoria intrínseca. Por ejemplo, se ha demostrado que favorecer la expresión de miR-124 es beneficioso en modelos de Esclerosis Múltiple (Ponomarev et al., 2011). 23 Además de los acercamientos farmacológicos clásicos, también hay otros métodos fisiológicos que conducen a cambios en la microglía. Un ejemplo surge de un informe que afirma que el “enriquecimiento ambiental” reduce los niveles de deposición amiloide en modelo de ratón con Alzheimer (Lazarov et al., 2005). Por lo tanto, la modificación del ambiente o la conducta podría tener efectos beneficiosos en la función cerebral mediante la afectación de la microglía. Por último, el microbioma juega un papel central en la salud y en la enfermedad. El microbioma del hospedador controla la maduración y la función de la microglía (Erny et al., 2015). Los animales que crecen en un ambiente libre de gérmenes o ratones tratados con antibióticos de amplio espectro desarrollan microglía disfuncional, un efecto que se puede mejorar con ácidos grasos de cadena corta. Debido a esto, es posible que la modificación o modulación del microbioma pueda tratar enfermedades neurodegenerativas a través de sus efectos en la microglía. Por ello se encuentran en proceso diversos estudios del microbioma en enfermedades neurodegenerativas como Parkinson (Sampson et al., 2016), Alzheimer (Vogt et al., 2017) y Esclerosis Múltiple (Jangi et al., 2016). 4.7.2 Biomarcadores Para entender la función de la microglía en la enfermedad y nuestra habilidad para tratarla como diana u objetivo, es requerimiento fundamental ser capaz de medir la función de la microglía a través de biomarcadores. Los biomarcadores más ampliamente utilizados en enfermedades neurodegenerativas están relacionados con técnicas de imagen y por ello dichas técnicas están siendo usadas para comprobar el efecto de tratamientos en la microglía (Politis et al., 2012). Desarrollar tratamientos para las enfermedades como Esclerosis Múltiple ha requerido que la terapia afecte a tejidos o moléculas que puedan ser medidos u observados a través de las imágenes obtenidas mediante la técnica de Resonancia Magnética Nuclear (Bakshi et al., 2008). En este caso, la extensión y el grado de tejido dañado se hace visible en las imágenes mediante la observación de las lesiones o de la concentración de metabolitos asociados a la atrofia localizada en el SNC. En Alzheimer, la medida de péptido β amiloide y tau son usadas como medidas de eficacia de la terapia (Johnson et al., 2012). La identificación de nuevos marcadores microgliales que están ligados a estados asociados a homeostasis o enfermedad puede presentar una forma más clara de evaluar la microglía en la enfermedad y el efecto de la terapia. Otros biomarcadores para medir la función de la microglía pueden estar presentes en el fluido cerebroespinal como es el ejemplo de TREM2 soluble, cuyos niveles aumentan con el desarrollo del Alzheimer (Brendel et al., 2017). 24 5. CONCLUSIONES Los estudios genéticos demuestran que el sistema de inmunidad innata juega un papel clave en la patogenia de las distintas enfermedades neurodegenerativas, y por ello, la caracterización molecular de la microglía asociada a homeostasis y enfermedad proporciona una oportunidad para entender y tratar enfermedades humanas del sistema nervioso. Sin embargo, tras los ensayos realizados, aunque se conocen las vías que regulan las firmas fenotípicas de la microglía, la distinción entre homeostasis y enfermedad no es exacta, y siguen existiendo moléculas como TREM2 que, aunque tienen una alta tasa de expresión en microglía activada asociada a enfermedad, también contribuyen beneficiosamente a la alteración del desarrollo de la patología. Es por ello por lo que no se conoce de forma exacta el impacto que tiene la microglía asociada a enfermedad en el desarrollo de la patología. Además, es necesario ampliar los estudios realizados en modelos de ratones a estudios en pacientes mediante modelos celulares de células humanas in vitro, así como tecnologías para la imagen y el análisis in vivo. Esto permitirá el desarrollo de una terapia farmacológica dirigida que module, favoreciendo la activación o inhibiendo, las principales moléculas que forman parte de la ruta neurodegenerativa, restaurando el estado de homeostasis del sistema nervioso central, frenando con ello el desarrollo de la enfermedad. Aunque aún se precise de una búsqueda amplia en este campo, los datos disponibles hasta el momento han supuesto una base indispensable en el conocimiento de la patogenia de la patología neurodegenerativa, a partir del cual continuar con la investigación.