Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal

Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Sevilla, 2017 Mª Fuensanta Torrecillas Nicolás Tesis doctoral Memoria presentada por Mª Fuensanta Torrecillas Nicolás para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. El presente trabajo ha sido realizado en el hospital universitario Virgen del Rocío y el Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) bajo la supervisión del Doctor Antonio Núñez Roldán y la Doctora Mª Francisca González Escribano. El proyecto de investigación ha recibido financiación del Proyecto de Excelencia P07-CTS-02886 y del Fondo de Investigaciones Sanitarias (10/02332). D. ANTONIO NÚÑEZ ROLDÁN, DOCTOR EN MEDICINA Y CIRUGÍA, CATEDRÁTICO DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Y JEFE DE SERVICIO DE INMUNOLOGÍA DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO VIRGEN DEL ROCÍO DE SEVILLA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación que lleva por título “Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal” ha sido realizado por la licenciada D.ª Mª Fuensanta Torrecillas Nicolás bajo su dirección y que reúne las condiciones necesarias para ser leído y defendido como tesis para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. En Sevilla, a 23 Enero 2017 Fdo: Antonio Núñez Roldán Director de tesis D.ª Mª FRANCISCA GONZÁLEZ ESCRIBANO, DOCTORA EN BIOLOGÍA Y FACULTATIVA ESPECIALISTA DE ÁREA EN INMUNOLOGÍA EN EL HOSPITAL UNIVERSITARIO VIRGEN DEL ROCÍO DE SEVILLA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación que lleva por título “Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal” ha sido realizado por la licenciada D.ª Mª Fuensanta Torrecillas Nicolás bajo su dirección y que reúne las condiciones necesarias para ser leído y defendido como tesis para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. En Sevilla, a 23 Enero 2017 Fdo: Mª Francisca González Escribano Directora de tesis En primer lugar agradecer a mis directores de tesis la oportunidad que me han dado de poder realizar este trabajo, así como su ayuda y guía durante todo el proyecto. Gracias por confiar en mí. A todo el personal del Servicio de Inmunología y del IBiS, gracias por vuestra acogida durante estos 5 años. Ha sido una experiencia laboral y vital muy intensa. A los amigos y compañeros con los que empecé esta andadura que hoy están distribuidos por distintas partes de España y del mundo. Hemos vivido muy buenos momentos que nunca olvidaré, y los que nos quedan por vivir… A todos a los que he tenido oportunidad de conocer durante este camino, cada uno de vosotros ha puesto su granito de arena. A los que estaban antes de comenzar esta etapa y estarán después, sois un auténtico pilar en mi vida. Y en especial a ti, por intentar hacerme la vida más fácil en estos últimos tiempos. Y a mi familia, por su apoyo incondicional en todo momento. Por animarme a conseguir mis objetivos. Sin la educación y valores que tenéis y me habéis aportado, no lo hubiera logrado. No puedo estar más orgullosa de vosotros!! Gracias!!!! AGRADECIMIENTOS A mi familia y amigos FIGURAS Figura 1: Isotipos de Ig .......................................................... 14 Figura 2: Vías de activación del C incluyendo moléculas reguladoras .......................................................... 15 Figura 3: Posibles mecanismos de daño crónico mediado por Ac ........................................................................ 18 Figura 4: Genes y moléculas HLA ............................................ 20 Figura 5: Fundamento de la técnica de CDC ...................... 23 Figura 6: Principio de la técnica de detección de Ac mediante citometría de flujo ............................................. 25 Figura 7: Ejemplo de cómo la densidad de antígenos y la concentración de Ac puede influir en el rendimiento de los ensayos de detección de Ac. .............. 28 Figura 8: Técnica de detección de Ac con C1q ................. 31 Figura 9: Estructura cristalográfica de MICA ......................... 33 Figura 10: Implicaciones de la interacción NKG2D-MICA en el trasplante de órganos sólidos .............. 37 Figura 11: Sistema renina-angiotensina-aldosterona. ......... 39 Figura 12: Estructura del ATR1 .................................................. 40 ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS Figura 13: Localización de gen ERAP2 y sus dos isoformas: haplotipo A y B ....................................................... 44 Figura 14: Esquema de la técnica SSOP ............................... 59 Figura 15: Plan de trabajo para el objetivo 1. ...................... 76 Figura 16: Plan de trabajo para el objetivo 2. ...................... 77 Figura 17: Plan de trabajo para el objetivo 3 ....................... 78 Figura 18: MFI de la microesfera control positivo en el ensayo de escrutinio. ........................................................... 82 Figura 19: Índices k de los grupos de microesferas en los ensayos de escrutinio. ................................................... 88 Figura 20: Valores de MFI de la microesfera control positivo para el ensayo de SA con cada uno de los 2º Ac ...................................................................................... 90 Figura 21: Valores más elevados de MFI para el ensayo de SA con cada uno de los 2º Ac. ........................... 91 Figura 22: Índices k de las 5 primeras microesferas positivas en el ensayo de SA ........................... 92 Figura 23: Índices k de las 10 primeras microesferas positivas en el ensayo de SA ........................... 93 Figura 24: Comparación de técnicas de asignación de especificidades de Ac anti-HLA fijadores de C ............. 96 Figura 25: Porcentaje de sueros con XMv positivo con cada uno de los 2º Ac ..................................................... 97 Figura 26: Esquema y resultados del estudio de Ac anti-MICA ............................................................................. 109 Figura 27: Ac anti–ATR1 en sueros pre y post-trasplante ........................................................................... 115 Figura 28: Modelo de daño producido por Ac anti-ATR1 ............................................................................... 146 Figura A1: MFI de la microesfera control positivo en el ensayo de escrutinio ...................................................... 184 TABLAS Tabla 1: Criterios de Banff para diagnóstico de rechazo en trasplante renal (actualización 2013) ............... 9 Tabla 2: Características de las técnicas de detección de Ac ....................................................................... 30 Tabla 3: Alelos MICA y posición 129 de la molécula ........... 36 Tabla 4: Pacientes incluidos en cada objetivo del estudio ......................................................................................... 52 Tabla 5: Características de la cohorte 1................................ 53 Tabla 6: Características de la cohorte 2................................ 55 Tabla 7: Variantes del gen ERAP2 incluidas en el estudio ......................................................................................... 60 Tabla 8: FC para los diferentes grupos de microesferas del escrutinio ....................................................... 66 Tabla 9: Punto de corte para los diferentes grupos de microesferas del escrutinio ................................................. 67 Tabla 10: Número medio de grupos de microesferas positivas en los sueros con Ac en el ensayo de escrutinio ..................................................................................... 83 Tabla 11: Concordancia de los distintos grupos de microesferas en el ensayo de escrutinio ........................ 84 Tabla 12: Número de ensayos de escrutinio positivos con los distintos 2º Ac ............................................................... 89 Tabla 13: Datos utilizados para el cálculo de concordancia en el ensayo de escrutinio entre técnicas de Ac fijadores de C ................................................ 89 Tabla 14: Comparativa del porcentaje de coincidencia de las 5 y 10 primeras microesferas del SA .......................................................................................... 94 Tabla 15: Número de sueros positivos en los diferentes ensayos de determinación de especificidades con los distintos 2ºAc ................................... 94 Tabla 16: Datos utilizados para el cálculo de concordancia en el ensayo de determinación de especificidades entre técnicas de Ac fijadores de C............................................................................. 95 Tabla 17: Datos utilizados para el cálculo de concordancia entre las dos técnicas de detección de Ac anti-HLA DSA fijadores de C ........................................ 98 Tabla 18: Valores medios de MFI en el ensayo convencional para la microesfera DSA y detección de DSA en cada uno de los ensayos de Ac fijadores de C............................................................................. 99 Tabla 19: Evolución del trasplante y Ac anti-HLA DSA de clase I fijadores de C .......................................................... 100 Tabla 20: Evolución del trasplante y Ac anti-HLA DSA de clase II fijadores de C .......................................................... 101 Tabla 21: Evolución del trasplante y Ac anti-HLA DSA con diversos 2º Ac ..................................................................... 102 Tabla 22: Distribución de alelos MICA en nuestra población ................................................................................... 104 Tabla 23: Frecuencias genotípicas de MICA A5.1 y número de incompatibilidades recibidas ............................. 105 Tabla 24: Evolución en el trasplante y MICA A5.1 ................ 106 Tabla 25: Frecuencia del polimorfismo en el aminoácido 129 ......................................................................... 107 Tabla 26: Polimorfismo del aminoácido 129 y evolución del trasplante ............................................................................. 108 Tabla 27: Genotipado MICA de las parejas donante/receptor y descripción de especificidades ......... 111 Tabla 28: Evolución del trasplante y Ac anti-MICA detectados por el escrutinio.................................................... 112 Tabla 29: Análisis multivariante Ac anti-HLA DSA y Ac anti-MICA .............................................................................. 113 Tabla 30: Evolución del trasplante y Ac anti-MICA detectados por SA .................................................................... 113 Tabla 31: Evolución del trasplante y Ac anti-MICA-DSA ........................................................................... 114 Tabla 32: Evolución del trasplante y Ac anti-ATR1 preformados ....................................................... 117 Tabla 33: Ac anti-ATR1 y HLA-DSA preexistentes y evolución del trasplante .......................................................... 117 Tabla 34: Distribución de los alelos y genotipos de ERAP2 en receptores y donantes ........................................... 120 Tabla 35: Frecuencia de haplotipos de ERAP2 .................... 121 Tabla 36: Frecuencia de genotipos de ERAP2 ..................... 121 Tabla 37: Distribución de genotipos de los receptores en relación a Ac anti-ATR1 previos al trasplante ................. 122 Tabla 38: Genotipos de ERAP2 y evolución del trasplante .................................................................................... 123 Tabla A1: Valores de MFI de la microesfera control positivo en el ensayo de escrutinio para diferentes diluciones del 2º Ac .................................................................. 182 Tabla A2: Valores medios de MFI en el ensayo de escrutinio con los distintos 2º Ac ............................................. 186 Tabla A3: Ensayos de escrutinio con lgG2/IgG4 .................. 188 1 Ac: anticuerpo/s. ACV: accidente cerebrovascular. ADCC: citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. ADN: ácido desoxirribonucleico. AMR: rechazo mediado por anticuerpos. APC: células presentadoras de antígenos. ATG: timoglobulina. ATR1: receptor tipo 1 de la angiotensina II. C: complemento. CDC: citotoxidad dependiente de complemento. D: donante. DSA: anticuerpos específicos frente al donante. ELISA: ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima. ENDAT: genes de activación y daño endotelial. ERAP: endoplasmic reticulum aminopeptidase. FA: frecuencia alélica. FC: factor de corrección. ABREVIATURAS 2 Fc: fragmento cristalizable. GSTT1: enzima glutatión S-trasferasa T1. H: Cadena pesada de inmunoglobulinas. HLA: Moléculas del sistema principal de histocompatibilidad humano. Hsp70: proteína de choque térmico 70. IFN-: interferón . Ig: inmunoglobulinas. IMGT: International ImMunoGeneTics project. K: índice Kappa. LD: desequilibrio de ligamiento. M: metionina. MAC: complejo de ataque a la membrana. MAF: Frecuencia del alelo minoritario. MFI: intensidad media de fluorescencia. MHC: complejo principal de histocompatibilidad. MICA: human major histocompatibility complex class I chainrelated gene A. min: minuto. MMF: mofetil micofenolato. 3 n: tamaño muestral. NDSA: anticuerpos no específicos frente al donante. NK: natural killer. PCR: reacción en cadena de la polimerasa. PE: ficoeritrina. Pr: prednisona. PRA: panel de reactividad de anticuerpos. Porcentaje de donantes de una población frente a los que se predice que el paciente tendría una prueba cruzada positiva según su patrón de anticuerpos anti-HLA. R: receptor. RIC: rango intercuartílico. RT: temperatura ambiente. s: segundo. SA: ensayo de antígeno simple. SD: desviación típica. SNPs: polimorfismos de cambio de nucleótido. SSOP: sondas de oligonucleótidos específicas de secuencia. SSP: primers específicos de secuencia. Tac: tacrolimus. TCMR: rechazo mediado por células T. 10 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal b. Evidencia de interacción de Ac con el endotelio vascular, incluyendo al menos uno de las siguientes:  Tinción C4d en capilares peritubulares  Moderada inflamación microvascular  Aumento de la transcripción de ENDATs u otros marcadores génicos validados de expresión de daño endotelial en tejido de biopsia c. Evidencia serológica de Ac donante específicos (HLA u otros antígenos) 3. Cambios borderline: “sospechosos” de rechazo agudo mediado por células T  No hay arteritis intimal pero hay focos de tubulitis con mínima inflamación intersticial, o hay inflamación intersticial leve 4. Rechazo mediado por células T Rechazo agudo mediado por células T Tipo/grado:  IA. Inflamación intersticial >25% y focos de tubulitis moderada  IB. Inflamación intersticial >25% y focos de tubulitis severa  IIA. Arteritis intimal leve a moderada  IIB. Arteritis intimal severa, obstruyendo más del 25% de su luz  III. Arteritis transmural o necrosis fibrinoide de la pared arterial acompañada de inflamación linfocítica Rechazo crónico activo mediado por células T  Arteriopatía crónica del injerto (fibrosis intimal arterial con infiltración de células mononucleares en la fibrosis, formación de neoíntima) 5. Fibrosis intersticial y atrofia tubular, sin evidencia de etiología específica Puede incluir esclerosis vascular o glomerular inespecíficas, pero la severidad se gradúa de acuerdo con las lesiones crónicas tubulointersticiales. Grado:  Fibrosis intersticial y atrofia tubular leve (<25% del área cortical)  Fibrosis intersticial y atrofia tubular moderada (26-50% del área cortical)  Fibrosis intersticial y atrofia tubular severos (>50% del área cortical) 6. Otros  Cambios que no se consideran debidos a rechazo agudo y/o crónico. Puede incluir glomerulitis, glomerulopatía crónica del injerto o engrosamiento fibroso intimal arterial aislado ME: microscopio electrónico; MO: microscopio óptico. Introducción 11 Una vez que se describieron las causas del rechazo hiperagudo y se estableció la manera de evitarlo (ver más adelante), el principal reto a superar en la medicina del trasplante pasó a ser el rechazo celular agudo. Desde los primeros años del trasplante, este tipo de rechazo era extremadamente común y, debido a su complicado tratamiento, era la principal causa de pérdida del injerto (Starzl TE y col. 1980, Ferguson R 1994). En la década de los 80, el desarrollo de potentes agentes inmunosupresores disminuyó las tasas de rechazo agudo situándolos en niveles inferiores al 10% en el primer año. Actualmente, el rechazo celular raramente es causa de pérdida del injerto (Tantravahi JR y col. 2007). Por ello, la investigación se ha dirigido al estudio del rechazo mediado por Ac. Existen gran cantidad de evidencias que sustentan que los Ac pueden ser causa directa de pérdida del injerto (Terasaki PI 2003). Así, como hemos comentado anteriormente, si un riñón es trasplantado a un paciente con alta tasa de Ac preformados frente a moléculas presentes en ese riñón, el órgano es inmediatamente rechazado (rechazo hiperagudo) y este hecho determinaba que en los inicios del trasplante, la tasa de rechazo aumentara con los sucesivos retrasplantes. Sin embargo, gracias al uso de métodos que permiten detectar la presencia de Ac dirigidos frente a moléculas HLA del donante (HLA-DSA) en el suero del receptor, es decir, a la realización de pruebas cruzadas previas al trasplante, la tasa de supervivencia del injerto de un individuo trasplantado por primera vez o retrasplantado, ha pasado a ser prácticamente idéntica (Patel R y col. 1969). Esta mejora se ha producido incluso, a 12 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal pesar de que la técnica tradicionalmente utilizada hasta fechas recientes, la citotoxidad dependiente de C (CDC), no es un método muy sensible. La relevancia clínica de esta esta técnica es incuestionable, ya que, la presencia de HLADSA detectados mediante CDC en sueros pre-trasplante es predictivo de rechazo hiperagudo y disminuye la tasa de supervivencia del injerto (Terasaki PI y col. 1971). El desarrollo de la tecnología y el mejor conocimiento de la biología aloinmune, han permitido incrementar la sensibilidad de las técnicas de detección de Ac. Además, la determinación de especificidades con ensayos muy específicos y sensibles permite, disponiendo del tipaje HLA del donante, la realización de una prueba cruzada virtual (HLA-XMv), que se considera positiva si los Ac detectados son HLA-DSA y negativa en caso de que no se detecten Ac o éstos no sean HLA-DSA. En este sentido, uno de los problemas que más debate ha generado recientemente es el impacto clínico de los Ac detectados con estos métodos mucho más sensibles, especialmente cuando se detectan en tasas bajas. Numerosas publicaciones concluyen que los Ac anti-HLA detectados con estos métodos son clínicamente relevantes y que, no se deben trasplantar pacientes con una HLA-XMv positiva siempre que pueda evitarse (Gibney EM y col. 2006, Patel AM y col. 2007, Bielmann D y col. 2007, Eng HS y col. 2008, Amico P y col. 2009, Rietmüller S y col. 2010, Lefaucheur C y col. 2010, Amico P y col. 2011). Introducción 13 MECANISMOS DE DAÑO MEDIADO POR Ac Pese a todo lo expuesto anteriormente, hay ciertas cuestiones que siguen sin resolverse. La evolución clínica de los pacientes con HLA-DSA determinados con métodos más sensibles es diversa, algunos pacientes presentan claros signos clínicos y anatomopatológicos de AMR con deterioro de la función renal y otros mantienen buena función renal sin signos de rechazo a medio y largo plazo. Entre los factores que determinan esta diversidad en la evolución, podrían encontrarse los problemas de relacionados con la detección de las dianas relevantes clínicamente y los distintos mecanismos de daño mediado por Ac determinados por diferencias en las funciones efectoras de los isotipos de inmunoglobulinas (Ig). En relación con la primera cuestión, Ac frente a moléculas no HLA también pueden influir en la evolución del trasplante. Pero lo cierto es que, aunque la determinación Ac DSA frente a moléculas HLA o no-HLA, se incluyen entre los criterios diagnósticos de AMR de Banff (ver tabla 1), el resto de las dianas moleculares no están bien definidas. En cuanto a la segunda cuestión, recordar que existen 5 isotipos de Ig: IgM, IgG, IgA, IgE e IgD con diferencias estructurales y funcionales que están relacionadas con su cadena pesada (H) (figura 1). Así, sólo la IgM y dos de los subtipos de IgG, IgG1 e IgG3, son capaces de activar el C, mientras que, la IgG, IgA e IgE son capaces de activar células efectoras con receptores Fc para la correspondiente cadena H. 14 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Figura 1: Isotipos de Ig. (Rojas R y col. 2002). Existen 5 tipos distintos de Ig denominadas IgA, IgD, IgE, IgG e IgM que pueden aparecer de forma soluble y como parte del receptor de los linfocitos B. Cada Ig consta de dos cadenas H y dos cadenas ligeras y forman monómeros (IgD, IgE e IgG), dímeros como la IgA o pentámeros como la IgM. Desde la descripción de Ehrlich a finales de 1890 y la posterior caracterización por Bordet, se ha atribuido un importante papel a la cascada del C en la respuesta inmunitaria. La capacidad de la cadena H de los Ac para unir la fracción C1q es el primer paso para la activación de la vía clásica del C y determina el potencial citotóxico de los Ac. En la figura 2, se muestra un resumen de la vía clásica de activación del C. Hay que señalar que C4b, y en especial su producto de inactivación posterior, C4d, permanece en la superficie de las células endoteliales y puede ser detectado inmunohistoquímicamente, por lo que Introducción 15 se utiliza como un marcador de AMR. La activación del C tiene un gran potencial patológico por lo que está sometida a una estrecha regulación. Figura 2: Vías de activación del C incluyendo moléculas reguladoras (Noris M y col. 2012). La unión de la porción Fc a C1q activa C1r que actúa como una serín-proteasa activando a su vez a C1s que una vez 16 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal activa, hidroliza C4 generando dos fragmentos, uno pequeño, C4a, que difunde al plasma y otro grande, C4b, capaz de fijarse a la membrana de la célula diana. De igual modo, C1s activa tiene capacidad de escindir la molécula C2 en un fragmento pequeño que difunde al plasma, C2b, y un fragmento más grande que queda unido a C4b, C2a. El complejo C4bC2a activo es conocido como “convertasa de C3”, ya que, cataliza la ruptura enzimática de C3, dando lugar a C3a (fragmento pequeño soluble) y C3b que se une a C4bC2a activo formando el complejo “convertasa de C5” que escindirá la molécula C5, siendo el fragmento C5b clave para la formación del “complejo de ataque a la membrana” (MAC) en el que participan las subunidades C6, C7, C8 y C9. El inicio de la formación del MAC es la etapa convergente de las tres vías de activación del C (clásica, alternativa y de las lectinas). Abreviaturas: CFH, factor H; CFI, factor I; DAF, factor acelerador del decaimiento; MAC, complejo de ataque a la membrana; MASP, serín proteasa asociada a manosa; MBL, lectina de unión a manosa; MCP, proteína cofactor de membrana; TAFIa, inhibidor de la fibrinólisis activable por trombina; THBD, trombomodulina. En relación con el trasplante, la activación del C puede causar daño al injerto por tres mecanismos diferentes: a) daño directo del endotelio provocado por el MAC (Lautenschlager I y col. 1999); b) reclutamiento de células inflamatorias por los fragmentos solubles del C (C3a, C4a y C5a) con capacidad quimiotáctica (Bos IG y col. 2002) y c) reconocimiento de fragmentos del C depositados en el endotelio a través de receptores de fagocitos (Deitch EA y col. 1993). Sin embargo, también es posible que tras la unión de los Ac al antígeno, el daño endotelial sea producido por un mecanismo independiente de C como es la citotoxicidad celular dependiente de Ac (ADCC) (Stiller CR y col. 1976). Introducción 17 Por tanto, los Ac no fijadores de C también podrían estar involucrados en la evolución del trasplante. De hecho, aunque algunos estudios sugieren que sólo los DSA con isotipos capaces de unir C1q tienen un papel relevante en la patogénesis del AMR (Lachmann N y col. 2013) y en la supervivencia del injerto (Loupy A y col. 2013), este punto no ha sido totalmente aclarado, especialmente en el AMR crónico (Stegall MD y col. 2012). La figura 3 muestra ejemplos de los posibles mecanismos de daño crónico mediado por Ac dependiente o independientemente de su capacidad de fijación de C. 18 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Figura 3: Posibles mecanismos de daño crónico mediado por Ac. (Stegall MD y col. 2012). La figura muestra ejemplos de los posibles mecanismos de daño crónico mediado por Ac en pacientes trasplantados renales en los que están implicados factores dependientes e independientes de la activación del C: a) Depósito de Ac frente a antígenos del donante y activación del C con generación de C3a y C5a que provoca infiltración con células inflamatorias. b) El AMR crónico podría ser inicialmente independiente del C o resultado de una activación intermitente debido a niveles bajos de DSA no detectables por técnicas actuales. c) Los Ac frente a moléculas del Introducción 19 donante pueden causar daño directo a las células endoteliales mediante activación de la cascada del C y formación del MAC. SISTEMA HLA Como se ha dicho anteriormente, los Ac más relevantes en la evolución del trasplante son los dirigidos frente a las moléculas del sistema HLA. Las moléculas del MHC humano (sistema HLA) juegan un papel clave en el sistema de defensa del organismo, ya que se encargan de presentar los antígenos a los linfocitos T. Este sistema se descubrió precisamente por su importancia en el rechazo de órganos. FAMILIA DE GENES Y ESTRUCTURA Los genes de este sistema se encuentran en una región localizada en el brazo corto del cromosoma 6 que abarca unas 4Mb (figura 4a). Las moléculas HLA se dividen en dos grandes grupos, clase I y clase II que se diferencian en su estructura, distribución celular y función. Según su estructura, las moléculas de clase I constan de una sola cadena , que se asocia con una cadena de β2 microglobulina, mientras que las moléculas de clase II están formadas por dos cadenas polipeptídicas,  y β (figura 4b). En cuanto a su distribución celular, las moléculas de clase I se expresan de manera constitutiva en la mayoría de las células del organismo, mientras que las de clase II sólo lo hacen en células presentadoras de antígenos. Por último, respecto a su función, las moléculas de clase I presentan péptidos a las células T CD8 y algunas de ellas controlan la actividad NK a través de la unión a determinados 26 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal que llevo a plantearse si la relevancia de los Ac anti-HLA dependía de su capacidad para fijar C. MÉTODOS NO CELULARES El desarrollo de nuevos ensayos en fase sólida como los de tipo enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Kao KJ y col. 1993, Zachary AA y col. 2001) y sobretodo, aquellos que utilizan microesferas múltiples, ensayos tipo Luminex® (Pei R y col. 1998), han contribuido a mejorar la sensibilidad y especificidad cuando se trata de determinar la presencia de Ac anti-HLA en el suero de pacientes candidatos a trasplante y facilitar los estudios post-trasplante que anteriormente eran muy difíciles de realizar. La tecnología Luminex® se basa en la utilización de microesferas impregnadas de colorante a las que se unen moléculas HLA extraídas de líneas celulares o recombinantes. La reacción se lee en un fluorocitómetro que tiene dos láseres (Luminex® Corporation TX, USA). Un láser rojo que excita el colorante de las microesferas y otro láser verde que excita la ficoeritrina (PE) conjugada con el Ac secundario. De este modo, los detectores reconocen por un lado, la microesfera, y por otro, la fluorescencia emitida si el Ac 2º conjugado con PE, se ha unido a una microesfera concreta. De esta manera el sistema distinguirá las microesferas negativas de las positivas. Las principales ventajas del Luminex® respecto a los otros métodos son que no requiere de células vivas y que los dos fluoróforos en sus distintas combinaciones posibilitan que se puedan generar hasta 100 ventanas distintas en el citómetro, permitiendo analizar en un único pocillo hasta 100 proteínas distintas. De Introducción 27 hecho, esta técnica ha tenido gran aceptación en los laboratorios asistenciales en los que se ha incorporado tanto para el escrutinio como para la determinación de especificidades En estas técnicas, como en el caso de la citometría de flujo convencional, el isotipo de Ac que se detecta también depende de la especificidad del segundo Ac por lo que podemos detectar Ac tanto fijadores como no fijadores de C. De hecho, los sistemas que se utilizan habitualmente tanto en el escrutinio como en la determinación de especificidades, incluyen como 2º Ac una anti-IgG total que revela la presencia tanto de las subclases fijadoras (IgG1 e IgG3) como de las no fijadoras (IgG2 e IgG4). Otro aspecto a tener en cuenta en la utilización de estas técnicas, es que pese al gran salto de sensibilidad en la detección de Ac, la interpretación de los resultados es compleja. Características concernientes a la fuente de antígenos tales como si este es purificado o recombinante, intacto o desnaturalizado o la densidad de antígenos que cubre la microesfera, pueden interferir en la detección de Ac, así como en la interpretación de los resultados (figura 7). 28 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Figura 7: Ejemplo de cómo la densidad de antígenos y la concentración de Ac puede influir en el rendimiento de los ensayos de detección de Ac. (Gebel HM y col. 2014). a) Hay una cantidad suficiente de Ac en el suero, pero existe un bajo número de moléculas del antígeno diana en la superficie de la microesfera, situación que daría lugar a falsos negativos. b) La misma concentración de Ac podría ser detectada si la microesfera tiene mayor densidad en superficie de la molécula HLA diana. c) En este caso, es la concentración de Ac el factor limitante. Esta limitación es importante cuando se realizan ensayos de antígeno simple (ver más adelante) y los Ac reconocen epítopos compartidos por múltiples moléculas HLA. En esta situación se darían también resultados falsos negativos. Generalmente, estas determinaciones se realizan con dos ensayos. El primero consiste en un cribado con el que determinaríamos la presencia o ausencia de Ac en el suero (positivo/negativo). Posteriormente, determinaríamos la especificidad en los sueros positivos mediante un segundo ensayo. En cuanto a la composición de los antígenos diana puede ser de dos tipos: a) moléculas de HLA de clase I y II purificadas de líneas celulares humanas que se usa Introducción 29 habitualmente en los ensayos de cribado o b) moléculas HLA de clase I o II recombinantes que son empleadas en los ensayos para determinar la especificidad. Las limitaciones de estas técnicas están relacionadas con las discrepancias en el nivel de intensidad media de fluorescencia (MFI) que se debe establecer como punto de corte para considerar como positivo o “presente” un determinado Ac. Se ha observado una variabilidad del 20- 25% en la detección de Ac entre laboratorios, incluso bajo condiciones en las que los reactivos y protocolos eran idénticos (Reed EF y col. 2013). Por tanto, se hace necesaria una normalización que soslaye estos problemas, con ese fin se han propuesto tres enfoques, 1) estadístico: establecimiento del nivel de fluorescencia (punto de corte) significativamente por encima del nivel de fluorescencia de fondo; 2) práctico: a través de correlaciones con resultados de pruebas cruzadas y 3) clínico: a través de la identificación de un nivel que pueda predecir una pérdida temprana del injerto (Gebel HM y col. 2014). A modo de resumen, en la siguiente tabla se detallan las principales características de cada técnica. 30 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Tabla 2: Características de las técnicas de detección de Ac. C C CA A AR R RA A AC C CT T TE E ER R RÍ ÍÍS S ST T TI IIC C CA A A C C CD D DC C C C C CI IIT T TO O OM M ME E ET T TR R RÍ ÍÍA A A D D DE E E F F FL L LU U UJ J JO O O E E EL L LI IIS S SA A A L L LU U UM M MI IIN N NE E EX X X E E ES S SP P PE E EC C CI IIF F FI IIC C CI IID D DA A AD D D Baja Baja Alta Alta S S SE E EN N NS S SI IIB B BI IIL L LI IID D DA A AD D D Baja Alta Alta Muy alta D D DE E ET T TE E EC C CC C CI IIÓ Ó ÓN N N Fijación de C Ac 2º Ac 2º Ac 2º I IIS S SO O OT T TI IIP P PO O O IgG1, IgG3 e IgM Ac 2º Ac 2º Ac 2º C C CÉ É ÉL L LU U UL L LA A AS S S V V VI IIA A AB B BL L LE E ES S S Si Si No No T T TI IIP P PO O O A A Ag g g Nativo Nativo Purificado/ Recombinante Purificado/ Recombinante Debido a que las técnicas de citometría de flujo y las que utilizan microesferas múltiples no discriminan entre las subclases de IgG fijadores o no de C, en los últimos años se han desarrollado una serie de modificaciones de la técnica de Luminex®, para detectar Ac anti-HLA fijadores de C. Este ensayo consiste en preincubar los sueros con moléculas C1q o C3d y utilizar como segundo Ac un anti-C1q o anti-C3d marcados con PE (figura 8). De esta manera, se detectarán Ac IgM, IgG1 e IgG3 que serán los únicos que fijen C. Publicaciones recientes utilizan esta técnica para detectar Ac fijadores de C y los asocian a una peor evolución del trasplante (Loupy A y col. 2013, Sicard A y col 2015). Otros investigadores como Tinckam KJ y Heeger PS cuestionan estos hallazgos basándose en limitaciones propias de la Introducción 31 técnica, ya que según estos investigadores esta técnica solo detectaría los Ac fijadores si estos se encuentran en una concentración suficientemente alta (Tinckam KJ y col. 2013). Figura 8: Técnica de detección de Ac con C1q. (One Lambda). Los sueros se preincuban con C1q y se añaden las microesferas recubiertas de antígenos HLA. Si los Ac presentes en el suero son de isotipos fijadores de C, la molécula C1q se unirá a la cadena H, y si reconocen alguna molécula en la superficie de la microesfera se producirá una reacción antígeno-Ac. Esta reacción se pondrá de manifiesto al unirse al C1q un Ac 2º anti-C1q marcado con un fluorocromo. Ac FRENTE A MOLÉCULAS NO HLA Pese a los avances en la detección de Ac anti-HLA y la contribución que estos avances han supuesto en la supervivencia del injerto, siguen dándose casos de AMR agudo incluso en trasplante entre hermanos HLA-idénticos (Opelz G 2005), situación que pone de manifiesto la importancia de la respuesta inmune contra antígenos no 32 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal HLA. Entre los Ac no anti-HLA que se han asociado a una peor evolución del trasplante, se encuentran tanto aloantígenos como autoantígenos. Así, se ha descrito cierta influencia de Ac frente a moléculas HLA de clase I no clásicas, concretamente frente a MICA (human major histocompatibility complex class I chain-related gene A) (Zou Y y col. 2006), frente a enzimas como la glutatión S- trasferasa T1 (GSTT1) (Aguilera I y col. 2008) y también auto- Ac frente a moléculas localizadas en la superficie de células endoteliales (Praprotnik S y col. 2001), la vimentina (Jurcevic S y col. 2001) y el receptor tipo 1 de la angiotensina II (ATR1) (Dragun D 2008, Zhang Q y col. 2010). Pese a todo, el impacto de estos Ac en la función y supervivencia del injerto sigue siendo bastante controvertido. MICA Como se ha dicho anteriormente, existe un grupo de moléculas que están estructuralmente relacionadas con las moléculas de clase I clásicas pero que no presentan péptidos a los linfocitos T /β, dentro de este grupo se encuentran las moléculas MIC. Estas moléculas están codificadas por una familia de genes que se encuentran localizados a 46.4 kb hacia el centrómero con respecto a HLA-B (The MHC sequencing consortium 1999). Debida a esta cercana localización, los genes MIC presentan un fuerte desequilibrio de ligamiento (LD) con el locus HLA-B. La región contiene dos genes funcionales, MICA y MICB, y cinco pseudogenes (MICC a MICG). MICA codifica moléculas de superficie cuya expresión se induce en Introducción 33 condiciones de estrés de forma similar a los genes que codifican la proteína de choque térmico 70 (hsp70) (Groh V y col. 1996). En cuanto a su estructura, es similar a las moléculas MHC de clase I clásicas (figura 9). Figura 9: Estructura cristalográfica de MICA. (Li P y col. 1999). El gen MICA, consta de 6 exones separados por 5 intrones siendo el primer intrón el de mayor tamaño (Bahram S 2000). La proteína MICA (11.7 kb) es un polipéptido de 383 aminoácidos y 43 kDa (Bahram S y col. 1994). A diferencia de HLA clase I, la proteína MICA no se asocia con la β2 microglobulina. Los dominios 1 y 2 de la proteína forman una plataforma análoga a la plataforma formada por los dominios 1 y 2 de las moléculas HLA clase I. Sin embargo, mientras que en la moléculas HLA clase I, esta plataforma constituye la hendidura de unión de péptido, en la molécula MICA, la hendidura tiene muy poca profundidad y es incapaz de unir péptidos. 34 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Las moléculas MICA no tienen una expresión ubicua sino que ésta se encuentra restringida a ciertas células o tejidos tales como queratinocitos, fibroblastos, células endoteliales o células del epitelio intestinal entre otras (Stephens HA 2001), si bien, se han encontrado transcritos de los genes MIC en la mayoría de los órganos salvo en el cerebro (Schrambach S y col. 2007). Estas moléculas actúan como marcadores de estrés y su expresión se induce por calor, inflamación, infecciones virales o daño en el ADN y puede ser regulada por TNF o receptores del sistema inmune como los receptores Toll-like (Gannage M y col. 2008, Schreiner B y col. 2006). Las moléculas MICA son ligandos del receptor NKG2D (Li P y col. 2001), una glicoproteína de membrana presente en las células NK y linfocitos citotóxicos tanto / como /. La unión de MICA a su receptor provoca lisis en la célula portadora de la molécula MICA. El receptor NKG2D está relacionado con el sistema inmune innato por lo que se ha atribuido un papel relevante a la interacción MICA-NKG2D en enfermedades autoinmunes, tumores e infecciones. Del mismo modo, la exposición a aloantígenos MICA puede provocar alorespuestas que se asocien con una peor evolución del trasplante, ya que, también presentan cierto grado de polimorfismo. POLIMORFISMO MICA El gen MICA es el más polimórfico dentro de los genes que codifican moléculas HLA de clase I no clásicas. Se han identificado 101 alelos diferentes para MICA y 40 para MICB (international ImMunoGeneTics project, IMGT/HLA Introducción 35 database; http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla). Los alelos se identifican por el nombre del gen (en este caso MICA) seguido por un asterisco y un número de 3 dígitos que identifica el grupo alélico, siguiendo las normas estandarizadas del IMGT. Las posiciones polimórficas se localizan fundamentalmente entre los exones 2-4 que son los que codifican los 3 dominios extracelulares. Las posiciones polimórficas de MICA son distintas de las descritas en las moléculas HLA de clase I clásicas y la mayoría de estos cambios no son conservadores. Generalmente se trata de sustituciones de un solo aminoácido, que determinan que en una posición concreta encontremos un residuo u otro, salvo en las posiciones 156 y 251 donde se pueden encontrar 3 aminoácidos distintos (Mason PM y col. 1998). También se ha descrito otro polimorfismo consistente en un número variable de repeticiones microsatélites del triplete GCT en la región transmembrana de MICA. Concretamente, se han encontrado 7 alelos que se designan como A4-A10 con 4-10 repeticiones y un alelo con 5 repeticiones además de una inserción adicional de G, que se denomina A5.1, esta inserción causa una alteración del marco de lectura que origina un codón prematuro de parada (Mizuki N y col. 1997). La forma A5.1 se encuentra solamente en 4 alelos: MICA*008, MICA*023, MICA*028 y MICA*053. Ciertos cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína MICA podrían influir en la afinidad de la interacción con su receptor, NKG2D. Se ha descrito que la presencia de metionina (M) en la posición 129 (129M), confiere fuerte afinidad, mientras que, la presencia de valina 129 (129V) determina afinidad débil por el receptor 42 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal cardiaco, enfermedad renal, arteriosclerosis y desarrollo de cáncer. ERAP2 Variantes de la enzima endoplasmic reticulum aminopeptidase (ERAP2), parálogo de ERPA1, así como de sus niveles de expresión, se han asociado a preeclampsia y otras complicaciones hipertensivas del embarazo con componentes inmunológicos e inflamatorios (Johnson MP y col. 2009). Esta enzima, al igual que ERAP1, está implicada en el procesamiento intracelular de péptidos, ya que, su papel principal es el recorte de péptidos que van a ser cargados a las moléculas de clase I en el retículo endoplásmico. Las moléculas ERAP1 y 2 tienen distinta especificidad y pueden actuar de forma complementaria, ya que se ha observado que la acción de ambas enzimas es necesaria para recortar los péptidos y que puedan ser cargados eficazmente en las moléculas HLA. De hecho, pueden formar heterodímeros que mejoran la eficacia en la generación de péptidos de tamaño adecuado (Saveanu L y col. 2005, Evnouchidou I y col. 2014). Además, ERAP1 y ERAP2 contribuyen a otros procesos biológicos (Andrés AM y col. 2010), así, pueden regular la angiogénesis y la presión sanguínea a través de la degradación de angiotensina II y angiotensina III (Watanabe Y y col. 2003, Yamamoto y col. 2002). Ambos genes están regulados por interferón  (IFN-) y están implicados en la activación de la respuesta inmune y la inflamación. ERAP2 está menos estudiado que ERAP1, ya que fue descubierto posteriormente y, además, no existe análogo Introducción 43 en roedores, por lo que no se dispone de un modelo animal. El gen ERAP2 está situado en la región 5q15, entre ERAP1 y LNPEP (leucil-cistinil aminopeptidasa) y tiene 19 exones. Se han descrito diferentes polimorfismos en el gen ERAP2 que dan lugar a dos variantes haplotípicas que, según se ha sugerido por datos en 6 poblaciones humanas, se mantendrían por selección equilibrada. Las dos variantes genéticas dan lugar a ARNm diferentes a causa de la presencia de un polimorfismo de cambio de nucleótido (SNP), rs2248354A/G, que determina un splicing alternativo en el exón 10 que origina un codón prematuro de parada, de manera que, teóricamente, la variante daría lugar a una proteína truncada de 534 aminoácidos en lugar de la proteína completa que consta de 960 aminoácidos (figura 13). En realidad, la variante no genera proteína porque el ARNm se degrada por el proceso denominado nonsensemediated decay que elimina los ARNm aberrantes. Como consecuencia, los niveles enzimáticos serían nulos en los homocigotos para esta variante, y más bajos en los heterocigotos que en los homocigotos para el otro alelo. Previsiblemente, y según datos experimentales, la expresión de complejos de membrana moléculas HLA de clase I- péptidos se vería afectada por este polimorfismo (Andrés AM y col. 2010). Por tanto, el polimorfismo de ERAP2 podría condicionar la evolución del trasplante por dos mecanismos: determinando una mayor o menor expresión de moléculas HLA de clase I en el injerto y por su relación con el eje renina-angiotensina. 44 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Figura 13: Localización de gen ERAP2 y sus dos isoformas: haplotipo A y B (Andrés AM y col. 2010). Este último codifica un ARNm aberrante que no llega a traducirse. Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Hipótesis y objetivos 47 Los Ac dirigidos contra las moléculas HLA juegan un papel crucial en el rechazo y pérdida de los órganos trasplantados. Sin embargo, hay pacientes trasplantados sin Ac anti-HLA que presentan signos clínicos y anatomopatológicos de AMR con deterioro de la función renal, mientras que algunos pacientes con Ac anti-HLA DSA mantienen buena función renal y no muestran ningún signo de rechazo. Planteamos como hipótesis de trabajo que, determinados factores como el isotipo de los Ac anti-HLA, la presencia de alo-Ac dirigidos frentes a las moléculas MICA o de auto-Ac como los dirigidos frente al receptor tipo 1 de la angiotensina II pueden influir en la evolución del trasplante. HIPÓTESIS 48 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal 1. Comparar métodos de detección de Ac anti-HLA fijadores de C para determinar su relevancia clínica en la evolución del trasplante renal. 2. Investigar si el polimorfismo de moléculas de histocompatibilidad no clásicas, MICA y/o la presencia de Ac frente a éstas condiciona la evolución del trasplante renal. 3. Investigar si moléculas relacionadas con el sistema renina angiotensina condicionan la evolución del trasplante renal. OBJETIVOS Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Pacientes y métodos 51 Parte susceptible de publicación. PACIENTES Y MÉTODOS 128 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal C3d, fueran menos sensibles que los ensayos de IgG y así se ha puesto de manifiesto muy recientemente (Lobo PI y col. 2014, Tinckam KJ y col. 2013, Yell M y col. 2015, Loupy A y col. 2015, Sicard A y col. 2015). Otros problemas derivan de la propia técnica ya que las proteínas presentes en el plasma pueden interferir y enmascarar esta detección (Gloor JM y col. 2010, Weinstock C y col. 2013). En el presente trabajo intentamos desarrollar un método de detección de subclases de IgG fijadoras, IgG1+IgG3, y no fijadoras, IgG2+IgG4. Este objetivo presentaba una serie de limitaciones de las que éramos conscientes. En primer lugar, la microesfera control positivo, que se utiliza en los ensayos convencionales, tanto escrutinio como en el estudio de especificidades, para verificar la adición del 2ª Ac, está recubierta por las diferentes subclases de IgG en las proporciones en las que estas se encuentran en el suero. Por tanto, cabía esperar que el valor de MFI obtenido al revelar con determinadas subclases de IgG fuera inferior al obtenido al revelar con IgG total. Esta limitación nos generaría una cierta incertidumbre en el control del ensayo, ya que el valor de MFI de esta microesfera dependería de la concentración de cada subclase de IgG y podría ser mayor en el caso del ensayo de IgG1+IG3 que en el caso de IgG2+IgG4. De hecho, los valores de MFI obtenidos en los diferentes ensayos con esta microesfera corroboran esta suposición, correspondiendo los valores más elevados con IgG1 (37.0%) y los más bajos con IgG3 (2.5%), siendo el porcentaje de IgG2 el esperado (13.0%) y el de IgG4 más elevado del previsible (13.5%). En este sentido resaltar, que con el ensayo Discusión 129 de C1q comercial, se obtuvieron valores de MFI para esta microesfera control similares a los obtenidos al detectar IgG1 e IgG3 conjuntamente y que correspondían aproximadamente con el 40% del valor del ensayo convencional, circunstancia también previsible si se tienen en cuenta tanto la coexistencia de isotipos fijadores y no fijadores como las relaciones moleculares entre los Ac fijadores y el C1q. La suma del valor de MFI de esta microesfera en los ensayos con las diferentes subclases de IgG es ligeramente inferior a la MFI del ensayo convencional. Por otro lado, el hecho de que la suma de los valores de MFI obtenida en los ensayos de las distintas subclases de IgG sea inferior a la obtenida en el ensayo de IgG, sugiere una menor sensibilidad de la técnica de detección con los diferentes subtipos de IgG con respecto al ensayo convencional. Esta menor sensibilidad puede estar relacionada con diferencias en las propiedades de unión del 2º Ac, o bien con el hecho de que éste no se encuentre a saturación. Cabría esperar, sin embargo, que la limitación con la microesfera control positivo no influyera en la detección de los Ac anti-HLA, ya que, el resto de las microesferas están recubiertas de moléculas HLA nativas (escrutinio) o recombinantes (determinación de especificidades), a las que deberían unirse los Ac independientemente de la subclase, y que, por tanto, los valores de MFI en estas microesferas solo dependerían de la subclase de IgG de los Ac anti-HLA. Sin embargo, no conseguimos poner a punto la metodología para poder detectar Ac no fijadores de C, ya que, nos encontramos con problemas de sensibilidad y 130 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal especificidad que no nos permitían discriminar correctamente qué sueros presentaban estas subclases. En consecuencia, con respecto a la detección de Ac no fijadores, no hemos podido alcanzar totalmente nuestro objetivo. En cuanto a la comparación de ensayos de fijadores, el problema es que no se dispone de una técnica gold estándar, ya que, en principio, cabe esperar que entre los sueros positivos para el ensayo de IgG, se encuentren tanto sueros con isotipos fijadores como no fijadores y que, por tanto, como se dijo anteriormente, encontremos sueros con patrón positivo en el ensayo convencional pero negativos con IgG1+IgG3 y C1q. Por tanto, establecimos una serie de parámetros que nos permitieran comparar los ensayos, en concreto, en los ensayos de escrutinio, el número de grupos de microesferas positivos; y en el de determinación de especificidades, la concordancia de las primeras 5 y 10 microesferas. En lo que respecta al ensayo de escrutinio, en general, se observó que el número de sueros positivos para todos los grupos de microesferas es mayor cuando se utiliza el ensayo de IgG1+IgG3 que cuando se utiliza el de C1q, y que el grado de concordancia entre las 2 técnicas de Ac fijadores de C es bastante pobre. La concordancia de las técnicas de fijadores con el ensayo convencional era también bastante deficiente en ambos casos, encontrándose las discordancias en el sentido de sueros positivos según la técnica convencional y negativos con las de IgG1+IgG3 y C1q. Estas discordancias eran más acusadas con el ensayo de C1q, y esto puede ser debido a que este ensayo no está validado para escrutinio, sino sólo Discusión 131 para la determinación de especificidades, aunque intentamos adaptarlo por razones básicamente económicas, ya que, los ensayos de detección de especificidades con SA son muchos más caros que los de escrutinio, por lo que, poder contar con una técnica de escrutinio capaz de distinguir este tipo de Ac supondría un ahorro importante. En cuanto al ensayo de determinación de especificidades, los resultados de ambas técnicas son muy similares. Tanto en lo que respecta al grado de concordancia de las primeras 5 y 10 microesferas positivas, como en los valores medianos de MFI, donde no observamos diferencias significativas. Además presentan un grado de concordancia bueno, tanto en la detección de Ac frente a moléculas de clase I como de clase II. En cuanto a la correlación entre las dos técnicas no celulares para fijadores de C y la CDC, la concordancia del ensayo de determinación de especificidades de clase I con ambos 2º Ac y la CDC es bueno, aunque con algunas discordancias en ambos sentidos. Quizás la más llamativa, es el caso de 2 sueros positivos con CDC y en los que se detectan Ac anti-HLA-A2 en el ensayo convencional, que, sin embargo, resultaron negativos tanto para IgG1+G3 como para C1q, resultados que ponen de manifiesto que se pueden encontrar sueros con Ac anti-HLA específicos en concentraciones suficientes para ser detectados por CDC y que, sin embargo, resultan negativos con técnicas más sensibles cuando se utilizan anti-IgG1+G3 o C1q como 2ºAc. No se pudo establecer concordancia de estos ensayos con la CDC para clase II porque sólo disponíamos de los resultados de ensayos de CDC con células T. 132 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal En resumen, aunque el grado de concordancia entre las técnicas de detección de Ac fijadores de C para el ensayo de determinación de especificidades es bueno, se encontraron discrepancias en ambos sentidos, por lo que, se decidió analizar los resultados con ambos 2º Ac. Así, de acuerdo con nuestros resultados, en nuestra cohorte de pacientes trasplantados con XMv positivo en el ensayo convencional y CDC negativa, detectamos que prácticamente la tercera parte de los pacientes se trasplantó con XMv positivo para Ac fijadores de C tanto con el ensayo de IgG1+IgG3, como con el ensayo de C1q. Nuestros resultados para el ensayo de IgG1+IgG3 son similares a los publicados por otros autores en cuanto a la prevalencia de Ac anti- HLA-DSA de isotipos IgG1+IgG3 en sueros pre-trasplante de pacientes trasplantados con CDCXM negativo y XMv IgG positivo (Hönger G y col. 2011). Existen discrepancias en cuanto a los datos de prevalencia de Ac anti-C1q DSA pre-trasplante, que oscilan entre la mitad (Crepo M y col. 2013), un cuarto (Thammanichanond P y col. 2016) e incluso menos, alrededor de un 15% (Otten HG y col. 2012) de los pacientes trasplantados con CDC-XM negativo y XMv IgG positivo. Las diferencias encontradas pueden deberse al número de pacientes incluidos en cada estudio, que es bastante bajo, algunos con menos de 30 pacientes; a diferencias en los valores de MFI considerados en los puntos de corte y a diferencias de procedimiento. Nuestros datos sugieren que el resultado del XMv con C1q o con IgG1+IgG3 depende en gran medida de los valores de MFI de la microesfera DSA en el ensayo convencional, ya que, los anti-HLA DSA detectados por las técnicas de Ac fijadores de C presentaban valores de MFI más elevados Discusión 133 con la técnica convencional, observación que coincide con las de otros autores (Crespo M y col. 2013, Yell M y col. 2015, Zeevi A y col. 2013). Por tanto, además de que la clase y subclase de los Ac anti-HLA sea fijadora de C, el resultado del XMv con fijadores de C parece depender de la concentración de Ac específicos, ya que, los valores de MFI en técnicas como SA reflejan, aunque con excepciones, la concentración de Ac. Además, determinados estudios sugieren que XMv C1q positivo y cualquier DSA con MFI> 12.000 tienen efectos equivalentes sobre la supervivencia del injerto (Freitas M y col. 2013). Uno de los objetivos de este trabajo era determinar si existen diferencias en la evolución del trasplante entre los pacientes que presentan DSA fijadores y aquellos con DSA no fijadores de C. En la cohorte empleada para este estudio, se había demostrado en un estudio previo, que los DSA detectados con técnicas sensibles eran relevantes en la evolución del trasplante, no obstante, se observaban diferencias en la evolución de los pacientes (Caro-Oleas JL y col. 2011, Caro-Oleas JL y col. 2013). Los resultados del presente estudio, que pretende ayudar a establecer las bases de esa diferente evolución, sugieren una mayor incidencia de AMR en los pacientes con XMv positivo cuando la determinación de DSA se realiza con C1q y o, sobre todo, con IgG1+IgG3, tanto para clase I y especialmente para clase II, aunque las diferencias no alcanzaron la significación estadística, probablemente por limitaciones en el tamaño de la cohorte. Sin embargo, no se observó ninguna tendencia en la incidencia de TCMR ni en la pérdida de injerto. En este sentido, nuestros resultados son 134 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal consistentes con los de otros estudios donde se observa mayor incidencia de AMR en pacientes que presentaban Ac anti-HLA DSA de subclases IgG1 y/o IgG3, tanto de manera aislada como en mezcla con Ac anti-HLA DSA de subclases no fijadoras de C (Hönger G y col. 2011). Además, en estudios en pacientes pediátricos trasplantados de corazón se ha observado asociación entre XMv con C1q positivo y mayor incidencia de AMR agudo, si bien, algunos de estos pacientes presentaban en el momento del trasplante incluso CDC-XM positivos (Chin C y col. 2012, Zeevi A y col. 2012). Sin embargo, otros autores no observan mayores tasas de AMR en trasplantados renales con XMv C1q positivo pre-trasplante (Crespo M y col. 2013; Thammanichanond P y col. 2016). De nuevo, las discrepancias pueden ser debidas al bajo número de pacientes incluidos en los diferentes estudios, a los puntos de corte y a la metodología empleada. En estos trabajos, al igual que en el nuestro, no se observa mayor incidencia de pérdida del injerto en estos pacientes (Hönger G y col. 2011, Otten HG y col. 2012, Crespo M y col. 2013, Thammanichanond P y col. 2016). Nuestras conclusiones se han encontrado limitadas por el hecho de no poder poner a punto la metodología para detectar las subclases no fijadoras de C. No hemos podido determinar el papel que pueden tener estos Ac en la evolución del trasplante, pero creemos que no se debería asumir que los casos XMv IgG positivo que son negativos para IgG1+G3 y C1q, son XMv positivos correspondientes a Ac no fijadores de C. Nuestros resultados, como se ha mencionado, sugieren que los XMv IgG1+G3 y C1q se corresponden con XMv con valores de MFI más elevados en el ensayo convencional, por lo que Discusión 135 pensamos que el grupo de sueros negativos para ambos ensayos de fijadores incluiría algunos no fijadores, pero también sueros que, en general, presenten valores de MFI más bajos. Además, los sueros con Ac anti HLA-A2 detectados tanto con Luminex® IgG como con CDC que son negativos con IgG1+IgG3 y C1q, demuestran que no solo factores propios del suero como el isotipo y la concentración intervienen en el patrón de reacción del mismo. Algunos de estos factores son conocidos: concentración de moléculas HLA en cada microesfera, reconocimiento de epítopos compartidos por muchas moléculas HLA, etc., pero otros tienen difícil interpretación. Además, la capacidad de activar el C in vivo depende de muchos más factores. El isotipo de Ig o subclase de IgG, es condición necesaria pero no suficiente para la activación in vivo. Otros condicionamientos a parte de los ya mencionados para la activación in vivo son, el efecto sinérgico generado por varios Ac dirigidos a distintos epítopos situados en la misma o en diversas moléculas HLA, y los mecanismos de regulación de la activación del C que presentan las células endoteliales (Kushihata F y col. 2004, Bartel G y col. 2007). Además, los cambios que se producen en el trasplante y después del mismo, así como la terapia inmunosupresora pueden condicionar la magnitud de la respuesta humoral y de la antigenicidad al epítopo HLA diana (Burns JM y col. 2008), y este hecho podría explicar, en parte, las diferencias encontradas entre los estudios pre y post-trasplante. 136 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal En cuanto al estudio del sistema MICA, la distribución de los alelos que se ha encontrado en el presente trabajo, es similar a la descrita en población española (Lucas D y col. 2008, Cambra A. y col. 2009). Cabe destacar la diferente distribución de los alelos MICA*008 y MICA*009 en los grupos de pacientes y donantes. Una posible explicación para este hallazgo y especialmente para el incremento de MICA*009 entre los receptores, puede ser la enfermedad de base de los pacientes trasplantados. Así, las nefropatías de base autoinmune pueden estar asociadas a determinados haplotipos HLA que contengan este alelo MICA. De hecho, entre los pacientes portadores de MICA*009 observamos que las enfermedades más comunes son la nefropatía diabética y algunas enfermedades sistémicas (nefritis lúpica, vasculitis por ANCA, síndrome urémico hemolítico y el síndrome de Goodpasture), todas ellas con componente autoinmune y asociadas a HLA. Concretamente, el 23.8% de los receptores MICA*009 tenían este tipo de patologías frente al 5.0% de los receptores no portadores de este alelo (p= 0.001; OR 5.9 IC 95% [1.7-21.6]). Existen algunos estudios que sugieren asociación de ciertos alelos MICA, entre los que se encuentra MICA*009 y la diabetes (Triolo TM y col. 2009, Alizadeh BZ y col. 2007, Van Autreve JE y col. 2006, Gambelunghe G y col. 2000, Raache R y col. 2012) aunque otros atribuyen esta asociación al desequilibrio de ligamiento de ciertos alelos MICA con determinados alelos HLA de la región de clase II, que serían los relacionados con la enfermedad (Field SF y col. 2008). Las moléculas MICA actúan como ligandos para las células NK y los cambios en la secuencia de la proteína Discusión 137 podrían influir en una expresión anormal de la molécula. Así, el alelo MICA*008 tiene una mutación (A5.1) que determina que la proteína sea más corta y contenga menos aminoácidos hidrófobos, características que influyen en la expresión de la molécula en la superficie celular y que podrían relacionarse con alteraciones de la respuesta inmune (Tonnere P y col. 2010). La mutación A5.1 se ha asociado con predisposición al cáncer (Lavado-Valenzuela R y col. 2009), a determinadas infecciones virales (Moenkemeyer M y col. 2009) y, más recientemente, con la evolución del trasplante (Tonnerre P y col. 2013). Interesantemente, en nuestro estudio se observó que todos los pacientes que perdieron su injerto, habían sido trasplantados con donantes de portadores de la mutación A5.1. Aunque el número de pacientes es pequeño y la tasa de pérdida del injerto baja, se trata de un factor a considerar en futuros estudios, ya que, las células endoteliales con la mutación A5.1 potencian la interacción con el ligando NKG2D y la activación de las células NK del receptor, promoviendo la lisis de las células endoteliales A5.1 alogénicas (Tonnerre P y col. 2013), lo que podría afectar a la supervivencia del injerto y explicar nuestros resultados. El polimorfismo MICA puede afectar no solo a la expresión de la molécula en superficie, sino también a su afinidad en la interacción con NKG2D que puede afectar al umbral de activación de las células NK y a la modulación de la respuesta de las células T CD8 (Steinle A y col. 2001). Las interacciones de alta afinidad podrían desempeñar un papel en el desencadenamiento o exacerbación de 144 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal los Ac anti-ATR1 IgG3 reconocen un epítopo que también se encuentra en la proteína de la cápside del parvovirus B19 (Stepan H y col. 2007) y se han encontrado Ac frente a receptores acoplados a proteínas G en miastenia grave y la enfermedad de Chagas (Schwimmbeck PL y col. 1989, Masuda MO y col. 1998). No se conoce porque los Ac anti- ATR1 podrían relacionarse con una peor evolución del trasplante, sin embargo, se sabe que se unen al segundo loop extracelular del ATR1 mimetizando los efectos de su propio ligando (la angiotensina II) lo que origina una hiperactivación del sistema renina-angiotensina-aldosterona (Dragun D y col. 2005). La alteración del eje reninaangiotensina-aldosterona da lugar a varios efectos patológicos que incluyen hipertensión, preeclampsia, fallo cardiaco, enfermedad renal, arteriosclerosis y desarrollo de cáncer. La relación con el trasplante puede ser consecuencia de un aumento en la expresión de ATR1 en el riñón dañado por la respuesta alogénica (Reinsmoen NL y col. 2010). Se ha propuesto un mecanismo fisiopatológico de daño, según el cual, la unión de estos Ac a su receptor ejercería un efecto directo sobre las células endoteliales y células musculares vasculares del injerto mediante la activación de la vía de señalización de la fosfolipasa C, que produce la fosforilación de la kinasa Erk 1/2 y aumento del factor de transcripción ĸβ (Dragun D y col. 2005). Este mecanismo sería independiente de la vía del C lo que explicaría la baja frecuencia de biopsias C4d positivas encontradas en estos pacientes (Scornik y col. 2007). El modelo plantea varios factores permisivos, tales como el estrés oxidativo, inducido por la isquemia/reperfusión o los aloantígenos, factores pueden alterar el equilibrio Discusión 145 homeostático en el endotelio y/o cambiar las características bioquímicas y biofísicas de la unión del Ac a su receptor y, por lo tanto, aumentar la predisposición a este proceso. La unión del Ac al receptor podría provocar disfunción endotelial causando vasoconstricción arteriolar, aumento de la adhesión y migración de células efectoras o favorecer la coagulación, lo que provocaría hipertensión y rechazo de tipo vascular. Además, los Ac anti-ATR1 pueden actuar sobre las células epiteliales tubulares y las células intersticiales, amplificando la respuesta inflamatoria local y aumentando la presentación antigénica, así como de citoquinas de tipo Th1 y de quimiocinas que, en definitiva, provocarían un rechazo celular (figura 28). Por tanto, aún no está claro si la patología relacionada con la presencia de Ac anti-ATR1 supone una situación cierta de rechazo, o por el contrario, se trata de un fenómeno autoinmune que se evidencia en un medio ambiente alogénico permisivo (Dragun y col. 2007). 146 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Figura 28: Modelo de daño producido por Ac anti-ATR1. (Dragun D y col. 2007). Determinados factores tales como la isquemia/reperfusión, el estrés oxidativo y la inflamación pueden provocar disfunción endotelial e inflamación tubulointersticial que desembocan en hipertensión, rechazo vascular o rechazo celular del injerto al estar presentes Ac anti- ATR1. AT1RAA: Ac anti-ATR1; I/RI: daño por isquemia/ reperfusión; RAS: sistema renina angiotensina. En resumen, aunque está bien establecido que los Ac anti-HLA juegan un papel esencial en el rechazo y pérdida de injertos, en el presente trabajo hemos desarrollado un método de detección de Ac anti-HLA IgG1+IgG3 que presenta un buen grado de correlación con la detección con C1q para la determinación de especificidades. Los pacientes con XMv positivo IgG1+IgG3 presentan mayor tendencia al desarrollo de AMR y pérdida de injerto. Además, hemos observado que determinados polimorfismos Discusión 147 de las moléculas MICA condicionan la evolución del trasplante, ya que, los pacientes trasplantados con injertos de donantes con la mutación A5.1 presentan mayor tasa de pérdida del órgano y los pacientes trasplantados con la incompatibilidad 129M tienen mayor prevalencia de TCMR. Por último, nuestros resultados sugieren relación entre la presencia de Ac anti-MICA y la pérdida de injertos y mayor prevalencia de TCMR precoz con mayor grado de vasculitis en los pacientes con Ac anti-ATR1. Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Perspectivas 149 Se debe seguir profundizando en el papel que podrían jugar los distintos isotipos de Ac en la evolución del trasplante renal. Para ello, en primer lugar se deberían de desarrollar ensayos capaces de detectar Ac no fijadores de C, algo que no hemos podido lograr en el presente trabajo, para poder conocer su implicación real. Y en segundo lugar, conociendo las limitaciones de estas técnicas, confirmar la relevancia de estos Ac en estudios pre-trasplante y posttrasplante, ya que parece que la presencia de Ac fijadores de C post-trasplante y especialmente los de novo tienen implicaciones en la evolución de trasplante. Loupy describe en su trabajo una fuerte asociación entre la presencia de Ac anti-C1q post-trasplante y mayor riesgo de pérdida del injerto (Loupy y col. 2013). En un trabajo publicado en 2015 asocian la presencia de Ac de subclase IgG3 DSA con mayor incidencia de AMR agudo y con un menor tiempo de rechazo y la presencia de Ac C1q DSA con un mayor fracaso del injerto (Lefaucheur C y col. 2015). PERSPECTIVAS 150 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal En lo que respecta a los estudios de Ac anti-MICA, en la mayoría de los estudios no se analiza la especificidad de los Ac ni se estudia el tipaje MICA del donante. La especificidad de los Ac contra antígenos MICA se debe verificar realizando el tipaje MICA del donante y del receptor. En nuestro estudio 9 pacientes desarrollaron Ac anti-MICA de novo (uno de tipo DSA) y no se observó ninguna asociación entre la presencia de Ac anti-MICA post-trasplante y una peor evolución del trasplante renal. Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Conclusiones 153 1. En relación con las técnicas de detección de anticuerpos fijadores de complemento frente a moléculas HLA, se ha desarrollado una metodología para detectar anticuerpos de isotipos IgG1 e IgG3 con buen grado de concordancia con la técnica comercial de detección de moléculas HLA recombinantes con anti-C1q. Ninguno de estos métodos de detección es adecuado para el escrutinio con moléculas HLA nativas. 2. Las técnicas de detección de anticuerpos anti-HLA fijadores de complemento presentan ciertos problemas de sensibilidad, que sugieren que el grupo de pacientes con prueba cruzada virtual negativa para estos anticuerpos, es en realidad un grupo mixto donde se encuentran pacientes con anticuerpos anti- HLA específicos frente moléculas del donante de CONCLUSIONES 160 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal o Arsenault J, Lehoux J, Lanthier L et al. A singlenucleotide polymorphism of alanine to threonine at position 163 of the human angiotensin II type 1 receptor impairs Losartan affinity. Pharmacogenet Genomics 2010; 20: 377-388. o Bahram S. MIC genes: from genetics to biology. Adv. Immunol 2000; 76: 1-60. o Bahram S, Bresnahan M, Geraghty DE et al. A second linege of mammalian major histocompatibility complex class I genes. Proc Natl Acad Sdi U.S.A. 1994; 91: 6259-6263. o Banasik M, Boratyńska M, Kościelska-Kasprzak K et al. 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Se seleccionaron 2 sueros según sus resultados en el ensayo convencional, uno negativo, suero1, y otro con Ac anti-clase I y II, suero 2. Los valores de MFI de la microesfera control positivo (ver Pacientes y Métodos) que se obtuvieron utilizando diferentes diluciones del 2º Ac (anti-IgG1) se muestran en la tabla A1 ANEXO 1: ENSAYOS PREVIOS 182 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Tabla A1: Valores de MFI de la microesfera control positivo en el ensayo de escrutinio para diferentes diluciones del 2º Ac. D D DI IIL L LU U UC C CI IIÓ Ó ÓN N N 2 2 2º º º A A Ac c c* * * M M MF F FI II M M MI IIC C CR R RO O OE E ES S SF F FE E ER R RA A A C C CP P P S S SU U UE E ER R RO O O 1 1 1 M M MF F FI II M M MI IIC C CR R RO O OE E ES S SF F FE E ER R RA A A C C CP P P S S SU U UE E ER R RO O O 2 2 2 1 1 1/ / /4 4 40 0 00 0 00 0 0 1145 999 1 1 1/ / /2 2 20 0 00 0 00 0 0 1839 1857 1 1 1/ / /1 1 10 0 00 0 00 0 0 2750 2488 1 1 1/ / /6 6 64 4 40 0 0 2918 3155 1 1 1/ / /5 5 50 0 00 0 0 4053 3724 1 1 1/ / /4 4 40 0 00 0 0 2261 2112 1 1 1/ / /3 3 32 2 20 0 0 3603 3966 1 1 1/ / /2 2 20 0 00 0 0 3167 3071 1 1 1/ / /1 1 16 6 60 0 0 4871 4585 1 1 1/ / /1 1 10 0 00 0 0 4193 5627 1 1 1/ / /8 8 80 0 0 4890 5265 1 1 1/ / /5 5 50 0 0 5314 5228 1 1 1/ / /4 4 40 0 0 5047 5694 1 1 1/ / /2 2 20 0 0 5736 6253 1 1 1/ / /1 1 10 0 0 5960 6600 CP: control positivo. * El 2ª Ac ensayado fue la anti-IgG1 Se decidió utilizar la dilución 1/10 para todas las subclases de IgG porque los valores de MFI de la microesfera control positivo eran los más altos y con esta dilución se obtenía una mejor correlación tanto en lo que se Anexos 183 refería al número de grupos de microesferas positivos como al nivel de MFI entre el ensayo convencional y el ensayo con anti-IgG1 para el suero 2. Además, a la dilución seleccionada no se detectaban falsos positivos con el suero 1. Valor de MFI de la microesfera control positivo con los diferentes 2º Ac. La figura A1 muestra la media de los valores de MFI de la microesfera control positivo en las determinaciones previas del ensayo de escrutinio tanto con el suero empleado como control negativo propio como con el control negativo del kit con los diferentes 2º Ac utilizados. En algunos casos, se analizaron mezclas de diferentes 2º Ac. En cada ensayo se incluía un control negativo propio y se realizaba una determinación en paralelo con IgG además de con el 2º Ac que se estaba ensayando. Se muestra también la media de los valores de MFI de esta microesfera en el ensayo convencional como referencia. 184 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Figura A1: MFI de la microesfera control positivo en el ensayo de escrutinio. En el eje de abscisas se representan los valores de MFI. IgG n=16; C1q n=4; IgG1 n=3; IgG2 n=2; IgG3 n=2; IgG4 n=2 e IgG1+IgG3 n=7. La línea indica la media de cada grupo. Resultados del ensayo de escrutinio en las pruebas previas. En la tabla A2 se muestran los resultados preliminares obtenidos en cada ensayo con los distintos 2º Ac en las pruebas previas para clase I (A2a) y para clase II (A2b). Los pacientes incluidos en estas determinaciones habían sido estudiados previamente en el Servicio de Inmunología del Anexos 185 hospital universitario Virgen del Rocío y presentaban alguna de estas 2 características: o Historial de sueros positivos con CDC que podrían ser positivos en el ensayo anti-IgG1/IgG3 y/o C1q. o Historial de Ac positivo con técnica de Luminex® y negativo con CDC que, a parte de otras posibilidades, podrían representar sueros con Ac anti- HLA no fijadores de C y ser, por tanto, positivos en los ensayos con anti-IgG2/IgG4. En base a los niveles de MFI detectados en estas muestras nos planteamos la necesidad de realizar una normalización de los datos poder comparar los resultados de los distintos 2º Ac utilizados. 192 Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Núñez-Roldán y M.F González-Escribano. Reply: “Interlekin-28B genetic variants and hepatitis virus infection by different viral genotypes”. Hepatology 2011; 53: 367-368. Relevancia clínica de los anticuerpos en el trasplante renal Anexos 195 COMUNICACIONES ORALES A CONGRESOS o “Influencia del polimorfismo rs12979860 de IL28B en la respuesta al tratamiento de pacientes con hepatitis C trasplantados de hígado”. F. Torrecillas-Nicolás, J.M. Pascasio, M.A. Montes-Cano, J.M. Sousa, S. Burillo- Sanz, F. Gavilán, M.A. Gómez-Bravo, A. Núñez y M.F. González-Escribano. XXXVII Congreso de la Sociedad Española de Inmunología, Salamanca. Mayo 2013. o “Influence of the presence of pretransplant antiangiotensin II type 1 receptor antibodies in the outcome of kidney transplant”. M.F Torrecillas-Nicolás, J.L Caro-Oleas, G. Bernal-Blanco, F.M González- Roncero, M.A Gentil-Govantes, M.F González- Escribano, A. Núñez-Roldán. XXXVIII Congreso de la Sociedad Española de Inmunología, Badajoz. Mayo 2014. o “Influencia de la presencia de anticuerpos anti receptor de angiotensina II tipo 1 antes del trasplante en la evolución del trasplante renal”. M.F Torrecillas- Nicolás, J.L Caro-Oleas, F.M González-Roncero, G. Bernal-Blanco, M.A Gentil-Govantes, M.F González- Escribano, A. Núñez-Roldán. III Congreso de la Sociedad Española de Trasplante, Valencia. Junio 2014. ANEXO 3