Síntese de novos conjugados de S- e N,S-heterociclos-dipéptidos potencialmente antitumorais: formação e caraterização de um hidrogel

Universidade do Minho Escola de Ciências Ana Morgana Gonçalves Pereira da Silva outubro de 2022 Síntese de novos conjugados de Se N,S-heterociclos-dipéptidos potencialmente antitumorais; formação e caraterização de um hidrogel Ana Morgana Gonçalves Pereira da Silva Síntese de novos conjugados de Se N,S-heterociclos-dipéptidos potencialmente antitumorais; formação e caraterização de um hidrogel UMinho|2022 Universidade do Minho Escola de Ciências Ana Morgana Gonçalves Pereira da Silva outubro de 2022 Síntese de novos conjugados de Se N,S-heterociclos-dipéptidos potencialmente antitumorais; formação e caraterização de um hidrogel Trabalho efetuado sob a orientação da Doutora Maria João R. P. Queiroz Dissertação de Mestrado Mestrado em Química Medicinal ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição-CompartilhaIgual CC BY-SA https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/ iii Agradecimentos À minha orientadora, Doutora Maria João R. P. Queiroz, pelo seu imenso apoio, os seus inúmeros ensinamentos, o seu constante acompanhamento do trabalho, assim como a sua resiliência e paciência em relação a mim. Aos meus colegas do Laboratório 2.11 – Carlos Oliveira, André Carvalho, Carolina Amorim e Valéria Gomes – pela ajuda em relação aos hidrogéis. Ao Centro de Química da Universidade do Minho (CQUM, UID/QUI/686/2020), financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) e ao Departamento de Química, pelas facilidades concedidas à realização deste trabalho. À Escola de Ciências da Universidade do Minho, pelo apoio administrativo e logístico. À rede nacional de Ressonância Magnética Nuclear (PT NMR) e à Drª Elisa Pinto, técnica superior do Departamento de Química, pela simpatia e prontidão com que executou todos os espetros de RMN necessários à caraterização dos compostos. Ao Dr. João Amorim, pela sua ajuda e orientações que me mantiveram concentrada e positiva sobre a finalização deste longo trabalho. Aos meus familiares, principalmente à minha mãe, em certos momentos a minha única fonte de esperança nesta fase crítica da minha vida. iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v Síntese de novos conjugados de S - e N,S -heterociclos-dipéptidos potencialmente antitumorais; formação e caraterização de um hidrogel Resumo A conjugação de um heterociclo bioativo com péptidos biocompatíveis vai atuar como uma restrição conformacional, sendo usada para preparar conjugados de heterociclo-péptidos, com atividade biológica e reconhecimento celular aumentados. Neste trabalho, foram sintetizados conjugados de heterociclo-dipéptidos, usando S- (benzo[ b ]tiofeno) e N,S - (tieno[2,3b ]piridina e tieno[2,3b ]quinolina) heterociclos como grupos potencialmente antitumorais e N -protetores de dipéptidos de L-Phe-L-Phe e de L-Phe-L-Leu. Prepararamse os ácidos tieno[2,3b ]piridina-2-carboxílico e tieno[2,3b ]quinolina-2-carboxílico, como componentes de acoplamento, a partir das reações da 2-cloro-piridina-3-carbaldeído e 2-cloro-quinolina-3-carbaldeído, respetivamente, com tioglicolato de metilo em meio básico, formando anéis de tiofeno fundidos, substituídos com éster metílico na posição 2, que foram depois hidrolisados. O ácido benzo[ b ]tiofeno-2carboxílico foi adquirido comercialmente. O acoplamento dos ácidos carboxílicos heterocíclicos com sais de trifluoroacetato de L-fenilalanil-L-fenilalaninato de etilo e de L-fenilalanil-L-leucinato de etilo ocorreu usando HBTU e Et3N, tendo originado os correspondentes ésteres etílicos, que foram hidrolisados aos ácidos carboxílicos correspondentes – N -(tieno[2,3b ]piridina-2-carbonil)-L-fenilalanil-L-fenilalanina, N - (tieno[2,3b ]quinolina-2-carbonil)-L-fenilalanil-L-fenilalanina, N -(benzo[ b ]tiofeno-2-carbonil)-L-fenilalanil-Lfenilalanina, N -(tieno[2,3b ]piridina-2-carbonil)-L-fenilalanil-L-leucina, N -(tieno[2,3b ]quinolina-2-carbonil)- L-fenilalanil-L-leucina e N -(benzo[ b ]tiofeno-2-carbonil)-L-fenilalanil-L-leucina. Os conjugados heterociclodipéptido (ésteres e ácidos) foram completamente caraterizados por p.f., 1H, 13C RMN e massa de alta resolução no ião [M+H]+. Péptidos pequenos protegidos com núcleos aromáticos no N -terminal mostraram originar hidrogéis peptídicos supramoleculares bioativos, biocompatíveis e biodegradáveis. Deste modo, os seis conjugados preparados, com o ácido carboxílico livre, foram submetidos a estudos de gelificação em água, pelo método de abaixamento de pH, usando glucono-δ-lactona. Apenas o conjugado de benzo[ b ]tiofeno com L-Phe-L-Phe formou um hidrogel, com concentração crítica de 0,15 wt% e pH final de 6,85, que foi caraterizado por STEM, formando uma rede 3D de fibras entrelaçadas (espessura média de 17 nm), e reologia, mostrando um comportamento viscoelástico semelhante à matriz extracelular de alguns tecidos humanos. Palavras-chave: Antitumorais, conjugados heterociclo-dipéptidos, dipéptidos, heterociclos, hidrogéis. vi Synthesis of novel potentially antitumor S - and N,S -heterocycle-dipeptide conjugates; formation and characterization of a hydrogel Abstract The conjugation of a bioactive heterocycle with biocompatible peptides will act as a conformational constraint, which is used to prepare heterocycle-peptide conjugates with increased biological activity and cellular recognition. In this work, heterocycle-dipeptide conjugates were synthesized using S - (benzo[ b ]thiophene) and N,S - (thieno[2,3b ]pyridine and thieno[2,3b ]quinoline) heterocycles as potentially antitumor and N - protective groups of L-Phe-L-Phe and L-Phe-L-Leu dipeptides. The thieno[2,3b ]pyridine-2-carboxylic acid and thieno[2,3b ]quinoline-2-carboxylic acid precursors were prepared as coupling components from the reactions of 2-chloro-pyridine-3-carbaldehyde and 2-chloro-quinoline-3-carbaldehyde, respectively, with methyl thioglycolate in a basic medium, forming fused thiophene rings, substituted with methyl esters in position 2, that were hydrolyzed. Benzo[ b ]thiophene-2-carboxylic acid was obtained commercially. Coupling of heterocyclic carboxylic acids with trifluoroacetate salts of ethyl L-phenylalanyl-Lphenylalaninate and of ethyl L-phenylalanyl-L-leucinate took place using HBTU and Et3N, giving rise to the corresponding ethyl esters, which were hydrolyzed to the carboxylic acids – N -(thieno[2,3b ]pyridine-2carbonyl)-L-phenylalanyl-L-phenylalanine, N -(thieno[2,3b ]quinoline-2-carbonyl)-L-phenylalanyl-Lphenylalanine, N -(benzo[ b ]thiophene-2-carbonyl)-L-phenylalanyl-L-phenylalanine, N -(thieno[2,3b ]pyridine2-carbonyl)-L-phenylalanyl-L-leucine, N -(thieno[2,3b ]quinoline-2-carbonyl)-L-phenylalanyl-L-leucine and N - (benzo[ b ]thiophene-2-carbonyl)-L-phenylalanyl-L-leucine. The heterocycle-dipeptide conjugates (esters and acids) were fully characterized by m.p., 1H, 13C NMR and high-resolution mass in the [M+H]+ ion. Small peptides with aromatic nuclei at the N -terminus have been shown to yield bioactive, biocompatible and biodegradable supramolecular peptide hydrogels. Thus, the six conjugates prepared, with free carboxylic acids, were subjected to gelation studies in water, by the pH lowering method, using glucono-δ-lactone. Only the conjugate of benzo[ b ]thiophene with L-Phe-L-Phe formed a hydrogel, with a critical concentration of 0.15 wt% and final pH 6,85, which was characterized by STEM, forming a 3D fiber network (average thickness of 17 nm), and rheology, showing a viscoelastic behavior similar to the extracellular matrix of human tissues. Keywords: Antitumoral, dipeptides, heterocycle-dipeptide conjugates, heterocycles, hydrogels. vii Índice 1. Introdução .................................................................................................................................. 2 1.1 Peptidomiméticos baseados em heterociclos ............................................................................ 2 1.2 Hidrogéis peptídicos supramoleculares ..................................................................................... 5 1.3 Seleção dos sistemas heterocíclicos com propriedades antitumorais para grupos N -protetores de péptidos ....................................................................................................................................... 10 2. Apresentação de resultados e discussão ............................................................................. 15 2.1 Síntese dos precursores ésteres metílicos heterocíclicos 2a e 2b e dos correspondentes ácidos carboxílicos 3a e 3b para acoplamento com dipéptidos ................................................................ 15 2.2 Síntese do éster etílico dipeptídico N -Boc protegido 6b e dos sais de trifluoroacetato dos ésteres etílicos dipeptídicos 7a e 7b......................................................................................................... 17 2.3 Acoplamento dos compostos heterocíclicos 3a-c com sais de trifluoroacetato dos dipéptidos 7a e 7b ............................................................................................................................................... 19 2.3.1 Acoplamento dos compostos heterocíclicos 3a-c com o sal de trifluoroacetato do L-fenilalanilL-fenilalaninato de etilo (7a) ...................................................................................................... 19 2.3.2 Acoplamento dos compostos heterocíclicos 3a-c com o sal de trifluoroacetato do L-fenilalanilL-leucinato de etilo (7b) ............................................................................................................ 20 2.4 Síntese dos ácidos carboxílicos dos dipéptidos N -protegidos 10a-c e 11a-c ........................... 21 2.5 Estudos de gelificação por abaixamento de pH usando GdL .................................................... 34 2.5.1 Caraterização do hidrogel por reologia.............................................................................. 36 4. Parte experimental .................................................................................................................. 42 4.1 Geral ...................................................................................................................................... 42 4.1.1 Síntese dos ésteres metílicos dos precursores heterocíclicos 2a e 2b .............................. 42 4.1.2 Síntese dos ácidos carboxílicos dos precursores heterocíclicos 3a e 3b ........................... 43 4.1.3 Síntese dos ésteres etílicos dipeptídicos N -protegidos por Boc 6a e 6b ............................ 44 4.1.4 Síntese dos sais trifluoroacetato de L-fenilalanil-L-fenilalaninato de etilo e de L-fenilalanil-Lleucinato de etilo, 7a e 7b, respetivamente .............................................................................. 45 4.1.5 Acoplamento dos compostos heterocíclicos 3a-c com o sal de trifluoroacetato do L-fenilalanilL-fenilalaninato de etilo 7a e com o sal de trifluoroacetato do L-fenilalanil-L-leucinato de etilo 7b 46 4.1.6 Síntese dos ácidos carboxílicos dos dipéptidos N -protegidos por heterociclos 10a-c e 11a-c ................................................................................................................................................ 52 5. Referências .............................................................................................................................. 59 2 1. Introdução 1.1 Peptidomiméticos baseados em heterociclos Os péptidos e proteínas possuem uma grande diversidade de estruturas químicas e desempenham um papel importante na maioria dos processos fisiológicos associados à vida. São biopolímeros flexíveis, cuja estrutura e conformação são fortemente influenciadas pelas caraterísticas dos aminoácidos constituintes e pelo ambiente biofísico. Estes aspetos contribuem para que se tornem um ponto de partida particularmente atrativo para o desenho e descoberta de novos fármacos. Contudo, a elevada flexibilidade conformacional dos péptidos gera um potencial problema no desenvolvimento de novos fármacos, visto que um péptido ativo, para se ligar ao seu alvo biológico, necessita de adquirir uma conformação específica. Para isto, a introdução de uma restrição conformacional estrutural pode melhorar a ligação do péptido ao seu alvo e consequentemente o seu potencial terapêutico. Outras desvantagens associadas aos péptidos naturais ativos incluem: a sua inerente instabilidade face à degradação proteolítica, reduzida biodisponibilidade oral e a impossibilidade de atravessarem a barreira hematoencefálica.1 Os peptidomiméticos – compostos cujos constituintes estruturais essenciais (farmacóforo) mimetizam tridimensionalmente um péptido natural ou proteína, interagindo da mesma forma com o seu alvo, produzindo o mesmo efeito biológico – são desenhados para ultrapassar os problemas associados ao péptido natural. Algumas propriedades, como estabilidade em relação à proteólise, solubilidade, seletividade para o alvo ou potência podem ser, assim, substancialmente melhoradas. Nos últimos anos, o campo dos peptidomiméticos tem vindo a suscitar um enorme interesse na obtenção de análogos não-naturais de péptidos como moléculas biologicamente ativas. A incorporação ou substituição de um sistema heterocíclico em péptidos, que atua como uma restrição conformacional e que pode conferir uma atividade biológica efetiva, tem sido utilizada para preparar péptidos modificados como híbridos de heterociclo-péptido, com melhor eficácia in vivo do que o péptido natural.1,2 Uma técnica usada para introduzir uma restrição conformacional consiste na substituição das ligações amida da estrutura principal por substitutos ou isósteros destas, que possam inibir atividade proteolítica in vivo . Grupos isósteros da ligação amida posicionados estrategicamente podem também aumentar a biodisponibilidade e o transporte de péptidos. Pensa-se que a conformação cis das ligações amida é importante para a atividade biológica de alguns péptidos e proteínas. Assim, têm sido dirigidos esforços para preparar peptidomiméticos que mimetizem uma ligação peptídica numa conformação cis . 3 Pequenos anéis heteroaromáticos, incluindo pirroles, tetrazoles, triazoles e pirazoles, têm sido usados com este objetivo.2 A reação de química de click de 1,3-cicloadição de azida-alquino catalizada por Cu(I) gera regiosseletivamente 1,2,3-triazoles 1,4-dissubstituídas (Figura 1A). Esta reação é muito importante na síntese de peptidomiméticos com potencial em química medicinal, devido a vários atributos: origina o núcleo 1,2,3-triazole que pode apresentar atividade biológica; é compatível com as cadeias laterais de todos os aminoácidos, pelo menos nas formas protegidas; os produtos são originados em altos rendimentos e as dimensões moleculares das 1,2,3-triazoles 1,4-dissubstituídas são de alguma maneira semelhantes às das ligações amida em termos de distância e planaridade (Figura 1B).3 Figura 1 – (A) Reação de click para formação de 1,2,3-triazoles 1,4-dissubstituídas. (B) Representação de dipéptidos com uma ligação amida ou com um anel de 1,2,3-triazole 1,4-dissubstituido como isóstero. O anel de tetrazole 1,5-dissubstituído também é conhecido como sendo um excelente mimético da ligação cisamida (Figura 2A). Em 2002, May e Abell sintetizaram um dipeptidomimético I (Figura 2B), baseado num α-metilenotetrazole, como uma unidade de restrição conformacional não-hidrolisável para introdução em péptidos. A obtenção de peptidomiméticos baseados em heterociclos pode também envolver a introdução de um sistema heterocíclico que lhes confira propriedades biológicas e físicoquímicas a ele associadas. Os autores prepararam, assim, os peptidomiméticos IIa-c (Figura 2B), contendo a unidade de α-metilenotetrazole e um anel de quinolina (também presente no Saquinivir, um potente inibidor da HIV protease), que foram estudados como inibidores da HIV protease. Os resultados 4 dos estudos demonstraram que a atividade dos ligandos é afetada pela complementaridade entre a conformação cis-like conferida pela unidade de restrição de α-metilenotetrazole e a extensão dos resíduos de aminoácidos no C -terminal (Figura 2B).4 Figura 2 – (A) Representação da ligação cis -amida e do mimético tetrazole 1,5-dissubstituído. (B) Estrutura do dipeptidomimético com uma unidade de restrição α-metilenotetrazole I e dos conjugados de quinolina-péptidos IIa-c, e resultados dos estudos de inibição da HIV protease dos últimos. A substituição de uma sequência de aminoácidos por um sistema heterocíclico em péptidos também dá origem a peptidomiméticos. O octapéptido angiotensina II (H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-PheOH, AII) é um dos mais antigos péptidos conhecidos por uma multiplicidade de ações biológicas. Estudos de relações estrutura-atividade efetuados por diferentes laboratórios revelaram a contribuição topológica individual de cada resíduo de aminoácido na molécula ativa AII. Em 2005, Cordopatis, Varvournis et al. , baseados no seu conhecimento da química de tienopirimidinas e de AII, desenvolveram protocolos para gerar novos peptidomiméticos de AII com heterociclos, usando um derivado de tienopirimidina apropriado como um bloco molecular. Através de estudos teóricos, chegaram à estrutura híbrida mais promissora, substituindo os resíduos de His-Pro pelo grupo 2-amino-4-pirrolidinotieno[2,3d ]pirimidina-6-carbonilo (ATPC), H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-ATPC-Phe-OH. Os autores consideraram que este bloco heterocíclico de substituição podia funcionar também como grupo protetor do N -terminal no desenho de vários 5 peptidomiméticos biologicamente ativos, tendo preparado diferentes estruturas híbridas de heterocicloAA/péptidos ácidos carboxílicos, ésteres ou amidas (Figura 3).5 Figura 3 – Peptidomiméticos obtidos por acoplamento do ácido 2-amino-4-pirrolidinotieno[2,3d ]pirimidina-6-carboxílico com o N -terminal de diferentes aminoácidos ou péptidos. 1.2 Hidrogéis peptídicos supramoleculares Os hidrogéis supramoleculares têm atraído uma atenção considerável devido às suas potenciais aplicações biotecnológicas e biomédicas como, por exemplo, distribuição de fármacos,6 cultura de células,7 engenharia de tecidos8 e cicatrização de feridas,9 entre outras. Após receberem um impulso externo, péptidos curtos N -protegidos com sistemas aromáticos, – hidrogeladores de baixo peso molecular (BPM) – podem sofrer auto-associação para formar redes tridimensionais (3D) altamente ordenadas, formando longas fibras que podem reter moléculas de água, originando hidrogéis supramoleculares biocompatíveis e biodegradáveis. O processo de auto-associação ocorre através de interações não-covalentes, tais como pontes de hidrogénio, empilhamento π-π, interações hidrofóbicas, iónicas e de Van der Waals. Vários métodos têm sido reportados como efetivos para desencadear a gelificação, como por exemplo, mudança de pH, mudança de temperatura e modificação enzimática do hidrogelador. Para uma hidrogelação efetiva, é crucial existir um equilíbrio de grupos hidrofílicos e hidrofóbicos, de modo a estabelecer as interações intermoleculares necessárias à formação de uma rede fibrosa e à imobilização de moléculas de água. Em termos gerais, a incorporação de resíduos de aminoácidos muito polares tem de ser compensada pela incorporação de hidrofobicidade noutro ponto da molécula.10 Existem, na literatura, inúmeros exemplos de hidrogéis supramoleculares peptídicos, nomeadamente constituídos por die tripéptidos. Tipicamente, o N -terminal encontra-se funcionalizado por um sistema aromático volumoso, como por exemplo, fluorenometilmetoxicarbonilo (Fmoc),11 6 derivados de naftaleno (Nap)12 e de naproxeno (Npx)13 (Figura 4), entre outros,14 enquanto o C -terminal se encontra livre na forma de ácido carboxílico. Um potencial problema é o facto da ligação covalente de uma molécula aromática biologicamente ativa a um péptido hidrogelador efetivo poder impedir a gelificação do conjugado. Assim, estes conjugados devem reter a capacidade de gelificação do péptido hidrogelador quando a molécula aromática do fármaco atua como um grupo N -protetor. Figura 4 – Estruturas gerais de hidrogeladores peptídicos supramoleculares e exemplos de grupos Nprotetores aromáticos. Diversos estudos confirmaram que péptidos contendo um C -terminal na forma de ácido carboxílico originam hidrogéis quando o pH de uma solução alcalina do hidrogelador diminui em direção ao pKa do ácido carboxílico, o que significa que o grupo carboxilato fica protonado. Várias estratégias foram desenvolvidas para induzir a formação de hidrogéis através de uma diminuição controlada do pH. Em 2009, Sanderson et. al. reportaram pela primeira vez uma técnica genérica para ajustar com precisão o pH da solução do hidrogelador BPM, usando a hidrólise da glucono-δ-lactona (GdL) a ácido glucónico, em água (Figura 5). A hidrólise lenta da GdL, associada a uma rápida dissolução, permite uma mudança de pH uniforme em toda a amostra, resultando na formação de hidrogéis homogéneos com propriedades mecânicas reprodutíveis, o que é crítico para as aplicações. O pH final atingido pode ser determinado regulando a quantidade de GdL adicionada. Usando este método, o processo de gelificação pode ser 7 monitorizado ao longo do tempo, permitindo ter uma visão mais aprofundada do mecanismo pelo qual a gelificação ocorre.15 Figura 5 – Hidrólise da GdL em ácido glucónico. Na Figura 6, mostra-se a formação de hidrogéis a partir de Fmoc-L-Leu-Gly-OH usando HCl, com o qual se formou um hidrogel heterogéneo e turvo, e GdL, que originou um hidrogel homogéneo e transparente. Figura 6 – Fotografia de hidrogéis preparados a partir de Fmoc-L-Leu-Gly-OH, através da adição de HCl ou de GdL . Em ambos os casos o pH final é 3,9.15 Os hidrogéis estão a atrair particular atenção como sistemas para libertação de fármacos, como pro-fármacos para libertação sustentada de moléculas terapêuticas ligadas covalentemente, e como materiais smart que tenham a capacidade de serem manipulados remotamente em resposta a um estímulo externo.16 Hidrogéis formados por conjugados de péptidos com naproxeno – um anti-inflamatório não-esteroide (AINE) – mostraram-se promissores para aplicação nestas três áreas. Quando o grupo aromático N -protetor é um AINE (por exemplo, o naproxeno), originando hidrogeladores híbridos, alguns conjugados exibem retenção ou aumento das propriedades anti-inflamatórias do sistema aromático usado e, por vezes, são observadas novas e não esperadas atividades biológicas. A conjugação do Npx com péptidos frequentemente origina seletividade para a inibição da ciclo-oxigenase-2 (COX-2) relativamente à da COX-1, enzimas envolvidas nos processos inflamatórios, o que constitui a chave para 8 reter os benefícios dos anti-inflamatórios não-esteroides, minimizando os efeitos colaterais gástricos. É desejável que estes conjugados possuam uma alta estabilidade in vivo , o que é normalmente conseguido trocando L-aminoácidos por aminoácidos não-proteinogénicos, como D-aminoácidos, β-aminoácidos e desidroaminoácidos (∆AAs).10 Num estudo recente, foram estudadas as propriedades anti-inflamatórias de alguns conjugados de N -naproxeno-péptidos incluindo desidroaminoácidos na estrutura peptídica. O conjugado Npx-L-AlaZ - ∆Phe-OH (Figura 7) mostrou inibir seletivamente a COX-2, tendo mostrado também poder inibitório da lipo-oxigenase (LOX), enzima envolvida na regulação das respostas inflamatórias, o que o torna num potencial anti-inflamatório com propriedades inibitórias duais LOX/COX-2. Alguns estudos de atividade antitumoral também foram feitos neste tipo de conjugados, não tendo os resultados sido promissores.17 Figura 7 – Estrutura do conjugado Npx-L-Ala-Z-∆Phe-OH. Em estudos anteriores do mesmo grupo de investigação, o conjugado representado na Figura 7 mostrou formar um hidrogel à concentração de gelificação crítica (CGC) 0,8 wt% e um pH de transição de fase sol-gel = 5, tendo a sua análise morfológica sido levada a cabo por microscopia de transmissão eletrónica (TEM) (Figura 8). As nanofibras do hidrogelador são curtas (comprimento entre 170-750 nm) e não uniformes, exibindo uma largura mínima de 12 nm e uma máxima de 16 nm.18 9 Figura 8 – Imagem de TEM do hidrogel obtido a partir do hidrogelador representado na Figura 7 (barra de escala de 100 nm). A inversão do frasco constitui o método mais simples para avaliar inicialmente a formação de um hidrogel supramolecular e fornece uma impressão intuitiva da forma e da força do hidrogel. Técnicas de microscopia eletrónica – incluindo microscopias de transmissão (TEM), scanning (SEM) e de scanning e transmissão (STEM) – fornecem informação valiosa sobre a morfologia dos agregados moleculares/nanofibras que conduzem à hidrogelação. Estas microscopias utilizam um feixe de eletrões acelerados como fonte, sendo possível observar estruturas extremamente pequenas, na ordem dos nanómetros, em resoluções elevadas.19 As propriedades macroscópicas dos hidrogéis supramoleculares podem ser estudadas usando reologia (viscosimetria). Esta técnica consiste no estudo da deformação e da fluidez da matéria sob a aplicação de stresse, e permite avaliar a cinética de formação do hidrogel, calculando os módulos G' (medida da elasticidade) e G'' (medida da viscosidade) em função de uma força aplicada.20 Como exemplo, apresentam-se os parâmetros reológicos do hidrogel obtido a partir do hidrogelador representado na Figura 7 (Npx-L-AlaZ -∆Phe-OH) com CGD = 0,8 wt%, tendo apresentado valores de G’ (5,9 × 102 Pa) significativamente superiores a G’’ (1,1 × 102 Pa), o que indica um comportamento viscoelástico.18 10 1.3 Seleção dos sistemas heterocíclicos com propriedades antitumorais para grupos N -protetores de péptidos Os heterociclos são um grupo de moléculas orgânicas muito importantes em química medicinal, ocupando uma posição fulcral na síntese orgânica. Sistemas de anéis heterocíclicos com substituições específicas em posições apropriadas constituem estruturas-base para estudos de diversas atividades biológicas. Os compostos heterocíclicos encontram-se amplamente distribuídos na natureza e são simultaneamente sintetizados em laboratório, sendo inúmeros utilizados com sucesso como agentes terapêuticos. Compostos heterocíclicos contendo nitrogénio são os mais abundantes, estando presentes em vários produtos naturais biologicamente ativos, fármacos sintéticos e produtos agroquímicos. Na indústria farmacêutica, a presença de sistemas heterocíclicos em fármacos é muito prevalente, sendo que mais de 60% dos fármacos mais comercializados para o tratamento de diversas doenças apresentam, pelo menos, um anel heterocíclico. Nas últimas décadas, entre os heterociclos de enxofre, o benzo[ b ]tiofeno mostrou ser um núcleo singular como importante farmacóforo de algumas moléculas biologicamente ativas. Derivados de benzo[ b ]tiofeno atraíram o interesse dos químicos medicinais para o desenvolvimento de fármacos antitumorais, apresentando-se o Raloxifene, como exemplo, na Figura 9. Este fármaco pertence à categoria dos moduladores seletivos dos recetores de estrogénio (SERMs), sendo antagonista destes no tecido mamário, podendo ser utilizado como antitumoral em cancros de mama ER positivos, e agonista nos ossos, sendo usado no tratamento de osteoporose na mulher pós-menopáusica. Pode ainda ser usado para reduzir o risco de cancro de mama invasivo em mulheres pós-menopáusicas com osteoporose.21 Figura 9 – Estrutura do fármaco Raloxifene, baseado no núcleo de benzo[ b ]tiofeno. 11 Outros derivados de benzo[ b ]tiofeno têm sido desenvolvidos como antitumorais, atuando em diferentes alvos. Por exemplo, Romagnoli et al . reportaram a síntese de duas séries de compostos baseadas em 3-amino-2-(3,4,5-trimetoxibenzoil)benzo[ b ]tiofeno e nos isómeros posicionais 2-amino, e avaliaram a sua atividade antiproliferativa pela inibição da polimerização da tubulina e efeitos no ciclo celular, tendo o composto III (Figura 10) mostrado ser o mais promissor entre os compostos preparados.22 Figura 10 – Exemplo de um composto derivado de benzo[ b ]tiofeno que apresentou atividade antiproliferativa pela inibição da polimerização da tubulina. N -heterociclos fundidos com anel de tiofeno têm adquirido considerável interesse na área da química medicinal e na descoberta de novos fármacos. As tieno[2,3b ]piridinas foram inicialmente descobertas como potenciais inibidores da fosfolipase C (PLC) por virtual screening (vHTS), tendo Reynisson et al . 23 em 2009 identificado os compostos IV e V (Figura 11) e em 2016 24 o composto VI (Figura 11). Estes compostos mostraram atividade antitumoral muito promissora em células melanoma MDA-MB-435.24,25 O composto V também se mostrou ativo em células de cancro da mama MD-MB-231.26 Figura 11 – Estruturas dos compostos derivados tieno[2,3b ]piridina que mostraram atividade antitumoral promissora em diferentes linhas celulares. 18 Esquema 5 – Mecanismo de acoplamento de um ácido carboxílico com uma amina usando HBTU. Para além do HBTU ser mais reativo e impedir a racemização dos aminoácidos, comparando com o uso de outros agentes de acoplamento, como carbodiimidas (RN=C=NR’) ou combinação destas com HOBt, também apresenta como vantagem a formação do derivado solúvel de N , N’ -tetrametilureia como subproduto, que é facilmente eliminado no tratamento da reação, constituindo um melhoramento no isolamento do produto de acoplamento.30 Os compostos 6a e 6b foram depois N -desprotegidos usando TFA, tendo-se obtido os sais de trifluoroacetato correspondentes 7a e 7b em rendimentos quantitativos (Esquema 5), depois da remoção do excesso de TFA no evaporador rotativo, usando éter etílico múltiplas vezes. 19 Esquema 6 – Síntese dos sais de trifluoroacetato 7a e 7b. Os compostos 7a e 7b obtidos foram usados diretamente nas reações de acoplamento com os ácidos carboxílicos heterocíclicos preparados 3a e 3b e o ácido benzo[ b ]tiofeno-2-carboxílico (3c) comercial. 2.3 Acoplamento dos compostos heterocíclicos 3a-c com sais de trifluoroacetato dos ésteres etílicos dipeptídicos 7a e 7b 2.3.1 Acoplamento dos compostos heterocíclicos 3a-c com o sal de trifluoroacetato do L-fenilalanil-L-fenilalaninato de etilo (7a) Os compostos 3a-c foram acoplados com o composto 7a, tendo-se obtido os dipéptidos N - protegidos pelos heterociclos correspondentes, 8a-c, em 50% de rendimento, usando como agente de acoplamento HBTU e Et3N como base em ACN (Esquema 7). 20 Esquema 7 – Síntese dos ésteres etílicos dipeptídicos N -protegidos por heterociclos, 8a-c. Os produtos obtidos 8a-c foram completamente caraterizados por p.f., 1H e 13C RMN, incluindo DEPT θ = 135o e espetros bidimensionais de correlações homonucleares 1H-1H (COSY) e heteronucleares 1H-13C (HSQC) e massa de alta resolução ESI no ião [M+H]+. 2.3.2 Acoplamento dos compostos heterocíclicos 3a-c com o sal de trifluoroacetato do L-fenilalanil-L-leucinato de etilo (7b) Os compostos 3a-c foram acoplados com o composto 7b, tendo-se obtido os dipéptidos N - protegidos pelos heterociclos correspondentes, 9a-c, em bons rendimentos (60-63%), usando como agente de acoplamento HBTU e Et3N como base em ACN (Esquema 8). 21 Esquema 8 – Síntese dos ésteres etílicos dipeptídicos N -protegidos por heterociclos, 9a-c. Os produtos obtidos 9a-c foram completamente caraterizados por p.f., 1H e 13C RMN, incluindo espectros de DEPT θ = 135o e espetros bidimensionais de correlações homonucleares 1H-1H e heteronucleares 1H-13C e massa de alta resolução ESI no ião [M+H]+. 2.4 Síntese dos ácidos carboxílicos dos dipéptidos N -protegidos 10a-c e 11a-c Os ésteres etílicos 8a-c foram hidrolisados aos respetivos ácidos carboxílicos, 10a-c, usando NaOH 2M em etanol durante a noite, à temperatura ambiente, seguido de acidificação com KHSO4 1M, em rendimentos bons a quantitativos (Esquema 9). 22 Esquema 9 – Síntese dos ácidos carboxílicos dipeptídicos N -protegidos por heterociclos, 10a-c. Os produtos obtidos (10a-c) foram completamente caraterizados por p.f., 1H e 13C RMN, incluindo espectros de DEPT θ = 135o e espetros bidimensionais de correlações homonucleares 1H-1H e heteronucleares 1H-13C, e massa de alta resolução no ião [M+H]+. Como exemplo da caraterização por 1H e 13C RMN, apresentam-se espetros do composto 10c, incluindo correlações bidimensionais COSY e HSQC (Figuras 14-19). No espetro de 1H RMN apresentado na Figura 14, podem ser observados, na zona alifática, os dois sinais correspondentes aos dois multipletos de β-CH2, entre 2,93-2,99 e 3,06-3,11 ppm, e os dois multipletos correspondentes aos α-CH, entre 4,44-4,49 e 4,70-4,76 ppm. Na zona aromática, são visíveis os sinais dos 15H aromáticos, destacando-se o singleto correspondente ao 3-H, a 8,14 ppm. Observa-se ainda os dois dupletos correspondentes aos sinais dos NH, a 8,40 e 8,55 ppm, com J = 8,0 e 8,8 Hz, respetivamente. 23 Figura 14 – Espetro de 1H RMN (400 MHz, DMSOd6 ) do composto 10c. Na Figura 15 está representado o espetro de COSY do composto 10c, realçando-se o acoplamento entre os protões β-CH2 e entre estes e os adjacentes α-CH. Estes últimos estão a acoplar também com os NH adjacentes. 24 Figura 15 – Espetro 2D de COSY do composto 10c. A Figura 16 representa o espetro de 13C RMN do composto 10c. Pela análise diferencial do último, usando DEPT θ = 135º (Figura 17), é possível atribuir os sinais dos β-CH2 (a 36,6 e 37,0 ppm), os sinais dos α-CH (a 53,6 e 54,6 ppm) e os CH aromáticos, sendo que 8 são equivalentes dois a dois e outros aparecem sobrepostos. Os 8 carbonos quaternários do composto 10c observam-se na Figura 16, sendo o primeiro a 137,4 e o último, a 172,7 ppm. 25 Figura 16 – Espetro de 13C RMN (100,6 MHz, DMSOd6 ) do composto 10c. Figura 17 – Espetro de DEPT θ = 135º do composto 10c. 26 Na Figura 18, está representada uma expansão das correlações HSQC da zona alifática. Pode concluir-se que o primeiro multipleto de β-CH2 no espetro de 1H correlaciona com o carbono a 36,6 ppm, e o segundo conjunto correlaciona com o carbono a 37,0 ppm. O primeiro multipleto do α-CH em 1H RMN correlaciona com o carbono a 53,6 ppm, e o segundo multipleto correlaciona com o carbono a 54,6 ppm. Figura 18 – Expansão da zona alifática do espetro de HSQC do composto 10c. A Figura 19 representa a expansão da zona aromática do espetro de HSQC do composto 10c. Nela se observa 5 sinais para as correlações dos protões do benzo[ b ]tiofeno com os carbonos a eles ligados – sendo possível identificar o 3-CH a 125,2 ppm – e outros sinais que correspondem aos 10 protões dos fenilos. 27 Figura 19 – Expansão da zona aromática do espetro de HSQC do composto 10c. Os ésteres etílicos 9a-c foram hidrolisados aos respetivos ácidos carboxílicos, 11a-c, usando NaOH 2M em etanol durante a noite, à temperatura ambiente, seguido de acidificação com KHSO4 1M, em bons a altos rendimentos (Esquema 10). 34 2.5 Estudos de gelificação por abaixamento de pH usando GdL Como mencionado na secção 1.2 da introdução, hidrogeladores de BPM auto-organizam-se devido à presença de múltiplas interações não-covalentes, que permitem a associação dos blocos monoméricos em estruturas fibrilares que se entrecruzam e interagem umas com as outras para formar a rede 3D do hidrogel. O processo de hidrogelação de péptidos pequenos depende do equilíbrio entre hidrofobicidade e hidrofilicidade. Diversos métodos têm sido descritos e usados para promover gelificação, entre os quais o método de abaixamento de pH. Neste trabalho, a hidrogelação foi conseguida por um abaixamento lento e controlado do pH, através da adição de GdL, que é hidrolisada a ácido glucónico.15 Os conjugados 10a-c e 11a-c foram submetidos a estudos de gelificação, dissolvendo inicialmente 4 mg, de cada um, em 1 mL de água (0,4 wt%), com NaOH (1M, 30 µL). A esta solução foi adicionada GdL (0,4 wt%), deixando em repouso durante a noite. Nestas condições, nenhum composto formou gel, tendo os compostos 11a e 11c precipitado. Quando se adicionou mais 2 mg de GdL (0,6 wt%) às soluções aquosas dos outros compostos e se deixou em repouso durante a noite, somente o composto 10c formou gel (Figura 27C). Estudos posteriores (Figura 27A, B) revelaram uma concentração crítica de gelificação (CGC) de 0,15 wt% (pH 6,85), sendo que a 0,1 wt% já não se formou gel. Figura 27 – Estudos de gelificação realizados A (0,15 wt%), B (0,3 wt%) e C (0,4 wt%) para determinar a CGC do hidrogelador 10c, usando o método de inversão do frasco. Como, nas condições estudadas, apenas o composto 10c formou hidrogel, este foi caraterizado por STEM e estudos reológicos. Para verificar se, mesmo não formando gel, os restantes compostos sintetizados se auto-associavam, estudou-se também o composto 10b por STEM. 35 2.5.1 Caraterização do hidrogel por STEM O hidrogel originado pelo composto 10c apresentou as seguintes imagens em STEM, nas quais se observa uma auto-associação em nanofibras entrelaçadas com uma espessura média de 17 nm (Figura 28). Figura 28 – Imagens de STEM, com diferentes ampliações, do hidrogel formado pelo composto 10c (0,15 wt%) com GdL (0,6 wt%). No caso do composto 10b, que não formou hidrogel, obtiveram-se também as imagens de STEM (Figura 29). De acordo com as imagens obtidas, o composto 10b agrega para formar nanoestruturas tipo vesículas, que parecem unir-se para dar origem a fibras. No entanto, as fibras não são em número suficiente para se entrecruzarem e darem origem a um hidrogel. Deverão ser efetuados outros estudos, nomeadamente estudos de dinâmica molecular, de modo a justificar os resultados obtidos. Figura 29 – Imagens de STEM da solução do composto 10b (0,4 wt%) com GdL (0,6 wt%) em água. As imagens de STEM da Figura 28 são semelhantes a imagens microscópicas de hidrogéis encontradas na literatura. Como exemplo, apresentam-se abaixo as imagens de TEM de outros hidrogéis cujo hidrogelador consiste num dipéptido de difenilalanina conjugado com um grupo protetor aromático: 36 Npx-Phe-Phe-OH IX31 (Figura 30) e Fmoc-Phe-Phe-OH X32 (Figura 31). Em ambos os exemplos, foi determinada a CGC, cujos valores obtidos foram 0,2 e 0,5 wt%, respetivamente. Figura 30 – Imagens de TEM do hidrogel do composto IX. Figura 31 – Imagens de TEM do hidrogel do composto X. 2.5.1 Caraterização do hidrogel por reologia Como referido na secção 1.2 da introdução, os estudos reológicos dão informação sobre a deformação e fluidez da matéria sob a aplicação de stress e permitem avaliar a cinética de deformação do hidrogel e os módulos G’ (elasticidade) e G’’ (viscosidade) em função da força aplicada. Da Figura 32, pode concluir-se que o gel tem uma cinética de 6 horas, usando uma concentração de 0,4 wt%. 37 Figura 32 – Variação de G’ e G’’ durante o processo cinético de gelificação do composto 10c. Quando se atingiu o equilíbrio estrutural estabelecido pela leitura dos módulos G’ e G’’, realizouse um varrimento de frequência de 100 Hz até 0,1 Hz, com uma deformação de 0,01%, para se obter o espetro mecânico da Figura 33. O valor de G’ é aproximadamente 10 vezes superior ao valor de G’’ (Tabela 1), como verificado para outros hidrogéis com uma sequência de fenilalanilfenilalanina na literatura. Por exemplo, Li et al. formaram e caraterizaram um hidrogel a partir do composto IX, tendose obtido um valor de G’ máximo semelhante (1,7 × 103 Pa)31 ao hidrogel do composto 10c. Mahler et al . produziram também resultados, para o hidrogel do composto X, semelhantes com G’ aproximadamente 10 vezes superiores a G’’ (Figura 34). Figura 33 – Dependência da frequência dos módulos G’ e G’’ do composto 10c a 0,4 wt%. 38 Tabela 1 – Valores de G’ e G’’ do hidrogel obtido a partir do composto 10c. Hidrogel G’ (Pa) G’’ (Pa) 10c 3,03 × 103 3,28 × 102 Figura 34 – Gráfico obtido a partir do varrimento de frequência do hidrogel do composto X. De seguida, realizou-se um varrimento de tensão a uma frequência de 1 Hz, aumentando a deformação de 0,01 a 100%, tendo-se obtido o gráfico mostrado na Figura 35. Figura 35 – Dependência da tensão dos módulos G’ e G’’ do composto 10c a 0,4 wt%. Num hidrogel, o módulo G’ é independente da tensão de oscilação aplicada, até ser atingida a chamada tensão crítica, que leva à deformação do hidrogel e à queda dos valores de G’ e G’’. O hidrogel do composto 10c apresenta uma baixa tensão crítica, semelhante ao hidrogel do composto IX, com uma tensão crítica de 0,6%.31 39 Capítulo 3 Conclusões e perspetivas 40 3. Conclusões e perspetivas Sintetizaram-se seis conjugados de dipéptidos Phe-Phe-OH e Phe-Leu-OH com S - e N , S - heterociclos como grupos N -protetores a partir dos correspondentes ésteres etílicos. Os compostos S - e N , S -heterocíclicos usados foram o ácido benzo[ b ]tiofeno-2-carboxílico, o ácido tieno[2,3b ]piridina-2-carboxílico e o ácido tieno[2,3b ]quinolina-2-carboxílico, tendo sido estes dois últimos preparados neste trabalho. Estes temas heterocíclicos foram escolhidos para conferir atividades antitumorais aos conjugados. Os ácidos heterocíclicos foram acoplados com sais de trifluoroacetato dos dipéptidos L-fenilalanilL-fenilalaninato de etilo ou L-fenilalanil-L-leucinato de etilo, usando HBTU como agente de acoplamento e Et3N como base, tendo-se obtido, após hidrólise dos conjugados heterociclo-dipéptido na forma de ésteres etílicos, os ácidos carboxílicos correspondentes – N -(tieno[2,3b ]piridina-2-carbonil)-L-fenilalanil-Lfenilalanina, N -(tieno[2,3b ]quinolina-2-carbonil)-L-fenilalanil-L-fenilalanina, N -(benzo[ b ]tiofeno-2-carbonil)- L-fenilalanil-L-fenilalanina, N -(tieno[2,3b ]piridina-2-carbonil)-L-fenilalanil-L-leucina, N -(tieno[2,3b ]quinolina-2-carbonil)-L-fenilalanil-L-leucina e N -(benzo[ b ]tiofeno-2-carbonil)-L-fenilalanil-L-leucina. Os conjugados heterociclo-dipéptido (ésteres e ácidos) foram completamente caraterizados por p.f., 1H, 13C RMN e massa de alta resolução no ião [M+H]+. Os seis ácidos carboxílicos conjugados heterociclo-dipéptido foram submetidos a estudos de gelificação em água, através de abaixamento do pH usando GdL, NaOH para dissolução do composto, e deixando em repouso durante a noite. Nestas condições, somente o ácido de 10c formou gel quando se inverteu o frasco, tendo posteriormente sido determinada a CGC, com valor de 0,15 wt%, e o pH final de 6,85. Os outros compostos ou precipitaram ou não formaram hidrogel, mesmo depois de se ter adicionado mais GdL. Desta forma, o único hidrogel formado foi caraterizado por STEM – onde foi possível a visualização de uma rede 3D de fibras entrelaçadas, com espessura média de 17 nm – e, por reologia, tendo mostrado um comportamento viscoelástico (G’ = 3,03 × 103 Pa; G’’ = 3,28 × 102 Pa) semelhante à matriz extracelular de alguns tecidos humanos. Adicionalmente, de modo a verificar se, mesmo não formando gel, os restantes compostos sintetizados se auto-associavam, estudou-se, como exemplo, a solução do ácido de N -(tieno[2,3b ]quinolina-2-carbonil)-L-fenilalanil-L-fenilalanina por STEM, tendo-se observado nanoestruturas fibrilares tipo vesículas, mas em número insuficiente para formar um hidrogel. As propriedades antitumorais dos conjugados preparados serão posteriormente estudadas em colaboração com outro grupo de investigação. 41 Capítulo 4 Parte experimental 42 4. Parte experimental 4.1 Geral As reações foram monitorizadas por cromatografia de camada fina (TLC). Os pontos de fusão foram determinados utilizando o SPM3-Stuart apparatus. Os espetros de 1H e 13C RMN foram feitos num Bruker Avance III a 400 e 100,6 MHz, respetivamente. Usou-se DEPT θ = 135º e espetros de correlações homonucleares 1H-1H (COSY) e heteronucleares 1H-13C (HSQC e HMBC). Os compostos novos foram também caraterizado por espetrometria de massa de alta resolução usando a técnica de ESI, no serviço de espetrometria de massa do CACTI da Universidade de Vigo. 4.1.1 Síntese dos ésteres metílicos dos precursores heterocíclicos 2a e 2b Tieno[2,3b ]piridina-2-carboxilato de metilo (2a) – Adicionou-se ao 2-cloropiridina-3-carbaldeído (1a) (0,650 g, 4,57 mmol) em DMF (5,2 mL), tioglicolato de metilo (0,450 mL, 5,03 mmol) e carbonato de potássio (3 equiv., 1,900 g, 13,7 mmol) e deixou-se a agitar a 80 ºC durante 3 horas. De seguida, colocou-se a mistura reacional em gelo, com agitação, tendo-se formado um precipitado. Filtrou-se, usando vácuo, tendo-se obtido o composto 2a como um sólido branco (0,530 g, 60%).1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ = 3,97 (3H, s, OCH3), 7,37 (1H, dd, J = 8,0 e 4,4 Hz, 5-H), 8,01 (1H, s, 3-H), 8,16 (1H, dd, J = 8,0 e 1,6 Hz, 4-H), 8,69 (1H, dd, J = 4,4 e 1,6 Hz, 6-H) ppm. Este espetro é idêntico ao descrito na literatura.29 Tieno[2,3b ]quinolina-2-carboxilato de metilo (2b)33 – Adicionou-se ao 2-cloroquinolina-3carbaldeído (1b) (0,700 g, 2,15 mmol) em DMF (18,0 mL), tioglicolato de metilo (0,360 mL, 4,02 mmol) e carbonato de potássio (3 equiv., 1,51 g, 1,10 mmol) e deixou-se agitar a 80 ºC durante 3 horas. De 43 seguida colocou-se a mistura reacional em gelo, com agitação, tendo-se formado um precipitado. Filtrouse, usando vácuo, tendo-se obtido o composto 2b como um sólido branco (0,524 g, 60%). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ = 4,01 (3H, s, OCH3), 7,60-7,66 (1H, m, ArH), 7,83-7,88 (1H, m, ArH), 8,03 (1H, d largo, J = 8,4 Hz, ArH), 8,14 (1H, s, ArH), 8,25 (1H, d largo, J = 8,4 Hz, ArH), 8,75 (1H, s, ArH) ppm. 13C RMN (100,6 MHz, CDCl3) δ = 53,0 (OCH3), 125,7 (C), 126,3 (CH), 127,5 (CH), 127,9 (CH), 128,7 (CH), 131,2 (CH), 131,4 (C), 134,0 (CH), 134,9 (C), 147,0 (C), 163,0 (C) ppm. 4.1.2 Síntese dos ácidos carboxílicos dos precursores heterocíclicos 3a e 3b Ácido tieno[2,3b ]piridina-2-carboxílico (3a) – A uma solução de tieno[2,3b ]piridina-2-carboxilato de metilo (2a) (0,530 g, 2,74 mmol) em MeOH (20,0 mL) adicionou-se NaOH 2M (2 equiv.) e a mistura ficou a agitar à temperatura ambiente durante a noite. Evaporou-se o solvente e ao resíduo obtido adicionou-se H2O e algumas gotas de HClconc. até pH = 1. Formou-se um precipitado que se filtrou, tendose obtido o composto 3a como um sólido branco (0,488 g, rendimento quantitativo), p.f. 314-316 ºC. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6 ) δ = 7,52 (1H, dd, J = 8,2 e 4,4 Hz, 5-H), 8,09 (1H, s, 3-H), 8,40 (1H, dd, J = 8,2 e 1,6 Hz, 4-H), 8,69 (1H, dd, J = 4,4 e 1,6 Hz, 6-H) ppm. Ácido tieno[2,3b ]quinolina-2-carboxílico (3b) – Uma mistura de tieno[2,3b ]quinolina-2carboxilato de metilo (2b) (0,524 g, 2,15 mmol) em MeOH (28,0 mL) e NaOH 2M (2 equiv., 0,778 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. Evaporou-se o solvente e ao resíduo obtido adicionouse H2O e algumas gotas de HClconc. até pH = 1. Formou-se um precipitado que se filtrou, tendo-se obtido o composto 3b como um sólido branco (0,457 g, 93%), p.f. 335-337 ºC. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6 ) δ = 7,63-7,67 (1H, m, ArH), 7,84 -7,89 (1H, m, ArH), 8,07 - 8,10 (1H, m, ArH), 8,16 - 8,19 (1H, m, ArH), 8,22 (1H, s, ArH), 9,04 (1H, s, ArH) ppm. 13C RMN (100.6 MHz, DMSO-d6) δ = 125,5 (C), 126,0 50 N -(tieno[2,3b ]piridina-2-carbonil)-L-fenilalanina-L-leucinato de etilo (9b) – Ao composto 3b (0,330 g, 0,785 mmol) adicionou-se ACN (10 mL) e deixou-se a agitar. Juntou-se o agente de acoplamento HBTU (1,2 equiv., 0,478 g), a 0ºC, e o sal de trifluoroacetato 7b (1 equiv., 0,785 mmol) dissolvido em ACN (3 mL). Adicionou-se à mistura reacional Et3N até pH = 7, e deixou-se a agitar durante a noite à temperatura ambiente. Evaporou-se o ACN e adicionou-se AcOEt (20 mL). Foram efetuadas lavagens da fase orgânica utilizando KHSO4 (3 × 15 mL), NaHCO3 (3 × 15 mL) e solução saturada de NaCl (3 × 15 mL). Secou-se a fase orgânica usando sulfato de magnésio anidro, filtrou-se e evaporou-se o AcOEt, tendo-se obtido um sólido amarelado que, depois de lavado com éter etílico, originou o composto 9b como um sólido branco (0,249 g, 61%), p.f. 189-191 ºC. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6 ) δ = 0,86 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3), 0,92 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3), 1,17 (3H, t, J = 6,8 Hz, OCH2 CH3 ), 1,48-1,73 (3H, m, CH e β-CH2 Leu), 2,97-3,03 (1H, m, β-CH Phe), 3,14-3,18 (1H, m, β-CH Phe), 4,03-4,14 (2H, m, O CH2 CH3), 4,28-4,34 (1H, m, α-CH Leu), 4,75-4,90 (1H, m, α-CH Phe), 7,14-7,18 (1H, m, ArH), 7,257,29 (2H, m, ArH), 7,40-7,42 (2H, m, ArH), 7,61-7,65 (1H, m, ArH), 7,81-7,85 (1H, m, ArH), 8,06 (1H, d largo, J = 7,6 Hz, ArH), 8,16 (1H, d largo, J = 7,6 Hz, ArH), 8,29 (1H, s, ArH), 8,59 (1H, d, J = 7,6 Hz, NH Leu), 9,03 (1H, s, ArH), 9,13 (1H, d, J = 8,0 Hz, NH Phe) ppm. 13C RMN (100,6 MHz, DMSOd6 ) δ = 14,0 (OCH2 CH3 ), 21,3 (CH3), 22,7 (CH3), 24,3 (CH Leu), 37,1 (β-CH2 Phe), 39,6 (β-CH2 Leu), 50,6 (α-CH Leu), 54,6 (α-CH Phe), 60,5 (O CH2 CH3), 123,2 (CH), 125,5 (C), 125,8 (CH), 126,3 (CH), 127,8 (CH), 128,1 (2 × CH), 128,9 (CH), 129,1 (2 × CH), 130,5 (CH), 131,7 (C), 133,3 (CH), 138,1 (C), 140,0 (C), 146,9 (C), 161,1 (C), 162,0 (C), 171,4 (C), 172,3 (C) ppm. MS ESI valor teórico para [M+H]+ C29H32N3O4S 518,2108. Valor encontrado 518,2109. 51 N -(benzo[ b ]tiofeno-2-carbonil)-L-fenilalanina-L-leucinato de etilo (9c) – Ao composto 3c (0,120 g, 0,644 mmol) adicionou-se ACN (7 mL) e deixou-se a agitar. Juntou-se o agente de acoplamento HBTU (1,2 equiv., 0,318 g), a 0 ºC, e o sal de trifluoroacetato 7b (1 equiv., 0,664 mmol) dissolvido em ACN (3 mL). Adicionou-se à mistura reacional Et3N até pH = 7, e deixou-se a agitar a durante a noite à temperatura ambiente. Filtrou-se o sólido branco precipitado e evaporou-se o ACN, tendo-se adicionado depois AcOEt (20 mL). Foram efetuadas lavagens da fase orgânica utilizando KHSO4 (3 × 15 mL), NaHCO3 (3 × 15 mL) e solução saturada de NaCl (3 × 15 mL). Secou-se a fase orgânica usando sulfato de magnésio anidro, filtrou-se e evaporou-se o AcOEt, tendo-se obtido um sólido amarelado que, depois de lavado com éter etílico, originou o composto 9c como um sólido branco (total: 0,242 g, 60%), p.f. 212214 ºC. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6 ) δ = 0,85 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3), 0,93 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3), 1,17 (3H, t, J = 7,2 Hz, OCH2 CH3 ), 1,50-1,73 (3H, m, CH e β-CH2 Leu), 2,94-3,00 (1H, m, β-CH Phe), 3,11-3,15 (1H, m, β-CH Phe), 4,02-4,14 (2H, m, O CH2 CH3), 4,26-4,32 (1H, m, α-CH Leu), 4,72-4,78 (1H, m, α-CH Phe), 7,13-7,17 (1H, m, ArH), 7,23-7,27 (2H, m, ArH), 7,37-7,39 (2H, m, ArH), 7,41-7,46 (2H, m, ArH), 7,92-7,98 (2H, m, ArH), 8,17 (1H, s, 3-H), 8,53 (1H, d, J = 7,6 Hz , NH Leu), 8,90 (1H, d, J = 8,8 Hz, NH Phe) ppm. 13C RMN (100,6 MHz, DMSOd6 ) δ = 14,0 (OCH2 CH3 ), 21,4 (CH3), 22,7 (CH3), 24,3 (CH Leu), 37,1 (β-CH2 Phe), 39,6 (β-CH2 Leu), 50,6 (α-CH Leu), 54,6 (α-CH Phe), 60,5 (O CH2 CH3), 122,8 (CH), 124,9 (CH), 125,2 (CH), 125,3 (3-CH), 126,2 (CH), 126,3 (CH), 128,1 (2 × CH), 129,1 (2 × CH), 138,2 (C), 139,1 (C), 139,5 (C), 140,2 (C), 161,4 (C), 171,5 (C), 172,3 (C) ppm. MS ESI valor teórico para [M+H]+ C26H31N2O4S 467,1999. Valor encontrado 467,1998. 52 4.1.6 Síntese dos ácidos carboxílicos dos dipéptidos N -protegidos por heterociclos 10a-c e 11a-c Ácido N -(tieno[2,3b ]piridina-2-carbonil)-L-fenilalanina-L-fenilalanina (10a) – A uma solução do composto 8a (0,0860 g, 0,171 mmol) em EtOH (10 mL) adicionou-se NaOH 2M até pH = 10-12 e a mistura ficou a agitar à temperatura ambiente durante a noite. Evaporou-se o solvente e ao resíduo obtido adicionou-se H2O e algumas gotas de KHSO4 1M até pH = 1. Precipitou um sólido, que foi filtrado, tendose obtido o composto 10a como um sólido branco (0,074 g, 91%), p.f. 235-237 ºC. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6 ) δ = 2,93-2,99 (2H, m, β-CH2) 3,07-3,12 (2H, m, β-CH2), 4,42-4,48 (1H, m, α-CH), 4,71-4,77 (1H, m, α-CH), 7,14-7,25 (8H, m, ArH), 7,33-7,35 (2H, m, ArH), 7,47 (1H, dd, J = 8,0 e 4,8 Hz, 5-H), 8,13 (1H, s, 3-H), 8,36-8,41 (2H, m, 4-H e NH), 8,62 (1H, dd, J = 4,8 e 1,6 Hz, 6-H), 8,99 (1H, d, J = 8,8 Hz, NH) ppm. 13C RMN (100,6 MHz, DMSOd6 ) δ = 36,6 (β-CH2), 37,0 (β-CH2), 53,8 (α-CH), 54,7 (αCH), 120,6 (5-CH), 123,3 (3-CH), 126,3 (CH), 126,4 (CH), 128,1 (CH), 128,2 (CH), 129,15 (CH), 129,2 (CH), 132,6 (C), 133,5 (4-CH), 137,5 (C), 138,1 (C), 138,9 (C), 148,6 (6-CH), 161,0 (C), 162,0 (C), 171,0 (C), 172,7 (C) ppm. MS ESI valor teórico para [M+H]+ C26H24N3O4S 474,1482. Valor encontrado 474,1485. 53 Ácido N -(tieno[2,3b ]quinolina-2-carbonil)-L-fenilalanina-L-fenilalanina (10b) – A uma solução do composto 8b (0,0680 g, 0,123 mmol) em EtOH (10 mL) adicionou-se NaOH 2M até pH = 10-12 e a mistura ficou a agitar à temperatura ambiente durante a noite. Evaporou-se o solvente e ao resíduo obtido adicionou-se H2O e algumas gotas de KHSO4 1M até pH = 1. Precipitou um sólido, que foi filtrado, tendose obtido o composto 10b como um sólido branco (0,0640 g, rendimento quantitativo), p.f. 206-208 ºC. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6 ) δ = 2,93-3,00 (2H, m, β-CH2), 3,09-3,13 (2H, m, β-CH2), 4,44-4,49 (1H, m, α-CH), 4,75-4,81 (1H, m, α-CH), 7,14-7,37 (8H, m, ArH), 7,36-7,37 (2H, m, ArH), 7,62-7,66 (1H, m, ArH), 7,82-7,86 (1H, m, ArH), 8,07 (1H, d largo, J = 8,8 Hz, ArH), 8,17 (1H, d largo, J = 8,0 Hz, ArH), 8,26 (1H, s, ArH), 8,44 (1H, d, J = 7,2 Hz, NH), 9,04 (1H, s, ArH), 9,10 (1H, J = 8,4 Hz, NH) ppm. 13C RMN (100,6 MHz, DMSOd6 ) δ = 36,6 (β-CH2), 37,0 (β-CH2), 53,7 (α-CH), 54,7 (α-CH), 123,1 (CH), 125,5 (C), 125,8 (CH), 126,3 (CH), 126,4 (CH), 127,8 (CH), 128,0 (CH), 128,1 (CH), 129,0 (CH), 129,1 (CH), 129,2 (CH), 130,5 (CH), 131,7 (C), 133,3 (CH), 137,5 (C), 138,1 (C), 140,0 (C), 146,9 (C), 160,9 (C), 162,0 (C), 171,0 (C), 172,7 (C) ppm. MS ESI valor teórico para [M+H]+ C30H26N3O4S 524,1639. Valor encontrado 524,1644. 54 Ácido N -(benzo[ b ]tiofeno-2-carbonil)-L-fenilalanina-L-fenilalanina (10c) – A uma solução do composto 8c (0,166 g, 0,331 mmol) em EtOH (15 mL) adicionou-se NaOH 2M até pH = 10-12 (2 ml), e a mistura ficou a agitar à temperatura ambiente durante a noite. Evaporou-se o solvente e ao resíduo obtido adicionou-se H2O e algumas gotas de KHSO4 1M até pH = 1. Precipitou um sólido, que foi filtrado, tendo-se obtido o composto 10c como um sólido branco (0,780 g, 50%), p.f. 231-233 ºC. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6 ) δ = 2,93-2,99 (2H, m, β-CH2), 3,06-3,11 (2H, m, β-CH2), 4,44-4,49 (1H, m, α-CH), 4,70-4,76 (1H, m, α-CH), 7,13-7,35 (10H, m, ArH), 7,41-7,44 (2H, m, ArH), 7,93-7,97 (2H, m, ArH), 8,14 (1H, s, 3-H), 8,40 (1H, d, J = 8,0 Hz, NH), 8,85 (1H, d, J = 8,8 Hz, NH) ppm. 13C NMR (100,6 MHz, DMSOd 6) δ = 36,6 (β-CH2), 37,0 (β-CH2), 53,6 (α-CH), 54,6 (α-CH), 122,8 (CH), 124,9 (CH), 125,2 (3-CH), 125,24 (CH), 126,3 (CH), 126,5 (CH), 128,1 (CH), 128,2 (CH), 129,2 (CH), 137,4 (C), 138,2 (C), 139,1 (C), 139,4 (C), 140,2 (C), 161,3 (C), 171,2 (C), 172,7 (C) ppm. MS ESI valor teórico para [M+H]+ C27H25N2O4S 473,1530. Valor encontrado 473,1533. 55 Ácido N -(tieno[2,3b ]piridina-2-carbonil)-L-fenilalanina-L-leucina (11a) – A uma solução do composto 9a (0,185 g, 0,396 mmol) em EtOH (13 mL) adicionou-se NaOH 2M até pH = 10-12 e a mistura ficou a agitar à temperatura ambiente durante a noite. Evaporou-se o solvente e ao resíduo obtido adicionou-se H2O e algumas gotas de KHSO4 1M até pH = 1. Precipitou um sólido, que foi filtrado, tendose obtido o composto 11a como um sólido branco (0,152 g, 87%), p.f. 168-170 ºC. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6 ) δ = 0,85 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3), 0,91 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3), 1,50-1,73 (3H, m, CH e βCH2 Leu), 2,94-3,00 (1H, m, β-CH Phe), 3,12-3,16 (1H, m, β-CH Phe), 4,23-4,29 (1H, m, α-CH Leu), 4,73-4,79 (1H, m, α-CH Phe), 7,13-7,16 (1H, m, ArH), 7,23-7,26 (2H, m, ArH), 7,37-7,39 (2H, m, ArH), 7,47 (1H, dd, J = 8,0 e 4,8 Hz, 5-H), 8,15 (1H, s, 3-H), 8,38 (1H, dd, J = 8,0 e 1,6 Hz, 4-H), 8,42 (1H, d, J = 7,6 Hz, NH Leu), 8,62 (1H, dd, J = 4,8 e 1,6 Hz, 6-H), 9,00 (1H, d, J = 8,4 Hz, NH Phe) ppm. 13C RMN (100,6 MHz, DMSOd6 ) δ = 21,4 (CH3), 22,9 (CH3), 24,3 (CH Leu), 37,1 (β-CH2 Phe), 39,9 (β-CH2 Leu), 50,5 (α-CH Leu), 54,7 (α-CH Phe), 120,5 (5-CH), 123,3 (3-CH), 126,3 (CH), 128,1 (2 × CH), 129,2 (2 × CH), 132,6 (C), 133,4 (4-CH), 138,2 (C), 139,0 (C), 148,5 (6-CH), 161,1 (C), 161,2 (C), 171,2 (C), 173,9 (C) ppm. MS ESI valor teórico para [M+H]+ C23H26N3O4S 440,1639. Valor encontrado 440,1637. 56 Ácido N -(tieno[2,3b ]quinolina-2-carbonil)-L-fenilalanina-L-leucina (11b) – A uma solução do composto 9b (0,233 g, 0,431 mmol) em EtOH (19 mL) adicionou-se NaOH 2M até pH = 10-12 e a mistura ficou a agitar à temperatura ambiente durante a noite. Evaporou-se o solvente e ao resíduo obtido adicionou-se H2O e algumas gotas de KHSO4 1M até pH = 1. Precipitou um sólido, que foi filtrado, tendose obtido o composto 11b como um sólido branco (0,120 g, 57%), p.f. 228-230 ºC. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6 ) δ = 0,85 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3), 0,90 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3), 1,50-1,62 (2H, m, β-CH2 Leu), 1,63-1,74 (1H, m, CH), 2,97-3,03 (1H, m, β-CH Phe), 3,15-3,20 (1H, m, β-CH Phe), 4,23-4,28 (1H, m, α-CH Leu), 4,76-4,81 (1H, m, α-CH Phe), 7,13-7,16 (1H, m, ArH), 7,23-7,27 (2H, m, ArH), 7,39-7,41 (2H, m, ArH), 7,61-7,65 (1H, m, ArH), 7,81-7,85 (1H, m, ArH), 8,05 (1H, d largo, J = 8,0 Hz, ArH), 8,15 (1H, d largo, J = 8,4 Hz, ArH), 8,29 (1H, s, ArH), 8,41 (1H, d, J = 8,0 Hz, NH Leu), 9,01 (1H, s, ArH), 9,18 (1H, d, J = 8,8 Hz, NH Phe) ppm. 13C RMN (100,6 MHz, DMSOd6 ) δ = 21,5 (CH3), 23,0 (CH3), 24,4 (CH Leu), 37,2 (β-CH2 Phe), 40,3 (β-CH2 Leu), 50,9 (α-CH Leu), 54,9 (α-CH Phe), 123,2 (CH), 125,5 (C), 125,8 (CH), 126,3 (CH), 127,8 (CH), 128,1 (2 × CH), 128,9 (CH), 129,2 (2 × CH), 130,5 (CH), 131,8 (C), 133,2 (CH), 138,2 (C), 140,1 (C), 146,9 (C), 161,1 (C), 162,0 (C), 171,0 (C), 174,1 (C) ppm. MS ESI valor teórico para [M+H]+ C27H28N3O4S 490,1795. Valor encontrado 490,1796. 57 Ácido N -(benzo[ b ]tiofeno-2-carbonil)-L-fenilalanina-L-leucina (11c) – A uma solução do composto 9c (0,0760 g, 0,163 mmol) em EtOH (10 mL) adicionou-se NaOH 2M até pH = 10-12 e a mistura ficou a agitar à temperatura ambiente durante a noite. Evaporou-se o solvente e ao resíduo obtido adicionou-se H2O e algumas gotas de KHSO4 1M até pH = 1. Precipitou um sólido, que foi filtrado, tendose obtido o composto 11c como um sólido branco (0,046 g, 65%), p.f. 221-223 ºC. 1H RMN (400 MHz, DMSOd6 ) δ = 0,85 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3), 0,90 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3), 1,50-1,72 (3H, m, CH e βCH2 Leu), 2,94-3,00 (1H, m, β-CH Phe), 3,12-3,16 (1H, m, β-CH Phe), 4,23-4,28 (1H, m, α-CH Leu), 4,71-4,77 (1H, m, α-CH Phe), 7,12-7,16 (1H, m, ArH), 7,22-7,26 (2H, m, ArH), 7,37-7,44 (4H, m, ArH), 7,92-7,99 (2H, m, ArH), 8,17 (1H, s, 3-H), 8,38 (1H, d, J = 7,6 Hz , NH Leu), 8,89 (1H, d, J = 8,8 Hz, NH Phe) ppm. 13C RMN (100,6 MHz, DMSOd6 ) δ = 21,4 (CH3), 22,9 (CH3), 24,3 (CH Leu), 37,1 (β-CH2 Phe), 39,8 (β-CH2 Leu), 50,5 (α-CH Leu), 54,7 (α-CH Phe), 122,8 (CH), 124,9 (CH), 125,17 (3-CH), 125,2 (CH), 126,2 (CH), 126,3 (CH), 128,1 (2 × CH), 129,2 (2 × CH), 138,3 (C), 139,1 (C), 139,5 (C), 140,2 (C), 161,4 (C), 171,3 (C), 174,0 (C) ppm. MS ESI valor teórico para [M+H]+ C24H27N2O4S 439,1686. Valor encontrado 439,1689. 58 Capítulo 5 Referências 59 5. Referências 1. Abell AD. Heterocyclic-based peptidomimetics. Lett. Pept. Sci . 2001, 8: 267-72. https://doi.org/10.1007/BF02446527 2. Vagner J., Qu H., Hruby VJ. Peptidomimetics, a synthetic tool of drug discovery. Curr. Opin. Chem. Biol . 2008, 12(3): 292-26. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2008.03.009 3. Angell YL., Burgess K. Peptidomimetics via copper-catalyzed azide–alkyne cycloadditions. Chem. Soc. Rev . 2007, 36(10): 1674-89. https://doi.org/10.1039/B701444A 4. May BCH., Abell AD. α-Methylene tetrazole-based peptidomimetics: Synthesis and inhibition of HIV protease. J. Chem. Soc. Perkin 1 . 2002, 2(2): 172-8. https://doi.org/10.1039/B109128J 5. Bissyris EE., Belekos D., Magafa V., Tsoungas PG., Varvounis G., Cordopatis P. 2-Amino-4pyrrolidinothieno[2,3d ]pyrimidine-6-carboxylic acid as an N-terminal surrogate in amino acid and peptide analogues. Synthesis (Stuttg) . 2005, 18: 3159-66. https://doi.org/10.1055/s-2005-918426 6. 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