Empleo de andamios tridimensionales celularizados estimulados mecánica y eléctricamente para la creación de tejido musculo-esquelético

EMPLEO DE ANDAMIOS TRIDIMENSIONALES CELULARIZADOS ESTIMULADOS MECÁNICA Y ELECTRICAMENTE PARA LA CREACIÓN DE TEJIDO MUSCULO-ESQUELÉTICO ESCUELA INTERNACIONAL DE POSGRADO UNIVERSIDAD DE SEVILLA Tesis Doctoral Programa de Doctorado en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica Departamento de Cirugía Autor Francisco José Calero Castro Tutor y Director Fernando de la Portilla de Juan Sevilla, Junio de 2022 vii AGRADECIMIENTOS No sería objetivo si dijera que no tendría a quien agradecer nada. El desarrollo en este Oficio no ha sido un camino sencillo hasta haber podido llegar a este anhelado final. Sin El apoyo que me ha dado toda la gente que me rodea no habría sido tan fácil haber podido Llegar hasta aquí. Esta experiencia ha sido gracias a todas las personas que me han Influenciado e inspirado desde siempre a ser quien hoy he podido llegar a ser y poder Afrontar un reto de este calibre. Esta estapa se cierra con vivencias que no podre olvidar Nunca. En primer lugar, me gustaría agradecer a Fernando De la Portilla por haberme brindado la oportunidad de poder desarrollar este trabajo. Gracias por haber confiado desde mis inicios en mí y dejarme crecer profesionalmente en esta profesión, por permitirme adentrar en el mundo de la Ingeniería Tisular y los biomateriales y dejarme descubrir mi vocación. A Victor Pérez y a José Fernando Rubio por su ayuda en los estudios reológicos y habernos podido proporcionar los andamios fabricados mediante electrospinning. A Alberto Olmo y Francisco Rodríguez por haber contribuido en la fabricación de las placas de electrodos fabricadas mediante impresión 3D. A los técnicos de limpieza, del servicio de cultivo y de microscopía. A Carlos por su disponibilidad siempre para entregarme a tiempo el instrumental del biorreactor para cada experimento. A Rocío por tener siempre en orden el incubador y el biorreactor, a pesar de que no lo haya puesto fácil. A Konstantin y a John por su paciencia y haberme facilitado la experimentación con el servicio de microscopía. A mis compañeras de laboratorio por hacer tan llevadero el día a día dentro del laboratorio. A Sheila, por ser una compañera ejemplar, siempre dispuesta a ayudarme y enseñarme y hacerme el camino más fácil dentro de esta profesión. A Mavi, aunque ya no estés por aquí, sigues estando para cualquier cosa que necesitemos de ti. A Patri por su tremenda paciencia y profesionalidad, no me cabe duda que te espera una carrera brillante. A Elena, por tu fuerza y tu capacidad de resistencia que tienes, eres una de las personas más duras y valientes que he conocido. A Rocío, por hacer tan amenas todas las mañanas con tu alegría. Y al resto de compañeros que han pasado por el laboratorio Laura, viii Mª Ángeles, Imán, María, Paula, Carlotta y Adele. Al servicio de Cirugía General por haberme hecho sentir uno más dentro del Servicio y a enfermería del bloque quírurgico. Especialmente a Sara, Noelia, María José, Gregorio, Sandra y Lola. Y a mi amiga de Ingeniería, Sara, por entender todos mis dilemas dentro de nuestro mundo de la investigación biomédica y todos los momentos de desconexión por Sevilla. A mis amigos de siempre por ser un apoyo fundamental. Sobre todo a Paquito, Carlos, Alba, Vero, Mamen, Ana, Ana María, Olga, José Luis, Manuel y Alberto, muchas gracias por estar siempre que os necesito, por el apoyo que me dais a diario y por hacerme sentir tan bien siempre que estamos juntos pero sobre todo por haberme comprendido mis ausencias y más en estos últimos meses, espero estar ahora más libre para vosotros. Y también a las recientes incorporaciones, Blanca, Cristina y Ana María, por la frescura que nos aportan. No me puedo dejar atrás a mi fiel escudera, Isa, por acompañarme en cada ocurrencia y por convertirte en alguien indispensable en mi vida. Por todas las llamadas de teléfono de vuelta y por dejarme confiar en ti. Estoy seguro que tu momento va a llegar pronto, eres una persona trabajadora que se merece todo lo bueno. Me siento muy afortunado de poder contar contigo siempre que te necesito. A mi familia y mis primos por ser para mí como hermanos, principalmente a mis primos Sara, Desirée y Juan. Muchas gracias por dejarme contar con vosotros siempre que os necesito. Pero sobre todo por hacer inolvidable cada encuentro de los Castro. A mis abuelos por todo el cariño con el que nos has tratado siempre sin esperar nada a cambio. Especialmente a mi abuela, nunca tendré suficientes palabras para agradecerte la alegría que siempre nos das. Gracias hacerme ver lo privilegiados que somos hoy en día teniendo una educación al alcance de todos y enseñarme a valorarla. A mis padres por haberme educado en libertad y dejarme decidir por mí mismo mi futuro y dejarme ser quién soy hoy en día. Por hacerme ver que se puede sacar fuerza de donde no la hay, siempre que exista la voluntad de uno. A mi padre por inculcarme valores de tenacidad y perfeccionismo y a mi madre, que siempre se preocupa porque todo esté correcto y no nos haya faltado nunca de nada. Gracias por enseñarme que siempre hay que hacer una parada y de que hay tiempo para todo. Nunca habrá palabras suficientes para expresar toda la gratitud que tengo. Siento tanta admiración por vosotros por vuestra forma de superar todos los obstáculos que os estáis encontrando continuamente. ix A mi hermana Noelia, por enseñarme a ser fiel a mis principios, convicciones y decisiones. Hace 8 años, en un mar de dudas sobre si ese chico de 18 años había escogido realmente bien a lo que se quería dedicar el resto de su vida, el destino decidió ponerle punto y final a tu camino, dejándonos a todos con un futuro incierto y muchas cuestiones por resolver. Pero aquí estoy, casi 9 años después, fiel a mi decisión como me enseñaste. Hoy, no me arrepiento de la elección que tomé, de poder contribuir a que no pase lo que tuvimos que vivir. Me consuela saber al menos pudieras ver mis primeros pasos en esta trayectoria. Estoy seguro que donde quieras que estés, esta meta la estás celebrando como si fuera tuya también. No sabes cuánto te echo de menos y cuanto me gustaría poder celebrarlo contigo. A mi hermana Natalia, que siempre me apoya y me defiende. Por haberme dado tanta felicidad y haberme enseñado tanto, y especialmente que hay vida más allá del trabajo y que hay que aprender a compaginarlo. Eres un referente con tu profesionalidad y claridad a la hora de tomar las decisiones. Gracias por haberme hecho el mayor regalo que me podrían hacer, los dos niños de mis ojos. Ojalá me pudieras transmitir parte de la paciencia que estás desarrollando. A Bartolo por estar siempre dispuesto para cuando le necesito pero sobre todo por cuidar tan bien de mi hermana y mis sobrinos. A mi sobrino Noel, que tanto quiero. Por ser una luz que me ilumina en los momentos más oscuros y evadirme momentáneamente de la realidad para llevarme a su mundo lleno de inocencia. Por hacerme sentir tanto y emocionarme con tan solo verte. Es todo un privilegio verte crecer. Espero que esa alegría que tienes te acompañe siempre. Finalmente, me gustaría dejar constancia de que estas últimas palabras las empecé cuando tan solo llevabas 48 horas en el mundo pero ya las estaba pensando antes de saber si te tendría que llamar Fabio o Elián durante el resto de tu vida. Espero, Noel y Elián, que esto algún día os pueda servir como inspiración para que sepáis que se puede llegar hasta límites que uno no alcanza a imaginar. Espero que podáis superar todos los obstáculos que os encontréis y siempre le saquéis lo positivo porque todo os ayudará a aprender y a haceros más fuerte. Que el destino os permita hacer lo que realmente os guste y tengáis una vida llena de felicidad como la que vosotros nos dais. xi INDICE INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1 1.1. Generalidades del músculo esquelético ........................................................ 3 1.1.1. Embriología del músculo esquelético ............................................................ 4 1.1.2. Histología del músculo esquelético ................................................................ 9 1.1.3. Inervación del músculo ................................................................................. 10 1.1.4. Vascularización del músculo esquelético .................................................... 12 1.1.5. Diferencias del músculo esquelético y músculo liso................................... 13 1.2. Ingeniería Tisular ...................................................................................... 14 1.2.1. Definición ...................................................................................................... 14 1.2.2. Componentes dentro de la Ingeniería Tisular .............................................. 17 1.3. Biomateriales ............................................................................................ 19 1.3.1. Definición ...................................................................................................... 19 1.3.2. Historia ........................................................................................................... 21 1.3.3. Propiedades y cualidades necesarias para el uso de un biomaterial........... 22 1.3.4. Clasificación y tipos ...................................................................................... 25 1.4. Técnicas de Fabricación de andamios ........................................................ 33 1.4.1. Bioimpresión 3D ........................................................................................... 33 1.4.2. Electrospinning .............................................................................................. 42 1.5. Biorreactores ............................................................................................. 47 1.5.1. Biorreactor de estimulación mecánica ......................................................... 50 1.5.2. Estimulación eléctrica ................................................................................... 51 1.6. Ingeniería de tejidos aplicado a músculo .................................................... 52 1.6.1. Músculo liso .................................................................................................. 53 1.6.2. Músculo esquelético ...................................................................................... 53 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ....................................................................................... 59 xviii INDICE DE TABLAS Tabla 1: Tipos de andamios y ensayos realizados. ....................................................... 75 Tabla 2: Viabilidad celular y morfología celular de CA1 y CA2. ................................. 97 Tabla 3: Viabilidad celular y morfología celular de L6 en diferentes densidades celulares en la biotinta CA2. ..................................................................................... 100 Tabla 4: Viabilidad celular y morfología celular de L6 en cada grupo de estimulación en la biotinta CA2. ......................................................................................................... 101 Tabla 5: Viabilidad celular y morfología celular de L6 en densidad celular 40 x 106 células/mL por cada grupo de estimulación en la biotinta CA2. ................................. 103 Tabla 6: Viabilidad celular y morfología celular de L6 en densidad celular 80 x 106 células/mL por cada grupo de estimulación en la biotinta CA2. ................................. 103 Tabla 7: Viabilidad celular y morfología celular de L6 en densidad celular 160 x 106 células/mL por cada grupo de estimulación en la biotinta CA2. ................................. 104 Tabla 8: Viabilidad celular y morfología celular de C2C12 en densidad celular 160 x 106 células/mL por cada grupo de estimulación en la biotinta CA2. ........................... 107 Tabla 9: Viabilidad celular y morfología celular de L6 y C2C12. .............................. 108 Tabla 10: Viabilidad celular y morfología celular de C2C12 en andamios fabricados por electrospinning. ......................................................................................................... 111 Tabla 11: Viabilidad celular y morfología celular de C2C12 en andamios alineados estimulados. .............................................................................................................. 112 Tabla 12: Viabilidad celular y morfología celular de C2C12 en andamios fabricados mediante bioimpresión y electrospinning. ................................................................. 114 Tabla 13: Viabilidad celular y morfología celular de C2C12 en andamios fabricados mediante bioimpresión y electrospinning sin estimulación. ....................................... 114 xix Tabla 14: Viabilidad celular y morfología celular de C2C12 en andamios fabricados mediante bioimpresión y electrospinning estimulados mecánicamente. ..................... 115 Tabla 15: Morfología nuclear de andamios de electrospinning. ................................. 122 Tabla 16: Morfología nuclear de andamios alineados estimulados. ............................ 122 Tabla 17: Concentraciones de calcio intracelular y luminiscencias tras estímulos de soluciones altas en K+. .............................................................................................. 127 INDICE DE VÍDEOS QR 1: Vídeo andamio random ................................................................................... 126 QR 2: Vídeo andamio semialineado .......................................................................... 126 QR 3: Vídeo andamio alineado ................................................................................. 128 QR 4: Vídeo andamio alineado con estimulación eléctrica ........................................ 129 QR 5: Vídeo andamio alineado con estimulación mecánica ....................................... 129 QR 6: Andamio respondiendo a pulsos eléctricos y solución alta en potasio .............. 130 xx GLOSARIO DE ABREVIATURAS ADN: Ácido Desoxirribonucleico ADP: Adenosín difosfato Alg: Alginato AM: Fabricación Aditiva ATP: Adenosín trifosfato BMP: Proteína Morfogenética Ósea BS: Solución Bloqueo BSA: Albúmina de Suero Bovino ºC: Grado centígrado Ca2+: Calcio CaCl2: Cloruro cálcico CAD: Diseño asistido por ordenador CE: Conformidad Europea cm: centímetro Col: colágeno dECM: Matriz extracelular descelularizada DLP: procesamiento digital de la luz DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO: Dimetilsulfóxido ECM: Matriz Extracelular EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético EEUU: Estados Unidos EGF: Factor de crecimiento endotelial EHD: electrohidrodinámicas ePTFE: Politetrafluoroetileno expandido ERK: Extracellular Signal-Regulated Kinases Ethd1: homodímero-1 de etidio FBS: Suero Fetal Bovino FDA: Food and Drug Administration FDM: Modelado por Deposición Fundida FGF: Factor de crecimiento de fibroblastos GA: Ácido 1,4-α-L-ácido gulurónico GMSC: Células madre mesenquimales gingivales Gly: Glicina HA: Ácido hialurónico hASC: Células madre derivadas del tejido adiposo humano HGF: Factor de crecimiento de hepatocitos HFIP: 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol IF: Inmunofluorescencia IGF: Factor de crecimiento de insulínico IHQ: Inmunohistoquímica iPSC: Induced Pluripotent Stem Cell ISO: International Organization for Standardization K+: Potasio kV: Kilo Voltio LDM: Low Temperature Deposition Modeling LIFT: Laser-Assisted Bioprinting MA: Ácido 1,4-β-D-manurónico MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinases MG: Medio de crecimiento Mg: Magnesio mL: mililitro mM: milimolar MPa: Megapascal xxi MR: Medicina Regenerativa MRF: Factores de Regulación Miogénicos MRF4: Factor Regulador Miogénico 4 MSC: células madre mesenquimales MyHC: Isoformas de cadena pesada de miosina NFAT: vía del factor nuclear de las células T activadas nM: nanomolar NSF: National Science Foundation PANi: Polianilina PBS: Phosphate-Buffered Saline PCL: Policaprolactona PDGF: Platelet Derived Growth Factor PEG: Polyethylene Glycol PEG-DA: Polyethylene Glycol Diacrylate PFA: Paraformaldehido Pi: Unidad de fosfato PLA: Ácido poliláctico PLCL: Poly(lactide-co-epsilon-caprolactone) PLGA: Poly(lactic-co-glycolic acid) PVA: Acetato de polivinilo PVDF: Fluoruro de polivinilideno Rpm: Revoluciones por minuto SDF-1α: Factor derivado de células estromales Sem: Semana Shh: Sonic Hedgehog SLA: Estereolitografía SLS: Sinterizado Selectivo por Láser SMA: Smooth Muscle Actin SMAD: Small Mothers Against Decantaplegic STL: STereoLithography TCF: T-Cell Factors TGF-β: Factor de crecimiento transformante U: Unidad enzimática UV: Ultravioleta V: Voltio VEGF: Factor de crecimiento endotelial vascular W/V: weigth/volumen xxiii RESUMEN La Ingeniería de Tejidos tiene dentro de sus desafíos la regeneración de músculo esquelético. Para ello es preciso el uso de andamios tisulares, que pueden ser fabricados por diversas técnicas, siendo dos de las más utilizadas la bioimpresión 3D y el electrospinning. El empleo de biorreactores que estimulen mecánica y/o eléctricamente andamios celularizados podría promover la diferenciación de tejido muscularesquelético. Es por ello que en este trabajo se ha estudiado el empleo de andamios fabricados mediante bioimpresión y electrospinning estimulados mecánicamente y eléctricamente para la regeneración de músculo esquelético. Se han empleado 9 biotintas diferentes a testar; colágeno, colágeno y Matrigel; colágeno, Matrigel, fibrina y albúmina de suero bovino y el resto biotintas de colágeno y alginato a diferentes concentraciones. Se han usado 3 andamios de electrospinning de PCL y gelatina con diferente grado de alineamiento entre sus fibras random; semialineado y alineado. Se compararon dos líneas celulares de mioblastos L6 y C2C12. Los andamios fueron estimulados mecánica y eléctricamente. Tras esto, se midió la viabilidad, morfología del citoesqueleto y funcionalidad de las fibras que se crearon. Los resultados mostraron que los andamios colágeno y alginato (82.33 ± 13.14%) presentaron mayor viabilidad celular (P=0.001) frente al resto de biomateriales. Entre las biotintas de colágeno y alginato se vio que las que tenían mayor concentración de colágeno y alginato aumentaban la viabilidad (73.26 ± 3.33 % vs 94.08 ± 3.50 %; P=0.000). La estimulación mecánica y eléctrica no tuvo efecto sobre la viabilidad, sin embargo, sí que lo tuvo sobre la morfología tanto de las células L6 como de las C2C12, siendo mayor la madurez en la línea C2C12. Comparando la bioimpresión y el electrospinning, el segundo presentó mayor viabilidad y maduración celular. La morfología del citoesqueleto de los andamios bioimpresos no fue miotubular, al contrario que los andamios de electrospinning. Entre estos andamios solamente se demostró que los miotubos de los andamios alineados (9.84 ± 1.15 µm) eran más finos que los de los andamios random (11.55 ± 3.39 µm; P=0.001) y semialineados (11.32 ± 2.73 µm; P=0.003). Al estimular los andamios alineados mecánicamente se aumentó el grosor (12.92 ± 3.29 µm; P=0.000), la fusión nuclear (95.73 ± 1.05 %; P=0.004), la densidad de actina (80.13 ± 13.52 %; P=0.017) respecto al control. Los andamios random y los andamios alineados estimulados mecánicamente presentaron mayor contractibilidad. INTRODUCCIÓN CAPÍTULO 1 INTRODUCCIÓN 3 1.1. Generalidades del músculo esquelético El músculo esquelético es uno de los tejidos más dinámicos y plásticos del cuerpo humano. En los seres humanos, el músculo esquelético representa aproximadamente el 40 % del peso corporal total, contiene entre el 50 y el 75 % de todas las proteínas corporales y representa entre el 30 y el 50 % del recambio proteico de todo el organismo. La masa muscular depende del equilibrio entre la síntesis y la degradación de proteínas y ambos procesos son sensibles a factores como el estado nutricional, el equilibrio hormonal, la actividad física, el ejercicio y las lesiones o enfermedades, entre otros (1). Este músculo se caracteriza por su acción mediante estímulos voluntarios enviados desde el sistema nervioso central a través de señales transmitidas por motoneuronas (2). Las estructuras anatómicas fundamentales del mencionado músculo son (1):  Epimisio: La capa externa del músculo, rodeando el vientre muscular.  Perimisio: Dentro del epimisio, engloba y organiza los distintos fascículos musculares.  Endomisio: Capa de revestimiento a las fibras musculares, integradas por estructuras miofibrilares. El músculo esquelético (Figura 1) se caracteriza por seguir una disposición muy ordenada de las fibras musculares asociadas al tejido conectivo. La célula progenitora del músculo esquelético es el mioblasto, son células mononucleadas que durante su maduración se fusionan y formando fibras alargadas polinucleadas (3). La unidad estructural del tejido muscular es la miofibra, una célula única polinucleada de unos 20- 100 μm de diámetro. Las miofibras están dispuestas en paralelo y presentan una longitud desde 2 mm hasta varias decenas de milímetros dependiendo del músculo. Las miofibras están recubiertas por una matriz de tejido conectivo, el endomisio, que agrupa las fibras en fascículos. Estos fascículos a su vez están soportados por el perimisio (formado por colágeno, fibras elásticas, nervios y vasos sanguíneos). Existe una última membrana, el epimisio, que envuelve el músculo y sostiene la continuidad estructural y funcional de la unión músculo tendón. Este tejido conectivo está compuesto por colágeno (tipo I y III) y proteoglicanos (4). INTRODUCCIÓN 10  La nebulina se integra en los filamentos finos que contienen actina. Junto a la titina contribuyen a las propiedades mecánicas, fisiológicas del músculo y a la integridad del sarcómero. También influyen en la tensión pasiva y en las características de rigidez de las células individuales, y pueden ser relevantes para el ensamblaje de las miofibrillas y la señalización celular (64,65).  El disco Z del sarcómero contiene varias proteínas, entre ellas la actinina, y sirve de punto de unión para el miofilamento de actina. Otras proteínas conectan el disco Z (por ejemplo, la desmina) con el sarcolema y la matriz extracelular (ECM), como se ha indicado anteriormente, y pueden ser disfuncionales en algunas miopatías (1). El sistema de túbulos transversales T es una invaginación del sarcolema cuyo papel importante es la conducción del potencial de acción nervioso al interior de la célula (66). Esta red de túbulos está en contacto con el exterior de la célula y asegura que la excitación pueda propagarse uniformemente por toda la fibra. La disferlina es una importante proteína localizada en la membrana del sistema de túbulos T y es sensible a los cambios en la concentración de calcio dentro de la célula (67). 1.1.3. Inervación del músculo El deslizamiento de las proteínas responsables de la contracción muscular es el resultado final de una cascada de reacciones que transforma señales eléctricas en señales químicas, como por ejemplo voltajes de membrana a partir de sensores de ion Ca2+. La despolarización de la membrana de la célula muscular resulta en una rápida transmisión de la señal nerviosa o eléctrica a lo largo de la fibra muscular a través de los túbulos-T (66). La red de túbulos está en contacto con el exterior de la célula y asegura que la excitación pueda propagarse uniformemente por toda la fibra (Figura 4) (67). INTRODUCCIÓN 11 Figura 4: Sarcómero relajado y contraído. En la membrana tubular se encuentran unos biosensores de voltaje que están directamente en contacto a canales de salida de Ca2+ del retículo sarcoplásmico de la célula (también conocidos como acoplamiento excitación-contracción). Aquí es donde se produce el cambio de señal eléctrica a química que comentamos previamente. El retículo sarcoplásmico es responsable del almacenamiento, la liberación y la recaptación de calcio tras la activación. Dos tipos de proteínas en el retículo sarcoplásmico contribuyen a mantener la homeostasis del calcio: la Ca2-ATPasa del retículo sarcoplásmico y la calsequestrina. La primera es responsable de la recaptación de calcio en la cisterna tras la activación del músculo y la segunda fija el calcio de forma suelta dentro del retículo sarcoplásmico (1). Los sensores de Ca2+ de las fibras representan una segunda interfaz que transformará la señal química en una respuesta contráctil. Estos biosensores son los más sensibles a concentraciones de Ca2+ conocidos por el hombre, en la actualidad no se ha conseguido la fabricación de un sensor artificial capaz de igualar su eficacia. Para ello los iones se unen a la troponina-C provocando la contracción de las fibras de actina/miosina en el músculo. La unión del ion Ca2+ a la troponina C desplaza a la tropomiosina, dejando libre los sitios activos de la actina. La miosina se une a estos puntos activos al llevarse a cabo la hidrólisis del ATP, liberando ADP y Pi. Se produce un cambio conformacional en la cabeza de la miosina que permite desplazar el filamento de actina hacia la banda H. Este nuevo cambio permite la unión de un nuevo ATP a la cabeza de miosina, separándose de la actina. Se repite el ciclo varia veces por segundo, permitiendo el desplazamiento del filamento de actina por la cabeza de la miosina hacia la banda H. El ciclo se mantendrá INTRODUCCIÓN 12 siempre que las concentraciones de Ca2+ intracelulares se mantengan altas. Una vez finalizado el impulso nervioso, las bombas de Ca2+ lo devuelven al retículo sarcoplásmico (Figura 5) (63). Figura 5: Proceso de contracción de una fibra muscular. Las mitocondrias generan la energía necesaria para las acciones musculares cuando el oxígeno se pone a disposición de la fibra muscular (68). Algunas mitocondrias están situadas más cerca del sarcolema, lo que reduce la distancia de difusión del oxígeno transportado por el suministro capilar. Esto es especialmente útil durante el ejercicio aeróbico (o de resistencia) cuando aumenta la demanda de oxígeno (1). 1.1.4. Vascularización del músculo esquelético El tejido muscular es uno de los que más metaboliza la glucosa ya que representa más del 80% de la eliminación de la glucosa estimulada por la insulina. La permeabilidad del músculo esquelético a la glucosa es alta, por lo que se espera que el flujo sanguíneo (suministro de sustrato) actúe como paso limitante de la tasa de captación de glucosa. La insulina desempeña un papel central como vasodilatador, para así poder eliminar la glucosa estimulada por la insulina. Tradicionalmente, la insulina induce la relajación de los grandes vasos conductores, lo que conduce a un aumento general del flujo sanguíneo y la captación de glucosa del músculo. Los capilares también responden a los efectos vasodilatadores de la insulina, lo que da lugar a una mayor perfusión microvascular. La conexión funcional entre la captación de glucosa y la vasodilatación estimulada por la INTRODUCCIÓN 13 insulina se ha hecho cada vez más evidente, ya que se requiere una vascularidad tisular y una exposición a los nutrientes adecuados para un correcto metabolismo de la glucosa (69). La angiogénesis también está inducida por el ejercicio del músculo esquelético siendo el resultado de las respuestas integradas de múltiples sistemas y estímulos. Los niveles de VEGF aumentan en el músculo ejercitado. La degradación de las proteínas de la ECM libera factores angiogénicos y hace posible la migración celular (70). 1.1.5. Diferencias del músculo esquelético y músculo liso El requisito funcional más notable de la musculatura esquelética es la capacidad de generar fuerza y/o movimiento bajo el control del sistema nervioso. Los músculos lisos, por el contrario, desempeñan funciones en el cuerpo que son más o menos continuas, y que a menudo implican muy poco movimiento o el mantenimiento de fuerzas tónicas constantes (2). Una de las diferencias más evidentes entre las células musculares esqueléticas/cardíacas y las células musculares lisas es su tamaño y aspecto general, siendo las últimas unas de las más pequeñas del organismo. Además, las fibras y las proteínas contráctiles tienen una distribución diferente a la que presentan las células musculares esqueléticas (71). La proporción de actina respecto a la miosina que posee el músculo liso es mayor que la del músculo esquelético (72). El músculo liso carece de troponina que posee el músculo esquelético para la regulación de los filamentos de actina, en su lugar pueden contener caldesmón o calponina que pueden desempeñar funciones modulares en la contracción del músculo liso (73). La molécula de miosina del músculo liso es morfológicamente idéntica a la miosina del músculo esquelético, pero bioquímicamente muy diferente, especialmente en lo que respecta a la regulación de la actividad ATPasa activada por la actina. La miosina lisa puede formar grandes filamentos y despolimerizarse, en lugar de ensamblarse en un filamento grueso. Esta mayor labilidad de los filamentos de miosina del músculo liso podría desempeñar un papel en los procesos fisiológicos normales y permitir una rápida reestructuración del aparato contráctil, lo que no ocurre en los sarcómeros de los músculos estriados. El menor contenido de miosina y la polimerización INTRODUCCIÓN 14 incompleta de la miosina conducen a una densidad de filamentos gruesos del músculo liso mucho menor que en el músculo esquelético y cardíaco (72). Aunque el músculo liso carece de la estructura sarcomérica organizada del músculo esquelético y cardíaco, está organizado en dominios de filamentos contráctiles. Debido a la mayor longitud de los filamentos finos y a la organización menos restringida de las unidades contráctiles, las células individuales pueden acortarse más del 70% de su longitud en reposo. El Ca2+ regula la contracción tanto de los músculos estriados como de los lisos, pero los mecanismos son diferentes (74). 1.2. Ingeniería Tisular 1.2.1. Definición El fracaso de tejidos y órganos debido a enfermedades, lesiones y defectos de desarrollo se ha convertido en una de las principales preocupaciones económicas y sanitarias (75). En la actualidad, el uso de tejidos y órganos donados es la práctica clínica para hacer frente a esta situación. Sin embargo, debido a la escasez de donantes de órganos, el creciente número de personas en las listas de espera para trasplantes y el envejecimiento cada vez mayor de la población, la dependencia de los tejidos y órganos donados no es un enfoque práctico (76). La Ingeniería de Tejidos (IT) ha surgido para solventar esta necesidad. La IT y la Medicina Regenerativa (MR) son campos multidisciplinarios que combinan conocimientos y tecnologías de diferentes campos como la biología, la química, la ingeniería, la medicina, la farmacia y la ciencia de los materiales para desarrollar terapias y productos para la reparación o el reemplazo de tejidos y órganos dañados (76,77). Según Langer y Vacanti la IT es la aplicación de los principios de la ingeniería y las ciencias biológicas para el entendimiento de la relación estructura-función en tejidos, y el desarrollo de sustitutos biológicos que restauren, mantengan o mejoren la función de dichos tejido que maneja tres aspectos tecnológicos básicos: el empleo de células aisladas, el de sustancias inductoras a formación de tejido y la disposición de ambos sobre un andamios tisulares (77). Durante su crecimiento y maduración, las células están expuestas a una serie de interacciones con su entorno y las células vecinas que condicionan el éxito de estos procesos (78). INTRODUCCIÓN 15 La MR es una disciplina bastante nueva, estrechamente relacionada con la IT y la biología. Se considera una rama de la investigación traslacional en IT y biología molecular. El objetivo consiste en un proceso de sustitución, ingeniería o regeneración de células, tejidos u órganos humanos para restaurar o establecer la función normal de los tejidos u órganos dañados. La originalidad de este nuevo campo de investigación radica en las condiciones de estimulación de las células y los tejidos utilizando los mecanismos de reparación del propio cuerpo para obtener nuevos tejidos u órganos funcionales (79). En general, la IT busca fabricar implantes funcionales que puedan inducir la regeneración de los tejidos (80). Una de las principales ventajas de la IT es la reparación con precisión del defecto del tejido. Por lo tanto, es de esperar que se pueda satisfacer la demanda de injertos de tejidos, reconstrucciones quirúrgicas y dispositivos mecánicos para la reparación de tejidos (81). Este campo ha avanzado tanto en los últimos tiempos que se está utilizando para desarrollar terapias para pacientes que padecen enfermedades crónicas graves que afectan a órganos importantes como el riñón, el corazón y el hígado proporcionándoles tejidos sanos diseñados para sustituir su tejido enfermo y restaurar su función (76). En la actualidad, la IT se ha desarrollado en dos tipos (Figura 6): Figura 6: Enfoques de Ingeniería Tisular.  Uno es la IT in vitro, que consiste en implantar un complejo funcionalizado de células y andamios, cultivados in vitro para la formación deseada de nuevos tejidos (82,83).  La otra es la IT in vivo, basada en la implantación de un andamio que será el encargado de reclutar las células necesarias para la funcionalización in vivo (84– INTRODUCCIÓN 16 86). Existen estudios que propician un nicho microambiental de apoyo que influye en el comportamiento de las células endógenas en el sitio de interés. Una variante dentro de la IT in vivo es la IT in situ, donde el andamio a implantar es cargado con citoquinas o moléculas de señalización paracrina para impulsar la regeneración endógena proporcionando señales a las células huéspedes (87). En nuestro caso nos vamos a centrar en la IT in vitro. Normalmente, para lograr una eficacia satisfactoria en la reparación de tejidos en esta disciplina hay que tener en cuenta tres factores clave (Figura 7) (81): (i) La selección de las células apropiadas, que contribuyen a la formación del tejido deseado. (ii) La elección correcta de los andamios que sirvan para una imitación de la ECM, que no sólo ofrezca un soporte tridimensional sino que genere un entorno de crecimiento para que las células contribuyan a la formación del tejido. (iii) Conseguir complejos célula-andamio que permitan un control de las interacciones entre las células y los andamios que dirijan la regeneración tisular deseada. Figura 7: Componentes de la Ingeniería Tisular. Como se está comentando es muy importante el uso de andamios tisulares que recreen la matriz extracelular (ECM). Este concepto referencia a una red de moléculas y proteínas y fibras, en su mayoría de colágeno que proporcionan un soporte tridimensional a las células para así formar los tejidos y órganos (88). Además, la ECM le confiere a las células resistencia a la tracción (89). Aproximadamente el 30% de todas las proteínas del cuerpo de los vertebrados están compuestas por colágeno, aunque este INTRODUCCIÓN 17 valor varía en función del tejido. Es muy importante conocer la ECM del tejido a recrear porque crea un entramado y un microambiente que modulará las células y su comportamiento. La célula está inmersa en un paisaje dinámico compuesto por macromoléculas insolubles de la ECM, factores bioactivos solubles y células vecinas (90). El entorno que controla el destino de la célula dentro del cuerpo vivo se denomina microambiente celular. Este se compone de señales de las células vecinas, estímulos físicos, factores solubles, como los factores de crecimiento, y factores insolubles, como la ECM. Se ha demostrado que la ECM influye en la mitogénesis y la quimiotaxis celular (91), dirige la diferenciación celular (92–94) e induce respuestas constructivas de remodelación del tejido del huésped (95–97). La regeneración del tejido a partir de un cultivo de células es un procedimiento limitado; se ha comprobado que estas células necesitan un armazón físico que haga una función similar a la ECM y dirija la organización celular. La ECM de todos los tejidos define en gran medida el nicho microambiental y modula la migración, el comportamiento y el fenotipo de las células residentes durante el desarrollo, la homeostasis y en respuesta a las lesiones (87). 1.2.2. Componentes dentro de la Ingeniería Tisular 1.2.2.1. Andamios tisulares Los andamios son estructuras diseñadas para proporcionar un entorno tridimensional en la formación de tejidos, constituyendo el soporte estructural que permite dirigir el crecimiento celular y facilitar el desarrollo de tejidos (87). Debe permitir la adhesión, el crecimiento, la diferenciación y la colonización de las células para obtener un nuevo tejido que tenga la misma funcionalidad que el sustituido. Por lo general, se trata de un biomaterial poroso. La porosidad (tamaño, distribución, diámetros de las interconexiones) desempeña un papel importante en el crecimiento y la rehabilitación de las células: cuanto mayor sea la vascularización del órgano objetivo, mayor deberá de ser el volumen poroso desarrollado y el área específica del andamio. Otros muchos parámetros, como las propiedades fisicoquímicas y mecánicas del material, son muy importantes: la rugosidad, la química de la superficie, la energía de la superficie, el tipo de material (polímero o cerámica), la degradación y los productos de degradación, etc (98). La regeneración de las propiedades físicas de la ECM nativa es importante para la regeneración de las INTRODUCCIÓN 18 propiedades biológicas, es imprescindible el biomimetismo de la ECM, que se define como la propiedad de un andamio de imitar la estructura del órgano o tejido que reemplaza (87). En el epígrafe 1.3.3 sobre las propiedades de biomateriales se detallan las propiedades que debe de tener un biomaterial y un andamio tisular. 1.2.2.2. Fuentes celulares En la actualidad se utilizan diversos tipos de células para la IT. Entre ellas se encuentran las autólogas, las alogénicas, las progenitoras, las células madre adultas unipotentes o multipotentes y las iPSC. Para algunas aplicaciones, la capacidad de expandir un número suficiente de células autólogas a partir de una pequeña biopsia está bien establecida (99). Sin embargo, en muchos casos, es un reto cosechar y/o expandir suficientes células autólogas apropiadas para este propósito. Nuevas fuentes o métodos para obtener estos tipos celulares en cantidades pueden hacer avanzar la ingeniería de estos tejidos/órganos y beneficiar significativamente el tratamiento de las enfermedades asociadas (100). La extensión de este enfoque a otros sistemas de tejidos y órganos dependerá en gran medida de la búsqueda de fuentes de células madre y progenitoras adecuadas. Actualmente se están investigando intensamente tres fuentes principales de células madre (76): 1. Las células madre embrionarias, que se derivan de embriones humanos desechados, y las células germinales embrionarias equivalentes; 2. Las iPSC derivadas de la reprogramación genética de células somáticas; y 3. Las células madre de tejidos adultos autólogas o alogénicas (procedentes de tejidos fetales, neonatales, pediátricos o de donantes adultos). Todas las células madre tienen en común su capacidad de autorrenovación y su capacidad para dar lugar a determinadas clases de células diferenciadas. Las células madre embrionaria, las células germinales embrionarias e iPSC pueden servir como precursoras de muchos tipos de células especializadas que se encuentran durante el desarrollo normal y, por tanto, son pluripotentes. Las células madre adultas suelen estar restringidas a conjuntos limitados de linajes celulares, por lo que se denominan unipotentes (limitadas a un único destino) o multipotentes (pueden dar lugar a múltiples tipos celulares) (76). INTRODUCCIÓN 19 En nuestro trabajo nos vamos a centrar en dos líneas celulares de mioblastos:  L6: es una línea celular de mioblastos de rata.  C2C12: es una línea celular de mioblastos de ratón C2 establecida por Yaffe y Saxel (101). Las células C2C12 se cultivan como mioblastos proliferativos y, mientras no alcancen la confluencia, las células pueden pasarse y expandirse indefinidamente. Sin embargo, al alcanzar la confluencia, los mioblastos comienzan a diferenciarse, fusionándose en fibras alargadas, multinucleadas y ocasionalmente contráctiles. Esta diferenciación es estimulada por la retirada de factores de crecimiento e implica la expresión coordinada de muchos genes específicos y proteínas del músculo (102). 1.2.2.3. Biorreactores Se ha establecido ampliamente que los modelos de cultivo bidimensionales (2D) in vitro demasiado simplificados no pueden representar las complicadas respuestas fisiológicas o fisiopatológicas humanas. Aunque los avances en los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) son prometedores, la complejidad celular heterogénea, junto con la ECM asociada del tejido nativo, no ha podido ser recapitulada por completo. En las últimas décadas, los biorreactores ofrecen la solución de ingeniería para recrear el entorno fisiológico de la regeneración tisular y se están perfeccionando para ofrecer mejores condiciones de cultivo in vitro y ex vivo, para acabar convirtiéndose en sistemas de crecimiento tisular seguros, ampliables y reproducibles (103). 1.3. Biomateriales 1.3.1. Definición La definición actualizada de un biomaterial es la siguiente "material destinado a suplir o sustituir todo o parte de un órgano deficiente". Esta última definición integra el entorno biológico (sistema vivo, fluidos biológicos, proteínas, células y tejidos), así como las limitaciones y funciones biológicas. Por lo tanto, los biomateriales se diferencian de otros materiales en el sentido de que deben tener la capacidad de existir en contacto con los tejidos del sistema vivo sin provocar un grado inaceptable de defensa o una respuesta hostil del huésped (79). INTRODUCCIÓN 26 1.3.4.1. Naturales 1.3.4.1.1. Colágeno El colágeno es una de las principales proteínas que podemos encontrar en la ECM la cual está implicada en la expresión de diferentes funciones de las células y tejidos. Los componentes del colágeno interactúan secuencialmente entre sí y con otros constituyentes de la ECM para producir estructuras de orden superior con numerosos niveles jerárquicos de asociación y funciones específicas. Al tratarse de una de las principales proteínas de la ECM, es muy usada para reproducir su función. No obstante, hay que tener en cuenta de que la ECM va a variar según el tipo de tejido por lo que el diseño de ECM va a ser diferente según el tejido al que se dirija (120). Principalmente, el colágeno puede distinguirse en dos tipos: fibrilar y no fibrilar. Hay 28 tipos de colágeno y los tipos de colágeno I, II y III son los colágenos clásicos que forman fibrillas y representan el 80-90% de todos los colágenos del cuerpo humano (120,121). La fibrilla de colágeno es muy importante desde el punto de vista de que sus propiedades y la morfología proporcionan la clave de las estructuras del andamio en el cuerpo según la localización (120). El término colectivo "colágeno" engloba a toda una familia de glicoproteínas que se caracterizan por tres rasgos característicos. El primero de ellos es la secuencia de repetición de aminoácidos [Gly-X-Y]n. El segundo rasgo característico es la ocupación de las posiciones X e Y por la prolina y su forma hidroxilada, la hidroxiprolina, respectivamente. En tercer lugar, la triple hélice derecha está formada por tres cadenas de poliprolina izquierda de idéntica longitud, lo que confiere al colágeno una estructura cuaternaria única. La molécula de colágeno está compuesta por una región de triple hélice y dos regiones no helicoidales en cada extremo de la hélice. La conformación de la triple hélice es el elemento estructural que define a todos los colágenos. La triple hélice del colágeno (estructura terciaria) tiene una estructura en espiral formada por tres cadenas polipeptídicas paralelas (estructura secundaria) que se enrollan una alrededor de la otra en una hélice regular para generar una estructura en forma de cuerda. Los enlaces de hidrógeno intramoleculares entre las glicinas de las cadenas adyacentes estabilizan la triple hélice. La prolina y la hidroxiprolina estabilizan la molécula de colágeno debido a su naturaleza alicíclica, y dan rigidez a la cadena, donde se producen impidiendo la INTRODUCCIÓN 27 rotación alrededor del enlace CN (122). La figura 9 representa gráficamente la estructura del colágeno fibrilar. Figura 9: Estructura del colágeno fibrilar. Las fibrillas de colágeno presentan un alto grado de alineación axial, lo que da lugar a una periodicidad característica, debida a la alternancia de zonas de solapamiento (dos hélices triples adyacentes) y de separación (hélices triples alineadas cabeza con cola con algo de espacio entre ellas), producida por la disposición de empaquetamiento específica de las moléculas de colágeno de 300 nm de longitud y 1,5 nm de diámetro (122). Se ha demostrado que el colágeno posee una no inmunogenicidad y una buena compatibilidad celular, y puede obtenerse de diversas fuentes. El colágeno se purifica tras ser tratado con un ajuste de pH o con digestión de pepsina. En cualquier caso, el colágeno debe ser soluble en agua para poder procesarlo y utilizarlo como biomaterial. Existen varios tipos de matriz de colágeno: gel, película, micropartículas, conjugado, minipellets o esponja (123,124). Sin embargo, todavía hay muchos problemas que superar como la baja resistencia mecánica y la rápida tasa de degradación en solución acuosa del colágeno no reticulado. Principalmente, la reticulación se realiza utilizando grupos α-amino de lisina o hidrolisina, y residuos de ácido aspártico o ácido glutámico (123–125). Este biopolímero puede ser reticulado utilizando la temperatura o el cambio de pH o incluso utilizando la vitamina Riboflavina (126,127). El reticulado del colágeno les proporciona resistencia a la tracción y propiedades viscoelásticas de las que el colágeno no reticulado carece (128,129). La reticulación o gelificación del colágeno requiere un mínimo de 30 minutos a 37 °C. Por lo tanto, el uso del colágeno directamente en la bioimpresión 3D es INTRODUCCIÓN 28 difícil y se suele emplear en combinación con otros materiales para solventar este problema (128). Existen trabajos de bioimpresión 3D donde combinan el colágeno con alginato sódico para el desarrollo de condrocitos presentando un aumento en la viabilidades y de las propiedades mecánicos de los andamios generados (130). Las revisiones actuales (131) indican que los trabajos se han centrado en la regeneración tisular de piel de vasos sanguíneos. 1.3.4.1.2. Alginato El alginato es un biopolímero aniónicos naturales extraídos de las paredes de algas pardas de la familia de las “feofíceas”, tales como Laminaria hyperborea y Laminaria Lessonia (132). Es un polisacárido construido a partir de dos monómeros primero, el ácido 1,4-β-D-manurónico (MA) y segundo, el ácido 1,4-α-L-ácido gulurónico (GA), que se organizan en una configuración para formar una larga cadena de polímero de naturaleza aniónica (133). La longitud de la cadena y el porcentaje de cualquiera de las unidades repetitivas alteran el funcionamiento del polímero e inducen a diferentes propiedades (134,135). El alginato es conocido por su alta biocompatibilidad, baja inmunogenicidad y por ser biodegradable (136). Tal es así que, existen varias formas de alginatos que están aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para su uso principalmente como agente espesante (137). El alginato muestra una química de reticulación y encapsulación de proteínas y otras biomoléculas como fármacos gracias a su alta tasa de permeabilidad (138), permitiendo su liberación paulatina para la administración (139), pero no admite la infiltración celular. El alginato no es digerido enzimáticamente por los mamíferos y los hidrogeles de alginato solo se degradarán de manera incontrolada cuando los iones divalentes se intercambien con los medios circundantes (136). La tasa de degradación y las propiedades mecánicas del hidrogel se consideran factores críticos en la formación de nuevos tejidos. Su degradación depende en gran medida del grado de oxidación, del pH y de la temperatura del medio (140). A pesar de todas estas ventajas, se ve afectado por una estabilidad mecánica y biológica (adhesión celular, inhibiendo la proliferación celular) inadecuada producto de la ausencia INTRODUCCIÓN 29 de péptidos de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), los cuales intervienen en la unión celular (136). Para solventar estas desventajas, se reticulan largas cadenas de alginato. Existen diferentes formas de reticulación, algunas son la reticulación covalente (141) o la reticulación celular (142). Pero la más utilizada es la reticulación iónica con iones calcio (figura 10), bario, magnesio y estroncio, que potencian la gelificación del alginato favoreciendo la encapsulación de células (133). El calcio es el más utilizado debido a su carencia de toxicidad. Además, su lenta biodegradabilidad in vivo puede mejorarse oxidando el alginato, ya que proporciona a la estructura lugares más reactivos (136). Figura 10: Estructura del gel de alginato y estructura tras reticulación (143). Así, a partir del análisis de la literatura, se puede afirmar que, aunque los alginatos presentan retos característicos de inestabilidad mecánica y fijación celular (debido a su origen natural), estos biomateriales presentan grandes cualidades para la IT gracias a la variedad de mecanismos de reticulación modificación de la superficie, compuestos y en combinación con otros biomateriales (136). A pesar de los inconvenientes que presentan los hidrogeles de alginato, sus posibles modificaciones permiten que sean numerosas las aplicaciones de los hidrogeles de alginato:  Alginatos en apósitos para heridas: Los hidrogeles de alginato se utilizan ampliamente como interfaces de heridas en apósitos destinados a favorecer la cicatrización tras quemaduras, úlceras por presión, úlceras venosas y otras heridas cutáneas exudativas. Dado que los alginatos permiten la difusión relativamente INTRODUCCIÓN 30 libre de agua y solutos, se cree que los apósitos de alginato generan un entorno relativamente fisiológico en la interfaz de la herida que favorece la cicatrización (144).  Alginatos en la encapsulación: En la actualidad se está trabajando en el uso de biomateriales que sirvan como vehículo transportador de fármacos. La estructura del alginato protege y facilita la administración de los compuestos terapéuticos previstos. Debido a su flexibilidad, capacidad de modificación y biocompatibilidad bien estudiada, los hidrogeles a base de alginato suelen ser candidatos para esta aplicación. Se han encapsulado en el alginato agentes terapéuticos que van desde la insulina hasta la doxorrubicina, pasando por células y tejidos enteros, que se han administrado en el entorno fisiológico y se han estudiado en ensayos preclínicos y clínicos (144).  Alginato en bioimpresión 3D e IT: Hay trabajos que han estudiado el uso del alginato para la bioimpresión 3D de andamios de alginato (136). 1.3.4.1.3. Gelatina La gelatina es una forma desnaturalizada e hidrolizada de colágeno que se obtiene hidrolizando las fibrillas de proteína de colágeno mediante métodos físicos y químicos (145). Se obtiene principalmente de la piel de cerdo y es relativamente rentable en comparación con el colágeno debido a su forma desnaturalizada y es menos inmunogénica (146). La propiedad termorresistente de la gelatina se debe al proceso de desnaturalización del colágeno que aporta las propiedades de gelificación reversible en la gelatina. Se gelifica fácilmente a baja temperatura y se funde a mayor temperatura en estado líquido. La gelatina se ha utilizado en varios formatos y mezclas para aplicaciones de IT debido a su biodegradabilidad, biocompatibilidad y propiedades de procesamiento simples (145). Se encuentra básicamente en dos tipos de gelatinas, el tipo A, que es obtenido por el tratamiento ácido del colágeno y el tipo B que se obtiene por el tratamiento alcalino. El valor Bloom o fuerza de gel depende de la cantidad de cadenas de colágeno intactas y de la longitud media total de la cadena del polímero natural (147). A pesar de ser la forma desnaturalizada del colágeno, contiene muchos aminoácidos como glicina, prolina, ácido glutámico, hidroxilprolina, arginina, alanina, ácido aspártico, INTRODUCCIÓN 31 etc., que despiertan el interés de los investigadores para su uso como biomaterial en IT en la fabricación de andamios (148) y otros campos de la industria farmacéutica como microesferas (149) y vehículos de administración de fármacos, factores de crecimiento (150) y células (151), selladores para prótesis vasculares o apósitos para heridas (145). La gelatina presenta algunas limitaciones como la falta de propiedades mecánicas y la rápida biodegradación. No obstante, algunos trabajos se han centrado en el uso de la reticulación gelatina (152,153) y de su modificación química (154) para mejorar la estabilidad térmica y mecánica. En IT, la gelatina ha sido usada en 3 estados diferentes; andamios porosos en combinación con otros biomateriales como acetato de vinilo y quitosano (155) presentando una estructura porosa, adhesión celular y alineación; también se han preparado hidrogeles de gelatina reticulada y PVA o con agarosa; finalmente se han creado andamios mediante electrospinning de gelatina en combinación con polímeros como PCL para la regeneración de piel (156). Otros ensayos de andamios han mostrado una buena biocompatibilidad y potencial de diferenciación con células estromales mesenquimales alogénicas en cerebro de rata (145). 1.3.4.1.4. Fibrina La fibrina es una proteína que se encuentra en la sangre y ayuda a la coagulación. El hidrogel de fibrina puede fabricarse a partir de fibrinógeno mediante el tratamiento enzimático de la trombina. Este hidrogel tiene una excelente biocompatibilidad y propiedades de biodegradación, pero tiene propiedades mecánicas débiles. Es por ello que se suele mezclar con otros polímeros para aumentar la viscosidad de la tinta. Los hidrogeles de fibrina han sido usados en regeneración de uretra, nervios y encapsulamiento de células de Schwann (134). 1.3.4.1.5. Ácido hialurónico El ácido hialurónico (HA) es un polisacárido natural que se observa abundantemente en la ECM del cartílago y los tejidos conectivos. Es un biomaterial útil por sus propiedades de adhesión celular. Al igual que otros polímeros naturales, el HA tiene unas propiedades mecánicas bajas y un comportamiento de gelificación lento en comparación con los hidrogeles de polímeros sintéticos. Debido a sus escasas propiedades mecánicas y a su lento tiempo de gelificación, se suele modificar químicamente o mezclar con otros polímeros para lograr la imprimibilidad en 3D. Hasta ahora se han descrito muchas INTRODUCCIÓN 32 mezclas diferentes de biotintas basadas en HA. Este puede ser reticulado con otros polímeros para aumentar la estabilidad de la estructura impresa manteniendo la adhesión y viabilidad celular, como el PEG o la fibrina, que se usó en regeneración de menisco y vasos vasculares, respectivamente. Otros trabajos aumentaron las propiedades mecánicas y reológicas aumentando la irradiación ultravioleta (UV) a la que se expone el gel de HA metacrilado (116,134). 1.3.4.2. Sintéticos 1.3.4.2.1. PCL La policaprolactona (PCL) es un polímero semicristalino, que presenta un punto de fusión de 59-69ºC y una temperatura de transición vítrea de -60ºC. Las propiedades de PCL incluyen disponibilidad, no toxicidad, biocompatibilidad y alta elasticidad (157). La PCL es un poliéster alifático sintetizado mediante la polimerización de apertura de anillo de la ε-caprolactona (Figura 11). La degradación del PCL es muy lenta debido a los cinco grupos -CH2 en las cadenas repetidas alifáticas y la degradación se produce principalmente a través de la escisión hidrolítica de los enlaces éster y, por lo tanto, ha recibido mucha atención como material para su uso como biomaterial implantable (158). Se trata de uno de los biomateriales poliméricos más prometedores que se ha utilizado como andamio para la medicina regenerativa. La PCL es un biomaterial aprobado por la FDA que se utiliza en aplicaciones médicas como dispositivo de administración de fármacos, suturas y barrera de adhesión (147). Figura 11: Estructura de la PCL. La PCL ha encontrado una serie de aplicaciones como andamios para aplicaciones de IT que abarcan una gama de tejidos, desde el hueso y el cartílago hasta los tejidos blandos como los vasos sanguíneos y la piel, debido a la facilidad de fabricación. Este polímero puede adaptarse a diferentes andamios 3D utilizando diferentes técnicas de fabricación como electrospinning, la impresión 3D y los métodos de extrusión (147). No obstante, uno de los inconvenientes es el problema de la hidrofobicidad, que dificulta la adhesión INTRODUCCIÓN 33 celular, por lo que generalmente se recomienda su uso modificando la superficie o por la síntesis de otros polímeros hidrofílicos (159). Diversos estudios han estudiado el uso de la PCL en andamios de impresión 3D con quitosano (160) o solos de PCL (161) en la regeneración de tejido óseo. Pektok et al. (162) produjeron andamios biodegradables de pequeño diámetro fabricados con nanofibras de PCL mediante electrospinning mostrando una mejora en la cicatrización que los injertos de ePTFE. Otra de las aplicaciones que presenta la PCL es para la liberación de fármacos a largo plazo, ya sea a través de microfibras o microsesferas (163). 1.3.4.2.2. Matrigel Nombre comercial de una solución de proteína gelatinosa secretada por las células de sarcoma de ratón, que presenta una gran similitud a la ECM y se utiliza como sustrato de matriz de membrana basal para el cultivo celular. La composición del Matrigel es similar a la de una membrana basal conservada en el desarrollo temprano que facilita la organización de los microtejidos en diferentes tipos de tejidos y diferentes especies. Los componentes son la laminina-111, el colágeno IV, la entactina y el proteoglicano de heparán sulfato, que proporcionan funciones tanto estructurales como de transducción de señales. Todos estos factores la hacen altamente similar a la membrana basal embrionaria. Además de los componentes principales, se han identificado varios factores de crecimiento, como el FGF, el EGF, el TGF, el IGF y el PDGF (164). 1.4. Técnicas de Fabricación de andamios 1.4.1. Bioimpresión 3D 1.4.1.1. Definición La bioimpresión es una subcategoría de la impresión 3D o fabricación aditiva (AM) que se define por la impresión de estructuras utilizando células viables, biomateriales y moléculas biológicas (165,166). La bioimpresión debe producir andamios con una microarquitectura adecuada que proporcione estabilidad mecánica y promueva el crecimiento celular, al tiempo que considera el impacto de la fabricación en la viabilidad celular (167). INTRODUCCIÓN 34 Tras esta definición, resulta imprescindible definir la impresión 3D, que no es más que un proceso para crear piezas directamente de un modelo de diseñado por ordenador (CAD). La impresión 3D es una técnica de fabricación por capas, siendo su característica más llamativa que las piezas son creadas por adición y no por sustracción (168). La impresión 3D o AM ha revolucionado la perspectiva del diseño de los dispositivos médicos. Esta novedosa tecnología nos permite fabricar un prototipo de un diseño CAD en un tiempo relativamente corto y con un bajo costo, evitando los largos procesos de los métodos de fabricación convencionales (168). Sus usos y aplicaciones en biomedicina han sido muy diversos, abarcando desde sus usos en cirugía como modelos anatómicos para la planificación quirúrgica y guías para la inserción de tornillos hasta la IT y órganos artificiales pasando por sistemas de administración de medicamentos o prótesis y órtesis para países de bajos recursos (168). 1.4.1.2. Historia de la bioimpresión 3D La bioimpresión ha surgido de la unión de la AM, la IT + la MR y la biofabricación. Estas tecnologías comenzaron sus andaduras en la década de 1980 por separado hasta que a comienzos de este siglo convergen para dar paso a la bioimpresión 3D (169). Los inicios de la bioimpresión 3D se remontan a los comienzos de la impresión 3D (Figura 12). Esta tecnología comenzó en la década de 1970, pero no fue hasta 1981 cuando Hideo Kodama describió esta tecnología. Su proceso de AM se basó en la reticulación de los polímeros con radiación UV (170). Aunque presentó una solicitud de patente para esta invención en 1980, esta expiró sin pasar a las fases posteriores del proceso de patentes japonés (169). En 1984, Charles Hunt creó objetos 3D en versión reducida mediante capa a capa y exposición a la luz UV, lo que hoy en día conocemos como estereolitografía (SLA) (170). Durante la década y la siguiente comenzaron a surgir otras versiones de esta tecnología como es el modelado por deposición fundida (FDM), donde un termoplástico es extruido y modelado cuando se aplica calor (169); el sinterizado selectivo por láser (SLS), que implica la deposición por fusión de polímero en polvo para crear un objeto 3D (171); el robocasting que ha empleado materiales que experimentarían el flujo y la estabilización simplemente mediante la aplicación y el cese de las fuerzas impulsoras del flujo (172). INTRODUCCIÓN 35 Figura 12: Línea del tiempo de la bioimpresión 3D. Los primeros pasos de la bioimpresión consistieron en la aplicación de las tecnologías de impresión 3D (SLS, SLA, FDM) existentes en sistemas de liberación de fármacos (173) o regeneración ósea (174,175). A principios de la década de 2000 los desarrollos se centraron en la innovación de los materiales a usar, así surgió el uso de hidrogeles (176). Además la expiración de la patente del FDM a mediados de los años 2000, hizo que aumentara la investigación de la impresión 3D (169). Poco a poco, esto fue evolucionando, y la creación de andamios biofuncionales o bioactivos condujo a centrarse en el concepto de bioimpresión de tejidos y órganos. De esta forma se comenzaron a inventar nuevas técnicas para desarrollos en IT y facilitar el control de los microambientes celulares y las interacciones célula-material como la inclusión de células dentro de hidrogeles (177). Durante la primera década de los 2000, el creciente interés y la expectación en torno a la tecnología de bioimpresión se relacionaron con un amplio interés en los enfoques de biofabricación para abordar los desafíos dentro de la IT (178). Comenzaron a surgir algunas empresas como Organovo, la cual fue el resultado de una técnica de bioimpresión donde se depositaban agregados celulares y esferoides con una impresora ink-jet modificada provista de agujas luer-lock (179), se trata de una tecnología híbrida basada en gotas que apuntaba al eventual uso de tecnologías basadas en la extrusión en la impresión de esferoides (179,180). INTRODUCCIÓN 42 bioimpresión, la fabricación de una capa puede describirse como la transferencia de energía (mecánica, térmica, química y electromagnética) de la máquina de bioimpresión al material cargado de células. Este proceso puede afectar al fenotipo y la viabilidad de las células, dañar las membranas celulares o alterar el equilibrio osmótico entre las células y el entorno externo. Uno de los criterios clave para una buena biotinta es proteger las células de las fuerzas mecánicas dañinas que se experimentan durante la extrusión (205).  Otros aspectos importantes deseables para un biotinta son la gelificación in situ, las propiedades viscoelásticas, el bajo coste, la fácil disponibilidad, la escalabilidad industrial, la biomimetización de las estructuras internas de los tejidos, la integridad mecánica y la compatibilidad inmunológica, cuando se implantan in vivo, y la amplia variedad de diferentes tipos de células. La permeabilidad del gas de oxígeno, los residuos metabólicos y el transporte de nutrientes también son importantes (168). 1.4.2. Electrospinning 1.4.2.1. Definición En los últimos tiempos, el electrospinning ha surgido un gran interés por la capacidad de crear nanofibras. Fue patentado por primera vez por Cooley (206) y Morton (207) en 1902. En el campo de la biomedicina, estas nanofibras pueden utilizarse con diferentes funcionalidades, Por un lado, son capaces de imitar la ECM de los tejidos abarcando con una gran superficie (208), mientras que también pueden ser usados como dispositivos de administración de fármacos, fibras antimicrobianas y encapsulación de antioxidantes en el área de la ciencia de los alimentos (209). El electrospinning consta de una bomba de jeringa con una jeringa, donde se encuentra la solución del material, una hilera y un colector de fibras conectado a una fuente de alimentación de alto voltaje (Figura 17). El material es disuelto en un disolvente conveniente, el cual al final del proceso va a ser evaporado. La fuente de alimentación va a generar un campo eléctrico entre la punta de la jeringa y el colector. La bomba de jeringa expulsa la solución del polímero. El potencial eléctrico generado hace que el polímero se estire debido a la alta reacción de la tensión superficial de la solución por las repulsiones electrostáticas de la solución y el campo eléctrico aplicado. Cuando el INTRODUCCIÓN 43 campo eléctrico aplicado supera es supera la tensión superficial del polímero forma un hilo de polímero estable que sale del cono de Taylor. El hilo de polímero es expulsado bajo la influencia del campo eléctrico que lo desplaza hacia el colector conectado a tierra. El chorro de solución que se aplica con cargas electrostáticas sufre un estiramiento antes de llegar al colector. Finalmente, el chorro se solidifica en el colector en forma de nanofibras con la evaporación de los disolventes (210). Figura 17: Esquema de electrospinning. El electrospinning puede considerarse una variante de la técnica de electrospraying (211), ambas basadas en el uso de un alto voltaje para expulsar chorros de líquido. Las principales diferencias entre el electrospinning y el electrospraying radican en la viscosidad y viscoelasticidad del líquido implicado y, por tanto, en el comportamiento del chorro. Durante el electrospinning, el chorro puede mantenerse en forma continua para producir fibras en lugar de romperse en gotas (para la formación de partículas) como ocurre con la electrodeposición (212). El grosor de las fibras y la morfología de las mismas puede ser modificado variando diferentes parámetros del electrospinning tales como el tipo de polímero, la naturaleza del disolvente, el voltaje aplicado, la distancia entre la punta de la jeringa y el tipo de colector (213). Por ejemplo, un colector tipo rotatorio permite obtener nanofibras alineadas mientras que el colector de tipo estático favorece la generación de nanofibras aleatorias (210). INTRODUCCIÓN 44 1.4.2.2. Historia La historia de producción de fibras se remonta a la prehistoria, tal es el hecho que se han encontrado artículos de algodón del año 5000 a.C. En el año 1300 se inventó el huso para fabricar fibras de lana y algodón para la producción de tejidos (Figura 18) (214). Figura 18: Línea del tiempo de electrospinning. El concepto de electrospinning comenzó a surgir en 1600 cuando William Gilbert observó la deformación de una gota de agua en forma de cono en presencia de un campo eléctrico (215). Stephan Gray, observó un siglo después como la gota podía generar un hilo muy fino (216). Charles V. Boys, en 1887, demostró la formación de fibras finas a partir de un fluido viscoelástico en presencia de un campo eléctrico externo y cómo estas eran capaces de moverse hacia el borde del plato, lo que ahora conocemos como colector (217). Sin embargo, no es hasta 1902 cuando John Cooley y William Morton presentaron dos patentes sobre electrospinning, respectivamente en las que se describía un prototipo de montaje para electrospinning (206,207). Posteriormente, Anton Formhals presentó un par de patentes adicionales en 1934 y 1944 para divulgar la mejora del equipo, avanzando hacia la comercialización del electrospinning para la fabricación de hilos textiles (218,219). Durante la segunda guerra mundial, la Unión Sovieta desarrolló filtros de aire INTRODUCCIÓN 45 mediante electrospinning. Tras estos acontecimientos, el desarrollo de la técnica de electrospinning experimentó 20 años de estancamiento, ya que no recibió mucha atención por parte del mundo académico ni de la industria. Hasta que en 1977, se patenta el uso de esta tecnología como aplicación para material de vendaje (220). A principios de la década de 1990, gracias a la accesibilidad que presentaban los microscopios electrónicos, se comenzó a reinventar la técnica y a incrementar el uso de polímeros orgánicos para la generación de nanofibras por los grupos de Darrell Reneker y Gregory Rutledge (221,222). Durante principios de este siglo, se comenzaron a desarrollar nuevas estrategias para controlar la estructura, porosidad, morfología y la alineación de las nanofibras lo que aumentó sus oportunidades en aplicaciones en la biomedicina (223). También se desarrolló diferentes tipos de electrospinning como el coaxial que permite producir nanofibras recubiertas (224). En la actualidad, varias empresas han diseñado y puesto en marcha líneas de producción industrial para fabricar nanofibras electrospiladas en grandes volúmenes, lo que permite obtener productos comerciales posteriores. Con la obtención de la marca de Conformidad Europea (CE) para el injerto de acceso vascular AVflo de Nicast, cada vez son más los productos biomédicos basados en nanofibras de electrospinning para uso clínico (212). 1.4.2.3. Aplicaciones La investigación biomédica actual está investigando las posibles aplicaciones biomédicas de las nanofibras fabricadas mediante electrospinning que pueden ser divididas en 2 ramas:  Sistemas de liberación de fármacos: Se han desarrollado varios sistemas de administración de fármacos con nanofibras para la administración local de agentes terapéuticos debido a la gran flexibilidad en la elección del material, la facilidad de encapsulación del fármaco y la gran versatilidad en las formulaciones de los mismos (225). Es posible crear una liberación de fármaco en 2 fases, una inicial en ráfaga seguida de una liberación prolongada, basada en la difusión del fármaco y la degradación del polímero para las formulaciones de nanofibras electrospinning (226). Sin embargo, hay veces que la liberación en ráfaga no es deseable y es conveniente INTRODUCCIÓN 46 su eliminación, para ello, el uso de electrospinning coaxial nos puede ayudar a eliminar esta primera liberación e incluso retrasar el inicio de la liberación hasta que las fibras comienzan a ser degradadas (227). No solamente es posible la encapsulación de fármaco en nanofibras, sino que hay incluso estudios que han encapsulado y liberado factores de crecimientos, tales como el VEGF o el FGF controlando su liberación con nanopartículas. Esto aceleró la epitelización y la maduración de los vasos sanguíneos (228).  IT: o Recreación de tumores: Las fibras electrospinning como andamios 3D para la recreación de modelos in vitro de tumores han sido muy usados ya que permiten imitar fielmente la interacción célula-ECM (229). Los andamios de electrospinning se han usado en la recreación de sarcoma de Ewing en 3D, melanoma y cáncer de mama, glioblastoma presentando una reproducción mejor del tumor. No solamente han sido empleados para recrear modelos tumorales, sino también como tejidos de modelos neuronales, modelos de mucosas, modelos de tejidos de la barrera hematoencefálica y modelos de cultivo de células de la glía (225). o MR: Los polímeros sintéticos, como el PLGA y el PCL, se utilizan ampliamente por su buena integridad mecánica (230). En comparación, los materiales naturales, como el colágeno, la gelatina y el quitosano, presentan propiedades biocompatibles superiores, aunque con propiedades mecánicas más débiles (231). Por lo tanto, se han desarrollado andamios híbridos combinando polímeros sintéticos y naturales o polímeros sintéticos/naturales y partículas inorgánicas (232). De este modo, mediante la modificación de las nanofibras se pretende poder controlar el comportamiento celular en función de lo que nuestras investigaciones requieran gracias a la recreación del microambiente y de la ECM (225). Es posible el recubrimiento de fibras sintéticas con polímeros naturales o factores de crecimiento mediante el electrospinning coaxial o la modificación de la superficie (233). La diferenciación celular es un factor controlable a través de las señales topográficas tales como el tamaño (234), la orientación (235) o las propiedades mecánicas (236). Por ejemplo, un andamio con fibras alineadas y blandas promoverán la diferenciación de músculo o neural mientras que una orientación más INTRODUCCIÓN 47 aleatoria y unas propiedades mecánicas más rígidas promueven la osteogénesis. La creación de andamios con fibras electroactivas con biomateriales de nueva generación permiten recrear mejor la estructura y la conductividad de la ECM para la propagación de señales eléctricas y pueden regular la adhesión, la proliferación y la diferenciación de las células (237), facilitando la regeneración de los nervios, el corazón y el músculo esquelético (238). Los andamios de nanofibras funcionalizadas pueden mejorar la diferenciación de las células madre de forma significativa y ofrecer señales bioquímicas sinérgicas y guía de contacto para dirigir el destino de las células madre (239). La migración celular desempeña un potente papel en el desarrollo embrionario, esta puede ser controlada mediante la guía topográfica (240,241), o por la funcionalización de fibras mediante la adición de señales (242). Además de la topografía, las propiedades mecánicas también afectan a la migración celular (243). La señalización química es fundamental para el reclutamiento de células endógenas, la funcionalización de los andamios de fibra con moléculas bioactivas y factores quimiotácticos como el factor derivado de células estromales (SDF-1α), (244) el FGF y el VEGF es una vía prometedora en la IT (245), y por impresión EHD a chorro controlada espacialmente (225). 1.5. Biorreactores Los biorreactores clásicamente han sido asociados a los bioprocesos industriales como la fermentación de levaduras. Tuvieron su origen en 1857 (246), pero sólo se ha utilizado ampliamente en la IT y la MR hasta que el concepto de IT fue propuesto y definido formalmente por la National Science Foundation (NSF) (Estados Unidos) en 1987 (247). Sin embargo, a lo largo de las últimas décadas, esta idea ha ido evolucionando hasta hoy en día donde frecuentemente se aplican en IT. Ahora está claro que los biorreactores representan no sólo potentes herramientas técnicas para apoyar y dirigir el desarrollo in vitro de tejidos vivos y funcionales, sino también sistemas de modelos de cultivo dinámicos para estudiar los mecanismos fundamentales de la función celular en condiciones fisiológicamente relevantes (248). INTRODUCCIÓN 48 En la IT intervienen tres elementos clave: las células, el andamio y las citoquinas (77). Sin embargo, el entorno en el que los tres elementos interactúan in vitro es diferente al in vivo, y los tres elementos suelen estar combinados, careciendo de la sincronización con diversos factores ambientales como la tensión mecánica y el campo eléctrico (103). Los biorreactores se utilizan para recapitular los entornos fisiológicos en los que existen las células in vivo: regeneración de tejido para su posible uso clínico, probar posibles nuevos tratamientos en entornos similares a los in vivo y establecer nuevas dianas terapéuticas. Concretamente, en este trabajo nos centraremos en los biorreactores que están dedicados a la IT y MR. Algunos de estos sistemas pueden admitir el crecimiento de tejidos enteros en andamios, el cocultivo de células de diferentes fenotipos, generar condiciones de cultivo dinámicas que faciliten la transferencia de masa y disponer de sensores avanzados y capacidades de imagen que permitan la monitorización en tiempo real de los parámetros fisiológicos (76). De esta forma se ayuda a mitigar problemas o hándicaps que presentan los cultivos convencionales tales como la aparición de zonas necróticas y aumentar el tamaño de tejido creado (75,249). Aportando además ciertas mejoras como el crecimiento celular masivo y homogéneo de las células en el tejido voluminoso, el suministro eficiente de nutrientes y la eliminación de metabolitos, así como los estímulos ambientales esenciales (250). Por un lado, puede convertirse en un medio importante para investigar las modulaciones de diferentes estimulaciones ambientales en el cultivo funcional 3D de células y tejidos específicos. Por otro lado, es una de las claves para mejorar la calidad del tejido funcional y reducir el coste de producción. Además, también es un paso clave en la traslación de los resultados de la IT del laboratorio a la industria para la producción a gran escala y la aplicación de directrices y procedimientos operativos estándar (103). Entre los usos de los biorreactores en la IT destacan (251): • Mejorar la infiltración y distribución celular sembrando dinámicamente las células en andamios. • Facilitar la expansión celular para mitigar cambios fenotípicos indeseados que pueden ocurrir cuando se construye artificialmente un tejido. • Superar las limitaciones de oxígeno y transporte de nutrientes que se observan en los cultivos 3D estáticos. INTRODUCCIÓN 49 • Mejorar la estructura y propiedades mecánicas de la ECM. Los biorreactores para el cultivo de tejidos representan un sistema de modelo de control para (251): 1. Estudiar los efectos de los estímulos biofísicos y agentes terapéuticos en las células y tejidos construidos. 2. Comparar las respuestas de la construcción in vitro en cuanto a la in vivo, ayudando a definir su potencial de supervivencia. 3. Desarrollar y probar regímenes de terapia física para pacientes que han recibido implantes de estos tejidos. Los biorreactores se pueden clasificar en base a diferentes criterios, uno de ellos y más típicos es en función de las condiciones de flujo dinámico. De esta forma podemos encontrar 4 tipos de biorreactores Spinner Flask, los biorreactores de perfusión, los biorreactores Rotating Wall Vessel y el biorreactor de rotación biaxial (103,248). Sin embargo, en este estudio nos vamos a regir por otros criterios más convenientes a nuestro tejido diana, en este caso el músculo esquelético. Algunos trabajos optan por la clasificación de los biorreactores de tejido muscular en función del desarrollo o mantenimiento del tejido muscular, si el biorreator se implanta dentro de un organismo o se conecta al mismo (in vivo) o el tejido/organismo muscular se mantiene aislado de un organismo huésped (in vitro o ex vivo) (248). Concretamente, los que a este trabajo conciernen se centran en la creación de tejido in vitro o ex vivo. El uso moderno de biorreactores para cultivar tejido muscular in vitro consiste en una adaptación de los biorreactores usados para la regeneración de tejido óseo y cartilaginoso. Tratándose de adaptaciones físicas de sistemas ya existentes para su uso en otros tejidos (252). Tal es el caso que existen revisiones literarias dedicadas a la IT donde exponen sistemas para los huesos, los ligamentos, los tendones y los cartílagos. Todo ello ha podido ser suscitado por la combinación de actividades mecánicas tanto activas como pasivas que requiere el músculo esquelético, mientras que los tejidos óseos y cartilaginosos solamente precisan de una señal mecánica pasiva. Estas señales que requieren el músculo se tratan de actividad mecánica tanto activa como pasiva, a menudo provocada por intervenciones eléctricas aplicadas externamente estratégicamente INTRODUCCIÓN 50 coordinadas para producir la contracción y alargamiento de las fibras conduciendo a un mayor aumento de la masa muscular (253,254). 1.5.1. Biorreactor de estimulación mecánica Para imitar los regímenes de carga fisiológicos, algunos biorreactores han incorporado sistemas de carga mecánica para proporcionar fuerzas de compresión, tensión, cizallamiento y torsión a los injertos. A nivel celular, estos estímulos activan las vías de señalización celular de la mecano-transducción y provocan cambios como las adhesiones focales, los contactos entre células y los cambios en la expresión genética, sincronizándose contracciones con los estímulos y aumentando la expresión de proteínas de la ECM (255). Generalmente la compresión se ha usado con éxito para la IT de hueso y cartílago con buenos resultados tanto de proliferación, viabilidad y diferenciación (256). Las fuerzas de torsión se han utilizado en la IT de ligamentos y discos intervertebrales (257). Las fuerzas cortantes o de cizallamiento han creado un elevado interés debido a la imitación del flujo sanguíneo. Estos estudios han demostrado un aumento de la proliferación y síntesis de ECM (258). Finalmente, las fuerzas de tracción se experimentan con más frecuencia en los músculos, los tendones, los ligamentos y los tejidos cardíacos (259). Los andamios tisulares con progenitores miogénicos pueden ser estimulados mecánicamente mediante una tensión uniaxial. Los andamios son conectados a un actuador mecánico externo y realizando un acortamiento y/o alargamiento uniaxial de una distancia y frecuencia determinados. Las condiciones de cultivo pueden establecerse de forma que el propio tejido muscular genere una fuerza suficiente para provocar cambios de longitud activos o pasivos contra un punto de anclaje conforme. La reacción de los miotubos contra puntos de anclaje fijos en el cultivo tiene el importante efecto de provocar la alineación de los miotubos a lo largo del eje formado por los dos puntos de anclaje, incluso cuando no se aplican otras fuerzas externas (260). Nagai et al. han analizado los cambios a nivel molecular, como el aumento de los niveles de fosforilación de ERK, al aplicar una tensión estática uniaxial a un andamio sembrado de células musculares esqueléticas (261). Baker et al. demostraron un aumento de la producción de colágeno y de la expresión de genes fibrosos en la carga de tracción INTRODUCCIÓN 51 dinámica de las células madre mesenquimales (MSC) sembradas en nanofibras de PCL (262). Sharifpoor et al. demostraron una mayor masa de ADN, una mejor cobertura del área celular, de la distribución de las células y aumento de las propiedades mecánicas de tracción al aplicar una tensión cíclica uniaxial en andamios de poliuretano sembrados con células musculares lisas (263). En resumen, la aplicación de señales mecánicas funcionalmente relevantes dentro de la cámara de un biorreactor ha demostrado claramente una mejor funcionalidad del tejido debido a la recapitulación del microambiente biofísico nativo. Aunque será una hazaña técnica imitar exactamente las condiciones in vivo per se en un biorreactor, nuestro progreso en la comprensión de los efectos mecánicos en la IT nos está acercando al desarrollo de tejidos/órganos de ingeniería clínicamente relevantes (259). 1.5.2. Estimulación eléctrica La estimulación eléctrica o magnética puede aplicarse a diversos tejidos, como los nervios, el corazón, los huesos y cartílagos, los músculos y el esqueleto. La mayoría de las células humanas generan y emplean señales eléctricas para comunicarse entre sí (264). En 1987, Findl et al. propusieron el término homeostasis eléctrica para denominar un estado en el que las células no reaccionan permanentemente a una sola estimulación. Cuando se aplica la estimulación, la propia célula regula el entorno interno y el de la membrana celular (265). Dicha estimulación eléctrica externa altera la forma, la motilidad y dirección de las células, y afecta a la membrana plasmática (266). En condiciones normales, la estimulación eléctrica externa en el rango fisiológico no afecta notablemente a las funciones generales de la célula a nivel macroscópico (264). La estimulación eléctrica se ha utilizado durante muchos años en cultivos celulares bidimensionales de músculo para estudiar su efecto sobre la formación de miotubos, la alineación de los miocitos, el tipo de fibra, la función metabólica, la transcripción y la síntesis de proteínas. En las construcciones musculares tridimensionales, la estimulación eléctrica puede utilizarse tanto para evaluar la contractilidad y la excitabilidad de los tejidos diseñados como para intentar guiar el desarrollo de los tejidos diseñados durante el cultivo durante un periodo superior a 2 semanas sin que se produzcan fallos (260). Se ha demostrado que la estimulación crónica de baja frecuencia altera el fenotipo y la función del músculo de ingeniería (267). CAPÍTULO 2 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 61 2.1. Hipótesis El músculo esquelético representa el 40% del peso total del ser humano y contribuye de manera significativa a varias funciones corporales. Su principal función es la transformación de la energía química en mecánica. El hecho de que sea un tejido altamente diferenciado, limita la capacidad para regenerarse. A pesar de que existen diferentes técnicas como tratamiento no hay en la actualidad un tratamiento para lograr la recuperación total (1). La IT surge como una nueva disciplina que tiene como objetivo la regeneración de tejidos dañados intentando imitar las propiedades del tejido nativo (77). Para ello, entre otros elementos, hace uso de andamios tisulares que pretenden conformar estructuras tridimensionales funcionales (80). Su fabricación puede llevarse a cabo de diferentes formas, siendo la bioimpresión 3D y el electrospinning las dos más utilizadas en la actualidad. La bioimpresión 3D ha impulsado importantes innovaciones en el campo de la IT. Esta tecnología utiliza CAD y puede facilitar la construcción de tejido vivo individualizado al defecto de cada paciente mediante el depósito directo de biomateriales, biomoléculas y células. Los materiales que encapsulan las células desempeñan un papel esencial a la hora de proporcionar un microentorno adecuado para la diferenciación celular y la maduración en el proceso de bioimpresión. Estos materiales servirán para la recreación de una ECM, que señalizarán los procesos celulares, por lo que es diferente para cada tejido y linaje celular (167). Como hemos visto en la introducción existe una vasta literatura en la que se ha empleado diferentes hidrogeles en conjunto con la bioimpresión 3D para crear andamios que permiten la habitabilidad de altas densidades celulares con una buena viabilidad (130,284,307) Por otro lado el electrospinning es una técnica muy prometedora para la creación de estructuras de andamiaje con una conformación fibrilar que favorece la regeneración de determinados tejidos. Efectivamente, las estructuras nanofibrilares de andamios creados con este método han demostrado propiedades beneficiosas para la proliferación, adhesión y alineamiento de las células (210). HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 62 Finalmente, existen antecedentes que demuestran que la combinación de gelatina al 4% y PCL al 16% es ideal para que sea utilizada en la creación de andamios ya que crea estructuras más deformables, menos rígidos y más hidrofílica, favoreciendo una mayor adhesión celular (292). Diferentes trabajos han descrito una mejor funcionalidad y diferenciación del tejido cuando los andamios son expuestos a estimulación mecánica (259,299), aumentando la expresión de actina y miosina (294,300), diámetro y longitud de las fibras musculares esqueléticas maduras (274). Por otro lado, la estimulación eléctrica simulando el efecto de las motoneuronas ha permitido aumentar la contractilidad de los miotubos (302), promoviendo variaciones en la adhesión, proliferación y expresión génica de las células (268). Sin embargo, estas estimulaciones pueden tener efectos negativos y es muy importante su estudio para llegar a conocer las condiciones ideales de cultivo. Teniendo en cuenta lo anteriormente descrito nos planteamos la hipótesis de que: La bioimpresión 3D y el electrospinning de PCL con gelatina, así como su estimulación en un biorreactor electro-mecánico podría mejorar la creación de tejido muscular esquelético. 2.2. Objetivo 2.2.1. Objetivo principal Conseguir regenerar tejido músculo esquelético funcional a través de andamios tisulares fabricados mediante bioimpresión 3D y electrospinning y con la estimulación de los mismos con un biorreactor electro-mecánico. 2.2.2. Objetivos secundarios 1) Determinar la línea celular idónea de estudio. 2) Fijar el tiempo de cultivo. 3) Valorar la cantidad de células a usar en la siembra de los andamios. 4) Precisar la mejor técnica para la fabricación de andamios para la regeneración de tejido muscular-esquelético. 5) Describir los estímulos convenientes para la regeneración del tejido. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 63 6) Determinar la viabilidad celular de los andamios y cuáles son los mejores andamios para la regeneración atendiendo a la viabilidad celular y su morfología. 7) Estudiar el grosor de las fibras. 8) Analizar la direccionalidad de las fibras. 9) Examinar la densidad nuclear de los miotubos. 10) Estudiar la expresión de actina y la morfología del citoesqueleto de los miotubos. 11) Comprobar la funcionalidad de las fibras. CAPÍTULO 3 MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 67 3.1. Tipo de Estudio Estudio comparativo in vitro para la regeneración tisular de músculo esquelético a partir de andamios creados mediante bioimpresión 3D de hidrogeles de colágeno en combinación con otros biomateriales frente a andamios fabricados mediante electrospinning de PCL y gelatina y estimulados mecánica y eléctricamente. 3.2. Diseño de dispositivos Para el diseño de los dispositivos se usó el software de diseño asistido FreeCAD 0.17 (FreeCAD © Juergen Riegel, Werner Mayer), un modelador 3D paramétrico, libre y multiplataforma. 3.2.1. Andamios tisulares Se generó una estructura 3D de 1 mm de altura. 20 mm de largo y 10 mm de ancho. Su conformación consta de un rombo hueco de 14 mm de largo y 10 mm de ancho, en cada uno de los extremos longitudinales, se encuentran un prisma rectangular de 3 mm de largo y 10 mm de ancho (Figura 19 a, andamio 1). Cada prisma está conectado al rombo en su parte central. Se diseñó otro andamio igual, pero 5 mm de ancho en lugar de 10 (Figura 19 b, andamio 2). Figura 19: Diseño de andamios. a. Andamio 1. b. Andamio 2. Diseñado el andamio, se exportó desde FreeCAD como archivo STL, para utilizarlo en el proceso de bioimpresión más adelante. Gracias al software propio de la bioimpresora REGEMAT3D, se plantearon y realizaron diversas modificaciones para aumentar la eficacia de la fijación del hidrogel sobre los andamios: la impresión del hidrogel con una MATERIALES Y MÉTODOS 74 (MERLN Institute of Regenerative Medicine). Su fabricación fue detallada en el trabajo de Pérez-Puyana et al. (159). Figura 25: Andamio fabricado mediante electrospinning. Brevemente, la PCL y la gelatina se disolvieron en 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) durante el proceso de fabricación por electrospinning, la concentración del PCL era de 16% w/v y la de la gelatina de 4% w/v. La solución fue preparada a temperatura ambiente y estuvo en agitación durante 24 horas. Las condiciones de procesamiento fueron establecidas de la siguiente forma: el voltaje fue de 14kV; la velocidad de flujo fue 0.4 ml/h; distancia desde la aguja al colector de 14 cm; la temperatura fue de 25ºC y humedad de 40%. Se usaron 3 tipos de andamios, los cuales variaron en la velocidad angular al colector, esto derivó en el grado de alineamiento de las nanofibras. Así se obtuvieron andamios de PCL/Gelatina random cuya velocidad angular fue 0 rpm y un alineamiento de 0.13 ± 0.03; andamios de PCL/Gelatina semialineados con velocidad angular de 300 rpm y un alineamiento de 0.40 ± 0.04; y andamios de PCL/Gelatina fabricados con una velocidad angular de 600 rpm y un alineamiento de las fibras de 0.75 ± 0.02. Los andamios fueron esterilizados mediante radiación ultravioleta como paso previo a la siembra con 10 x 106 células de la línea C2C12. 3.7. Determinación de condiciones ideales de cultivo En la tabla 1 se indican las diferentes combinaciones de experimentos que se realizaron de los diferentes biomateriales usados para esclarecer las combinaciones que se mantuvieron: MATERIALES Y MÉTODOS 75 Tabla 1: Tipos de andamios y ensayos realizados. ENSAYOS IHQ PROP MECANICAS IHQ PROP MECANICAS IHQ PROP MECANICAS IHQ VIABILIDAD VIABILIDAD VIABILIDAD IF VIABILIDAD IF VIABILIDAD IF ESTIMULACIÓN CONTROL CONTROL CONTROL CONTROL ELÉCTRICA CONTROL ELÉCTRICA MECÁNICA CONTROL ELÉCTRICA MECÁNCIA CONTROL CONTROL Nº CÉLULAS POR ANDAMIO 10 x 106 cell/ml 10 x 106 cell/ml 10 x 106 cell/ml 10 x 106 cell/mL 20 x 106 cell/mL 40 x 106 cell/mL 10 x 106 cell/ml 20 x 106 cell/mL 40 x 106 cell/mL 40 x 106 cell/ml 2 x 106 cell/ml 2 x 106 cell/ml DENSIDAD CELULAR 20 x 106 cell/ml 20 x 106 cell/ml 20 x 106 cell/ml 20 x 106 cell/mL 40 x 106 cell/mL 80 x 106 cell/mL 40 x 106 cell/ml 80 x 106 cell/mL 160 x 106 cell/mL 160 x 106 cell/ml 20 x 106 cell/ml 20 x 106 cell/ml VOL 500 500 500 500 250 250 100 100 TIEMPO DE CULTIVO 4 SEM 4 SEM 4 SEM 2 SEM 24H 2 SEM 24H 2 SEM 1 SEM 1 SEM LÍNEA CELULAR L6 L6 L6 L6 L6 C2C12 C2C12 C2C12 BIOTINTA COLÁGENO COLÁGENO MATRIGEL MEC COLÁGENO ALGINATO 1 COLÁGENO ALGINATO 2 COLÁGENO ALGINATO 2 COLÁGENO ALGINATO 3 COLÁGENO ALGINATO 4 MATERIALES Y MÉTODOS 76 Continuación tabla 1: Tipos de andamios y ensayos realizados. ENSAYOS VIABILIDAD IF VIABILIDAD IF VIABILIDAD IF TEST CALCIO VIABILIDAD IF TEST CALCIO VIABILIDAD IF TEST CALCIO ESTIMULACIÓN CONTROL CONTROL CONTROL CONTROL CONTROL ELÉCTRICA MECÁNICA Nº DE CÉLULAS EN ANDAMIO 2 x 106 cell/ml 2 x 106 cell/ml 10 x 106 10 x 106 10 x 106 DENSIDAD CELULAR 20 x 106 cell/ml 20 x 106 cell/ml 10 x 106 10 x 106 10 x 106 VOL 100 100 - - - TIEMPO DE CULTIVO 1 SEM 1 SEM 2 SEM 2 SEM 2 SEM LÍNEA CELULAR C2C12 C2C12 C2C12 C2C12 C2C12 BIOTINTA COLÁGENO ALGINATO 5 COLÁGENO ALGINATO 6 RANDOM SEMI ALINEADOS ALINEADOS MATERIALES Y MÉTODOS 77 3.8. Estimulación de los andamios con biorreactor Los andamios que presentaron un mayor alineamiento y viabilidad celular en estático fueron además estimulados mediante biorreactor. El biorreactor que se usó fue el biorreactor TC3 (EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, España) (Figura 26). Este modelo permite la estimulación de los cultivos tanto mecánica como eléctricamente. Para ello, el sistema cuenta con un módulo de control, un sistema accionamiento para la generación de la estimulación mecánica, un sistema de control para la estimulación eléctrica y un generador de corriente. El biorreactor EBERS TC3 es controlado por ordenador diseñado para garantizar una actuación adecuada y fiable. El software de control permite una fácil programación, control y monitoreo de condiciones que serán aplicadas sobre los andamios y cultivos, tales como grado de estiramiento, la velocidad de deformación y el ciclo específico de dicha deformación. Figura 26: Biorreactor TC-3. a. Ordenador, generador de corriente, módulo de control y sistema de control para la estimulación eléctrica. b. Sistema de accionamiento para la generación de la estimulación mecánica. c. Capsula hermética con andamios. MATERIALES Y MÉTODOS 78 El sistema TC-3 está diseñado para contener muestras de tejido o andamios en los cuales las células son cultivadas mientras que son sometidas a estímulos de cargas mecánicas de tensión o de compresión o señales eléctricas. Para su uso, el biorrector se encuentra dentro del incubador New Brunswick (CO2 Incubator Shaker S41i, Eppendorf, Hamburgo, Alemania) que permite emplear un atmosfera propicia para el cultivo celular. La cámara de cultivo (Figura 26 c) es hermética y puede montarse y desmontarse de forma sencilla. Los materiales de las cámaras son biocompatibles, no citotóxicos y han sido esterilizados a través de autoclave. El intercambio de gas entre la atmósfera del incubador y la parte interna de la cámara se consigue a través de membranas gaseosas permeables. Para la estimulación mecánica se usaron unas mordazas planas que permiten transferir la carga de compresión a los andamios a través de un actuador lineal controlado por ordenador para impulsar las mordazas, transmitiendo las cargas a las muestras. El módulo de estimulación eléctrica permite la aplicación de estímulos eléctricos de forma coordinada con los estímulos mecánicos a través de electrodos de platino. Los andamios se cultivaron durante 15 días desde su siembra. La figura 27 muestra el diseño del experimento. Se generaron 3 grupos en función de la estimulación que recibieron: Figura 27: Esquema temporal de ensayos. MATERIALES Y MÉTODOS 79  Grupo control: Grupo sin estimulación.  Grupo estimulación mecánica. Transcurridas 48 h desde la siembra de los andamios, los andamios fueron estimulados mecánicamente a lo largo del eje longitudinal de los andamios. La estimulación varió en las dos semanas de cultivo: 1) Semana 1: Estimulación mecánica con una amplitud del 5% (0.9 mm) a una frecuencia de 0.5Hz durante 55 min y 5 min de reposo en relajación (figura 28 a). 2) Semana 2: Estimulación mecánica con una amplitud del 10% (1.8 mm) a una frecuencia de 0.5Hz durante 55 min y 5 min de reposo en relajación (figura 28 b). Figura 28: Configuración estimulación mecánica. a. Semana 1. b. Semana 2.  Grupo estimulación eléctrica. A las 48 h de la celularización de los andamios, fueron electro-estimulados durante 2 semanas. La estimulación eléctrica se dio de dos formas diferentes que sirvió para comparar la efectividad de ambos métodos con andamios alineados de PCL y gelatina con células C2C12 sembradas. El primero fue mediante el uso de la cámara del biorreactor ebers, y la segunda a través de la placa diseñada (Figura 29). Los pulsos eléctricos se sincronizaron para que el pulso eléctrico fuera generado en el momento que las mordazas del biorreactor estuvieran en el momento más próximo (Figura 30 c). Los pulsos eléctricos fueron: MATERIALES Y MÉTODOS 80 Figura 29: Estimulación eléctrica mediante tapadera de placa diseñada. 1) Semana 1 (Figura 30 a): Estimulación eléctrica con pulsos de 1V a una amplitud de 1ms y una frecuencia de 0.5Hz durante 55 min y 5 min de reposo en relajación. 2) Semana 2 (Figura 30 b): Estimulación eléctrica con pulsos de 5V a una amplitud de 1ms y una frecuencia de 0.5Hz durante 55 min y 5 min de reposo en relajación. Figura 30: Estimulación eléctrica. a. Generador durante semana 1. b. Generador durante semana 2. c. Sincronización con estimulador mecánico. MATERIALES Y MÉTODOS 81 3.9. Pruebas reológicas Para obtener parámetros de interés únicamente del andamio de PCL, se realizó un ensayo de tracción para obtener el módulo de Young y así caracterizar su comportamiento elástico. Para el estudio completo, se aplicó un ensayo de tres puntos, dividido en el test de barrido de deformación y en el test de barrido de frecuencia, con el que se obtendrán parámetros de interés como el módulo elástico y viscoso, además de comprobar la funcionalidad a un esfuerzo dinámico a 5Hz de frecuencia, que es concretamente la condición dinámica del biorreactor en el que se incubará el andamio. Para aplicarlo correctamente, hubo que introducir los sensores reservados para el ensayo de tres puntos en la máquina. A continuación se colocó el andamio en posición equidistante en el sensor, y se calibró la fuerza aplicada ajustando los sensores y acercándolos al máximo hacia el andamio, hasta llegar al punto más próximo al andamio y aplicar el cero indicador. Finalmente, bastó con personalizar la geometría del ensayo de tres puntos (añadiendo la longitud, la anchura y el espesor del andamio) para poder realizar el primer test de este ensayo, denominado como "Dynamic Strain Sweep Test" o test de deformación, en el que se averiguó el parámetro necesario para el test de frecuencia, la deformación crítica, además de otros parámetros de interés, como el módulo elástico o viscoso del material, junto con la tangente delta. Con la deformación crítica se conoce la fuerza que destruiría internamente la estructura del andamio, necesaria para realizar el test de frecuencia. Una vez obtenida la deformación crítica, se realizó a otro andamio del mismo tipo (ya que el anterior quedó deformado debido al ensayo) el ensayo de frecuencia de 0 a 20Hz, aplicando por convenio el 65% del valor obtenido como deformación crítica, para asegurar la permanencia o la no rotura del andamio. De esta forma, se pudo obtener los módulos elásticos y viscosos, entre otras propiedades de interés, y comprobar si a 5Hz el andamio se comporta elásticamente para poder ser tratado en un biorreactor de estimulación mecánica longitudinal. Estos estudios reológicos se realizaron tanto para conocer las propiedades del andamio de PCL como para comprender el comportamiento de las propias láminas de los distintos hidrogeles depositados en el mismo. MATERIALES Y MÉTODOS 82 3.10. Ensayo de viabilidad celular Se usó el kit LIVE/DEAD™ Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells (L3224) (Invitrogen™, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos) para el estudio de viabilidad celular. Este kit está compuesto por dos componentes, la calceína y el EthD-1. Las células vivas se distinguen por la presencia de una actividad esterasa intracelular ubicua, determinada por la conversión enzimática de la calceína AM, prácticamente no fluorescente, en calceína intensamente fluorescente. La calceína permite teñir el citoplasma celular de verdes ya que se trata un tinte polianiónico que es retenido por las células vivas produciendo una fluorescencia verde intensa y uniforme en las células vivas (ex/em ~495 nm/~515 nm). EthD-1 entra en las células con membranas dañadas y aumenta su fluorescencia al unirse a los ácidos nucleicos, produciendo así una fluorescencia roja brillante en las células muertas (ex/em ~495 nm/~635 nm). El EthD-1 es excluido por la membrana plasmática intacta de las células vivas. El medio de los andamios fue retirado y los andamios fueron lavados con PBS. Diluimos en PBS la solución de EthD-1 2 mM y calceína AM 4 mM en PBS hasta obtener una dilución de 4 µM y 2 µM, respectivamente y agitamos hasta homogeneizar el reactivo. Teñimos cada andamio con uno 200 µL de la solución preparada e incubamos durante unos 30 min. Finalmente, visualizamos mediante microscopía confocal Nikon A1R+ con láser 488 nm. Las imágenes fueron tomadas con el aumento 10X. Las células vivas fueron contabilizadas como citoplasmáticas verdes mientras que las células muertas como núcleos teñidos de rojo. 3.11. Estudio del citoesqueleto de los miotubos Una vez finalizados los experimentos, el medio de los andamios fue retirado. Se realizaron 3 lavados con PBS. Después, permeabilizamos con 0.1% Tritón en PBS durante 30 segundos. Fijamos los andamios durante 15 minutos con paraformaldehído (PFA). Pasado ese tiempo, lavamos con PBS 3 veces de nuevo. Permeabilizamos con Tritón al 0.5% en PBS durante 5 minutos, retiramos el sobrenadante y aplicamos la solución bloqueo (BS) (1% BSA, 0.1% Tween 20 en PBS) durante 10 minutos. A continuación teñimos los andamios con una concentración 1:1000 de Phalloidin-iFluor 647 Reagent (ab176759, AbcamTM, Cambridge, Reino Unido) en MATERIALES Y MÉTODOS 83 solución bloqueo durante 1 hora en cámara húmeda y oscura con agitación a temperatura ambiente. Retiramos y lavamos con BS durante 2 minutos tres veces. Montamos los andamios sobre portaobjetos y añadimos medio de montaje con Dapi (PROLONG, Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos). Mediante microscopía confocal Nikon A1R+ con los láseres 405 y 638 nm visualizamos los núcleos teñido y la actina del citoesqueleto formado, respectivamente. Las imágenes fueron tomadas con el aumento 10X para la medición del alineamiento celular y longitud de las fibras, mientras que con el aumento 40X se midió el grosor de las fibras, el número de núcleos que poseían las fibras, la morfología de los núcleos y la densidad de actina. 3.12. Estudio de funcionalidad celular Las células fueron teñidas con el kit Fluo-4 AM (Invitrogen TM, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos) para medir la funcionalidad y capacidad contráctil de los andamios cultivados. Este ensayo se realizó mediante microscopía confocal. Fueron necesarias dos soluciones buffer, una como control, caracterizada por una solución baja en potasio; y otra con niveles altos de potasio que estimulan la contracción celular. Ambas soluciones estaban compuestas de cloruro cálcico (C1016, sigma Aldrich, San Luis, EEUU) al 2.5 mM, cloruro de magnesio (M8266, sigma Aldrich, San Luis, EEUU) al 2 mM; Hepes (A3724, Panreac Química, España) al 10mM y glucosa (G8270, sigma Aldrich, San Luis, EEUU) al 10 mM. Ambas diferían en el cloruro sódico (S9888, sigma Aldrich, San Luis, EEUU) al 140 mM y al 30 mM, en la solución control y en la solución no control, respectivamente; y en el cloruro potásico (P3911, sigma Aldrich, San Luis, EEUU) 2.5 mM y 110 mM, en la solución control y en la solución no control, respectivamente. Las soluciones fueron neutralizadas a pH 7.4. Las alícuotas de Fluo-4 fueron diluidas en DMSO a 1-5 mM como solución de stock, para finalmente usarlas en una dilución 1-5 µM en medio de cultivo, los andamios fueron incubados con la solución durante 20 min, hasta comenzar el ensayo. Durante el estudio, se usaron dos jeringas, una con cada solución. Cada jeringa tiene una llave de paso, la de la solución control estuvo siempre abierta durante todo el experimento, mientras que la de la solución no control fue abierta en momentos puntuales RESULTADOS 91 4.1. Propiedades mecánicas de los hidrogeles Se realizó un ensayo de tres puntos divido en dos test, tanto para el andamio de PCL como para los hidrogeles. Se optó por un estudio de deformación para obtener la deformación crítica, indispensable para el desarrollo del test de barrido de frecuencias, que sería el estudio de principal interés. Finalmente se incluyó un test de tracción para obtener el Módulo de Young. 4.1.1. Resultados reológicos: Andamio de PCL Se estableció la relación tensión-deformación del andamio de PCL (n=3) a través de su Módulo de Young, resultando en 26.1MPa. Tras aplicar el primer estudio de deformación se obtuvo el valor de deformación crítica del andamio (Figura 32 a), siendo la deformación del 0.1%. Figura 32: Propiedades reológicas. a. Estudio de deformación de andamios de PCL. b. Estudio de frecuencias de andamios de PCL. c. Barrido de deformación de hidrogeles. d. Test de frecuencias de hidrogeles. RESULTADOS 92 Como se observa en la figura 32 a, a partir del valor 10-1 % de deformación, el material alcanza el punto de no retorno respecto a su posición basal, produciéndose su rotura y mayor deformación. También se comprobó que el modulo elástico E' es mayor que el módulo viscoso E'', caracterizando así el comportamiento elástico del andamio de PCL. A continuación se completó el test de frecuencias con la deformación crítica obtenida anteriormente, para considerar si el dispositivo de PCL era apto para su cultivo en biorreactores, que trabajan a una frecuencia de 5Hz (n=3). Como resultado, se obtiene una gráfica (Figura 32 b) con el módulo elástico y viscoso como parámetros que varían según la frecuencia. Concretamente en esta figura se presentan dos andamios de PCL, el utilizado en este trabajo (Rep1) y otro más estrecho (Rep2) con un tamaño establecido de 2x0.5cm, verificando que el utilizado presenta aparentemente una mayor elasticidad y consecuentemente una mayor capacidad de deformación. 4.1.2. Resultados reológicos: Hidrogeles Por otro lado, realizando el mismo barrido de deformación a los hidrogeles se obtuvieron los resultados que se muestran en la figura 32 c (n=3). Tras ello se determinó su barrido de frecuencia, en todos se obtuvo un valor de deformación crítica menor de 0.1%. En condiciones iniciales, el hidrogel de colágeno y matrigel es el que presenta un mayor módulo elástico, seguido del hidrogel MEC (col + a’ en la figura 32). El hidrogel de colágeno tiene un módulo elástico menor. A medida que aumentan los esfuerzos y la deformación, los módulos elásticos de cada hidrogel disminuyen. De forma más notable en el hidrogel MEC es el que obtuvo un mayor descenso de módulo elástico, seguido del hidrogel colágeno y colágeno y matrigel, respectivamente. Tras aplicar el barrido de frecuencias a las biotintas, se analizó su comportamiento ante la variación de frecuencia. Observando la gráfica (figura 32 d), se vuelve a corroborar una vez más que el hidrogel constituido por colágeno y matrigel contiene las mejores propiedades reológicas en comparación al resto de hidrogeles, y que todos los hidrogeles mantienen cierta continuidad a lo largo de la variación de frecuencias (n=3). Esto se explica por la continuidad que mantiene el módulo elástico E' al aumentar el porcentaje de deformación del andamio, siendo el hidrogel colágeno y matrigel el que mayor módulo elástico presenta ante las deformaciones, y también ante las variaciones de frecuencia. En cambio, RESULTADOS 93 observamos que los hidrogeles colágeno y MEC presentan resultados muy similares, por debajo del hidrogel colágeno y matrigel tanto en el inicio con frecuencias bajas como al final con frecuencias altas. 4.2. Testeo inicial de viabilidad celular y diferenciación 4.2.1. Viabilidad Para el testeo de las biotintas colágeno, colágeno y Matrigel y MEC se usaron mioblastos de la línea celular L6, resuspendidos en una densidad celular de 20 x 106 células/mL y para cada andamio se usó 500 µL de biotinta(n=7) (figura 33 a, c y e). Mientras que para los ensayos de la biotinta CA1 se usaron 3 densidades celulares diferentes 20 x 106 células/mL; 40 x 106 células/mL; 80 x 106 células/mL y para cada andamio se emplearon 500 µL de biotinta (n=3) (figura 34 a, c y e). Se usó el andamio 1 para la impresión de estas biotintas. Primero se testaron todas las biotintas con la misma densidad celular, para conocer cuál es la idónea para usar en bioimpresión (figura 35 a). La biotinta colágeno mostró una viabilidad celular de 20.29 ± 5.21 % (figura 33 a) y la de la biotinta colágeno y matrigel fue de 25.68 ± 12.05 % (figura 33 c). La biotinta MEC mostró una viabilidad de 34.62 ± 31.90 % (figura 33 e) y CA1 82.33 ± 13.14 % (figura 34 a). Se evidenció diferencia estadística entre las biotintas (P=0.001). Concretamente, la inferencia estadística la presentó la biotinta CA1 frente a la biotinta de colágeno (P=0.001), de colágeno y matrigel (P=0.002) y MEC (P=0.009). Entre las otras no se evidenció diferencia significativa (P>0.05). Los andamios producidos con la biotinta CA1 y una densidad de 20 x 106 células/mL mostraron una viabilidad del 82.33 ± 13.14 % (figura 34 a). En estos andamios, la viabilidad celular era predominante en las esferas formadas por las células y en el interior de los filamentos. Los andamios con una densidad de 40 x 106 células/mL (Figura 34 c) tuvieron una viabilidad de 74,74 ± 13,20 %, mientras que los andamios con la densidad de 80 x 106 células/mL (Figura 34 e) presentaron una viabilidad del 93,23 ± 6,64 %. En estos andamios, la viabilidad celular era predominante en las estructuras grandes. La viabilidad celular (figura 35 b) de las 3 densidades celulares fue estadísticamente idéntica (P=0,442). RESULTADOS 94 Figura 33: Hematoxilina-Eosina e Inmunohistoquímicas de hidrogeles. a. Hematoxilina-Eosina de hidrogel de colágeno. b. Inmunohistoquímica de hidrogel de colágeno. c. Hematoxilina-Eosina de hidrogel de colágeno y matrigel. d. Inmunohistoquímica de hidrogel de colágeno y matrigel. e. Hematoxilina-Eosina de hidrogel MEC. f. Inmunohistoquímica de hidrogel MEC. RESULTADOS 95 Figura 34: Hematoxilina-Eosina e Inmunohistoquímicas de hidrogel CA1. a. Hematoxilina-Eosina de hidrogel CA1 con densidad celular de 20 x 106 células/mL. b. Inmunohistoquímica de hidrogel CA1 con densidad celular de 20 x 106 células/mL. c. Hematoxilina-Eosina de hidrogel CA1 con densidad celular de 40 x 106 células/mL. d. Inmunohistoquímica de hidrogel CA1 con densidad celular de 40 x 106 células/mL. e. Hematoxilina-Eosina de hidrogel CA1 con densidad celular de 80 x 106 células/mL. f. Inmunohistoquímica de hidrogel CA1 con densidad celular de 80 x 106 células/mL. Figura 35: Viabilidad celular. a. Hidrogeles con densidad celular de 20 x 106 células/mL. b. Hidrogel CA1 con diferentes densidades celulares. RESULTADOS 96 4.2.2. Inmunohistoquímica Para el análisis de las muestras, también se tiñó la SMA con un anticuerpo específico. Esta técnica permite identificar los componentes proteicos que se unen a la actina y, por tanto, permite detectar las células musculares y su grado de diferenciación. Los andamios que presentaron una viabilidad celular menor al 10% no se le realizó el estudio inmunohistoquímico. Los andamios de colágeno (n=4) (figura 33 b) mostraron un marcaje leve, de un 5% de las células viables en el 50% de los casos y el resto no mostró marcaje de SMA. El 50% de los andamios de colágeno y matrigel (n=4) (figura 33 d) no superaron el 10% de las células viables marcadas con SMA, siendo nulo el marcaje en el resto de los andamios. El 50% de los andamios fabricados con la biotinta denominada MEC (n=4) (figura 33 f) presentaron un marcado leve de entorno al 10% del andamio. Este marcaje fue mayoritario en las zonas filamentosas y bordes del andamio. En el resto de los andamios el marcaje fue nulo. La SMA se marcó en el 15,08 ± 6,28% de la población celular para los andamios con la biotinta CA1 que se produjeron con células a una densidad de 20 x 106 células/mL (n=3). El marcaje era predominante en las zonas periféricas y en los filamentos delgados (figura 34 b). Observamos que apenas un 10% de las células estaban marcadas con el anticuerpo SMA en los andamios producidos con células a una densidad de 40 x 106 células/mL (n=3) (figura 34 d). El marcaje no se observó en el 33,33% de los andamios teñidos, y la mayor parte de la tinción se observó en los bordes del andamio. La expresión de actina se observó en el 7,08 ± 6,49% de la población celular para los andamios que se produjeron con células a una densidad de 80 x 106 células/mL (n=3) (figura 34 f). En todos los casos, la mayor parte de la expresión de actina se observó en los bordes de los andamios o en los pequeños filamentos de los andamios. Los resultados demostraron que la expresión de actina en los andamios producidos a partir de células cultivadas a 3 densidades diferentes era estadísticamente idéntica (P = 0,269). RESULTADOS 97 4.3. Viabilidad celular 4.3.1. Andamios bioimpresos 4.3.1.1. CA1 vs CA2. Primeramente se analizaron 2 tipos de biotintas diferentes, CA1 y CA2, y con una densidad celular de 20 x 106 células/mL y 40 x 106 células/mL, respectivamente, o lo que sería lo mismo una densidad de 10 x 106 células/andamio, para estudiar la viabilidad y morfología de la bioimpresión de ambas tintas (n=6) que fueron impresas sobre el diseño del andamio 1. La viabilidad de CA1 fue de 73.26 ± 3.33 % mientras que la de CA2 es de 94.08 ± 3.50 % (figura 36 a). Se evidenció diferencia significativa entre la viabilidad de ambas biotintas (P=0.000). En el estudio de la morfología se analizaron la circularidad, la redondez, cuanto más similar a 1, la célula estará más redondeada y tiene una tendencia estar menos madurada, mientras que la ratio del aspecto de la célula debe de ser mayor que 1 para indicar la mayor maduración de la célula. La tabla 2 muestra la descripción de estas variables, en el grupo CA1 la circularidad fue de 0.81 [0.72, 0.87], mientras que en la biotinta CA2 fue de 0.83 [0.74, 0.89], se encontró diferencia significativa entre ambas biotintas (P=0.000), la redondez en la biotinta CA1 fue de 0.76 [0.66, 0.86] y la de CA2 fue de 0.78 [0.67, 0.87], hallándose diferencia entre los dos grupos (P=0.000). Finalmente, el ratio del aspecto de las células fue de 1.31 [1.17, 1.52] y 1.29 [1.15, 1.48], en los grupos CA1 y CA2, respectivamente. La diferencia significativa entre ambas biotintas fue de P=0.000. CA1 CA2 P VIABILIDAD 73.26 ± 3.33 % 94.08 ± 3.50 % P=0.000 CIRCULARIDAD 0.81 [0.72, 0.87] 0.83 [0.74, 0.89] P=0.000 REDONDEZ 0.76 [0.66, 0.85] 0.78 [0.67, 0.87] P=0.000 RATIO DEL ASPECTO 1.31 [1.17, 1.52] 1.29 [1.15, 1.48] P=0.000 Tabla 2: Viabilidad celular y morfología celular de CA1 y CA2. RESULTADOS 98 Figura 36: Viabilidad celular. a. CA1 frente a CA2. b. CA1 frente a CA2 tanto control como estimulada eléctricamente. Los andamios fabricados con ambas tintas fueron estimulados eléctricamente. La media del grupo sin estimulación de CA1 (n=3) (figura 37 a) fue de 72.18 ± 4.68 %, mientras que la media del grupo electroestimulado (n=3) con la misma biotinta fue de 74.33 ± 2.36 % (figura 37 b), en el estudio de inferencia estadística no se pudo demostrar que la estimulación eléctrica promoviera un aumento de la viabilidad celular de la biotinta (P=0.49) (figura 36 b). La circularidad, redondez y ratio del aspecto de la biotinta CA1 sin estimular fueron 0.81 [0.73, 0.88], 0.76 [0.66, 0.85] y 1.31 [1.17, 1.51], respectivamente y en el grupo electroestimulado fueron 0.81 [0.72, 0.87], 0.76 [0.65, 0.86] y 1.31 [1.16, 1.53]. Se evidenció diferencia significativa en la variable circularidad (P=0.000) pero no en las variables redondez (P=0.708) y ratio del aspecto (P=0.710). El estudio descriptivo y el estudio estadístico de la biotinta CA2 (n=3) se describe en el apartado 4.3.1.2.1 dentro de la densidad celular 40 x 106 células/mL. Figura 37: Test viabilidad celular de CA1 con una densidad celular de 40 x 106 células/mL. a. Grupo control. b. Grupo electroestimulado. RESULTADOS 99 Además se estudió si existía diferencia significativa entre los grupos controles de ambas biotintas y la viabilidad de ambos grupos electroestimulados. Se evidenció diferencia entre los grupos controles (P=0.004) y los grupos electroestimulados (P=0.000). También se demostró diferencia significativa en los grupos controles de ambas biotintas entre las 3 variables morfológicas, circularidad, redondez y ratio del aspecto (P=0.000; P=0.002; P=0.002, respectivamente) y en las variables morfológicas entre los grupos estimulados (P=0.000; P=0.000; P=0.000, respectivamente). 4.3.1.2. Variación de la densidad celular en CA2 Nos centramos en estudiar en profundidad la biotinta CA2, la cual fue impresa sobre el andamio 1. Se compararon 3 densidades celulares diferentes, 2 estimulaciones (mecánica y eléctrica) y 2 líneas celulares, como se ha detallado previamente en el capítulo de materiales y métodos. 4.3.1.2.1. Línea celular L6 La densidad celular de 40 x 106 células/mL (n=9) tuvo una viabilidad celular de 93.11 ± 4.19 %, una circularidad de 0.83 [0.74, 0.89], una redondez de 0.78 [0.67, 0.87] y un ratio del aspecto de 1.29 [1.15, 1.48]; la densidad celular de 80 x 106 células/mL (n=9) mostró una viabilidad de 84.38 ± 10.16 %, la circularidad fue de 0.84 [0.76, 0.90], la redondez fue de 0.78 [0.67, 0.87] y la ratio del aspecto fue de 1.28 [1.15, 1.78]; y de 84.65 ± 12.28 % fue la viabilidad de la densidad de 160 x 106 células/mL (n=9), la circularidad de 0.76 [0.64, 0.86], la redondez fue de 0.72 [0.60, 0.83] y la ratio del aspecto fue de 1.39 [1.21, 1.66] (tabla 3). No se demostró diferencia significativa entre la viabilidad de las 3 densidades (P=0.117) (figura 38), por lo que la viabilidad de las 3 densidades es estadísticamente igual, sin embargo, se demostró inferencia estadística en las 3 variables morfológicas, circularidad (P=0.000), redondez (P=0.000) y ratio del aspecto (P=0.000). El estudio por pares demostró que las densidades 40 x 106 células/mL y 160 x 106 células/mL; 80 x 106 células/mL y 160 x 106 células/mL, presentaron diferencias significativas en las 3 variables expuestas; redondez (P=0.000), circularidad (P=0.000) y ratio del aspecto (P=0.000), mientras que 40 x 106 células/mL y 80 x 106 células/mL presentaron solamente diferencia significativa en la circularidad (P=0.000). No se pudo demostrar que existiera inferencia estadística entre la redondez (P=0.124) y la ratio del aspecto (P=0.123). RESULTADOS 106 significativa entre ambos tiempos de medida (P= 0.020). La densidad de 80 x 106 células/mL (n=3) tuvo una viabilidad de 81.81 ± 3.59 % a las 24 horas (figura 40 h) y a las 2 semanas fue del 93.33 ± 1.63 % (figura 40 e). Se pudo demostrar que hay diferencia significativa entre la viabilidad a las 24 horas y a las 2 semanas (P=0.007). Finalmente la densidad celular de 160 x 106 células/mL (n=3) presentó una viabilidad inicial del 88.98 ± 5.46% (figura 40 l) y una viabilidad a las 2 semanas de 94.31 ± 1.99 % (figura 40 i). No se demostró que existiera diferencia estadística en la viabilidad entre estos dos tiempos (P=0.188). 4.3.1.2.2. Línea celular C2C12 En el caso de la línea celular C2C12 (n=3), la viabilidad celular en el grupo control fue de 81.22 ± 6.38 % (figura 42 a), y la viabilidad celular del grupo estimulado fue del 75.20 ± 7.39 % (figura 42 b). Entre ambos grupos no se demostró diferencia significativa (P=0.341) (figura 41). La circularidad, redondez y ratio del aspecto del grupo sin estimulación fueron 0.59 [0.41, 0.74], 0.63 [0.50, 0.75] y 1.59 [1.33, 2.01], respectivamente, mientras que en el grupo estimulado mecánicamente fue de 0.56 [0.39, 0.69], 0.56 [0.41, 0.75], 1.78 [1.40, 2.46] (tabla 8). Se encontró diferencia significativa en todas las variables morfológicas; circularidad (P=0.000), redondez (P=0.000) y ratio del aspecto (P=0.000). Figura 42: Test de viabilidad celular C2C12. a. Grupo control. b. Grupo estimulado mecánicamente. c. Tras 24 horas de cultivo. RESULTADOS 107 CONTROL MECÁNICA P VIABILIDAD 81.22 ± 6.38 % 75.20 ± 7.39 % P=0.341 CIRCULARIDAD 0.59 [0.41, 0.74] 0.56 [0.39, 0.69] P=0.000 REDONDEZ 0.63 [0.50, 0.75] 0.56 [0.41, 0.75] P=0.000 RATIO DEL ASPECTO 1.59 [1.33, 2.01] 1.78 [1.40, 2.46] P=0.000 Tabla 8: Viabilidad celular y morfología celular de C2C12 en densidad celular 160 x 106 células/mL por cada grupo de estimulación en la biotinta CA2. 4.3.1.2.2.1. Variación de la viabilidad 24 horas y 2 semanas La viabilidad a las 24 horas de la bioimpresión de la biotinta CA2 con la línea celular C2C12 fue de 94.37 ± 2.74 % (figura 42 c) y a las 2 semanas se produjo una reducción a 81.22 ± 6.38 % siendo evidente que la viabilidad de esta línea celular se ve reducida a las 2 semanas (P=0.031) (figura 41). Además se comparó la viabilidad a las 24 horas entre ambas líneas celulares, no se demostró la existencia de diferencia significativa entre la viabilidad de ambas líneas a las 24 horas (P=0.352). 4.3.1.2.2.2. L6 frente a C2C12 Las dos líneas celulares fueron analizadas, L6 y C2C12, con una densidad celular de 160 x 106 células/mL para comparar la viabilidad y morfología de la bioimpresión de ambas líneas celulares (n=6) (figura 43). La viabilidad de L6 fue del 87.38 ± 13.54 % mientras que la de C2C12 es del 78.18 ± 7.02 %. No se evidenció diferencia significativa entre las medias de ambas líneas celulares (P=0.132). La tabla 9 muestra la descripción de las variables a través de las cuales se han medido la morfología celular, circularidad, redondez y ratio el aspecto. En la línea L6 la circularidad fue de 0.76 [0.64, 0.86], mientras que en la biotinta C2C12 fue de 0.57 [0.40, 0.72], se encontró diferencia significativa entre ambas biotintas (P=0.000), la redondez en de las células L6 fue de 0.72 [0.60, 0.83] y la de C2C12 fue de 0.60 [0.47, 0.73], hallándose diferencia entre las dos líneas (P=0.000). Finalmente, el ratio del aspecto de las células fue de 1.39 [1.21, 1.66] y 1.68 [1.36, 2.24], en las células L6 y C2C12, respectivamente. La diferencia significativa entre ambas biotintas fue de P=0.000. RESULTADOS 108 Figura 43: Viabilidad celular de L6 y C2C12. L6 C2C12 P VIABILIDAD 87.38 ± 13.54 % 78.18 ± 7.02 % 0.132 CIRCULARIDAD 0.76 [0.64, 0.86] 0.57 [0.40, 0.72] 0.000 REDONDEZ 0.72 [0.60, 0.83] 0.60 [0.47, 0.73] 0.000 RATIO DEL ASPECTO 1.39 [1.21, 1.66] 1.68 [1.36, 2.24] 0.000 Tabla 9: Viabilidad celular y morfología celular de L6 y C2C12. Además se estudió si existía diferencia significativa entre los grupos controles de ambas línea celular y la viabilidad de ambos grupos estimulados mecánicamente. Se evidenció diferencia entre los grupos controles (P=0.027) y los grupos estimulados (P=0.655) (figura 41) y entre los grupos controles de ambas biotintas entre las 3 variables morfológicas, circularidad, redondez y ratio del aspecto (P=0.000; P=0.000; P=0.000, respectivamente), al igual que entre las 3 variables morfológicas de los grupos estimulados (P=0.000; P= 0.000; P=0.000, respectivamente).saf 4.3.1.3. Efecto de la variación de concentración de alginato y colágeno en las biotintas y reducción de tiempo de cultivo Se midió el efecto que produjo la variación de colágeno y alginato (n=3) sobre la línea C2C12 durante 1 semana, estas biotintas fueron impresas sobre el andamio 3. La biotinta CA3 (figura 44 a) presentó una viabilidad celular de 70.62 ± 16.32 %, la biotinta CA4 tuvo una viabilidad celular de 53.85 ± 3.34 % (figura 44 b). La viabilidad de la biotinta CA5 fue 58.69 ± 2.88% (figura 44 c), mientras que la de CA6 fue del 69.12 ± 1.04% RESULTADOS 109 (figura 44 d). No se evidenció diferencia significativa entre cada una de las biotintas de estudio (P=0.218) (figura 45). Figura 44: Test de viabilidad celular. a. biotinta CA3. b. Biotinta CA4. c. Biotinta CA5. d. Biotinta CA6. Figura 45: Viabilidad celular entre biotintas con diferente concentración de colágeno y alginato. 4.3.2. Andamios de nanofibras Los andamios de nanofibras (n=3) fueron cultivados con 10 x 106 células de la línea C2C12. Los andamios random tuvieron una viabilidad de 80.14 ± 9.36 % (figura 46 a), RESULTADOS 110 los andamios semialineados presentaron una viabilidad de 98.28 ± 0.64 % (figura 46 b), mientras que la de los andamios alineados fue de 84.12 ± 12.69 % (figura 46 c). No se hallaron inferencias significativas entre ninguno de los 3 grupos (P= 0.071) (figura 47). Figura 46: Test de viabilidad celular de andamios fabricados mediante electrospinning. a. Andamios random. b. Andamios semialineados. c. Andamios alineados. d. Andamios alineados estimulados mecánicamente. e. Andamios alineados estimulados eléctricamente en biorreactor. f. Andamios alineados estimulados eléctricamente con tapadera de impresión 3D. RESULTADOS 111 Figura 47: Viabilidad celular de andamios fabricados mediante electrospinning. Atendiendo ahora a la morfología citoplasmática de los andamios random, se halló que las células tenían una circularidad de 0.31 [0.17, 0.48], la redondez fue de 0.38 [0.23, 0.56] y la ratio del aspecto de 2.61 [1.78, 4.37]. En los andamios semialineados, la circularidad fue de 0.61 [0.43, 0.77] y la redondez fue de 0.54 [0.38, 0.71] y la ratio del aspecto fue de 1.86 [1.42, 2.61]. Los andamios alineados mostraron una circularidad de 0.44 [0.30, 0.61] y una redondez de 0.41 [0.27, 0.58] y una ratio del aspecto de 2.43 [1.73, 3.77] (tabla 10). Se hallaron diferencias significativas entre los 3 grupos para cada una de las variables morfológicas medidas circularidad (P=0.000), redondez (P=0.000) y ratio del aspecto (P=0.000), el estudio por pares desveló que existía inferencia significativa entre cada uno de los pares analizados para las 3 variables morfológicas, circularidad (P=0.000), redondez (P=0.000) y ratio del aspecto (P=0.000). RANDOM SEMIALINEADOS ALINEADOS P VIABILIDAD 80.14 ± 9.36 % 98.28 ± 0.64 % 84.12 ± 12.69 % P=0.171 CIRCULARIDAD 0.31 [0.17, 0.48] 0.61 [0.43, 0.77] 0.44 [0.30, 0.61] P=0.000 REDONDEZ 0.38 [0.23, 0.56] 0.54 [0.38, 0.71] 0.41 [0.27, 0.58] P=0.000 RATIO DEL ASPECTO 2.61 [1.78, 4.37] 1.86 [1.42, 2.61] 2.43 [1.73, 3.77] P=0.000 Tabla 10: Viabilidad celular y morfología celular de C2C12 en andamios fabricados por electrospinning. RESULTADOS 112 4.3.2.1. Efecto de la estimulación mecánica y eléctrica sobre la viabilidad Los andamios alineados además fueron sometidos a estimulación mecánica (n=3) y a estimulación eléctrica (n=3). Los andamios estimulados mecánicamente presentaron una viabilidad del 96.00 ± 3.13 % (figura 46 d), mientras que la de los andamios electroestimulados fue del 92.76 ± 2.66 % (figura 46 e). No se pudo demostrar que la estimulación conllevara un aumento en la viabilidad celular en estos andamios (P=0.256) (figura 47). Los andamios estimulados mecánicamente presentaron una circularidad de 0.45 [0.29, 0.65] una redondez de 0.42 [0.26, 0.64] y una ratio del aspecto de 2.37 [1.58, 3.84], mientras que la circularidad fue 0.45 [0.28, 0.61] y de 0.40 [0.27, 0.56] fue la redondez y la ratio del aspecto de los andamios electroestimulados fue de 2.52 [1.79, 3.77] (tabla 11). Se demostró que existe diferencia significativa entre cada una de las variables morfológicas medidas; circularidad (P=0.000), redondez (P=0.000) y ratio del aspecto (P=0.000). Se estudió por pares y se comprobó que entre los grupos sin estimulación y estimulados mecánicamente existe diferencia significativa en la circularidad (P=0.015), en la ratio del aspecto (P=0.005) y en la redondez (P=0.005); entre los andamios estimulados mecánicamente y electroestimulados se halló inferencia estadística en las variables circularidad (P=0.001), ratio del aspecto (P=0.000) y redondez (P=0.000). Sin embargo, entre los grupos no estimulados y electroestimulados no se encontró diferencia significativa en la circularidad (P=0.993), ratio del aspecto (P=0.130) y redondez (P=0.130). CONTROL ELÉCTRICA MECÁNICA PLACA P VIABILIDAD 84.12 ± 12.69% 92.76 ± 2.66% 96.00 ± 3.13% 77.69 ± 7.82% P=0.256 CIRCULARIDAD 0.44 [0.30, 0.61] 0.45 [0.28, 0.61] 0.45 [0.29, 0.65] 0.51 [0.38, 0.66] P=0.000 REDONDEZ 0.41 [0.27, 0.58] 0.40 [0.27, 0.56] 0.42 [0.26, 0.64] 0.57 [0.42, 0.70] P=0.000 RATIO DEL ASPECTO 2.43 [1.73, 3.77] 2.52 [1.79, 3.77] 2.37 [1.58, 3.84] 1.77 [1.43, 2.38] P=0.000 Tabla 11: Viabilidad celular y morfología celular de C2C12 en andamios alineados estimulados. RESULTADOS 113 4.3.2.2. Estimulación eléctrica mediante placa vs biorreactor Para testar el efecto que genera la estimulación eléctrica (n=3) mediante las placas fabricadas con impresión 3D de polímero conductor, lo comparamos frente a los grupos controles y a los grupos de estimulación eléctrica. Los andamios a testar fueron los andamios alineados fabricados mediante electrospinning. Estos andamios estimulados mediante esta placa tuvieron una viabilidad del 77.69 ± 7.82 % (figura 46 f), la circularidad fue de 0.51 [0.38, 0.66] y la redondez de 0.57 [0.42, 0.70] y la ratio del aspecto fue de 1.77 [1.43, 2.38] (tabla 11). Se hallaron diferencias significativas en la ratio del aspecto (P=0.000), circularidad (P=0.000) y redondez (P=0.000) con los andamios controles y con los andamios electroestimulados en la ratio del aspecto (P=0.000), circularidad (P=0.000) y redondez (P=0.000), pero no se encontró diferencia significativa en la viabilidad entre esta nueva estimulación y la de los andamios controles (P=0.971) y los electroestimulados con el biorreactor (P=0.339). 4.3.3. Bioimpresión vs Electrospinning Se comparó la viabilidad celular y la morfología de las células usadas en ambas técnicas (n=6). Para poder comparar ambas técnicas escogimos los andamios sembrados con la línea celular C2C12. Los andamios bioimpresos tuvieron una viabilidad media del 78.18 ± 7.02%, mientras que la de los andamios fabricados mediante electrospinning fue de 89.88 ± 9.86% (figura 48). Se evidenció diferencia significativa en la viabilidad celular entre ambas técnicas (P=0.013). Centrándonos en la morfología de las células en estos andamios, los andamios bioimpresos presentaron una circularidad de 0.57 [0.40, 0.72], una redondez de 0.60 [0.45, 0.73] y una ratio del aspecto de 1.68 [1.36, 2.24] mientras que los andamios de electrospinning mostraron que la circularidad fue de 0.46 [0.29, 0.65], de 0.44 [0.29, 0.63] fue la redondez y la ratio del aspecto de 2.25 [1.59, 3.48]. Se evidenciaron diferencia significativa en las 3 variables morfológicas; circularidad (P=0.000), redondez (P=0.000) y ratio del aspecto (P=0.000) (tabla 12). RESULTADOS 114 Figura 48: Viabilidad celular de andamios fabricados mediante bioimpresión vs electrospinning. BIOIMPRESIÓN ELECTROSPINNING P VIABILIDAD 78.18 ± 7.02 % 89.88 ± 9.86 % P=0.013 CIRCULARIDAD 0.57 [0.40, 0.72] 0.46 [0.29, 0.65] P=0.000 REDONDEZ 0.60 [0.45, 0.73] 0.44 [0.29, 0.63] P=0.000 RATIO DEL ASPECTO 1.68 [1.36, 2.24] 2.25 [1.59, 3.48] P=0.000 Tabla 12: Viabilidad celular y morfología celular de C2C12 en andamios fabricados mediante bioimpresión y electrospinning. Además se estudió la viabilidad en función de la estimulación que recibieron (n=3). Los valores descriptivos sobre los andamios bioimpresos sin estimulación y con estimulación se detallan en el apartado 4.3.1.2.2, los valores de los andamios de electrospinning sin estimulación se detallaron en el apartado 4.3.2 y los estimulados en el 4.3.2.1. Las tablas 13 y 14 recogen brevemente los resultados descriptivos de los andamios sin estimulación y estimulados mecánicamente, respectivamente. BIOIMPRESIÓN ELECTROSPINNING P VIABILIDAD 81.22 ± 6.38 % 87.17 ± 11.62 % P=0.423 CIRCULARIDAD 0.59 [0.41, 0.74] 0.47 [0.27, 0.68] P=0.000 REDONDEZ 0.63 [0.50, 0.75] 0.46 [0.30, 0.65] P=0.000 RATIO DEL ASPECTO 1.59 [1.33, 2.01] 2.16 [1.55, 3.33] P=0.000 Tabla 13: Viabilidad celular y morfología celular de C2C12 en andamios fabricados mediante bioimpresión y electrospinning sin estimulación. RESULTADOS 115 BIOIMPRESIÓN ELECTROSPINNING P VIABILIDAD 75.13 ± 7.39 % 96.00 ± 3.13 % P=0.013 CIRCULARIDAD 0.56 [0.39, 0.69] 0.45 [0.29, 0.65] P=0.000 REDONDEZ 0.56 [0.41, 0.71] 0.42 [0.26, 0.64] P=0.000 RATIO DEL ASPECTO 1.78 [1.40, 2.46] 2.37 [1.58, 3.84] P=0.000 Tabla 14: Viabilidad celular y morfología celular de C2C12 en andamios fabricados mediante bioimpresión y electrospinning estimulados mecánicamente. 4.4. Morfología del citoesqueleto 4.4.1. Andamios bioimpresos 4.4.1.1. Citoesqueleto en biotinta CA2 Se realizó inmunofluorescencia de los andamios de la biotinta CA2 (n=3) con la línea celular C2C12, tanto sin estimulación como estimulados mecánicamente. Estos andamios presentaron una elevada inmaduración y un bajo alineamiento entre sus células como se puede ver en la figura 49. A pesar de la presencia de actina, la formación de miotubos y alineamiento es escasa tanto en andamios con estimulación como sin estimulación. El mayor grado de alineamiento encontrado se da en las células depositadas sobre los filamentos de PCL, la cual ha promovido el alineamiento entre las células. Sin embargo, este alineamiento puede darse entre células que no se encuentre encapsuladas en la biotinta. Figura 49: Inmunofluorescencia de CA2 con C2C12. RESULTADOS 122 andamios random y alineados se vieron diferencias significativas en las 3 variables estudiadas (P=0.000). Los andamios semialineados y alineados tuvieron diferencia significativa en las variables ratio del aspecto (P=0.000) y redondez (P=0.000), sin embargo no se hallaron diferencias significativas en la circularidad (P=0.937). RANDOM SEMIALINEADOS ALINEADOS P RATIO DEL ASPECTO 1.49 [1.30, 1.75] 1.51 [1.30, 1.83] 1.76 [1.50, 2.10] P=0.000 CIRCULARIDAD 0.59 [0.50, 0.74] 0.65 [0.48, 0.67] 0.65 [0.52, 0.75] P=0.000 REDONDEZ 0.67 [0.57, 0.77] 0.66 [0.55, 0.77] 0.57 [0.48, 0.67] P=0.000 Tabla 15: Morfología nuclear de andamios de electrospinning. 4.4.2.3.1. Efecto de la estimulación mecánica y eléctrica sobre la viabilidad Los andamios alineados estimulados mecánicamente (n=3) presentaron una ratio del aspecto de 1.60 [1.40, 1.88], la circularidad fue de 0.50 [0.39, 0.60] y la redondez de 0.63 [0.53, 0.71]. Los núcleos de las células electroestimuladas (n=3) presentaron una ratio del aspecto de 1.96 [1.55, 2.57], una circularidad de 0.39 [0.22, 0.55], y una redondez de 0.51 [0.39, 0.64] (tabla 16). Se evidenció diferencia significativa en todas las variables morfológicas entre todos los pares de estimulaciones (P=0.000). CONTROL ELÉCTRICA MECÁNICA P RATIO DEL ASPECTO 1.76 [1.50, 2.10] 1.96 [1.55, 2.57] 1.60 [1.40, 1.88] P=0.000 CIRCULARIDAD 0.65 [0.52, 0.75] 0.39 [0.22, 0.55] 0.50 [0.39, 0.60] P=0.000 REDONDEZ 0.57 [0.48, 0.67] 0.51 [0.39, 0.64] 0.63 [0.53, 0.71] P=0.000 Tabla 16: Morfología nuclear de andamios alineados estimulados. 4.4.2.4. Densidad nuclear en fibras Se analizaron los núcleos que estaban dentro de las fibras sobre el total de núcleos detectados en cada tipo de andamio (n=3). Así, encontramos que en los andamios random el 80.73 ± 5.21 % de los núcleos estaban dentro de las fibras, en los andamios semialineados la densidad nuclear se vio levemente reducida al 76.74 ± 25.37 % mientras que en los andamios alineados la densidad sufrió un ascenso al 87.28 ± 2.22 %. No se RESULTADOS 123 evidenció diferencia significativa entre la densidad nuclear de los 3 tipos de andamios (P=0.301) (figura 56). Figura 56: Fusión nuclear. 4.4.2.4.1. Efecto de la estimulación mecánica y eléctrica sobre la viabilidad La estimulación eléctrica (n=3) mostró una disminución de los núcleos dentro de las fibras, siendo esta del 82.91 ± 4.41 %, mientras que los andamios estimulados mecánicamente (n=3) promovieron un aumento de la densidad nuclear de hasta el 95.73 ± 1.05 %. Se demostró la existencia de diferencia significativa entre los 3 grupos de estimulación estudiados (P=0.005) (figura 56). El estudio por pares demostró que los andamios alineados estimulados mecánicamente presentaron diferencia significativa respecto a los andamios sin estimulación (P=0.028) y los andamios con estimulación eléctrica (P=0.004), sin embargo, no se pudo demostrar que existiera diferencia significativa entre los andamios electroestimulados y los controles (P=0.238). 4.4.2.5. Densidad de actina en fibras La densidad de actina en los andamios random (n=3) fue del 76.18 ± 10.55 %, en los andamios semialineados (n=3) la densidad fue del 79.87 ± 2.36 %, mientras que en los andamios alineados (n=3) 74.56 ± 2.63 %. No se demostró que existiera diferencia significativa entre los 3 tipos de andamios testados (P=0.179) (figura 57). RESULTADOS 124 Figura 57: Densidad de actina. 4.4.2.5.1. Efecto de la estimulación mecánica y eléctrica sobre la viabilidad El efecto de la estimulación eléctrica (n=3) sobre la densidad de actina en los andamios alineados se tradujo en una reducción de la expresión de actina al 55.62 ± 2.47 %. Por el contrario, el efecto mecánico sobre los andamios alineados (n=3) fue un aumento al 80.13 ± 12.52 %. Se demostró diferencia significativa entre los 3 grupos de los andamios alineados (P=0.004) (figura 57). En el estudio por pares, se vio que la estimulación eléctrica presentó diferencia significativa frente a los andamios sin estimulación (P=0.049) y los andamios estimulados mecánicamente (P=0.017). No obstante, no se pudo demostrar que existiera diferencia significativa entre la estimulación mecánica y el grupo control (P=0.656). 4.5. Actividad funcional de los tejidos Los andamios fabricados mediante electrospinning (n=3) fueron sometidos a estudio de funcionalidad, ya que mostraron una morfología más similar a la del músculo estriado. Todos los grupos y todas las estimulaciones mostraron funcionalidad, aunque no toda esta funcionalidad fue ante la respuesta a un estímulo de iones K+ o de pulsos eléctricos como se puede ver en la figura 58, donde se muestra la luminiscencia normalizada de grupos de células. A partir de estos datos obtuvimos la molaridad de calcio intracelular tras ser expuestos a soluciones altas en iones K+ el incremento de luminiscencia tras el estímulo. RESULTADOS 125 Figura 58: Luminiscencia de las células ante soluciones altas en K+. a. Andamios random. b. Andamios semialineados. c. Andamios alineados. d. Andamios alineados estimulados eléctricamente. e. Andamios alineados estimulados mecánicamente. f. Andamios alineados estimulados mecánicamente estimulados con pulsos eléctricos y soluciones altas en K+. En los andamios random (figura 58 a), alineados (figura 58 c), alineados con estimulación eléctrica (figura 58 d) y mecánica (figura 58 e) podemos ver picos de luminiscencia tras aproximadamente minuto y medio tras el cambio de concentración. En los andamios semialineados (figura 58 b) podemos ver ligeras oscilaciones del valor de luminiscencia en los intervalos que aumenta la concentración de K+. Esto nos habla de una capacidad de contracción muy pobre del tejido y dependiente de la densidad celular de la muestra. RESULTADOS 126 A través de la luminiscencia se hizo una estimación del calcio intracelular, en el primer pico y en el segundo como se puede ver en la tabla 17. De este modo pudimos ver la reacción a estos estímulos por parte de las células y además la fatiga celular en el tren de estímulos, calculando la diferencia entre ambos picos tanto de luminiscencia como de calcio. Así vimos que en los andamios random, tras el primer estímulo, la luminiscencia se incrementó 34.39 [23.15, 46.20] y la concentración de calcio en el primer pico se aumentó en 87.75 nM [45.81, 257.30], llegando a tener una concentración de 178.96 nM [99.95, 393.77]. Tras el segundo estímulo, la luminiscencia se incrementó 16.15 [4.50, 22.14] y la concentración de calcio intracelular en 36.58 nM [4.96, 106.09], con una concentración total de 102.49 nM [48.93, 224.37]. Así la diferencia de calcio entre ambos estímulos fue de 49.46 nM [23.96, 154.63] y la diferencia de luminiscencia de 16.71 [12.34, 25.67]. Escaneando el código QR1 se puede visualizar un breve video de la reacción que sufren las células cultivadas en el andamio random. En el caso de los andamios semialineados el incremento de la luminiscencia fue de 1.99 [1.27, 3.29] y la concentración se incrementó 40.24 nM [18.82, 86.08], resultando en una concentración de calcio de 271.88 nM [148.29, 510.89]. Tras el segundo estímulo la luminiscencia se incrementó 1.38 [0.96, 2.17], la concentración de calcio se redujo 9.32 [-34.29, -1.44], dejando así la concentración de calcio intracelular en 219.61 nM [126.46, 406.76]. Las diferencias de calcio y luminiscencia fueron de 49.65 nM [10.73, 121.78] y 0.52 [0.06, 1.38], respectivamente. Como se puede observar, no hay subida de luminiscencia tras los estímulos. El código QR2 nos lleva a un vídeo donde se puede ver la reacción celular de estos andamios. QR 1: Vídeo andamio random QR 2: Vídeo andamio semialineado RESULTADOS 127 Tabla 17: Concentraciones de calcio intracelular y luminiscencias tras estímulos de soluciones altas en K+. DIFERENCIA DE LUMINISCENCIA 16.71 [12.34, 25.67] 0.52 [0.06, 1.38] 8.50 [7.18, 10.15] 6.49 [3.13, 17.54] 31.51 [18.98, 40.39] DIFERENCIA DE CALCIO 49.46 nM [23.96, 154.63] 49.65 nM [10.73, 121.78] 522.58 nM [63.99, 2262.99] 67.52 nM [10.96, 196.36] 100.68 nM [38.37, 237.96] PICO 2 LUM 16.15 [4.50, 22.14] 1.38 [0.96, 2.17] 13.73 [5.30, 22.25] 2.48 [-2.65, 8.69] 0.43 [-1.68, 1.58] SUBIDA DE CACIO 36.58 nM [4.96, 106.09] -9.32 nM [-34.29, -1.44] 589.00 nM [19.62, 1559.47] 8.34 nM [-17.30, 76.31] -1.61 nM [-10.15, 2.02] PICO DE CALCIO 102.49 nM [48.93, 224.37] 219.61nM [126.46, 406.76] 745.80 nM [134.94, 2029.51] 200.90 nM [92.29, 454.82] 115.31 nM [77.66, 176.13] PICO 1 LUM 34.39 [23.15, 46.20] 1.99 [1.27, 3.29] 22.51 [14.86, 29.74] 12.86 [7.67, 17.49] 32.21 [17.32, 39.87] SUBIDA DE CACIO 87.75 nM [45.81, 257.30] 40.24 nM [18.82, 86.08] 1111.58 nM [83.61, 3822.46] 94.83 nM [27.93, 289.53] 98.87 nM [37.85, 232.33] PICO DE CALCIO 178.96 nM [99.95, 393.77] 271.88 nM [148.29, 510.89] 1268.37 nM [198.93, 4292.50] 280.32 nM [119.27, 635.22] 193.81 nM [125.20, 420.02] RANDOM SEMIALINEADOS ALINEADOS (CONTROL) ALINEADOS (EÉCTRICA) ALINEADOS (MECÁNCIA) RESULTADOS 128 Los andamios alineados presentaron un incremento de luminiscencia de 22.51 [14.86, 29.74] y un incremento de la concentración de calcio de 1111.58 nM [83.61, 3822.46], con una concentración de calcio total de 1268.37 nM [198.93, 4292.50]. Tras el segundo la luminiscencia y la concentración de calcio se incrementaron 13.73 [5.30, 22.25] y 589.00 nM [19.62, 1559.47], respectivamente. La concentración total de calcio intracelular tras el segundo estímulo fue de 745.80 nM [134.94, 2029.51], así la diferencia de concentraciones de calcio fue 522.58 nM [63.99, 2262.99] y la diferencia de luminiscencia de 8.50 [7.18, 10.15] entre ambos picos. Escaneando el código QR3, podremos ver la respuesta de los andamios alineados ante los estímulos. Se demostraron diferencias significativas en los incrementos de calcio tras el primer estímulo (P=0.007) y tras el segundo (P=0.000), así como en los incrementos de las luminiscencias tras el primer (P=0.000) y el segundo estímulo (P=0.000). Finalmente se evidenció diferencia en la concentración total de calcio intracelular tras el segundo estímulo (P=0.015) y en la diferencia de luminiscencia entre ambos estímulos (P=0.000). Revisando por pares los andamios random y semialineados presentaron diferencias en los incrementos de calcio tras el primer estímulo (P=0.006) y tras el segundo (P=0.000), en los incrementos de las luminiscencias tras el primer (P=0.000) y el segundo estímulo (P=0.000) y en la concentración total de calcio tras el segundo estímulo (P=0.021) y en la diferencia de luminiscencia entre ambos estímulos (P=0.000). Entre los andamios semialineados y alineados se demostraron diferencias solamente en los incrementos de calcio intracelular tras el primer estímulo (P=0.047) y tras el segundo estímulo (P=0.002) y en los incrementos de luminiscencia (P=0.000) y (P=0.002), respectivamente y en la diferencia de luminiscencia entre ambos picos (P=0.000). Finalmente, los andamios alineados y random presentaron diferencias significativas solamente en la diferencia de luminiscencia entre ambos picos (P=0.004). Atendiendo a los andamios alineados, la estimulación eléctrica (n=3) produjo un incremento de la luminiscencia en 12.86 [7.67, 17.49] y un incremento de la concentración de calcio tras el primer estímulo de 94.83 nM [27.93, 289.53], con un concentración total de 280.32 nM [119.27, 635.22]. Tras el segundo estímulo, el incremento de la luminiscencia fue de 2.48 [-2.65, 8.69] y el aumento de la concentración QR 3: Vídeo andamio alineado RESULTADOS 129 fue de 8.34 nM [-17.30, 76.31] con una concentración total de 200.90 nM [92.29, 454.82], mientras que las diferencias de la concentración de calcio y de luminiscencia fueron de 67.52 nM [10.96, 196.36] y 6.49 [3.13, 17.54], respectivamente. Con el código QR 4 podremos observar la respuesta de las células cultivadas en estos andamios. En los andamios estimulados mecánicamente (n=3), la luminiscencia se incrementó 32.21 [17.32, 39.87] y el calcio 98.87 nM [37.85, 232.33], así la concentración de calcio tras el primer estímulo en los andamios estimulados mecánicamente fue de 193.81 nM [125.20, 420.02]. Tras el segundo estímulo, el incremento de la luminiscencia fue de 0.43 [-1.68, 1.58] mientras que la concentración de calcio se redujo 1.61 nM [-10.15, 2.02]. Estaba baja respuesta puede ser debida al poco tiempo de exposición al estímulo o bien a la fatiga del anterior estímulo. La concentración de calcio fue de 115.31 nM [77.66, 176.13], la diferencia de calcio fue de 100.68 nM [38.37, 237.96] y la diferencia de luminiscencia fue de 31.51 [18.98, 40.39]. A través del código QR 5, es posible la visualización de la respuesta de las células cultivadas en estos andamios ante los estímulos. Se evidenciaron diferencias en la concentración de calcio tras el segundo estímulo (P=0.028), el incremento de calcio tras el segundo estímulo (P=0.025), en el incremento de luminiscencia tras el primer (P=0.000) y segundo estímulo (P=0.009) y en la diferencia de luminiscencia entre ambos estímulos (P=0.000). Entre los andamios sin estimulación y estimulados eléctricamente se vio diferencia significativa en el incremento de calcio tras el segundo estímulo (P=0.049). Entre los andamios sin estimulación y estimulados mecánicamente se vio diferencia en el incremento de calcio tras el segundo estímulo (P=0.006) y en el incremento de luminiscencia tras el segundo estímulo (P=0.000). Entre los grupos estimulados se demostró diferencia en el incremento de la luminiscencia tras el primer estímulo (P=0.000), en la concentración de calcio tras el segundo estímulo (P=0.020) y en la diferencia de luminiscencia entre ambos estímulos (P=0.000). En resumen, hemos observado que la capacidad de contracción del tejido es superior en andamios alineados tanto con estimulación mecánica como sin estimulación y los andamios random de la misma manera que el grado de formación de músculo esquelético. QR 4: Vídeo andamio alineado con estimulación eléctrica QR 5: Vídeo andamio alineado con estimulación mecánica RESULTADOS 130 Finalmente, los andamios estimulados mecánicamente, al presentar una contracción evidente y una orientación de las fibras, fueron sometidos a estimulación eléctrica para conocer su respuesta antes este nuevo estímulo. Como podemos ver en la figura 58 f, primero se sometió a una frecuencia de 0.2 Hz, después a 0.5 Hz, 1 Hz y 2 Hz, cada tren de descargas duró 30 segundos. Además, el código QR 6, nos permite visualizar un breve vídeo de la respuesta de las células de este grupo ante los estímulos a los que fueron expuestas. Pudimos ver la respuesta de las células a bajas frecuencias, sin embargo a la frecuencia de 2 Hz la respuesta no fue tan evidente como la presentaron a bajas. Esto se pude deber al tiempo de despolarización de las membranas celulares, puede que sea más lento que la velocidad a la que cambian los estímulos y no permite que el calcio entre dentro de las células. Aun así, los cultivos fueron estimulados de nuevo a 1 Hz y a soluciones altas en K+ y pudimos comprobar que volvían a ser funcionales. QR 6: Andamio respondiendo a pulsos eléctricos y solución alta en potasio CAPÍTULO 5 DISCUSIÓN