Papel del p53 y los receptores de muerte celular en la supervivencia de paciente con hepatocarcinoma: implicación en el mecanismo antitumoral de Sorafenib

UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA Departamento de Cirugía P Pa ap pe el l d de el l p p5 53 3 y y l lo os s r re ec ce ep pt to or re es s d de e m mu ue er rt te e c ce el lu ul la ar r e en n l la a s su up pe er rv vi iv ve en nc ci ia a d de e p pa ac ci ie en nt te e c co on n h he ep pa at to oc ca ar rc ci in no om ma a. . I Im mp pl li ic ca ac ci ió ón n e en n e el l m me ec ca an ni is sm mo o a an nt ti it tu um mo or ra al l d de e S So or ra af fe en ni ib b MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR Virginia Gómez Cabeza de Vaca Bajo la dirección de los doctores Prof. Francisco Javier Padillo Ruiz Dr. Jordi Muntané Relat Dr. José María Álamo Martínez Sevilla, 2016 UNIVERSIDAD DE SEVILLA FACULTAD DE MEDICINA TESIS DOCTORAL Papel del p53 y los receptores de muerte celular en la supervivencia de paciente con hepatocarcinoma. Implicación en el mecanismo antitumoral de Sorafenib Doctorando: Virginia Gómez Cabeza de Vaca Directores: Prof. Francisco Javier Padillo Ruíz Dr. Jordi Muntané Relat Dr. José María Álamo Martínez D. FRANCISCO JAVIER PADILLO RUÍZ, CATEDRÁTICO DE CIRUGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA; D. JORDI MUNTANÉ RELAT, SUBDIRECTOR I+D+I DE LA UNIDAD DE GESTIÓN CLÍNICA INTERCENTRO CIRUGÍA GENERAL Y DIGESTIVA DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO VIRGEN MACARENA-VIRGEN DEL ROCÍO Y D. JOSÉ MARÍA ÁLAMO MARTÍNEZ, PROFESOR ASOCIADO DE CIRUGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA, CERTIFICAN: Que Doña Virginia Gómez Cabeza de Vaca ha realizado bajo nuestra dirección su Tesis Doctoral titulada: “PAPEL DEL P53 Y LOS RECEPTORES DE MUERTE CELULAR EN LA SUPERVIVENCIA DE PACIENTES CON HEPATOCARCINOMA. IMPLICACIÓN EN EL MECANISMO ANTITUMORAL DE SORAFENIB” finalizada, reúne las condiciones necesarias para obtener el grado de Doctor, por lo que autorizamos la presentación de la misma para su defensa y calificación por el Tribunal correspondiente. Y para que conste, expiden el siguiente certificado en Sevilla a de de 201. Fdo. Francisco Javier Padillo Ruiz Fdo. Jordi Muntané Relat Fdo. José María Álamo Martínez “El futuro tiene muchos nombres. Para los débiles es lo inalcanzable. Para los temerosos, lo desconocido. Para los valientes es la oportunidad”. Víctor Hugo Agradecimientos Quisiera agradecer a mis directores de Tesis la oportunidad de haber terminado este trabajo que comencé siendo Residente de Cirugía en el Hospital Virgen del Rocío de Sevilla. Al Dr. D. José María Álamo siempre dispuesto a colaborar, al Dr. Prof. D. Javier Padillo, persona brillante y emprendedora con quien he tenido el privilegio de trabajar y especialmente al Dr. D. Jordi Muntané un investigador incansable y ejemplo a seguir. A los que fueron mis compañeros Residentes y Adjuntos de Sevilla, de todos guardo un grato recuerdo y sobre todo a mis actuales compañeros del Servicio de Cirugía General del Hospital San Roque de Las Palmas de Gran Canaria donde voy feliz a trabajar. A mis padres Antonio y Juani por ser mi ejemplo de vida y a mis hermanos Juan Diego y Antoñito por ser mis mejores amigos. A mi cuñada Regina por ser mi hermana. A Paco, mi marido y amigo por alegrarme la vida y acompañarme en esta aventura que es vivir. A nuestro hijo, Pedro, un regalo del cielo que nos hace levantarnos con ilusión por las mañanas. Índice de abreviaturas 1.5. TRATAMIENTO ……………………………….. 49 1.5.1. RESECCIÓN QUIRÚRGICA 1.5.2. TRASPLANTE HEPÁTICO 1.5.3. QUIMIOEMBOLIZACIÓN ARTERIAL 1.5.4. RADIOFRECUENCIA 1.5.5. RADIOTERAPIA 1.5.6. ALCOHOLIZACIÓN PERCUTÁNEA 1.5.7. QUIMIOTERAPIA Y OTROS TRATAMIENTOS SISTÉMICOS 1.5.8. ANÁLOGOS DE HORMONAS 1.5.9. PERSPECTIVAS FUTURAS 1.6. CRIBADO Y SEGUIMIENTO …………………. 80 1.7. MARCADORES BIOLÓGICOS ……………….. 82 1.7.1. ALFA-FETOPROTEÍNA 1.7.2. OTROS MARCADORES BIOLÓGICOS 1.7.3. MARCADORES GENÉTICOS 2. OBJETIVOS ………………………………………………... 103 3. MATERIALES Y MÉTODO ……………………………….. 105 4. RESULTADOS …………………………………………. 118 5. DISCUSIÓN ……………………………………………. 167 6. CONCLUSIONES ………..……………………………. 173 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ………………. 175 Introducción Introducción -- 19 1.1.- BIOLOGÍA MOLECULAR DEL HEPATOCARCINOMA 1.1.1.- ETIOPATOGENIA El carcinoma hepatocelular (CHC), es el cáncer primario de hígado más frecuente (90%) que representa la quinta neoplasia maligna más común en todo el mundo, tercera causa de muerte relacionada con cáncer y con un número estimado de nuevos casos anual creciente que oscila entre 500 000 a 1 millón y con un número de fallecidos entre 600 000 y 700 000 por año (1). Existe una distribución geográfica de manera que la incidencia es elevada en países en vías de desarrollo como los del sudeste asiático y el África subsahariana; intermedia en Japón y países europeos del área mediterránea, e inferior en el norte de Europa y EE.UU. Se observan diferencias significativas también respecto a factores de riesgo y patogénesis entre los diferentes países (2). La mortalidad de este cáncer es muy elevada, con una tasa de supervivencia a los 5 años del 5-6%. Hasta hace pocos años su diagnóstico se realizaba en fases avanzadas, cuando el paciente presentaba síntomas relacionados con el tumor y éste había alcanzado gran tamaño, lo cual impedía la aplicación de un tratamiento con finalidad curativa; por tanto, el pronóstico a corto plazo era malo. Sin embargo, en los últimos años la introducción de la ecografía, los avances en las técnicas de imagen y la inclusión de los pacientes con un riesgo elevado en un programa de seguimiento intencionado han permitido el diagnóstico de este tumor en un estadio más inicial, en el que es posible la aplicación de un tratamiento con intención curativa mejorando así la tasa de supervivencia (3). Introducción -- 20 El desarrollo del CHC está vinculado a la existencia de cirrosis hepática de cualquier etiología. Sin embargo, también se ha diagnosticado en pacientes no cirróticos con hígado normal. Los factores de riesgo más importantes son (Tabla 1) (4,5): - Edad del paciente y género masculino, asociado a una mayor exposición a los factores de riesgo (6), mayor índice de masa corporal, niveles elevados de andrógenos y disminuidos de estradiol. - Alteraciones inmunológicas (trastornos relacionados con las hepatitis autoinmunes): Su incidencia es baja ya que aparece más frecuentemente en el sexo femenino. - Cirrosis: hasta el 90% de los CHC aparecen en hígados cirróticos o con fibrosis avanzada. No está claro si esta asociación está relacionada con un aumento del proceso regenerativo o está provocado por la propia cirrosis. El riesgo de desarrollo de tumor depende del tipo de cirrosis, de manera que cuando la causa es viral (78% de los CHC a nivel mundial) el riesgo es mucho más elevado que cuando estamos ante otras causas no virales como la cirrosis biliar primaria (CBP) (7). En este último caso la incidencia es muy baja ya que la prevalencia de esta enfermedad es baja y porque aparece más frecuentemente en el sexo femenino, de todas maneras el riesgo existe, siendo del 0,3% en fases precoces de la enfermedad y del 1,5% en fases más avanzadas. La incidencia de CHC sobre hígado no cirrótico asciende al 10-20% pero se ha observado que aunque no presentan una cirrosis confirmada mediante biopsia, aparece cierto grado de fibrosis, esteatosis o displasia celular. Introducción -- 21 - VHB: se ha estimado que hasta 40 millones de personas son portadoras de este virus, es por ello que es tan frecuentes en Asia Oriental y África subsahariana (zona endémica de VHB) y además se ha demostrado que el riesgo relativo de desarrollar un CHC es mucho más alto en los portadores crónicos de HbsAg positivo y aún mayor en los portadores HbeAg positivo de forma concomitante. Aunque también influyen factores como la carga del VHB en sangre y la edad del paciente. Por el contrario, -el tratamiento del VHB con interferón o análogos de los nucleótidos reduce el riesgo de forma significativa. Las campañas de vacunación en áreas de alta incidencia de HVB como Taiwan han permitido una disminución de la incidencia de CHC hasta el 60% (8,9). - La infección crónica por el VHC. Es la causa más frecuente en las zonas de baja e intermedia prevalencia como Estados Unidos, Europa y el área mediterránea. En los países orientales más del 70% de los pacientes con CHC presentan anticuerpos anti-HVC en suero. El riesgo relativo de desarrollar un CHC es mucho más alto en los pacientes positivos para VHC afectos de cirrosis o fibrosis avanzada y la media de aparición desde la infección por VHC es 30 años. Sin embargo, también puede ocurrir en portadores sanos del virus C. Algunos marcadores de inflamación involucrados son: las células CD68+, la presencia de 8- hidroxideoxiguanina en el ADN y la proteína 4-hidroxinonenal (10,11,12). Los buenos resultados obtenidos con Interferón y Ribavirina en lo que se refiere a mejor evolución de la infección han contribuido a una disminución sustancial de la incidencia de CHC. Introducción -- 22 - Hemocromatosis: esta enfermedad se caracteriza por la absorción aumentada de hierro que a su vez incrementa las reacciones oxidativas intracelulares. Es aún controvertido si el riesgo de desarrollo de CHC es mayor en estos pacientes que en otros con cirrosis de etiología diferente. Una vez que aparece la cirrosis el riesgo anual de aparición de CHC es del 5%. También se asocia, al igual que con otros factores, a la diabetes mellitus tipo 2. Otras entidades como la β-talasemia heterocigota también se asocia a un aumento de CHC (13). - Las toxinas ambientales como la aflatoxina B1 (14), las aguas contaminadas y otras infecciones como la esquistosomiasis. En zonas rurales de Asia oriental y África, existen dos contaminantes relacionados con el desarrollo del CHC. Uno es la aflatoxina B1, que es una micotoxina que contamina los granos de algunos cereales, legumbres y frutos secos como el maíz, la soja y los cacahuetes, cuyo efecto oncogénico se ha relacionado con la mutación del gen p53. El otro, es la toxina procedente de algas azul verdosas (microcystin), que contaminan el agua. - Enolismo. El consumo elevado (mayor de 50-70 gramos al día) y prolongado de alcohol ha demostrado ser una causa directa de desarrollo de CHC. En Asia contribuye a un 10% de los CHC y al doble, en el caso de Europa. A pesar de que la ingesta alcohólica está relacionada con el riesgo de desarrollar cirrosis y CHC, la relación existente entre la cantidad y la duración del hábito enólico con el desarrollo del proceso maligno no están claramente determinadas. La Introducción -- 23 coexistencia de infección crónica por VHC y VHB, y la ingesta de alcohol potencia el riesgo de desarrollar CHC. - La esteatohepatitis no alcohólica. Es una de las causas más comunes de enfermedad hepática en USA. Su evolución va desde una esteatosis leve al desarrollo de cirrosis. Se asocia estrechamente con la diabetes mellitus de tipo 2 y la obesidad, como parte del síndrome metabólico. Se estima que hasta el 70% de pacientes diabéticos presentan esteatosis hepática, ascendiendo al 9% en el caso de pacientes obesos. - Enfermedades metabólicas: déficit de α1 anti-tripsina, porfiria cutánea parda, tirosinemia, hipercitrulinemia, glucogenosis grado IV, intolerancia hereditaria a la fructosa, enfermedad de Wilson, son considerados factores de bajo riesgo de CHC. - Adenomas, anticonceptivos y andrógenos: Los adenomas asociados a glucogenosis grado IV (15), a andrógenos o a anabolizantes pueden transformarse en CHC incluso en hígados no cirróticos. La enfermedad de Fanconi también es un factor de riesgo sobre todo si se trata con esteroides. En el caso de la ingesta de anticonceptivos, el riesgo de transformación de adenomas en CHC existe pero es menor al 10%. Esta transformación es más frecuente en nódulos mayores de 5 cm, en el género masculino y se relaciona a su vez con mutaciones a nivel de las - En algunas series, del total de pacientes sometidos a hepatectomía parcial (HP), el 7,9% tenían VHB y el 60%, VHC. En el caso de los pacientes sometidos a trasplante hepático (TH), el 7,1% tenían VHB, el 74%, VHC, y el 16% eran consumidores de alcohol. Sin embargo, en Introducción -- 24 EEUU, en el 25% de los casos no se encuentra una causa clara que justifique la aparición de la enfermedad. 1.1.2.- ONCOGÉNESIS La oncogénesis del CHC se asocia con un proceso inflamatorio crónico del tejido hepático cirrótico (vía indirecta) y la estabilidad genética de los hepatocitos (vía directa). Por ejemplo, en el hígado infectado con el VHC, la reacción inflamatoria crónica, las especies reactivas del oxígeno (ROS), daño en el ADN celular, estrés del retículo endoplásmico (RE), la apoptosis y la respuesta autofágica están involucrados en la inducción de CHC (16). a) VHB Y VHC El mecanismo mejor conocido de la oncogénesis del CHC es la respuesta inflamatoria crónica. En el caso de infección por el VHB o el VHC, serán los linfocitos T citotóxicos (CTL), específicos frente a las proteínas virales los que provoquen el daño a nivel del hepatocito. Estos ciclos mantenidos de necrosis, inflamación y regeneración (renovación celular acelerada) causan Introducción -- 25 mutaciones en el ADN y por lo tanto, pueden inducir a su vez la aparición de CHC por la propagación de lesiones oncogénicos. Este mecanismo de hepatocarcinogénesis se encuentra promovido por el estrés oxidativo de los hepatocitos generadoras a partir de diversas fuentes intracelulares (mitocondria, retículo endoplásmico, NADPH oxidasa, y síntesis de derivados del acido araquidónico) y la activación de las células estrelladas que promueven la aparición de mutaciones de ADN celular contribuyendo a un estado pro-carcinógeno en el tejido. En el caso del VHB se han demostrado que existen unos mecanismos más directos de carcinogénesis que consisten en la integración del ADN del VHB a nivel del ADN de los hepatocitos induciendo así alteraciones en la pauta de lectura en el ADN celular y genes relevantes en la aparición del cáncer, como son la telomerasa, transcriptasa inversa, y otros. Además, el VHB puede ejercer otra acción directa sobre la génesis del cáncer, mediante la inactivación de la proteína p53 (proteína supresora de tumores) y por la activación de la expresión de múltiples genes de control del crecimiento (activación transcripcional de HBX). De acuerdo con algunas observaciones, la delección a nivel de la región pre-S de algunas proteínas del VHB está particularmente involucrada en el desarrollo de CHC mediante la inducción de estrés a nivel del retículo endoplásmico y, en consecuencia, generando daños celulares. Aunque el VHC presenta muchas diferencias virológicas significativas con el VHB, múltiples mecanismos de inducción de carcinogénesis son comunes para ambos virus. El daño continuado a los hepatocitos que provoca la acumulación de lesiones en el ADN, y su propagación a través de la Introducción -- 32 Es más frecuente en varones con una proporción de entre 2:1 y 6:1, dependiendo del área geográfica. En España en el año 2007 se registraron 7.500 ingresos hospitalarios por cáncer hepático o de vías biliares, y según los registros de mortalidad, se produjeron un total de 2.437 defunciones por CHC (637 mujeres y 1.800 varones). (22,23). En Cataluña los ingresos hospitalarios fueron 1.543 y las defunciones 493 (139 mujeres y 354 varones). En el Hospital Vall d´Hebrón un total de 165 pacientes ingresaron en el año 2007 por CHC, pero solo 24 pacientes (14,5%) fueron sometidos a cirugía. 1.2.2.- PRESENTACIÓN CLÍNICA Hay principalmente tres situaciones de diagnóstico: - Hallazgo casual durante un estudio de rutina. - Hallazgo casual durante estudio de rutina en pacientes con alteración de la función hepática o con otra condición patológica. - Presentación mediante síntomas relacionados con el tumor: la severidad de los síntomas está relacionada con el estadio del tumor y con la función hepática del hígado sano. Habitualmente el CHC en estadios iniciales no presenta síntomas. Puesto que la mayoría de ellos se desarrollan sobre un hígado cirrótico, el paciente puede padecer los síntomas propios de la cirrosis. La descompensación de un cirrótico debe hacer pensar en la aparición de un CHC entre otras causas de descompensación (24). Un porcentaje mínimo de pacientes, cuyo CHC se desarrolla sobre un hígado sano, puede presentar síntomas inespecíficos del tipo dolor, pérdida de peso, masa palpable, etc (25). Existen series en las cuales, de los pacientes sometidos a HP el 74% tenían una cirrosis de base Introducción -- 33 (66% Child-Pugh A y 8% Child-Pugh B); el 20% presentaban diferentes grados de hepatopatía crónica y el 6% un hígado sano. Entre los pacientes sometidos a TH el 96,5% tenían cirrosis de base (48% Child-Pugh A, 40% Child-Pugh B, 8,5% Child-Pugh C), el 2% un CHC sobre hepatopatía crónica y el 1,5% tenían un hígado sano. Todos, excepto los casos presentados sobre hígado sano, fueron diagnosticados en el transcurso de controles rutinarios de la hepatopatía de base (26). Han sido descritas en la literatura otras presentaciones más raras, como son ictericia obstructiva cuando la tumoración comprime la vía biliar, hemobilia si la tumoración se rompe hacia el conducto biliar, hemoperitoneo si se rompe hacia el peritoneo (5-15%), dolor óseo o disnea si la presentación es metastásica, fiebre si el CHC es grande y presenta necrosis central tumoral, etc. Algunos pacientes pueden presentar síntomas diversos secundarios a síndrome paraneoplásico. Los más frecuentemente descritos son hipoglucemia producida por gran metabolismo energético del tumor y secreción de sustancias semejantes a la insulina, eritrocitosis por secreción de eritropoyetina, hipercalcemia por secreción de proteínas relacionadas con la paratohormona, diarrea acuosa por secreción de péptidos intestinales vasoactivos del tipo de prostaglandinas, y síntomas cutáneos diversos (dermatomiositis, pénfigo, queratosis seborreica, pitiriasis, porfiria cutánea tarda, etc.). En ocasiones puede presentar síntomas propios de los lugares a los que metastatiza más frecuentemente (pulmón, ganglios linfáticos, huesos, suprarrenal y cerebro). Introducción -- 34 1.3.- DIAGNÓSTICO 1.3.1.- PRUEBAS DE IMAGEN El diagnóstico de sospecha se realiza habitualmente mediante las pruebas de imagen. El objetivo de estas pruebas es el cribado de pacientes de alto riesgo, la identificación de pequeñas lesiones, el diagnóstico diferencial entre las lesiones ocupantes de espacio (LOEs) y la selección del tratamiento adecuado para cada paciente (27). El número de lesiones, el tamaño y su extensión, la presencia de nódulos satélites, invasión vascular, afectación extrahepática y enfermedad subyacente del hígado, son factores importantes a la hora del elegir el mejor tratamiento.  Ecografía La imagen ecográfica puede ser hipoecoica, isoecoica o hiperecoica. Se le atribuye una sensibilidad del 60% (disminuye considerablemente en la cirrosis avanzada) y una especificidad del 97%. Identifica el 85- 95% de las lesiones de 3-5 cm y el 60-80% de los tumores de 1 cm aunque esto puede estar influenciado por la localización del tumor. Los tumores pequeños, suelen aparecer como imágenes hipoecoicas y homogéneas que a veces dificultan el diagnóstico diferencial de nódulos displásicos no neoplásicos. A media que aumentan de tamaño, suelen adquirir un aspecto heterogéneo y pueden ser hipo o hiperecoicos con un anillo hipoecogénico alrededor que corresponde a la cápsula fibrosa. Introducción -- 35 Su utilidad para el estudio de extensión de la enfermedad es limitada, principalmente por la baja sensibilidad en la detección de las metástasis intrahepáticas menores de 2 cm y por su escasa capacidad para detectar infiltración de estructuras vasculares sobre todo en hígados cirróticos. La aplicación del Doppler puede poner de manifiesto una arteria nutricia o las venas de drenaje. También en la ecografía pueden ponerse de manifiesto, signos indirectos de cirrosis como ascitis, atrofia de algún segmento, esplenomegalia, circulación colateral. Las nuevas tecnologías ecográficas con contraste son muy prometedoras en la mejoría del diagnóstico sin embargo no parece que aumenten su sensibilidad (28).  Tomografía computarizada (TC) abdominal. Se le atribuye una sensibilidad del 68% y una especificidad del 93%. La hiperintensidad en fase arterial con hipointensidad en fase portal y venosa permite el diagnóstico en tumores > 2 cm. En CHC menos vascularizados de menos de 2 cm la dificultad diagnóstica puede ser mayor. En ocasiones la hiperintensidad puede estar asociada a depósitos de hierro o a infiltración grasa. Aporta la ventaja de poder valorar la infiltración vascular.  Resonancia magnética (RM) abdominal. Es la prueba de elección para el diagnóstico diferencial del CHC con otros tumores hepáticos sobre todo mayores de 2 cm. El patrón típico del CHC es un patrón en mosaico y la presencia de cápsula (29). Introducción -- 36 Tiene la ventaja de no requerir contraste nefrotóxico, por lo que estaría indicada en pacientes con insuficiencia renal o pacientes con alergia a los contrastes. El patrón de captación es hiperintensidad en T2 e hipointensidad en T1 (54%) o hipointenso en T1 e hiperintenso en T2 (16%). Se le atribuye una sensibilidad de 81% y una especificidad del 85%. Las nuevas técnicas de angiorresonancia trifásica consiguen una alta sensibilidad al detectar nódulos de hasta 10 mm. Se le atribuye una mayor precisión en diferenciar el CHC de los nódulos displásicos, el hemangioma y la esteatosis focal. La TC y la RM presentan una mayor sensibilidad para determinar la extensión de esta neoplasia; aun así, subestiman el 30-50% de los casos cuando se comparan con el estudio patológico del explante hepático. Recientemente se ha comparado la eficacia diagnóstica de la angiorresonancia magnética y la TC espiral para el estudio de extensión del CHC (30). La angiorresonancia fue superior a la TC para el diagnóstico de tumores de 10-20 mm (el 76 frente al 61%; p = 0,001), mientras que no hubo diferencias entre las dos técnicas en cuanto a la detección de tumores con diámetro mayor de 2 cm o menor de 1 cm. Por tanto, se propone la angiorresonancia magnética como la técnica más adecuada para el estudio de extensión del CHC previo a la aplicación de tratamientos con una sensibilidad del 100% para nódulos mayores de 2 cm, 89% para aquellos de 10 a 20 mm y 34% para nódulos de menos de 1 cm.  Angiografía Es una técnica que ha dejado de utilizarse para el diagnóstico puro. Sigue siendo utilizada para tratamiento en casos de quimioembolización o para Introducción -- 37 control de un hemoperitoneo secundario a rotura de CHC. Aparecen falsos negativos en casos de tumores necróticos, avasculares o fibróticos.  Angiografía combinada con TC o RM abdominal. Es muy invasiva y no parece obtener mejores resultados que el TC o la RMN.  Gammagrafía con tecnecio-99m marcado con una antialfa-fetoproteína. Es una técnica con limitada experiencia.  Tomografía por emisión de positrones (PET)-TC. El papel de la PET-TC en el diagnóstico del CHC es incierto. El CHC acumula cantidades variables de 18F-fluorodesoxiglucosa lo que limita su sensibilidad al 55-65% con muchos falsos positivos y negativos. En cambio, tiene mejor sensibilidad para detectar metástasis a distancia siempre que sean mayores de 1 cm. Así, en las metástasis pulmonares tiene una sensibilidad del 100% y una especificidad del 84%; en las metástasis ganglionares, una sensibilidad del 100% y una especificidad del 94%. 1.3.2.- MARCADORES SEROLÓGICOS Los marcadores serológicos ayudan a complementar el diagnóstico por la imagen. El más conocido es la α-fetoproteína (Ver apartado de MARCADORES BIOLÓGICOS). Otros marcadores serológicos, que no han superado a la α-fetoproteína (AFP), son la lecitina, la des-γ-carboxiprotrombina, las isoenzimas de la γ- Introducción -- 38 glutamiltranspeptidasa, el factor de crecimiento β-1 urinario, las moléculas de adhesión intercelular de tipo 1 y la α-L-fucosidasa sérica. Cada vez están cobrando más importancia los estudios de biología molecular. Se han estudiado numerosos marcadores para el diagnóstico precoz del CHC mediante las firmas genéticas o patrones diferenciales de expresión proteíca. Incluso existen diferentes marcadores moleculares que nos permitirían clasificar los CHC de acuerdo con el mecanismo de activación que utilicen: la vía de la Wnt-catenina, la vía de la proliferación (asociada a alteraciones de los cromosomas), u otras vías. Todo esto se expondrá con más detalle en el apartado de “Marcadores Biológicos”. 1.3.3-. DIAGNÓSTICO HISTOLÓGICO La confirmación del diagnóstico se lleva a cabo por citología e histología. La biopsia no está indicada de rutina en pacientes cirróticos sobre todo por el riesgo de hemorragia, aparición de dolor y posibilidad de siembre tumoral en el trayecto de la aguja (1-5%) o extensión vascular. Con PAAF se han publicado hasta 30-40% de falsos negativos. 1.3.4-. ALGORITMO DIAGNÓSTICO DEL CHC Como hemos visto, para el diagnóstico de CHC disponemos de técnicas radiológicas, determinación de valores de AFP y de otros biomarcadores y biopsia. La secuencia en la utilización de éstas depende del tamaño de la lesión en la ecografía abdominal (tabla 2) (31): Introducción -- 39 – Si se aprecia un nódulo mayor de 2 cm (sobre hígado cirrótico) en la ecografía abdominal, con características radiológicas (lesión hipervascular en fase arterial que se lava en fase venosa) de CHC en una prueba dinámica (TC o RM con contraste) o con AFP superior a 200 ng/ml, no es precisa la biopsia. Sin embargo, aquéllos con un aspecto radiológico atípico o que se detectan en un paciente sin cirrosis deben someterse a biopsia. Posteriormente expondremos el seguimiento de los pacientes cirróticos en el cribaje de CHC. – Los nódulos de 1-2 cm de diámetro deben estudiarse con 2 pruebas dinámicas. Si el aspecto radiológico en 2 técnicas es típico de CHC, debe tratarse como si lo fuera; si los hallazgos en las 2 pruebas no son coincidentes o no muestran características típicas de CHC, debe realizarse biopsia de la lesión. – Las lesiones menores de 1 cm deben someterse a ecografías periódicas cada 3-6 meses; si en un período de 2 años la lesión no ha aumentado de tamaño, se continuará con el esquema de detección previo. Introducción -- 40 Tabla 2. Algoritmo diagnóstico del HCC 1.4.- EVOLUCIÓN NATURAL Y SISTEMAS DE ESTADIFICACIÓN Tradicionalmente, la historia natural del CHC es la de un tumor de pronóstico infausto de manera que la esperanza de vida se expresa habitualmente en semanas. En un análisis reciente de los resultados de grupos controles de estudios controlados y aleatorizados, la media de supervivencia en pacientes con enfermedad avanzada y síntomas asociados al tumor es de 6 meses (32). En un 50-60% de estos casos la mortalidad está relacionada con el propio tumor, mientras que el sangrado y el fallo hepático son responsables del resto de los fallecimientos (30-10%). En el caso de pacientes no tratados y con Introducción -- 41 enfermedad no terminal en el momento del diagnóstico el pronóstico es mejor de lo esperado, llegando a supervivencias de 2 (40-56%) y 3 años (13-28%). En pacientes asintomáticos y sin invasión tumoral la supervivencia puede llegar a 3 años en el 50% de los pacientes. Estos datos se basan en el diagnóstico de la enfermedad en estadios precoces donde aún la función hepática está conservada, dado que esta última condiciona por sí misma la indicación, la aplicabilidad y el éxito del posible tratamiento. El objetivo principal de los sistemas de estadificación es predecir la evolución de estos pacientes. También permite anticiparnos al pronóstico de la enfermedad y ayuda en el momento de elegir el tratamiento. La supervivencia de estos pacientes viene influenciada sobre todo por la extensión local del tumor, la presencia y la gravedad de los síntomas asociados a la enfermedad y al grado de severidad y evolución de la cirrosis subyacente (33). No obstante, en el caso del CHC no ha sido posible elaborar un sistema de clasificación pronóstica y estadificación aceptado de forma universal y podemos encontrar más de 8 clasificaciones pronósticas (34). Esto se debe a que el CHC es una enfermedad muy heterogénea según las distintas zonas del mundo (35), lo que refleja los diferentes factores de riesgo y epidemiológicos existentes. Los factores pronósticos claves se conocen sólo parcialmente y varían en cada estadio evolutivo de la enfermedad. Los sistemas de estadificación más recientes intentan incluir los tres parámetros más importantes: - Aunque la estadificación inicial se ha basado en la clasificación TNM (Tabla 3) las particularidades fisiopatológicas de este tumor han obligado a la implementación de ciertas modificaciones en países de oriente Introducción -- 48 Tabla 7: estadiaje y tratamiento. BCLC 2016 ESTRATEGIAS TERAPÉUTICAS EN EL TRATAMIENTO DEL HCC Barcelona Liver Cancer (BCLC) staging classification Veryearlystage(0) Nódulo único ≤2 cm Child-Pugh A PS 0 Diagnóstico Tratamiento Candidato a trasplante hepático ortotópico (THO) No Si Ablación Intermediatestage(B) Multinodular Child-Pugh A-B PS 0 TACE Advancedstage (C) Invasión portal Nódulos extrahepáticos N1, M1 Child-Pugh A-B PS 1-2 Sorafenib Child-Pugh C PS 3-4 Terminal stage(D) Mejor tratamiento paliativo Tratamiento efectivos con beneficio terapéutico Earlystage(A) Nódulo único, o hasta tres nódulos ≤ 3 cm Child-Pugh A-B PS 0 Nódulo único Hipertensión portal /bilirrubina Normal Resección Incrementada Hasta tres nódulos ≤ 3 cm Enfermedades asociadas No Si AblaciónTHO Una conferencia de consenso entre la AJCC y la Asociación Americana de hepato-bilio-pancreática estableció en el 2002 que los pacientes considerados para cirugía (resección o trasplante) debían estadiarse de acuerdo al sistema TNM y BCLC (45), mientras que los demás podían estadiarse usando el sistema CLIP. El pronóstico está marcado por las recurrencias hepáticas, que alcanzan hasta el 60% tras 5 años de seguimiento, y que sobre todo en los tumores grandes se producen en los primeros 2 años tras la resección. Además, el 80% de la mortalidad tardía también se debe a la recidiva hepática lo que resalta la importancia del diagnóstico temprano, tanto del tumor primario como de las recidivas, para conseguir unos resultados óptimos. Introducción -- 49 1.5. TRATAMIENTO Al analizar los tratamientos disponibles para el CHC hay que tener en cuenta que en la actualidad no hay ensayos clínicos de gran tamaño ni metaanálisis de datos individuales, por lo que los niveles de evidencia en esta área se derivan de metaanálisis de datos agrupados, de ensayos clínicos aleatorizados de pequeño tamaño o de estudios de cohortes. Los tratamientos curativos únicamente pueden aplicarse a los pacientes diagnosticados en fases tempranas de la enfermedad. Por este motivo, las principales guías de consenso recomiendan la creación de programas de vigilancia mediante ecografía y determinación de AFP. Como hemos señalado previamente, el pronóstico de los pacientes con CHC depende no sólo de la extensión tumoral, sino también de la función hepática, ya que ésta condiciona en muchos casos la supervivencia y la aplicabilidad de los tratamientos. En el caso de HCC complicados con sangrado, no está contraindicado administrar tratamiento. Si el tumor sangra de forma activa y no es tratado, la mortalidad es del 100%. Las diferentes opciones van desde packing, ligadura de arteria hepática, puntos hemostáticos o resección del tumor. 1.5.1-. RESECCIÓN No existe un acuerdo sobre una estrategia común de tratamiento para los pacientes con CHC por lo que se han publicados múltiples guías (46- 48). Las tres intervenciones terapéuticas curativas principales (resección, TH y Introducción -- 50 tratamientos percutáneos) compiten por ser la primera opción terapéutica en aquellos pacientes con HCC de pequeño tamaño y con función hepática conservada. Se ha demostrado que tanto la resección hepática como el TH aportan las mejores cifras de supervivencia en pacientes bien seleccionados (supervivencia a 5 años del 60-70%) (49). Los autores japoneses utilizan la indocianina para identificar los mejores candidatos, mientras que la presión portal y bilirrubina son los parámetros utilizados en Europa. La resección hepática es la primera opción terapéutica curativa para el HCC. El hecho de que en nuestro medio el CHC se desarrolle sobre hígado cirrótico reduce las posibilidades de resección quirúrgica, sin embargo, el hígado sano permite resecciones hepáticas muy amplias, de hasta un 70% únicamente limitadas por aspectos técnicos. La resección hepática está indicada en: – Tumores únicos hepáticos (en general no hay límite de tamaño como criterio de selección). – Sin invasión vascular. –Sin hipertensión portal. –Con buena función hepática y bilirrubina normal. Según el estadiaje TNM, correspondería a los pacientes en los estadios I, II, IIIA, incluyendo los casos de rotura peritoneal. La cirrosis es el factor más determinante a la hora de valorar la resecabilidad del CHC, puesto que de la gravedad de la cirrosis depende la reserva funcional hepática y la capacidad de Introducción -- 51 regeneración del parénquima remanente, de manera que solo podría llevarse a cabo la resección en pacientes con Child-Pugh A y en casos controvertidos algunos Child-Pugh B. La resección en pacientes con estadios B y C de Child- Pugh o de tumores múltiples presenta una morbimortalidad muy alta y malos resultados a largo plazo (50). La cirugía del CHC debe ser oncológica (margen de resección mayor de 1 cm) y preservar parénquima suficiente para evitar la insuficiencia hepática. La técnica habitual consiste en movilización del hígado, seguida de control vascular y seguida de la resección. Las nuevas armas instrumentales han revolucionado la estrategia técnica, de manera que algunos autores preconizan en primer lugar la transección hepática hasta llegar a la vena cava inferior; en segundo lugar, la ligadura de los vasos del hilio hepático y de la vena suprahepática y, en tercer lugar, la movilización del hígado. No hay estudios que demuestren la ventaja de una u otra estrategia para reducir la recurrencia de la enfermedad y mejorar la supervivencia. Un aspecto importante en la resección es la cantidad y calidad de hígado remanente que debe ser suficiente para mantener las funciones vitales del individuo. Como estrategia para aumentar este hígado, algunos autores utilizan la embolización portal previa a la resección (51). Así, pacientes que inicialmente no son candidatos a cirugía, pueden serlo tras la embolización. Y viceversa, pacientes inicialmente resecables no lo serán por progresión de la enfermedad en el intervalo de espera existente entre los dos tiempos de esta estrategia (52). Se ha demostrado que la embolización portal preoperatoria provoca una disminución de la tasa de complicaciones de hasta 50% con la disminución por tanto de la estancia hospitalaria. Si tras la Introducción -- 52 embolización el porcentaje de hígado remanente no crece más de un 10% se debería contraindicar la resección ya que además este es un marcador indirecto de la capacidad de regeneración hepática. Para evitar el crecimiento tumoral acelerado de nódulos existentes en el hígado remanente en casos de CHC bilobar, algunos autores asocian la quimioembolización arterial de los nódulos del hígado remanente con la embolización portal del hígado que se va a resecar. En general, la embolización portal debe ser considerada en casos de volumen remanente inferior al 20% en hígado sano y < 40% en hígado cirrótico. La morbilidad es variable, del 13 al 60% según las series, y la mortalidad perioperatoria a 30 días tras la resección varía del 1 al 24%. Las tasas son más altas para los cirróticos (entre el 14 y el 24%) que para los no cirróticos (entre el 1 y el 7%). Las principales causas de muerte de esta cirugía suelen ser la insuficiencia hepática que está íntimamente relacionada con las pérdidas sanguíneas superiores a 1.500 ml y las infecciones postoperatorias. En los grupos orientales se utiliza el test de aclaramiento de verde de indocianina para estimar la cuantía de resección tolerable, mientras que la medición de la presión portal y los valores de bilirrubina sérica son los parámetros utilizados en Occidente (53). Se han descrito supervivencias libres de enfermedad de entre el 32% y el 62% de los casos y supervivencia del 10 al 90% a 5 años. Esta gran variabilidad depende de factores relacionados con el tumor (tamaño, margen de resección, invasión vascular, presencia de cápsula, grado histológico, actividad de α-fetoproteína, etc.) y de factores relacionados con la enfermedad Introducción -- 53 de base (estadio Child-Pugh, comorbilidades asociadas, etc.), que son los más preponderantes (54). Respecto a la recurrencia del tumor, hay series que reflejan hasta una tasa de recurrencia del 70% a los 5 años, más elevada en cirróticos, que se debe a diseminación del tumor primario o por aparición de tumores de novo, sin apreciarse resultados favorables con ninguna terapia adyuvante sobre este hecho mientras que se considera que la transfusión intraoperatoria de sangre favorece la aparición. En la mayoría de las ocasiones la recurrencia se produce por diseminación del tumor primario y aparece en el primer año (40%), tercer año (60%) y a los 5 años (80%). La realización de una nueva resección es factible en aproximadamente la cuarta parte de los pacientes, pero la recidiva tras esta segunda resección es más precoz y, cuando aparece, lo habitual es que no se pueda resecar ni pueda ofrecerse el TH como opción terapéutica (55) ya que suele ser multifocal en más de un 50% y se asocia a un 15% de metástasis a distancia. Se ha demostrado que la supervivencia también está influenciada por las márgenes de resección de manera que un margen menor de 1 cm se asocia a una supervivencia a los 5 años del 49% mientras que si se amplía a 2 cm la supervivencia puede alcanzar cifras de 75% tras 5 años. 1.5.2-. TRASPLANTE HEPÁTICO El TH es la segunda opción terapéutica curativa para el CHC. Debe considerarse como la primera opción para aquellos pacientes con enfermedad Introducción -- 54 hepática avanzada (Child-Plug B y C) (56) ya que, en teoría, puede curar la cirrosis subyacente y la enfermedad tumoral. En el caso de pacientes con estadio A de Child-Pugh y tumor resecable, la indicación es controvertida (57). Actualmente no se dispone de estudios prospectivos y controlados que comparen estas 2 opciones, pero los estudios retrospectivos favorecen el TH frente a la resección. En estos pacientes, la supervivencia a largo plazo con TH es mejor que con resección (supervivencia a los 5 años del 75%), además de presentar una menor tasa de recidiva. El CHC supone una de las principales indicaciones de TH en nuestro medio. Asimismo, es la única neoplasia sólida que puede ser tributaria de curación mediante trasplante del órgano afectado (58). En la época inicial del TH, los pacientes afectados de CHC no subsidiario de resección quirúrgica presentaban un pésimo pronóstico a corto plazo y no disponían de un tratamiento alternativo eficaz. Por tal motivo, se planteó la posibilidad de realizar un TH como opción terapéutica. La inclusión de pacientes con enfermedad avanzada determinó unos resultados subóptimos, con una tasa de recidiva inadmisible que hizo cuestionar a algunos grupos de investigadores la indicación de TH en estos pacientes. La experiencia y los conocimientos acumulados durante años por los pioneros en trasplante permitieron sentar las bases para un uso racional de los órganos disponibles y evitar la indicación de un tratamiento quirúrgico altamente complejo, costoso e invasivo a pacientes que no se beneficiarían de él, consolidando esta opción como un tratamiento válido en la práctica clínica convencional. Introducción -- 55 La decisión de qué pacientes deben considerarse para TH y dónde se deben establecer los límites para indicarlo ha de estar basada en estudios científicos sólidos, de manera que la política sanitaria se ajuste al concepto de medicina basada en la evidencia y no en ideas bien intencionadas con escasa base racional y dirigida a casos anecdóticos. La limitación del trasplante es la escasez de donantes y, por tanto, el tiempo en lista de espera, lo que puede hacer progresar la enfermedad (59). Los diferentes sistemas de priorización de órganos según la gravedad de la hepatopatía (sistema MELD) pueden favorecer o penalizar el CHC en razón de la puntuación ponderada que se le adjudique. En Cataluña, donde está implantado el sistema MELD, los CHC únicos con un tamaño mayor de 3 cm o más de un nódulo (ninguno mayor de 3 cm), están priorizados con un MELD ponderado de 19 puntos, y se les asigna un punto adicional cada tres meses en lista de espera (documento de consenso de la OCATT-2007 sobre los criterios de priorización de pacientes adultos en lista de espera de TH). El TH también ha sido utilizado como estrategia de rescate en pacientes con recidiva del HCC tras la resección quirúrgica o el deterioro de la función hepática de reserva. Algunos autores afirman que los resultados son similares si se comparan con los sometidos a resección quirúrgica. Otros, en cambio, afirman que esta estrategia conlleva mayor mortalidad operatoria, mayor incidencia de recidiva tumoral y peor supervivencia a los cinco años que si los pacientes fueran considerados de entrada para trasplante (no todos los pacientes resecados cumplen los criterios de trasplante tras la recidiva). La utilización del TACE (quimioembolización transarterial) para reducir el estadiaje del CHC y así cumplir los criterios de TH es otra estrategia usada. La Introducción -- 56 supervivencia actual tras el TH con los criterios de Mazzaferro alcanza cifras de entre el 75 y el 85% a los cuatro años, similares a otras indicaciones no neoplásicas de TH, con una tasa de recurrencia inferior al 15%. Además, estas cifras van en constante aumento en series recientes, lo que indica una mejor selección de los candidatos a trasplante con CHC. No obstante, estas cifras hay que interpretarlas con cautela, ya que no corresponden a la supervivencia por intención de tratamiento. La supervivencia postrasplante no tiene en cuenta los pacientes en lista de espera que han muerto o han salido de la lista por progresión de la enfermedad. Cuando se compara la supervivencia del trasplante con la resección (la mejor opción de tratamiento existente hasta la fecha), ajustada por gravedad de la enfermedad, las supervivencias son semejantes. Los factores de mal pronóstico (asociados a menor supervivencia) tras el TH son el tipo de enfermedad de base (VHC peor pronóstico que el VHB) y el grado de inmunosupresión postrasplante. La tendencia actual es usar en estos pacientes inmunosupresores con propiedades antitumorales como los inhibidores del mTOR (rapamicina y everolimus) frente a inmunosupresores prooncogénicos como los anticalcineurínicos (ciclosporina y tacrolimus). Se está investigando sobre factores pronósticos basados en datos de biología molecular (60). BASE RACIONAL PARA LA BONDAD DE LOS CRITERIOS DE MILÁN La publicación de Mazzaferro y cols. (61) (Tabla 8) en 1996 representa un punto de inflexión en la selección de candidatos. Previamente, la realización Introducción -- 57 de TH en pacientes con un CHC avanzado determinaba unos pobres resultados en términos de tasa de recidiva y supervivencia, lo que determinó que muchos grupos cuestionaran la indicación de TH. Sin embargo, la experiencia acumulada por grupos líderes en París, Londres, Berlín o Pittsburgh mostraba que los pacientes trasplantados por una hepatopatía terminal con CHC incidental en el explante presentaban una tasa de supervivencia similar a los pacientes sin CHC, lo que correlacionaba la recidiva y supervivencia postrasplante directamente con la carga tumoral. Con esta hipótesis inicial, su estudio demostró que si la selección se ajustaba a sus criterios (Criterios de Milán) y se restringía el TH a pacientes con tumores únicos de un tamaño menor de 5 cm o con un máximo de 3 nódulos menores de 3 cm, sin invasión vascular y sin metástasis ganglionares ni a distancia, la supervivencia a los 5 años podía superar el 70% y ser indistinguible de la que pueden alcanzar los pacientes sin CHC. La importancia del tamaño tiene su base racional en su estrecha relación con la probabilidad de invasión vascular. Se dispone de estudios antiguos y modernos en los que se constata que, a partir de 2 cm de diámetro, la presencia de invasión vascular microscópica supera el 30-40% y que a partir de 3 cm la mitad de pacientes presenta una invasión vascular macroscópica reconocible si se explora de manera intencionada. Por último, el porcentaje es casi universal cuando se superan los 5 cm. Introducción -- 64 Organ sharing) o cualquier registro de trasplante con un número suficiente de pacientes trasplantados por CHC. De hecho, en el artículo inicial donde se describen los criterios de Milán, se expone que los pacientes que exceden los criterios en el explante presentan una supervivencia inferior. Todos estos datos muestran que el número de estudios que validan los criterios de Milán (68-70) y que evidencian el impacto negativo de expandir los límites superan ampliamente los estudios de signo contrario, y cualquier análisis de la evidencia indica que es deletéreo modificar la política actual. EXPANSIÓN DE CANDIDATOS, LISTA DE ESPERA Y REPERCUSIONES SEGÚN LA INTENCIÓN DE TRATAMIENTO Como se ha comentado previamente, hay un gran déficit de donantes para los pacientes que cumplen los criterios actuales de TH. Durante el tiempo de espera, la enfermedad puede progresar, y entre un 15 y un 25% de los pacientes con CHC en los que se indica un trasplante son excluidos cuando la demora supera los 9 meses. Esta circunstancia reduce la aplicabilidad del trasplante y la supervivencia según la intención de tratamiento. Por tanto, el problema actual no reside en cuántos más pacientes pueden beneficiarse del trasplante, sino cómo se distribuyen los escasos órganos disponibles de manera más efectiva. Para evitar la progresión del CHC en lista de espera algunos autores defienden la TACE o la radiofrecuencia (RFA), aunque no hay estudios controlados sobre sus ventajas. El uso de neoadyuvancia en lista de espera y la opción de donante vivo son otros aspectos controvertidos del TH. A favor del Introducción -- 65 donante vivo está la ausencia de la lista de espera y la posibilidad de planificar la estrategia. Los detractores de esta alternativa aducen motivos éticos como el riesgo vital sufrido por el donante y la necesidad de un donante cadáver como estrategia en caso de fallo del donante vivo. Otros autores van más allá, aduciendo una mayor recurrencia de la enfermedad al eliminar la selección natural que lleva implícita la lista de espera. Son necesarios estudios comparativos prospectivos para dilucidar los mejores resultados. Se puede argumentar que algunos de los candidatos no tumorales presentan una expectativa de vida inferior a la que tendrían los pacientes con criterio ampliado, pero lo sensato es mejorar los resultados en todas las entidades y no disminuir la exigencia de hacer el mejor uso posible de los órganos disponibles. Posiblemente, si hay pacientes con malas expectativas, se debería considerar su exclusión del programa, tal como ocurre actualmente en pacientes con CHC avanzado. Algunos autores argumentan que a los pacientes se les debe ofrecer la posibilidad de sobrevivir, aunque sea por debajo del 50% a los 5 años y que no es ético excluirlos de la lista de espera por exceder los criterios de Milán. Este argumento es adecuado desde el punto de vista del paciente excluido, pero no si se considera la población en su conjunto. Al haber un número finito de órganos, la utilización de uno de ellos en un paciente infraóptimo evita que se destine a un candidato adecuado y, por tanto, se hace un mal servicio a la sociedad. En resumen, los criterios de Milán deben seguir siendo el instrumento para seleccionar a los pacientes con CHC que deben incluirse en lista para TH. No se dispone de datos que demuestren la bondad de expandir los límites, sino que hay evidencias que demuestran que los resultados al exceder los criterios Introducción -- 66 de Milán dan lugar a cifras de supervivencia a largo plazo que no pueden considerase aceptables. Debido a la escasez de órganos para trasplante, el problema que se debe resolver es cómo distribuir los escasos órganos de que se dispone y trasladar el nivel de exigencia existente en los enfermos con CHC a las otras categorías de pacientes. De este modo, se rentabilizará al máximo la utilidad de los órganos y se evitará su uso indebido en los pacientes en quienes las expectativas de supervivencia no son las exigibles. Como en otras áreas de la medicina, las decisiones clínicas deben basarse en un análisis racional de la evidencia científica y no en impulsos aparentemente bienintencionados que, en realidad, resultan contraproducentes para el conjunto de los pacientes y la sociedad de la que forman parte. 1.5.3-. QUIMIOEMBOLIZACIÓN TRANSARTERIAL La embolización arterial es la técnica de elección en el tratamiento de la CHC no resecable (71) sin que esté indicada en las primeras etapas de la enfermedad. La TACE (72) consiste en la aplicación intra-arterial de un agente quimioterápico (doxorubicina sola o combinada con cisplatino y mitomicina C), con o sin lipiodol y material procoagulante (73). El lipiodol es un aceite de contraste que tiene apetencia por las células tumorales y agentes quimioterápicos y por tanto marca el tumor y retiene las drogas fijadas. Es aclarado por el parénquima hepático normal sin embargo es retenido por el tejido tumoral durante semanas o incluso hasta un año. El material procoagulante se utiliza para producir oclusión y trombosis de la rama arterial Introducción -- 67 correspondiente al tumor. Previamente a la aplicación de la técnica y cinco días después hay que administrar antibióticos, antieméticos y analgésicos. No existe evidencia sobre los mejores agentes quimioterápicos ni la estrategia de tratamiento. Con esta técnica se consiguen respuestas parciales en 15-55% de los pacientes (74) y retrasos significativos en la progresión tumoral y e invasión vascular (75). El TACE está indicado en: a) CHC de gran tamaño no candidatos a cirugía; b) como tratamiento puente en pacientes a la espera de un TH; c) para reducir la estadificación del CHC y cumplir los criterios de TH, y d) previamente a la resección o la RFA, para aumentar la supervivencia. Son contraindicaciones absolutas del TACE la trombosis portal, la encefalopatía y la obstrucción biliar. Serían contraindicaciones relativas la bilirrubina total > 2 mg/dl, una masa tumoral > 50% del volumen hepático, la presencia de ascitis y la existencia de insuficiencia renal o cardiaca. Debe indicarse cuidadosamente en pacientes con descompensación de su insuficiencia hepática o hepática (Child-Pugh C), por las potenciales complicaciones relacionadas con la isquemia. La heterogeneidad en la selección de los “candidatos ideales" puede ofrecer resultados opuestos, y por lo tanto debería ser tenido en cuenta a la hora de diseñar y analizar estudios controlados aleatorizados. Las complicaciones más frecuentemente descritas son el síndrome postembolización que inicialmente parecía relacionado con la necrosis del tumor pero que actualmente se relaciona más con la necrosis del parénquima sano. Suele cursar con dolor, fiebre, elevación transitoria de las transaminasas, abscesos hepáticos (0-3% con mortalidad cercana al 50%), rotura tumoral, Introducción -- 68 fístula biliar, insuficiencia hepática, embolización de lipiodol al pulmón e insuficiencia renal. Hay otras complicaciones consideradas raras, pero potencialmente mortales cuya fisiopatología está relacionada con la migración del trombo a la arteria cística (colecistitis isquémica) y arteria gastroduodenal o gástrica (perforación gástrica o duodenal). La mortalidad relacionada con el tratamiento es de 0 a 2% en estadios A de Child-Pugh y del 8 al 27% en Child-Pugh B y C. El TACE comparado con otras técnicas o con el manejo sintomático no ha demostrado aumento de la supervivencia. Como medida para mejorar los resultados, algunos autores repiten las sesiones de quimioembolización recomendando espaciar un mes como mínimo dos sesiones. La dificultad principal es medir la respuesta del tumor a la técnica, ya que la mayoría de los tumores no disminuyen de tamaño. Es necesario medir marcadores indirectos como falta de captación de contraste o de lipiodol en la TC o RM. 1.5.4-. RADIOFRECUENCIA La RFA consiste en la aplicación de ondas alternantes de alta frecuencia que produce ionización de los componentes celulares con fricción y calentamiento de los tejidos por encima de 60º. Está indicado en pacientes no candidatos a cirugía con tumores < 3-4 cm y Child-Pugh A o B. También estaría indicado en pacientes con recidiva de la enfermedad tras haber sido sometidos a resección o TH (76). En casos de tumores mayores de 2 cm se ha especulado que la capacidad de difusión del alcohol se bloquea por la existencia de septos, disminuyendo así su capacidad curativa. Está Introducción -- 69 contraindicado en tumores subcapsulares o en la periferia hepática por miedo a lesiones diafragmáticas o asas intestinales cercanas. Las nuevas técnicas que permiten marcar una zona de aislamiento térmico, podrían utilizarse en estos casos (77); además la energía generada induce necrosis coagulativa en forma de "anillo de seguridad" de tejido no tumoral, que podría eliminar los pequeños satélites detectados. Las contraindicaciones relativas serían la trombosis portal, la enfermedad extrahepática y la coagulopatía severa o plaquetopenia < 40.000/ml. En comparación con otras técnicas, se han objetivado mayor número de efectos adversos (10%) entre los que destacan el dolor y la irritación peritoneal. Menos frecuentemente se han descrito: insuficiencia hepática, perforación de colon, trombosis portal, fístula biliar, abscesos hepáticos, derrame pleural, quemaduras cutáneas, hipoxia, neumotórax, hematoma, insuficiencia renal, hemoperitoneo, siembra tumoral en el trayecto de la aguja, dolor, fiebre, etc. La recurrencia local varía de 0-28%, y la supervivencia a uno, tres y cinco años es del 92, 62 y 38%, respectivamente. Para mejorar estos resultados, algunos autores aplican una dosis única de doxorubicina liposomal. Otros autores combinan la TACE con la RFA o la alcoholización, con la intención de aumentar la supervivencia (78). En comparación con las técnicas de ablación percutánea se ha demostrado que la recidiva local es significativamente menor y se han publicado tasas de respuesta completa de hasta 96-100% para RF vs 86-89% de técnicas percutáneas. Introducción -- 70 Otras técnicas actuales como la crioablación, la ablación por láser y la ablación con microondas de calor no han adquirido la indicación ni aplicabilidad de la RFA. 1.5.5.- RADIOTERAPIA El HCC es un tumor radiorresistente alojado en un órgano extremadamente radiosensible, que en su totalidad solo tolera entre 2500 y 3000 Gy, con un riesgo importante de hepatitis secundaria a radiación, asociada con una mortalidad del 50%. Las nuevas técnicas de radioterapia esteroatáxica (79), en las que los rayos no paralelos convergen en un punto, permiten administrar altas dosis de radiación en un punto sin lesionar el tejido normal circundante. Con esta técnica se podrían tratar tumores de pequeños a moderados. Otras técnicas de radioembolización administran isótopos radiactivos (yodo-131 [131I]) vía intra-arterial, vehiculizados en lipiodol o ítrio- 90 en microesferas (80). La radioterapia no ha mostrado beneficios en la supervivencia. Se necesita estudios a más largo plazo para valorar sus resultados. 1.5.6 ALCOHOLIZACIÓN PERCUTÁNEA La PEI (percutaneous ethanol injection) produce una deshidratación citoplasmática con necrosis celular y fibrosis. Además, el alcohol afecta a las células endoteliales atrayendo plaquetas y causando trombosis e isquemia. Introducción -- 71 También se ha utilizado el ácido acético por sus menores efectos adversos. En ocasiones esta sustancia se acompaña de una fuente de energía que puede consistir en una de alta temperatura o justo lo contrario, actuando por un mecanismo de crioablación. Esta técnica consigue respuesta completa hasta en el 90-100% en tumores únicos menores de 2 cm (81). Por el contrario, en tumores de 3-5 cm de tamaño la necrosis completa se consigue en la mitad de los casos, y no se considera indicada en tumores de mayor tamaño ya que su eficacia se encuentra limitada por la existencia de septos intratumorales, que dificultan la difusión del alcohol, o por la presencia de lesiones satélite, que no son eliminadas por el procedimiento convencional. Por tanto, los mejores resultados se obtienen en pacientes con Child-Pugh A y con tumores únicos de menos de 2 cm (82). La supervivencia a uno, tres y cinco años para pacientes Child-Pugh A con tumores menores de 3 cm es de 98%, 79% y 47%, respectivamente y disminuye mucho a medida que aumenta el tamaño tumoral. Por el contrario, no hay evidencias de que el tratamiento consiga modificar la esperanza de vida en los pacientes con estadio Child-Pugh B o C. Otros predictores de supervivencia independientes son el estadio Child- Pugh, el número y tamaño de los nódulos, los niveles de AFP y la recidiva tumoral, que puede afectar a la mitad de los pacientes a los 3 años. Su principal ventaja es su bajo coste y la escasa sofisticación de la técnica (solo requiere la ayuda de un ecógrafo) y en la actualidad está siendo suplantado por la RFA. Introducción -- 72 La mejor manera de evaluar la eficacia antitumoral es mediante la TC al mes de tratamiento. La ausencia de captación intratumoral tras la administración de contraste indica la ausencia de tumor residual y se interpreta como respuesta completa. Las indicaciones, contraindicaciones y complicaciones son superponibles a la RFA. Aunque ofrece buenos resultados, éstos no son comparables con los obtenidos con la resección quirúrgica. 1.5.7.- ANÁLOGOS DE HORMONAS La hormonoterapia basada en el tamoxifen, megestrol, octeótride y lanreótide tiene su base en la existencia de receptores hormonales en algunos CHC, pero no se ha podido demostrar su eficacia (83). En un meta-análisis en el cual se compara el tamoxifeno frente al tratamiento conservador, no se observó efecto antitumoral ni aumento de la supervivencia. La falta de eficacia del tamoxifeno puede deberse a la baja expresión de receptores estrogénicos que presenta el CHC, o bien a que expresen receptores mutados (84). En cambio, en otros ensayos clínicos se obtuvieron resultados alentadores con octreótide, pero éstos no se han reproducido en estudios posteriores. Se han publicado respuestas de hasta el 40% en tumores con receptores positivos para somastostina (85). Se han publicado otros fármacos como el 131I vehiculizado en lipiodol, el ácido poliprenoico, el α- o β-interferón, la inmunoterapia con linfocitos autólogos activados, las vacunas con células tumorales autólogas, el cetuximab y el bevacizumab, sunitinib, etc., están siendo utilizados en diversos ensayos clínicos con resultados más o menos prometedores (86). Introducción -- 73 Con la mejora en el conocimiento de la patogénesis molecular del CHC, los nuevos fármacos dirigidos a vías de señalización moleculares han saltado al ámbito clínico. Los beneficios obtenidos con estos fármacos en pacientes con cáncer de pulmón (erlotinib y bevacizumab), el cáncer de mama (trastuzumab y bevacizumab), tumores del estroma gastrointestinal (imatinib) y metástasis hepáticas (cetuximab y bevacizumab) ofrece una esperanza para los pacientes que sufren CHC (87). Actualmente se están llevando a cabo diversos estudios de fases II y III que evalúan la eficacia del tratamiento dirigido en el CHC (88). Entre ellos cabe destacar los inhibidores de EGFR (erlotinib), PDGFR (sorafenib e imatinib) o anticuerpos dirigidos contra el VEGF (bevacizumab), que ya han demostrado eficacia antitumoral en otros tumores sólidos. Incluso se está aplicando genoterapia en pacientes con CHC avanzados (89). 1.5.8-. QUIMIOTERAPIA Y OTROS TRATAMIENTOS SISTÉMICOS El HCC es poco sensible a la quimioterapia, probablemente por la alta expresión de genes resistentes. Por otra parte, el paciente, por lo general añoso, es poco tolerante a las drogas quimioterápicas debido a la hepatopatía de base y a toda la comorbilidad asociada que conlleva la hepatopatía crónica. La quimioterapia está indicada en el CHC avanzado sin embargo no hay evidencia de que en casos de tumor no resecable, aporte beneficios terapéuticos. Los agentes utilizados en los diferentes ensayos clínicos son: la doxorrubicina sola o combinada con tamoxifen o cisplatino; el 5-fluorouracilo combinado con leucovorin; la capecitabina sola o combinada con oxaliplatino; Introducción -- 80 Están siendo estudiadas otras indicaciones para el Sorafenib en otros tumores como el cáncer de mama (160-163), ovario (164), próstata (165-167), colorrectal (168, 169), esófago (170), renal (171-174) para el cual ya está aprobado, pulmón (175), estómago (176, 177), tiroides (178, 179), leucemia y mieloma (180-183) y páncreas (184). 1.6. CRIBADO Y SEGUIMIENTO El objetivo de los programas de detección es realizar el diagnóstico de CHC en una fase temprana en que el paciente sea susceptible de recibir un tratamiento eficaz. Hoy día, gracias a la introducción en la práctica clínica de métodos de diagnóstico precoz, el diagnóstico de CHC puede realizarse antes de que éste dé lugar a manifestaciones. Para conseguir este objetivo, es necesaria la identificación de la población de riesgo para CHC (185). Todos los pacientes con enfermedad hepática crónica, independientemente de su etiología, tienen un riesgo aumentado de desarrollar CHC, lo que da lugar a una incidencia anual del tumor del 3-4% para los pacientes con cirrosis y del 1% para aquéllos con hepatitis crónica (186). A fin de que este programa tenga una buena relación coste-eficacia debe realizarse en poblaciones con riesgo elevado de CHC (ver factores de riesgo en el apartado de Etipatogenia). Se aconseja el seguimiento mediante prueba de imagen y AFP de la siguiente manera (Tabla 10) (187): Introducción -- 81 – Los nódulos menores de 1 cm deben ser seguidos con ecografía cada 3-6 meses. Si no hay crecimiento en dos años, se debe volver al seguimiento habitual. – Los nódulos entre 1 y 2 cm por ecografía, deben ser estudiados con otras dos pruebas: TC, RM o ecografía con contraste. Si las pruebas son típicas de CHC (hipervascular en fase arterial y lavado en las fases portal y venosa) en dos pruebas, el nódulo debe ser considerado CHC. Si las pruebas no son concluyentes deben ser biopsiados. – Los nódulos > 2 cm con estudio de imagen sugestivo de CHC o una AFP> 200 ng/ml no necesitan ser biopsiados. En caso contrario o en nódulos que aparecen sobre hígado sano, sí se requiere biopsia. – Cuando las biopsias no son diagnósticas, los nódulos deben ser seguidos con ecografía o TC cada 3-6 meses. Si el nódulo crece y no es característico de HCC, es necesario repetir la biopsia. La duración de los intervalos viene dada por los datos de la literatura médica sobre cinética tumoral que demuestran que el tiempo que transcurre desde que un tumor es indetectable hasta que adquiere un tamaño de 2 cm es de aproximadamente 4-12 meses, por lo que el intervalo adecuado es de 6 meses. Las perspectivas para limitar la incidencia de HCC son: profilaxis contra los virus de la hepatitis (vacunas) y un mejor conocimiento del diagnóstico molecular para ajustar e iniciar precozmente la intervención terapéutica, aunque de todas maneras son necesarios nuevos modelos experimentales para obtener una mejor comprensión de la interacción entre el Introducción -- 82 virus, los factores ambientales y el huésped. Tabla 10: Algoritmo diagnóstico y seguimiento CHC 1.8. MARCADORES BIOLÓGICOS 1.7.1. α-FETOPROTEÍNA Dado que el 80% de la mortalidad tardía se debe a la recidiva hepática, es de vital importancia el diagnóstico temprano, tanto del tumor primario como de las recidivas, para conseguir unos resultados óptimos. Uno de los métodos diagnósticos más eficientes es la determinación de un marcador serológico altamente sensible y específico. Los marcadores serológicos ayudan a complementar el diagnóstico por la imagen. Introducción -- 83 La AFP es el marcador de elección en el diagnóstico del CHC (188), siendo el más utilizado también para el control de la evolución clínica el diagnóstico temprano de las recidivas y la monitorización del tratamiento. Se trata de una glucoproteína de semivida plasmática de 5 a 7 días, sintetizada en el saco vitelino y en el hígado fetal, a partir de la décima semana de gestación. Tras el nacimiento disminuye progresivamente hasta alcanzar concentraciones muy bajas en el segundo mes de vida, y se mantiene así en la vida adulta, durante la que se consideran normales valores inferiores aquellos comprendidos entre 0 y 20 μg/L. La AFP puede encontrarse elevada en otras enfermedades tumorales (hepatoblastomas, tumores de células germinales y algunos tumores gastrointestinales), (189) en enfermedades hepáticas benignas y en procesos de regeneración hepática (hepatitis virales y cirrosis) donde se encuentra elevada de manera constante y estas cifras persistentemente elevadas de AFP indican un factor de riesgo para desarrollar CHC. Niveles por encima de 400 µg/l son diagnósticos de CHC con una fiabilidad del 95% y tiene un papel en el diagnóstico de CHC ante un paciente cirrótico que presenta una masa en el hígado y una AFP mayor de 200 ng/ml. Hasta en un 5-10% de los tumores, pueden verse cifras de AFP por encima de 10000 ng/ml. Sin embargo, no todos los CHC secretan AFP, como ocurre en el caso del CHC fibrolamelar y se ha observado que incluso más del 40% de los tumores pequeños pueden presentar cifras normales de AFP (190). Estas cifras no se correlacionan con el tamaño (otros autores encuentran una relación directa), el estadio o la prognosis tumoral. Muchos estudios en los Introducción -- 84 que la prevalencia es del 5%, confieren a la AFP una sensibilidad de entre el 41-65%, una especificidad de entre un 80-94%, un valor predictivo positivo de 25% y un valor predictivo negativo del 98%. En los grupos de riesgo, su sensibilidad es superior al 70% y su especificidad alcanza el 100%, habiéndose descrito además una sensibilidad mayor en el diagnóstico temprano cuando el HPC tiene un origen no viral. Los valores pretratamiento de AFP también tienen un valor pronóstico para los pacientes con CHC. Así, los rangos de supervivencia en pacientes con valores normales de AFP (< 21,8 μg/l) y moderadamente elevados (21,8-327 μg/l) son significativamente superiores que en pacientes con valores marcadamente elevados (> 436 μg/l). Tras la resección hepática, la determinación de AFP se considera un indicador del grado de resección del tumor. Así, una disminución de los valores de AFP menor de la esperada o valores estables después de 1 semana de la resección se asocian a resecciones incompletas y a un peor pronóstico. En el seguimiento de los pacientes, la AFP es útil para el diagnóstico temprano de las recidivas tumorales, de forma que ante un paciente con historia de tumor productor de AFP, su elevación es suficiente para establecer el diagnóstico de recidiva. Además, la determinación de la AFP, junto con las características patológicas del tumor, aporta información útil en la identificación de pacientes con riesgo de desarrollar una recurrencia difusa intrahepática, que es un patrón de recidiva temprana y con peor pronóstico. Los valores elevados de AFP también tienen una implicación en la terapéutica, puesto que se ha propuesto como uno de los criterios (junto con el CHC invasivo nodular, la invasión vascular, las metástasis intrahepáticas y las Introducción -- 85 roturas capsulares) que aconsejan el tratamiento adyuvante o el trasplante hepático debido al alto riesgo de recurrencia que presentan los pacientes con 3 o más de estos criterios. Dentro de la determinación de los niveles de AFP en sangre también pueden determinarse diferentes fracciones de la proteína con otra interpretación clínica: * ARNm de la AFP: su presencia en sangre periférica se ha propuesto como marcador predictivo de diseminación metastásica, pero su utilidad práctica no está bien establecida (191). Los pacientes cuyos valores se negativizan tras el tratamiento adyuvante tienen mejores cifras de supervivencia y de tiempo libre de enfermedad que aquellos con valores positivos permanentes. Por otra parte, la persistencia en sangre periférica tras la resección quirúrgica se considera un factor pronóstico de la recurrencia temprana intrahepática. * Fracción L3 de la AFP (L3-AFP): los pacientes con valores positivos de L3- AFP tienen peor función hepática, tumores de mayor tamaño, y tumores más avanzados y con histologías de peor pronóstico que aquellos con valores negativos, y con mayor frecuencia presentan metástasis a distancia (192). * Fracción reactiva fitohemaglutinina eritroaglutinante de la AFP (AFP-P4) (193) y fracción monosializada de la AFP (msAFP): es útil cuando la AFP tiene valores bajos y pierde su especificidad. Tanto los valores elevados de msAFP como su porcentaje respecto a la AFP total se consideran diagnósticos (194). Introducción -- 86 1.7.2 OTROS MARCADORES BIOLÓGICOS Existen otros marcadores biológicos que surgen de la necesidad arrojada por las limitaciones de la AFP. Se están realizando estudios sobre estos marcadores usados solos o en combinación con la AFP, como la desgammacarboxiprotombina (PIVKAII), las fracciones de AFP (L3) (195), la αfucosidasa y el glipicano 319 (196). Ninguno ha demostrado ser útil como herramienta de diagnóstico temprano y, por tanto, no se recomienda su utilización en la práctica clínica. A continuación, se exponen los más importantes: * Antígeno polipeptídico específico tisular (TPS): es un marcador de proliferación celular. Sus valores se correlacionan con el número de células tumorales, el carácter invasivo, el estadio tumoral y la supervivencia. El valor de TPS es un factor independiente de recidiva tumoral en pacientes previamente resecados (197). Los pacientes que presentan valores superiores de TPS tienen recidivas más tempranas que aquellos con valores bajos. Si se consideran los valores de TPS junto con el tamaño tumoral y la afección de los márgenes, el valor predictivo de estos 2 últimos factores se incrementa de 72% a 80%. * Proteínas inducidas por la ausencia de vitamina K o antagonistas II (PIVKA): es un marcador de baja especificidad, particularmente en la enfermedad Introducción -- 87 colestásica, que produce una disminución de la vitamina K. Sus valores preoperatorios tienen valor pronóstico tras la resección del CHC (198). * Des-γ carboxiprotrombina (DCP): es más sensible y específica que la AFP para diferenciar a pacientes con HPC de aquellos con enfermedades crónicas hepáticas no malignas. En algunos estudios ha mostrado ser mejor que la AFP en la predicción de tumores con patrón invasivo, aunque sin significación estadística; también ha sido útil en el diagnóstico de recurrencias (199). * Dipeptidil aminopeptidasa (GPDA-F): es una glucoproteína sérica rica en ácido siálico (200). Se trata de un nuevo marcador que puede resultar útil en el diagnóstico del CHC en los pacientes en que la AFP no está elevada. * ARNm de la transcriptasa inversa de la telomerasa (hTERT): es detectable en el suero de pacientes con diversos tipos de cáncer, entre ellos el de pulmón y el CHC. Su positividad se relaciona de manera independiente con los valores de AFP, el tamaño tumoral y el grado de diferenciación, por lo que se podría utilizar para el diagnóstico temprano del CHC (201). Introducción -- 88 Tabla 11: principales marcadores biológicos 1.7.3.- MARCADORES GENÉTICOS Se conoce que la progresión tumoral es el resultado del bloqueo del control del ciclo celular y la apoptosis que en condiciones normales es llevado a cabo por los genes supresores de tumores, así como la activación de protooncogenes. Introducción -- 89 Los factores de transcripción más estudiados en la actualidad son p53, p63 y p73. Esta reciente identificación ha abierto un nuevo capítulo en la investigación del cáncer (202). Como iremos desarrollando a lo largo de este apartado, p63 y p73 juega un papel importante en el desarrollo normal, aunque también está clara su implicación en la tumorigénesis humana y en la respuesta del tumor a la terapia (203-205). La muerte celular programada o apoptosis es un proceso regulado genéticamente que participa en el remodelado tisular, así como en el mantenimiento de la homeostasis fisiológica en el organismo adulto. La resistencia a los procesos apoptóticos es un evento clave en los procesos tumorales. De hecho, 4 genes supresores de tumores y un oncogén directamente relacionados con la expresión de las subunidades de los receptores de muerte celular se incluyen entre los 125 genes inductores de cáncer con mutaciones puntuales detectados en el rastreo genómico de 3284 tumores. La inducción de la apoptosis celular se lleva a cabo bien a través de la estimulación de receptores celulares y la activación directa de la maquinaria pro-apoptótica celular (células tipo I, vía extrínseca), o mediante la participación de la mitocondria (células tipo II, vía intrínseca). De este modo los receptores de muerte celular que se han relacionado con la muerte hepatocelular son TNF-R1, CD95 y TRAIL-R1 de los que hablaremos a continuación. La expresión de estos receptores y sus ligandos se encuentran incrementados en las enfermedades agudas y crónicas hepáticas, así como reducida en el CHC. La alteración de la señal dependiente de p53 es una de las mutaciones más prevalentes (20-50%) en el CHC. La inducción de muerte celular durante el Introducción -- 96 Figura 4: isoformas p63 II.a. p63 y apoptosis TAp63 activa genes que ejercen funciones en diferentes pasos del proceso de apoptosis. Tiene la capacidad, igual que p53 de activar genes que codifican receptores de muerte celular como CD95, TNF-R1 y TRAIL-R1 y -R2, así como genes que codifican otras proteínas (Bax, BCL2L11, Rad9, DAP3 y APAF1 (222). ∆Np63 regula negativamente la apoptosis por lo que está considerado como un gen con papel oncogénico (223). II.b. p63 en el cáncer A diferencia de p53, p63 rara vez se encuentra mutado en los cánceres humanos. En la mayoría de los tumores incluso se detecta una sobreexpresión de p63 lo que correlaciona este hallazgo con un papel pro-proliferativa u oncogénico (224). Se ha observado expresión en más del 80% de las células de carcinomas de células escamosas del cuello (CECC), así como otras neoplasias epiteliales (225,226). Introducción -- 97 Las diferencias entre p63 y p53 fueron reveladas en estudios en ratones: los ratones sin p63, presentaban anomalías en el desarrollo como envejecimiento precoz, ausencia completa de la piel (227), falta de extremidades, así como de otras estructuras epiteliales (228) y la displasia severa craneofacial (229), pero sin más tendencia al desarrollo de tumores (230, 231). La razón de estas deficiencias radica en la falta de células madre que son necesarias para el desarrollo y la diferenciación de estas estructuras epiteliales. p63 es el único gen conocido por ser de importancia esencial para la supervivencia de las células madre epiteliales (232). En el caso de los ratones sin p53 aparece aumentado el riesgo de desarrollar tumores malignos (233). El conocimiento del papel de p63 en la tumorigénesis es preliminar. Son necesarios más estudios para el entendimiento de la compleja red de interacciones entre las diferentes isoformas de p63, además de determinar cómo éstas influyen en otras proteínas de la familia p53. II.c. p63 y quimiosensibilidad Se ha demostrado recientemente que muchos agentes quimioterápicos inducen la síntesis de TAp63α. El bloqueo a su vez de la síntesis de TAp63 endógeno confiere quimiorresistencia mediante la inhibición de la apoptosis (234). (Fig. 5) Existen resultados in vitro que confirman que la expresión de ∆Np63α está directamente relacionada con la respuesta al cisplatino en los tumores de cabeza y cuello (235) considerándose esta isoforma como un factor pronóstico de supervivencia. Introducción -- 98 Figura 5: Efecto de los agentes quimioterápicos en p63 III. p73 El gen p73 en el ser humano está compuesto por más de 80.000 pares de bases constituidos por 15 exones en el cromosoma 1p36.3 (236). La expresión del gen TP73 se complica por la presencia de al menos siete isoformas derivadas de alteraciones a nivel del grupo C-terminal (p73 α-η) (237, 238) y de al menos otras cuatro derivadas de cambios a nivel del grupo N-terminal (239) (Fig. 6). Al igual que p63, el gen p73 puede ser transcrito a partir de dos promotores diferentes con dos resultados: la proteína con dominio de transactivación (TAp73) a partir del exón 1 y las proteínas de inhibidoras carentes del dominio de transactivación (∆TAp73) a partir del promotor alternativo del intrón 3. En total se han descrito hasta 29 isoformas. Estas isoformas son capaces de unirse específicamente al ADN a través del sitio de unión del p53 y activar la transcripción de genes diana, provocando resultados similares como la detención del ciclo celular o apoptosis. ∆Np73 actúa como un potente inhibidor de la TAp63, de TAp73 y de la forma nativa de p53 (240). Así, el locus TP73 codifica tanto un supresor de tumores (TAp73) como un oncogen (∆Np73) (241). Introducción -- 99 Figura 6: p73 humano III.a. p73 y la apoptosis TAp73 está implicado en la activación de la apoptosis tanto por la vía de las mitocondrias como por la vía intrínseca celular. TAp73 aumenta su expresión endógena en respuesta al daño del ADN provocado por las drogas quimioterápicas. Por el contrario, ∆Np73 confiere resistencia a dichos fármacos antitumorales y lo lleva a cabo inactivando la expresión del gen CD95. III. b. p73 en el cáncer TP73, a pesar de su similitud con p53 no responde al prototipo clásico de gen supresor de tumores (242). Los ratones deficientes para TP73 no presenta una incidencia más alta de tumores y es extremadamente raro el hallazgo de mutaciones que inactivan al TAp73 en las células tumorales humanas. Introducción -- 100 En un porcentaje significativo de tumores aparece expresión aumentada de la isoforma dominante negativa, lo que va a favor de su papel oncogénico (243). ∆Np73 coopera con el gen Ras en la transformación primaria de fibroblastos de embrión de ratón (MEFs) in vitro induciendo fibrosarcomas (244). La sobreexpresión de ∆Np73 en tumores crea un balance a favor de la actividad oncogénica en contra de la función proapoptótica de wild-type p53, TAp63 and TAp73. Se ha visto una acción aumentada de ∆Np73 en el gran número de tumores humanos. En el neuroblastoma, cuyas células expresan casi exclusivamente la forma nativa de p53, se ha visto una correlación de ∆Np73 con el resultado clínico. También en la leucemia linfoblástica aguda infantil (LLA) se encontró un aumento de la expresión de ∆TAp73, que puede contribuir a una quimiorresistencia. Se ha demostrado también que una sobreexpresión de ∆Np73 en el CHC se correlaciona con mal pronóstico. Este es un hallazgo importante y clínicamente relevante ya que sugiere que el uso de ∆Np73 como un marcador pronóstico de los pacientes (245). En un estudio reciente se ha determinado que DeltaEx2p73 (isoforma de p73) se expresa en hígados cirróticos y en otros sanos que albergan tumores primarios. También se ha demostrado que la activación del EGFR por su ligando, anfiregulina, cuya expresión se encuentra aumentada en el CHC activa la expresión de deltaEx2p73 que se encuentra en las células del CHC y en los hepatocitos normales. Sin embargo, aún más convincente fue el hallazgo de la expresión DeltaEx2p73 en casi el 100% de los tejidos normales del hígado de Introducción -- 101 los pacientes que habían desarrollado CHC y estaban libres de cualquier factor de riesgo conocido para el cáncer de hígado. El aumento de la expresión de DeltaEx2p73 regulado por anfiregulina en los hepatocitos normales, actúa como un potente protector del daño hepático de manera que puede ser considerada como una nueva diana terapéutica en CHC y otros tumores y en vista de la asociación de deltaEx2p73 con la mala progresión de la enfermedad hepática, el análisis de estas variantes mediante una biopsia hepática podría tener un valor pronóstico. III.c. p73 y quimiosensibilidad En varios estudios se pone de manifiesto que p73 es esencial para la apoptosis inducida por agentes citotóxicos (Tabla 7) y que la inactivación de p73 por una mutación dominante negativa lleva a la resistencia de las células a la apoptosis inducida por agentes genotóxicos (246, 247). TAp73 endógeno se activa en respuesta a una variedad de fármacos quimioterapéuticos y de radiaciones gamma mediante la activación de una vía dependiente de la tirosina quinasa c-Abl (248,249). Además, un estudio reciente indica que c-Abl es la responsable, mediante vías independientes de la p73, de la apoptosis inducida por gemcitabina (250). Diversas variantes de p53 mutado pueden inhibir la acción de TAp73 (251). Los pacientes cuyo tejido tumoral expresa formas mutadas de p53 en el loci 72 de arginina (72R) han derivado en una peor respuesta a la terapia (252), que aquellos que expresan mutantes de p53 que codifica prolina en la posición 72 (72P). Introducción -- 102 La identificación de la vía de degradación específica es de importancia clínica ya que es una diana farmacológica ideal. Figura 7: Efectos de los quimoterápicos en p73 endógeno Objetivos Objetivos -- 104 1) Determinar la asociación existente entre la expresión de los receptores de muerte celular y las isoformas TA y ∆N de p63 y p73 en el tejido tumoral y la supervivencia de los pacientes con HCC 2) Identificar el papel de las isoformas TA y ∆N de p63 y p73 en la expresión de los receptores de muerte y apoptosis en células tumorales hepáticas. Efecto del fármaco antitumoral Sorafenib. 3) Efecto de Sorafenib en la inducción de muerte celular, angiogénesis, fibrogénesis y desdiferenciación celular en tumores derivados de células tumorales hepáticas implantadas subcutáneamente en ratones inmunodeficientes. Materiales y método Materiales y método -- 112 los plásmidos se realizó mediante infección de bacterias competentes E.coli de la estirpe DH5 (T3007 Zymo Research). La purificación del plásmido se realizó mediante kit de maxiprep (Ref 12163, Quiagen). La sobreexpresión se llevó a cabo pre-incubando el reactivo de transfección de hepatocitos jetPEITM (Polyplus Transfection) con el plásmido de sobreexpresión (1 μg ADN) durante 20 minutos a temperatura ambiente, esta mezcla posteriormente fue transferida al medio de cultivo desprovisto de SBF y antibiótico durante 6 horas. Transcurrido este tiempo se cambio el medio de cultivo, permitiendo la expresión de las proteínas en estudio por un periodo de 18 horas previo a la adición de Sorafenib. Inhibición de la expresión de los genes de la familia de p53 y los receptores de muerte celular La inhibición de la expresión general de p53, p63 y p73 se realizó mediante las estrategias de interferencia celular siRNA. Los siRNA utilizados fueron son los utilizados en la Tabla 5. La expansión de los siRNA se realizó mediante transfección en bacterias competentes E.coli de la estirpe DH5 (T3007 Zymo Research). La purificación del plásmido se realizó mediante kit de maxiprep (Ref 12163, Quiagen). Los ensayos de interferencia siRNA de p53, p63 y p73 se llevaron a cabo pre-incubando el reactivo de transfección oligofectamina (12252-011, Invitrogen) con el medio de transfección (sc-36868, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) durante 5 minutos a temperatura ambiente, para posteriormente añadir las secuencias de siARN (160 pmol) o siRNA control (80 pmol) (Tabla 5) dejando incubar durante 20 minutos a temperatura Materiales y método -- 113 ambiente. Las distintas transfecciones indicadas se llevaron a cabo con medio de cultivo desprovisto de SBF y antibiótico durante 6 horas. Transcurrido este tiempo se cambio el medio de cultivo, permitiendo la expresión de las proteínas en estudio por un periodo de 18 horas previo a la adición de Sorafenib. Los estudios de interferencia por siRNA de los genes de la familia de p53, p63 y p73 no permitieron la discriminación entre las distintas isoformas, por lo que la reducción de la expresión de las isoformas TAp63, TAp73 y ∆Np73 se realizó mediante secuencias shRNA incluidas en el vector de expresión psiHIV- nH1 (Tabla 6). La expansión de los vectores se realizó mediante la transfección de bacterias competentes E.coli de la estirpe DH5 (T3007 Zymo Research). La purificación del plásmido se realizó mediante kit de maxiprep (Ref 12163, Quiagen). La transfección de las células se realizó mediante pre-incubación del reactivo de transfección de hepatocitos jetPEITM (Polyplus Transfection) con el plasmido (1 μg ADN) durante 20 minutos a temperatura ambiente, esta mezcla posteriormente fue transferida al medio de cultivo desprovisto de SBF y antibiótico durante 6 horas. Transcurrido este tiempo se cambio el medio de cultivo, permitiendo la expresión de las proteínas en estudio por un periodo de 18 h previo a la adición de Sorafenib. Materiales y método -- 114 siARN Referencia Casa comercial siARN p53 sc-44218 Santa Cruz Biotechnology Inc.; Delaware, CA, USA siARN p63 sc-36161 Santa Cruz Biotechnology Inc.; Delaware, CA, USA siARN p73 sc-43730 Santa Cruz Biotechnology Inc.; Delaware, CA, USA siRNA-A (control) sc-37007 Santa Cruz Biotechnology Inc.; Delaware, CA, USA Tabla 5. siRNA utilizadas en los estudios de interferencia celular. shARN Referencia Casa comercial shARN TAp63 CS-SH149J-HIVnH1 GeneCopeia, Rockville, Montgomery, USA shARN TAp73 CS-SH150J-HIVnH1 GeneCopeia, Rockville, Montgomery, USA shARN ∆Np73 CS-SH151J-HIVnH1 GeneCopeia, Rockville, Montgomery, USA shRNA-A (control) CS-HCTR001-HIVnH1 GeneCopeia, Rockville, Montgomery, USA Tabla 6. shRNA utilizadas en los estudios de interferencia celular. Estudio in vivo El efecto de Sorafenib en la progresión tumoral se ha evaluado en el modelo de implante subcutáneo de células tumorales hepáticas en ratones desnudos macho Hsd:Atímicos Nude-Foxn1nu (Harlan Laboratorios, Barcelona, Spain) de 4 semanas de edad (25-30 gr). Cuarenta y cuatro animales se distribuyeron aleatoriamente en 4 grupos en función del implante de células tumorales Hep G2 (n=12), Huh 7 (n=12) o Hep 3b (n=12) o control (n=8). Cada uno de los grupos con implante de células tumorales se dividieron aleatoriamente en dos grupos en función de la administración de Sorafenib o solvente. Las células (6x106) resuspendidas en medio de cultivo (100 μl) se mezclaron con un volumen igual de matrigel (Ref 356231, Becton-Dickinson, Lot. 36821), y se implantaron subcutáneamente en el dorso centro-lateral derecho del animal. Cuando el tumor alcanzó los 5 mm, se inició el tratamiento con Sorafenib (200 mg/kg). Se preparó una solución concentrada de Sorafenib en etanol (0.32 mg/μl) que se guardó a -20ºC. La solución de trabajo se Materiales y método -- 115 preparó diariamente mezclando la solución concentrada de Sorafenib en Koliphor EL (C5135, Sigma) y suero fisiológico a razón de 1:1:6. Los animales recibieron una dosis diaria de Sorafenib o solvente (5 μl/gr de ratón). Los animales se sacrificaron cuando alguno de los tumores de la serie de un mismo implante celular (con o sin Sorafenib) alcanzaba los 15 mm siguiendo las guías para el cuidado de los animales de experimentación en los modelos de cáncer con intención terapéutica (2-4 semanas) (7). Se calculó el volumen tumoral atendiendo a la siguiente fórmula V=[(longitud)x(anchura)x(profundidad)xπ]/6. El tumor fue recuperado, diseccionado y almacenado a -80ºC o fijado con paraformaldehido al 4% e incluido en parafina para el procesado y evaluación posterior del grado de apoptosis, proliferación celular, fibrogénesis y angiogénesis, así como la expresión de CD95, TNF-R1, TRAIL-R1, p53, p53BP2, TAp63, ΔNp63, TAp73 and ΔNp73. El protocolo de manejo de los animales de experimentación fue aprobado por el Comité de Bienestar Animal de la Institución. Estudios histológicos en el tejido tumoral La expresión de los genes de p53, receptores de muerte, proliferación, angiogénesis y fibrogénesis en las secciones de tejido tumoral procedente de los pacientes con HCC y/o estudios in vivo se valoró por inmunohistoquímica. Brevemente, se obtuvieron secciones de 5 μm que eran posteriormente desparafinadas y rehidratadas con una serie de soluciones decrecientes de etanol. Tras la hidratación las secciones se lavaron brevemente en agua, y se bloquearon los sitios inespecíficos a temperatura ambiente en tampón TBSA- Materiales y método -- 116 BSAT (Tris 10 mM, NaCl 0.9%, azida sódica 0.02%, BSA 2% y Triton-x100 0.1%). Las secciones se incuban durante toda la noche a temperatura ambiente con el anticuerpo primario correspondiente (Tabla 7). A la mañana siguiente las secciones se lavan con tampón TBSA-BSAT, y se incuban durante 5 horas con el anticuerpo secundario correspondiente (Tabla 8). La tinción nuclear de contraste se realizó con DRAQ-5th (Red Fluorescen Cell- Permeable DNA probe, Biostatus Limited, United Kingdom). La imagen de la immunofluorescencia fue obtenida con el microscopio de fluorescencia Olympus BX61, y su análisis se realizó mediante los programas Application Suite Advanced Fluorescence e ImageJ. Anticuerpo Huéspe d Referenci a Casa comercial Anti-CD95 Conejo sc-715 Santa Cruz Biotechnology Inc.; Delaware, CA, USA Anti-TNF-R1 Conejo sc-7895 Santa Cruz Biotechnology Inc.; Delaware, CA, USA Anti-TRAIL-R1 Cabra sc-6823 Santa Cruz Biotechnology Inc.; Delaware, CA, USA Anti-Ki67 Ratón IR626 Dako Diagnósticos, S.A., Sant Just Desvern, España Anti-CD31 Conejo ab28364 Abcam; Cambridge, England, Anti-α-sma Conejo ab5694 Abcam; Cambridge, England, Anti-p53 Conejo sc-6243 Santa Cruz Biotechnology Inc.; Delaware, CA, USA Anti-BP2 Cabra sc-10924 Santa Cruz Biotechnology Inc.; Delaware, CA, USA Anti-p63TA Cabra sc-8608 Santa Cruz Biotechnology Inc.; Delaware, CA, USA Anti-p63 ΔN Ratón sc-71827 Santa Cruz Biotechnology Inc.; Delaware, CA, USA Anti-p73TA Ratón IMG-246 IMGENEX; San Diego, CA, USA Anti-p73 ΔN Ratón IMG-313ª IMGENEX; San Diego, CA, USA Tabla 7. Anticuerpos primarios utilizados durante el procesado por inmunohistoquímica del tejido tumoral. Materiales y método -- 117 Anticuerpo Huéspe d Referencia Casa comercial Alexa 488 Anti-rabbitt IgG Cabra A11008 Invitrogen Alexa 488 Anti-mouse IgG Cabra A11001 Invitrogen Alexa 488 Anti-goat IgG Conejo A11078 Invitrogen Tabla 8. Anticuerpos secundarios utilizados durante el procesado por inmunohistoquímica del tejido tumoral. Análisis in situ de la apoptosis celular La apoptosis se evaluó mediante el ensayo DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System (G3250, Promega) que identifica las roturas del DNA nuclear mediante la incorporación catalítica de fluoresceina-12-dUTP en el extremo 3´- OH del ADN usando la enzima Terminal Deoxynucleotidyl Transferasa (TdT), la cual, forma una cola polimérica usando el principio de los ensayos de TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling). El ADN marcado con fluoresceina- 12-dUTP-se visualizó usando el microscopio de fluorescencia Olympus BX61. La cuantificación de la fluorescencia se llevo a cabo usando los programas Leica Application Suite Advanced Fluorescence e ImageJ. Análisis Estadístico Los resultados se presentan como media ± error estándar. El análisis estadístico se realizó a través del Análisis de la Varianza seguido del test posthoc LSD. Se utilizó el paquete estadístico Statgraphics 16.1.15. Resultados Resultados -- 119 El incremento de la expresión de la isoformas p63 y /p73∆N, así como la reducción de la expresión de los receptores de muerte celular son marcadores de mal pronóstico en los pacientes con HCC En pacientes con HCC diferenciado con infección por VHB se detectó un incremento de la expresión en el tejido tumoral de las isoformas p63TA y p63∆N (p≤0,01), así como de p73TA y p73∆N (p≤0,5) en comparación con el resto de etiologías (VHC y alcohol) entre las que no había diferencias (Figura 1A). Figura 1A: Expresion de p63TA y p63∆N (p≤0,01), así como de p73TA y p73∆N en los tumores diferenciados Asimismo, la presencia de VHB redujo significativamente la expresión de p63 y p73 en sus formas TA y ∆N en el tejido tumoral procedente de pacientes con CHC moderadamente diferenciado en comparación con el resto de etiologías (HVC y alcohol) entre las que no había diferencias (Figura 1B; p≤0,5). Estos datos indican que la presencia de VHB modula de forma significativa la expresión de p63 y p73 en sus formas TA y ∆N en el tejido tumoral pendiendo del grado de diferenciación del tumor. ** ** * * Resultados -- 120 Figura 1B: Expresión de p63TA y p63∆N (p≤0,01), así como de p73TA y p73∆N en los tumores diferenciados. La expresión de las isoformas p63∆N y p73∆N (p≤0,5, p≤0,01; respectivamente), pero no las isoformas p63TA y p73TA, se encontraron significativamente incrementadas en los pacientes que fallecieron por recurrencia del CHC (Figura 1C, 1D). Figura 1C: Expresión de las isoformas p63 y p73 en CHC Supervivientes p63TA Supervivientes Fallecidos Supervivientes Fallecidos p63ΔN p73TA Fallecidos p73ΔN Supervivientes Fallecidos * * * * Resultados -- 121 Figura 1D: Expresión de las isoformas p63 y p73 en CHC Una asociación interesante se observó entre la expresión de p63 y p73 con los receptores de muerte celular en CHC. En este sentido, la expresión de TNF-R1 y TRAIL-R1 en HCC diferenciado procedente de pacientes infectados por VHB estaba significativamente reducida comparada con los pacientes infectados por VHC y alcohol (Figura 1E; p≤0,01, p≤0,5; respectivamente). Figura 1E: Expresión de los receptores de muerte en tejido tumoral diferenciado ** * ** * Resultados -- 128 Figura 2H: Efecto de Sorafenib en la expresión proteica de TRAIL-R1 en la membrana celular Figura 2I: Efecto de Sorafenib en la expresión mRNA de TRAIL-R1 La participación de los procesos de inducción transcripcional y traduccional fue evaluada mediante la administración de actinomicina D (inhibidor de la transcripción) y cicloheximida (inhibidor de la síntesis de * ** ** * * Resultados -- 129 proteínas) respectivamente. El incremento de expresión de TNF-R1, CD95 y TRAIL-R1 por Sorafenib fue reducida con actinomina D (Figura 3A, 3C y 3E; p≤0,5, respectivamente) y cicloheximida (Figure 3B, 3D y 3F; p≤0,5 respectivamente). Figura 3A: Efecto de actinomicina D (Act) en el incremento de la expresión de TNF-R1 por Sorafenib * * * Resultados -- 130 Figura 3B: Efecto de cicloheximida (Cx) en el incremento de la expresión de TNF-R1 por Sorafenib Figura 3C: Efecto de actinomicina D (Act) en el incremento de la expresión de CD95 por Sorafenib * * * * * Resultados -- 131 Figura 3D: Efecto de cicloheximida (Cx) en el incremento de la expresión de CD95 por Sorafenib Figura 3E: Efecto de actinomicina D (Act) en el incremento de la expresión de TRAIL-R1 por Sorafenib * * * * Resultados -- 132 Figura 3F: Efecto de cicloheximida (Cx) en el incremento de la expresión de TRAIL-R1 por Sorafenib El incremento de expresión de los receptores de muerte celular se correlacionó con una inducción de los procesos de apoptosis. Sorafenib aumentó la actividad caspasa-8 (Figura 4A; p≤0,5, p≤0,001, p≤0,001; respectivamente) y el procesamiento de su fragmento activo (Figura 4B; p≤0,01, p≤0,001, p≤0,001; respectivamente) en Hep G2, Huh 7 o Hep 3b. * * Resultados -- 133 Figura 4A: Efecto de Sorafenib en la actividad caspasa-8 Figura 4B: Efecto de Sorafenib en el procesamiento de caspasa-8 En este sentido, la magnitud de la inducción de la apoptosis por Sorafenib seguía de forma decreciente el orden Huh 7 > Hep G2 > Hep 3b (Figura 4A, 4B). La repercusión funcional del incremento de la expresión de los receptores se validó con la adición de los agonistas según el incremento *** ** *** *** *** * Resultados -- 134 específico de cada receptor de muerte celular en las distintas estirpes celulares. En este sentido, a las células Hep G2 se añadió TNF-α, y a Huh7 y Hep 3b se añadieron los tres agonistas (TNF-α, CD95L y Trail). La adición de TNF-α fue capaz de incrementar (130 %, p≤0,001) la apoptosis por Sorafenib en Hep G2 (Figura 4C, 4D). TNF-α (185 %, p≤0,01) y Trail (170 %, p≤0,5), pero no CD95L, produjo un incremento de la apoptosis celular por Sorafenib en Huh 7 (Figura 4C, 4D). De forma diferente, la adición de los tres agonistas indujo un incremento de la muerte asociada a CD95 (147 %, p≤0,01), TNF-R1 (215 %, p≤0,5) y TRAIL-R1 (210 %, p≤0,5) por Sorafenib en Hep 3b que se mide por la actividad de caspasa-8 y el fragmento activo como se observa en las figuras 4C y 4D. Figura 4C: Efecto de Sorafenib (S) en la actividad caspasa-8 inducida por agonistas * * * * * *** ** * * * Resultados -- 135 Figura 4D: Efecto de Sorafenib (S) en el procesamiento caspasa-8 inducida por agonistas Reducción de la expresión de los receptores de muerte celular La capacidad de los siRNA de reducir la expresión de CD95, TNF-R1 y TRAIL-R1 fue verificada en todas las líneas celulares (Figura 5A). Figura 5A: Control de la expresión de los receptores de muerte celular con los correspondientes siRNA * * * ** ** * * ** * * * Resultados -- 136 La interferencia de un receptor no supuso una alteración de la expresión del resto de receptores debido a la especificidad de los siRNA utilizados- En este sentido, la administración de los siRNA previno el efecto estimulador de Sorafenib sobre la expresión de TNF-R1 (Figura 5B), CD95 (Figura 5C) y Trail- R1 (Figura 5D), la actividad caspasa-8 (Figure 5E) y el procesamiento de procaspasa-8 (Figura 5F). Figura 5B: Efecto de siRNA frente a la inducción de la expresión de TNF- R1 por Sorafenib * ** * * * * Resultados -- 137 Figura 5C: Efecto de siRNA frente a la inducción de la expresión de CD95 por Sorafenib Figura 5D: Efecto de siRNA frente a la inducción de la expresión de TRAIL-R1 por Sorafenib * * * * * * * * Resultados -- 144 incrementó la expresión de TNF-R1 (Figura 7B, p≤0,5, p≤0,01; respectivamente), CD95 (Figura 7C, p≤0,5, p≤0,01; respectivamente), TRAIL- R1 (Figura 7D, p≤0,01, p≤0,5; respectivamente), actividad caspasa-8 (Figura 7E, p≤0,001, p≤0,5; respectivamente) y procesamiento de pro-caspasa-8 (Figura 7F, p≤0,5, p≤0,01; respectivamente) en las células Huh 7 y Hep 3b tratadas con Sorafenib. Figura 7B: Efecto de la sobreexpresión de p53, p63TA, p63ΔN y p73TA en la regulación de la expresión de TNF-R1 por Sorafenib (S) * * * * ** Resultados -- 145 Figura 7C: Efecto de la sobreexpresión de p53, p63TA, p63ΔN y p73TA en la regulación de la expresión de CD95 por Sorafenib (S) Figura 7D: Efecto de la sobreexpresión de p53, p63TA, p63ΔN y p73TA en la regulación de la expresión de TRAIL-R1 por Sorafenib (S) ** ** * * ** * ** ** Resultados -- 146 Figura 7E: Efecto de la sobreexpresión de p53, p63TA, p63ΔN y p73TA en la regulación de la actividad caspasa-8 por Sorafenib (S) Figura 7F: Efecto de la sobreexpresión de p53, p63TA, p63ΔN y p73TA en la regulación del procesamiento de la caspasa-8 por Sorafenib (S) Interferencia de p53, p63 and p73 La interferencia de los genes de p53 se realizó mediante dos aproximaciones con distinto grado de especificidad. La interferencia de todas las isoformas de p53, p63 y p73 se realizó mediante siRNA genéricos (siRNA * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Resultados -- 147 p53, siRNA p63 y siRNA p73). De forma diferente, la interferencia específica de las isoformas p63TA, p63N y p73TA se realizó mediante shRNA. Los siRNA frente a p63 y p73 no fueron capaces de distinguir entre las correspondientes isoformas TA y N (Figura 8A). Figura 8A: Control de la expresión de las isoformas de p53 por los correspondientes siRNA Se observó que la interferencia de p53 wild type (siRNA p53) reducía el incremento de la expresión de TNF-R1 (Figura 8B, p≤0,5), pero no de CD95 (Figura 8C) y TRAIL-R1 (Figura 8D), y la activación de caspasa-8 (Figura 8E, p≤0,001; Figura 8F, p≤0,5; respectivamente) inducida por Sorafenib en Hep G2. La interferencia de p63TA redujo la expresión de CD95 (Figura 8C; p≤0,01, p≤0,5), TNF-R1 (Figura 8C; p≤0,5), TRAIL-R1 (Figura 8D; p≤0,5) y activación de caspasa-8 (Figura 8E, 8F; p≤0,001) inducida por Sorafenib en Huh7 y Hep3b, respectivamente. De forma similar, la interferencia de p73TA redujo la expresión de CD95 (Figura 8C; p≤0,5, p≤0,01), TNF-R1 (Figura 8B; p≤0,5), Resultados -- 148 TRAIL-R1 (Figura 8D; p≤0,5) y activación de caspasa-8 (Figura 8E, 8F; p≤0,001) inducida por Sorafenib en Huh7 y Hep3b, respectivamente. Se observa que la reducción de la expresión de p53, TAp63 y TAp73 se reduce la inducción por Sorafenib en la expresión de los receptores de muerte y la apoptosis. Figura 8B: Efecto de siRNA frente a p53, p63 y p73TA en la regulación de la expresión de TNF-R1 por Sorafenib (S) * * * * Resultados -- 149 Figura 8C: Efecto de siRNA frente a p53, p63 y p73TA en la regulación de la expresión de CD95 por Sorafenib (S) Figura 8D: Efecto de siRNA frente a p53, p63 y p73TA en la regulación de la expresión de TRAIL-R1 por Sorafenib (S) * * * * * ** * ** Resultados -- 150 Figura 8E: Efecto de siRNA frente a p53, p63 y p73TA en la reguladión de la actividad caspasa-8 por Sorafenib (S) Figura 8F: Efecto de siRNA frente a p53, p63 y p73TA en la regulación del procesamiento de caspasa-8 por Sorafenib (S) Los shRNA reducen específicamente la expresión de la isoforma para la que se encuentran diseñados al igual que los SiRNA (Figura 9A). *** *** * *** *** *** *** *** Resultados -- 151 Figura 9A: Control de la expresión de las isoformas de p53 por los correspondientes shRNA La administración de shRNA frente a p63ΔN no modifica la expresión de TNF-R1 (Figura 9B), CD95 (Figura 9C) y Trail-R1 (Figura 9D), ni la activación de caspasa-8 (Figura 9E, 9F) en ninguna de las tres líneas celulares estudiadas ya que, como hemos dicho, promueve un aumento de la proliferación celular. Sin embargo, el bloqueo específico de p63TA reduce el incremento de la expresión de los tres receptores de muerte celular (Figura 9B, 9C y 9D; p≤0,5), actividad caspasa-8 (Figura 9E; p≤0,001, p≤0,01) y expresión del fragmento activo de caspasa-8 (Figura 9F; p≤0,5) en Huh 7 y Hep 3b, respectivamente. De forma similar, el bloqueo específico de p73TA reduce el incremento de la expresión de los tres receptores de muerte celular (Figura 9B, 9C y 9D; p≤0,5), actividad caspasa-8 (Figura 9E; p≤0,001, p≤0,5) y expresión del fragmento activo de caspasa-8 (Figura 9F; p≤0,5) en Huh 7 y Hep 3b, respectivamente. Resultados -- 152 Figura 9B: Efecto de shRNA frente a p63TA, p63ΔN y p73TA en la regulación de la expresión de TNF-R1 por Sorafenib (S) Figura 9C: Efecto de shRNA frente a p63TA, p63ΔN y p73TA en la regulacióin de la expresión de CD95 por Sorafenib (S) * * * * * * * * Resultados -- 153 Figure 9D Figure 9E *** *** ** * * * * *