Moléculas HLA de clase I y receptores NK en la enfermedad de Behçet

MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET Ángel Luis Castaño Núñez Tesis doctoral Sevilla, 2023 Memoria presentada por Ángel Luis Castaño Núñez para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. El presente trabajo ha sido realizado en el Hospital Universitario Virgen del Rocío y el Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) bajo la supervisión de la Doctora Mª Francisca González Escribano y el Doctor Marco Antonio Montes Cano. El proyecto de investigación ha recibido financiación del Proyecto de Excelencia P07-CTS-02886 y del Fondo de Investigaciones Sanitarias (10/02332). D. JUAN MIGUEL GUERRERO MONTÁVEZ, DOCTOR EN BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR, CATEDRÁTICO DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Y JEFE DEL SERVICIO DE ANÁLISIS CLÍNICOS EN EL HOSPITAL VIRGEN DEL ROCÍO DE SEVILLA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación que lleva por título: “Moléculas HLA de clase I y receptores NK en la enfermedad de Behçet” ha sido realizado bajo su dirección por el licenciado D. Ángel Luis Castaño Núñez, y reúne las condiciones necesarias para ser leído y defendido como tesis para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Para que conste a los efectos oportunos, expide la presente certificación en Sevilla, a 19 de julio de 2023. Fdo.: Dr. Juan Miguel Guerrero Montávez TUTOR DE TESIS D.ª Mª FRANCISCA GONZÁLEZ ESCRIBANO, DOCTORA EN BIOLOGÍA Y JEFA DEL SERVICIO DE INMUNOLOGÍA EN EL HOSPITAL VIRGEN DEL ROCÍO DE SEVILLA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación que lleva por título: “Moléculas HLA de clase I y receptores NK en la enfermedad de Behçet” ha sido realizado bajo su dirección por el licenciado D. Ángel Luis Castaño Núñez, y reúne las condiciones necesarias para ser leído y defendido como tesis para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Para que conste a los efectos oportunos, expide la presente certificación en Sevilla, a 19 de julio de 2023. Fdo.: Dra. Mª Francisca González Escribano DIRECTORA DE TESIS D. f\1.ARCO ANTONIO MONTES CANO, DOCTOR EN BIOLOGÍA Y FACULTATIVO ESPECIALISTA DE ÁREA EN INMUNOLOGÍA EN EL HOSPITAL VIRGEN DEL ROCÍO DE SEVILLA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación que lleva por título: "Moléculas HLA de clase I y receptores NK en la enfermedad de Beh�et" ha sido realizado bajo su dirección por el licenciado D. ÁAgel Luis Castaño Núñez, y reúne las condiciones necesarias para ser leído y defendido como tesis para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Para que conste a los efectos oportunos, expide la presente certificación en Sevilla, a 4 de mayo de 2023. Fdo.: O. Marco Antonio Montes Cano :,;. . DIRECTOR DE TESIS XIII INDICE INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………..………1 1. Características generales de la enfermedad………………………….……………..………..2 2. Etiopatogenia……………………….………………………………………………………….……..……...6 3. Las moléculas HLA y la enfermedad de Behçet…………..………….…….…..…..….….13 4. Las células natural killer…………………………………………………………………..……..…….18 5. Los receptores KIR………………………………………….……………..…………………….…..….21 6. Las moléculas HLA de clase I como ligandos de KIR………….………………….…….….27 6.1 La interacción KIR-ligando en la educación de las células natural killer……….…29 6.2 Las moléculas HLA asociadas a la enfermedad de Behçet como ligandos KIR…………………………………………………………………………………….………………………....30 6.3 El complejo HLA-E-NKG2/CD94…………….………………………..………..….………….….…31 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS………………………………………………………………...…….…35 METODOLOGÍA……………………………………………………………………………………….39 RESULTADOS…………………………….…………………………………………………………….49 • Objetivo 1. Analizar la asociación de las moléculas HLA-I como ligandos de los receptores KIR y como moduladores de la función de HLA-E ……………………….51 • Objetivo 2. Estudiar el papel de la dotación de genes KIR en la enfermedad de Behçet…………………………………………………………………………………………….…………….61 • Objetivo 3. Analizar la implicación de polimorfismos funcionales conocidos en los genes KIR3DL1/S1 y KIRDS4 con la enfermedad……………………………….………64 • Objetivo 4. Examinar la asociación del polimorfismo de HLA-E en la predisposición a padecer la enfermedad……………………………………………………...69 XIV DISCUSIÓN…………………………….……………………………………………………………….73 CONCLUSIONES………………….…………………………………………….…………………..…93 PERSPECTIVAS…………………….……………………………………………………….…………97 BIBLIOGRAFÍA………….………………………………………………………………….…..……..99 PUBLICACIONES………………………………………………………………………………..….115 • Trabajo 1 • Trabajo 2 ANEXOS………………………………………………………………………………………….…….136 I. Resultados suplementarios I……….……….……….…………………………………137 II. Resultados suplementarios II………….…….……………….……………………..…144 III. Otras publicaciones del doctorando ……………………………….….………...…147 IV. Comunicaciones a Congresos como primer firmante.........……….………..148 V. Informes del Comité de Ética…………………………………………………….………...150 XV INDICE DE FIGURAS Y TABLAS FIGURAS • Figura 1. Distribución geográfica de la enfermedad de Behçet • Figura 2. Posibles alteraciones del sistema inmunitario en BD • Figura 3. El Eje autoinflamación/autoinmunidad en las enfermedades con base inmunológica • Figura 4. Estructura de las moléculas HLA de clase I (a) y clase II (b) • Figura 5. Organización de los genes del Complejo Principal de Histocompatibilidad Humano • Figura 6. Número de alelos de los genes HLA de Clase I (clásicas y no clásicas) y Clase II • Figura 7. Receptores en la célula NK • Figura 8. Estructura de los receptores KIR • Figura 9. Esquema de la organización de genes y haplotipos KIR comunes en población caucásica • Figura 10. Distribución de los haplotipos KIR en distintas poblaciones • Figura 11. Distribución de los epítopos de HLA-I ligandos de KIR en distintas poblaciones • Figura 12. Receptores KIR y sus ligandos HLA • Figura 13. Representación esquemática de la interacción entre las moléculas HLA- E y sus receptores NKG2 • Figura 14. Diseño experimental XVI TABLAS • Tabla 1. Principales manifestaciones clínicas de la enfermedad de Behçet • Tabla 2. Criterios de los dos sistemas de clasificación más utilizados para la enfermedad de Behçet • Tabla 3. Rasgos autoinmunes y autoinflamatorios de la enfermedad de BD • Tabla 4. Grado de polimorfismo alélico de los genes KIR • Tabla 5. Características clínicas de la cohorte de pacientes • Tabla 6. Clasificación de las moléculas HLA-I en los diferentes grupos de ligandos KIR • Tabla 7. Clasificación de moléculas HLA-I según el tipo de nonapéptidos presentados por HLA-E • Tabla 8. Clasificación de las muestras según el resultado del análisis conjunto de dotación KIR3DL1/DS1 y genotipado del rs149123986 • Tabla 9. Listado de hospitales y número de pacientes reclutados • Tabla 10. Distribución de moléculas HLA ligandos de KIR en casos y controles • Tabla 11. Distribución de moléculas HLA ligandos de KIR en casos y controles en individuos B51 negativos • Tabla 12. Distribución de las moléculas HLA según la secuencia de los aminoácidos 3-11 del péptido líder • Tabla 13. Análisis de regresión logística no condicionada incluyendo todas las secuencias 3-11 del péptido líder de las moléculas HLA de clase I clásicas encontradas en nuestra población • Tabla 14. Análisis de regresión logística condicionando cada una de las secuencias 3-11 del péptido líder de las moléculas HLA de clase I clásicas con frecuencia >5% encontradas en nuestra población con HLA-B51 XVII • Tabla 15. Distribución de las secuencias 3-11 del péptido líder de las moléculas HLA de clase I clásicas con frecuencia >5% encontradas en nuestra población en los grupos B51 positivo y negativo • Tabla 16. Distribución de los genotipos de las diferentes formas de las secuencias 3-11 del péptido líder de las moléculas HLA-A en la cohorte total y en los individuos B51 negativos y positivos • Tabla 17. Análisis de regresión logística de los grupos B51 negativo y positivo incluyendo en el modelo A3 y P1 • Tabla 18. Análisis de regresión logística en los grupos B51 positivo y negativo de P2 con tres modelos, incluyendo los grupos alélicos A2, A24 y A26 • Tabla 19. Distribución de los genotipos Met/Thr de los nonapéptidos derivados de HLA-B en pacientes con BD y controles • Tabla 20. Distribución de genes KIR en casos y controles • Tabla 21. Distribución haplotipos KIR en casos y controles • Tabla 22. Distribución genotipos KIR en casos y controles • Tabla 23. Distribución KIR3DL1/S1 en casos y controles • Tabla 24. Distribución del polimorfismo rs149123986 del gen KIR3DL1/S1 en casos y controles • Tabla 25. Distribución de las muestras de pacientes y controles clasificadas según los resultados en la presencia o ausencia de KIR3DL1 y 3DS1 y el polimorfismo rs149123986 • Tabla 26. Frecuencias alélicas del polimorfismo funcional de 3DL1/S1 en pacientes y controles • Tabla 27. Distribución del polimorfismo funcional de KIR3DL1/S1 en pacientes y controles B51 positivos y negativos XVIII • Tabla 28. Distribución de la deleción de 22 pb del gen 2DS4 en pacientes y controles • Tabla 29. Distribución de las variantes full/del del gen 2DS4 en el grupo de muestras que presentaban sus ligandos • Tabla 30. Distribución de las variantes full/del del gen 2DS4 en el grupo un único aKIR • Tabla 31. Distribución de alelos y genotipos de HLA-E en nuestra cohorte de pacientes y controles • Tabla 32. Distribución de alelos y genotipos de HLA-E en los grupos B51 positivo y negativo • Tabla 33. Distribución de genotipos de HLA-E en las muestras estratificadas según la secuencia 3-11 en el péptido señal • Tabla 34. Relación de publicaciones de estudios casos/control de genes KIR en BD • Tabla 35. Distribución (%) de 3DL1 y 3DS1 en pacientes y controles en estudios de BD • Tabla 36. Haplotipo KIR Tel-A1-V XIX ABREVIATURAS aKIR: receptor KIR activador BD: Behçet`s disease (enfermedad de Behçet) CCL2: monocyte chemoattractant protein-1 CD: clúster de diferenciación CpG-ODN: oligodeoxinucleótidos con motivos citosina-fosfato-guanina no metilados CMV: Citomegalovirus DAMP: Damage-associated molecular patterns (patrones moleculares asociados a daños) EBV: Epstein-Barr virus ERAP1: Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 1 (aminopeptidasa 1 del retículo endoplasmático) FIS: Fondo de Investigaciones Sanitarias GM-CSF: Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor G-CSF: Granulocyte colony-stimulating factor GWAS: Genome-wide association studies (Estudios de asociación completo del genoma) HBV: Hepatitis B virus HCV: Hepatitis C virus HIV: Human immunodeficiency virus HLA: Human leukocyte antigen (Antígenos leucocitarios humanos) HSP: Heat shock protein (proteína de choque térmico) HSV: Herpes simplex virus (virus del herpes simple) IFNγ: Interferón gamma iKIR: Receptor KIR inhibidor IL: Interleuquina XX ITIM: Tyrosine-based Inhibitory Motifs KIR: Killer-cell immunoglobulin-like receptors (Receptores tipo inmunoglobulina de las células NK) LRC: Leukocyte Receptor Complex LD: Linkage disequilibrium (Desequilibrio de ligamiento) MHC: Major Histocompatibility Complex (Complejo principal de histocompatibidad) MICA: Major histocompatibility complex class I-related Chain A NCR: Natural citotoxity receptor (receptores citotóxicos naturales) NK: natural killer cell (célula asesina natural) NKG2: Familia de receptores lectina tipo-C NKT: linfocitos natural killer T OR: Odd ratio PAMP: Pathogen-associated molecular patterns (patrones moleculares asociados a patógenos) PRR: Pattern Recognition Receptor (Receptores de reconocimiento de patrones) RE: Retículo endoplasmático SNP: Single Nucleotide Polymorphism (polimorfismo de un solo nucleótido) SRIR: self-recognition inhibitory receptor (receptor inhibidor de reconocimiento de lo propio) SSOP: Sequence specific oligonucleotide probe (Sonda oligonucleotídica específica de secuencia) Tc: Linfocitos T citotóxicos Th: Linfocitos T helper Tregs: linfocitos T reguladores TGFβ: transforming growth factor beta XXI TLR: Toll like receptors TNFα: Tumor necrosis factor alpha (factor de necrosis tumoral alfa) INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 8 modificador de la severidad de la enfermedad. Además de la distribución geográfica, otras características sugieren una base genética de la enfermedad. Así, el riesgo de enfermedad es más elevado en pacientes con historia familiar, puesto que la prevalencia en casos familiares es del 1-18%, aumentando en poblaciones donde la prevalencia es mayor, como los turcos (18.2%), coreanos (15.4%) y judíos (13.2%) (Kaya, 2012). Además, aunque el número de casos es muy limitado, la concordancia entre gemelos monocigotos es mayor que entre los dicigotos (Masatlioglu et al., 2010). Por último, como veremos más adelante, se ha descrito asociación con determinadas regiones génicas, fundamentalmente con un gen HLA de clase I, HLA-B, y con un grupo alélico concreto HLA-B*51 (Ohno et al., 1973). Además, la frecuencia de las diferentes manifestaciones de la enfermedad presenta también distinta distribución geográfica (Yurdakul y Yazici, 2008). Los resultados de todos estos estudios sugieren que se trata de una enfermedad compleja, que se desencadenaría cuando determinados factores medioambientales confluyen en individuos genéticamente predispuestos. Entre los factores medioambientales que podrían resultar desencadenantes de la enfermedad, se encuentran agentes infecciosos, tanto víricos (herpes virus tipo 1, virus de la hepatitis C y parvovirus B19) como bacterianos (micobacterias, Borrelia burgdorferi y Helicobacter pylori) (Marshall, 2004). Entre las hipótesis propuestas, se encuentra la del mimetismo molecular: antígenos derivados de algunos virus, como el HSV, o de bacterias pertenecientes a las especies del género Streptococcus, como S. sanguinis, presentan una elevada homología con determinadas proteínas humanas como la heat shock protein (HSP), y podrían desencadenar la respuesta inmunitaria mediante un mecanismo de mimetismo molecular (Lule et al., 2017). Sin embargo, hasta la fecha, no hay trabajos que sostengan el papel de ningún microorganismo como agente etiológico específico. Por otro lado, debido a que la sintomatología de la enfermedad comienza generalmente en la mucosa oral, se piensa que esta zona puede estar implicada en su patogénesis (Mumcu et al., 2004). Estudios recientes de secuenciación masiva del rRNA MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 9 16S han demostrado que las diferencias en la composición del microbioma salivar o intestinal (Consolandi et al., 2015) pueden jugar un papel en la patogénesis de la enfermedad, ya que los pacientes con BD presentan menor diversidad microbiana (disbiosis) que los controles sanos (Coit et al., 2016). En resumen, aunque no se ha encontrado un agente etiológico específico, se acepta de forma generalizada que, los agentes infecciosos, o la composición del microbioma oral y/o intestinal, pueden actuar como disparadores de la enfermedad. La enfermedad tiene una base inmunológica que se sustenta en las alteraciones descritas por numerosos estudios, tanto en los elementos celulares como humorales del sistema inmunitario innato y adquirido. En cuanto al brazo adquirido, diversos estudios han descrito la presencia de autoanticuerpos frente a determinados antígenos como la α-tropomiosina, α-enolasa, kinetina, antígeno S retiniano, y contra la proteína transportadora de selenio en el suero de pacientes con BD, si bien, ninguno de ellos es específico de la enfermedad (Kalayciyan y Zouboulis, 2007; Al-Mutawa y Hegab, 2004; Mor et al., 2002; Kapsimali et al., 2010). También se ha propuesto la participación de linfocitos T citotóxicos (Tc), basándose en la asociación de la enfermedad con moléculas HLA de clase I. Esta participación ha sido exhaustivamente investigada sin que se hayan encontrado resultados destacables (Giza et al., 2018), al igual que ocurre con los linfocitos T helper (Th) y los linfocitos B. En cambio, se han publicado resultados que sugieren participación de elementos celulares relacionados con el sistema inmunitario innato. Por ejemplo, se ha descrito un aumento de linfocitos T γ/δ en sangre periférica, en lesiones mucosas y cutáneas activas (Freysdottir et al., 2006), así como la presencia predominante en infiltrados intraoculares de linfocitos natural killer T (NKT) con fenotipo citotóxico a través de vías FasL y perforina (Ahn et al., 2005). En el humor acuoso de pacientes con estos infiltrados, se ha encontrado correlación entre el aumento de los niveles de IL15 y el predominio de linfocitos NKT. Esta citocina, está implicada en el desarrollo y supervivencia de las células citotóxicas como son las células natural killer (NK), NKT y Tc, y contribuye a la homeostasis y activación de células T γ/δ (Curnow et al., 2008). También se ha descrito una hiperactivación de INTRODUCCIÓN 10 neutrófilos (Eksioglu-Demiralp et al., 2001) relacionados generalmente con infiltración perivascular, como ha revelado el análisis histopatológico de las lesiones (Alpsoy, 2016). Los neutrófilos hiperactivados secretan citocinas con función autocrina, y otras estimuladoras de respuesta Th1 (Salmaninejad et al., 2017). En este sentido, se ha encontrado un aumento de IL12 e IFNγ en sangre periférica de pacientes con BD (Houman et al., 2004) que, además, es conjunta con el aumento de IL8 y TNFα en lesiones epidérmicas, orales, genitales, intestinales y oculares en pacientes con BD activa (Ben Ahmed et al., 2004; Imamura et al., 2005), mientras que los linfocitos Th2 y los niveles de citocinas IL4, IL10 y IL13 son generalmente bajos. Las células NK, identificadas en lesiones de pacientes con BD, parecen jugar un papel de control sobre la respuesta predominante Th1 (Yamaguchi et al., 2010). También se han encontrado características diferentes en pacientes activos y en remisión. Por ejemplo, se ha descrito un aumento de IL21 en el suero de pacientes con BD activa respecto de pacientes en remisión o controles sanos, así como una disminución de la frecuencia de linfocitos T reguladores (Tregs) (Geri, 2011). IL21 es producida por distintos subtipos de linfocitos T, incluido Th17, actuando de forma autocrina junto con IL17, favoreciendo la proliferación y diferenciación de esta subpoblación (Korn et al., 2007). Por tanto, IL21 podría contribuir a desplazar el equilibrio entre las subpoblaciones Th17/Th1 y Th17/Tregs hacia la actividad inflamatoria (Pineton de Chambrun et al., 2012). En esta línea, se ha descrito un aumento del cociente Th17/Th1 en la sangre periférica de pacientes en fase activa, siendo este hecho más acusado entre los pacientes con foliculitis o uveítis (Kim et al., 2010). La figura 2 muestra un resumen de las alteraciones en el sistema inmunitario descritas en esta enfermedad. MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 11 Figura 2. Posibles alteraciones del sistema inmunitario en BD Diversos factores desencadenarían la enfermedad en individuos genéticamente susceptibles provocando un desequilibrio proinflamatorio, en las ramas innata y adaptativa del sistema inmunitario. Tomado de New insights into the pathogenesis of Behçet’s disease (p.6), por Chambrun et al., 2012, Autoimmun Rev, 11(10):687-98 Por tanto, la BD es una enfermedad de base inmunológica y etiología desconocida que se ha considerado una enfermedad autoinmune por su relación con el sistema inmunitario adaptativo. Sin embargo, como hemos visto anteriormente, parece existir una considerable contribución del sistema inmunitario innato en el desarrollo de la enfermedad. La tabla 3 refleja algunas de las características relacionadas con la autoinmunidad y/o autoinflamación que se encuentran en estos pacientes. INTRODUCCIÓN 12 Tabla 3. Rasgos autoinmunes y autoinflamatorios de la enfermedad de BD Características de BD que son compartidas con otras patologías autoinmunes y autoinflamatorias. Tomado de Is Behçet’s disease a ‘class 1-opathy’? The role of HLA-B*51 in the pathogenesis of Behçet’s disease (p.2), por Giza et al., 2017, Clin Exp Immunol. 2018; 191: 11-18 Actualmente, se considera que las enfermedades inmunomediadas se pueden clasificar en un eje continuo entre las autoinmunes y autoinflamatorias. De esta forma, en los extremos del eje se situarían las enfermedades monogénicas autoinmunes y autoinflamatorias, y en el centro se encontrarían las enfermedades denominadas de patrón mixto, en las que la participación de los componentes de la inmunidad innata y adaptativa es semejante (Figura 3). A ambos lados de las enfermedades de patrón mixto se situarían las enfermedades poligénicas complejas, tanto autoinmunes (como la artritis reumatoide o el lupus eritematoso sistémico) como autoinflamatorias (como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa) (McGonagle y McDermott, 2006). La BD se encontraría entre las enfermedades de patrón mixto, junto con la espondilitis anquilosante y la psoriasis, con las que comparte características como la asociación con variantes alélicas de genes de vías inflamatorias IL-10 e IL-23/IL-17, y otros relacionados con el procesamiento y la presentación antigénica como ERAP1 y HLA de clase I. MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 13 Figura 3. El Eje autoinflamación/autoinmunidad en las enfermedades con base inmunológica Dependiendo del grado de participación del sistema inmune innato (autoinflamación) y adaptativo (autoinmunidad), las enfermedades inmunomediadas se clasifican en cinco grupos. BD se encontraría dentro del grupo de enfermedades de patrón mixto. Adaptada de A proposed classification of the immunological diseases (p.4), de McGonagle y McDermott, 2006, PLoS Med; 3(8):e297 3. LAS MOLÉCULAS HLA Y LA ENFERMEDAD DE BEHÇET Los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano (HLA) se encuentran en una región localizada en el brazo corto del cromosoma 6, extendiéndose sobre unas 3,5 MB. Estos genes se dividen en genes de clase I y II según la estructura, función y distribución celular de las moléculas que codifican. Respecto a su estructura, las moléculas HLA de clase I (HLA-I) constan de una cadena pesada polimórfica, α, que se asocia a una cadena invariante, la β2 microglobulina; mientras que las de clase II (HLA-II) tienen dos cadenas pesadas, denominadas α y β (Figura 4). INTRODUCCIÓN 14 Figura 4. Estructura de las moléculas HLA de clase I (a) y clase II (b) La cadena pesada α en la molécula HLA-I tiene tres dominios extracelulares (α1, α2 y α3) y se asocia a la cadena invariante β2 microglobulina. En cambio, la molécula HLA-II tiene dos cadenas pesadas, α y β, con dos dominios extracelulares cada una. La zona de unión al péptido, altamente polimórfica, está constituida por dominios α1 y α2 en HLA-I, y α 1 y β1 en HLA-II. Adaptado de Cellular and Molecular Immunology (p.129), por A. K. Abbas, 2018, Elsevier 9ª Ed En cuanto a su distribución celular, los genes HLA de clase I se expresan de forma constitutiva en la mayoría de las células, aunque su nivel de expresión varía dependiendo del tejido. En cambio, los genes de clase II, se expresan de manera constitutiva sólo en un subgrupo de células inmunitarias, las células presentadoras de antígenos, fundamentalmente células B, macrófagos, células dendríticas y células epiteliales tímicas. En cuanto a su función, ambas moléculas se encargan de la presentación de péptidos a las células T α/β: las moléculas HLA-I presentan péptidos a linfocitos Tc, y las moléculas HLA-II presentan péptidos a linfocitos Th. Este tipo de moléculas HLA se denominan clásicas, y son de varios tipos: A, B y C para la clase I, y DR, DQ y DP para la clase II. Algunas de las moléculas HLA-I clásicas también controlan la actividad NK a través de su unión a determinados receptores de estas células. Además, existen moléculas HLA-I denominadas no clásicas, entre ellas HLA-E, F, G y MIC-A y B, las cuales presentan una estructura y función semejante a las clásicas, ya a b MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 15 que participan en el control de la actividad NK y presentan péptidos a los linfocitos γ/δ. En conjunto, la región HLA comprende hasta 200 genes, gran parte de ellos relacionados con el sistema inmunitario (Figura 5), entre los cuales se encuentran genes que codifican componentes de la cascada del complemento o mediadores de inflamación, de manera que esta región alberga el mayor número de asociaciones descritas para una amplia variedad de patologías inmunológicas (de Bakker y Raychaudhuri, 2012). Figura 5. Organización de los Genes del Complejo Principal de Histocompatibilidad Humano En la figura se representan algunos genes del sistema HLA. En diferentes tonos de azul aparecen los de clase I; en púrpura y rosa los de clase II. La región MHC es una de las regiones más densas del genoma humano, con un 40% de genes relacionados con el sistema inmunitario. Muchos de estos genes se encuentran muy cerca unos de otros, lo que determina un elevado grado de desequilibrio de ligamiento, por lo que se heredan juntos en una frecuencia muy superior a la que se esperaría por azar. Adaptado de Genetic and functional relationships between MHC and NK receptor genes (p.3), de Trowsdale et al., 2001, Immunity, 15(3):363-74 Una de las características más destacables del sistema HLA es su extraordinaria INTRODUCCIÓN 16 variabilidad sustentada en su poligenismo y, sobre todo, en su elevado grado de polimorfismo. El poligenismo implica que existen varios genes que codifican moléculas con la misma función, ya que, como se ha dicho anteriormente, hay diferentes moléculas HLA clásicas, tanto HLA-I (A, B y C) como HLA-II (DR, DQ y DP). Además, el grado de polimorfismo de los genes determina la existencia de gran cantidad de formas alélicas distintas cuyas frecuencias dependen de la población. La evolución de las técnicas de tipaje, desde técnicas serológicas, menos precisas y capaces de detectar un grado de polimorfismo bastante limitado, a técnicas de genotipado mediante biología molecular más precisas, han permitido poner de manifiesto todo este grado de polimorfismo. La diversidad alélica en la población general es enorme (Figura 6) y supone la selección de un sistema ventajoso tanto para el individuo como para la especie, ya que, potencialmente, permite presentar cualquier péptido al sistema Inmunitario (Traherne, 2008). La expresión de moléculas HLA es codominante, por lo que se expresan tanto los genes de herencia materna como paterna, y el elevado poligenismo determina que los alelos heredados de cada rama familiar sean diferentes. Figura 6. Número de alelos de los genes HLA de Clase I (clásicas y no clásicas) y Clase II 7452 8849 7393 310 50 102 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 A B C E F G Número de alelos Locus HLA Clase I MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 17 En la figura se muestra el número de alelos descritos en cada gen en diferentes poblaciones humanas en marzo de 2022. Fuente: The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases, por Robinson et al., Nucleic Acids Research, 2015; 43:D423-431. (HLA Nomenclature @ hla.alleles.org) La relación de BD con la región HLA es ampliamente conocida. Desde que Ohno describiera la asociación de HLA-B51 con la enfermedad, se han realizado multitud de estudios en diferentes poblaciones confirmándose en casi todos ellos esta asociación, aunque con distintos OR. Así, la presencia del grupo alélico HLA-B*51 confiere un OR medio de aproximadamente 5.78, aunque depende de la localización geográfica (de Menthon et al., 2009). Sin embargo, a pesar de que la asociación ha sido claramente demostrada, los mecanismos causantes de dicha asociación siguen siendo desconocidos. Esta aparente falta de progreso se debe a características de la propia región HLA, como su elevada densidad génica, anteriormente comentada, que complica, en muchos casos, demostrar la variante causal por las dificultades derivadas del elevado desequilibrio de ligamiento (LD). En este sentido, señalar que diferentes trabajos, tanto de nuestro grupo como de otros, utilizando plataformas de alto rendimiento con hipótesis a priori (Immunochip) y libres de hipótesis (GWAs) que permiten realizar análisis de la región completa, concuerdan en descartar que las moléculas HLA-II estén involucradas en la predisposición a esta patología (Ombrello et al., 2014; Hughes et al., 2013, Ortiz-Fernández et al., 2016) y sustentan asociación del 32 4018 442 40 2230 406 5 1958 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 DRA DRB DQA1 DQA2 DQB1 DPA1 DPA2 DPB1 Número de alelos Locus HLA Clase II INTRODUCCIÓN 24 Figura 9. Esquema de la organización de genes y haplotipos KIR comunes en población caucásica La figura muestra el intervalo centromérico, flanqueado por los genes 3DL3 y 3DP1, y el intervalo telomérico, flanqueado por 2DL4 y 3DL2, con los diferentes genes KIR (cajas de color). Las combinaciones numeradas representan distintos genotipos, siendo el único haplotipo AA el número 1. Tomado de Encyclopedia of Immunobiology, Volume 1 (p.369-380), por Rajalingam, 2016 La dotación de genes KIR es variable entre individuos y cada combinación individual de genes se denomina genotipo KIR. Para nombrar estos genotipos se ha ideado una nomenclatura propia que emplea un número que indica su orden de descubrimiento (Marsh et al., 2003). Hasta la fecha, se han descrito 660 genotipos distintos en 24.950 individuos de 191 poblaciones diferentes, si bien, muchos de estos genotipos sólo se han descrito en una población, e incluso en un solo individuo. Los 13 genotipos más frecuentes suponen el 90% del total (The Allele Frequency Net Database [KIR Genotype Reference] (allelefrequencies.net). Tradicionalmente, basándose en estudios de polimorfismos con fragmentos de restricción, los haplotipos KIR se dividen en las categorías A y B, basadas en la presencia de una banda de 24 Kb, que posteriormente se comprobó que correspondía al gen 2DL5 (Vilches y Parham, 2002). Más adelante, se confirmó que el haplotipo A correspondía con una combinación prácticamente única de 7 genes y pseudogenes que incluyen 2DL3 y 2DL1 en el intervalo centromérico y 3DL1 y 2DS4 en el telomérico. El haplotipo B es más diverso en cuanto a combinación de genes, e incluye aquellas combinaciones que tuvieran al menos uno de estos genes: 2DL2, 2DL5, 2DS1, 2DS2, 2DS3, 2DS5 y 3DS1 (Martin et al., 2000). Además, el haplotipo A incluye varios genes que codifican KIR inhibidores, pero un sólo activador, 2DS4; MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 25 mientras que el haplotipo B incluye varios genes que codifican KIR activadores, puede tener pocos inhibidores o incluir genes que codifican KIR que no se unen o se unen débilmente con HLA-I (Uhrberg et al., 2002). La distribución de los haplotipos A y B es distinta en las diferentes poblaciones humanas (Figura 10). Figura 10. Distribución de los haplotipos KIR en distintas poblaciones Como se puede observar en la figura, los haplotipos A y B tienen frecuencias similares en población caucásica y africana, en las que la frecuencia del haplotipo A es ligeramente superior a la de haplotipos B. En la nativa americana la frecuencia de haplotipos B supera ligeramente a la del A. Sin embargo, en población asiática, las diferencias en las frecuencias son más notables. Así, en la china, japonesa y coreana, el predominio del haplotipo A es muy acusado (76%), mientras que en la hindú predominan los haplotipos B (68%). Tomado de Encyclopedia of Immunobiology, Volume 1 (p.369-380), por Rajalingam, 2016 Además del grado de diferenciación que suponen las diferencias en las dotaciones de genes KIR, cada uno de los genes presenta polimorfismo alélico (Tabla 4), que puede modificar la expresión de la molécula en membrana y alterar la especificidad y avidez del receptor (Yawata et al., 2006), así como la transducción de señal y función de secreción de citocinas. Muchas de estas variaciones funcionales están localizadas fuera de la zona de contacto con HLA-I, y, por tanto, son independientes de esta interacción. En este sentido, hay que destacar la presencia de polimorfismos alélicos en el gen 3DL1 asociados a variaciones en la expresión del receptor en la superficie celular (Boudreau et al., 2014). Especialmente interesante es el grupo alélico 3DL1*004, que presenta un polimorfismo de cambio de nucleótido en el exón 3 (A/G, rs149123986) que origina un plegamiento ineficiente de la proteína que causa que la mayoría sea retenida en el INTRODUCCIÓN 26 retículo endoplásmico, donde se une a calreticulina (Pando et al., 2003). El alelo 3DL1*004, bastante frecuente (Vierra-Green et al., 2012), constituye un caso extremo de bajo nivel de expresión en la superficie celular (Pando et al., 2003), mientras que el resto de los alelos expresados codifican una molécula que se exporta de manera eficiente a la superficie. Así mismo, pueden existir deleciones, algunas bastante frecuentes, como la descrita en 2DS4 (Crum et al., 2000). En este gen se ha descrito la existencia de una serie de grupos alélicos, concretamente *003/004/006/007/008/009/010/012/013, que contienen una deleción de 22pb en el exón 5. Esta deleción provoca la generación de un codón de parada al comienzo del exón 7, que codifica el dominio transmembrana, por lo que se origina una forma soluble (Maxwell et al., 2002). La frecuencia de estas variantes solubles varía desde el 39.6% en coreanos (Whang et al., 2005), al 89% en italianos (Bontadini et al., 2006). Esta elevada prevalencia podría ser importante sobre todo en caso de individuos AA, puesto que 2DS4 es el único gen activador en haplotipos A, con lo que la presencia de variantes que codifican proteínas solubles podría traducirse en la ausencia de aKIR en membrana. Tabla 4. Grado de polimorfismo alélico de los genes KIR En la tabla se muestra el número de alelos y proteínas descrito hasta la fecha para cada gen KIR. Como se puede ver existen diferencias notables en el grado de polimorfismo entre estos genes, MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 27 por ejemplo, se han descrito 228 alelos de 3DL3 y sólo 34 de 2DL2. Resaltar que el gen 3DL1 con 183 alelos descritos, presenta un grado de polimorfismo bastante elevado entre los genes KIR. (fuente: https://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/stats.html) Una función recientemente descrita de algunas moléculas KIR es la de actuar como receptores de reconocimiento de patrón (PRRs) con capacidad para reconocer patrones moleculares asociados con patógenos (PAMP) y daño (DAMP). Esta capacidad de unión está determinada por la presencia del dominio 0 (D0) en el receptor KIR, siendo las moléculas 3DL2, 3DL1, 3DS1 y 2DL4 las que presentan este dominio. Las moléculas de 3DL2 que pueden unirse en la superficie celular a oligodeoxinucleótidos con motivos citosina-fosfato-guanina no metilados (CpG-ODN), pueden ser fagocitados y transportados a endosomas (Sivori et al., 2010). Esta unión de 3DL2 con CpG-ODNs no provoca señales inhibitorias, sino liberación de citocinas. Las demás moléculas KIR con D0 unen CpG-ODN, pero los complejos no pueden internalizarse. 6. LAS MOLÉCULAS HLA DE CLASE I COMO LIGANDOS DE KIR En cuanto a los ligandos de KIR, de manera general, se trata de moléculas de HLA-I, todas las moléculas HLA-C y algunas moléculas A y B son ligandos de KIR (Litwin et al., 1994; Pende et al., 1996; Winter et al., 1998; Rajagopalan et al., 2006). Las moléculas HLA-C se dividen en dos grupos, C1 y C2, dependiendo de los aminoácidos presentes en las posiciones 77 y 80, que son los condicionarán su unión a determinadas moléculas KIR. Las moléculas HLA-A y B que unen KIR son aquellas que presentan el epítopo Bw4 (una determinada combinación de aminoácidos en las posiciones 80-84) y las moléculas codificadas por los grupos alélicos A*03/11. Estos cuatro epítopos son mutuamente excluyentes entre sí, es decir, una molécula de HLA-I podrá tener uno o ninguno de estos epítopos. En caucásicos, casi el 40% de las moléculas HLA-A y B son ligandos de KIR y en cuanto a HLA-C, como se ha dicho anteriormente, todas las moléculas son ligando de KIR, pero la proporción de C1 y C2 varía entre poblaciones (Figura 11). INTRODUCCIÓN 28 Figura 11. Distribución de los epítopos de HLA-I ligandos de KIR en distintas poblaciones La imagen muestra la frecuencia de los grupos HLA-I que presentan los distintos epítopos de unión KIR, y su distribución en las diferentes poblaciones. Tomado de Encyclopedia of Immunobiology, Volume 1 (p.369-380), por Rajalingam, 2016 La mayoría de las moléculas KIR con 2 dominios extracelulares tienen como ligando moléculas HLA-C, mientras que los que tienen 3 dominios se unen a moléculas HLA-A o B, o sea, con el epítopo Bw4 o A3/A11. Algunas moléculas HLA no clásicas como HLA-G, expresada sólo en el trofoblasto extravelloso, son también ligandos de KIR. Esta molécula está implicada en la interacción con NK uterinas, críticas en el entorno placentario. (Figura 12). MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 29 Figura 12. Receptores KIR y sus ligandos HLA La figura muestra la relación ligando-receptor entre distintas moléculas HLA-I y sus receptores KIR. Hasta la fecha, existen pocas moléculas HLA-I conocidas como ligandos de aKIR; mientras que los ligandos de iKIR están mejor definidos. Tomado de The Yin and Yang of HLA and KIR in human disease (p. 19), de Kulkarni et al., 2008, Semin Immunol. 20(6):343-352 6.1 La interacción KIR-ligando en la educación de las células NK La actividad de las células NK debe estar sometida a mecanismos de control para evitar las autoagresiones. Entre estos mecanismos de control, uno de los más importantes es la denominada educación de las células NK. Se han propuesto distintos modelos de educación que se basan en la interacción entre receptores KIR, mayoritariamente los iKIR, y sus ligandos, principalmente moléculas HLA de clase I (Raulet y Vance, 2006). Para comprender estos modelos hay que señalar también que, una célula NK de un determinado individuo no tiene por qué expresar todos los receptores que están presentes en su dotación genética. Los modelos propuestos son los siguientes: 1) Licenciamiento estimulatorio o rearme: Durante el proceso de maduración de la célula NK, la unión del iKIR a su ligando provocaría la señal activadora de maduración. Sin esta señal, la célula NK no podría licenciarse, y el reconocimiento de ligandos por los receptores activadores o la ausencia de moléculas HLA-I sólo generaría respuestas de baja intensidad (hiporespuesta), aunque podrían ser funcionalmente competentes ante ciertas infecciones. El tamaño de esta población hiporespondedora podría ser considerable, ya que se INTRODUCCIÓN 30 ha encontrado aproximadamente en un 10% en ratones y humanos (Fernández et al., 2005). 2) Licenciamiento Inhibitorio o desarme: Supone que, en el proceso de educación, sólo se licenciarían aquellas células NK que hayan recibido dos señales, de manera que la señal inhibidora producida por la unión de un iKIR a su ligando contrarrestaría la producida por la unión de un aKIR a su ligando. Si la señal activadora no es contrarrestada, las células NK entrarían en estado de continua activación y posteriormente de hiporespuesta. 3) Licenciamiento por reóstato: Implicaría que el licenciamiento se da por el grado de respuesta, es decir que, dependiendo del balance entre activación e inhibición de la célula NK, esta se licenciará o no. Este modelo contempla el papel de los demás receptores y abre la posibilidad de diferencias en la capacidad de licenciar no sólo según la dotación de genes KIR, sino también según la dotación alélica de cada individuo. En cualquier caso, el repertorio de células NK licenciadas en cada individuo depende de su dotación de genes y alelos KIR, y moléculas HLA. Dos individuos con la misma dotación KIR y diferentes moléculas HLA tendrán repertorios NK distintos y viceversa. 6.2 Las moléculas HLA asociadas a BD como ligandos KIR En trabajos anteriores de nuestro grupo realizados en población española, además de HLA-B51, se encontraron otras moléculas asociadas con la enfermedad. Concretamente, B57 como molécula de riesgo, y A3 como protectora (Montes-Cano et al., 2013). En otros estudios en población turca, se ha descrito también asociación de riesgo con A26, B15, B27 y B57 y de protección con A3 (Ombrello et al., 2014). HLA-A3 es, junto a A11, ligando de KIR3DL2, pudiendo influenciar la actividad NK. Además, tanto B51, como B57 y B27 tienen el epítopo Bw4, ligando de KIR3DL1. Se ha propuesto que la interacción entre Bw4 y KIR3DL1 podría explicar la relación entre HLA y la enfermedad. Sin embargo, otras moléculas HLA que no presentan el epítopo Bw4, como A26, se han MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 31 relacionado con la enfermedad, y la mayoría de las moléculas HLA-Bw4 no han sido asociadas con BD. Incluso, hay trabajos que describen moléculas HLA con este epítopo que se comportan como protectoras. Para explicar estas aparentes discordancias se ha propuesto que la presencia de ciertos aminoácidos en determinadas posiciones de la molécula HLA-I con el epítopo Bw4 pueden producir un plegamiento anómalo de la molécula. Todos estos trabajos sugieren que las moléculas HLA-I Bw4-péptido podían formar complejos “permisivos” y “no permisivos” para unirse a KIR3DL1 (Thananchai et al., 2007; Malnati et al., 1995). Además, para que la molécula HLA se exprese en superficie es necesario que tenga cargado un péptido. En este contexto, se ha visto que polimorfismos en los genes que codifican enzimas como ERAP1 y ERAP2, que son los encargados de recortar los péptidos al tamaño que encaja en el bolsillo de HLA-I (8-10 aminoácidos), podrían jugar un papel fundamental en la expresión de moléculas en superficie, modulando una mayor o menor expresión (Conde-Jaldón et al., 2014; Guasp et al., 2016; Takeuchi et al., 2016). 6.3 El complejo HLA-E-NKG2/CD94 Cuando se analizan las moléculas HLA de los pacientes B51 negativo, la posición más relevante en la asociación con BD es una posición localizada en el péptido señal de HLA-B que, interesantemente, regula también la actividad NK, ya que forma parte del nonámero que presenta HLA-E y podría modular la expresión de esta molécula HLA no clásica cuyo receptor, CD94/NKG2, es otro receptor de las células NK (Borrego et al., 1998). HLA-E comparte estructura con las moléculas HLA-I clásicas, sin embargo, tiene un polimorfismo muy limitado, prácticamente bialélico, ya que, dos alelos, E*01:01 y E*01:03, suponen casi el 100% del polimorfismo en población humana, siendo el resto variantes raras o proteínas no funcionales (Sharpe et al., 2019). Este dimorfismo, consistente en un cambio de aminoácido Arg107Gly, se ha relacionado con diferentes situaciones patológicas, como infecciones víricas (Schulte et al., 2009; Lajoie et al., INTRODUCCIÓN 32 2005), cáncer (Zheng et al., 2015; Hirankarn et al., 2004) y enfermedades autoinmunes (Paladini et. Al, 2009). Además, HLA-E presenta un set de péptidos muy restringido (Braud et al., 1997). Así, en condiciones fisiológicas, HLA-E une exclusivamente nonapéptidos derivados de la secuencia líder de las moléculas HLA-I. Concretamente estos nonapéptidos incluyen los residuos 3 a 11 de la secuencia líder de moléculas A, B, C (ver material y métodos) y G (VMAPRTLFL), y excluye péptidos derivados de HLA-F (PRSLLLLLS) y del propio HLA-E (DGTLLLLLS) (Braud et al., 1998). En determinadas circunstancias como estrés celular, HLA-E puede presentar péptidos derivados de la proteína de la Hsp60 (Michaelsson et al., 2002), o de ciertos virus (CMV, HIV, HBV, EBV, HCV) y bacterias (Salmonella, Listeria y Mycobacterium) (Van Hall et al., 2010). En cuanto a los receptores, NKG2 (CD159), se encuentran en células NK y también en algunos tipos de linfocitos Tc (Pietra et al., 2009; Joosten et al., 2016). Se trata de proteínas transmembrana de tipo II que pertenecen a la familia de los receptores de tipo lectina y que forman heterodímeros con CD94 (CD94/NKG2). Se localizan en el cromosoma 12 en el complejo NK (NKC). La familia de proteínas incluye siete miembros (A-H) divididos en inhibidores (NKG2A and B) y activadores (NKG2 C, D, E, F and H) de acuerdo con su función. Los receptores inhibidores contienen 2 motivos inhibidores citoplasmáticos (ITIM), de manera que la unión del ligando conduce al reclutamiento de tirosin-fosfatasa y desfosforilación de ZAP70 que pierde de su capacidad de unirse a los motivos activadores ITAM. En el caso de los receptores activadores, la interacción con el ligando conduce a la unión de la molécula adaptadora DAP-12 (excepto NKG2D que une DAP-10) que contiene dominios ITAM que disparan la cascada de activación a través de ZAP70. La función de NKG2F no está clara, pero se considera activador. La molécula CD94, que contiene un corto dominio intracitoplasmático, es la responsable de la trasmisión de la señal. Todos los miembros de la familia reconocen HLA-E, excepto NKG2D que une otras moléculas HLA-I no clásicas, MIC-A y MIC-B. Por tanto, junto con los KIR, los receptores NKG2 controlan la actividad de las células NK. MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 33 Figura 13. Representación esquemática de la interacción entre las moléculas HLA-E y sus receptores NKG2 La figura muestra las moléculas implicadas en la cascada de señales inhibidoras y activadoras que se producen como consecuencia de la interacción de las moléculas HLA-E unidas a péptido, así como MICA/B, a los distintos heterodímeros de NKG2/CD94. El sentido de la señal producida será dependiente del tipo de receptor NKG2. Fuente: https://www.omicsonline.org/articles-images/2161-0991-2-117-g001.html Todos estos antecedentes sugieren que el papel de las moléculas HLA-I en BD puede estar relacionado, al menos en parte, con el control de la actividad NK. METODOLOGÍA 40 DISEÑO DE INVESTIGACIÓN Estudio observacional multicéntrico de casos y controles, con estrategia de genes candidatos. El presente trabajo parte de una cohorte de pacientes preexistente en el grupo de investigación, a la cual se ha ido sumando, de forma progresiva, nuevos pacientes, todos ellos reclutados en 17 hospitales del Sistema Nacional de Salud, hasta completar una cohorte de estudio de 466 pacientes no emparentados, siendo la mayor cohorte de estudio de Behçet de Europa. Por otro lado, como grupo control se empleó una cohorte de individuos sanos de origen español, con 444 individuos. Las muestras biológicas de partida, obtenidas tanto de los pacientes como de los controles, fueron sangre y/o saliva. A partir de estas muestras se procedió a realizar la extracción de ADN y los procedimientos necesarios para alcanzar los objetivos enumerados anteriormente. Para alcanzar el primer objetivo, se procedió a ampliar el genotipado de la cohorte de estudio preexistente en las moléculas de HLA-I clásicas A, B y C, y a clasificar las muestras como ligandos de KIR (A3/11, Bw4 y C1/C2), así como según el tipo de nonapéptido en la región líder. Para la consecución del segundo objetivo, se realizó genotipado del set de genes KIR en toda la cohorte. Para la consecución del tercer objetivo, se eligió un polimorfismo de cambio de nucleótido (SNP) en el gen KIR3DL1 que permitía distinguir grupos alélicos que codifican moléculas con diferente grado de expresión en membrana. El estudio del polimorfismo de KIR2DS4 se realizó en paralelo al genotipado del set de genes KIR, ya que las sondas utilizadas y el software de análisis permiten diferenciar entre los alelos que presentan la deleción y el resto. Para alcanzar el cuarto objetivo, se realizó genotipado de un SNP HLA-E en un número más limitado de muestras. La figura 14 resume el diseño de investigación. MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 41 Figura 14. Diseño de investigación COHORTE DE ESTUDIO Y MÉTODOS 1. Pacientes y controles La cohorte de estudio incluyó 466 casos de pacientes no emparentados con enfermedad de Behçet (44% hombres) que fueron reclutados en 17 hospitales españoles. Para la clasificación de la enfermedad, se utilizaron los criterios del Grupo internacional de estudio de la enfermedad de Behçet de 1990, por lo que el 100% presentó úlceras orales. Además, el 59% de los pacientes presentaban úlceras genitales, y el 54% de uveítis como características más frecuentes. Las características clínicas de la cohorte se resumen en la Tabla 5. Hospitales del SNS: Reclutamiento de pacientes y controles Recolección de muestras Sangre/saliva ADN Obje�vo 4 Tipaje de genes HLA de Clase I (A, B y C) Obje�vo 2 Clasificación en Geno�pos y Haplo�pos Obje�vo 1 Tipaje de alelos funcionales de KIR2DS4 Obje�vo 3 Tipaje de polimorfismo HLA- E Sangre: ampliación Tipaje de alelos funcionales KIR3DL1/3DS1 Clasificación en ligandos de KIR Clasificación según nonapép�dos de HLA- E Tipaje de genes KIR METODOLOGÍA 42 Tabla 5. Características clínicas de la cohorte de pacientes MANIFESTACIÓN % úlceras orales 100 úlceras genitales 59 uveítis 54 artritis 42 vascular 21 neurológica 18 gastrointestinal 15 Como grupo control se emplearon 444 individuos sanos (50% hombres) no emparentados. Tanto la cohorte de estudio como el grupo control son españoles de origen caucásico, con características similares en cuanto a edad y género. Todos los individuos se incluyeron en el estudio después de la firma del correspondiente consentimiento informado. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de los Hospitales Universitarios Virgen Macarena y Virgen del Rocío, y financiado por diferentes proyectos FIS, fundamentalmente PI16/01373. 2. Extracción de ADN Como material de partida se utilizó saliva o sangre periférica recogida en tubos de EDTA. El ADN genómico se extrajo empleando QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, Barcelona, España) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La pureza del ADN extraído fue determinada usando el espectrofotómetro NanoDrop (ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE, USA). Únicamente las muestras de ADN que con una ratio 260/280 ≥1.7- 2.0 y una concentración final ≥10-20 ng/μl fueron consideradas apropiadas para estudio. Un total de 14 muestras de saliva de pacientes se descartaron por no cumplir estos criterios de calidad. Las muestras se almacenaron a -20ºC hasta su uso. MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 43 3. Tipaje de genes HLA-A*, B* y C* Para el tipaje de los genes HLA-I se utilizó un método basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con detección mediante sondas específicas de secuencia (SSOP) y revelado con fluorescencia (Luminex, LABType SSO, One Lambda Inc., Canoga Park, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. De forma resumida, el ADN problema se amplifica mediante PCR empleando cebadores grupo-específicos (HLA- A, B o C). Uno de los cebadores se encuentra biotinilado, por lo que el producto de amplificación queda marcado. Una vez desnaturalizado, el amplificado se somete a un proceso de hibridación con sondas específicas unidas a microesferas codificadas mediante color. Después de los correspondientes lavados, la muestra se incuba con un conjugado de estreptavidina marcada con ficoeritrina (PE). Al final del proceso, sólo aquellas microesferas que hayan unido amplificados estarán marcadas con PE. El resultado se lee en un citofluorometro con dos láseres y detectores capaces de reconocer el color de la microesfera y la intensidad de fluorescencia emitida (LABScanTM100). El resultado del tipaje HLA se obtiene por discriminación de microesferas negativas y positivas con el programa de análisis HLA fusion 2.0 (One Lambda Inc.). Este método permite un genotipado de media resolución de cada gen HLA-I. La clasificación de las correspondientes moléculas HLA-I como ligandos de KIR se realizó según la siguiente tabla (Tabla 6): Tabla 6. Clasificación de las moléculas HLA-I en los diferentes grupos de ligandos KIR Ligando Grupo alélico HLA-I A3/11 HLA-A*03, *11 Bw4 HLA-A*23, *24, *25, *32 HLA-B*13, *15:13, *15:16, *15:17, *27, *37, *38, *44, *47, *49, *51, *52, *53, *57, *58, *59 C1 C*01, *03, *07, *08, *12:02, *12:03, *14, *16:01 METODOLOGÍA 44 C2 C*02, *04, *05, *06, *15, *16:02, *17, *18 Para cada ligando se incluyen sólo los grupos alélicos HLA más frecuentes en población caucásica Respecto a la secuencia del nonapéptido en las posiciones 3-11 de la secuencia líder, las moléculas HLA-A, B y C se clasificaron en 10 grupos diferentes que se muestran en la tabla 7. Tabla 7. Clasificación de moléculas HLA-I según el tipo de nonapéptidos presentados por HLA-E Grupo Nonapéptido Grupo alélico HLA-I P1 VMAPRTLLL A*01, *03, *11, *29, *30, *31, *32, *33, *36, *74; C*02, *15 P2 VMAPRTLVL A*02, *23, *24, *25, *26, *34:02, *43, *66, *68, *69 P3 IMAPRTLVL A*34:01 P4 VMPPRTLLL A*80 P5 VMAPRTVLL B*07, *08, *14, *38, *39, *42, *48, *67, *73, *81 P6 VTAPRTLLL B*13, *18, *27, *37, *40:02, *40:06, *44, *47, *54, *55, *56, *59, *82, *83 P7 VTAPRTVLL B*15, *35, *40:01, *41, *45, *46, *49, *50, *51, *52, *53, *57, *58, *78 P8 VMAPRTLIL C*01, *03, *04, *05, *06, *08, *12, *14, *16, *17:02 P9 VMAPRALLL C*07, *18 P10 VMAPQALLL C*17 excepto C*17:02 Sólo se muestran las secuencias 3-11 presentes en moléculas HLA frecuentes en nuestra población. Para cada forma del nonapéptido se incluyen sólo los grupos alélicos HLA más comunes en población caucásica. Fuente: IPD-IMGT/HLA Database (ebi.ac.uk) MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 45 4. Determinación de la dotación de genes KIR El set de genes KIR presente en cada muestra se determinó también mediante PCR-SSOP Luminex (KIR SSO Genotyping Test, One Lambda Inc., Canoga Park, CA) según las instrucciones del fabricante. El principio del método es el mismo que el utilizado para el tipaje de los genes HLA-I, con los correspondientes cebadores y microesferas específicas. Este método permite asignar la presencia o ausencia de cada uno de los genes KIR, pero no el número de copias, por lo que la asignación de haplotipos KIR sólo se puede ser como AA y Bx (AB o BB). La asignación de genotipos se realizó utilizando la base de datos Allele Frequency Net Database, introduciendo los resultados del set de genes KIR de cada muestra en la aplicación “KIR Genotype Search” (http://www.allelefrequencies.net/kir6001a.asp). 5. Estudio del polimorfismo funcional de KIR2DS4 El sistema de tipaje utilizado permite discriminar entre algunos grupos de alelos en ciertos genes. Concretamente, en el gen KIR2DS4 se puede distinguir entre los alelos *001/011/014/015, que presentan la secuencia completa, de aquellos que contienen una deleción de 22pb, como son *003/004/006/007/008/009/010/012/013 (Marangon et al., 2014). 6. Estudio del polimorfismo funcional de KIR3DL1/DS1 En cuanto al estudio funcional del gen KIR3DL1/S1, se genotipó el SNP rs149123986 mediante PCR a tiempo real empleando TaqMan SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems, Barcelona, Spain) (SNP ID: 4351379 C_165500412_10) en un LightCycler 480 (Roche, Barcelona, Spain). El genotipado de este SNP (A/G) permite distinguir entre dos grupos de alelos 3DL1 con diferentes patrones de expresión en la superficie celular: el alelo 3DL1*004 (rs149123986G) con muy baja o nula expresión (3DL1Null) y el resto de los alelos (rs149123986A) con expresión normal, aunque variable (3DL1Exp y 3DS1). METODOLOGÍA 46 Según la combinación del resultado de tipaje de la dotación de genes KIR y del polimorfismo rs149123986, se encuentran una serie de combinaciones que nos permitieron clasificar las muestras según se muestra en la tabla 8. Tabla 8. Clasificación de las muestras según el resultado del análisis conjunto de dotación KIR3DL1/DS1 y genotipado del rs149123986 Dotación KIR Genotipado rs149123986 Alelos funcionales gen 3DL1/S1 3DL1 3DS1 + - AA 3DL1Exp/3DL1Exp + - AG 3DL1Exp/3DL1Null + - GG 3DL1Null/3DL1Null + + AA 3DL1Exp/3DS1 + + AG 3DL1Null/3DS1 - + AA 3DS1/3DS1 7. Estudio del polimorfismo de HLA-E El estudio del polimorfismo de HLA-E se realizó mediante PCR a tiempo real con sondas Taqman SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems, Barcelona, Spain) en un LightCycler 480 (Roche, Barcelona, Spain). Se genotipó un SNP localizado en el exón 3, rs1264457 (SNP ID: 4351379 C_175677552_10) (A>G), que determina un cambio de aminoácido Arg107Gly que permite distinguir los alelos *01:01 (A) de los alelos *01:03 (G) (Grimsley et al., 2002). Las muestras AA se clasificaron como 01:01, 01:01, las muestras AG como 01:01, 01:03 y las muestras GG como 01:03, 01:03. Este estudio se realizó en un subgrupo de 273 pacientes y 273 controles. MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 47 8. Análisis Estadístico Las frecuencias fenotípicas, genotípicas y haplotípicas se calcularon por contaje directo. La distribución en pacientes y controles se compararon mediante el test chi cuadrado en todos los casos: • Distribución de ligandos KIR: A3/11, B51, Bw4, Bw4-80I, C1, y C2. • Distribución de los diferentes grupos de moléculas HLA según la secuencia 3-11 en el péptido líder. • Distribución de dotación de genes, haplotipos y genotipos KIR. • Distribución de variantes funcionales y no funcionales del gen 2DS4: en la cohorte completa, entre los individuos AA y Bx, y estratificados de acuerdo con la presencia/ausencia de la combinación ligando y receptor. • Distribución de variantes del gen 3DL1/S1. • Distribución de genotipos y alelos HLA-E. Los valores p≤0.05 fueron corregidos mediante el ajuste de Bonferroni (Pc) considerando el número de test realizados en cada caso. Las comparaciones con Pc≤0.05 fueron consideradas asociadas, mientras aquellas con p≤0.05 y Pc >0.05 fueron consideradas sugestivas de asociación. Los odds ratios (ORs) y los intervalos de confianza al 95% (95% CI) fueron calculados usando el software web OpenEpi (Open Source Epidemiologic Statistics for Public Health, Versión 3.01. www.OpenEpi.com). Los ORs ajustados fueron calculados mediante modelo de regresión logística incondicional categorizando a los individuos de acuerdo con la presencia del factor asociado en el análisis univariante (p ≤0.05) utilizando el programa de software libre Epi Info (EPI Info 2002, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA). RESULTADOS RESULTADOS 56 estadística. Si bien el análisis de los B51 positivos está limitado por el bajo número de controles incluidos, las frecuencias de los péptidos P1 y P2 en pacientes y controles es muy similar en este grupo (Tabla 15). Tabla 15. Distribución de las secuencias 3-11 del péptido líder de las moléculas HLA de clase I clásicas con frecuencia >5% encontradas en nuestra población en los grupos B51 positivo y negativo B51 POSITIVO B51 NEGATIVO BD (%) n= 185 Controles (%) n= 70 BD (%) n= 250 Controles (%) n= 374 p/Pc OR (95% CI) P1 154 (83.2) 58 (82.9) 176 (70.4)* 299 (80.0)* 0.006/0.04 0.60 (0.41-0.86) P2 156 (84.3) 61 (87.1) 204 (81.6)* 267 (71.4)* 0.004/0.03 1.78 (1.20-2.63) P5 45 (24.3) 17 (24.3) 118 (47.2) 187 (50.0) P6 63 (34.1) 30 (42.9) 148 (59.2) 203 (54.3) P7# 185 (100) 70 (100) 163 (65.2) 249 (66.6) P8 156 (84.3) 56 (80.0) 224 (89.6) 332 (88.8) P9 51 (27.6) 14 (20.0) 108 (43.2) 155 (41.4) # El grupo P7 incluye B51 *sólo se muestran la p/Pc de las comparaciones estadísticamente significativas La asociación de P1 y P2 se ajusta a un modelo recesivo en el cual el genotipo P1P1 sería de protección y el genotipo P2P2 conferiría riesgo. Este modelo se cumple en los individuos B51 negativos (Tabla 16). MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 57 Tabla 16. Distribución de los genotipos de las diferentes formas de las secuencias 3-11 del péptido líder de las moléculas HLA-A en la cohorte total y en los individuos B51 negativos y positivos Genotipos COHORTE COMPLETA BD (%) n=435 Controles (%) n=444 p/Pc* OR (95%CI) P1P1 74 (17.0) 116 (26.1) 0.001/0.006 0.6 (0.4-0.8) P1P2 206 (47.4) 221 (49.8) 0.47 P1P3 1 (0.2) 0 (0.0) P2P2 152 (34.9) 105 (23.7) 0.0002/0.001 1.7(1.3-2.3) P2P3 1 (0.2) 0 (0.0) P2P4 1 (0.2) 2 (0.5) B51 NEGATIVOS BD (%) n=250 Controles (%) n=374 P1P1 45 (18.0) 107 (28.6) 0.003/0.02 0.6 (0.4-0.8) P1P2 117 (46.8) 182 (48.7) 0.65 P1P3 1 (0.4) 0 (0.0) P2P2 85 (34.0) 83 (22.2) 0.001/0.006 1.8 (1.2-2.6) P2P3 1 (0.4) 0 (0.0) P2P4 1 (0.4) 2 (0.5) B51 POSITIVOS BD (%) N=185 Controles (%) N=70 P1P1 29 (15.7) 9 (12.7) 0.59 P1P2 89 (48.1) 39 (55.7) 0.28 P1P3 0 (0.0) 0 (0.0) P2P2 67 (36.2) 22 (31.4) 0.48 P2P3 0 (0.0) 0 (0.0) RESULTADOS 58 P2P4 0 (0.0) 0 (0.0) Las p y Pc corresponden al análisis en modelo recesivo (AA vs. Aa+aa). Todas las comparaciones en modelo dominante (AA+Aa vs. aa) resultaron no significativas (p>0.05). Se muestran los valores de p cuando el tamaño supera el 5% El grupo P1, que no resultaba asociado en el grupo total, incluye HLA-A3, descrito como factor de protección en diversos trabajos. Al condicionar por A3, la asociación protectora de P1 encontrada en el grupo de los B51 negativos permanece significativa, perdiéndose la asociación de A3. Sin embargo, entre B51 positivos y con el mismo modelo, se pierde la asociación de P1, permaneciendo significativa la de HLA-A3 (Tabla 17). Tabla 17. Análisis de regresión logística de los grupos B51 negativo y positivo incluyendo en el modelo A3 y P1 Factor B51 negativos B51 positivos P OR (95% CI) P OR (95% CI) P1 0.02 0.64 (0.44-0.94) 0.65 A3 0.15 0.02 0.35(0.15-0.83) El grupo P2 incluye las moléculas HLA-A2, 24 y 26, que han sido asociadas a BD como factores de riesgo en diversos trabajos, aunque con diferencias entre poblaciones y discrepancias entre estudios incluso en la misma población. Para corregir la asociación de P2 con cada uno de estos factores, construimos tres modelos de regresión incluyendo P2 y cada una de estas moléculas HLA. En el grupo B51 positivo, P2 perdía significación en todos los casos, y ninguna de las moléculas HLA-A antes mencionadas resultaba asociada. Sin embargo, en el grupo de B51 negativo, P2 permanece asociado al condicionar por A24 y A26. En cambio, al condicionar por A2, ambos factores, P2 y A2, pierden la significación (Tabla 18). MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 59 Tabla 18. Análisis de regresión logística en los grupos B51 positivo y negativo de P2 con tres modelos, incluyendo los grupos alélicos A2, A24 y A26 Factor B51 negativos B51 Positivos P OR (95%CI) P OR (95%CI) A2 0.11 0.83 P2 0.09 0.73 A24 0.77 0.32 P2 0.007 1.75 (1.17-2.62) 0.46 A26 0.66 0.84 P2 0.006 1.75 (1.18-2.60) 0.59 Se ha descrito que los nonapéptidos derivados de HLA-B con 2Met unen HLA-E más eficientemente que aquellos con 2Thr (Horowitz et al., 2016). La distribución de este polimorfismo en nuestra cohorte presentaba diferencias significativas en pacientes y controles. Estas diferencias desaparecían al corregir por B51 (incluido en el grupo de los 2Thr) y también al dividir los individuos en B51 positivos y negativos (Tabla 19). Tabla 19. Distribución de los genotipos Met/Thr de los nonapéptidos derivados de HLA-B en pacientes con BD y controles GRUPO TOTAL Genotipo Met/Thr BD (%) n= 435 Controles (%) n= 444 p Pc OR (95% CI) Met/Met 16 (3.7) 25 (5.6) Met/Thr 147 (33.8) 179 (40.3) 0.046 >0.05 0.76 (0.57-0.99) Thr/Thr 272 (62.5) 240 (54.1) 0.01 0.03 1.42 (1.08-1.86) RESULTADOS 60 Modelo dominante BD (%) n= 435 Controles (%) n= 444 Met 163 (37.5) 204 (45.9) 0.01 0.02 0.71 (0.54-0.92) Thr 419 (96.3) 419 (94.4) 0.17 Modelo recesivo BD (%) n= 435 Controles (%) n= 444 Met 16 (3.7) 25 (5.6) Thr 272 (62.5) 240 (54.1) 0.01 0.02 1.42 (1.08-1.86) Modelo alélico BD (%) n= 870 Controles (%) n= 888 Met 179 (0.21) 229 (0.26) 0.01 0.02 0.75 (0.60-0.93) Thr 691 (0.79) 659 (0.74) 0.01 0.02 1.34 (1.07-1.68) GRUPO B51 POSITIVO Genotipo Met/Thr BD (%) n= 185 Controles (%) n= 70 p Pc OR (95% CI) Met/Met - - Met/Thr 45 (24.3) 17 (24.3) 0.99 Thr/Thr 140 (75.7) 53 (75.7) 0.99 GRUPO B51 NEGATIVO Genotipo Met/Thr BD (%) n= 250 Controles (%) n= 374 p Pc OR (95% CI) Met/Met 16 (6.4) 25 (6.7) 0.90 Met/Thr 102 (40.8) 162 (43.3) 0.53 Thr/Thr 132 (52.8) 187 (50.0) 0.49 Modelo dominante AA+Aa versus aa; Modelo recesivo AA versus Aa+aa. Cuando se corrige introduciendo B51 en el modelo, la asociación se pierde (P>0.05), mientras que B51 permanece asociado (P<10-4, OR=3,78, 95% CI 2.80-5.36). Se muestran los valores de p cuando el tamaño supera el 5% MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 61 OBJETIVO 2 Estudiar el papel de la dotación de genes KIR en la enfermedad de Behçet En el estudio de dotación de genes KIR se obtuvieron resultados en un total de 435 pacientes y 439 controles que fueron los incluidos en el análisis estadístico. La distribución de los genes KIR en la cohorte de pacientes y controles se resume en la Tabla 20. En el estudio se detectaron los 14 genes y 2 pseudogenes KIR descritos. Cuatro de ellos, que se corresponden con los genes flanqueantes centroméricos (3DL3 y 3DP1) y teloméricos (2DL4 y 3DL2), estaban presentes en todos los individuos analizados. Las mayores diferencias en la distribución de los genes en casos y controles se encontraron en los casos de 2DL5A/B (55.4% y 59.4%), 2DS1 (40.0% y 44.2%) y 2DS5 (32.4% y 38.3%) aunque en ningún caso se alcanzó significación estadística. Tabla 20. Distribución de genes KIR en casos y controles Gen KIR BD (%) n= 435 Controles (%) n= 439 p OR (95% CI) 2DL1 416 (95.6) 422 (96.1) 0.72 2DL2 270 (62.1) 267 (60.8) 0.70 2DL3 373 (85.7) 382 (87.0) 0.59 2DL4 435 (100) 439 (100) -- 2DL5A/B 241 (55.4) 261 (59.4) 0.23 2DP1 416 (95.6) 423 (96.4) 0.59 2DS1 174 (40.0) 194 (44.2) 0.21 2DS2 269 (61.8) 262 (59.7) 0.51 2DS3 156 (35.9) 153 (34.8) 0.75 2DS4 408 (93.8) 421 (95.9) 0.16 2DS5 141 (32.4) 168 (38.3) 0.07 RESULTADOS 62 3DL1 409 (94.0) 422 (96.1) 0.15 3DS1 181 (41.6) 192 (43.7) 0.53 3DL2 435 (100) 439 (100) -- 3DL3 435 (100) 439 (100) -- 3DP1 435 (100) 439 (100) -- En cuanto a la distribución de los haplotipos KIR, no se encontraron diferencias significativas entre pacientes y controles (p=0.43). El haplotipo Bx fue el más frecuente en ambos grupos (Tabla 21). Tabla 21. Distribución haplotipos KIR en casos y controles Haplotipo KIR BD (%) n= 435 Controles (%) n= 439 AA 109 (25.1) 100 (22.8) Bx 326 (74.9) 339 (77.2) Respecto al análisis de genotipos KIR, se encontraron 51 genotipos distintos en nuestra cohorte, sobre el total de 660 descritos. Sólo 12 de estos genotipos presentaban una frecuencia superior al 2% en al menos uno de los grupos, suponiendo en su conjunto, el 85.3% de los genotipos en pacientes y 87.7% en controles. El genotipo 1 fue el más representado tanto en pacientes (25.1%) como en controles (22.8%), seguido por el genotipo 4 (14.9% en pacientes y 14.3% en controles). El genotipo 2 presentó diferente distribución en pacientes y controles (p=0.01), estando menos representado en pacientes (8.7%) que controles (14.1%) (OR 0.58; 95% CI 0.38-0.89), si bien la diferencia desaparece al corregir el valor de p por el número de comparaciones (Tabla 22). MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 63 Tabla 22. Distribución genotipos KIR en casos y controles Genotipo KIR BD (%) n= 435 Controles (%) n= 439 p Pc OR (95% CI) 1 109 (25.1) 100 (22.8) 0.43 2 38 (8.7) 62 (14.1) 0.01 >0.05 0.58 (0.38-0.89) 3 23 (5.3) 21 (4.8) 4 65 (14.9) 63 (14.3) 0.80 5 39 (9.0) 45 (10.2) 0.52 6 26 (6.0) 36 (8.2) 0.20 7 18 (4.1) 16 (3.6) 13 10 (2.3) 4 (0.9) 70 9 (2.1) 5 (1.1) 71 8 (1.8) 12 (2.7) 72 14 (3.2) 11 (2.5) 73 12 (2.8) 10 (2.3) resto 64 (14.7) 54 (12.3) 0.30 Se muestran los valores de p cuando el tamaño supera el 5% RESULTADOS 64 OBJETIVO 3 Analizar la implicación de polimorfismos funcionales conocidos en los genes KIR3DL1/S1 y KIRDS4 con la enfermedad En este estudio se incluyeron los 435 pacientes y 439 con resultados de genotipado para la dotación de genes KIR. KIR3DL1/S1 Y POLIMORFISMO FUNCIONAL rs149123986 La Tabla 23 resume los resultados de la distribución de los alelos funcionales del gen KIR 3DL1/S1 en pacientes y controles. No se encontraron diferencias significativas entre ambos grupos. Tabla 23. Distribución KIR3DL1/S1 en casos y controles KIR3D BD (%) n= 435 Controles (%) n= 439 p OR (95% CI) L1 S1 + - 254 (58.4) 247 (52.2) 0.53 + + 155 (35.6) 175 (39.9) 0.20 - + 26 (6.0) 17 (3.9) 0.15 La Tabla 24 muestra los datos correspondientes a la distribución del polimorfismo rs149123986 del gen KIR3DL1/S1 en pacientes y controles. Se encontró una distribución diferente de los genotipos en pacientes y controles (p=0.01 en tabla de contingencia 2×3). Esta diferente distribución se debía a al aumento del genotipo AA y disminución de heterocigotos en los pacientes con respecto a los controles. MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 65 Tabla 24. Distribución del polimorfismo rs149123986 del gen KIR3DL1/S1 en casos y controles rs149123986 BD (%) n= 435 Controles (%) n= 439 p Pc OR (95% CI) AA 320 (73.5) 282 (64.3) 0.003 0.009 1.54 (1.16-2.07) AG 101 (23.0) 139 (31.7) 0.005 0.015 0.65 (0.48-0.88) GG 14 (3.5) 18 (4.0) Se muestran los valores de p cuando el tamaño supera el 5% Las muestras se clasificaron respecto la dotación de genes KIR, presencia o ausencia de KIR3DL1 y 3DS1, y el polimorfismo rs149123986 según se indica en el apartado correspondiente de la sección Material y Métodos. La Tabla 25 muestra los resultados de la distribución de los 6 genotipos que se obtienen teniendo en cuenta las diversas combinaciones posibles. Esta distribución presentaba diferencias estadísticamente significativas al comparar pacientes y controles (p=0.002 en tabla de contingencia 2x6). Esta diferente distribución se debe a una disminución significativa de los individuos 3DL1Null/3DS1 entre los pacientes y a un aumento de los individuos 3DL1Exp/3DL1Exp entre los pacientes que no alcanza la significación estadística tras corrección (Pc> 0.05). Tabla 25. Distribución de las muestras de pacientes y controles clasificadas según los resultados en la presencia o ausencia de KIR3DL1 y 3DS1 y el polimorfismo rs149123986 KIR3D RS Genotipo KIR3D BD (%) n=435 Controles (%) n= 439 p/Pc OR (95%CI) L1 S1 + - AA L1exp/L1 exp* 166 (38.2) 140 (31.8) 0.05/>0.05 1.32 (1.00-1.74) + - AG L1exp/L1 Null 74 (17.0) 89 (20.3) 0.22 + + AA L1exp/S1 128 (29.4) 125 (28.5) 0.76 + - GG L1Null/L1 Null 14 (3.2) 18 (4.1) DISCUSIÓN DISCUSIÓN 74 La enfermedad de Behçet es una patología compleja de etiología desconocida con base genética demostrada, cuyo conocimiento ha experimentado destacados avances con el desarrollo de las técnicas de genotipado masivo que han permitido relacionar esta patología con diferentes genes y perfilar el conjunto de rutas que pueden verse alteradas en esta enfermedad compleja de base inmunológica. Aun así, hay cuestiones sin resolver, entre ellas, una de las más importantes es la relación entre la enfermedad y las moléculas HLA. En estos últimos años, diferentes trabajos han puesto de manifiesto que sólo la región HLA-I se asociaría con la enfermedad, y dentro de ella, la asociación parece residir en dos genes clásicos HLA-A y, sobre todo, HLA-B. La asociación de la enfermedad con HLA-B51 se describió en los años 70 del pasado siglo, sin embargo, la causa última de esta asociación sigue sin resolverse. Las moléculas HLA-I clásicas, HLA-A, B y C, son esenciales en la selección del repertorio de células T CD8 y en el control de su actividad, ya que son las encargadas de presentar péptidos a esta subpoblación celular. Además, algunas moléculas de clase I, tanto clásicas (todas las moléculas HLA-C, y algunas A y B) como no clásicas (por ejemplo, HLA-E), participan en la selección del repertorio y el control de la actividad de las células NK mediante su acción como ligandos de algunos de los receptores que componen la plétora que presentan estas células. Estas interacciones dan lugar a una compleja red que dificulta enormemente su estudio. El presente trabajo de tesis doctoral pretende aportar información acerca de estas cuestiones mediante un diseño de estudio de casoscontrol de genes candidatos. A continuación, se resumen y discuten los resultados obtenidos de cada uno de los objetivos planteados. En anteriores trabajos realizados por nuestro grupo (Montes Cano et al., 2013; Ortiz Fernández L et al., 2016) se han abordado diferentes cuestiones relacionadas con la asociación de la región HLA y BD y, en consonancia con la mayoría de los trabajos publicados, han descartado asociación con clase II y han centrado la asociación en dos loci de clase I, HLA-A* y B*. Los datos de genotipado en genes HLA-I clásicos (A*, B* y C*) de parte de los individuos incluidos en este trabajo, proceden de estudios anteriores (Montes-Cano et al., 2013 y Tesis Doctoral de Marta Conde Jaldón, 2014), MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 75 aunque se ha incrementado el número de muestras utilizando el mismo método. Sin embargo, los datos se han analizado con un propósito diferente, investigar si la asociación entre las moléculas HLA de clase I y la enfermedad pueden estar relacionadas con el control de la actividad NK considerando dos aspectos diferentes, su acción como ligando de receptores KIR y como moduladores de la función de HLA-E. En relación con el primer aspecto, son escasos los trabajos que han analizado las moléculas HLA-I en relación a su función como ligandos de los receptores KIR. Los diferentes receptores KIR reconocen los cuatro epítopos mutuamente excluyentes presentes en algunas moléculas HLA-I, concretamente A3/11, Bw4, C1 y C2. Respecto del epítopo A3/11, nuestros resultados sugieren asociación como factor de protección tanto en el grupo total como en los subgrupos B51 negativo y positivo, si bien, en este último, no se alcanzó la significación estadística debido, probablemente, al bajo número de controles B51 positivos incluidos. Por tanto, el epítopo A3/11 es un factor protector independiente de B51 y, en este sentido, nuestros resultados son concordantes con los obtenidos en otros estudios en diferentes poblaciones (Ombrello et al., 2014; Takeuchi et al., 2017). Al igual que en el caso de HLA-B51, hasta la fecha, no se ha explicado este efecto protector de HLA-A3/11 en la enfermedad. Una posible explicación, como veremos más adelante, podría estar relacionada con su función como ligando de KIR3DL2. En cuanto al epítopo Bw4, la molécula HLA-B51, al igual que otras moléculas HLA-A y B, contiene el epítopo Bw4. Además, el epítopo Bw4 no es homogéneo, ya que, las distintas moléculas HLA-Bw4 tienen diferencias en la secuencia en las posiciones 77, 80 y 81. Concretamente, la posición 80 es particularmente interesante ya que ha sido asociada como factor de riesgo en nuestra población (Ortiz Fernández et al., 2016) y provoca una diferente interacción con el receptor KIR3DL1 según presente 80Ile o 80Thr (Cella et al., 1994; Luque et al., 1996). La isoforma Bw4-80Ile se ha asociado a patología infecciosa, neoplásica y a enfermedades inmunomediadas de patrón mixto, DISCUSIÓN 76 similares por tanto a BD, como la espondilitis anquilosante, aunque con resultados no concluyentes (Fu et al., 2011; Gillespie et al., 2007). En cuanto a BD, se describió asociación con Bw4-80Ile en un estudio realizado en pacientes B51 negativos alemanes y turcos emigrados, (Kuranov et al. 2014). Sin embargo, estos resultados no se replicaron en otra cohorte de mayor tamaño (Erer et al., 2016). En otro estudio que describe asociación con Bw4 o Bw4-80I, los pacientes no se estratificaron en B51 positivos y negativos, por lo que no se descartó la dependencia de estas asociaciones con B51 (Mohammad-Ebrahim et al., 2018). Nuestros resultados descartan asociación independiente de Bw4 o Bw4-80I por dos motivos: el OR de la asociación tanto de Bw4 como de Bw4-80I es menor que el de HLA-B51, de hecho, la asociación desaparece en el grupo B51 negativo. Estos resultados están en consonancia con la mayoría de los datos publicados que sugieren que el epítopo Bw4 como tal no está asociado con la enfermedad (Ombrello et al., 2014; Middleton et al., 2007). En este sentido, aunque algunas moléculas HLA-Bw4 como B27 (80Thr) y B57 (80Ile), aparte del propio B51 (80Ile), han sido relacionadas con la enfermedad, la mayoría de las moléculas con este epítopo no se han asociado a BD y, por tanto, nuestros resultados son concordantes con estos estudios. La explicación a la asociación de moléculas HLA-B con BD, concretamente la de HLA-B51, y otras como B27 y B57, podría residir en una serie de posiciones aminoacídicas críticas situadas fuera del epítopo Bw4 que resultan fundamentales para modular la unión con 3DL1 (Sanjanwala et al., 2008). En concreto, son muy interesantes las posiciones son la 67 y 97 (Ombrello et al., 2014, Ortiz- Fernández et al., 2016). las moléculas HLA-B13, B27, B51, B52 y B57 son las únicas moléculas HLA-B con el epítopo Bw4 que no presentan un residuo Arg97 o Ser97. La molécula B52, que no ha sido asociada con BD, sólo se diferencia de B51 en dos posiciones, una de ellas la posición 67 (Ser67 en B52 por Phe67 en B51). La otra molécula Bw4 no Arg/Ser97 no asociada con BD, B13, es también Ser67. Por tanto, la asociación de las moléculas HLA-B51, B27 y B57 podría ser debida al polimorfismo de determinadas posiciones aminoacídicas situadas fuera del epítopo Bw4 que modifican la conformación de la molécula y su interacción con KIR. MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 77 En cuanto a los epítopos C1 y C2, no se encontraron diferencias significativas entre pacientes y controles. Estos resultados son concordantes con la ausencia de asociación independiente de las moléculas HLA-C publicadas por nuestro grupo (Tesis Doctoral de Marta Conde Jaldón, 2014; Ortiz Fernández et al., 2016), y otros (Ombrello et al., 2014), aunque discrepantes de alguno que sugiere asociación independiente del gen HLA-C (Hughes et al., 2013). Los trabajos anteriores no están enfocados al análisis de las moléculas HLA-C en cuanto a su función como ligandos de KIR, de hecho, hay muy pocos trabajos donde el análisis se realice con este objetivo. Middleton et al. (2007) analizaron los datos de C1 y C2 en función de la presencia de su receptor KIR, sin encontrar ninguna diferencia significativa entre los grupos analizados. Mohammad- Ebrahim et al. (2018) describieron asociación de riesgo con el epítopo C2, y, consecuentemente, protección de C1 en un análisis univariante realizado en una cohorte iraní, pero sin descartar que la asociación descrita se deba a desequilibrio de ligamiento entre alelos C2 y B51. Por tanto, y en relación con este apartado, los resultados del presente trabajo y de otros anteriores de nuestro grupo y otros, sugieren que, de los cuatro epítopos HLA-I ligandos de KIR mutuamente excluyentes, sólo A3/11 se encontraría asociado con BD independientemente de HLA-B*51, y que esta asociación tendría un carácter protector. Por el contrario, los modelos de asociación de B51, B57 y B51+57 explican mejor la predisposición que los modelos del epítopo Bw4 (Bw4 o Bw4-80Ile), aunque no se puede descartar que la interacción entre KIR3DL1 y Bw4 influya en la predisposición a BD ya que podría estar modulada por los aminoácidos presentes en otras posiciones localizadas fuera de este epítopo. En cuanto a los dos epítopos ligandos de KIR de moléculas HLA-C, C1 y C2, no parecen implicados en la enfermedad. En cuanto al análisis de la distribución de los genes KIR no se observaron diferencias significativas en la distribución de genes KIR, ni de los haplotipos AA y Bx. Hay que destacar que el número de estudios que analizan la dotación de genes KIR, y su distribución según haplotipos y genotipos en esta enfermedad, son muy escasos. DISCUSIÓN 78 Nuestros resultados son concordantes con la mayoría de los publicados, cuyas características principales se resumen en la tabla 34, que sugieren no asociación con BD (Middleton et al., 2007; Arayssi et al., 2009; Moon et al., 2013; Mohammad- Ebrahim et al., 2018). En cuanto al estudio de genotipos KIR, está condicionado por la gran diversidad de combinaciones posible y la escasa frecuencia de la mayoría de ellas. Así, en nuestro trabajo encontramos 51 genotipos distintos, pero sólo 12 presentaban una frecuencia superior al 2%. Encontramos que el genotipo 2 era sugestivo de asociación en nuestra cohorte con un efecto protector que se pierde al corregir por el número de comparaciones. Esta asociación no está descrita en otras cohortes, por lo que puede tratarse de un error tipo I (falso positivo). Entre las limitaciones, hay que mencionar también que muy pocos genotipos sobrepasaban el 10% de frecuencia, por lo que la potencia estadística es reducida, lo que puede condicionar este y otros trabajos, aumentando la posibilidad de cometer errores tipo II (falsos negativos). Entre los pocos trabajos que analizan la distribución de genotipos KIR en BD, Moon et al., no encontraron diferencias significativas, y Mohammad-Ebrahim et al., describieron asociación protectora del genotipo 3 (p= 0.04) sin corregir por el número de comparaciones. Tabla 34. Relación de publicaciones de estudios casos/control de genes KIR en BD Autor (año) Población Casos/controles Parámetro KIR Middleton (2007) Turca 134/154 Distribución de genes Arayssi (2009) Libanesa 43/120 Distribución de genes, genotipos y haplotipos Moon (2013) coreana 86/154 Distribución de genes, genotipos y haplotipos Erer (2016) Turca 1799/1710 Distribución de 3DL1/S1 MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 79 Mohammad- Ebrahim (2018) iraní 397/300 Distribución de genes y genotipos En cuanto a la distribución de genes KIR3DL1/S1 (receptor del epítopo Bw4), no se encontraron diferencias significativas entre pacientes y controles. Es importante señalar que los genes KIR3DL1 y 3DS1 se comportan como formas alélicas de un mismo gen y que, a efectos de nomenclatura, los alelos de ambos se nombran en una misma serie numérica: 3DL1*001 a 3DL1*009, 3DS1*010 a 3DS1*014, 3DL1*015…etc. Esta situación genera alguna confusión en la comparación entre trabajos; así, en los estudios de Middleton, Arayssi, Moon y Mohammad-Ebrahim, el análisis de KIR3DL1/S1 se realizó considerándolo como dos genes distintos, mientras que Erer et al., realizan el análisis como si se tratase de un gen único. En cualquier caso, nuestros resultados son concordantes con los trabajos citados, cuyos resultados se resumen en la tabla 35, ya que, en ninguno de ellos se observaron diferencias significativas. Tabla 35. Distribución (%) de 3DL1 y 3DS1 en pacientes y controles en estudios de BD Autor (año) BD Controles 3DL1 3DS1 3DL1 3DS1 Middleton (2007) 94.8 37.3 96.1 32.5 Arayssi (2009) 90.7 51.2* 95.8 37.5* Moon (2013) 95.3 41.9 94.2 36.4 Erer (2016) 92.9 42.7 93.4 41.0 Mohammad-Ebrahim (2018) 92.7 43.3 88.7 46.7 *p=0.08 DISCUSIÓN 80 Por tanto, en nuestros resultados y los de estos trabajos, no se encuentran evidencias de que la asociación de B51 con la enfermedad se deba a la distribución de sus genes que codifican su ligando KIR3DL1 o 3DS1. Sin embargo, como se señaló en la introducción, cada gen KIR tiene diferentes formas alélicas y, en algunos casos, se sabe que algunas de estas formas alélicas codifican proteínas con diferente expresión en membrana. A este respecto, nuestros resultados sugieren que el grupo 3DL1Exp, el cual incluye diversos alelos que codifican proteínas KIR3DL1 expresadas y con función inhibidora, puede asociarse como factor de riesgo a la enfermedad, ya que la frecuencia se encontraba aumentada en pacientes. Por el contrario, el grupo 3DL1Null, que incluye un único grupo de alelos, KIR3DL1*004, que codifican una proteína que no se encuentra (o se encuentra con baja expresión) en superficie, se comporta como un factor de protección, ya que su frecuencia se encontraba disminuida entre los pacientes. Por último, el alelo 3DS1, que codifica proteínas activadoras, no se asociaría a la enfermedad, ya que su distribución era semejante en pacientes y controles. En el análisis de genotipos, el efecto de riesgo de 3DL1Exp sólo se observa en los homocigotos, perdiéndose la significación al corregir por el número de comparaciones. En cuanto a 3DL1Null, el efecto protector alcanza la significación en heterocigotos 3DL1Null/3DS1, pero no en homocigotos, probablemente debido al escaso número de individuos con esa condición. Esta asociación parece independiente de B51, ya que las tendencias son similares en los grupos B51 positivos y negativos, aunque la significación estadística se pierde al estratificar, probablemente debido a la pérdida de potencia estadística. Hasta donde sabemos, a parte del nuestro, sólo se ha publicado un estudio analizando los genotipos funcionales de 3DL1/S1 (Petrushkin et al., 2019). Este trabajo incluye una cohorte de 267 pacientes de distintas procedencias y 445 controles. Estos autores no encontraron diferencias significativas en la distribución de los grupos alélicos 3DL1 y 3DS1 entre pacientes y controles. En cuanto al estudio de alelos funcionales de 3DL1/S1, los resultados de nuestro trabajo y el de Petrushkin et al. no son totalmente comparables. En el estudio de Petrushkin et al. el grupo 3DL1Exp está subdividido en MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 81 3DL1High y 3DL1Low en función de su expresión en membrana. Estos autores describen diferencias significativas en la distribución del genotipo 3DL1Low/3DS1, de riesgo, y del genotipo 3DL1High/3DL1Null, de protección. Las frecuencias alélicas se pueden deducir de los datos aportados en el trabajo y la asociación encontrada en esta cohorte para 3DL1Null es similar a la que encontramos en nuestro estudio, es decir, de protección, aunque la significación estadística sólo se alcanza en nuestra cohorte. Hay algunas discordancias entre ambos estudios, ya que, según nuestro trabajo, 3DL1Exp podría ser un factor de riesgo puesto que alcanza significación estadística sin corrección; mientras que en el trabajo de Petrushkin et al., es 3DS1 el que se detecta como posible factor de riesgo. Una de las razones en las que puede basarse esta discordancia, es que, en nuestro trabajo, todos los alelos que codifican moléculas expresadas inhibidoras se englobaron en un único grupo, 3DL1Exp, mientras que en el estudio de Petrushkin et al., se encuentran divididos en dos grupos, 3DL1High y 3DL1Low. Otros motivos pueden ser las diferencias en los grupos étnicos estudiados, ya que la cohorte de Petrushkin et al. está compuesta por individuos precedentes de varios continentes, y nuestro trabajo es sobre población española; los métodos de tipaje, y la estratificación de cohortes relativamente pequeñas también pueden influir en las discrepancias encontradas. Sin embargo, resaltar de nuevo que ambos estudios concuerdan en el papel protector de 3DL1Null, o lo que es lo mismo, 3DL1*004 en la enfermedad. Las formas funcionales de KIR3DL1/S1 se han estudiado en distintas enfermedades inmunomediadas como lupus (Doi et al., 2019), poliangeitis microscópica (Tsuchiya et al., 2012) y esclerosis múltiple (Hollenbach et al., 2016), siendo en nuestro caso de particular interés los publicados en psoriasis (Ahn et al., 2016) y espondilitis anquilosante (Díaz Peña et al., 2010), ya que se trata de patologías de patrón mixto, asociadas a moléculas HLA-I como BD. El trabajo en psoriasis incluye una cohorte de 203 pacientes americanos de ancestros europeos, cuyos resultados sugieren que 3DL1*004 se comporta como factor de protección independiente de Bw4. En cuanto al trabajo en espondilitis, incluye 270 pacientes procedentes de dos cohortes españolas y DISCUSIÓN 88 (9Leu), pero el aminoácido en posición 2 pude ser Met o Thr. Los nonapéptidos 2Met se unen a HLA-E más eficientemente que los 2Thr. Los nonapéptidos derivados de moléculas HLA-A y C son todos 2Met, pero los derivados de HLA-B pueden ser 2Met (P5 en este estudio) ó 2 Thr (P6 y P7 en este trabajo). Los individuos con HLA-B-2Met tendrán una mayor expresión de HLA-E en superficie y, consecuentemente, propiedades inhibitorias más potentes en las células NK a través de la unión a los receptores inhibidores. Nuestros resultados no sustentan que la asociación de las moléculas HLA-B se deba a la modulación de la expresión de moléculas HLA-E en superficie, ya que, las diferencias detectadas en la distribución del polimorfismo 2Met/Thr es dependiente de HLA-B51 (2Thr). Con respecto a los residuos secundarios de anclaje (posiciones 3, 6 y 7 del nonapéptido), que podrían modificar la afinidad de los nonapéptidos 2Met y por tanto la expresión de HLA-E en membrana, nuestros resultados no sugieren ninguna influencia de estas posiciones. P1, P2, P3 y P8 tiene la misma secuencia en estos residuos (3Ala 6Thr 7Leu), P3 que es poco frecuente y P8 que es más común, no se encontraron asociados y P1 y P2 se encuentran asociados, pero en sentidos opuestos. Con respecto al segundo aspecto, los nonapéptidos son factores indispensables para la unión de HLA-E a sus receptores (Braud et al., 1997; Lee et al., 1998; Valés-Gómez et al., 1999; Saunders et al., 2015). Se ha demostrado que cambios específicos en la conformación del nonapéptido afectan profundamente al reconocimiento del complejo HLA-E/péptido por parte de los receptores CD94-NKG2 (Hoare et al., 2008) y que la secuencia del nonapéptido determina la magnitud de la desgranulación de las células NK NKG2A+ (Lauterbach et al., 2015; Braud et al., 1998; Maier et al., 2000; Miller et al., 2003). Las posiciones relevantes en la interacción del complejo HLA- E/nonapéptido con el receptor son los residuos 4, 5 y 8, que están totalmente expuestos, mientras que los residuos 1 y 6 están menos expuestos. Estudios mutacionales sugieren que el residuo invariable 5Arg y el residuo hidrofóbico variable de la posición 8 son los contactos principales para CD94/NKG2A. Así, mutaciones en la posición 5 tienen la capacidad de abortar la interacción con NKG2A (Michaelsson et al., MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 89 2002; Miller et al., 2003; Cheent et al., 2013) y se ha descrito que las 4 últimas posiciones del extremo C terminal del péptido interactúan con CD94 y modifican entre 8 y 29 veces la afinidad por NKG2, atribuyendo el máximo efecto a la posición 8 (Kraft et al., 2000; Kaiser et al, 2005; Miller et al., 2003). Modelos de interacciones complejas sugieren que, incluso las sustituciones conservadas en la posición 8 del nonapéptido afectan significativamente a la afinidad del ligando por sus receptores (Miller et al., 2003). Los nonanéptidos derivados de HLA-B son todos 8Leu, sin embargo, los nonapéptidos derivados de HLA-A, se dividen en 2 grupos, 8 Leu (P1, protección) y 8 Val (P2, riesgo). Esta sustitución implica un residuo de menor tamaño, y podría ser la causa de un peor reconocimiento por el receptor, lo que conllevaría a una menor interacción entre NKG2/CD94 y el complejo HLA-E/péptido. En este sentido, hay estudios que demuestran que HLA-E-VMAPRALLL (P9), derivado de células HLA-C*07, es pobremente reconocido por NKG2/CD94, mientras que la interacción con HLA-E- VMAPRTLFL, derivado de células HLA-G*01, es la más fuerte (Kaiser BK et al, 2005). Se ha sugerido que el mayor tamaño del residuo hidrofóbico que origina la 8Phe puede ser la causa de este reconocimiento preferencial. En este sentido, la sustitución de Leu por Val, como es el caso de la secuencia de P2, originaría un residuo de menor tamaño aún que podría ser la causa de un peor reconocimiento por el receptor (Hoare et al., 2008). En un estado de infección vírica donde predominen señales activadoras con células NK NKG2C, la reducida capacidad de interacción del complejo HLA-E/péptido con su receptor, implicaría un peor aclaramiento viral y mayor probabilidad de perpetuar un estado proinflamatorio que favoreciera el desencadenamiento de la enfermedad. Aunque algunas de las moléculas HLA-C tienen la forma P1, el bajo número no permite un análisis estadístico independiente. Además, una de estas moléculas HLA-C (C15) tiene un fuerte desequilibrio de ligamiento con B51, lo que dificultaría la interpretación de los resultados. Los nonapéptidos derivados de HLA-C de los grupos P9 y P10 son, al igual que los de P1, 2Met y 8Leu, la falta de asociación observada en estos casos puede ser debida a la pobre expresión de moléculas HLA-C comparada con las de HLA-A y B, y específicamente a la descrita para las moléculas DISCUSIÓN 90 codificadas por alelos del grupo C*07 que son las más frecuentes de las incluidas en estos grupos. Por lo tanto, nuestros resultados apoyan que la asociación con BD descrita en la región HLA-A en diferentes estudios estaría relacionada con el control de la actividad de NK a través de la interacción del ligando HLA-E-péptido y del receptor NKG2, pero solo en pacientes B51 negativos. Hay evidencia de dos formas de haplotipo HLA predominantes; una que proporciona preferentemente ligandos CD94/NKG2A y la otra que proporciona ligandos KIR (Saunders et al., 2015; Horowitz et al., 2016). Muchas moléculas HLA-B con nonapéptidos derivados de 2Thr tienen el epítopo Bw4, por lo que son ligandos de KIR3DL1. Por el contrario, la mayoría de las moléculas 2Met HLA-B no son ligandos de KIR. Al respecto, estudios funcionales sugieren que los individuos Met/Met o Met/Thr tienen células NK mejor educadas, fenotípicamente más diversas y funcionalmente más potentes que las de los individuos Thr/Thr (Horowitz et al., 2016). HLA-B51 es una molécula 2Thr HLA-B con el epítopo Bw4, como muchos de los incluidos en los grupos P6 y P7. Estudios de nuestro grupo y de otros anteriormente discutidos, sugieren diversos mecanismos por los cuales la interacción HLA-Bw4-KIR puede estar involucrada en la susceptibilidad a BD, pero no respaldan un modelo en el que la asociación HLA-B esté relacionada con la actividad de control de NK a través de CD94/NKG2A. En cuanto a las moléculas HLA-C, todas suministran nonapéptidos a CD94/NKG2A y son ligandos KIR, nuestros resultados descartan la asociación de estas moléculas HLA y no sugieren relación con ninguno de estos dos mecanismos de control. La falta de asociación con moléculas HLA-C puede estar relacionada con su baja expresión comparada con las de las otras moléculas HLA clásicas. Todas las moléculas HLA-A son 2Met y por tanto son eficientes suministradoras de péptidos a HLA-E. Además, el grupo P2 incluye varias moléculas con el epítopo Bw4 (A23, 24, 25 y 26), mientras que P1 contiene solo una molécula Bw4 (A32) y otras dos moléculas HLA, A3 y A11, son ligandos de otro KIR (KIR3DL2). Por lo tanto, todas las moléculas HLA-A MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 91 suministran ligandos CD94/NKG2A, pero solo algunas son ligandos KIR. Nuestros resultados respaldan la asociación de la región HLA-A con BD en individuos B51 negativos acorde con su función como ligandos CD94/NKG2A. Estos resultados también sugieren que un mecanismo distinto operaría en individuos B51 positivos y negativos, con un mayor peso de las interacciones HLA-KIR entre los positivos y de las interacciones CD94/HLAE-NKG2A entre los negativos. En este sentido hay que destacar la asociación de HLA-A3 que está incluido en el grupo P1 sería el factor de protección en individuos B51, pero que dicha asociación se pierde en el grupo B51 negativo, quedando como factor de protección P1. Estos resultados pueden respaldar una base diferente en el papel protector de esta molécula, basada en, la selección de células NK KIR3DL2 licenciadas en B51 positivos, y en su función como ligando CD94/NKG2A en individuos B51 negativos. En cuanto al polimorfismo HLA-E, aunque existe un número considerable de alelos, concretamente 342 que codifican 139 proteínas diferentes (fuente: https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/about/statistics/, consultado 13/11/2022), la mayoría se consideran variantes raras o proteínas no funcionales, representando los grupos 01:01 y 01:03 prácticamente el 100% de los descritos en otras poblaciones humanas (Sharpe et al., 2019). Nuestros resultados no sugieren asociación con la enfermedad en ninguno de los modelos de herencia, aunque existe una tendencia a una frecuencia ligeramente superior de HLA-E*01:01 entre pacientes. Estudios anteriores que han encontrado asociación del dimorfismo de HLA-E con distintas enfermedades inmunomediadas como espondilitis anquilosante (Paladini et. Al, 2009), artritis reumatoide (Iwaszko et al., 2015) y psoriasis (Zeng et al., 2013), aunque en otros casos no encuentra asociación en espondilitis anquilosante (Santos et al., 2018), o se han publicado resultados contradictorios como sucede en el caso del pénfigo vulgar (Bhanusali et al., 2013; Altun et al., 2017), por lo que no existen evidencias claras de asociación del dimorfismo de HLA-E en estas enfermedades. En cuanto a la predisposición a BD, Park et al. (2007), en una cohorte coreana, sugieren asociación de protección con el genotipo HLA-E*01:01 , 01:01, en nuestras cohorte no se DISCUSIÓN 92 encontraron diferencias significativas y en cualquier caso la tendencia sería contraria. Las discordancias en los resultados de ambos trabajos pude ser debida a diferencias en las cohortes, los métodos de tipaje y a la etnicidad. En cualquier caso, nuestros resultados no sustentan relevancia del polimorfismo HLA-E en la susceptibilidad a BD. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 94 1) Nuestros resultados sugieren que, la predisposición a la enfermedad de Behçet vinculada con moléculas HLA de clase I puede estar relacionada, al menos en parte, con la función de estas moléculas como controladoras del repertorio y la actividad de las células NK, como ligandos de los receptores KIR y como moduladores de la función de NKG2/CD94 a través de los complejos HLA-E/nonapéptido. 2) En cuanto a la función de las moléculas HLA clásicas como ligandos de receptores KIR, nuestros resultados sugieren que, de los cuatro epítopos ligandos de KIR mutuamente excluyentes: el epítopo A3/11 se asociaría con la enfermedad, no descartan un efecto del par Bw4/KIR3DL1 al que contribuyeran posiciones aminoacídicas situadas fuera del epítopo Bw4 y descartan influencia de los epítopos C1 y C2 derivados de moléculas C. 3) En cuanto al papel de las moléculas HLA I clásicas como moduladoras de la función de HLA-E, nuestros resultados sostienen que, en individuos B51 negativos, la relación de determinadas moléculas HLA-A con la enfermedad puede estar relacionada con el control de la actividad NK a través de la interacción de complejos HLA-E/nonapéptido con NKG2/CD94. Asimismo, los análisis multivariantes descartan que los nonapéptidos derivados de moléculas HLA-B y C influyan en la predisposición a la enfermedad a través de este mecanismo. 4) El estudio de dotación de genes KIR no sugiere asociación con la predisposición a padecer la enfermedad, aunque no puede descartarse un papel del polimorfismo a nivel alélico debido al elevado número de variantes que presentan los genes KIR. De hecho, nuestros resultados sugieren que la variante funcional 3DL1*004 podría tener un papel protector en el desarrollo de la enfermedad. MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y RECEPTORES NK EN LA ENFERMEDAD DE BEHÇET 95 5) Los diferentes modelos analizados no sugieren asociación de dimorfismo HLA-E con la enfermedad. 6) Globalmente, nuestros resultados sugieren que los mecanismos de selección del repertorio y control de células NK que operarían en individuos con y sin moléculas HLA de riesgo podrían ser diferentes, con un mayor peso de las interacciones HLA-KIR entre los primeros y de las interacciones CD94/HLAE-NKG2A entre los segundos. PERSPECTIVAS BIBLIOGRAFÍA 104 Hamzaoui K, Ayed K, Hamza M, Touraine JL. Natural killer cells in Behçet’s disease. Clin Exp Immunol. 1988; 71:126–31. Hasan MS, Ryan PL, Bergmeier LA, Fortune F. Circulating NK cells and their subsets in Behçet's disease. Clin Exp Immunol. 2017; 188(2):311-322. Hayashi T, Imai K, Morishita Y, Hayashi I, Kusunoki Y, Nakachi K. 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KIR BD Controls PPc n=435 (%) n=439 (%) Genes 2DL1 416 (95.6) 422 (96.1) 2DL2 270 (62.1) 267 (60.8) 2DL3 373 (85.7) 382 (87.0) 2DL4 435 (100) 439 (100) 2DL5A/2DL5B 241 (55.4) 261 (59.4) 2DP1 416 (95.6) 423 (96.4) 2DS1 174 (40.0) 194 (44.2) 2DS2 269 (61.8) 262 (59.7) 2DS3 156 (35.9) 153 (34.8) 2DS4 408 (93.8) 421 (95.9) 2DS5 141 (32.4) 168 (38.3) 3DL1 409 (94.0) 422 (96.1) 3DS1 181 (41.6) 192 (43.7) 3DL2 435 (100) 439 (100) 3DL3 435 (100) 439 (100) 3DP1 435 (100) 439 (100) Haplotypes n=435 (%) n=439 (%) AA 109 (25.1) 100 (22.8) Bx 326 (74.9) 339 (77.2) Genotypes n=435 (%) n=439 (%) 1 109 (25.1) 100 (22.8) 2 38 (8.7) 62 (14.1) 0.01 >0.05 3 23 (5.3) 21 (4.8) 4 65 (14.9) 63 (14.3) 5 39 (9.0) 45 (10.2) 6 26 (6.0) 36 (8.2) 7 18 (4.1) 16 (3.6) 13 10 (2.3) 4 (0.9) 70 9 (2.1) 5 (1.1) 71 8 (1.84) 12 (2.7) 72 14 (3.2) 11 (2.5) 73 12 (2.8) 10 (2.3) The resta64 (14.7) 54 (12.3) aGenotypes with a frequency lower than 2%. frequently represented in patients than in controls (8.7 vs. 14.1%, respectively, P=0.01, Pc >0.05; OR 0.58; 95% CI 0.38–0.89). Functional KIR Polymorphyms Data regarding the polymorphism of KIR3DL1/S1 are displayed in Table 3. The distribution of individuals KIR3DL1/S1 was not significantly different in patients and controls (KIR3DL1+DS1+ 35.6 vs. 39.9%, KIR3DL1+DS1– 58.3 vs. 56.3%, KIR3DL1-DS1+ 6.0 vs. 3.9%, respectively). Nevertheless, the distribution of the genotypes of rs149123986 was significantly different in both groups (p=0.01 in 2 ×3 contigency Table) with an overrepresentation of AA in patients (73.5% vs. 64.3 in controls, Pc = 0.006; OR =1.54; 95% CI 1.16–2.07) and a down-representation of AG (23.0 vs. 31.7%, Pc =0.015, OR =0.65; 95% CI 0.48–0.88). The distribution of the individuals in the six possible groups taking into account both, the KIR3DL1/S1 and the rs149123986, was different in patients and controls (p=0.002 in 2 ×6 Table) with down-representation of 3DL1Null/3DL1 (6.2 vs. 11.4%, p= 0.007, Pc =0.042; OR =0.51; 95% CI 0.32–0.84) and a trend to an over-representation of 3DL1Exp/3DL1Exp (38.1 vs. 31.9%, p=0.052) individuals among patients. The distribution of the three allele groups: 3DL1Exp, 3DL1Nul, and 3DS1 was different in patients and control (p=0.01, in 2 ×3 contigency Table) having the group of patients a decreased frequency of 3DL1Null (0.15 vs. 0.20, P=0.005, Pc =0.015; OR =0.70; 95% CI 0.54– 0.90) and a slight increased frequency of 3DL1Exp (0.61 vs. 0.56, P=0.03, Pc >0.05). Results were similar among B51 positive and negative individuals with a suggestive down-representation of 3DL1Null/3DLS1 in both groups (B51positive: 5.9% in patients vs. 15.9% in controls P=0.009 Pc >0.05; OR =0.34; 95% CI 0.13–0.83 and B51 negative: 6.4% in patients vs. 10.5% in controls P=0.04 Pc >0.05; OR =0.58; 95% CI 0.3–1.05) (Table 4). Regarding the deletion of 22 bp of 2DS4, differences in the distribution of individuals with at least one copy of the 2DS4Full between patients and controls were not detected (42.7 vs. 37.5%, P=0.13). Since 2DS4 is the only activator binding classical HLA molecules in AA individuals, patients and controls were stratified according to their haplotype group in AA or Bx but no differences were detected (Data not showed). DISCUSSION The main finding of this study is the association of the KIR3DL1∗004 with susceptibility to BD. This allele is protective in the development of the disease and, according to our results, its effect is independent of HLA-B51. Previous studies analyzed the relationship between the distribution of the KIR genes and the disease. Similarly to our results, no differences between patients and controls have been reported in these studies (12–15). Only one of these studies, performed in the Iranian population, investigated KIR genotypes. That study reported a different distribution of various KIR genotypes, including genotype 2, although the direction of the association was contrary to that found in the present study (15). KIR3DL1/DS1 has focused on interest because of its function as the receptor of the Bw4 epitope. The distribution of KIR3DL1 and 3DS1 in BD was evaluated in a large cohort of Turkish. Similarly to our results, no association was found in the whole cohort neither in subgroups with B51, Bw4, or Bw4- 80I (16) but this study did not investigate variants on this gene. Variants in KIR3DL1 have been reported as associated with the disease in two high throughput studies (10,17), although none of them was designed to investigate the possible involvement of functional variants in this disease. Very recently, during the submission of this paper, a study that addresses this question in a smaller cohort composed of ethnicallymixed patients and controls was published (18). The main conclusion of that study is the same as ours, an association of the functional alleles of KIR3DL1, independent of HLA- B51 with the disease. Nevertheless, they are some discrepancies Frontiers in Immunology | www.frontiersin.org 4November 2019 | Volume 10 | Article 2755 Castaño-Núñez et al. KIR, HLA-Ligand, and Behçet’s Disease TABLE 3 | Frequency of the KIR3DL1/DS1 functional polymorphism in BD patients and controls. KIR rs149123986 BD Controls PPc OR (95%CI) 3DL1 3DS1 n =435 % n=439 % +– AA 3DL1Exp/3DL1Exp 166 38.1 140 31.9 0.05 >0.05 +– AG 3DL1Exp/3DL1Null 74 17.0 89 20.3 + + AA 3DL1Exp/3DS1 128 29.4 125 28.5 +– GG 3DL1Null/3DL1Null 14 3.2 18 4.1 + + AG 3DL1Null/3DS1 27 6.2 50 11.4 0.007 0.042 0.51 (0.32–0.84) -+AA 3DS1/3DS1 26 6.0 17 3.9 AF AF 3DL1Exp 534 0.61 494 0.56 0.03 >0.05 3DL1Null 129 0.15 175 0.20 0.005 0.015 0.7 (0.54–0.90) 3DS1 207 0.24 209 0.24 >0.05 >0.05 AF, allelic frequency. Bold values are those statistically significant after correction. TABLE 4 | Frequency of the KIR3DL1 functional polymorphism in BD patients and controls stratified according to the HLA-B51. B51+B51– BD Controls BD Controls 185 69 250 370 n%n%n%n% 3DL1Exp/3DL1Exp 76 41.1 25 36.2 90 36.0 115 31.1 3DL1Exp/3DL1Null 28 15.1 11 15.9 46 18.4 78 21.1 3DL1Exp/3DS1 53 28.7 19 27.5 75 30.0 106 28.6 3DL1Null/3DL1Null 7 3.8 3 4.3 7 2.8 15 4.1 3DL1Null/3DS1 11 5.9 11 15.9 16 6.4 39 10.5 3DS1/3DS1 10 5.4 0 0.0 16 6.4 17 4.6 3DL1Exp 233 0.63 80 0.58 301 0.60 414 0.56 3DL1Null 53 0.14 28 0.20 76 0.15 147 0.20 3DS1 84 0.23 30 0.22 123 0.25 179 0.24 in the associated genotypes between these two studies. When the allele frequencies of the study by Petrushkin et al. are deduced of their data, results are similar to ours regarding the allele KIR3DL1∗004, which is underrepresented in patients (with similar OR), although the statistical significance is only reached in our cohort. Nevertheless, we have opposite results concerning KIR3DL1Exp and KIR3DS1. In our cohort, the alleles that encode KIR3DL1Exp are significantly overrepresented among patients whereas, in its cohort, it is KIR3DS1 which tends to be overrepresented among patients. In our opinion, the distribution of the allelic frequencies reinforces the idea of association with the allele KIR3DL1∗004. Discrepancies could be due to different reasons, among them, methods used in KIR3DL1 genotyping, approaches, stratification of cohorts with a relatively small number of individuals and ethnical differences. Besides, there are previous studies in other class-I pathologies such as psoriatic disease (PD) and ankylosing spondylitis (AS), in which a protective association of the KIR3DL1∗004 allele has been reported (19–21). KIR3DL1∗004 encodes a misfolded receptor which is retained in the cell, although it has been described that a small quantity of folded protein can be exported to the membrane (22). One possible explanation to the protective effect of KIR3DL1∗004 in these pathologies is that this misfolded molecule retains intracellularly the corresponding class I-risk molecules. In this case, differences in the distribution of KIR3DL1∗004 among patients with and without the risk molecule would be expected, nevertheless, no differences were found in the present study neither in other pathologies (20,21,23) and no evidence supporting the intracellular interaction between KIR3DL1 and MHC class I molecules have been found (5). Interestingly, KIR3DL1∗004 is within a common telomeric haplotype Tel-A1-V which, also, bears two alleles encoding secreted receptors, KIR2DL4∗008 and KIR2DS4∗006 and another that encodes a membrane receptor KIR3DL2∗003/005/011/020 (24)3. Therefore, this Tel-A1-V haplotype, protective in BD, carries non-functional alleles with the only exception of KIR3DL2. Consequently, KIR3DL1∗004 could be a marker of the Tel-A1-V haplotype and the protective association found in our study could be explained by the fact that KIR3DL2 is the only functional gene in this haplotype. KIR3DL2 is an inhibitor framework gene, found in 100% of the population and it has many allelic forms encoding many different proteins (161 and 111, respectively, in the last database), the relative expression levels of these different proteins are unknown. The KIR3DL2 HLA-ligands are A3 and A11 and there is some evidence that KIR3DL2 can bind these HLA molecules in vivo (25). The education of the NK cells is based on the interaction between the inhibitory receptors and the self-MHC- I molecules, only those individuals bearing the HLA-ligand molecules have licensed NK cells that express the corresponding receptor and therefore, only the individuals A3 and A11 have mature NK cells expressing KIR3DL2. Noticeably, similarly to the findings in the present cohort, different studies in several populations have found a protective association of HLA-A3 with BD, independent of HLA-B51 (9,10,26). This protective effect 3https://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/sequenced_haplotypes.html Frontiers in Immunology | www.frontiersin.org 5November 2019 | Volume 10 | Article 2755 Castaño-Núñez et al. KIR, HLA-Ligand, and Behçet’s Disease of HLA-A3, not yet explained, could be based on the presence of licensed KIR3DL2 NK cells in these individuals. KIR molecules having 3 extracellular domains (KIR3DL1 and KIR3DL2) are pattern recognition receptors (PRR), they sense pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), specifically single-stranded microbial DNA molecules containing CpG motifs (CpG-ODN). KIR3DL2 binds CpG-ODN by the D0 domain and the complexes are internalized and recognized by TLR9 located in the endosomal compartment what results in cell activation. Nevertheless, in spite of KIR3DL1 binds CpG-ODN, the complexes are not internalized (27). Thus, one possible explanation to the protective effect of the Tel- A1-V haplotype is that the lack of expression of KIR3DL1 in these individuals permits a better efficiency to eliminate pathogens by KIR3DL2 NK cells. In other words, NK cells of individuals with the KIR3DL1Exp would be lesser efficient in eliminating pathogens resulting in a perpetuation of the release of inflammatory cytokines. In this sense, a protective effect of KIR3DL1∗004 against the progression of the VIH infection to AIDS has been described (28). This mechanism would explain why the association is independent of B51 and Bw4 in our study but also psoriasis. Moreover, some HLA-Bw4 molecules, such as B27 (associated with ankylosis spondylitis) and B51 could be more efficient to license KIR3DL1 NK cells and this could be related to its association with inflammatory diseases. In this sense, the activity of ERAP1, an enzyme that has been related in an epistatic way with the HLA molecules involved in these pathologies and that can conditioner the repertoire of peptides binding to them, could modify the role of the diverse HLA-Bw4 molecules in these diseases (29). Lastly, the Tel-A1-V haplotype includes KIR2DS4∗006, which has the deletion of 22 base pairs, but according to our results, this deletion does not influence the disease susceptibility. In conclusion, our results suggest a protective role of a telomeric KIR haplotype with only one functional gene in BD. Therefore, the education of the NK cells depending on the HLA, the balance of licensed KIR3DL1/KIR3DL2 NK cells and the different capacities of these receptors to eliminate pathogens could be involved in the etiopathogenesis of BD. DATA AVAILABILITY STATEMENT The raw data supporting the conclusions of this article will be made available by the authors, without undue reservation, to any qualified researcher. ETHICS STATEMENT The studies involving human participants were reviewed and approved by CEI de los Hospitales Universitarios Vírgen Macarena-Virgen del Rocío. The patients/participants provided their written informed consent to participate in this study. AUTHOR CONTRIBUTIONS M-FG-E: experimental design. ÁC-N: experimental procedures performance. M-AM-C and J-RG-L: experimental support. ÁC-N, M-AM-C and M-FG-E: data analysis and preparation of the manuscript. NO-C, F-JG-H, GE, GG-G, JS-B, M-RJ, RS, RB, A-CB-M, RG, PF, MR-C, LR-R, TC, SC, J-JA-S, and JM: samples and clinical data providers. FUNDING This work was supported by Fondo de Investigaciones Sanitarias, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, 13/01118 and 16/01373), Fondos FEDER and Plan Andaluz de Investigación (CTS-0197). REFERENCES 1. 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The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) and the copyright owner(s) are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms. Frontiers in Immunology | www.frontiersin.org 7November 2019 | Volume 10 | Article 2755 The complex HLA-E- nonapeptide in Behcet disease A ´ ngel Luı ´s Castaño-Nu ´ñez 1 , Marco-Antonio Montes-Cano 1 , Jose ´-Rau ´lGarcı ´a-Lozano 1 , Norberto Ortego-Centeno 2 , Francisco Jose ´Garcı ´a-Herna ´ndez 3 , Gerard Espinosa 4 , Genaro Graña-Gil 5 , Juan Sa ´nchez-Burso ´n 6 , Marı ´a Rosa Julia ´ 7 , Roser Solans 8 , Ricardo Blanco 9 , Ana-Celia Barnosi-Marı ´n 10 , Ricardo Go ´mez de la Torre 11 , Patricia Fanlo 12 , Mo ´nica Rodrı ´guez-Carballeira 13 , Luis Rodrı ´guez-Rodrı ´guez 14 , Teresa Camps 15 , Santos Castañeda 16 , Juan-Jose Alegre-Sancho 17 , Javier Martı ´n 18 and Marı ´a Francisca Gonza ´lez-Escribano 1 * 1 Department of Immunology, Hospital Universitario Virgen del Rocı ´o (IBiS, CSIC, US), Sevilla, Spain, 2 Department of Internal Medicine, Hospital Clı ´nico San Cecilio, Granada, Spain, 3 Department of Internal Medicine, Hospital Universitario Virgen del Rocı ´o, Sevilla, Spain, 4 Department Autoimmune Diseases, Hospital Universitari Clı ´nic, Barcelona, Spain, 5 Department of Rheumatology, Complejo Hospitalario Universitario A Coruña, Coruña, Spain, 6 Department of Rheumatology, Hospital Universitario de Valme, Sevilla, Spain, 7 Department of Immunology, Hospital Universitari Son Espases, Palma de Mallorca, Spain, 8 Department of Internal Medicine, Autoimmune Systemic Diseases Unit, Hospital Vall d’Hebron, Universidad Autonoma de Barcelona, Barcelona, Spain, 9 Department of Rheumatology, Hospital Universitario Marque ´s de Valdecilla, Santander, Spain, 10 Department of Internal Medicine, Complejo Hospitalario Torreca ´rdenas, Almerı ´a, Spain, 11 Department of Internal Medicine, Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo, Spain, 12 Department of Internal Medicine, Hospital Virgen del Camino, Pamplona, Spain, 13 Deparment of Internal Medicine, Hospital Universitari Mu ´tua Terrassa, Terrassa, Spain, 14 Department of Rheumatology, Hospital Clı ´nico San Carlos, Madrid, Spain, 15 Department of Internal Medicine, Hospital Regional Universitario de Ma ´laga, Ma ´laga, Spain, 16 Department of Rheumatology, Hospital de la Princesa, IIS-Princesa, Madrid, Spain, 17 Department of Rheumatology, Hospital Universitario Doctor Peset, Valencia, Spain, 18 Instituto de Parasitologı ´a y Biomedicina “Lo ´pez-Neyra”, CSIC, PTS Granada, Granada, Spain Introduction: The knowledge of the aetiology of Behçet disease (BD), an immune-mediated vasculitis, is limited. HLA-B, mainly HLA-B51, and HLA-A molecules are associated with disease, but the ultimate cause of this association remains obscure. There is evidence that NK cells participate in the etiopathology of BD. NK cells have activator and inhibitor surface receptors, like the KIR and the NKG2 families. Classical HLA-class I molecules (A, B and C) are keys in the activity control of the NK because they are KIR ligands. Most NKG2 receptors bind HLA-E, which presents only nonapeptides derived from the signal peptide of other class-I molecules. Objective: This study investigates the contribution of the pair HLA-E and ligand, nonapeptide derived from the 3-11 sequence of the signal peptides of class I classical molecules, to the susceptibility to BD. Methods: We analyzed the frequency of the HLA-derivated nonapeptide forms in 466 BD patients and 444 controls and an HLA-E functional dimorphism in a subgroup of patients and controls. Results: In B51 negative patients, the frequency of VMAPRTLLL was lower (70.4% versus 80.0% in controls; P=0.006, Frontiers in Immunology frontiersin.org01 OPEN ACCESS EDITED BY Fernando Gabriel Chirdo, CONICET Instituto de Estudios Inmunolo ´gicos y Fisiopatalo ´gicos (IIFP), Argentina REVIEWED BY A. Raj Kumar Patro, Kalinga Institute of Medical Sciences (KIMS), India Daniel E. Geraghty, Fred Huchinson Cancer Research Center, United States Johannes Nowatzky, New York University, United States Efe Sezgin, Izmir Institute of Technology, Türkiye *CORRESPONDENCE Marı ´a Francisca Gonza ´lez-Escribano mariaf.gonzalez.sspa@ juntadeandalucia.es RECEIVED 25 October 2022 ACCEPTED 04 July 2023 PUBLISHED 10 August 2023 CITATION Castaño-Nu ´ñez A ´L, Montes-Cano M-A, Garcı ´a-Lozano J-R, Ortego-Centeno N, Garcı ´a-Herna ´ndez FJ, Espinosa G, Graña-Gil G, Sa ´nchez-Burso ´nJ,Julia ´MR, Solans R, Blanco R, Barnosi-Marı ´n A-C, Go ´mez de la Torre R, Fanlo P, Rodrı ´guez-Carballeira M, Rodrı ´guez-Rodrı ´guez L, Camps T, Castañeda S, Alegre-Sancho J-J, Martı ´n J and Gonza ´lez-Escribano MF (2023) The complex HLA-E-nonapeptide in Behc¸et disease. Front. Immunol. 14:1080047. doi: 10.3389/fimmu.2023.1080047 COPYRIGHT ©2023Castaño-Nu ´ñez, Montes-Cano, Garcı ´a-Lozano, Ortego-Centeno, Garcı ´a-Herna ´ndez, Espinosa, Graña-Gil, Sa ´nchez-Burso ´n, Julia ´,Solans,Blanco, Barnosi-Marı ´n, Go ´mez de la Torre, Fanlo, Rodrı ´guez-Carballeira, Rodrı ´guez-Rodrı ´guez, Camps, Castañeda, Alegre-Sancho, Martı ´n and Gonza ´lez-Escribano. This is an openaccess article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) and the copyright owner(s) are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms. TYPE Original Research PUBLISHED 10 August 2023 DOI 10.3389/fimmu.2023.1080047 Pc=0.04, OR=0.60, 95%CI 0.41-0.86), and the frequency of VMAPRTLVL was higher (81.6% versus 71.4% in controls; P=0.004, Pc=0.03, OR=1.78, 95%CI 1.20-2.63). In homozygosity, VMAPRTLLL is protective, and VMAPRTLVL confers risk. The heterozygous condition is neutral. There were no significant differences in the distribution of the HLA-E dimorphism. Discussion: Our results explain the association of BD with diverse HLA-A molecules, reinforce the hypothesis of the involvement of the NK cells in the disease and do not suggest a significant contribution of the HLA-E polymorphism to disease susceptibility. KEYWORDS Behc¸et disease, gene association, classical HLA Class I molecules, HLA-E, NK cells Introduction Behcet disease (BD) [Mendelian Inheritance in Man, MIM, 109650] is a complex and immune-mediated systemic syndrome featured by inflammatory lesions of various blood vessels throughout the body (most frequently small vessels). This chronic inflammation results in diverse clinical phenotypes: recurrent oral and genital ulceration, ocular involvement (mainly uveitis), skin lesions and others. Although BD aetiology remains obscure, some data suggest that infectious agents and environmental factors may trigger the disease in genetically predisposed individuals (1). Likely in most immune-mediated diseases, the most substantial genetic contribution is located in the region of the Major Histocompatibility Complex (MHC, HLA in humans). Thus, one of the class I molecules, HLA-B51, associated with disease predisposition in different ethnic groups, is considered the most important genetic risk factor for this condition (2). Also, other HLA class I molecules are involved in susceptibility to BD (3–6). The ultimate cause of the association of HLA class I molecules and BD remain obscure. Diverse studies suggest that the natural killer (NK) cells participate in the etiopathology of the HLA class I-associated diseases (such as BD, spondyloarthritis and psoriasis) (7). NK cells are lymphocytes of the innate immune system with many activators and inhibitor receptors on their surface, like the Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor (KIR) family. The KIR ligands are HLA class I molecules, and the interaction between the pair ligandreceptor is fundamental for the NK repertory selection and the regulation of cell activity. All the classical HLA-class I molecules (HLA-A, B and C) present peptides to the CD8+ T cells, but not all are KIR ligands. Several studies suggest that this role of the HLA- class I molecules, particularly HLA-B, could explain, at least partially, their association with diseases (4,6,8). Besides KIR, other NK receptors control the activity of these cells. These type II- transmembrane proteins are a family of C-type lectin receptors, the NKG2 receptors, that form heterodimers with CD94 (CD94/NKG2). The human genes encoding the NKG2 receptors cluster in the natural killer complex (NKC) on chromosome 12. This protein family includes seven members: NKG2A, B, C, D, E, F and H, divided into inhibitory (NKG2A and B) and activating (NKG2 C, D, E, F and H) receptors according to their function. CD94 contains a short cytoplasmic domain, and it is responsible for signal transduction (9). CD94/NKG2 binds HLA-E, a human nonclassical HLA class I molecule, except NKG2D, which binds other nonclassical HLA class I molecules, such as MIC-A and MIC-B. HLA-E is structurally similar to classical MHC class I molecules but present a very restricted set of peptides. In physiological conditions, HLA-E binds only a nonapeptide derived from the 3-11 sequence of the signal peptides of some class I molecules: (HLA-A, some B, C and G) but not from others (HLA-F and HLA-E (10). The load of the peptide to the HLA-E in the endoplasmic reticulum regulates the cell surface complex expression. NK cells can indirectly monitor the expression of classical MHC class I molecules through the CD94/NKG2 interaction with HLA-E. Only the HLA molecules with a leader peptide capable of upregulating HLA-E surface expression confer resistance to NK cell-mediated lysis for the inhibitory receptor CD94/NKG2A, predominantly expressed on the surface of NK cells and CD8+ T-lymphocyte. So, HLA-E molecules are involved in both innate and adaptive immunity. The HLA-E CD94/NKG2 system modulates either inhibition or activation of the NK cell-mediated cytotoxicity and cytokine production. In infection conditions, HLA-E can present microbial-derived peptides from viruses or bacteria, inducing T- cell responses (11). Contrasting to the classical HLA class I genes, HLA-E is minimally polymorphic. There are hundreds of alleles described (12), but the most common are two non-synonymous and functional HLA-E alleles worldwide distributed with similar frequency in the human population (approximately 50% each). These two alleles, HLA-E*01:01 and HLA-E*01:03, encode two proteins with a single amino acid substitution Arg107Gly (a2 domain of the heavy chain) (13). These two alleles differ in their quantitative cell surface expression, having HLA-E*01:03 higher concentrations on transfected cells when compared to HLA- E*01:01 (14). A single nucleotide polymorphism (SNP), rs1264457, permits classifying the HLA-E alleles into two groups, the most common of which are HLA-E 01:01 and 01:03. Castaño-Nu ´ñez et al. 10.3389/fimmu.2023.1080047 Frontiers in Immunology frontiersin.org02 This study investigates the contribution of the pair HLA-E and ligand, nonapeptide derived from the 3-11 sequence of the signal peptides of class I classical molecules, to the susceptibility to BD. Materials and methods Study population The study included a total of 466 BD-unrelated patients (44.2% males) who fulfilled the 1990 International Study Group classification criteria for BD (15) and 444 unrelated healthy individuals (50% males) included in the control group. All the subjects were Spanish European recruited from 17 Spanish hospitals. The local ethical committees of the hospitals approved the study. All the study participants gave their written informed consent to participate. Clinical features of the patient group were the following: 100% had oral ulcers, 59.4% genital ulcers, 53.9% uveitis, 42% arthritis, 21% vascular, 18.2% neurological, 16.3% positive pathergy test and 15.4% gastrointestinal involvement. DNA extraction Peripheral blood collected in EDTA tubes (healthy controls and a set of the patients) or saliva (part of the patients) served as starting material. Genomic DNA was extracted according to the manufacturer’s recommendations using the QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Barcelona, Spain) and stored at −20°C until use. The purity of DNA was determined using a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA). Only DNA samples having a 260/280 absorbance ratio of 1.7-2.0 and a final concentration of 10-20 ng/ml were considered appropriate. We discarded 14 DNA samples from saliva that did not meet the quality criteria. Genotyping of HLA class I classical molecules The present study includes data from the HLA class I (A, B and C) genotypes obtained in previous works of our group (6,16). Briefly, we used a PCR-SSOP Luminex method (LABType SSO Class I A Locus Typing Test, LABType SSO Class I B Locus Typing Test and LABType SSO Class I C Locus Typing Test. One Lambda Inc., Canoga Park, CA) according to the manufacturer´s instructions to genotype. The DNA samples were PCR-amplified using group-specific primers (HLA-A, -B or -C). The biotinylated- PCR products were denatured and hybridized with specific probes bound to coloured-coded microspheres. Phycoerythrin conjugated to Streptoavidin was used to label and reveal reactions. The results were read in a flow analyzer, LABScanTM100, to quantify the fluorescence intensity on the microspheres. We used the HLA Fusion 2.0 software (One Lambda Inc) for the HLA-locus typing assignment. This method allows medium-resolution genotyping. Table 1 displays the criteria used in sample classification according to the HLA-class I molecules nonamer leader 3-11 peptide sequence (17). The different nonamers are named as “N”plus number. The analyses included only samples with complete typing data in all three HLA class I loci (435 patients and 444 controls) Genotyping of the dimorphism of HLA- E Genotyping of the rs1264457 (NM_005516.6: c.382A>G p.Arg128Gly correspond to mature protein codon 107) in a subgroup of 273 patients and 273 controls by using a TaqMan® SNP Genotyping Assay (Applied Biosystems, Barcelona, Spain) in a LightCycler 480 (Roche, Barcelona, Spain). For comparing purposes, we classified the samples according to their genotyping result as HLA-E01:01, 01:01 (rs1264457AA), HLA-E01:01, 01:03 (rs1264457AG) and HLA-E*01:03. 01:03 (rs1264457GG). TABLE 1 Classification of the samples according to the different forms of the 3-11 nonapeptide sequence of the leader fragment of their HLA-class I classical molecules. Group Sequence HLA-I allele groups N1 VMAPRTLLL A*01, *03, *11, *29, *30, *31, *32, *33, *36, *74; C*02, *15 N2 VMAPRTLVL A*02, *23, *24, *25, *26, *34:02, *43, *66, *68, *69 N3 IMAPRTLVL A*34:01 N4 VMPPRTLLL A*80 N5 VMAPRTVLL B*07, *08, *14, *38, *39, *42, *48, *67, *73, *81 N6 VTAPRTLLL B*13, *18, *27, *37, *40:02, *40:06, *44, *47, *54, *55, *56, *59, *82, *83 N7 VTAPRTVLL B*15, *35, *40:01, *41, *45, *46, *49, *50, *51, *52, *53, *57, *58, *78 N8 VMAPRTLIL C*01, *03, *04, *05, *06, *08, *12, *14, *16, *17:02 N9 VMAPRALLL C *07, *18 N10 VMAPQALLL C*17 except C*17:02 Only sequences 3-11 present in common alleles in Caucasians are listed. Other sequence variants are only in uncommon alleles. For each variant, the allelic groups listed are those in which the most common alleles have this sequence. The different nonamers are named as “N”plus number. Castaño-Nu ´ñez et al. 10.3389/fimmu.2023.1080047 Frontiers in Immunology frontiersin.org03 Statistical analysis Phenotypic and genotypic frequencies were estimated by direct counting. In the univariate analyses, we used c2. The P- values were corrected by Bonferroni adjustment (Pc), considering the number of tests in each case. The Pc-values<0.05 were considered statistically significant, and those with P-values<0.05 and Pc>0.05 were considered suggestive of association. EpiInfoTM software v 7.2.4.0 was used for the logistic regression analysis to calculate the odds ratios (ORs) and 95% confidence intervals (95% CI) (18). Results The study population is at Hardy–Weinberg equilibrium (p>0.05) for the polymorphisms studied. Supplementary Tables 1–3display the phenotypical frequencies of the classical- HLA molecules in our population in the whole cohort and individuals B51 negative and B51 positive. Association of the different nonamer forms with BD Table 2 shows the frequencies of all the sequences 3-11 in the leader peptide of the HLA classical class I molecules in BD patients and healthy controls in our population. According to the univariate analysis, N2 and N7 frequencies are higher, whereas N5 is lower in patients than controls. After adjustment, only the N2 association remains significant. Then, as an additional way to reduce the problem of multiple testing, we constructed an unconditioned logistic regression model (Supplementary Table 4) with all the peptide forms (N1-N10) as independent dichotomous variables. Similarly, to the results with the Bonferroni adjustment, N2 resulted as the only associated peptide (P=0.01). Nonamer forms in B51 positive and negative patients Next, because HLA-B*51 is the most consistently diseaseassociated risk factor, we constructed different regression models by conditioning each peptide on B51. As a result, there were associations only for N1 and N2 (Table 3). Then, we divided the cohort into B51 positive and negative groups (Table 4). In the B51 negative group, N2 was a risk factor, whereas N1 conferred protection. Both associations were still significant after multiple test corrections. On the contrary, in the B51 positive, there were no significant differences in the distribution of the different peptides. The model of association of N1 and N2 is recessive, being N1N1 the protective and N2N2 the risk factors in the B51 negative individuals (Table 5). Since different nonamer forms include BD-associated HLA molecules, we realized several conditional analyses. So, N1 contains A*03, a protective factor for susceptibility to BD, in various studies in several populations. For this reason, we conditioned N1 on HLA-A*03 in the B*51 positive and negative groups. In the case of B*51 positive, A*03 remains significant, and N1 lost statistical significance. Otherwise, in the B51 negative group, N1 remains significantwhileA*03lostthe association (Table 6). Another way, N2 includes A*02, A24 and A*26, which are HLA molecules associated with the disease in various studies. Conditioning N2 on these factors, in the group of B51 carriers, N2 lacks association in all the cases, and none of the HLA-A molecules mentioned above had an association. Nevertheless, among B51- negative, N2 remains associated with conditioning on A24 and A26. For A2 and N2, both factors lack association (Table 6). The functional 2-position of the nonapeptide and BD The nonapeptide position 2, which is polymorphic only in HLA-B molecules, is functionally relevant because the 2Met- HLA-B nonapeptides bind more efficiently to HLA-E when TABLE 2 Distribution of the nonapeptide-sequence types in BD patients and healthy controls. Peptide BD n= 435 %Controls n= 444 % P/Pc values OR (95% CI) N1 330 75.9 357 80.4 N2 360 82.8 328 73.9 0.001/0.01 1.70 (1.22-2.35) N3 2 0.5 0 0.0 N4 1 0.2 2 0.5 N5 163 37.5 204 46.0 0.01/0.1 0.70 (0.53-0.92) N6 211 48.5 233 52.5 N7 348 80.0 319 71.9 0.006/0.06 1.57 (1.15-2.15) N8 380 87.4 388 87.4 N9 159 36.6 169 38.1 N10 7 1.6 11 2.5 The table displays univariate analysis for each nonapeptide. Statistically significant comparisons are in bold. After adjustment by the number of tests, only N2 remains significantly associated. Pc is the adjusted P-value. Castaño-Nu ´ñez et al. 10.3389/fimmu.2023.1080047 Frontiers in Immunology frontiersin.org04 compared to the Thr variant. The distribution of this dimorphism in our cohort has significant differences between patients and controls in the univariate analysis, with risk association of 2Thr- HLA-B in a recessive model that became non-significant by correcting on B51 and also stratifying by B51 positive and negative (Supplementary Table 5). HLA-E polymorphism and BD Regarding polymorphism of HLA-E, although the patient group tends to have a higher frequency of the genotype 01:01, 01:01, there were no significant differences in the distribution of genotypes, phenotypes (dominant and recessive models) and alleles (Table 7). Neither when categorizing individuals in B51 positive and negative (Supplementary Table 6) nor stratifying by the different types of 3- 11 leader sequence peptides (Supplementary Table 7). Discussion This study investigates the contribution of the pair HLA-E and ligand, nonapeptide derived from the 3-11 sequence of the signal peptides of class I classical molecules, to the susceptibility to BD. TABLE 4 Distribution of the variants of the sequence 3-11 of the leader of the HLA class I classical molecules with frequency >5% in the B51 positive and negative groups. Peptide B51 positive B51 negative P/Pc OR (95% CI) BD (%) n= 185 Controls (%) n= 70 BD (%) n= 250 Controls (%) n= 374 N1 154 (83.2) 58 (82.9) 176 (70.4) 299 (80.0) 0.006/0.04 0.60 (0.41-0.86) N2 156 (84.3) 61 (87.1) 204 (81.6) 267 (71.4) 0.004/0.03 1.78 (1.20-2.63) N5 45 (24.3) 17 (24.3) 118 (47.2) 187 (50.0) N6 63 (34.1) 30 (42.9) 148 (59.2) 203 (54.3) N7* 185 (100) 70 (100) 163 (65.2) 249 (66.6) N8 156 (84.3) 56 (80.0) 224 (89.6) 332 (88.8) N9 51 (27.6) 14 (20.0) 108 (43.2) 155 (41.4) Nonapeptide variants univariate analysis among B51-positive and B51-negative individuals. * The N7 group includes B51. Statistically significant comparisons are in bold. Pc is the adjusted P-value. TABLE 3 Results of the analyses conditioning the forms of the sequence of the nonapeptide 3-11 of the leader of the HLA class I classical molecules with frequency >5% on B*51. Factor P value OR 95% CI B51 <10 -4 4.10 2.98-5.66 N1 0.02 0.66 0.47-0.93 B51 <10 -4 3.83 2.78-5.28 N2 0.02 1.51 1.07-2.12 B51 <10 -4 3.87 2.80-5.36 N5 0.54 B51 <10 -4 4.00 2.90-5.53 N6 0.68 B51 <10 -4 4.04 2.88-5.66 N7 0.72 B51 <10 -4 4.00 2.90-5.50 N8 0.46 B51 <10 -4 4.05 2.94-5.60 N9 0.34 Multivariate analysis of each nonapeptide conditioned on B51. Statistically significant comparisons are in bold. Castaño-Nu ´ñez et al. 10.3389/fimmu.2023.1080047 Frontiers in Immunology frontiersin.org05