Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón

Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 1 Trabajo Fin de Grado Grado en Ingeniería de las Tecnologías de Telecomunicación Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón Autor: Miriam del Rocío Sumariva Soto Tutor: Ramón de Jesús Risco Delgado Dpto. de Física Aplicada Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2020 Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 2 Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 3 Trabajo Fin de Grado Grado en Ingeniería de las Tecnologías de Telecomunicación Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón Autor: Miriam del Rocío Sumariva Soto Tutor: Ramón de Jesús Risco Delgado Profesor titular Dpto. de Física Aplicada Escuela Técnica Superior de Ingeniería Universidad de Sevilla Sevilla, 2020 Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 4 Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 5 Trabajo Fin de Grado: Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón Autor: Miriam del Rocío Sumariva Soto Tutor: Ramón de Jesús Risco Delgado El tribunal nombrado para juzgar el Proyecto arriba indicado, compuesto por los siguientes miembros: Presidente: Vocales: Secretario: Acuerdan otorgarle la calificación de: Sevilla, 2020 El Secretario del Tribunal Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 6 Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 7 Agradecimientos Han pasado muchos años desde que comencé mis estudios en Ingeniería , los cuales han sido muy duros para mí, pero hoy que culmina esta etapa académica quisiera agradecer a todos los que lo han hecho posible. En primer lugar me gustaría agradecer a mis padres su esfuerzo, dedicación y confianza plena en mí durante todo este largo camino, gracias a ellos hoy día soy quién soy. Gracias por no dejarme bajar los brazos jamás. Agradecer a mi hermana, por sus palabras de aliento cuando todo se me complicaba, gracias por hacerme ver que yo si era capaz de culminar toda esta etapa. También quiero hacer una mención especial a mi compañero de vida. Gracias por aguantar mi mal humor, mis llantos etc, sin ti no hubiera sido capaz de continuar y levantarme tantísimas veces, gracias por ver en mis ojos más de lo que veo yo misma. Y por último me gustaría agradecer a mi tutor Ramón Risco Delgado toda la paciencia y dedicación puestas en este trabajo. Y para concluir quiero dedicar unas palabras a mí misma. Cree más en ti y de todo lo que puedes lograr, porque con trabajo y constancia sí eres capaz de todo. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 8 Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 9 Índice de contenidos 1. Resumen. ................................................................................................................. 13 2. Introducción. ........................................................................................................... 15 2.1. Introducción a la criobiología. ......................................................................... 15 2.2. La criopreservación. ......................................................................................... 16 2.2.1. Principios físicos-químicos de la congelación. .......................................... 16 2.2.2. Respuesta celular ante la congelación y descongelación......................... 18 2.2.3. Agentes crioprotectores (CPA). ................................................................ 21 2.3. Métodos de criopreservación. ......................................................................... 22 2.3.1. Congelación lenta. .................................................................................... 23 2.3.2. Vitrificación. .............................................................................................. 24 2.3.2.1. Fundamentos de la vitrificación. ....................................................... 24 2.3.2.2. Soportes de vitrificación.................................................................... 25 2.3.2.3. Factores determinantes en el desarrollo de un sistema de vitrificación cerrado y eficiente. .......................................................................... 29 2.4. Daños biológicos. ............................................................................................. 31 2.5. Aplicaciones. .................................................................................................... 31 2.6. Información adicional sobre el instrumento de medida para el experimento, el ratón. 32 3. Objetivos. ................................................................................................................ 37 3.1. Objetivo general. ............................................................................................. 37 3.2. Objetivos específicos. ...................................................................................... 37 4. Material y métodos. ................................................................................................ 39 4.1. Localización. ..................................................................................................... 39 4.2. Material animal. ............................................................................................... 39 4.3. Manejo animal. ................................................................................................ 40 4.4. Diseño experimental. ....................................................................................... 43 4.4.1. Protocolo de producción de embriones. .................................................. 43 4.4.2. Protocolo de criopreservación. ................................................................ 44 4.4.2.1. Vitrificación. ...................................................................................... 46 4.4.2.2. Recalentamiento. .............................................................................. 47 4.5. Material instrumental. ..................................................................................... 49 Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 16 Actualmente existen dos métodos de criopreservación, congelación lenta y vitrificación. “En el sistema de congelación lenta, la temperatura desciende aproximadamente de 0,3 a 2 °C por minuto en un medio con concentraciones bajas de crioprotectores (por ejemplo, glicerol 1,5M) hasta -30 a -80 °C. De esta manera las células tienen tiempo suficiente para eliminar exceso de líquido (deshidratarse) y equilibrarse con el medio” (2 p16). En cuanto a la vitrificación es un proceso de solidificación que utiliza soluciones altamente concentradas que implica la formación de vidrio en lugar de cristales de hielo en el interior de las células. “Durante este proceso el agua llega al estado sólido (vítreo) sin pasar por la formación de cristales. Esto se logra por medio de una congelación ultra-rápida (>1000 °C/min) y el uso de altas concentraciones de crioprotectores. Las células son deshidratadas, antes de la congelación, colocándolas en altas concentraciones de un crioprotector (> 6M)” (2 p16). Con el método de vitrificación se consigue eliminar la formación de hielo intracelular en cambio presenta un inconveniente, la toxicidad a la que están expuestas las muestras biológicas debido al uso de altas concentraciones de crioprotector, es por ello que para evitar dicho problema se debe controlar en forma muy precisa la concentración del medio crioprotector, la temperatura y el tiempo (2). 2.2. La criopreservación. 2.2.1. Principios físicos-químicos de la congelación. “El proceso de congelación conlleva cambios físicos y químicos a nivel de la célula que pueden alterar la fisiología de ésta, llegando a ocasionarle daños incluso letales (5)” (6 p2). Sin embargo, es posible reducir estos daños mortales y mejorar la supervivencia celular gracias a los avances conseguidos en los protocolos de congelación. Para conseguir la viabilidad de células congeladas, es necesario pues un buen conocimiento de los principios físicos que rigen la criobiología: descenso crioscópico y ósmosis (6). - Descenso crioscópico. El descenso crioscópico es la disminución de la temperatura del punto de congelación de una disolución respecto a la temperatura del disolvente puro, es decir que al añadir soluto bajamos el punto de congelación de la disolución. El descenso crioscópico es una de las propiedades coligativas ya que sólo depende de la naturaleza del disolvente y de la cantidad de partículas del soluto (concentración del soluto) pero no de la naturaleza química de este último, es decir, el descenso crioscópico no guarda Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 17 ninguna relación con el tamaño ni con cualquier otra propiedad de los solutos, dicho de otra forma, cualquier soluto en la misma cantidad producirá el mismo efecto. (7) El descenso crioscópico se puede expresar como: ΔT ≈𝑅∗(𝑇𝑓)2 𝛥𝐻𝑓*𝑥𝐵 Donde ΔT es el descenso crioscópico, 𝑇 𝑓 la temperatura de fusión, 𝑥𝐵 la fracción molar del soluto presente y 𝛥𝐻𝑓 la entalpía de fusión, así que el descenso crioscópico es directamente proporcional a la molalidad (número de moles de soluto que contiene un kilogramo de disolvente) (8). Ilustración 1: Diagrama de una disolución acuosa. Fuente: (7). En la figura podemos observar como a medida que aumenta la molalidad y la concentración de la disolución, disminuye la temperatura de congelación siguiendo una curva descendente (7). - Presión osmótica. La ósmosis es la difusión pasiva a través de una membrana semipermeable, la cual está formada por poros de tamaño minúsculo, lo que provoca que solo puedan atravesarla las partículas pequeñas y no grandes, es decir, esta membrana semipermeable actúa como una barrera de control que regula la entrada y salida de moléculas al medio extracelular, permitiendo el paso solo a moléculas de disolvente e impidiéndoselo a las moléculas de solutos. Esto hace que la difusión de las moléculas de disolvente sea desde la disolución de menor concentración de solutos, disolución hipotónica, a la de mayor concentración, disolución hipertónica, hasta alcanzar un equilibrio entre las dos distribuciones conocida como disolución isotónica. (9) Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 18 La presión osmótica es la cantidad de presión necesaria para detener completamente el proceso de ósmosis, dicho de otra forma, es la presión que se debe aplicar a una solución para detener el flujo de disolvente a través de la membrana semipermeable (9). Ilustración 2: Membranas celulares. Fuente: (9). En la figura podemos ver las variaciones de volumen que sufren las células ocasionadas por el fenómeno de ósmosis. Al sumergir las células en un medio hipertónico, es decir, con una mayor concentración de solutos extracelular, se produce la difusión de agua hacia el exterior produciéndose una deshidratación y reducción del volumen de la célula, en cambio, al sumergirla en un medio hipotónico, es decir, con una menor concentración de solutos extracelular, se origina la difusión de agua hacia el interior produciéndose una hinchazón e incremento del volumen de la célula. En el caso de medio isotónico, no se produce difusión, ya que la concentración de solutos es igual en el interior y exterior celular, es decir, se encuentra en equilibrio. (9) 2.2.2. Respuesta celular ante la congelación y descongelación. “La criopreservación de material biológico tiene lugar usualmente en una solución acuosa con diferentes solutos presentes. Las propiedades físico-químicas que rigen los eventos a los cuales están sometidas la solución durante la congelación derivan de la concentración de solutos disueltos en ella (10)” (11 p1). Para entender Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 19 cómo actúan las células a la congelación en una solución acuosa hay que tener en cuenta que el ambiente intracelular es también una solución acuosa ya que el agua constituye alrededor del 80% del volumen de la célula. La solución acuosa intracelular está separada de la solución acuosa extracelular por una membrana plasmática semipermeable que actúa como barrera de control para evitar la cristalización y permitir el equilibrio osmótico. Por lo tanto, la supervivencia criobiológica durante el ciclo de congelación como de descongelación reside en la capacidad de respuesta osmótica de la célula y en el destino del agua intracelular (6). A bajas temperaturas (entre -5 °C y -10 °C), cuando en una solución acuosa hay solutos presentes, aumenta el descenso crioscópico, es decir, se produce un descenso del punto de congelación, de modo que en dicha solución se comenzará a crear cristales de hielo con una temperatura menor a la necesaria para congelar el agua pura (0°C), lo que conlleva a un sobre-enfriamiento de la muestra (12). Con este descenso de la temperatura el medio extracelular se cristaliza formándose hielo puro, de modo que a medida que el cambio de fase avanza, es decir, de líquido a sólido, los solutos quedan progresivamente más concentrados en la región extracelular, en otras palabras, habrá mayor concentración de solutos en el espacio extracelular que en el espacio intracelular (11). En respuesta a esa diferencia de gradiente que se genera entre el medio intracelular y extracelular, se ocasiona una evacuación de agua desde la región con menor concentración de solutos a la región con mayor concentración de solutos, o sea desde la región intracelular a la extracelular a través de la membrana semipermeable con lo cual la célula se deshidratará para así mantener el equilibrio osmótico con un medio extracelular cada vez más hipertónico (13). Precisamente es el hielo extracelular quien rompe el equilibrio isotónico natural ya que cuando se forma hielo en el exterior celular, simultáneamente se está produciendo un aumento de la concentración de solutos, así que la formación de hielo extracelular tiene como consecuencia la difusión de agua desde el espacio intracelular al extracelular, proceso conocido como deshidratación celular. Además, es la deshidratación de la región intracelular la que conlleva posteriormente un aumento en la concentración de solutos en el interior lo que provoca a su vez un descenso en el punto de congelación. Sin embargo, en estos momentos gracias a la naturaleza semipermeable de la membrana, no se formará cristales de hielo en el interior y además se sabe que “la probabilidad de iniciar la nucleación en el medio intracelular es mucho menos que en el medio extracelular ya que la nucleación está directamente relacionada con el tamaño del compartimiento a congelar (13)” (14). Una vez iniciada la formación de hielo extracelular y la deshidratación en el medio intracelular la velocidad de enfriamiento será la variable que determine las alteraciones que se puedan llegar a ocasionar en el interior de la célula (13, 15). Si la velocidad de enfriamiento es muy lenta dará lugar a una elevada concentración de Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 20 solutos en la región extracelular con lo cual la deshidratación en el interior será máxima pudiéndose llegar al colapso celular, en cambio si la velocidad de enfriamiento es rápida provocará la formación de hielo intracelular ya que la célula no es capaz de deshidratarse lo suficientemente rápido (16-18). En cambio, existe una velocidad de enfriamiento óptima que minimiza el daño celular y alcanza un máximo en la probabilidad de supervivencia de las células a la criopreservación (5). Durante el proceso de congelación la membrana es la estructura que mayor daño sufre debido a la pérdida de fluidez de sus componentes lipídicos y en consecuencia aumenta su fragilidad (19). Cuando se descongela la solución y se produce el cambio de fase, en este caso de sólido a líquido, se reduce progresivamente la concentración de solutos en la región extracelular y de nuevo en respuesta a esa diferencia de gradiente se produce una evacuación de agua a través de la membrana desde el medio extracelular al intracelular así que la célula volverá a hidratarse para mantener el equilibrio osmótico, de modo que durante la descongelación se producen los cambios osmóticos inversos a los descritos para la congelación (14). Los cristales que se generan en el medio intracelular con el proceso de congelación pueden crecer durante un proceso lento de descongelación produciéndose lo que se conoce como recristalización, en cambio esto podría evitarse si se realiza un proceso rápido de calentamiento (20). Tras todo lo descrito anteriormente se llega a la conclusión que el control de la cantidad y localización de los cristales de hielo constituye un gran desafío en la criobiología (12,21). Ilustración 3: Eventos físicos y lesiones criogénicas de las células durante la congelación y descongelación. Fuente: (22). Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 21 2.2.3. Agentes crioprotectores (CPA). Para mejorar la viabilidad celular, además de una correcta velocidad de enfriamiento, es necesario modificar el comportamiento físico-químico de las soluciones acuosas en las cuales tiene lugar la criopreservación. Para ello se añade al medio de congelación agentes crioprotectores, los cuales son sustancias muy hidrosolubles y de baja toxicidad que promueven una rápida deshidratación celular, o sea, aumenta la concentración de solutos en el medio intracelular, así pues será más complicado que se congele el agua interior de la célula ya que a mayor concentración de soluto mayor descenso del punto de congelación, por tanto el uso de estos agentes alterará el comportamiento de congelación de las células (23). En función de la permeabilidad celular se distinguen dos tipos de agentes: - Crioprotectores permeables: son sustancias de bajo peso molecular que penetran en el interior de las células y las protegen de las lesiones producidas por las congelaciones a velocidad lenta. Debido a su bajo peso pueden atravesar la membrana celular y actuar provocando la deshidratación reemplazando las moléculas de agua por las del crioprotector evitando así el estrés osmótico. Al iniciarse el proceso de congelación las moléculas de crioprotector no se congelan en forma de hielo, sino que se solidifican formando una sustancia amorfa de consistencia vidriosa. Lo más empleados son: 1,2-Propanodiol (PROH), Dimetilsulfóxido (DMSO), etilenglicol (EG) y glicerol. (6) El crioprotector glicerol fue descubierto en 1949 por Polge, Smith y Parkes (24) y fue el aditivo más efectivo hasta que en 1959 se descubrió el efecto del crioprotector DMSO por Lovelock y Bishop (25). El gicerol se usa sobre todo para el almacenamiento de bacterias y esperma animal (26) y el DMSO para la criopreservación de células de mamíferos cultivadas (25) y ambos pueden actuar tanto dentro como alrededor de la célula a cualquier temperatura, en cambio se ha comprobado que DMSO presenta menor tasa de supervivencia debido a la metilación del ADN lo cual crea algunas dificultades para usarlo en aplicaciones clínicas (22). - Crioprotectores no permeables: son sustancias de alto peso molecular que actúan en el exterior de las células y son efectivas cuando se utilizan velocidades altas de congelación. Estos crioprotectores no penetran en la célula así que ejercen su función crioprotectora promoviendo una rápida deshidratación celular reduciendo la probabilidad de formación de hielo intracelular. Los más empleados son: sacarosa, dextrosa, glucosa, polivinil. pirrolidona (PVP), dextrano y polietilenglicol (PEG). (11) Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 22 El uso de agentes crioprotectores aporta muchos beneficios como dilución de los electrolitos, disminución de la concentración del agua, aumento de la viscosidad, efecto coligativo, en resumen, reducen la cantidad de hielo formado a una determinada temperatura y por tanto la concentración de solutos durante la congelación y así la deshidratación celular. No obstante, estos agentes también presentan desventajas ya que pueden llegar a ser muy dañinos cuando son empleados especialmente en grandes concentraciones. Algunos de estos problemas son toxicidad, ósmosis y cambios en la permeabilidad al agua de la membrana plasmática. (14) 2.3. Métodos de criopreservación. Actualmente existen dos protocolos de congelación para criopreservar muestras biológicas, congelación lenta y vitrificación, siendo las concentraciones de CPA y velocidad de enfriamiento utilizadas la principal diferencia entre ambas técnicas. En la ilustración podemos observar otras diferencias significativas (22): Ilustración 4: Comparación entre los métodos de congelación lenta y vitrificación. Fuente: (22). Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 23 2.3.1. Congelación lenta. El objetivo de la congelación lenta es crear un delicado balance entre la nucleación de hielo, la concentración de crioprotectores empleados y la velocidad de enfriamiento para provocar hielo extracelular, pero evitar hielo intracelular el cual resulta letal para las muestras biológicas (27). La congelación lenta es una técnica de criopreservación de equilibrio osmótico donde los organismos biológicos son expuestos gradualmente a bajas concentraciones de crioprotectores, exponiéndolos posteriormente a un descenso lento de la temperatura realizado en sistemas de enfriamiento programables controlando las velocidades de enfriamiento. Para alcanzar el equilibrio osmótico se produce una rápida difusión del agua que da lugar a una deshidratación de la célula y posterior reducción de su tamaño el cual se recupera con la entrada del crioprotector en el interior celular (5), así pues, para que dicha deshidratación se pueda llevar a cabo correctamente se debe usar una velocidad de enfriamiento extremadamente lenta (6). El descenso de la temperatura se inicia a temperatura ambiente de -2 °C/min, pero la aparición de los primeros cristales de hielo en el medio extracelular, conocido como seeding, no se produce hasta que no se alcanza los -7 °C (28), momento en el cual dicha cristalización comienza a propagarse lentamente a toda la solución (6). “El calor liberado con la siembra de hielo, favorece la deshidratación de las células, contribuyendo así a minimizar la cantidad de agua atrapada en el citoplasma y por tanto reduciendo la probabilidad de formación de hielo intracelular” (29 p26), dicho de otro modo, a dicha temperatura no se formará hielo intracelular debido a la alta concentración de solutos en el interior que provocan un descenso del punto de congelación. Tras el seeding, el descenso de temperatura tiene lugar a una velocidad extremadamente lenta (aproximadamente -0,3 °C/minuto) para la correcta difusión de los crioprotectores y el mínimo estrés osmótico posible, en cambio si el descenso de la temperatura es rápido, podría provocar la formación de hielo intracelular debido a una deshidratación insuficiente. Se puede concluir por tanto que el éxito de esta técnica reside en conseguir un adecuado balance entre la proporción de agua que sale de las células y la que se convierte en hielo. (6) La congelación lenta ha sido la técnica de elección para embriones desde los inicios de la criopreservación, siendo aplicada con mínimas modificaciones y ofreciendo resultados altamente satisfactorios de supervivencia y gestación clínica. Estos buenos resultados conllevaron el uso de la congelación lenta para congelar ovocitos (30,31) pero desafortunadamente los resultados no fueron eficaces debido a la estructura y características del ovocito humano. El ovocito es una célula de gran tamaño con 150 mm de diámetro aproximadamente, con gran cantidad de agua y una Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 24 ratio superficie-volumen muy baja (32) de manera que ante una congelación lenta se produce una deshidratación máxima que conlleva cambios en su forma esférica, alteraciones en su citoesqueleto (33,34), zona pelúcida y gránulos corticales (17,35). Sin embargo, desde sus orígenes se han logrado progresos en la criopreservación de ovocitos gracias a la mejora de crioprotectores usados y velocidad de descenso (31,36,37) e incluso algunos grupos han publicado resultados extraordinarios (38-42) con tasas de supervivencia del 80%, pero debido a la enorme variabilidad para reproducir esos resultados clínicos se ha desarrollado otro procedimiento alternativo conocido como vitrificación. (6) 2.3.2. Vitrificación. 2.3.2.1. Fundamentos de la vitrificación. La vitrificación es una técnica de criopreservación ultrarrápida donde las muestras biológicas son expuestas a elevadas concentraciones de crioprotector, donde a diferencia de la técnica de congelación lenta, no es necesario alcanzar el equilibrio osmótico entre el medio extracelular e intracelular durante el periodo de enfriamiento de las células (6). Esta técnica emplea el nitrógeno líquido como solución criogénica y fue descubierta hace 50 años por C. Polge y J. Lovelock (24,43). Durante el proceso de vitrificación se produce la solidificación de la solución acuosa sin la formación de cristales tanto dentro como fuera de la célula, es decir, la transición de un estado líquido a un estado sólido de consistencia vidriosa (estado vítreo) sin producción de hielo intracelular y extracelular. La transición de líquido a la fase no cristalizada se consigue enfriando el líquido que contiene una elevada concentración de crioprotectores a una velocidad extremadamente alta, así que con este rápido descenso de la temperatura la viscosidad de la muestra aumenta en gran medida, hasta el punto en que las moléculas quedan totalmente inmovilizadas y el líquido se transforma a un estado vítreo en el que la cristalización no puede ocurrir (44). La criopreservación exitosa de ovocitos usando dicha técnica ha sido posible desde hace relativamente poco tiempo ya que ha planteado serios inconvenientes, resultando más complicada la eliminación total de los cristales de hielo debido a la estructura de la célula. “Uno de los principales obstáculos iniciales para la aplicación rutinaria de la técnica era la exposición de los ovocitos, durante largos periodos de tiempo, a altas concentraciones de crioprotectores con la consiguiente citotoxicidad y estrés osmótico para ellos (45)”(6 p4). En consecuencia, para solucionar estos problemas se han realizado distintas modificaciones en los protocolos como reducción del tiempo de exposición, combinación de nuevos crioprotectores como el etilenglicol Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 25 y sacarosa o incluso pequeñas variaciones en la composición de los crioprotectores (6). Por el contrario, los inconvenientes que presentan los ovocitos disminuyen cuantiosamente en el caso de los embriones ya que al estar compuestos por varias células presentan una relación superficie-volumen bastante mayor, siendo este el motivo por el cual la vitrificación de embriones no ha supuesto serios problemas en la aplicación clínica llegando incluso a mejorar los resultados obtenidos con el método de congelación lenta (46). Este método de criopreservación presenta numerosas ventajas como son la total eliminación de la formación de hielo o la disminución del daño causado por el enfriamiento, puesto que atraviesa la zona de temperatura de peligro que oscila entre +15 °C y -5 °C a velocidades de enfriamiento muy rápidas evitando así los efectos adversos del frío como son alteraciones en el citoesqueleto y contenido lipídico de la membrana (47,48). Por otro lado, a diferencia de la congelación lenta, este método permite mayor flexibilidad, se efectúa rápidamente, en pocos minutos, y elimina la necesidad de mantenimiento de equipos caros. Finalmente, gracias a las continuas mejoras en la técnica, se puede concluir que el método de vitrificación puede ser considerado la alternativa más eficiente al método de congelación lenta para vitrificar tanto ovocitos como embriones en día 3 y blastocitos, pues se han conseguido mejores resultados (49-53). El presente proyecto está encaminado a solventar uno de los inconvenientes de la vitrificación, la toxicidad, que en ocasiones sufren las muestras biológicas a vitrificar debido al uso de altas concentraciones de crioprotector. Para ello se ha empleado una novedosa técnica (54) en la que, a través del uso de un sistema cerrado de mínimo volumen, concretamente capilares de policarbonato, se consigue mejorar la velocidad de enfriamiento, la transmisión de calor y reducir la concentración de crioprotector necesaria para una vitrificación óptima. Esta técnica se especificará en apartados posteriores. 2.3.2.2. Soportes de vitrificación. Desde el inicio de la vitrificación se ha podido evidenciar una creciente variedad de técnicas, todas ellas en busca de lograr mejores niveles de supervivencia. Estas mejoras fueron encaminadas a conseguir disminuir la toxicidad que sufren los organismos biológicos a través de una reducción considerable del volumen de solución a vitrificar, aumentando las tasas de enfriamiento y/o calentamiento y reduciendo la concentración de crioprotector (6). Para ello se han diseñado diferentes soportes de vitrificación lo que conlleva a que actualmente los embriólogos se enfrenten al dilema de tener que elegir entre dos sistemas de vitrificación: abierto o cerrado (55). Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 32 un único embrión, obtener mayor aprovechamiento de un solo ciclo de estimulación ovárica, permitir la maternidad a personas por diferentes razones médicas etc. (6). En nuestro proyecto hemos detallado el desarrollo de una técnica, descrita en capítulos posteriores, para poder aplicarla a este sector clínico. En la siguiente ilustración podemos apreciar los resultados de supervivencia de las diferentes publicaciones acerca de los resultados con embriones y blastocitos vitrificados (29). Ilustración 11: Estudios publicados de vitrificación de embriones y blastocitos en diferentes estados de desarrollo. Fuente: (29). 2.6. Información adicional sobre el instrumento de medida para el experimento, el ratón. El ratón es el modelo biológico más usado en investigaciones científicas debido a las numerosas ventajas que ofrecen. Una de las líneas de investigación es la reproducción asistida en la cual se centrará nuestro proyecto. Algunas ventajas que presenta el ratón son (76): - De fácil cuidado y mantenimiento debido a su pequeño tamaño. - Bajos costos de manutención. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 33 - Eficiencia reproductiva - Tienen un sistema inmune y genoma similar al de los seres humanos. - Breve período de gestación. Es importante destacar que para obtener unos resultados satisfactorios en los experimentos es primordial cumplir previamente con unas condiciones óptimas de cuidado del animal. Como podemos observar en la ilustración estas condiciones están relacionadas con el ambiente que lo rodea (76). Ilustración 12: Condiciones para la manipulación. Fuente: (76). En cuanto al desarrollo embrionario del ratón podemos decir que es completamente diferente al de otras especies ya que una de las principales características de los embriones de ratón es que no se asientan sobre la yema como ocurre en embriones de otras especies, tales como peces o anfibios (77). Tras la fecundación del óvulo por parte del espermatozoide, el ovocito fertilizado experimenta una serie de divisiones mitóticas que ocasionan un incremento del número de células dividiéndose sucesivamente en dos, cuatro, ocho, dieciséis y treinta y dos células, en cambio, este incremento de células no va a producir un aumento del tamaño neto. El día posterior a la punción, y si se ha producido efectivamente la fecundación, el embrión recibe el nombre de cigoto y estará formado por dos corpúsculos polares (2CP) y dos pronúcleos (PN). El segundo día el embrión ya Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 34 ha realizado las primeras divisiones y tiene entre 2-4 células, también conocidas como blastómeras y en el tercer día el embrión tiene entre 6-8 células. Tres días después de la fecundación, las células del embrión se dividen hasta formar la mórula formada por un total de dieciséis células, momento en el cual se produce una distinción entre células externas e internas. Las células internas de la mórula constituyen la masa celular interna que formará el embrión y las células externas constituyen el trofoectodermo que ayudará a formar la placenta. Estas células externas inician un transporte activo por la zona pelúcida que recubre el embrión hasta la masa celular interna que permiten la entrada de líquido para formar una cavidad interna denominada blastocele, lo que se conoce como proceso de cavitación. La blastocele es una cavidad interior rellena de líquido e identifica al estadio de blastocisto. (77) Ilustración 13: Desarrollo embrionario en el ratón. Fuente: (77). Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 35 Ilustración 14: Visión de una mórula. Fuente: Google imágenes. Por último, vamos a justificar qué estadio es el más idóneo para la vitrificación y posterior transferencia embrionaria. El proceso de criopreservación se puede aplicar tanto a embriones en estadios tempranos de desarrollo como en estadio de blastocisto donde la calidad de éstos es la variable que influye decisivamente en la supervivencia (78). La congelación de embriones de peor calidad lleva a bajas tasas de supervivencia y de implantación embrionaria (79), de manera que cuanto más sano o mejor sea un embrión (más calidad), más probabilidad tendrá de sobrevivir a la descongelación embrionaria (80). Por otra parte, se ha demostrado que en el embrión en fase de blastocisto tiene mayor capacidad de implantación que los embriones en estadios tempranos de desarrollo ya que a la fase de blastocisto solo llegan los embriones de buena calidad así que la utilización de embriones en estadio de blastocisto es el más idóneo porque disminuye la posibilidad de gestación múltiple conservando la tasa de éxito de la transferencia, y supone una selección natural de los embriones con mayor potencial de desarrollo (80). En nuestros experimentos hemos aplicado nuestro método a las muestras en el estado de desarrollo correspondiente al día 2 y al día 4 debido a su mayor resistencia a la manipulación. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 36 Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 37 3. Objetivos. 3.1. Objetivo general. La finalidad de este trabajo de investigación es estudiar el rendimiento de un dispositivo cerrado de dimensiones reducidas, SafeSpeed, para examinar la viabilidad de obtener una alta supervivencia posterior a la vitrificación de los embriones procedentes del ratón. 3.2. Objetivos específicos. Como objetivos específicos, se plantean los siguientes: - Evaluación del desarrollo morfológico de las muestras biológicas del grupo control. - Evaluación del desarrollo morfológico de las muestras biológicas criopreservadas. - Inspección de la supervivencia morfológica de las muestras biológicas del grupo control. - Inspección de la supervivencia morfológica de las muestras biológicas criopreservadas. - Estudiar los resultados obtenidos hallando la tasa de supervivencia de ambos grupos. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 38 Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 39 4. Material y métodos. 4.1. Localización. El ensayo se desarrolló en dos localizaciones diferentes, en cada una de ellas se realizó la producción de embriones y aplicación del método de criopreservación. El proceso de producción de embriones se realizó en el Centro de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla en el término municipal de Espartinas (Sevilla) con coordenadas 37°22'42.5"N 6°07'42.0"W. Ilustración 15. Centro de producción y experimentación animal. Fuente: Google Maps (2019). El ensayo experimental se llevó a cabo en nuestro laboratorio de criopreservación. 4.2. Material animal. Para el desarrollo de los ensayos se utilizaron ratones como fuente de embriones, procedentes del Centro de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla. Dicho centro trabaja con ratones de distintas especies, una de ellas era la cepa FVB y la otra cepa era la CD-1, el centro produce en cantidades suficientes ratones hembras FVB y en menor cantidad hembras CD-1, de tal modo que, Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 40 con el fin de adaptarnos a sus necesidades acordamos la fabricación de embriones únicamente con hembras FVB, no obstante, para los ratones machos usábamos las dos cepas. De este modo, para la generación de embriones de ratón se realizaron dos cruces diferentes, un cruce era FVB*FVB, es decir hembra de la cepa FVB y macho de la cepa FVB, de este cruce se obtenían embriones no híbridos, ya que eran procreados por individuos de la misma especie; el otro cruce era FVB*CD-1, es decir, hembra de la cepa FVB y macho de la cepa CD-1, de dicho cruce se obtenían embriones híbridos, comúnmente conocido como mestizos, ya que eran procreados por individuos de distinta especie. La razón por la cual se utilizaron también ratones machos CD-1 en el cruce fue porque a la hora de realizar el proceso de criopreservación observamos que los embriones generados tenían más capacidad de supervivencia y más fortaleza que los que procedían del cruce con macho FVB. Atendiendo a la programación de producción de muestras por el personal en el Centro de Producción y Experimentación Animal pactamos 20 o 30 embriones los lunes. Igualmente, la cantidad de embriones generados nunca era 100% fijo semanalmente, ya que dependían del número de ratones hembras disponibles en el centro para microinyectar. Ilustración 16: Ratón de laboratorio. Fuente: Google imágenes. 4.3. Manejo animal. Los embriones llegaban a nuestro laboratorio de criopreservación en transporte a una temperatura de 34°C-35°C, para conservarlos directamente a 37°C de temperatura y 6% de concentración de CO2, para ello se contó con un termo de acero inoxidable relleno de lentejas. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 41 A la entrada en el laboratorio las muestras se observaban para verificar si efectivamente estaban formadas por dos corpúsculos polares y dos pronúcleos, es decir, se había producido la fecundación. Seguidamente dichas muestras se depositaban en microgotas (G-IVF, G1Plus, G2Plus, Vitrolife) cubierta de aceite mineral en una placa de Petri y posteriormente se alojaban en la incubadora del laboratorio y se dejaban en cultivo hasta el segundo día de desarrollo cuando se seleccionaban para ser criopreservadas. El aceite mineral fue el medio que se utilizó como protector de las microgotas de cultivo embrionario, dicho medio simulaba al máximo el ambiente uterino ya que aportaba todos los nutrientes necesarios para facilitar el crecimiento celular, gracias a este medio se conseguía proteger los embriones frente a posibles contaminaciones, cambios de pH y temperatura. Las placas donde se encontraban las microgotas cubiertas de aceite mineral recibían el nombre de placas de cultivo, esta placa se dividió en tres zonas, las cuales fueron identificadas por líneas horizontales trazadas con un bolígrafo indeleble. La parte superior se usaba para depositar las muestras biológicas que llegaban en los viales, la parte central se utilizaba para depositar los embriones que se criopreservaban en el día 2 y la parte inferior se utilizaba para alojar los embriones que se criopreservaban en el día 4. Por lo tanto, la zona superior se dedicaba para el grupo control y la zona central e inferior para el grupo vitrificado, además, en cada una de las zonas había un total de 10 microgotas y en cada microgotas se podía depositar un máximo de 4 embriones para facilitar el trabajo. Para entender mejor la disposición de las placas se muestra su distribución en la siguiente ilustración: Ilustración 17: Distribución de las muestras biológicas en la placa. Fuente: Elaboración propia. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 48 - Recorte capilar sobre el área sellada. II. Paso por la solución de recalentamiento TS: - Traslado de los embriones del capilar a la gota de la solución TS de la placa TS. En dicha solución se lavaron los embriones por pipeteo hasta eliminar cualquier VS sobrante. - Permanencia de los embriones durante 1 minuto en la gota. - Antes que finalizara el minuto de la fase II, creación de una gota de 100 µl de la solución DS en la placa DS usando la micropipeta. III. Paso por la solución de recalentamiento DS: - Cumplido el minuto de la fase II traslado de los embriones de la gota de la solución TS a la gota de la solución DS en la placa DS usando el sistema de aspiración. Se lavaron los embriones como en las otras soluciones para eliminar cualquier TS sobrante. - Incubación de los embriones durante 3 minutos en la gota. - Transcurridos los 2 minutos de la fase III, creación de una gota de 100 µl de la solución WS en la placa WS usando la micropipeta. IV. Primer lavado: - Cumplidos los 3 minutos de la fase III, traslado de los embriones de la gota de la solución TS a la gota de la solución WS de la placa WS. - Permanencia de los embriones durante 5 minutos en la gota de la solución WS. - Transcurridos los 4 minutos de la fase IV, creación de otra gota de 100 µl de la solución WS en la placa WS usando la micropipeta. V. Segundo lavado: - Transcurridos los 5 minutos de la fase IV, traslado de los embriones de la primera gota de la solución WS a la segunda gota de la solución WS usando el sistema de aspiración. - Incubación de los embriones durante 1 minuto en la gota. - Traslado de los embriones de la segunda gota de la solución WS a la placa de cultivo. - Introducción de la placa de cultivo a la incubadora. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 49 4.5. Material instrumental. Las herramientas utilizadas durante la realización del ensayo fueron las siguientes:  Incubadora, para mantener las muestras biológicas a 37 °C de temperatura y una concentración del 6 % de CO2. Ilustración 20: Incubadora DH DURAFLOW AUTOMATIC. Fuente: Elaboración propia.  Bomba de oxígeno, conectada a la incubadora para proporcionarle 6 % de CO2. Ilustración 21: Bomba de oxígeno. Fuente: Elaboración propia. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 50  Dispositivo calibración de C𝑂2 (Labotect/InControl 1050), para control y evaluación de C𝑂2 ,temperatura y oxígeno. Ilustración 22. Dispositivo de medición independiente (Labotect/ InControl 1050). Fuente: (81).  Dispositivo SafeSpeed, soporte para vitrificar y recalentar las muestras biológicas. Ilustración 23. Dispositivo SafeSpeed. Fuente: Google imágenes.  Gasas estériles, para limpiar la incubadora y secar el dispositivo SafeSpeed. Ilustración 24. Gasas estériles. Fuente: Google imágenes. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 51  Agua desionizada, para desinfectar la incubadora. Ilustración 25. Agua desionizada. Fuente: Google imágenes.  Sistema de agua, compuesta por una nevera y un termostato que calienta el agua hasta alcanzar la temperatura deseada de 37°C. Ilustración 26. Sistema de agua. Fuente: Elaboración propia.  Termómetro, para verificar que el agua está a la temperatura deseada. Ilustración 27. Termómetro. Fuente: Elaboración propia. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 52  Nitrógeno líquido, para congelar las muestras biológicas. Ilustración 28: Nitrógeno líquido. Fuente: Google imágenes.  Temporizador, para controlar los tiempos marcados durante el experimento. Ilustración 29. Temporizador. Fuente: Google imágenes. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 53  Termo de acero inoxidable para transportar, relleno de lentejas, los viales con las muestras biológicas desde el Centro de producción y experimentación animal de la Universidad de Sevilla hasta el laboratorio de manipulación. Ilustración 30: Termo de acero inoxidable. Fuente: Google imágenes.  Lentejas, para mantener la temperatura de las muestras en el interior del termo. Con ellas se lograba que los embriones conservaran la temperatura en el trayecto desde el Centro de Producción y Experimentación Animal hasta el laboratorio.  Soluciones SafeSpeed, para la criopreservación de las muestras. Ilustración 31. Medios SafeSpeed. Fuente: Elaboración propia. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 54  Vinoteca, para mantener los medios entre 6°C-8°C de temperatura. Ilustración 32. Vinoteca. Fuente: Elaboración propia.  Placa de Petri, para situar en ella las gotas de las soluciones y las muestras biológicas tanto para el grupo de control como para el grupo vitrificado. Ilustración 33. Placa de Petri FALCON de 35 mm. Fuente: Google imágenes.  Sistema de aspiración, para transportar las muestras por las diferentes gotas de las soluciones, así como para cargarlos dentro del capilar para proceder a vitrificarlos y recalentarlos. El método de uso consiste en absorber muy suavemente por la boquilla para atrapar las muestras. Se conoce comúnmente como pipeta de boca y consta de un conector, dos tubos de silicona y dos filtros estándar de 22 micras, en cada extremo del conector se acopla los filtros y a éstos filtros se conectan los tubos de silicona. En función del uso del sistema de aspiración su construcción es diferente, si el sistema se usa para trasladar muestras por las distintas soluciones hay que conectar por un extremo del tubo una punta amarilla y por el otro extremo pipetas Pasteur esterilizadas; en cambio, si el sistema se usa para cargar Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 55 muestras, hay que conectar por un extremo una punta amarilla y por el otro extremo el dispositivo SafeSpeed. En ambos casos la punta amarilla se introducía en la boca y tanto la pipeta Pasteur esterilizada como el dispositivo SafeSpeed se sujetaba con la mano derecha. Ilustración 34. Sistema de aspiración. Fuente: Elaboración propia.  Selladora SafeSealer, para sellar el capilar por uno de sus extremos evitando así la contaminación procedente del nitrógeno. Ilustración 35. Selladora manual. Fuente: Elaboración propia.  Tijeras de acero inoxidable, para recortar el sellado del dispositivo SafeSpeed. Ilustración 36: Tijeras de acero inoxidable. Fuente: Google imágenes. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 56  Pletina calefactora, para seguir conservando a 37°C de temperatura las placas de Petri, evitando de este modo que se produjese choque térmico. Ilustración 37. Pletina calefactora SBS OSAKA II PK 312. Fuente: Elaboración propia.  Estereomicroscopio, para buscar las muestras en las gotas de las soluciones situadas en las respectivas placas y para observar su trayectoria durante el proceso de introducción en el dispositivo SafeSpeed. Ilustración 38. Estereomicroscopio URA Technic. Fuente: Elaboración propia.  Micropipeta, para extraer las gotas de las soluciones y situarlas en las placas de Petri. Ilustración 39. Micropipeta NICHIPET EXII 0-200µl. Fuente: Elaboración propia. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 57  Puntas amarillas, para colocarlas en la punta de la micropipeta con el fin de dosificar en cantidades precisas las soluciones necesarias. Ilustración 40. Puntas amarillas GILSON 2-200 µl. Fuente: Google imágenes.  Pipetas Pasteur no estériles, para desplazar las muestras por las diferentes gotas de las soluciones situadas en las placas de Petri. Ilustración 41. Pipetas Pasteur no estériles. Fuente: Google imágenes. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 64 Tabla 4. Resultados semana 4. Recepción de 20 muestras FVB*FVB. D1 D2 Vitrificado Superv. D3 D4 Vitrificado Superv. D5 Fecha 06/02/2017 07/02/2017 07/02/2017 07/02/2017 08/02/2017 09/02/2017 10/02/2017 Téc Miriam Miriam Miriam Miriam Miriam Miriam Miriam 12CP 2 Cél - - Mórula Mórula compactada - - Blasto 22CP 2 Cél - - Mórula Mórula compactada - - Blasto 32CP 2 Cél - - Mórula Mórula compactada - - Blasto 42CP 2 Cél - - Mórula Mórula compactada - - Blasto 52CP 2 Cél - - Mórula Mórula compactada - - Blasto 62CP 2 Cél - - Mórula Mórula compactada - - Blasto 72CP 2 Cél - - Mórula Mórula compactada - - Blasto 82CP 2 Cél - - Mórula Mórula compactada - - Blasto en formación 92CP 2 Cél - - Mórula Mórula compactada - - Blasto en formación 10 2CP 2 Cél - - Mórula Mórula compactada - - Blasto en formación 11 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula Mórula compactada - - Blasto en formación 12 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula Mórula compactada - - Mórula con cavidad iniciándose 13 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula Mórula compactada - - Mórula con cavidad iniciándose 14 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula Mórula compactada - - Mórula con cavidad iniciándose 15 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula Mórula compactada - - Mórula con cavidad iniciándose 16 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula Mórula compactada - - Mórula con cavidad iniciándose 17 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula Mórula compactada - - Mórula compactada 18 2CP 2 Cél Sí No - - - - - 19 2CP 2 Cél Sí No - - - - - 20 2CP 2 Cél Sí No - - - - - CONTROL PROTOCOLO Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 65 Tabla 5. Resultados semana 5. Recepción de 30 muestras FVB*CD-1. D1 D2 Vitrificado Superv. D3 D4 Vitrificado Superv. D5 Fecha 13/02/2017 14/02/2017 14/02/2017 14/02/2017 15/02/2017 16/02/2017 17/02/2017 Téc Miriam Miriam Miriam Miriam Miriam Miriam Miriam 12CP 2 Cél - - Mórula compactada Blasto en formación - - Blasto eclosionado 22CP 2 Cél - - Mórula compactada Blasto en formación - - Blasto eclosionado 32CP 2 Cél - - Mórula compactada Blasto en formación - - Blasto expandido 42CP 2 Cél - - Mórula compactada Blasto en formación - - Blasto expandido 52CP 2 Cél - - Mórula compactada Mórula con cavidad - - Blasto expandido 62CP 2 Cél - - Mórula compactada Mórula con cavidad - - Blasto expandido 72CP 2 Cél - - Mórula compactada Mórula con cavidad - - Blasto expandido 82CP 2 Cél - - Mórula compactada Mórula compactada - - Blasto expandido 92CP 2 Cél - - Mórula compactada Mórula compactada - - Blasto expandido 10 2CP 2 Cél - - Mórula compactada Mórula compactada - - Blasto expandido 11 2CP 2 Cél - - Mórula 3-4 Cél Mórula compactada - - Blasto expandido 12 2CP 2 Cél - - Mórula 3-4 Cél Mórula compactada - - Blasto 13 2CP 2 Cél - - Mórula 3-4 Cél Mórula degradada - - Blasto 14 2CP 2 Cél - - Mórula degradada Degenerado - - Degenerado 15 2CP 1 Cél - - 1 Cél 1 Cél - - 1 Cél 16 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula compactada Mórula compactada - - Blasto expandido 17 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula compactada Mórula compactada - - Blasto expandido 18 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula compactada Mórula compactada - - Blasto expandido 19 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula compactada Mórula compactada - - Blasto expandido 20 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula compactada Mórula compactada - - Blasto expandido 21 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula compactada Mórula compactada - - Blasto expandido 22 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula compactada Mórula compactada - - Blasto expandido 23 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula compactada Mórula compactada - - Blasto 24 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula compactada Mórula compactada - - Blasto 25 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula compactada Mórula compactada - - Mórula con cavidad 26 2CP 2 Cél Sí Sí Mórula compactada Mórula compactada - - Mórula con cavidad 27 2CP 2 Cél Sí No - - - - - 28 2CP 2 Cél No - - - - - - 29 2CP 2 Cél No - - - - - - 30 2CP 2 Cél No - - - - - - CONTROL PROTOCOLO Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 66 Tabla 6. Resultados semana 6. Recepción de 20 muestras FVB*FVB. D1 D2 Vitrificado Superv. D3 D4 Vitrificado Superv. D5 Fecha 20/03/2017 21/03/2017 21/03/2017 21/03/2017 22/03/2017 23/03/2017 24/03/2017 Téc Miriam Miriam Miriam Miriam Miriam 12CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 22CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 32CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 42CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 52CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 62CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 72CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 82CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 92CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 10 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 11 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 12 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 13 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 14 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 15 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 16 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 17 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 18 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 19 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 20 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado CONTROL PROTOCOLO Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 67 Tabla 7. Resultados semana 7. Recepción de 30 muestras FVB*CD-1. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 68 Tabla 8. Resultados semana 8. Recepción de 32 muestras FVB*FVB. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 69 Tabla 9. Resultados semana 9. Recepción de 31 muestras FVB*CD-1. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 70 Tabla 10. Resultados semana 10. Recepción de 18 muestras FVB*CD-1. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 71 Tabla 11. Resultados semana 11. Recepción de 33 muestras FVB*FVB. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 72 Tabla 12. Resultados semana 12. Recepción de 20 muestras FVB*FVB. D1 D2 Vitrificado Superv. D3 D4 Vitrificado Superv. D5 Fecha 15/05/2017 16/05/2017 16/05/2017 16/05/2017 17/05/2017 18/05/2017 18/05/2017 18/05/2017 19/05/2017 Téc Miriam Miriam Miriam Miriam Miriam 12CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 22CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 32CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 42CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 52CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 62CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 72CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 82CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 92CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 10 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 11 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 12 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 13 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 14 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 15 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 16 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 17 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 18 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 19 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado 20 2CP Degenerado - - Degenerado Degenerado - - Degenerado CONTROL PROTOCOLO Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 73 Finalmente aplicamos nuestro método a 153 muestras biológicas, entre el estado correspondiente al día 2 y al día 4, y tras una valoración morfológica realizada según el protocolo de viabilidad comentado con anterioridad, sobrevivieron en total 114 muestras, es decir, obtuvimos una tasa de supervivencia del 74.5%. Además, se dejaron en cultivo embrionario 135 muestras, de las cuales sobrevivieron 101, así que obtuvimos una tasa de supervivencia del 74.8%. Tabla 13. Tasa de supervivencia y de recuperación tras el procedimiento de desvitrificación. Nuestro proyecto tuvo una duración de 3 meses ya que las dos últimas semanas observamos que todas las muestras se degeneraron debido a la alta temperatura que se alcanzó en el laboratorio, con lo que se concluyó que para poder realizar nuestro experimento la temperatura no debía alcanzar los 25 °C. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 80 vitrification. Reprod Biomed Online. 2011;23:298–306. 45. Fuller B PS. Fundamentals of cryobiology in reproductive medicine. Reprod Biomed Online. 2004;9:680–91. 46. Loutradi KE, Kolibianakis EM, Venetis CA, Papanikolaou EG, Pados G, Bontis I et al. Cryopreservation of human embryos by vitrification or slow freezing: a systematic review and meta-analysis. Fertil Steril. 2008;90(1):189–93. 47. Kong IK., Lee SI, Cho SG, Cho SK PC. Comparison of open pulled straw (OPS) vs. glass micropipette (GMP) vitrification in mouse blastocysts. Theriogenology. 2000;53:1817–182. 48. Misumi K, Suzuki M, Sato S SN. Successful production of piglets derived from vitrified morulae and early blastocysts using a microdroplet method. Theriogenology. 2003;60:253–60. 49. García JI, Noriega-Portella L N-HL. Efficacy of oocyte vitrification combined with blastocyst stage transfer in an egg dona-tion program. Hum Reprod. 2011;0:1–9. 50. Lieberman J TM. Comparison of vitrification and conventio¬nal cryopreservation on day 5 and day 6 blastocysts during clinical application. Fertil Steril. 2006;86:20–6. 51. Stachecki J, Garrisi J, Sabino S et al. A new safe, simple ans successful vitrification method for bovine and human blastocysts. Reprod Biomed Online. 2008;17:360–7. 52. Van Landuyt L, Stoop D, Verheyen G et al. Outcome of closed blastocyst vitrification in relation to blastocyst quality: evaluation of 759 warming cycles in a single-embryo transfer policy. Hum Reprod. 2011;26:527–33. 53. Zhu D, Zhang J, Cao S et al. Vitrified-warmed blastocyst transfer cycles yield higher pregnancy and implantation rates compared with fresh blastocyst transfer cycles-time for a new embryo transfer strategy. Fertil Steril. 2011;95:1691–5. 54. P CT. WO 2014/057148 A2. Vol. 10. 2012 Oct. 55. Gallardo M, Hebles M, Migueles B, Dorado M, Aguilera L, González M, et al. Thermal and clinical performance of a closed device designed for human oocyte vitrification based on the optimization of the warming rate. Cryobiology. 2016;73(1):40–6. 56. Arav A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 2014;81(1):96–102. 57. Vajta G, Rienzi L UF. Open versus closed systems for vitrification of human oocytes and embryos. Reprod Biomed. 2015;30(4):325–33. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 81 58. Arav A, Zeron Y OA. A new device and method for Vitrification increases the cooling rate and allows successful cryopreservation of bovineoocytes. Theriogenology. 2000;53:248–9. 59. M K. Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology. 2007;67(1):73–80. 60. Seki S MP. The dominance of warming rate over cooling rate in the survival of mouse oocytes subjected to a vitrification procedure. Cryobiology. 2009;59:75– 82. 61. Cobo A, Bellver J, de los Santos MJ RJ. Viral screening of spent culture media and liquid nitrogen samples of oocytes and embryos from hepatitis B, hepatitis C, and human immunodeficiency virus chronically infected women undergoing in vitro fertilization cycles. Fertil Steril. 2012;97(1):74–8. 62. Muthukumar K, Mangalaraj AM, Kamath MS GK. Blastocyst cryopreservation: vitrification or slow freeze. Fertil Steril. 2008;90(S426):7. 63. Arav A, Gianaroli L, Bafaro G DL. A new vitrification technique for 8-cellstage mouse embryos. IVF Meet. 1987;118. 64. Matsumoto H, Jiang JY, Tanaka T, Sasada H SE. Vitrification of large quantities of immature bovine oocytes using nylon mesh. Cryobiology. 2001;42(2):139–44. 65. Chian RC, Kuwayama M, Tan L, Tan J, Kato O NT. High survival rate of bovine oocytes matured in vitro following vitrification. J Reprod Dev. 2004;50(6):685– 96. 66. Hamawaki A, Kuwayama M HS. Minimum volume cooling method for bovine blastocyst vitrification. Theriogenology. 1999;51:165. 67. Kuwayama M, Vajta G, Ieda S KO. Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and the elimination of potential contamination. Reprod Biomed Online. 2005;11(5):608–14. 68. Panagiotidis Y, Vanderzwalmen P, Prapas Y, Kasapi E, Goudakou E Papatheodorou A, Passadaki T, Petousis S, Veletza S. NikolettosN, Prapas N MG. Open versus closed vitrification of blastocysts from an oocytedonation programme: a prospective randomized study. Reprod Biomed. 2013;26:470–6. 69. Papatheodorou A, Vanderzwalmen P, Panagiotidis Y PN, Zikopoulos K, Georgiou I PY. Open versus closed oocyte vitrification system: a prospective randomized sibling oocyte study. Reprod Biomed. 2013;26:595–602. 70. Vajta G, Holm P, Greve T CH. Vitrification of porcine embryos using the Open Pulled Straw (OPS) method. Acta Vet Scand. 1997;38(4):349–52. 71. Vajta G, Holm P, Kuwayama M, Booth PJ, Jacobsen H, Greve T et al. Open Pulled Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 82 Straw (OPS) vitrification: a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos. Mol Reprod Dev. 1998;51(1):53–8. 72. Chen SU, Lien YR, Cheng YY, Chen HF, Ho HN YY. Vitrification of mouse oocytes using closed pulled straws (CPS) achieves a high survival and preserves good patterns of meiotic spindles, compared with conventional straws, open pulled straws (OPS) and grids. Hum Reprod. 2001;16(11):2350–6. 73. Risco R, Elmoazzen H, Doughty M, He X TM. Thermal performance of quartz capillaries for vitrification. Cryobiology. 2207;55(3):222–9. 74. SafeSealer [Internet]. Available from: https://safepreservation.es/es/selladorasafespeed/ 75. Arav A. Vitrification of oocytes and embryos. DVM Thesis Bol Bol Univ. 1989; 76. F Fuentes, R Mendoza, A Rosales, A Cisneros. Guia de manejo y cuidado de animales de laboratorio:Raton [Internet]. Instituto nacional de salud. 2008. 1–54 p. Available from: www.ins.gob.pe/insvirtual/images/.../GUIA_ANIMALES_RATON.pdf 77. Crespo Alonso M. Evolución del blastocisto del ratón. Mecanismos de especificación de los primeros linajes. Tesis Dr [Internet]. 2008;115. Available from: https://repositorio.uam.es/bitstream/handle/10486/3140/5282_crespo_alonso _miguel.pdf?sequence=1 78. Kondo I, Suganuma N, Ando T, Asada Y, Furuhashi M, Tomoda Y. Clinical factors for successful cryopreservedthawed embryo transfer. J Assist Reprod Genet. 1996;13:201–6. 79. Schalkoff ME, Oskowitz SP, Powers R. A multifactorial analysis of the pregnancy outcome in a successful successful embryo cryopreservation program. Fertil Steril. 1993;59:1070–4. 80. Asebir G, Decreto R. Congelación embrionaria. 2006;319–28. 81. El dispositivo de medición de Labotect mide especialmente la atmósfera de la incubadora [Internet]. [cited 2020 May 30]. Available from: https://www.labotect.com/products/measuring-device Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 83 8. Anexos. CALENDARIO - Semana 1 o Día 1: Se reciben 30 muestras FVB*FVB, de las cuales 15 se dejan para el grupo control y las otras 15 para el grupo experimental. o Día 2: Observación del desarrollo morfológico y realización del protocolo a las muestras del grupo experimental, vitrificándose 15 muestras de las cuales sobrevivieron 10. o Día 3: Observación del desarrollo morfológico. o Día 4: Observación del desarrollo morfológico y destrucción de las muestras. o Día 5: Nada. - Semana 2 o Día 1: Se reciben 29 muestras FVB*FVB, de las cuales 15 se dejan para el grupo control y las otras 14 para el grupo experimental. o Día 2: Observación del desarrollo morfológico y realización del protocolo a las muestras del grupo experimental, vitrificándose 13 muestras de las cuales sobrevivieron 10. o Día 3: Observación del desarrollo morfológico. o Día 4: Observación del desarrollo morfológico y destrucción de las muestras. o Día 5: Nada. - Semana 3 o Día 1: Se reciben 20 muestras FVB*FVB, de las cuales 10 se dejan para el grupo control y las otras 10 para el grupo experimental. o Día 2: Observación del desarrollo morfológico y realización del protocolo a las muestras del grupo experimental, vitrificándose 10 muestras de las cuales sobrevivieron 6. o Día 3: Nada. o Día 4: Observación del desarrollo morfológico. o Día 5: Observación del desarrollo morfológico y destrucción de las muestras. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 84 - Semana 4 o Día 1: Se reciben 20 muestras FVB*FVB, de las cuales 10 se dejan para el grupo control y las otras 10 para el grupo experimental. o Día 2: Observación del desarrollo morfológico y realización del protocolo a las muestras del grupo experimental, vitrificándose 10 muestras de las cuales sobrevivieron 7. o Día 3: Observación del desarrollo morfológico. o Día 4: Observación del desarrollo morfológico. o Día 5: Observación del desarrollo morfológico y destrucción de las muestras. - Semana 5 o Día 1: Se reciben 30 muestras FVB*CD-1, de las cuales 15 se dejan para el grupo control y las otras 15 para el grupo experimental. o Día 2: Observación del desarrollo morfológico y realización del protocolo a las muestras del grupo experimental, vitrificándose 12 muestras de las cuales sobrevivieron 11. o Día 3: Observación del desarrollo morfológico. o Día 4: Observación del desarrollo morfológico. o Día 5: Observación del desarrollo morfológico y destrucción de las muestras. - Semana 6 o Día 1: Se reciben 20 muestras FVB*FVB, de las cuales 10 se dejan para el grupo control y las otras 10 para el grupo experimental. o Día 2: Observación del desarrollo morfológico. Se contempló que todas las muestras, tanto del grupo control como experimental estaban degeneradas debido a que nos quedamos sin oxígeno en el laboratorio. o Día 3: Observación del desarrollo morfológico. o Día 4: Observación del desarrollo morfológico. o Día 5: Observación del desarrollo morfológico y destrucción de las muestras. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 85 - Semana 7 o Día 1: Se reciben 30 muestras FVB*CD-1, de las cuales 10 se dejan para el grupo control y las otras 20 para el grupo experimental. o Día 2: Observación del desarrollo morfológico y realización del protocolo a las muestras del grupo experimental, vitrificándose 14 muestras de las cuales sobrevivieron 12. o Día 3: Nada. o Día 4: Observación del desarrollo morfológico. o Día 5: Observación del desarrollo morfológico y destrucción de las muestras. - Semana 8 o Día 1: Se reciben 32 muestras FVB*FVB, de las cuales 10 se dejan para el grupo control y las otras 22 para el grupo experimental. o Día 2: Observación del desarrollo morfológico y realización del protocolo a las muestras del grupo experimental, vitrificándose 15 muestras de las cuales sobrevivieron 11. o Día 3: Nada o Día 4: Observación del desarrollo morfológico y realización del protocolo a las muestras vitrificadas que sobrevivieron en el día 2, vitrificándose 10 muestras de las cuales sobrevivieron 7. o Día 5: Destrucción de las muestras. - Semana 9 o Día 1: Se reciben 31 muestras FVB*CD-1, de las cuales 10 se dejan para el grupo control y las otras 21 para el grupo experimental. o Día 2: Observación del desarrollo morfológico y realización del protocolo a las muestras del grupo experimental, vitrificándose 13 muestras, sobreviviendo todas ellas. o Día 3: Nada o Día 4: Observación del desarrollo morfológico y realización del protocolo a las muestras vitrificadas que sobrevivieron en el día 2, vitrificándose 13 muestras de las cuales sobrevivieron 12. o Día 5: Observación del desarrollo morfológico y destrucción de las muestras. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 86 - Semana 10 o Día 1: Se reciben 18 muestras FVB*CD-1, de las cuales 10 se dejan para el grupo control y las otras 8 para el grupo experimental. o Día 2: Observación del desarrollo morfológico y realización del protocolo a las muestras del grupo experimental, vitrificándose 8 muestras de las cuales sobrevivieron 7. o Día 3: Nada o Día 4: Observación del desarrollo morfológico y realización del protocolo a las muestras vitrificadas que sobrevivieron en el día 2, vitrificándose 7 muestras, sobreviviendo todas ellas. o Día 5: Destrucción de las muestras. - Semana 11 o Día 1: Se reciben 33 muestras FVB*FVB, de las cuales 10 se dejan para el grupo control y las otras 23 para el grupo experimental. o Día 2: Observación del desarrollo morfológico y realización del protocolo a las muestras del grupo experimental, vitrificándose 13 muestras de las cuales sobrevivieron solo una. o Día 3: Nada o Día 4: Nada o Día 5: Observación del desarrollo morfológico y destrucción de las muestras. Esta semana se degeneraron todas las muestras debido a la alta temperatura que se alcanzó en el laboratorio. - Semana 12 o Día 1: Se reciben 20 muestras FVB*FVB, de las cuales 10 se dejan para el grupo control y las otras 10 para el protocolo experimental. o Día 2: Observación del desarrollo morfológico. o Día 3: Observación del desarrollo morfológico. o Día 4: Observación del desarrollo morfológico. o Día 5: Observación del desarrollo morfológico y destrucción de las muestras. Esta semana se degeneraron todas las muestras debido a la alta temperatura que se alcanzó en el laboratorio. Estudio del rendimiento de un sistema de vitrificación cerrado basado en altas velocidades de recalentamiento: viabilidad en embrión de ratón 87