Estudio de la familia de proteínas Rho GTPasas en la biología del neuroblastoma
Abstract
El neuroblastoma (NB) es el tumor extracraneal sólido de aparición más común durante la edad pediátrica. El NB surge a raíz de un desarrollo erróneo del linaje simpatoadrenal de la cresta neural. Es una enfermedad muy heterogénea y las variantes más agresivas presentan resistencia a las terapias existentes y una supervivencia enormemente baja. Esto genera una gran demanda por una investigación básica y translacional que esclarezca los mecanismos moleculares y celulares subyacentes al crecimiento tumoral, a las metástasis y/o recaídas. La heterogeneidad intratumoral a nivel celular del neuroblastoma ha emergido recientemente como una característica definitoria en estos tipos de tumores. Entre estas poblaciones se pueden identificar células semejantes a neuroblastos en diferentes estados madurativos y otras poblaciones con características similares a las células de la cresta neural, multipotentes y migratorias, que podrían explicar su variada presentación clínica y la aparición de recaídas agresivas. En relación a esto, en el laboratorio hemos descrito la existencia de una población de células progenitoras, con alta expresión del marcador CD44, y con características tumorigénicas y metastáticas. Una de las vías de señalización que aparece altamente afectada en neuroblastomas agresivos es la regulación de las proteínas de la familia Rho GTPasas. Las Rho GTPasas son moléculas señalizadoras que actúan como interruptores moleculares, alternando entre una forma GTP activa y una GDP inactiva, modulada a su vez por un gran número de reguladores moleculares: las proteínas tipo GEF (Guanine Exchange Factor) activadoras y proteínas tipo GAP (Guanine Activator Protein) y GDI (Guanine Dissociation Inhibitor) inhibidoras. Una vez activadas, las proteínas Rho GTPasas interaccionan con los denominados efectores, activándolos y regulando así el funcionamiento de multitud de vías de señalización. Debido al papel integrador de esta familia de proteínas en la diferenciación y proliferación celulares, estas podrían estar además involucradas en la biología de las poblaciones progenitoras en NB. En esta tesis doctoral, se han realizado análisis de expresión en cohortes de pacientes de NB que muestran la desregulación de la señalización de Rho GTPasas como un sello distintivo de la progresión de la enfermedad, en correlación con parámetros clínicos, especialmente relacionados con la señalización de Cdc42 Los ensayos funcionales realizados indican que la sobreexpresión de Cdc42 es perjudicial para la progresión del tumor, ya que afecta a la proliferación y diferenciación celular. Se encontró una regulación positiva de CdGAP, GAP específica de las GTPasas Cdc42 y Rac1, en células CD44Hi, aparentemente controlando la acción de Cdc42. Silenciar CdGAP o activar Cdc42 disminuye la capacidad de mantenimiento de las células las poblaciones progenitoras de NB al afectar los factores involucrados en la especificación de las células de la cresta neural. En conclusión, la señalización mediada por las Rho GTPasas se encuentra alterada en casos de NB de alto riesgo, lo que indica su posible papel en NB agresivo. En particular, Cdc42 juega un papel en la proliferación y diferenciación de células NB. Se ha descubierto que CdGAP está específicamente regulado al alza en células de NB con características progenitoras, siendo un posible culpable de la desregulación de Cdc42 en esta población de células malignas.
Full text
Estudio de la familia de proteínas Rho GTPasas en la biología del neuroblastoma María de los Ángeles Gómez Muñoz Instituto de Biomedicina de Sevilla Universidad de Sevilla 2022 TESIS DOCTORAL
ESTUDIO DE LA FAMILIA DE PROTEÍNAS RHO GTPASAS EN LA BIOLOGÍA DEL NEUROBLASTOMA TESIS DOCTORAL MARÍA DE LOS ÁNGELES GÓMEZ MUÑOZ Laboratorio de Fisiopatología de células madre neurales Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) Universidad de Sevilla (US) 2022 Programa de Doctorado: Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica Directores de Tesis: Ricardo Pardal Redondo Francisco M. Vega Moreno Tutor de Tesis: Ricardo Pardal Redondo
Dr. Ricardo Pardal Redondo, catedrático del Departamento de Fisiología Mdica y Biofsica e investigador principal del Instituto de Biomedicina de Sevilla y Dr. Francisco Manuel Vega Moreno, profesor del Departamento de Biologa Celular y co-investigador principal del Instituto de Biomedicina de Sevilla CERTIFICAN: Que la memoria con titulo “Estudio del papel de la familia de protenas Rho GTPasas en la biologa del Neuroblastoma”, presentada por la graduada MARÍA DE LOS ÁNGELES GÓMEZ MUÑOZ para optar al titulo de doctora en Biología Molecular, Biomedicina e Investigación Clínica, ha sido realizada bajo su dirección en el Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), y reúne contenidos suficientes para que se presentada ante el tribunal correspondiente y optar al grado de Doctora por la Universidad de Sevilla. Y para que as conste, a efectos legales, expiden el presente certificado: En Sevilla, a 31 de mayo de 2022 Firmado: Ricardo Pardal Redondo Catedrático del Departamento de Fisiología Médica y Biofísica Investigador principal Instituto de Biomedicina de Sevilla Universidad de Sevilla Firmado: Francisco M Vega Moreno Profesor del Departamento de Biología Celular Co-Investigador principal Instituto de Biomedicina de Sevilla Universidad de Sevilla
Esta memoria ha sido realizada por la estudiante predoctoral María de los Ángeles Gómez Muñoz, financiada de forma directa por diferentes proyectos durante la realización de la misma, detallados a continuación: - Becaria a cargo de la Asociación NEN: Pacientes y amigos de pacientes con neuroblastoma (octubre 2017-junio 2020) - Becaria a cargo de fondos gestionados por SEHOP: Sociedad Española de Hematología y Oncología pediátricas (julio 2020-junio 2021) - Técnico de apoyo a la investigación financiada a cargo de proyecto I+D+i FEDER Andalucía 2014-2020 (US 12-629985), (julio 2021-marzo 2022) La investigación en el laboratorio ha sido financiada por los proyectos: - Ministerio de Ciencia e Innovación y Agencia Estatal de Investigación (PID2019-1108117RB-I00) - Junta de Andalucía- FEDER (US 12-629985) - Universidad de Sevilla-Junta de Andalucía-FEDER (P18-RT-3151)
1 Índice Resumen ……………………………………………………….………….…...................5 Abstract ……………………………………………………….………….…....................7 Abreviaturas……………………………………………………….………….…............ 9 Índice de figuraS ……………………………………………………….………………….…13 Índice de tablas ……………………………………………………….………….…...17 Introducción ……………………………………………………….………….………19 1. El cáncer ……………………………………………………….………….………21 1.1 Cáncer pediátrico o infantil ……………………………………..……….…..21 2. El Neuroblastoma (NB) ………………………………………….………….….. 25 2.1 Presentación clínica ………………………………………….………….…..25 2.1.1 Estadificación y diagnóstico ………………………………………..27 2.1.2 Histología ……………………………………………………….……30 2.1.3 Alteraciones genéticas y factores pronóstico …………………….31 2.1.3.1 Neuroblastoma familiar ………………………………………...31 2.1.3.2 Neuroblastoma esporádico …………. ……….………….…..32 2.2 Tratamiento……………………………………………………………….…..35 2.3 Origen celular del neuroblastoma ………………………………………….38 2.4 Heterogeneidad tumoral en neuroblastoma ………………………………41 2.5 Células madre cancerosas y células indiferenciadas en NB……...…….45 3. Rho GTPasas ……………………………………………………….……………48 3.1 Regulación de las Rho GTPasas …………………………………………..51 3.1.1 GEFs ……………………………………………………….…………52 3.1.2 GAPs …………………………………………………………………53 3.1.3 GDIs ……………………………………………………….………….53 3.1.4 Efectores ……………………………………………………….…….53 3.1.5 Localización subcelular ……………………………………………..54 3.1.6 Regulación transcripcional …………………………………………55 3.2 Función fisiológica …………………………………………………………...56 3.3 Rho GTPasas en patologa…………………………………………………62 3.4 Rho GTPasas y cáncer ……………………………………………………...63 Objetivos …………………………………………………………..................................69 Materiales y Métodos …………………………………………………………............71 1. Análisis de datos de expresión génica de cohortes de pacientes de neuroblastoma.…………………………………………………………………...73 1.1 Análisis de supervivencia………………………………………………….75
1.2 Análisis de correlación de expresión.…………………………………….75 1.3 Análisis de red de co-expresión de genes ponderados o Weighted Correlation Network Analysis (WGCNA).………………………………..76 1.4 Análisis de similitud o análisis Jaccard ………………………………….77 1.5 Análisis de regresión univariable y multivariable de Cox. Training set y Validation set..………………………………………………………………77 1.6 Análisis de ontología de genes y enriquecimiento funcional de vías de señalización. Análisis de interacción proteica. ………………………… 79 2. Generación de bacterias competentes. Transformación y selección bacteriana ………………………………………………………………….……..80 3. Líneas celulares de neuroblastoma…………………………………………… 82 4. Ensayo de formación de tumores subcutáneos derivados de biopsias de pacientes o Patient Derived Xenograft (PDXs) ……………………………….83 5. Dispersión y cultivo de células provenientes de tumores xenoinjerto derivados de pacientes.…………………………………………………………...………… 84 6. Análisis de expresión mediante citometría de flujo …………………………..85 7. Separación celular mediante citometría de flujo (FACS) …………………….87 8. Inmunofluorescencia e inmunohistoquímica …………………………………..88 9. Extracción y amplificación de ARN. Retrotranscripción de ARN a ADN complementario…………………………………………………………………. 91 10. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real (Real time quantitative polimerase chain reaction, rt-qPCR) ……………………………..92 11. Extracción y cuantificación de proteínas.……………… ………………………93 12. Inmunodetección de proteínas mediante electroforesis y electrotransferencia (SDS-PAGE). Western Blot …………………………….94 13. Ensayo de detección de actividad de proteínas Rho GTPasas. Pull Down..96 13.1 Generación de bolas GST (Glutation-S-Transferasa) acopladas a dominios PBD y RBD ……………………………………………….…….96 13.2 Aislamiento de fracción activa de Rho GTPasas en lisados proteicos ………………………………………………………………………………..97 14. Proteómica cuantitativa tipo label free (LFQ) …………………………….......98 15. Ensayos de transfección con plásmidos ……………………………………...99 16. Ensayos de silenciamiento génico …………………………………………….100 17. Ensayos de viabilidad celular ………………………………………………….101 18. Ensayos de formación de esferas……………………………………………. 101 19. Ensayos de diferenciación celular …………………………………………...102 20. Análisis de morfología celular …………………………………………………103
3 21. Ensayos de formación de tumores subcutáneos derivados de líneas celulares …………………………………………..……………………………………..…104 22. Ensayos de formación de tumores ortotópicos derivados de líneas celulares. Detección de expresión de Luciferasa por bioluminiscencia.………….….105 23. Estadística……….……………………..…………………………………....…106 Resultados…………………………….……………..………………………………...107 1. Expresión de la familia de las Rho GTPasas en cohortes de pacientes de NB …………………………………………..……………………………………….109 1.1 Estadio de la enfermedad y clasificación del riesgo.………………109 1.1.1. Amplificación del oncogén MYCN.………………………….111 1.1.2. Histología y Heterogeneidad intratumoral.…...……………112 1.1.3. Recaídas.……………………………………………….……..112 1.2 Análisis de supervivencia.………………………………………...….114 2. Análisis de la red reguladora de la actividad de las Rho GTPasas en NB: GAPs, GEFs, GDIs y efectores….………………………………………...….117 3. Análisis de la implicación de la alteración de la red de interacción Rho GTPasa en relación con vías de señalización relevantes para la patología de NB.…………………………………………………………………………….…124 4. Expresin de la familia de la red de interaccin de las GTPasas en diferentes perfiles transcriptmicos asociados a poblaciones celulares en NB….….126 5. Utilidad predictiva de las vas de sealizacin por Rho GTPasas en el neuroblastoma agresivo.………………………………………………….......127 6. Generación y caracterización de cultivos celulares derivados de xenoinjertos procedentes de pacientes…………………………………………………….134 7. Expresin de la familia de las Rho GTPasas en muestras biolgicas de NB …………………………………………………………………………………...137 8. Sobrexpresin de las protenas Cdc42 y RhoB en lneas celulares de NB..142 9. Papel de Cdc42 y RhoB en la proliferacin celular del NB.………….……144 10. Papel de Cdc42 en la dinámica del citoesqueleto de las clulas de NB….……………………………………………………………………...….…147 11. Papel del regulador negativo de Cdc42, CdGAP, en la proliferacin de lneas celulares de NB,,,,……………………………………………………………..153 12. Efecto del silenciamiento de CdGAP en el citoesqueleto de las clulas de NB ………………………………………………………………………………...…155 13. Papel de Cdc42 en el crecimiento tumoral….………………………...…....158 14. Efecto de la sobreexpresin de la protena Cdc42 en el protema de clulas de NB..………………………………………………………………..……....…161
15. Papel de Cdc42 en la indiferenciacin de tumores de neuroblastoma......167 16. Estudio de la protena Cdc42 en tumoresferas y poblaciones progenitoras de NB.…………………………………………………………………………….….170 17. Efecto de la sobreexpresin de Cdc42 en la formacin de tumoresferas...176 18. Expresin de la GAP CdGAP en clulas indiferenciadas de NB.................179 19. Papel de CdGAP en el mantenimiento del carcter indiferenciado de cultivos de tumoresferas.….……………………………………………………….…….182 Discusión .………………………………………………………………………….…...191 1. La expresión de la familia de las Rho GTPasas y su red de señalización se encuentra alterada en NB en correlación a parámetros clínicos.……….....193 2. La sobreexpresión de la expresión de Cdc42 conlleva una disminución de la proliferación celular en células de NB.………………………………….…..…206 3. El aumento de la acción de la proteína Cdc42 refuerza la diferenciación de tipo neuronal en células de NB.……………………………………………..…210 4. La inactivación de la expresión de la GTPasa Cdc42 es un factor involucrado en el mantenimiento de la población progenitora en NB….………………...212 5. Posible potencial diagnóstico y terapéutico de la red de interacción de las Rho GTPasas, en concreto, de la señalización mediada por Cdc42 en NB.…..217 Conclusiones.…………………………………………………………………………..221 Bibliografía…………………………………………………………………………....225 Anexos.…………………………………………………………………….………….…257
5 Resumen El neuroblastoma (NB) es el tumor extracraneal sólido de aparición más común durante la edad pediátrica. Surge a raíz de un desarrollo erróneo del linaje simpatoadrenal de la cresta neural. Es una enfermedad muy heterogénea y las variantes más agresivas presentan resistencia a las terapias existentes y una supervivencia enormemente baja. Esto genera una gran demanda por una investigación básica y translacional que esclarezca los mecanismos moleculares y celulares subyacentes al crecimiento tumoral, a las metástasis y/o recaídas. La heterogeneidad intratumoral a nivel celular del neuroblastoma ha emergido recientemente como una característica definitoria en estos tipos de tumores. Entre estas poblaciones se pueden identificar células semejantes a neuroblastos en diferentes estados madurativos y otras poblaciones con características similares a las células de la cresta neural, multipotentes y migratorias, que podrían explicar su variada presentación clínica y la aparición de recaídas agresivas. En relación a esto, en el laboratorio hemos descrito la existencia de una población de células progenitoras, con alta expresión del marcador CD44, y con características tumorigénicas y metastásicas. Una de las vías de señalización que aparece mayoritariamente mutada en los neuroblastomas agresivos es la de regulación de las proteínas de la familia Rho GTPasas. Las Rho GTPasas son moléculas señalizadoras que actúan como interruptores moleculares, alternando entre una forma GTP activa y una GDP inactiva, modulada a su vez por un gran número de reguladores moleculares: las proteínas tipo GEF (Guanine Exchange Factor) activadoras y proteínas tipo GAP (Guanine Activator Protein) y GDI (Guanine Dissociation Inhibitor) inhibidoras. Una vez activadas, las proteínas Rho GTPasas interaccionan con los denominados efectores, activándolos y regulando así el funcionamiento de multitud de vías de señalización. Debido al papel integrador de esta familia de proteínas en la diferenciación y proliferación celulares, estas podrían estar además involucradas en la biología de las poblaciones progenitoras en NB. En esta tesis doctoral, se han realizado análisis de expresión en cohortes de pacientes de NB que muestran la desregulación de la señalización de Rho GTPasas como un sello distintivo de la progresión de la enfermedad, en correlación con parámetros clínicos, especialmente relacionados con la señalización de Cdc42. Los ensayos funcionales realizados indican que la sobreexpresión de Cdc42 es perjudicial para la progresión del tumor, ya que afecta a la proliferación y diferenciación celular. Se encontró una regulación positiva de CdGAP, GAP específica de las GTPasas Cdc42 y Rac1, en células CD44Hi, aparentemente
controlando la acción de Cdc42. Silenciar CdGAP o activar Cdc42 disminuye la capacidad de mantenimiento de las células las poblaciones progenitoras de NB al afectar los factores involucrados en la especificación de las células de la cresta neural. En conclusión, la señalización mediada por las Rho GTPasas se encuentra alterada en casos de NB de alto riesgo, lo que indica su posible papel en NB agresivo. En particular, Cdc42 juega un papel en la proliferación y diferenciación de células NB. Se ha descubierto que CdGAP está específicamente regulado al alza en células de NB con características progenitoras, siendo un posible culpable de la desregulación de Cdc42 en esta población de células malignas. Palabras clave: neuroblastoma, Rho GTPasas, población progenitora, diferenciación, factores pronósticos, progresión.
7 Abstract Neuroblastoma (NB) is the most common solid extracranial tumor during childhood. It arises in the embryonic neural crest due to an uncontrolled behavior of sympathetic nervous system progenitors, giving rise to aggressive tumors. NB intratumoral heterogeneity has emerged as a defining characteristic that can explain its aggressive behavior. Recent single cell expression analyses in NB tumors have described different cell profiles that could be responsible of NB origin, such as neuroblasts or progenitor cells resembling neural crest stem cells. In our laboratory, we have described the existence of a progenitor population, with high expression of the CD44 marker and metastatic characteristics which are enriched in malignant NB. Genomic analyses on NB tumors have described Rho GTPase signaling as one of the most frequently mutated in aggressive NB. Rho GTPases are signaling molecules that act as molecular switches, alternating between an active GTP form and an inactive GDP, modulated in turn by a large number of molecular regulators: activator GEF (Guanine Exchange Factor) type proteins and GAP type proteins. (Guanine Activator Protein) and GDI (Guanine Dissociation Inhibitor) inhibitors. Once activated, the Rho GTPase proteins interact with the so-called effectors, activating them and thus regulating a multitude of signaling pathways. Due to the integrative role of this family of proteins in cell differentiation and proliferation, they could also be involved in the biology of progenitor populations in NB. As part of this PhD project, expression analyzes have been performed in NB patients cohorts showing dysregulation of Rho GTPase signaling as a hallmark of disease progression, in correlation with clinical parameters, especially related to Rho GTPase Cdc42. Functional assays performed indicate that Cdc42 reexpression is detrimental to tumor progression, affecting cell proliferation and differentiation. Upregulation of CdGAP, GAP specific to the GTPases Cdc42 and Rac1, was found in CD44Hi cells, apparently controlling Cdc42 action. Silencing CdGAP, specific Cdc42 GAP, or activating Cdc42 decreases the ability of cells to maintain NB progenitor populations by affecting factors involved in neural crest cell specification. In conclusion, Rho GTPase signaling is altered in high-risk NB cases, indicating its possible role in aggressive NB. In particular, Cdc42 plays a role in the proliferation and differentiation of NB cells. CdGAP has been found to be specifically upregulated in NB cells with progenitor characteristics, being a possible culprit for the deregulation of Cdc42 in this population of malignant cells. Key words: Neuroblastoma, Rho GTPases, progenitor population, differentiation, prognostic factors, progression.
15 Figura 34. Análisis y caracterización inmunohistoquímica de tumores ortotópicos en ratones SCIDs derivados de células CHLA 255 con o sin GFP- Cdc42………….……………………………………………………………………..160 Figura 35. Análisis Proteómica Cuantitativa Label Free (LFQ) para las líneas CHLA 20 con o sin GFP-Cdc42 realizado con Metaboanalyst.…….………………….163 Figura 36. Análisis de las proteínas que cambian de manera significativa obtenidas del análisis de proteómica cuantitativa LF de las líneas CHLA 20 con o sin GFP- Cdc42…………………………………………………………………………………166 Figura 37. Relación entre la expresión de Cdc42 y genes involucrados en el mantenimiento de poblaciones indiferenciadas en NB………………………….169 Figura 38. Caracterización de la expresión de las Rho GTPasas tumoresferas..172 Figura 39. Caracterización de la expresión de las Rho GTPasas en células CD44Hi ……………………………………………………………….………………………..173 Figura 40. Expresión de las Rho GTPasas en poblaciones progenitoras ……175 Figura 41. Cultivos de tumoresferas de las líneas SK-N-SH y GI-ME-N transfectadas para expresar GFP-Cdc42………………………………………...177 Figura 42. Cultivos de tumoresferas de la línea SK-N-SH silenciada para la expresión de la proteína Cdc42……………………………………………………178 Figura 43. Expresión de la GAP CdGAP/ARHGAP31 en poblaciones indiferenciadas de NB………………………………………………………………181 Figura 44. Efecto del silenciamiento de CdGAP en tumoresferas de la línea celular SK-N-SH……………………………………………………………………………..183 Figura 45. Efecto del silenciamiento de CdGAP en tumoresferas del cultivo celular NB48T………………………………………………………………………………..184 Figura 46. Efecto del silenciamiento de CdGAP en tumoresferas adheridas del cultivo celular NB48T……………………………………………………………….185 Figura 47. Efecto del silenciamiento de CdGAP en poblaciones progenitoras CD44Hi de la línea SK-N-SH………………………………………………………187 Figura 48. Efecto del silenciamiento de CdGAP en poblaciones progenitoras CD44Hi del cultivo celular NB48T…………………………………………………188 Figura 49. Caracterización morfológica de células procedentes de tumoresferas de cultivo NB48T tras silenciamiento de siCdGAP……………………………...189 Discusión Figura 50. Resumen gráfico del mecanismo de acción propuesto para la Rho GTPasa Cdc42………………………………………………………………………218 Figura 51. Resumen gráfico del mecanismo de acción propuesto de la GAP CdGAP………………………………………………………………………………..219
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17 Índice de tablas Introducción Tabla 1. International Neuroblastoma Staging System (INSS)…………………….28 Tabla 2. International Risk Neuroblastoma Staging System…………………...….28 Tabla 3. International Risk Neuroblastoma Group (INRG)………………….….….29 Materiales y métodos Tabla 4. Bases de datos de NB utilizadas en el análisis de expresión de la familia de las Rho GTPasas………………………………………………………….……….73 Tabla 5. Principales características clínicas de las cohortes de pacientes utilizadas ………………………………………………………………………………….………..74 Tabla 6. Bacterias competentes y sus características……………………….……80 Tabla 7. Plásmidos y sus características…………………………………….……..81 Tabla 8. Líneas celulares y características…………………………………….…...83 Tabla 9. Tumores PDX utilizados para generar cultivos primarios y sus características…………………………………………………………………….……85 Tabla 10. Anticuerpos primarios utilizados para citometría de flujo………...……86 Tabla 11. Anticuerpos secundarios utilizados para citometría de flujo..…….…..86 Tabla 12. Anticuerpos primarios utilizados para inmunofluorescencia……….…89 Tabla 13. Anticuerpos secundarios utilizados para inmunofluorescencia….…...89 Tabla 14. Anticuerpos primarios utilizados para inmunohistoquímica……….….90 Tabla 15. Anticuerpos secundarios utilizados para inmunohistoquímica…….…91 Tabla 16. Secuencias cebadores sentido y antisentido……………………….….92 Tabla 17. Anticuerpos primarios utilizados para la técnica Western Blot….……95 Tabla 18. Anticuerpos secundarios utilizados para la técnica Western Blot.......96 Tabla 19. Secuencias siRNA pool, ARHGAP31 y CDC42…………………….…101 Tabla 20. Características morfológicas analizadas por Cell Profiler…………....103 Resultados Tabla 21. Grupo de genes en la red de señalización de las Rho GTPasas seleccionadas para el estudio………………………………………………………117 Tabla 22. Firma de genes relacionados con la familia de las Rho GTPasas con capacidad predictiva de la supervivencia total de los pacientes en NB……….128 Tabla 23. Análisis de predicción de las proteínas con mayor posibilidad de interacción con los genes pertenecientes a la firma……………………………..132 Tabla 24. Listado de proteínas que cambian de expresión significativamente en la línea CHLA 20 que sobreexpresa GFP-Cdc42, en comparación con la línea control, en el análisis de proteómica LFQ ……………………………………..…164
18 **Las tablas y figuras mencionadas en apartados diferentes a los que pertenecen se encuentran debidamente hipervinculadas en la versión PDF con el fin de facilitar la lectura del documento. Así mismo los índices y anexos**
Introducción
Introducción 21 1. El cáncer Cáncer es el término utilizado para denominar al conjunto de enfermedades provocadas por la división descontrolada de células en un tejido concreto, con capacidad de invadir otros tejidos en forma de metástasis. Actualmente sigue siendo una de las primeras causas de mortalidad en todo el mundo, incluyendo a países de todos los niveles económicos, a pesar de los grandes avances que se han dado en su estudio durante los últimos 25 años (Hanahan & Weinberg, 2000, 2011). Estos avances son más limitados si nos referimos al estudio del cáncer pediátrico, por razones suscritas a su idiosincrasia como patología. Esta tesis doctoral tiene como objeto principal de estudio un cáncer de tipo pediátrico, el Neuroblastoma (NB), por lo tanto, seguidamente, se detallarán las particularidades de los tumores pediátricos frente a los tumores en la edad adulta, y cómo estas diferencias provocan consecuencias a la hora de plantear su estudio como enfermedad. 1.1. Cáncer pediátrico o infantil El cáncer infantil provoca altos índices de mortalidad, aunque se considera un conjunto de enfermedades raras, debido a su baja incidencia en números absolutos en comparación con el cáncer en la edad adulta. El cáncer en la edad adulta se origina como consecuencia de una acumulación y selección de mutaciones no reparadas en un tejido durante un largo periodo de tiempo, que provocan su malignización. Sin embargo, el cáncer pediátrico no se origina en el tiempo requerido para que se acumulen este tipo de alteraciones, por lo que se desarrolla en otro contexto biológico y celular, resaltado a continuación. La ratio de mutaciones acumuladas en tumores infantiles es 14 veces menor que en tumores durante la edad adulta (Gröbner et al., 2018; Kattner et al., 2019). De hecho, estudios pan-genómicos y transcriptómicos en más de 1000 muestras de tumores infantiles han demostrado que las mutaciones encontradas en este tipo de tumores solo coinciden en un 45% con las encontradas en estudios de tumores adultos. Se describe que, en cambio, estas alteraciones suelen dar lugar a profundos cambios epigenéticos, debido a la recurrencia de mutaciones en los complejos de cromatina o histonas. Un ejemplo de esto lo encontramos en el glioma difuso intrínseco, en el que se dan mutaciones puntuales en histonas como la H3 (Wu et al., 2012). Se ha descrito que solo entre un 7-8% de estos tumores tienen origen hereditario, por mutaciones de la línea germinal, una cifra similar a lo que ocurre en tumores durante la edad adulta (Gröbner et al., 2018; J. Zhang et al., 2015). Estos eventos hereditarios se dan de forma más común
Introducción 22 en los carcinomas adrenocorticales (50%) y en las leucemias agudas linfoblásticas de célula B (28%). La mayoría de los genes diana para este tipo de eventos hereditarios son genes dentro de la familia de reparación del ADN. Así mismo, un 62% de las alteraciones que se dan en los tumores infantiles son aberraciones cromosómicas o variables estructurales que dan lugar a la formación de proteínas de fusión o eventos celulares catastróficos como la cromotripsis (Ma et al., 2018). Los tumores pediátricos poseen orígenes celulares variados y engloban a tumores hematológicos (leucemias o linfomas) y tumores sólidos como los del sistema nervioso central, sarcomas de hueso y tejido blando o retinoblastomas, tumores rabdoides, y neuroblastomas, este último, tema central de este trabajo de tesis doctoral. En concreto, los tumores pediátricos sólidos se pueden originar a partir de cualquiera de las tres capas germinales del embrión durante el desarrollo: ectodermo (retinoblastoma, neuroblastoma, o melanoma), mesodermo (sarcomas) o endodermo (tumor estromal gastrointestinal o GIST, hepatoblastoma, o carcinomas colorrectales) (Chen et al., 2015). De hecho, el origen de algunos de estos tumores en el tejido embrionario es una de las claves biológicas más relevantes en su estudio, por lo que a continuación se exponen las singularidades que esto provoca en el inicio y desarrollo de los tumores pediátricos. Muchos de los tumores que se dan durante la edad pediátrica se deben a eventos prenatales o durante el desarrollo del embrión o feto. De hecho, se ha descrito que algunos tumores diagnosticados durante edades muy tempranas poseen características biológicas que los asemeja a tejidos embrionarios, en la capacidad migratoria e invasiva de sus células, o en patrones de expresión génica compartidos (Ma et al., 2010). Estudios recientes de secuenciación de célula única en tumores del sistema nervioso, como gliomas, tumores rabdoides o meduloblastomas, en comparación con tejido embrionario cerebral, han descrito patrones de expresión comunes entre células tumorales y células progenitoras neurales sanas. Adicionalmente, dentro de la población tumoral se encuentran diferentes patrones genéticos que corresponderían con una gran diversidad de tipos celulares prenatales, donde además se identifican alteraciones en el proceso de diferenciación celular como posible mecanismo común de malignización (Jessa et al., 2019; Vladoiu et al., 2019). Parece haber por tanto una clara asociación entre estos eventos tumorigénicos pediátricos y el carácter embrionario e indiferenciado de las células afectadas.
Introducción 23 Se considera que los eventos oncogénicos que provocan este tipo de malignización no se dan al azar, sino que se dan en células madre progenitoras que poseen características celulares que las hacen más vulnerables a este tipo de alteraciones, durante etapas del desarrollo específicas (Marshall et al., 2014). A este fenómeno se le denomina cellular pliancy o flexibilidad celular. Este concepto se refiera a que, durante el desarrollo, la expresión de protooncogenes o supresores tumorales es específica de un tipo celular y de un periodo temporal concreto y, por lo tanto, el posible efecto tumoral de la alteración de estos genes depende del linaje celular y del estadio del desarrollo. Además, los tejidos en desarrollo se caracterizan por poseer una gran dinámica celular que varía en el tiempo y en el espacio. Es por eso que las lesiones oncogénicas específicas en un tipo celular concreto en un momento determinado pueden dar lugar al desarrollo de cáncer, mientras que estas alteraciones, en otro tipo celular concreto, no son toleradas y no dan lugar a malignización celular. La epigenética también juega un papel fundamental en esta flexibilidad celular, ya que el epigenoma es susceptible de sufrir cambios de manera muy acelerada y repentina durante el desarrollo. Cuando una célula se compromete hacia el desarrollo de un linaje celular concreto, se activa el programa transcripcional necesario para el desarrollo de ese tipo celular, principalmente mediante cambios epigenéticos. Existirán por lo tanto zonas de la cromatina más accesibles y el resto del genoma que no es necesario durante ese proceso será silenciado. El control de estos procesos también es susceptible de ser modificado por una lesión oncogénica, provocando una diferenciación celular fallida. Teniendo en cuenta estos principios, existen células que poseen una mayor flexibilidad celular que otras, y que por lo tanto son más susceptibles de sufrir lesiones oncogénicas. Las células que poseen una alta flexibilidad genómica ofrecen una conformación de la cromatina más abierta y accesible, por lo que son más susceptibles de sufrir lesiones oncogénicas, aunque también poseen una mayor cantidad de mecanismos de reparación disponibles o activos. Por otro lado, las células con una baja flexibilidad celular son más resistentes a sufrir daños de este tipo (Puisieux et al., 2018). Estos hechos confirman la suma relevancia de que los procesos derivados del desarrollo embrionario, como el proceso de especificación celular, se encuentren extremadamente regulados a nivel espacio-temporal. El estudio de la heterogeneidad y dinámicas celulares en el origen de los tumores pediátricos supone un desafío, ya que, en estadios tempranos del desarrollo, la misma alteración en un tipo celular específico puede dar lugar a diferentes tipos de respuestas, dependiendo de la expresión génica de esa célula en ese momento del
Introducción 24 desarrollo. Por ejemplo, en el mesodermo conviven diferentes tipos de progenitores de naturaleza heterogénea, que, en el mismo entorno, darán lugar a células de diferente naturaleza: músculo, adipocito o condrocito. El rabdomiosarcoma tiene origen en este tejido. Mientras la alteración de la vía de señalización de Hedgehog sólo afecta a la transformación maligna de células comprometidas al linaje adiposo, la mutación del oncogén RAS solo tiene repercusión en el linaje comprometido a músculo, aunque ambas alteraciones darán lugar a la formación de este tipo de tumor (Hatley et al., 2012). Este fenómeno se conoce clásicamente como competencia para el desarrollo (Cepko et al., 1996). A través del estudio de este tipo de eventos celulares, se reitera la importancia del análisis no solo de los diferentes estados madurativos de los tejidos durante el desarrollo embrionario, sino también de los eventos tumorales responsables de la transformación maligna de ciertas poblaciones celulares durante el desarrollo de algunos tipos de tumores pediátricos. Por otro lado, también ha suscitado interés el posible efecto de factores medioambientales, como la radiación o la dieta materna durante el embarazo, en el desencadenamiento de estos eventos oncogénicos (Bluhm et al., 2008; Cardis et al., 2006). Sin embargo, los estudios de corte epidemiológico que analizan esas variables ambientales no explican de forma completa el desarrollo de este tipo de enfermedades, que se consideran de origen multifactorial. Los tumores pediátricos no sólo suponen un reto en cuanto a su estudio sino también en el planteamiento clínico para su tratamiento. A la hora de establecer un abordaje clínico en pacientes en edad pediátrica, se tienen en cuenta otros aspectos clínicos del paciente, como los efectos del tratamiento a largo plazo, ya que estos tienen efectos secundarios que en algunos casos pueden llegar a provocar discapacidad mental o desarrollo de neoplasias secundarias en los pacientes en su etapa adulta. Así mismo, como se ha mencionado, los tumores infantiles se desarrollan en un contexto diferente en relación a su origen y los eventos oncogénicos que los inician, por lo que, en muchos casos, no se pueden aplicar los mismos protocolos de tratamiento que en el caso del cáncer en la edad adulta (Filbin & Monje, 2019; Kattner et al., 2019). Por ello, en la actualidad, sigue existiendo una necesidad imperiosa de generar nuevos abordajes clínicos y terapias para el cáncer pediátrico, desarrolladas a partir de estudios más exhaustivos y específicos de la biología de estos tipos de tumores. Un claro ejemplo de esta necesidad lo podemos encontrar en la clínica del neuroblastoma, tumor pediátrico de comportamiento especialmente agresivo,
Introducción 31 se caracterizan principalmente por poseer aberraciones cromosómicas que se relacionan con un mal pronóstico (Brodeur, 2003). A continuación, se exponen minuciosamente las principales alteraciones genéticas causadas por la inestabilidad cromosómica característica de este tipo de tumor. Figura 2. Cortes histológicos correspondientes a diferentes tumores de NB en diferentes estadios de diferenciación, teñidos con HE. Tomado de Irwin, 2015. A) Tumor poco diferenciado. B) Tumor diferenciado. C) Ganglioneuroblastoma (estroma rico en células de Schwann). 2.1.3. Alteraciones genéticas y factores pronóstico La ratio de mutaciones que desencadenan eventos tumorigénicos es menor en tumores de tipo infantil, y los NB no son una excepción dentro del cáncer pediátrico. Como ya se ha mencionado, en esta patología es más característica la presencia de aberraciones cromosómicas causantes de la agresividad, en lugar de la acumulación de mutaciones puntuales característica del cáncer adulto (Brodeur, 2003). Las causas genéticas del NB pueden ser variadas y esto hace que también se puedan dividir en dos grupos: neuroblastomas de tipo familiar o neuroblastomas de tipo esporádico. 2.1.3.1. Neuroblastoma familiar Un subconjunto de pacientes que padecen NB presenta predisposición de origen genético a desarrollar la enfermedad. Esta predisposición corresponde con un patrón de herencia autosómico dominante. El NB de tipo hereditario o familiar se da en un 1-1,5 % de los casos (Knudson & Strong, 1972). Existen trabajos que describen
Introducción 32 mutaciones en el brazo corto del cromosoma 1. Y por otro lado, existen otras corrientes de investigación que apuntan a que mutaciones en el locus 16p12-13 son las responsables de esta predisposición genética a padecer NB (Maris et al., 2002). Clásicamente, se debate sobre si sólo existe un locus que determina la predisposición a la enfermedad o si es resultado de la anormalidad de múltiples loci (Brodeur, 2003). En pacientes con NB de tipo hereditario se han descrito mutaciones en el gen homeobox 2b (PHOX2B) y en el gen “Anaplastic lymphoma kinase” (ALK). Ambos factores juegan un papel esencial en la correcta adquisición de la identidad simpatoadrenal de los neuroblastos en el embrión, así como en general en el desarrollo de las estructuras derivadas de la cresta neural. La alteración de estos genes confirma de alguna manera el origen del NB en el linaje simpatoadrenal de las células de la cresta neural. La mutación en ALK aparece en el 50% de los casos de NB familiar. ALK mutado permite el crecimiento y supervivencia celular mediante la activación de las vías de señalización intracelular como PI3K-AKT o MAPK (Nicolai et al., 2015). Su inhibición se utiliza actualmente como diana terapéutica en NB (Mossé et al., 2016; Van der Wekken et al., 2016). 2.1.3.2. Neuroblastoma esporádico Sin embargo, la mayoría de los NB no son hereditarios, sino que aparecen de forma esporádica, por lo que no se deben a alteraciones específicas en la línea germinal. Su aparición se produce por cambios somáticos, principalmente ganancia o pérdida de alelos, la activación de oncogenes, o cambios en la ploidía de las células tumorales (Brodeur, 2003). Los tumores de tipo agresivo se suelen caracterizar por la presencia de translocaciones, amplificaciones, y deleciones cromosómicas, mientras que los tumores con un fenotipo benigno se suelen relacionar con la ganancia de cromosomas. Todo ello convierte a los NB en un tipo de tumores predominantemente heterogéneos a nivel genético (Maris, 2010). Las alteraciones cromosómicas más comunes son la pérdida del brazo 1p36, presente en un 25-35% de los casos de NB de alto riesgo, y la amplificación del locus 2p23-24, responsable de la amplificación del oncogén MYCN. También son habituales alteraciones en cromosomas 5, 4q, 6q, y ganancias en 17q, 14q o 18q. Además, existe una anormalidad del cariotipo asociada a la pérdida de un fragmento del brazo largo del cromosoma 11, relacionada con NB más agresivo y desarrollo del tumor a una edad más avanzada, presente en un 35% de los tumores. Los
Introducción 33 desbalances de los cromosomas 1 y 11, en algunos casos, son los responsables de la ganancia en el cromosoma 17, estando las tres alteraciones relacionadas con un peor pronóstico del paciente (Carén et al., 2010; Maris et al., 2007; Molenaar et al., 2012). Mediante estudios de secuenciación de tumores, se ha identificado que en la patología de NB se dan procesos de reorganización cromosómica aberrante, como la cromotripsis. La cromotripsis es un fenómeno cromosómico catastrófico en el que se da la rotura total de un cromosoma y este se vuelve a re-ensamblar de forma desordenada. En NB se ha descrito por ejemplo para el cromosoma 5. En general, la inestabilidad genómica y el reordenamiento cromosómico que se da en NB podría ser responsable tanto de la gran heterogeneidad presente en la enfermedad como de su comportamiento más agresivo. En los estudios de secuenciación total de tumores de NB, se ha descrito que una de las funciones celulares más afectadas por las alteraciones cromosómicas y/o mutaciones halladas en los NB más agresivos es la de la correcta formación de neuritas o neuritogénesis, evento celular vital para la correcta diferenciación hacia el linaje neuronal y que por tanto se encontraría alterado en los NB de alto riesgo (Molenaar et al., 2012). Dentro de los grupos de genes encargados de esta función podemos encontrar la vía de regulación de la familia de las Rho GTPasas, objetivo de estudio de este trabajo de tesis doctoral, y de la que se tratará en detalle en el apartado 3. Existe otra aberración genética muy relevante en NB, la amplificación del oncogén MYCN, descrita en los años 80, lo que constituye uno de los marcadores más utilizados en el diagnóstico. Este gen es un factor de transcripción responsable de la expresión de genes que controlan los procesos de proliferación y diferenciación celular en células de NB (Schwab et al., 1983). Esta amplificación se encuentra íntimamente relacionada con la capacidad de rápida expansión del tumor, así como con el fracaso de la quimioterapia como tratamiento. Aparece en un 20-30% de los pacientes y la supervivencia de estos no alcanza el 50% a los 5 años del diagnóstico (Brodeur, 2003). Existe aun así un gran grupo de tumores de alto riesgo que no presentan la amplificación de este oncogén, aunque sí expresan niveles muy altos de la proteína estabilizada. Trabajos realizados en nuestro laboratorio han descrito que uno de los genes diana del factor de transcripción MYCN es la proteína quinasa VRK1, asociada al control de la proliferación y al estado madurativo celular en NB (Colmenero-Repiso et al., 2020), y que se encuentra especialmente expresada en tumores de alto riesgo.
Introducción 34 Dentro de otras alteraciones moleculares descritas en NB, se encuentran los receptores quinasa de factores neurotróficos: TrkA, TrkB, y TrkC, y sus ligandos NGF, BDNF, y neurotrofina. En situaciones fisiológicas, estos receptores son importantes para la regulación de la supervivencia celular, el crecimiento, y la diferenciación neuronal. Se expresan siguiendo un patrón espacio-temporal que regula la diferenciación hacia el linaje simpatoadrenal. La expresión diferencial de estos receptores se ha relacionado con el fenotipo del NB. Los NB favorables expresan altos niveles del receptor TrkA, pero no de su ligando, NGF, lo que activa las vías de señalización de muerte celular en estos tipos celulares. Los NB de mal pronóstico, expresan una variante del receptor TrkA (TrkA-III) que confiere a estas células un comportamiento agresivo. Dentro de los tumores agresivos, también se ha descrito que expresan el receptor TrkB y su ligando BDNF, manteniendo la activación de la supervivencia y la proliferación celular (Maris et al., 2007). En un 20-30% de los NB de tipo agresivo también se han descrito reordenamiento del gen que codifica para la transcriptasa TERT (Telomerase reverse transcriptase). En otros casos de alto riesgo, también se han identificado diferentes longitudes en los telómeros (ALT, del inglés Alternative Lenghtening of Telomeres). Los dos grupos están asociados con la activación de la señalización relacionada con el mantenimiento de los telómeros y con un peor pronóstico de la enfermedad. La pérdida gradual de la longitud de los telómeros se encuentra asociada con procesos de envejecimiento celular, por ello, la activación de su mantenimiento está relacionado con eventos oncogénicos y de reordenamiento cromosómico (George et al., 2020; Gröbner et al., 2018; Peifer et al., 2015). Adicionalmente, también se han descrito un pequeño grupo de variaciones somáticas y alteraciones estructurales en los genes ALK (9.2%) y ATRX (2-7%), en tumores de alto riesgo. El gen asociado al cromosoma X, ATRX (Alpha Thalassemia/Mental Retardation Syndrome X-Linked), es un remodelador de la cromatina involucrado en procesos de reparación del ADN. También se han encontrado alteraciones en otros remodeladores de la cromatina como los de la familia ARID1 (Sausen et al., 2013). De hecho, se ha descrito que la pérdida de expresión de ARID1A, promueve la transdiferenciación entre diferentes tipos celulares de NB, lo que provocaría en casos de alto riesgo un aumento de la capacidad invasiva y de la resistencia a terapias en el tumor (Shi et al., 2020).
Introducción 35 Además de todas estas alteraciones estructurales y mutaciones que condicionan la agresividad tumoral en NB, la epigenética juega también un papel esencial en la modulación de la agresividad de este tipo de tumor. Existen diferentes publicaciones que han descrito patrones de hipermetilación en genes normalmente conocidos como supresores de tumores, o inhibición de la modificación de histonas en NB de alto riesgo (Almutairi et al., 2019; Wang et al., 2012). Recientemente, se han descrito 4 patrones epigenéticos en muestras de NB, cuyos circuitos de expresión son capaces de estratificar a los pacientes en grupos clínicos ya descritos: MYCN amplificados, MYCN no amplificados de alto riesgo, MYCN no amplificados de bajo riesgo, y otro subtipo más heterogéneo, característico de casos de recidivas y con presencia de marcadores de células progenitoras. Estos últimos estudios revelan la importancia de la epigenética en la regulación de la identidad celular en los diferentes subtipos de NB, y por lo tanto en la modulación de la agresividad de los mismos (Gartlgruber et al., 2021). La descripción de factores pronóstico y marcadores de la enfermedad tiene como principal finalidad el desarrollo de nuevas terapias que tengan como diana estos marcadores. Hoy en día, la generación y diseño de nuevos tratamientos para el NB sigue siendo una prioridad en el campo. En el siguiente apartado, se describe el estado actual del tratamiento del NB, así como avances relacionados en la terapia. 2.2. Tratamiento La gran heterogeneidad a nivel intertumoral de estos tumores tiene como consecuencia que exista una gran variedad de abordajes terapéuticos para el tratamiento de los pacientes con NB. Para establecer el tratamiento ideal, se tiene en cuenta el grupo de riesgo (Tabla 3), el estadio tipo INSS (Tabla 2), la histología del tumor (Figura 2), la ploidía celular, y la existencia o no de amplificación del oncogén MYCN (PDQ Pediatric Treatment Editorial Board, 2002, actualizado hasta 2021). Existe un grupo especial dentro de los pacientes asintomáticos, normalmente englobados en el estadio 1 o 4s, que experimentan regresión espontánea, a los que se les prescribe solo observación y cuidados clínicos. Aunque en general, para los pacientes de bajo riesgo asintomáticos el protocolo de actuación consiste en cirugía de la zona y observación. Para los sintomáticos de bajo riesgo, que experimentan por ejemplo compresión de la médula espinal, se prescriben bajas dosis de quimioterapia convencional junto con cirugía. El tratamiento de NB de riesgo
Introducción 36 intermedio sigue un protocolo similar, introduciendo también la radioterapia para casos donde existe progresión mientras se está tratando con quimioterapia. En el caso de los pacientes de alto riesgo el abordaje clínico es extremadamente agresivo. En primer lugar, se da un régimen de quimioterapia, y posteriormente cirugía y radioterapia. Se incluye terapia mieloablativa para eliminar la enfermedad mínima residual, e inmunoterapia anti-GD2 con dinutuximab, IL-2 y GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos). Además, se administra terapia con agentes diferenciadores, como los derivados del ácido retinoico, que facilitan la diferenciación de remanentes tumorales tras la terapia y la cirugía, aunque la efectividad de estos tratamientos es limitada (Matthay et al., 1999). A pesar de esto, existe un gran número de pacientes que presentan resistencia a las terapias convencionales. La supervivencia de los pacientes en estos casos es del 20%. De hecho, existen estudios centrados en la descripción de clones con ciertas alteraciones genéticas ventajosas que surgen durante el tratamiento del paciente y son los responsables de la resistencia (Gröbner et al., 2018; Schramm et al., 2015). Para el tratamiento de recidivas o de NB resistentes, existen diferentes aproximaciones clínicas dependiendo del caso del paciente. Para las recidivas locales, la cirugía y la radioterapia es el primer paso, mientras que para las recidivas en forma de metástasis se incluye quimioterapia de alto riesgo, inmunoterapia, e inhibidores del receptor tirosin-quinasa ALK como el crizotinib, para pacientes con mutaciones en ALK. Adicionalmente, en este momento se encuentran en desarrollo numerosos ensayos clínicos en los que intervienen pacientes con recidivas resistentes. Algunos de ellos son, por ejemplo, el ensayo ANBL1821 (NCT03794349), del inhibidor de ODC1, una diana aguas abajo del factor de transcripción MYCN, el ENCIT-01 (NCT02311621), un ensayo clínico sobre el uso de linfocitos T CAR contra el receptor de células de NB CD171, o el ensayo clínico NANT2015-02 (NCT03107988) que estudia el efecto de un inhibidor oral de ALK/ROS1 para pacientes con recidiva dirigida por la alteración de este receptor. Al mismo tiempo, existe un ensayo clínico basado en medicina personalizada (APEC1621 (NCT03155620) o MATCH) donde, utilizando secuenciación de siguiente generación de pacientes pediátricos de diferentes tumores sólidos, entre ellos el NB, se buscan agentes terapéuticos que tengan como diana los genes mutados en estos pacientes (PDQ Pediatric Treatment Editorial Board, 2002, actualizado hasta 2021).
Introducción 37 De forma complementaria a los diferentes ensayos clínicos, existen otros trabajos preclínicos donde se analiza el uso de diferentes inhibidores para dianas terapéuticas descritas en otros tipos de tumores. Un ejemplo sería el uso de inhibidores de metilasas como 5-Aza-deoxycytidine, que modifican la hipermetilación de las islas CpG que se da en los NB de alto riesgo (Westerlund et al., 2017), activando la expresión de genes supresores de tumores, o el tratamiento con inhibidores de deacetilasas (DHAC), que también tienen como diana principal la modificación epigenética de los tumores (Phimmachanh et al., 2020). Otro ejemplo de desarrollo de nuevas terapias se da en el estudio del uso de inhibidores de ROCK2 para neuroblastomas de alto riesgo con amplificación del oncogén MYCN (Dyberg et al., 2017), ya que la alta expresión de este gen correlaciona con una supervivencia baja en pacientes de NB. La descripción y el desarrollo de nuevas dianas terapéuticas a través de la medicina personalizada sigue siendo una prioridad en el campo del NB. Un ejemplo de ello es la gran cantidad de trabajos centrados en la secuenciación de tumores de pacientes antes y después del tratamiento, que tienen como objetivo describir las alteraciones responsables de las resistencias en estos pacientes (Chicard et al., 2018; Gröbner et al., 2018). Una de las características que se relaciona de forma directa con la aparición de resistencias a los tratamientos es la heterogeneidad intratumoral en este tipo de tumores, ya que existen algunos tratamientos que seleccionan de forma positiva a ciertos clones preexistentes resistentes, que mantendrán el crecimiento del tumor. Es por ello que la heterogeneidad tumoral del neuroblastoma a nivel celular ha emergido en los últimos años como característica clave en estos tumores, capaz de explicar su variada presentación clínica y la aparición de recaídas agresivas (van Groningen et al., 2017). La razón de esta heterogeneidad celular radica en su supuesto origen embrionario, ya que las células de origen tan primitivo poseen una alta capacidad plástica y multipotente. En los siguientes apartados se detallan las características celulares del NB en relación a su origen, y las consecuencias de este origen en el carácter especialmente heterogéneo y agresivo de este tipo de tumores.
Introducción 38 2.3. Origen celular del neuroblastoma Como se ha mencionado, algunos tipos de tumores pediátricos diagnosticados durante los primeros años de edad mantienen características celulares y genéticas del linaje embrionario, como por ejemplo el neuroblastoma (Ma et al., 2010). Existen múltiples estudios que describen, desde diferentes aproximaciones, el origen del NB en el linaje simpatoadrenal de las células madre derivadas de la cresta neural. De hecho, estudios de secuenciación han determinado que existen semejanzas a nivel transcriptómico entre células sanas del linaje simpatoadrenal, neuroblastos, y tumores de NB (Cheung & Dyer, 2013; De Preter et al., 2006). La cresta neural es un tejido embrionario formado por células con diferentes grados de multipotencia y plasticidad, y que se origina durante la gastrulación en tejidos involucrados en el desarrollo del tubo neural. El tubo neural primitivo consta de tejido no ectodérmico y de la placa neural. En el borde de la placa neural se da la activación de genes que provocan la aparición de patrones de expresión específicos de la cresta neural, a través de la acción de diferentes vías de señalización como bone morphogenic protein (BMP), vía de Wnt, fibroblast growth factor (FGF), Notch, y del ácido retinoico (AR). La acción de estas vías de señalización se encuentra regulada por el ectodermo, el neuroepitelio y el mesodermo adyacente (Mayor & Theveneau, 2013; Tomolonis et al., 2018) En torno a las 3-4 semanas de gestación durante el desarrollo de un embrión sano, se da el cierre del tubo neural y posteriormente se produce la delaminación de la cresta neural (Figura 3). Durante esta etapa, las células de la cresta neural (NCC) sufren una transición epitelio-mesénquima (EMT, del inglés Epithelial-Mesenchymal transition) controlada en un principio por los factores de transcripción Sox9 y Sox10. Durante esta transformación, las células pierden la capacidad de adhesión a las células neuroepiteliales adyacentes, mediante el paso de polaridad apical a basal y la reorganización del citoesqueleto celular, procesos mediados por las vías de señalización de Snail o de las Rho GTPasas, entre otras (Clay & Halloran, 2013; Faure & Fort, 2015; Mayor & Theveneau, 2013). Las células adquieren un fenotipo mesenquimal y migran a través del embrión para diferenciarse y dar lugar a un extenso número de tipos celulares diferentes como por ejemplo células de músculo liso, cartílago, hueso, células pigmentarias, neuronas sensoriales, glía y células cromafines (Figura 3).
Introducción 39 El proceso de diferenciación de las NCC se encuentra controlado por un pequeño número de genes, como por ejemplo los factores de transcripción SOX, así como por señales extracelulares que controlan la acción de otros genes específicos aguas abajo, y que confieren a la célula en diferenciación su identidad definitiva (Sauka- Spengler & Bronner-Fraser, 2008). Durante el proceso de diferenciación es vital la correcta activación del programa de transcripción asociado al tipo celular de destino, por lo que se da bajo una regulación transcripcional muy compleja. En modelos animales, se ha descrito que las NCC que darán lugar a células comprometidas con el linaje simpatoadrenal (Sox10+) migran de forma ventro-lateral hacia la aorta dorsal, donde se agregan y forman el ganglio simpático primario. Aquí, se induce la expresión del factor de transcripción Phox2b activado por la vía de señalización de BMP, necesario para la especificación de los precursores del linaje simpatoadrenal, también conocidos como neuroblastos, para adquirir identidad neuronal. A partir de aquí, el progenitor pierde la expresión de Sox10 y migra o a los ganglios simpáticos paraespinales o a la médula adrenal/glándula suprarrenal, para dar lugar a células de carácter neuronal, principalmente simpáticas. Una pequeña población de estas células contribuye a la formación de las células cromafines. Sin embargo, la mayoría de esta población de derivados simpatoadrenales se forma a partir de una población de NCC migratorias tardías, también conocidas como células precursoras schwannianas (SCP, del inglés Schwann cell precursors). Los precursores de las células de Schwann llegan a la médula adrenal a través de los axones de neuronas preganglionares. El proceso de diferenciación de estas células precursoras a células cromafines se conoce como estado de transición o estado puente (del inglés bridge state), en el que primero se expresan genes como Ascl1 y Htr3a, para luego expresar genes específicos de médula adrenal como Phox2b y Th (Chan et al., 2017; Tsubota & Kadomatsu, 2018).
Introducción 40 Figura 3. Trayectorias de desarrollo del linaje simpatoadrenal desde células derivadas de la cresta neural. Modelo de ratón, modificado de Tsubota et al. 2018. En el panel de la izquierda se observa la migración ventrolateral temprana de células de la cresta neural (Sox10+) (1) y cómo alcanzan la aorta descendente (2). Una vez alcanzan este destino, se comprometen al linaje simpatoadrenal y comienzan a expresar genes específicos de la línea, como Phox2b. Los precursores simpáticos pierden la expresión de Sox10, y posteriormente migran al ganglio simpático, a la médula adrenal, o al ganglio simpático suprarrenal (3). En el panel de la derecha se puede observar la migración tardía de células de la cresta neural (Schwann cell precursors, p75+ Sox10+), que migran a través de los axones de los nervios pregangliónicos (4) hasta alcanzar la médula adrenal (5). Los precursores de células de Schwann se diferencian hacia célula cromafín en un estadio que se denomina estadio puente o bridge state, y expresan genes específicos del linaje como Th (6). Aproximadamente, un 80% de la población de células cromafines proviene de estos precursores (Tsubota & Kadomatsu, 2018). Migración temprana Migración tardía (nervios pregangliónicos) CCI AD GSP MA CA GS GRD N: Notocorda GS: Ganglio simpático AD: Médula adrenal GSP: Ganglio simpático suprarrenal MA: Médula adrenal CA: Corteza adrenal AD: Aorta ascendente CCI: Célula columna intermediolateral GRD: Ganglio raíz dorsal
Introducción 47 semejantes a los neuroblastos, se ha observado que el estado madurativo de esta población es menos avanzado. Adicionalmente, en algunos tumores de alto riesgo también se ha podido describir un enriquecimiento en genes de la firma mesenquimal y en células semejantes a los precursores schwannianos y/o células bridge o en transición (Figura 4). Este enriquecimiento en células de carácter indiferenciado, de gran plasticidad, podría ser el responsable de la aparición de metástasis agresivas, recaídas y enfermedad mínima residual. De ahí la importancia del estudio de la biología de esta población, que se está demostrando que no es única y que se puede presentar en diferentes estados debido a su característica multipotente y plástica. La alteración de los diferentes procesos celulares que sufren las células de la cresta neural durante el desarrollo embrionario para dar lugar a células del linaje simpatoadrenal, puede dar lugar a la iniciación del NB. Una de las principales consecuencias de estos eventos es la parada del proceso de diferenciación celular y el mantenimiento de la capacidad de autorrenovación de las células indiferenciadas, que, junto con otros eventos oncogénicos, conduce a la malignización de las células. Dentro de un proceso de diferenciación celular fisiológico, es importante el control de diferentes fenómenos celulares, como el control del ciclo y división celular, la adaptación del metabolismo celular, la regulación de la síntesis de proteínas específicas, o el cambio de forma celular a través del control de la disposición del citoesqueleto. El control del citoesqueleto celular es un proceso celular de relevancia tanto a la hora del mantenimiento del estado indiferenciado en poblaciones de células progenitoras como durante el proceso de diferenciación hacia la célula de destino o procesos relacionados con la migración celular. De hecho, el estudio de la forma celular es una herramienta útil a la hora de estudiar la biología de los diferentes tipos celulares y tejidos. Las células madre poseen una morfología fibroblástica, y es necesaria la reorganización del citoesqueleto de actina y tubulina para su diferenciación hacia otros tipos celulares, pero también para la activación de los procesos de migración e invasión celular. En células con capacidad migratoria, como es el caso de las células madres cancerosas, el citoesqueleto es un elemento dinámico cuya acción se encuentra regulada por la familia de las Rho GTPasas y otras quinasas (Clay & Halloran, 2013). La desregulación de estas vías de señalización podría intervenir como desencadenantes del mantenimiento de este tipo de poblaciones en los tumores. Por ejemplo, la activación del eje Rho-ROCK es relevante para el mantenimiento del fenotipo migratorio y el aumento de la motilidad celular, y su alteración se ha descrito en algunos tipos de tumores, como en Neuroblastomas de alto riesgo (Dyberg et al., 2017). Además, de forma más
Introducción 48 concreta, el ensamblaje estable de filamentos de actina y microtúbulos es esencial para una correcta diferenciación a lo largo del linaje neuronal, mientras que en las células indiferenciadas estas estructuras son inestables, con el fin de mantener su capacidad plástica (Govek, Newey, & Van Aelst, 2005; Kapitein & Hoogenraad, 2015). De hecho, en los últimos años se han llevado a cabo estudios genómicos masivos, en colecciones de tumores de NB, en los que se ha descrito que una de las vías de señalización más mutada en neuroblastomas agresivos es la de las proteínas de la familia de los reguladores de las Rho GTPasas, que se encuentra íntimamente relacionada con el control del citoesqueleto celular, y en concreto, con procesos de diferenciación neuronal, como el establecimiento de las neuritas o neuritogénesis. A pesar de la alta tasa de mutaciones y modificaciones de expresión de esta familia de proteínas, descrita en NB, su papel en este tipo de cáncer es aún desconocido (Gröbner et al., 2018; Molenaar et al., 2012), por lo que su estudio es el objetivo principal de este trabajo de tesis doctoral. A continuación, se introducirán los aspectos generales más importantes de esta familia de proteínas. 3. Rho GTPasas Las Rho GTPasas son un grupo de proteínas dentro de la superfamilia Ras o de guanosin trifosfatasas pequeñas (del inglés small guanosine triphosphatases, GTPases), donde también se incluyen las subfamilias Ras, Rab, Arf y Ran. La superfamilia Ras comprende en torno a 150 miembros que comparten mecanismo bioquímico y funcionan como interruptores moleculares (Wennerberg et al., 2005). La principal diferencia entre la familia de las Rho y los otros subtipos dentro de la familia Ras es la presencia de un dominio Rho específico. Las Rho GTPasas se encuentran muy conservadas entre eucariotas inferiores, plantas y animales. En mamíferos, la familia de las Rho GTPasas está formada por 20 proteínas, divididas en 8 subfamilias, agrupadas según su estructura: Rho-like (RhoA, RhoB, RhoC), Cdc42-like (Cdc42, RhoJ/TCL, RhoQ/TC10), Rac-like (Rac1, Rac2, Rac3 y RhoG), subfamilia RhoD y RhoF, subfamilia RhoH, Rnd-like (Rnd1, Rnd2, Rnd3/RhoE), subfamilia RhoU (Wrch1) y RhoV (Wrch2/Chp), y por último subfamilia RhoBTB (Figura 5) (Boureux et al., 2007).
Introducción 49 Figura 5. Árbol filogenético de la familia de las Rho GTPasas. Tomado de Lawson, 2018. Conexión filogenética entre los 20 miembros de la familia de las Rho GTPasas humanas teniendo en cuenta su estructura. Existen 8 subfamilias Rho-like, Cdc42-like, RhoD y RhoF, RhoH, Rac-like, RhoU y RhoV, Rnd-like y RhoBTB-like. Las Rho GTPasas son proteínas monoméricas de alrededor de 20 kDa. Su estructura comprende un dominio central denominado G (dominio de unión a GTP o GDP) compuesto por secuencias muy conservadas y que constituye un sello de la familia de las Rho GTPasas y de otras familias dentro de la superfamilia Ras. En este dominio se encuentra una zona de unión de nucleótidos de guanina. Junto al dominio G se ha caracterizado un dominio de inserción Rho y un terminal carboxilo (C- terminal) hipervariable o caja CAAX, responsable del anclaje de estas proteínas a la membrana celular (Figura 6) (Schaefer et al., 2014).
Introducción 50 Figura 6. Organización de la familia de las Rho GTPasas según sus dominios. Modificado de Vega et al. 2008. RhoA, RhoB, RhoC, RhoD, RhoF, Rac1, Rac2, Rac3, RhoG, Cdc42, RhoQ/TC10 y RhoJ/TCL tienen una estructura similar. Rnd1, Rnd2, Rnd3 y RhoH comparten estructura semejante y carecen de dominios de unión a GTP/GDP. RhoU y RhoV se caracterizan porque poseen una región rica en prolina en la zona nterminal. Las proteínas RhoBTB poseen la estructura más diferente dentro de la familia de las Rho GTPasas. Se caracterizan por la presencia de dos dominios BTB y NLS (secuencia de localización nuclear). Estas proteínas son moléculas señalizadoras que actúan como interruptores moleculares. La mayoría de las Rho GTPasas alternan su estado conformacional entre una forma unida a GTP (forma activa) y una forma unida a GDP (forma inactiva). La forma unida a GTP reconoce los dominios de proteínas efectoras y las activa, controlando así la activación de multitud de vías de señalización. Dentro de una misma subfamilia, la similitud entre sus estructuras conlleva que las GTPasas puedan realizar funciones semejantes en distintos tejidos o incluso tener un papel compensatorio en el caso de que se dé la alteración de una de sus proteínas homólogas (Curtis, 2019; Pommereit & Wouters, 2007). La actividad de las GTPasas se encuentra muy controlada por un gran número de proteínas reguladoras (Etienne-Manneville & Hall, 2002), aunque también por otros procesos celulares, como veremos a continuación.
Introducción 51 3.1. Regulación de la acción de las Rho GTPasas Cerca del 1% del genoma codifica para proteínas que regulan o que son reguladas por la familia de las Rho GTPasas. Entre estas proteínas podemos encontrar las proteínas RhoGEF (Factor de intercambio de nucleótidos de guanina de Rho, del inglés Rho nucleotide Guanine Exchange Factor). Estas proteínas estimulan la liberación de GDP y forman un complejo con las Rho GTPasas clásicas. Debido a que la concentración de GTP intracelular es mayor que la de GDP, se da una unión de GTP y la activación de la GTPasa. Por otro lado, existen las proteínas RhoGAP (Proteínas activadoras de Rho GTPasas, del inglés Rho GTPases activating protein), que catalizan la hidrólisis de GTP a GDP y provocan la inactivación de la GTPasa. Finalmente, las Rho GTPasas se unen a chaperonas llamadas RhoGDI (inhibidores de la disociación de nucleótidos de guanina, del inglés Guanine nucleotide Dissociation Inhibitor). Estas últimas proteínas no poseen actividad catalítica y mantienen a las Rho GTPasas en su forma inactiva (Cherfils & Zeghouf, 2013; Garcia-Mata et al., 2011), (Figura 7). Figura 7. Ciclo básico de activación de las Rho GTPasas. Las Rho GTPasas son moléculas señalizadoras que actúan como interruptores moleculares, alternando entre una forma GTP-activa a una forma GDP- inactiva. Estos pasos son catalizados por proteínas reguladoras. Las proteínas GEFs (Guanine Exchange Factor) facilita la unión a GTP y la consecuente activación de la GTPasa. Las proteínas GAPs (Rho GTPases Activating Protein) catalizan la hidrólisis del GTP y la RhoGTP RhoGDP Effector GEF GAP GTP GDP Pi Vav ARHGEF Trio … ROCK ARHGAP IQGAP GDI Membrana celular Citoplasma Membrana celular Citoplasma
Introducción 52 inactivación de la proteína. Las proteínas GDI (Guanine nucleotide Dissociation Inhibitor) se unen a las GTPasas y las mantienen en su conformación inactiva. La conformación unida a GTP es responsable de la activación de diferentes efectores (effector) aguas abajo. En la figura se señalan solo algunos ejemplos de reguladores y efectores. No todas las Rho GTPasas regulan su actividad GTPasa a través de otros reguladores. Las subfamilias de Rho GTPasas Rnd, RhoH y RhoBTB carecen de dominio de hidrólisis de GTP, por lo que siempre se encuentran en estado activo. Estas familias se consideran como Rho GTPasas atípicas. Adicionalmente, las proteínas RhoU/Wrch1 y RhoV poseen unas sustituciones de aminoácidos de prolina en el dominio de hidrólisis de GTP, lo que provoca que este proceso sea muy rápido, por lo que se les considera constitutivamente activas (Aspenström et al., 2007; Faure & Fort, 2015). A pesar de las excepciones mencionadas, existen alrededor de 145 proteínas GAPs y GEFs que regulan la actividad de las Rho GTPasas clásicas, lo que demuestra la relevancia biológica de la regulación de esta familia de proteínas (Müller et al., 2020; Pertz, 2010). El hecho de la existencia de tal número de reguladores para un grupo reducido de proteínas, ha sido clásicamente objeto de debate. Estos reguladores se expresan de forma diferencial en tejidos, pero también a nivel intracelular y temporal, lo que demuestra lo complejo de su funcionamiento y su versatilidad como proteínas. A continuación, se introducirán las características más importantes de cada uno de estos grupos de reguladores y efectores. 3.1.1. GEFs Se han descrito cerca de 70 GEFs diferentes en mamíferos. El sitio de unión de las RhoGEFs solapa con los sitios de unión de las GAPs, GDIs y algunos efectores. Los dominios proteicos mejor descritos de los reguladores tipo GEF son los DH (dominio homólogo Dbl), junto con un dominio PH (dominio homólogo Pleckstrin), y los dominios DOCK (del inglés dedicator of cytokinesis) (Mosaddeghzadeh & Ahmadian, 2021). La mayoría de estas GEFs presentan especificidad limitada por lo que es necesaria la regulación espaciotemporal para facilitar una regulación específica de las GTPasas. Por ejemplo, se ha descrito que las GEFs tipo Vav, de dominio Dbl, muestran especificidad por las proteínas RhoA, Rac1 y Cdc42, aunque la unión a estas depende de la estructura de otros dominios dentro de la GEF (Snyder et al.,
Introducción 53 2002). Por otro lado, las GEF tipo DOCK tienen mayor afinidad para su unión con las GTPasas Rac1 y Cdc42 (Côté & Vuori, 2002). 3.1.2. GAPs En mamíferos, existen en torno a 80 GAPs diferentes, aunque se han descrito pocas que muestren especificidad completa por un tipo de GTPasa concreta. Por ejemplo, la GAP ARHGAP10 actúa inhibiendo la acción de RhoA en células PC3 de cáncer de próstata, mientras que tiene un efecto inhibitorio de la proteína Cdc42 en células HeLa (Dubois et al., 2005; Lazarini et al., 2013). Estudios estructurales han determinado que las RhoGAPs interaccionan con las GTPasas a través de un bucle localizado entre las regiones switch I y switch II (Dvorsky & Ahmadian, 2004). Las RhoGAPs poseen mecanismos adicionales de regulación que facilitan un control específico de su función en la célula, como la autoinhibición o la modificación postraduccional mediante fosforilación, además del control de su localización celular (Eberth et al., 2009; Minoshima et al., 2003). Algunas GAPs y GEFs realizan su función formando complejos multiproteicos, regulando la actividad de dos GTPasas diferentes de forma simultánea (Lawson & Ridley, 2018). 3.1.3. GDIs Al contrario que para las GAPs y GEFs, solo se han descrito 3 tipos de GDIs involucradas en la regulación de la actividad de las Rho GTPasas. Estas proteínas constan de dos dominios: el N-terminal que interacciona con los dominios switch I y II de las GTPasas, y el C-terminal que es importante para el secuestro de las GTPasas en la membrana celular. Esta familia incluye la GDI1 (RHOGDI ), que se expresa de forma ubicua, la GDI2 (RHOGDI ) de tejido hematopoyético, y GDI3 (o RHOGDI ), típica de cerebro humano y pulmón. El mecanismo de inhibición mediante estas proteínas se basa en la liberación de la Rho GTPasa de la membrana celular, la consecuente formación de un complejo RHO-GDI, y la liberación de la GTPasa a un compartimento subcelular (de León-Bautista et al., 2016; Garcia-Mata et al., 2011). 3.1.4. Efectores Las Rho GTPasas controlan múltiples vías de señalización a través del reconocimiento de diferentes efectores. Hasta la fecha se han identificado más de 70 efectores que interaccionan con la conformación activa de las GTPasas RhoA, Rac1 y Cdc42 (Bustelo et al., 2007). Las proteínas efectoras son quinasas o proteínas
Introducción 54 estructurales (scaffolding). Las quinasas más conocidas son las ROCK (del inglés, Rho associated coiled-coil kinase) o PAK (del inglés, p21 associated kinase). Las proteínas scaffolding que actúan como efectores de las GTPasas ejercen su función a través de la modificación de la dinámica de los filamentos de actina. Las más descritas son las IQGAP, con un dominio GAP asociado, (del inglés IQ motifcontaining GTP-ase activating protein) o las WASP (Wiskott-Aldrich syndrome protein) (Hedman et al., 2015; Zhao & Manser, 2005). 3.1.5. Localización subcelular Para llevar a cabo su función, las Rho GTPasas no solo necesitan activarse mediante el intercambio de GDP/GTP, sino que algunas necesitan anclarse a la membrana lipídica celular o a los orgánulos celulares. Esto ocurre a través de la modificación postraduccional de su dominio C terminal hipervariable o caja CAAX. A este extremo de la proteína, en un residuo cisteína presente, se ancla un grupo geranil-geranilo, o en menor frecuencia farnesilo, en un proceso catalizado por enzimas geranil-geranilo o farnesil transferasas. Después de esta modificación, la GTPasa viaja hasta el retículo endoplasmático, donde se da un corte proteolítico de la cola -AAX de la caja por la enzima Rce. El grupo carboxilo queda expuesto y se esterifica por una metiltransferasa (Bustelo et al., 2007). Algunas GTPasas sufren modificaciones postraduccionales adicionales, como es el ejemplo de RhoB, a la que se le añaden grupos palmitato. La modificación lipídica del motivo hipervariable CAAX es necesaria para que se dé el anclaje a la membrana. De hecho, la modificación postraduccional define el destino subcelular de la Rho GTPasa en casos como el de RhoB, que se une a endomembranas cuando se le han añadido grupos geranilo y a la membrana plasmática preferentemente cuando la modificación es a través de la adición de un grupo farnesilo (Vega & Ridley, 2018). Existen otros tipos de regulación postraduccional que controlan sobre todo la actividad de las GTPasas atípicas, por medio de fosforilación y ubiquitinación, entre otros procesos (Hodge & Ridley, 2016). Análisis sistemáticos del interactoma de las Rho GTPasas con sus reguladores han permitido determinar que una de las claves de la regulación específica de las GTPasas en una misma célula depende de la expresión diferencial del regulador en los diferentes orgánulos celulares (Müller et al., 2020). En concreto, se ha descrito cómo la distribución de GAPs y GEFs de la GTPasa Rac1, se encuentra segregada junto a las integrinas de células HEK293T, para el correcto control de la GTPasa en respuesta a diferentes señales mecánicas. Además, estos estudios han confirmado la naturaleza más específica de las GEFs con las Rho GTPasas, mientras que se ha
Introducción 55 reiterado la redundancia en cuanto a la especificidad de las GAPs, menos específicas y más abundantes a nivel celular (Bagci et al., 2020). Uno de los objetivos de la bioquímica actual es la caracterización del interactoma de las Rho GTPasas y sus reguladores mediante diferentes aproximaciones en diferentes tipos celulares. Existen algunos estudios en los que se dan contradicciones en cuanto a las interacciones descritas y a la localización de los distintos elementos, por lo que la descripción de la señalización de esta familia de proteínas tan extensa sigue siendo un campo principal de estudio (Bagci et al., 2020). Dentro de la regulación de la actividad de esta familia de proteínas, no solo es relevante la intervención del ciclo GTP/GDP, si no que existen otros factores que pueden ser relevantes en el control de su acción, como por ejemplo la regulación transcripcional. Este tipo de regulación se encuentra menos estudiada en esta familia de proteínas y se tratará de forma detallada en el siguiente apartado. 3.1.6. Regulación transcripcional Como se ha descrito, la mayoría de las Rho GTPasas regulan su actividad en base a su interacción con diferentes reguladores (GAPs, GEFs, GDIs) y efectores (ROCK, PAK…). Sin embargo, tambin existe una regulacin de la expresin de estas proteínas a nivel transcripcional, que tiene efectos en su actividad celular, siendo esta menos estudiada. Las Rho GTPasas pueden ser activadas a través de diferentes receptores celulares como son las integrinas, caderinas, receptores de citoquinas, receptores tirosinquinasa y proteínas tipo G. La subfamilia más estudiada en este aspecto es la de Rho. La actividad de RhoA puede ser controlada positivamente por el factor MYC. Por otro lado, la expresión de RhoB es regulada por la vía de señalización del TGF- y SMAD, y por vías de respuesta al daño celular, mientras que RhoC y Rnd3/RhoE parecen estar reguladas en respuesta a estrés celular y activación del gen supresor de tumores p53. Los factores de transcripción Sox controlan la expresión de la familia de Rho GTPasas RhoU y RhoV en células de la cresta neural (Faure & Fort, 2011). Los procesos celulares que regulan estas GTPasas dependerán del contexto celular. Por ejemplo, si la proteína RhoB es activada por la vía del TGF-, se desencadenan procesos de migración celular, mientras que si esta activación es debida a un daño
Introducción 56 celular, puede llevar a la activación de la apoptosis en la célula (Croft & Olson, 2011; Vasilaki et al., 2010). También se ha descrito el papel de los miRNA y lncRNAs (del inglés long non coding RNA) en la regulación de la expresión de esta familia de proteínas. Como ejemplos, los miR-21, miR-31 y miR-138 regulan negativamente la expresión de la subfamilia RhoA, RhoB y RhoC. Por otro lado, el miR-151 inhibe la expresión de RhoGDI que resulta en un aumento basal de la expresión de RhoA, Rac1 y Cdc42 (M. Liu et al., 2012). Además, la expresión de los reguladores de las GTPasas GAPs, GEFs y GDIs se encuentra estrechamente regulada por la expresión de diferentes miRNAs (Humphries et al., 2020). En conjunto con la regulación transcripcional a través de miRNAs aparecen los lncRNA LINC00974 regulando la expresión de RhoA a través de miR-122, o el H19 que tiene como diana la regulación de la expresión del eje Cdc42/PAK1 a través del miR-15b (Ghafouri-Fard et al., 2021). Adicionalmente, también se ha descrito el papel de algunas proteínas involucradas en la remodelación de la cromatina, relacionadas con el control de la expresión de este grupo de proteínas, como son la desmetilasa de histonas KDM2D y la metiltransferasa de histonas EZH2 (Zacharopoulou et al., 2018). Como se ha mencionado, la regulación de la familia de las Rho GTPasas se encuentra especialmente controlada. Este control tan preciso tiene mucho sentido fisiológico, ya que la señalización controlada por esta familia de proteínas regula numerosos procesos celulares vitales, principalmente a través del control del citoesqueleto celular. A continuación, repasaremos las bases de esa importancia fisiológica que posee esta familia de proteínas que son las Rho GTPasas. 3.2. Función fisiológica El citoesqueleto confiere la forma celular, estructura, o polaridad celular, y sufre de una constante remodelación para ello. La formación de los lamelipodios, los filopodios, las fibras de estrés y las uniones focales constituyen las principales estructuras controladas por el citoesqueleto, que a su vez es regulado principalmente por la acción de la familia de las Rho GTPasas. La activación de esta familia de proteínas, junto a otros efectores, conlleva la iniciación de vías de señalización aguas abajo que controlan procesos como la división celular, la proliferación, la expresión génica, la regulación transcripcional, la organización de la actina y los microtúbulos,
Introducción 63 de la expresión de la familia de las srGAP, más específicas de las GTPasas Rac y Cdc42, se ha relacionado con el desarrollo de diferentes desórdenes mentales infantiles, como la epilepsia y el retraso mental severo. El gen que codifica para ARHGEF10, activadora de RhoA, se ha asociado al desarrollo de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, una patología hereditaria mixta que contempla algunos tipos de neuropatías sensoriales y motoras. Todos estos casos confirman la importancia de la función de esta familia en el correcto establecimiento del tejido neuronal, y las consecuencias patológicas de la alteración de la misma. La alteración de esta familia de proteínas no solo es relevante en patologías neurológicas, sino que existe un extenso campo de investigación centrado en el análisis de las consecuencias de la alteración de la familia de las Rho GTPasas y su regulación en el inicio y desarrollo de diferentes tipos de tumores, tema que se expone de forma detallada a continuación. 3.4. Rho GTPasas y cáncer Como ya se ha referido, las Rho GTPasas son una familia de proteínas vital para el correcto funcionamiento de muchos procesos celulares: migración, diferenciación, proliferación, etc. Estos procesos son necesarios para el mantenimiento del tejido sano, pero por ello también están involucradas en procesos celulares asociados al inicio y progresión de diferentes tipos de tumores (Mosaddeghzadeh & Ahmadian, 2021). Hasta hace poco se creía que no existía una gran prevalencia de mutaciones en Rho GTPasas relacionadas con el inicio y progresión del cáncer. Sin embargo, recientemente se han descrito mutaciones relacionadas con el desarrollo de cáncer, como es la mutación de la prolina 29 de Rac1 (mutación activadora) en melanoma o cáncer de cabeza y cuello, o de RhoH en algunas neoplasias hematopoyéticas. A pesar de esto, son más comunes las alteraciones en la familia de los reguladores de Rho (GAPs y GEFs), relacionadas con eventos oncogénicos, que provocan alteraciones en la expresión y actividad de las Rho GTPasas (Porter et al., 2016). Clásicamente, se ha descrito que muchas de las GTPasas alteradas en diferentes tipos de tumores se encuentran sobreexpresadas. Sin embargo, se discuten algunos papeles contradictorios de esta familia en la progresión de algunos tumores. Un ejemplo de esto es la proteína RhoB: ratones knock-out para la expresión de RhoB tienen más probabilidades de desarrollo de cáncer de piel inducido por daño, mientras que la inhibición de esta misma proteína en células de glioma las conduce
Introducción 64 al arresto del ciclo celular, apoptosis y reducción de la tumorigénesis (Vega & Ridley, 2018). Esto abre un debate sobre los posibles papeles de las GTPasas dependiendo del tejido celular y de la etapa de desarrollo del tumor (Svensmark & Brakebusch, 2019; Zandvakili et al., 2016). RhoA está involucrada en diferentes etapas de la progresión de un tumor. En tumores humanos, se encuentra sobreexpresada, y su inhibición lleva a la disminución de la proliferación celular. Además, contribuye a la activación de la angiogénesis a través de la vía del VEGF. Se relaciona con la regulación de la señalización de Rho/ROCK mediante lncRNAs en procesos relacionados con metástasis (Tang et al., 2018). La sobreexpresión de RhoA suele estar relacionada con la activación de la migración celular a través de blebs, en diferentes tipos de tumores. El papel de RhoC parece estar más relacionado con la progresión del tumor y su capacidad metastásica. (Islam et al., 2009; Vega et al., 2011; Siyuan Zhang et al., 2009). La subfamilia Rho (RhoA, RhoB y RhoC) comparte una gran homología en sus estructuras, por lo que se considera que las diferentes funciones en las que se ven involucradas de forma diferencial, dependen de otros factores, como procesos de modificación postraduccional (Ridley, 2013) La señalización relacionada con Rac1 parece también estar involucrada en diferentes estadios de la progresión tumoral, sobre todo la sobreexpresión de una variante de splicing denominada Rac1b, que parece estar relacionada con la inducción de la transición epitelio-mesénquima (EMT), daño al DNA e inestabilidad genómica (Radisky et al., 2005). La subfamilia Rnd también parece tener un papel contradictorio en el desarrollo de diferentes tumores. Por un lado, está relacionada con un correcto proceso de diferenciación en algunos tipos celulares, aunque por otro lado, también se ha descrito que puede estar involucrada con un aumento de la quimioresistencia en cáncer de tipo gástrico (Basbous et al., 2020; K. Li et al., 2009). Por otro lado, las proteínas RhoBTB se consideran supresoras de tumores. En concreto RhoBTB2, se encuentra delecionada en algunos tumores de mama, y RhoBTB1 en algunos tumores de cabeza y cuello. De hecho, se ha descrito que BTB1 interacciona con ROCK, inhibiéndola, y esto provoca una inhibición de los procesos de invasión. RhoBTB2 es gen diana del factor de transcripción E2F1, que se encuentra involucrado en el control del ciclo celular y la apoptosis (Beder et al., 2006; Freeman et al., 2008; Haga et al., 2019)
Introducción 65 Otro ejemplo de GTPasa que parece tener un papel contradictorio según el tejido en estudio es Cdc42. Mientras que se ha descrito que se encuentra más expresada en algunos tipos de tumores como pulmón, adenocarcinoma, melanoma y cáncer de mama, por otro lado, se ha observado que su inhibición favorece el desarrollo tumoral en cáncer de hígado. Además, también se ha descrito que su menor expresión se encuentra relacionada con la progresión del feocromocitoma, un tumor de células adrenales (Croisé et al., 2016; Stengel & Zheng, 2011). Sus homólogos RhoJ y RhoQ se han descrito como más involucrados en procesos de angiogénesis en tumores, y en metástasis (Bridges et al., 2020; B. Chen et al., 2020) Adicionalmente, la alteración de algunas modificaciones postraduccionales en GTPasas, pueden llevar a la activación o inhibición de estas. Estos procesos podrían estar involucrados en tumorigénesis. Por ejemplo, el aumento de la degradación por ubiquitinación de la proteína Rac3 en células epiteliales altera el proceso de transición epitelio-mesénquima, teniendo un papel en la progresión del cáncer de esófago (Dong et al., 2014). En cuanto al papel de los reguladores de la familia de las Rho GTPasas en procesos tumorales, se ha descrito de forma general que un aumento de la expresión de GEFs y una disminución de expresión de GAPs y GDIs están relacionados con la activación de procesos de tumorigénesis. Sin embargo, se cree que esta consideración es demasiado general y que puede variar también dependiendo del tejido objeto de estudio y de la etapa de progresión tumoral. Existe una gran cantidad de GEFs cuya expresión se encuentra activada en diferentes tipos de tumores, como son las GEFs Tiam1, Vav1-3 o Ect2, activadora de RhoA (Porter et al., 2016). De hecho, se han desarrollado algunos agentes terapéuticos que tienen como diana estas proteínas, aunque no de forma exitosa, debido a que se componen de diferentes dominios y el diseño de agentes terapéuticos contra ellas es, por lo tanto, complicado. Normalmente la alteración de la actividad de estas GEFs se ve controlada por la activación de algunas vías de señalización activadas por receptores acoplados a proteínas G (GPCR) o receptores tirosín-quinasa (RTK) (Vigil et al., 2010). Por otro lado, el modelo por excelencia de GAP como supresora de tumores lo encontramos en la GAP DLC1 (ARHGAP7), que se encuentra delecionada en hepatocarcinoma, y tiene como principal diana la subfamilia Rho, aunque no Rac1 (Popescu, 1992). También encontramos a CdGAP o ARHGAP31, inhibidora de Cdc42 y Rac1, cuya activación se encuentra relacionada con procesos de transición epitelio-mesénquima en cáncer de próstata (Mehra et al., 2021). Hasta ahora, no se han descrito muchas
Introducción 66 más GAPs relacionadas con eventos tumorales, es más bien la sobreexpresión de las GEFs el proceso más común relacionado con el desarrollo de tumores. Esto puede deberse a la mayor redundancia estructural que se encuentra en las proteínas tipo GAP, por lo que la alteración de alguna de ellas se subsana por un efecto compensatorio de otra GAP con estructura similar. La función de los GDIs en el inicio y progresión de tumores también resulta controvertida. Su expresión se encuentra alterada en diferentes direcciones en distintos tipos de tumores humanos. Por ejemplo, RhoGDI parece estar alterado en carcinoma hepatocelular, y esto provoca una activación de RhoA, que activa procesos de migración y proliferación celular. Sin embargo, ese mismo GDI se encuentra menos expresado en cáncer de pulmón, y correlaciona de forma negativa con el grado de malignidad. Parece que la alteración de estos reguladores afecta a la señalización mediada por Rho GTPasas, en la que también influyen otros factores como el microambiente tumoral y el tipo celular, aunque aún no se ha definido completamente su función en procesos relacionados con la tumorigénesis (Cho et al., 2019; H. Wang et al., 2014) En neuroblastoma, a pesar de la relevancia de esta familia de proteínas, no se ha estudiado detalladamente qué papel podrían jugar en el inicio, progresión, y agresividad del tumor. Como ya se ha mencionado, sí existen algunos estudios que describen que los genes reguladores de las GTPasas son uno de los grupos más mutados en NB agresivos, de forma relativa, ya que la aparición de mutaciones en este tipo de tumores es en general poco frecuente. De hecho, se ha trabajado en algunas vías de señalización relacionadas con Rho, como el papel de la proteína ROCK2 en NB o el papel supresor de tumores de la GAP CHL1, aunque son, a pesar de las evidencias, de los pocos estudios que se refieren a esta familia de proteínas en esta patología (Dyberg et al., 2017; Ognibene et al., 2018; Ognibene & Pezzolo, 2020). Es por ello, que el objetivo principal de esta tesis doctoral se centra en el estudio y comprensión de la señalización de la familia de las Rho GTPasas y sus reguladores y su posible relación con la agresividad en este tipo de tumores.
Objetivos
Objetivos 69 1. Estudiar la expresión de la familia de las Rho GTPasas en pacientes de neuroblastoma en relación con diferentes parámetros clínicos. 2. Analizar la expresión de los reguladores GEFs, GAPs y GDIs, y efectores principales de las Rho GTPasas, en pacientes de neuroblastoma en relación con diferentes parámetros clínicos. 3. Estudiar la posible alteración de la familia de las Rho GTPasas, sus reguladores y efectores y su relación con la malignidad y la supervivencia de los pacientes de neuroblastoma. 4. Estudiar el papel de la Rho GTPasa Cdc42 en proliferación y diferenciación celular en neuroblastoma. 5. Examinar la expresión de las Rho GTPasas y sus reguladores más relevantes en la población celular progenitora en neuroblastoma. 6. Estudiar el papel de la Rho GTPasa Cdc42 en la población celular progenitora en neuroblastoma.
Materiales y Métodos
Materiales y Métodos 79 1.7. Análisis de ontología de genes y enriquecimiento funcional de vías de señalización. Análisis de interacción proteica. Las agrupaciones y módulos de genes de la familia de las Rho GTPasas y sus reguladores obtenidos del análisis de correlación génica, WGCNA y análisis multivariable, se analizaron con el uso de las plataformas Reactome Pathway Database (https://reactome.org/) y Gene Ontology (http://geneontology.org/). De este modo, se obtuvieron diferentes listas de vías de señalización en la que estos grupos de genes podrían estar involucrados de forma significativa. Los resultados de los diferentes análisis de enriquecimiento se representaron mediante gráficos generados mediante el uso de RStudio, el paquete ggplot2 y el código indicado a continuación. Para simplificar la representación del análisis, se eliminaron del mismo las vías de señalización resultantes redundantes entre sí. En este tipo de representación gráfica, el área de los círculos aumenta en relación al número de genes que se encuentran representados en las diferentes vías de señalización. El fold enrichment o enriquecimiento señala qué nivel de representación tienen estas proteínas o genes en la vía de señalización comparada. El color de los mismos varía en función del valor FDR, en una escala de rojo a verde desde -log10 de 30 hasta 0. library(ggplot2) GO_all<-read.table(".txt",sep="\t", quote="",check.names = FALSE ,header=TRUE,row.names=1) ls.str(GO_all) GO_all$Gene_number <- as.numeric(GO_all$Gene_number) GO_all$GO_biological_process <- chartr("_", " ", GO_all$GO_biological_process) GO_all$'|log10(FDR)|' <- -(log10(GO_all$FDR)) ggplot(GO_all, aes(x = GO_biological_process, y = Fold_enrichment)) + geom_hline(yintercept = 1, linetype="dashed", color = "azure4", size=.5)+ geom_point(data=GO_all,aes(x=GO_biological_process, y=Fold_enrichment,size = Gene_number, colour = `|log10(FDR)|`), alpha=.7)+ scale_x_discrete(limits= GO_all$GO_biological_process)+ scale_color_gradient(low="green",high="red",limits=c(0, NA))+ coord_flip()+ theme_bw()+ theme(axis.ticks.length=unit(-0.1, "cm"), axis.text.x = element_text(margin=margin(5,5,0,5,"pt")), axis.text.y = element_text(margin=margin(5,5,5,5,"pt")),
Materiales y Métodos 80 axis.text = element_text(color = "black"), panel.grid.minor = element_blank(), legend.title.align=0.5)+ xlab("GO biological processes")+ ylab("Fold enrichment")+ labs(color="-log10(FDR)", size="Gene_number") Para realizar el estudio de probabilidad de interacción proteica y funcionalidad de los diferentes grupos y módulos de genes de la familia de las Rho GTPasas y sus reguladores obtenidos mediante el análisis multivariable, se utilizó la plataforma STRING (https://string-db.org/). De esta forma, se obtuvo una predicción de las interacciones proteicas de los diferentes genes contenidos en estos grupos, en forma de nodos interconectados. Se representaron en modo de tabla y en gráficos, en los que el color de los nodos o círculos indica la vía de señalización en la que participa la proteína o gen y los colores de las líneas conectoras o edges el tipo de interacción que se ha descrito (experimental, bibliogrfica, de similitud…). 2. Generación de bacterias competentes. Transformación y selección bacteriana Para la generación de bacterias competentes químicamente en el laboratorio se inocularon cultivos de bacterias en LB (Luria Broth Media, Condalab) hasta la saturación. Se diluyó el cultivo en 50ml de LB fresco en proporción 1:100, y se creció hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm (OD600) equivalente a 0.2-0.5. Se resuspendieron y vortearon las células ligeramente en medio TSS frio (5g PEG 8000, 1.5 ml 1M MgCl2, 2.5 ml DMSO en 50 ml de LB) y se congelaron en alícuotas a - 80ºC para sus posteriores usos. También se utilizaron las cepas comerciales ya competentes de E. coli: BL21 (DE3) y DH5 (Sigma, Thermo-Fisher, Tabla 6). Tabla 6. Bacterias competentes y sus características Estirpe Características Casa comercial Nº Catálogo BL21(DE3) Las bacterias portan una copia del cromosoma de la polimerasa T7 bajo el control del promotor lacuv5. Utilizan IPTG como inductor de la expresión. Para la expresión de altas cantidades de proteína Sigma 69450-3
Materiales y Métodos 81 DH5alfa Subclonación rutinaria de plásmidos. Posee el marcador genético lacZΔM15 para la detección azul/blanca de colonias en placas que contienen X-gal o Bluo-gal. También el casete recA1 que asegura una mayor estabilidad de los insertos y evita una recombinación no deseada y endA1 que mejora la producción y la calidad del ADN plasmídico preparado a partir de minipreparaciones ThermoFisher 18265017 Con el objetivo de transformar bacterias competentes con diferentes vectores de expresión (Tabla 7) se descongelaron las bacterias competentes en hielo durante 5 minutos. A 50 l de estas bacterias se les añadió de 10 ng a 1 g de ADN plasmídico y se mezcló bien pero delicadamente con la ayuda de una pipeta. Se incubó la mezcla de ADN y bacterias durante 30 minutos en hielo. Se permeabilizaron las bacterias durante 1 minuto mediante un golpe de calor a 42ºC en un baño. Posteriormente, se reincubaron los tubos en hielo durante 2 minutos. Se les añadió hasta 1 ml de medio de recuperación (Thermo-Fisher) o medio LB, y se sembraron 100 l en placas de Petri previamente atemperadas, que contenían el antibiótico para selección adecuado (Ej.: Ampicilina (Sigma) a 100 g/ml de cultivo). Se centrifugó el resto, se resuspendió en otros 100 l de LB fresco y se sembró en otra placa de Petri con el antibiótico de selección. Se cultivó durante toda la noche en un incubador a 37ºC. Al día siguiente, se picaron colonias independientes y cada una se sembró por separado en un tubo de cultivo con 2-3 ml de medio y el antibiótico de selección. Una vez crecido, se congeló parte del cultivo en stocks de glicerol estéril al 20% (Sigma) a - 80ºC, y se amplificó otra parte con el fin de extraer el ADN plasmídico. Tabla 7. Plásmidos y sus características Secuencia Plásmido Nº copias Bacteria transformada Antibiótico Resistencia en células eucariotas GST-RBD Addgene 15247 Copia alta BL21 y DH5alfa Ampicilina pGEXTK-Pak1 70-117 Addgene 12217 Copia alta BL21 y DH5alfa Ampicilina pcDNA3-EGFP- Cdc42-wt Addgene 12975 Copia alta DH5alfa Ampicilina Geneticina Para la extracción del ADN plasmídico se añadieron entre 1 y 2 ml del cultivo bacteriano a un matraz Erlenmeyer con 200 a 400 ml de LB fresco, teniendo en cuenta si el plásmido era de copia alta o copia baja, respectivamente, con la
Materiales y Métodos 82 concentración adecuada de antibiótico para la selección de las bacterias transformadas, generalmente ampicilina a 100 g/ml. Se cultivó durante toda la noche. Al día siguiente, se centrifugó el cultivo a 4000 r.p.m. en frío para concentrar las bacterias. El pellet formado se almacenó a -80ºC después de haber sido congelado en N2 líquido, o se dio paso directamente a la extracción de DNA por Maxiprep, llevada a cabo con los kits GenElute HP Plasmid Maxiprep o Pure Link HiPure Filter Maxi prep (Sigma e Invitrogen respectivamente), siguiendo en ambos casos las instrucciones del fabricante. El ADN resultante se cuantificó midiendo en espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) y se almacenó a -20ºC. 3. Líneas celulares de neuroblastoma Se utilizaron las líneas celulares de NB humanas IMR-32, SK-N-SH, CHLA 20, CHLA 255, GI-ME-N y GI-CA-N. La línea celular IMR-32 es la única de estas que posee la amplificación del oncogén MYCN. Las líneas celulares GI-ME-N y GI-CA-N poseen morfología mesenquimal (MES), mientras que la morfología de las líneas IMR-32, CHLA 20 y CHLA 255 se corresponde con un fenotipo conocido como adrenérgico (ADRN) o neuroblástico, con células mayoritariamente determinadas hacia linaje simpatoadrenal, según el estudio realizado por Van Groningen et al. La línea SK-N- SH posee una morfología mixta, es decir, en cultivo se pueden observar dos morfologías, mesenquimal y neuroblástica (Tabla 8). Estas líneas se obtuvieron del repositorio The American Type Culture Collection (ATCC), excepto las células CHLA 20 y CHLA 255, que se adquirieron del COG Cell Line and Xenograft Repository (Texas Tech University Health Sciences Center). Adicionalmente se disponía de la línea CHLA 255 transformada establemente para la expresión de Luciferasa (Addgene: #26612, Luciferase-pcDNA3). Las líneas SK-N-SH, IMR-32 y GI-ME-N se cultivaron en medio DMEM + GlutaMAX (GIBCO BRL) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS, Fetal Bovine Serum) (GIBCO BRL), 100 µg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina (de aquí en adelante denominado medio completo). Para las células GI-CA-N se utilizó medio RPMI (GIBCO BRL) suplementado con 10% de FBS, 100 µg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina. En el caso de las células CHLA 20 y CHLA 255, el medio en el que se crecieron fue IMDM + GlutaMAX (GIBCO BRL) que se suplementó con 15% de suero, 100 µg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina y 1X ITS (5 µg/ml insulina, 5 µg/ml transferrina y 5 ng/ml ácido selenioso). Todas las células se mantuvieron en incubadores a 37ºC y atmósfera húmeda al 5% de CO2. Los pases
Materiales y Métodos 83 celulares se realizaron al 80-90% de confluencia mediante la utilización de 0,025% Tripsina-EDTA (GIBCO BRL) durante 3-5 minutos tras un lavado con PBS sin Ca+2 ni Mg+2 (Phosphate Buffer Saline, GIBCO BRL). Tras la tripsinización las células se recogieron y centrifugaron durante 5 minutos a 1400 r.p.m. El contaje celular se llevó a cabo usando el método Cell Counting Slides (LUNATM, Logos Biosystems), añadiendo azul tripan (GIBCO BRL) para la detección de la muerte celular. La congelación de las líneas celulares se realizó en medio completo con un 10% de DMSO (Sigma). Tabla 8. Líneas celulares y características 4. Formación de tumores subcutáneos derivados de biopsias de pacientes o Patient Derived Xenograft (PDXs) Para la generación de xenoinjertos derivados de biopsias de pacientes se utilizó la cepa de ratón inmunodeprimido C.B-17 SCID (Severe Combined Immunodeficiency) (genotipo: C.B-17/IcrHan HsdPrkdcscid), los cuales fueron suministrados por el Servicio de Producción y Experimentación Animal del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS). Se mantuvieron a temperatura constante (22 ± 1ºC), en un ciclo alternante de luz - oscuridad de 12 horas, con libre acceso al alimento y al agua en rack ventilados. Los SCID son animales inmunodeprimidos, lo que permite evitar el rechazo de células humanas inyectadas en ellos. En todos los experimentos se siguieron las normas recogidas en la guía de cuidados animales de la Unión Europea (86/609/EEC), y todos los procedimientos experimentales realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Ético para la Investigación Animal del Hospital Universitario Virgen del Rocío (HUVR). Las biopsias en fresco de pacientes de NB se recibieron del Biobanco del servicio de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Virgen del Rocío (HUVR), siguiendo los protocolos establecidos por el Biobanco, incluyendo la obtención de consentimiento informado. Estas biopsias se mantenían hasta el día siguiente en Línea celular Origen MYCN amp Fenotipo CHLA 20 Mujer. Post-quimioterapia. Tumor primario no ADRN CHLA 255 Metástasis. Cerebro no ADRN GI-CA-N Hombre. Metástasis médula ósea. no MES GI-ME-N Mujer. Post-quimioterapia. Metástasis. Estadio IV no MES SK-N-SH Mujer. Post-quimioterapia. MO metástasis. Estadio IV no MES/ADRN IMR-32 Hombre. Metástasis. Cerebro si ADRN MYCN amp: amplificación del oncogén MYCN; Fenotipo según Van Groningen et al (2017) ADRN: fenotipo adrenérgico; MES: fenotipo mesenquimal. MO: médula ósea .
Materiales y Métodos 84 medio de cresta neural (NCM) compuesto por medio DMEMF-12 (GIBCO BRL), suplementado con un 1% N2 (GIBCO BRL), 0,5% B27 (GIBCO BRL), 15% de FBS, 100 µg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina, 10 ng/ml FGF, 20 ng/ml IGF-1, y 20 ng/ml de EGF humano (R&D Systems). Para su insercin en los ratones SCID, en primer lugar, se anestesiaba a los animales mediante inyección intraperitoneal de 50µl (para un ratón de 20 gramos) de una mezcla 70:30 de 100 mg/kg de ketamina (Pfizer, nº de catálogo 631028H) y 10 mg/kg de xilacina (Bayer, nº de catálogo 572126.2). A continuación, se insertó de forma subcutánea, en un pequeño bolsillo hecho bajo la piel, 30µl de matrigel frío (Corning) conteniendo una muestra de biopsia de un tamaño de 3x3 mm aproximadamente. Cada tumor original se nombró con las siglas “NB” seguido del número de biopsia que le asignaba el Biobanco y la inicial T de tumor, por ejemplo, NB48T. El primer tumor crecido en un ratón se consideró el pase 1 (de aquí en adelante, PDX1). Se esperó hasta el crecimiento del tumor y, antes de que superara 1 cm2 de tamaño, se sacrificó al animal de manera indolora mediante sobredosis de los anestésicos anteriormente mencionados. Se fijaron muestras del tumor en 4% PFA (paraformaldehído) en PBS durante la noche a 4ºC para incluirlos en parafina, y del resto se extrajeron muestras de 3x3 mm para volver a introducirlos en ratones, de manera que se generara el pase 2 (PDX2), y así hasta alcanzar el pase número 5. También se conservaba un fragmento para su posterior disociación y cultivo celular y extracción de RNA y/o proteínas. 5. Dispersión y cultivo de células provenientes de tumores xenoinjerto derivados de pacientes. Para la generación de cultivos de células provenientes de tumores xenoinjerto derivados de pacientes (PDX) se realizó una dispersión mecánico-enzimática de un fragmento de tumor obtenido de un ratón PDX. Para ello, con un bisturí y en esterilidad, se realizaron cortes del fragmento de tumor de unos 2x2 mm2. Se resuspendieron los fragmentos en una solución enzimática de dispersión compuesta por 2ml de PBS sin Ca+2 ni Mg+2 (GIBCO BRL), 8.33 l de Colagenasa 0.05% (0.5 g/ml) y 10 l de Elastasa 0.005% (0.05 g/ml). La mezcla se incubó durante 10 minutos a 37ºC en agitación mínima. Posteriormente, la dispersión se filtraba muy cuidadosamente a través de filtros de 70 m. La dispersión filtrada se resuspendió con medio NCM y se centrifugó a 1400 r.p.m durante 5 minutos. El pellet obtenido se resuspendió en medio y se cuantificó utilizando azul tripan. La viabilidad ideal para un cultivo exitoso debía ser mayor del 50%. Se sembraron 50.000 células por pocillo en placas con pocillos de 60 mm de diámetro, o 100.000 células en placas de 100
Materiales y Métodos 85 mm de diámetro, con medio IMDM+GlutaMAX (GIBCO BRL) suplementado con 15% de suero, 100 µg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina y 1X ITS (5 µg/ml insulina, 5 µg/ml transferrina y 5 ng/ml ácido selenioso, GIBCO BRL), o en medio NCM, y se cultivaron a 37ºC en atmósfera húmeda al 5% de CO2. El medio se cambió cada 2-3 días, hasta la visualización de clones o células adheridas. Estos cultivos se expandieron y congelaron en medio completo mas 10% de DMSO. Los cultivos celulares obtenidos mediante esta técnica corresponden a los PDXs NB39T, NB48T y NB51T, por lo que se denominaron de la misma forma para su utilización en cultivo (Tabla 9) Tabla 9. Tumores PDXs utilizados para generar cultivos primarios y sus características Nombre Origen Ratón origen Estadio MYCN amp Histología IMK Pronóstico NB39T Tumor primario glándula suprarrenal SCID 1022 PDX4 4 sí ED Alto Favorable NB48T Tumor primario glándula suprarrenal SCID 1051 PDX3 4 no * * Favorable NB51T Metástasis hepática SCID 1293 PDX4 4 no ED Bajo Desfavorable 6. Análisis de expresión mediante citometría de flujo Para caracterizar las células obtenidas del cultivo celular de PDX, se realizó un análisis de citometría de flujo con diferentes marcadores celulares característicos de células de Neuroblastoma. Para ello, se tripsinizaron las células de los cultivos de NB48T y NB39T durante 5 minutos tras un lavado con PBS sin Ca+2 ni Mg+2 (GIBCO BRL). Las células se centrifugaron a 1400 r.p.m. durante 5 minutos y se lavaron con PBS frio. Tras el lavado, se resuspendieron en 1 ml de solución FACS (L15 media (GIBCO BRL), EDTA sal disódica al 0.1%, suero albúmina bovina (BSA) al 1%, 100 µg/ml de estreptomicina, y 100 U/ml de penicilina). Las células se contaron y se dividieron en diferentes tubos con unas 100.000 células cada uno. Se pasó al marcaje de marcadores extracelulares: CD45-APC, GD2-FITC, CD133-FITC, CD44 y c-Kit (Tabla 10) a concentración 1:100. Los anticuerpos se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente. Se llevaron además los correspondientes controles de isotipo. Los marcadores acoplados a un mismo fluorocromo se incubaron en dispersiones celulares separadas. Se centrifugó y lavó con FACS. Posteriormente, se añadieron los anticuerpos secundarios (Tabla 11) para los marcadores no conjugados, CD44 y *Muestra insuficiente para su valoración; MYCN amp: amplificación del oncogén MYCN; ED: en proceso de diferenciación; IMK: índice de proliferación
Materiales y Métodos 86 c-Kit, a concentración 1:1000 durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, tras los lavados, se procedió a la fijación y permeabilización celular para el marcaje y detección de la proteína intracelular TH (Tabla 10). La dispersión celular se fijó con una solución de PFA (paraformaldehído) al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó y lavó, y para la permeabilización se utilizó una solución de PBS con tritón X-100 (BioRad) al 0.2% durante 10 minutos en frío. Se lavó de nuevo y se añadieron los anticuerpos primarios de marcaje intracelular a una concentración 1:100 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se lavaron los anticuerpos primarios y se añadieron los anticuerpos secundarios, para el marcaje con los fluoróforos correspondientes (Tabla 11), a una concentración 1:1000 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las suspensiones celulares se lavaron y posteriormente se filtraron con un filtro de 40 m. Finalmente se analizaron con el citómetro analizador Fortessa LRS II (Beckton Dickinson). Todos estos marcajes se analizaron teniendo en cuenta los correspondientes controles de anticuerpo secundario e isotipo. Tabla 10. Anticuerpos primarios utilizados para citometría de flujo Anticuerpo Clon Compañía Nº Catálogo Conjugado Especie Reactividad CD45 BD Pharmigen 559864 APC Rata Ratón GD2 14.G2a BD Pharmigen 563439 FITC- Conjugado Ratón IgG2a Humano CD133 REA753 Mylteny Bioscienc 130-111- 085 FITC- conjugado Ratón IgG1 Humano CD44 G44-26 BD Pharmigen 555476 no Ratón IgG2b, k Humano C-kit abcam ab5506 no Conejo policlonal Humano, ratón TH NB NB300- 109 no Conejo policlonal Humano, ratón, rata Tabla 11. Anticuerpos secundarios utilizados para citometría de flujo Anticuerpo Compañía Nº Catálogo Conjugado Especie PE anti Rabbit IgG Jackson Inmu 111-116-144 PE Cabra PE anti Mouse IgM Jackson Inmu 115-116-075 PE Cabra Alexa 488 anti Mouse IgG Molecular Pro A-21202 Alexa 488 Burro Adicionalmente, se realizaron estudios del perfil del ciclo celular por citometría de flujo, mediante el uso de Ioduro de Propidio (IP). El IP es un agente intercalante del ADN que entra en la célula una vez permeabilizada y permite la cuantificación de la cantidad de ADN por evento celular. Para el procedimiento, se levantaron y lavaron
Materiales y Métodos 87 las líneas celulares en estudio. Se fijaron en PFA al 4% durante 15 minutos en frio. Se centrifugaron a 300 g y se resuspendieron en solución de permeabilización Tritón X-100 al 0.2% en PBS 10 minutos a 4ºC. Las células se centrifugaron y resuspendieron en 1 ml de medio FACS, y se incubaron en esta solución durante 15 minutos para rehidratarlas. Posteriormente, se añadió RNAsa (Sigma) a una concentración final de 0.3 mg/ml y se incubaron las soluciones celulares durante 1 hora a 37ºC en agitación. Este paso se realizó para eliminar cualquier ARN que pudiese interferir en la cuantificación del ADN celular. Tras la incubación con RNAsa, se añadió el IP a una concentración final de 0.1 mg/ml durante 20 minutos en frio. Se centrifugaron las células 5 minutos a 300 g y se resuspendieron en FACS cuidadosamente, para pasarlas por el citómetro. 7. Separación celular mediante citometría de flujo (FACS) Con el objetivo de aislar poblaciones celulares de NB en función de su expresión del marcador extracelular CD44 o de su expresión de GFP, se realizaron separaciones celulares mediante citometría de flujo o sorter. Para ello, se levantaron las células cultivadas en forma adherente de las líneas SK-N-SH, NB48T, GI-ME-N o GI-CA-N mediante tratamiento con 5 ml de Versene (GIBCO BRL) por cada frasco de cultivo de 75 cm2 durante 10 a 20 minutos. Las células se resuspendieron en medio FACS frío (L15 media (GIBCO BRL), EDTA sal disódica al 0.1%, suero albúmina bovina (BSA) al 1%, 100 µg/ml de estreptomicina, y 100 U/ml de penicilina) y se centrifugaron a 1400 r.p.m. durante 5 minutos en frio. Las células se resuspendieron en medio FACS y se distribuyeron en diferentes tubos: uno para el control de células sin marcaje, otro para el control de células solo con anticuerpo secundario, y finalmente para las células que iban a ser marcadas con el anticuerpo de interés CD44 creado en ratón (Tabla 10). Las células que iban a ser separadas para la expresión de GFP se llevaron directamente a separación sin la necesidad de marcarlas con ningún anticuerpo. Para el resto, se incubó la suspensión celular con el anticuerpo primario a una concentración de 1 µg/100 µl de solución durante 40 a 60 minutos en frío. Se lavó con medio FACS, y posteriormente, la suspensión celular y su correspondiente control se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente, anti-ratón acoplado a un fluoróforo (Alexa 488) (Tabla 11) a una concentración 1:1000 durante 30 minutos en hielo. Finalmente, las células se lavaron y centrifugaron, y se resuspendieron en FACS para filtrarlas a través de un filtro de 40 m. Posteriormente se realizaba la separación celular, aislando las células con marcaje CD44 alto (o high, Hi) del resto. Estas células separadas se resembraron
Materiales y Métodos 88 para su uso en ensayos funcionales o para análisis de expresión mediante PCR cuantitativa. 8. Inmunofluorescencia e inmunohistoquímica Para el marcaje por inmunofluorescencia de cultivos celulares, las células se fijaron con PFA al 4% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente y se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0.2% en PBS de 5 a 10 minutos a 4ºC, según el tipo de marcaje. Seguidamente, las células se lavaron con PBS y se incubaron con la solución de bloqueo PBS + 1% BSA durante al menos 1 hora a temperatura ambiente antes de incubarlas con los correspondientes anticuerpos primarios, diluidos en solución de bloqueo a 4ºC, durante toda la noche. Los anticuerpos primarios usados se detallan en la tabla 12. Tras 3 lavados de 5 minutos con PBS, las muestras se incubaron con los correspondientes anticuerpos secundarios, diluidos en solución de bloqueo, durante 1 hora a temperatura ambiente en oscuridad. Los anticuerpos secundarios usados fueron los detallados en la tabla 13. Además, junto con el secundario, se utilizó DAPI (4',6-diamino-2-fenilindol) a 1 μg/ml (Life Technologies) para el marcaje de los núcleos. Se siguió el mismo método para la inmunofluorescencia de tumoresferas cortadas en OCT y adheridas en porta, pero en este caso utilizando ventanas de incubación (Sigma). Las imágenes de fluorescencia se tomaron con un microscopio directo Olympus BX- 61, con uno invertido Olympus IX-71, o con un microscopio Nikon TiE, según el caso, utilizando aumentos de 10x, 20x o 40x. Las imágenes se analizaron en base al porcentaje de tinción en relación al área celular, o célula a célula, utilizando el software ImageJ (National Institutes of Health) o el software Cell Profiler (Carpenter et al., 2006). En el caso de cuantificarse célula a célula, los resultados se representaron en porcentaje relativos al número de núcleos totales (DAPI, % Céls. positivas). Para el análisis del porcentaje de área teñido con diferentes marcadores, se asignaba una región de interés, o ROI, que incluyó la zona de análisis, por ejemplo, una esfera. Esta región se midió y se consideró el área total de interés. Posteriormente, se establecieron valores umbrales de detección de señal con la función threshold para las diferentes tinciones, con el fin de homogeneizar el criterio de detección de señal positiva en el programa. Se procedió entonces a la medición de la totalidad del área positiva para las diferentes tinciones de forma relativa al área total de interés. Para la tinción con el anticuerpo Cdc42 se cuantificó la intensidad de expresión con ImageJ y/o Cell Profiler. En ImageJ se estableció un umbral de señal
Materiales y Métodos 95 90 min a 4ºC. Para comprobar que se había realizado la transferencia correctamente, la membrana se incubó durante 10 segundos con rojo Ponceau S (Sigma-Aldrich) y se lavó con TBS-T (Tris Buffered Saline-Tween, 50 mM Tris-HCL, NaCl 150 mM y 0,1 Tween-20 (BioRad)) hasta que aparecían las bandas, lavándose posteriormente con TBS-t. A continuación, se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente en solución de bloqueo que contenía TBS-T y 5% leche semidesnatada en polvo. Seguidamente, se incubó la membrana con el anticuerpo primario en solución de bloqueo durante toda la noche a 4ºC. Los anticuerpos primarios utilizados se indican en la tabla 17. Tras 3 lavados de 10 min con solucin TBS-T, se incub con el anticuerpo secundario unido a HRP (HorseRadish Peroxidase) de 1 a 2 horas a temperatura ambiente, dependiendo del anticuerpo primario utilizado. En la tabla 18 se detallan los anticuerpos secundarios utilizados. Tras 3 lavados cada 10 min con TBS-T de la membrana, se detect la quimioluminiscencia incubando con el reactivo ECL (Enhanced Chemiluminescence) Western Blotting Detection Reagent (Thermo Scientific), utilizando el sistema ChemiDocTM Touch Imagen System (BioRad). La cuantificación de las proteínas se llev a cabo usando el programa ImageJ (National Institutes of Health). Se midió la Densidad Integrada (Integrated Density), que es un valor que depende del área y de la media de intensidad de grises de la imagen. En primer lugar, la imagen se trató con la opción Invert, que tiene como función convertir las imágenes a modo negativo. Se seleccionó el tamaño de banda a cuantificar, que se mantenía siempre constante, y se midió el valor del fondo de la membrana, el valor de la banda control (GAPDH o Tubulina) y el valor de la banda a cuantificar. El valor de expresión de la proteína de interés se expresó en relación a la expresión de la banda de control de carga. Tabla 17. Anticuerpos primarios utilizados para la técnica Western Blot Nombre Origen Dilución Casa comercial Nº catálogo RhoB conejo 1:500 Santa Cruz sc-8048 RhoA ratón 1:500 Santa Cruz sc418 Cdc42 conejo 1:500 Cell Signalling 2462 Rac1 ratón 1:1000 (RT 1h) Sigma 05-389 VRK1 ratón 1:1000 1F6 p21 conejo 1:500 ABCAM ab109199 Anti HA ratón 1:500 Biolegend 901513 Anti GFP conejo 1:500 Invitrogen A11122 Sox9 conejo 1:200 Sigma HPA001758 Sox2 conejo 1:200 abcam ab97959 - tubulin ratón 1:2000 Sigma T9026
Materiales y Métodos 96 -catenina conejo 1:500 Zymed GSK3- ratón 1:500 Abcam AB93926 Fosfo Ser9 GSK3- conejo 1:500 Cell signalling 9323 GAPDH conejo 1:2000 Trevigen 2275-PC-100 Tabla 18. Anticuerpos secundarios utilizados para la técnica Western Blot Nombre Origen Dilución Casa comercial Nº catálogo Anti rabbit (HRP) Burro 1:1000 Jackson ImmunoResearch 711-035-152 Anti mouse (HRP) Burro 1:1000 Jackson ImmunoResearch 515-35-03 13. Ensayo de detección de actividad de proteínas Rho GTPasas (GST- pull down) Con el objetivo de detectar la fracción activa de las Rho GTPasas en lisados celulares, se realizaron ensayos Pull Down. Estos ensayos consisten en la incubación de los lisados con bolas acopladas a dominios de interacción específicos de la fracción activa (unida a GTP) de las GTPasas, como por ejemplo los dominios RBD (Rhotekin Binding Domain) o PAK PBD (Pak1 Binding Domain) (Materiales y Métodos, Apartado 13.1). Para la detección de la porción activa en lisados celulares de las Rho GTPasas de la subfamilia Rho se utilizan las bolas acopladas al dominio de interacción RBD y para las de la subfamilia de Cdc42 las bolas acopladas al dominio PAK. 13.1 Generación de bolas GST (Glutation-S-Transferasa) acopladas a dominios PBD y RBD Para la generación de bolas GST acopladas a dominios PAK y RBD, se inocularon en 50 ml de LB con ampicilina (100 g/ml) diferentes colonias de las estirpes bacterianas BL21(DE3), transformadas con los vectores GST-RBD y GST-PAK (Tabla 7), y se incubaron durante toda la noche a 37ºC en agitación. Al día siguiente, se hizo una dilución 1:100 de los cultivos bacterianos en 500 ml con ampicilina (100 g/ml) durante 2 horas a 37ºC en agitación. Se midió la densidad óptica a 600 nm (OD600) que se esperaba en valores entre 0.6 y 1. En este momento se realizó la inducción del promotor lac mediante la adición de IPTG (isopropil-β-D-1- tiogalactopiranósido, Sigma), compuesto análogo no hidrolizable de la lactosa, a una concentración final de 1 mM. Se incubó durante 3 horas a 30ºC y se interrumpió la
Materiales y Métodos 97 inducción por IPTG mediante el centrigugado del cultivo a 4000 r.p.m. a 4ºC durante 20 minutos. Posteriormente, se realizó la lisis del cultivo para la extracción de la fracción proteica (50 ml de cultivo, aproximadamente) con 5 ml de tampón STE frio (10 mM Tris pH=8.8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF) y se homogeneizó con agujas de 19G. Se añadió Lisozima (Sigma) a una concentración final de 100 g/ml y se mezcló sin utilización de vortex. Se incubó en hielo durante 15 minutos. Se añadió DTT a temperatura ambiente a una concentración final de 5 mM y se mezcló sin utilización de vortex. Se añadió Tween-20 y SDS a unas concentraciones finales del 1% y 0.03%, respectivamente. Se centrifugó durante 20 minutos a 15000 r.p.m. y se transfirió el sobrenadante a tubos de 15 ml. Si el sobrenadante era viscoso, se volvió a homogeneizar con aguja en frío. Se preparó la solución de bolas de Glutation Agarosa (Sigma) para su acoplamiento al vector GST (350 l/muestra) y se lavó en tampón STE al 50%, obteniendo una mezcla 1:1 de bolas y tampón. Se incubaron 175 l de bolas con los lisados de las inducciones de GST-PAK y GST-RBD durante 10 minutos a temperatura ambiente y en movimiento, para el acoplamiento. Se lavaron las soluciones 4 veces con tampón STE (1000 r.p.m. 4 minutos a 4ºC). En este paso se obtuvieron ya las bolas acopladas al vector GST, por lo que podían congelarse a -80ºC al 10% de glicerol o continuar con el proceso. Para finalizar, se corrió una porción de las bolas desnaturalizadas junto con un gradiente de BSA en un gel de acrilamida al 14%. Para ello, se desnaturalizaron las muestras con tampón Laemmli 2x y DTT 10 mM durante 5 minutos a 95ºC y se corrió el gel en una cubeta de electroforesis (BioRad) en tampón de electroforesis SDSPAGE 1X. El gel resultante se tiñó con solución Coomassie durante 1 hora a temperatura ambiente (1.25 gr de Coomassie, 225 ml de MeOH, 225 ml de H2O miliQ y 50 ml de ácido acético glacial) y posteriormente se destiñó con una solución de 300 ml de MeOH, 100 ml de ácido acético y 600 ml H2O miliQ, con el fin de visualizar las bandas a la altura correcta, entre 30 y 50 kDa, y cuantificar la cantidad de bolas acopladas a dominios GST-RBD o GST-PAK generadas después del proceso. 13.2 Aislamiento de fracción activa de Rho GTPasas en lisados proteicos Para la realización de este ensayo, se sembraron las células de NB en placas de 150 mm a una confluencia del 90% en medio completo. Se dispusieron las placas en hielo, y se lavaron con PBS frio. Se secaron lo máximo posible para evitar restos de
Materiales y Métodos 98 medio. Se añadieron de 0.4 a 1 ml de tampón de lisis (Tris-HCL 50 mM pH=7.5, EDTA 0.5 M pH=8, NaCl 500 mM, MgCl2 10 mM, Tritón X-100 1% (v/v), Deoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0,1 % y glicerol 10% (v/v), mas 150 μl de -mercaptoetanol, media tableta de cocktail inhibidor de proteasas (cOmplete, Roche) y PMSF 100 mM a una concentración 1:1000 para 30 ml de tampón), y se rasparon las células en esa solución. Se recogió el lisado y se centrifugó en tubos de 1.5 ml durante 20 minutos a 14000 r.p.m. El sobrenadante contenía el extracto de proteínas. Se cuantificaron las muestras mediante el método Bradford (Materiales y Métodos, Apartado 11). Se reservaron 50 g de lisado por muestras para el estudio de la fracción total y entre 800-1000 g para la evaluación de la fracción activa. Por otro lado, se realizaron controles positivos y negativos de la actividad de las Rho GTPasas mediante la incubación de 800-1000 g de lisado con GTPS 100X para el control positivo o GDP para el control negativo (Sigma), a una concentración final de 100 M y 10 mM, respectivamente, en presencia de EDTA 10 mM durante 15 minutos a 30ºC. Se interrumpió la reacción mediante la adición de MgCl2 en frío a una concentración 60mM. Los controles junto con las muestras para la detección de fracción activa se incubaron con 50-60 g de bolas GST-RBD para la detección de actividad de la subfamilia Rho, y/o con 8-10 g de bolas GST-PAK para la detección de actividad de la subfamilia de Cdc42 durante 1 hora a 4ºC en rotación. Posteriormente, se realizaron 4 lavados con tampón de lisis a 4ºC, centrifugando a 1000 r.p.m. durante 5 minutos. A continuación, se desnaturalizaron las muestras control, las fracciones totales y las fracciones activas junto con tampón de carga Laemmli 2x y 10 mM DTT a 95ºC durante 10 minutos. Las muestras se corrieron en un gel de acrilamida al 12.5% en una cubeta de electroforesis (BioRad), con tampón de electroforesis SDS-PAGE 1X y siguiendo el mismo procedimiento explicado anteriormente para el análisis de proteínas mediante inmunodetección o Western Blot de la Rho GTPasa de interés, detallado en el Apartado 12 de Materiales y Métodos. 14. Proteómica cuantitativa tipo label free (LFQ) Con el objetivo de caracterizar el perfil proteico diferencial de líneas celulares de NB de forma cuantitativa, se realizó un ensayo de proteómica cuantitativa tipo label free, a cargo del Servicio de Proteómica del Instituto de Biomedicina de Sevilla. La técnica de proteómica label free es un método de espectrometría de masas que permite la
Materiales y Métodos 99 identificación y cuantificación de cambios de expresión proteica relativos entre dos o más condiciones. De este ensayo se pueden obtener el nº de espectros de péptidos asociados a una proteína en concreto, pero también la medición cuantitativa a través del análisis del área bajo la curva de la señal de los iones en el cromatógrafo, dando lugar a una señal de intensidad para cada péptido. La intensidad de señal de los iones que conforman cada péptido correlaciona con la concentración de péptidos en cada muestra, por lo que se pueden cuantificar estas muestras utilizando réplicas de cada variable y comparando para obtener un análisis diferencial de las muestras objeto de estudio. El software generador de datos es el MSFragger. El análisis de los resultados de este ensayo se realizó bajo la supervisión y consejo de la Dra. María Carmen Durán Ruíz de la Universidad de Cádiz, mediante el uso del software de análisis Metabolanalyst. Se realizó un análisis de componentes principales para determinar la varianza entre réplicas y muestras. Las co-varianzas se expresaron de manera vectorizada en forma de Score y ayudan a representar la relación de las réplicas entre sí. Además, se realizó una visualización pormenorizada de la expresión de los diferentes péptidos entre réplicas representando los datos de intensidad normalizados en forma de heatmap. El método de clustering o agrupamiento se realizó mediante la media y la medida de distancia con el método Euclidean. A continuación, se realizó un análisis de expresión diferencial entre las líneas objeto de estudio, para el cual se consideró como cambio un fold change > 1.5. Se representó de forma gráfica el log2 del fold change (log2FC) para el estudio de las proteínas que cambiaban de expresión. Con este grupo de proteínas se realizó un análisis de enriquecimiento de vías de manera independiente, proteínas más expresadas (Up) y proteínas menos expresadas (Down), tal y como se describe en el Apartado 1.4. A continuación, se realizó un análisis de expresión diferencial significativa mediante el cálculo del valor p o p-value y el valor FDR (False Discovery Rate), seleccionando ambos parámetros menores que 0.05, y se representaron estos valores en forma del log10 del valor p (log 10 raw p value). Se representaron los valores de intensidad de señal para cada una de las proteínas que cambiaban de forma significativa, representando el valor de la misma en cada réplica. Para realizar el estudio de modelización de interacción proteica y funcionalidad de las proteínas que cambiaban de expresión de manera significativa entre condiciones, se utilizó la plataforma STRING (https://string-db.org/) tal y como se señala en el Apartado 1.4.
Materiales y Métodos 100 15. Ensayos de transfección con plásmidos Con el fin de sobreexpresar los genes CDC42 y RHOB en las líneas celulares de NB, se realizó una transfección de los plásmidos pcDNA3-EGFP-Cdc42-wt (Addgene: #12975, Tabla 7) y pcDNA3-HA-RhoB (cedido), mediante el uso de lipofectamina 2000 (Life Technologies). Se sembraron las líneas CHLA 20, CHLA 255 Luciferasa, SK-N-SH, GI-ME-N, GI-CA-N e IMR-32 en placas de 60 mm al 80 % de confluencia (unas 200.000 células). Una vez adheridas, se transfectaron con una solución de 2.5 a 5 µg de DNA de los plásmidos, usando Lipofectamina 2000, ambos diluidos e incubados previamente en medio OptiMEM bajo en suero (GIBCO, BRL). A las 48 horas, se cambió el medio y se añadió medio de selección con Geneticina (G418, Sigma) a una concentración final de 500 µg por ml de medio completo. Se seleccionaron durante 7 días y se congelaron con medio completo al 10% de DMSO. Se comprobó que la transfección se había dado correctamente mediante un análisis de proteínas por Western Blot y de actividad de las Rho GTPasas transfectadas mediante Pull Down (Apartados 12 y 13, Materiales y Métodos). Estas líneas se utilizaron para diferentes ensayos de caracterización o funcionales: análisis de proteínas por Western Blot, caracterización celular mediante inmunofluorescencia o citometría, viabilidad, diferenciación, formación de esferas, o inyección en ratones. 16. Ensayos de silenciamiento génico. Para llevar a cabo el silenciamiento de la GAP CdGAP/ARHGAP31 o la Rho GTPasa Cdc42, se llevaron a cabo diferentes aproximaciones, entre ellas los ensayos de silenciamiento por siRNA (small interfering RNA). Para ello, se sembraron en placas de 6 pocillos las líneas celulares CHLA 20, SK-N-SH y NB48T a una confluencia del 80-90% en medio completo. Una vez adheridas las células, se renovó el medio a medio bajo en suero sin antibiótico OptiMEM (GIBCO BRL) y se transfectaron de 50 a 100 nM del pool de siRNA de CdGAP u On Target Cdc42 (Tabla 19, Horizon), o con un siRNA pool control u Off Target a 50 nM con lipofectamina 2000 (Life Technologies), ambos diluidos e incubados previamente en medio OptiMEM (GIBCO BRL). Los siRNA tipo pool se componen de diferentes secuencias diana del mensajero de interés, en este caso de CdGAP, mientras que los On Target poseen una secuencia específica para el silenciamiento del mensajero, en este caso de Cdc42 (Tabla 19). Pasadas 24 horas se realizó un cambio de medio a medio completo. Una vez transcurridas 48 horas de la transfección, las células se tripsinizaron y se sembraron en placas de cultivo para realizar diferentes ensayos
Materiales y Métodos 101 funcionales, caracterización por inmunofluorescencia o Western Blot y/o formación de esferas. Tabla 19. Secuencias siRNA pool, ARHGAP31 y CDC42 Nombre Secuencia diana ON-TARGET plus Non-targeting Contro pool. Horizon no especificado ON-TARGET plus SMARTpool siRNA J-023577- 09 ARHGAP31. Horizon GGGAAAUUUCAAUCGAACA UCACCAAGCAGGAGGGCGA GGAUGUAACCCAUUCAGUA CCUCAGCGGAGAUCAGUAA ON-TARGETplus Human CDC42 siRNA no especificado 17. Ensayos de viabilidad celular Los ensayos para medir la viabilidad celular se llevaron a cabo con células de NB tras diferentes procedimientos y/o tratamientos en comparación con sus correspondientes líneas controles, usando el reactivo alamarBlue (Invitrogen). Esta medida se basa en la capacidad reductora de una célula viva. Al ser cultivada junto a resazurin, compuesto permeable activo del alamarBlue, de color azul y sin fluorescencia, las enzimas reductasas propias de la célula lo convierten en resorufin, un compuesto de color rojo y altamente fluorescente. Para el ensayo, se sembraron 20.000 células en placas de 96 pocillos, con 200 μl de medio completo. Una vez las células se encontraron adheridas, se iniciaron las medidas de viabilidad durante los días estimados según el protocolo. Para ello, se añadieron 6 μl de alamarBlue y se mantuvo durante 3 horas en el incubador a 37ºC en atmósfera húmeda al 5% de CO2. Pasado este periodo, se midió la fluorescencia emitida por las células a 590 nm en el lector de fluorescencia CLARIOstar (BMG Labtech). La señal emitida es proporcional a la cantidad de células vivas en el pocillo. Con estos datos, se construyó una recta de crecimiento de las diferentes condiciones y se obtuvo una curva patrón. Los datos de viabilidad a diferentes horas entre condiciones se compararon mediante un test de t-Student. 18. Ensayos de formación de esferas Los ensayos de formación de esferas permiten el enriquecimiento en células indiferenciadas o progenitoras de diferentes líneas celulares de Neuroblastoma, como SK-N-SH, GI-ME-N o NB48T. Las esferas se obtienen en condiciones de baja densidad celular y adherencia, en placas denominadas ultra-low adherence (Corning). Se sembraron de 2.000 a 5.000 células en pocillos de placas de 6 pocillos,
Materiales y Métodos 102 en medio de cultivo de cresta neural (NCM: medio DMEM-F-12, suplementado con un 1% N2, 0.5% B27, 15% FBS, 100 µg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina, 10 ng/ml FGF, 20 ng/ml IGF-1, y 20 ng/ml de EGF humanos) durante 7 das a 37ºC en atmósfera húmeda al 5% de CO2. Transcurrido este tiempo, se tomaron imágenes de las tumoresferas utilizando un microscopio invertido Olympus IX-71, a un aumento de 4x. El número y diámetro de las tumoresferas se cuantificó a partir de las imágenes obtenidas, utilizando el programa ImageJ (National Institutes of Health). El número de esferas formadas se utiliza como equivalente a la eficacia de formación de esferas y se expresa de forma relativa a la cantidad de células totales que se siembran al inicio del experimento. El diámetro de las esferas por otro lado, se utiliza como parámetro para evaluar la capacidad proliferativa de las células formadoras de esferas. Para conseguir mayor enriquecimiento en células indiferenciadas, estas tumoresferas se disgregaron y resembraron, hasta dos y tres veces, lo que se denominaba como tumoresferas secundarias y terciarias. Para ello, las tumoresferas se recogieron de los pocillos y se trataron con tripsina durante 5 minutos a 37ºC en agitación. Se filtraron a través de filtros de 40 m y se volvieron a sembrar en placas de baja adherencia a una densidad de 2.000 a 5.000 células por pocillo con NCM. En ocasiones, las tumoresferas se congelaron en N2 líquido para extracción de ARN, o se incluyeron en bloques con OCT (Optimum Cutting Temperature, Sakura) que se congelaron en hielo seco, para poder cortarlas con el criostato en secciones de 10μm que se montaron en portaobjetos tipo superfrost para su posterior tinción por inmunofluorescencia. Estos protocolos se pusieron a punto en el laboratorio y están publicados por el grupo (Amador-Álvarez et al., 2022). 19. Ensayos de diferenciación celular Con el fin de inducir la diferenciación de células de NB, se sembraron entre 10.000 y 20.000 células en placas de 24 pocillos sobre cubres, o 100.000 células en placas de 60 mm de diámetro con medio completo. Este medio se sustituyó a las 24 horas por medio bajo en suero (2% FBS), y a las 48 horas de la siembra se añadieron los medios de diferenciación correspondientes, durante un total de 7 a 10 días, dependiendo de las condiciones del experimento. El medio celular para diferenciación básico (NS, del inglés no serum) se compone de DMEM: F12 más 100 μg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina, 1% suplemento N2, 2% suplemento B27 con vitamina A, y se le añadía ácido retinoico (AR, Sigma) a una concentración
Materiales y Métodos 103 final de 10 μM, para hacerlo así específico para la diferenciación neuronal. El medio de diferenciación se renovó cada 72 horas y las células se fijaron a los 7-10 días con PFA al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente, para inmunofluorescencia con anticuerpos específicos, o para el análisis de proteínas por Western Blot o PCR cuantitativa. 20. Análisis de morfología celular Para el análisis del citoesqueleto celular, se utilizó el software Cell Profiler (Carpenter et al., 2006), que permite el estudio de diferentes características morfológicas como son el área o el número de ramificaciones celulares, entre otras características detalladas en la tabla 20, a través de la cuantificación del número de píxeles y la intensidad de señal en los mismos, de imágenes de cultivos celulares bajo diferentes condiciones. Para ello, se realizó una tinción del citoesqueleto de actina y el núcleo celular, mediante el uso de Faloidina y DAPI respectivamente, en células sembradas en baja densidad (Materiales y Métodos, Apartado 8, Tabla 13). Se tomaron imágenes con el microscopio directo Olympus BX-61 con el objetivo 20x. Se corrigió el fondo e iluminación de las imágenes con el uso del programa ImageJ (National Institutes of Health) y se cargaron en el programa Cell Profiler. Tabla 20. Características morfológicas analizadas por Cell Profiler Nombre Definición Area Nº total de pixeles en la región marcada por el objeto Excentricidad Conocido como elongación. Es la razón entre su semidistancia focal (radio que parte desde el centro y acaba en uno de los focos) y su semieje mayor. Los valores van de 0 (circular) a 1 (elipse) Solidez Conocido como convexidad. La proporción de pixeles que hay en la zona convexa que se encuentran también dentro del objeto. Cuantificado como area/area convexa Extensión Cantidad de pixeles en el cuadro delimitador que están también en la región del objeto. Cuantificado como el area dividida entre el area de la caja delimitadora no rotada Perimetro El nº de píxeles alrededor de la zona delimitadora de la imagen Factor de forma 4*pi*Area/(Perimeter^2). 1 es el valor del círculo perfecto Mediante el uso de un pipeline puesto a punto para el tipo celular en estudio, el programa detectó como objetos el núcleo y la membrana celular en las imágenes
Materiales y Métodos 104 cargadas. Mediante diferentes medidas basadas en los píxeles incluidos en cada célula reconocida, se pueden obtener una gran variedad de medidas relacionadas con características morfológicas de las células analizadas. Los datos se exportaron a una hoja Excel, o en formato .txt, para su posterior análisis. Los resultados morfológicos obtenidos se normalizaron mediante la aplicación de un z-score y se representaron en su mayoría en forma de Heatmaps y gráficos de distribución de cajas, mediante la utilización de Rstudio y las librerías ComplexHeatmap, ggplot2 y circlize, con el fin de comparar diferentes condiciones experimentales entre sí. El código diseñado para este proceso es el siguiente: library (ComplexHeatmap) library(ggplot2) library(circlize) > filename<-(".txt") >my_data<read.table(filename,sep="\t",quote="",check.names=FALSE,head er=TRUE,row.names=1) > my_matrix <- as.matrix(my_data) > df <- scale(my_matrix) > col_fun = colorRamp2(c(-1, 0, 1), c("blue", "white", "red")) > col_fun(seq(-1, 1)) > col<- colorRampPalette(c("red", "white", "blue")) >Heatmap(my_matrix,col=col_fun,show_row_names=TRUE,show_column_n ames=TRUE, cluster_rows = TRUE, cluster_columns = TRUE, show_column_dend = TRUE, show_row_dend = TRUE,column_names_gp = gpar(fontsize = ),row_names_gp=gpar(fontsize=), width=unit(,"mm")) 21. Ensayos de formación de tumores subcutáneos derivados de líneas celulares La formación de tumores subcutáneos se llevó a cabo inyectando de 1x105 a 1x106 células de la línea celular de neuroblastoma CHLA 255 +/- GFP-Cdc42, NB48T o NB39T, de forma subcutánea. Para la inyección, las células se resuspendieron en un volumen final de 100 µl, de los cuales 50 µl son de PBS (GIBCO BRL) con las células y los otros 50µl son de matrigel frío (Corning). La solución se inyectó con una aguja de calibre 29 (BD Micro-FineTM) subcutáneamente en el flanco del animal. Se observaron los animales cada dos semanas hasta que se detectó el inicio del tumor, entonces se pasó a vigilar una vez por semana. Se esperó hasta la formación del
Resultados 111 Amplificación del oncogén MYCN. Datos de la cohorte GSE45547 (Testt de Student, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). La expresión de las Rho GTPasas RHOBTB1, RAC3, RND1 y RHOV aumenta en el estadio 4, en comparación con el estadio 1 y 2. Los niveles de expresión de RHOBTB2, RHOA, RHOD, RHOF y RHOG cambian de manera similar, aunque no significativamente. Por el contrario, RHOB, RHOC, RHOH, CDC42, RHOJ, RHOQ, RAC1, RAC2, RND3 y RHOU resultan estar expresados a la baja de manera significativa en el estadio 4 en comparación con los estadios menos avanzados de la enfermedad (Figura 9A, Anexo 1). Adicionalmente, se dividieron las muestras en función de la clasificación INRG, en relación al riesgo del paciente. Para el estudio de muestras de pacientes según esta clasificación, se utilizó la base de datos GSE49710. Las Rho GTPasas RHOB, RHOC, RHOH, CDC42, RHOJ, RHOQ, RAC1, RAC2, RND3 y RHOU se expresan menos en muestras de pacientes de estadios de alto riesgo, mientras que las Rho GTPasas RHOA y RHOV se encuentran más expresadas de forma significativa en los casos de alto riesgo. RHOBTB1, RHOBTB2, RHOD, RHOF, RND1, RAC3 y RHOG poseen una tendencia no significativa de expresión a la baja en los casos de bajo riesgo (Figura 9B, Anexo 1). Por lo tanto, existe una alteración en la expresión de la amplia mayoría de las Rho GTPasas de manera consistente, que se puede relacionar con las manifestaciones más agresivas de la enfermedad. Mientras que un grupo de Rho GTPasas, como CDC42 o RHOB, poseen una tendencia de menor expresión en casos asociados a parámetros clínicos de agresividad, otras Rho GTPasas como RHOA o RHOV aumentan su expresión en pacientes de estadios más avanzados y de alto riesgo. 1.1.1. Amplificación oncogén MYCN La existencia de amplificación del oncogén MYCN en los pacientes de NB se utiliza actualmente en la clínica como una de las herramientas de clasificación de riesgo, asociada a mal pronóstico y agresividad. Las muestras asociadas a pacientes que portan tumores con amplificación del oncogén MYCN poseen una menor expresión significativa de RHOB, RHOC, RHOH, CDC42, RHOJ, RAC1, RAC2, RHOG, RND2, RND3, RHOU y RHOBTB2, pero niveles de expresión más altos de RHOF, RAC3, RHOV y RHOBTB1 (Figura 9C, Anexo 1)
Resultados 112 1.1.2. Histología y Heterogeneidad intratumoral La clasificación histopatológica de los tumores de NB es fundamental para establecer el pronóstico y el tratamiento de los pacientes. Los niveles de expresión de Rho GTPasas también varían entre los grados histopatológicos definidos tal y como se describe en la introducción, donde una histología más indiferenciada se asocia con mayor agresividad y peor pronóstico. RHOC, RAC1, RND2 y RND3 poseen niveles de expresión significativamente más bajos en casos de histología indiferenciada (Figura 10A, Anexo 1). Tal y como se describe en la introducción, diferentes estudios han definido patrones de expresión asociados a subpoblaciones celulares en células de NB, unas con un perfil adrenérgico (ADRN) y otras con un perfil más mesenquimal (MES) (van Groningen et al., 2017). Entre las células con este último perfil, se encuentran las células más indiferenciadas del tumor, con características progenitoras, similares a las células de la cresta neural (NCC). La expresión de algunas Rho GTPasas también parece estar enriquecida específicamente en estas diferentes poblaciones celulares. RHOC, RHOJ, y RHOG se expresan más en la población MES, mientras que RAC3, RHOU, RHOV y RHOBTB2 están sobreexpresadas en células de perfil ADRN. (Figura 10B, Anexo 1). 1.1.3. Recaídas Uno de los principales problemas en la presentación clínica del NB es la aparición de recaídas resistentes a las terapias convencionales. Nuestros análisis facilitaron la observación de la alteración de la expresión de algunas Rho GTPasas en caso de recurrencia de la enfermedad, como RHOB, CDC42, RAC3, RND3 y RHOG, siendo este último el único regulado al alza, mientras que la expresión de las demás se encuentra disminuida en estos casos agresivos (Figura 10C).
Resultados 113 Figura 10. Representación de la distribución de la expresión de las Rho GTPasas en tumores de pacientes según: A) Histología diferenciada e indiferenciada. Datos de la cohorte TARGET. B) Perfiles celulares génicos descritos por Van Groningen et al 2017. Adrenérgico (ADRN), Mesenquimal (MES), mostrando como control un perfil de células de la cresta neural (NCC). Datos de la cohorte GSE90803. C) Eventos de recurrencia o recaída de la enfermedad. Datos de las cohortes GSE16476 y GSE3446. (Test t-Student, **** p<0.0001, *** p<0.001, **p<0.01, *p<0.05). ** RHOC RHOJ RHOG RAC3 RHOU RHOV RHOBTB2 0 5 10 15 ADRN MES NCC ** ** ** **** * A) B) 2log expresión RHOC RAC1 RND2 RND3 0 5 10 15 Diferenciado Indiferenciado ** * ** * RHOB CDC42 RAC3 RND3 RHOG 0 5 10 15 No evento Recurrencia ****** ** **** * ** * 0 5 10 15 Recaída No evento ***** * *** ** 2log expresión 2log expresión C)
Resultados 114 1.2. Análisis de supervivencia Llevamos a cabo análisis Kaplan-Meier de supervivencia para determinar la posible relevancia de la expresión génica de esta familia de proteínas en el riesgo de deceso del paciente. El análisis de supervivencia determinó que la expresión de varias Rho GTPasas estratifica a los pacientes según su supervivencia global. En concreto, la alta expresión de RHOA, RHOV y RHOBTB1 determina una baja supervivencia total en los pacientes, mientras que la alta expresión de RHOB, RHOC, RHOD, RHOH, CDC42, RHOJ, RHOQ, RAC1, RAC2, RAC3, RND1, RND2, RND3 y RHOU se relaciona significativamente con casos de alta supervivencia (Figura 11). 1.00 0.50 0.00 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 (n=310) (n=441) (n=38) (n=460) (n=36) (n=131) (n=427) (n=405) (n=395) (n=426) (n=126) (n=457) p 1.1e-06 p 1.7e-15 p 1.9e-09 p 2.3e-05 p 2.9e-11 p 5.5e-18 p 4.2e-04 p 2.6-03 p 1.000 p 1.0e-13 p 0.013 p 0.044 p 1.7e-08 p 0.026 p 3.4e-14 p 8.3e-08 p 8.8e-04 RHOA RHOB RHOC RHOD RHOH RAC1 RAC2 RAC3 RND1 RND2 RND3 CDC42 RHOJ RHOQ RHOU RHOBTB1 Supervivencia total Meses 1.00 0.50 0.00 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 1.00 0.50 0.00 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 1.00 0.50 0.00 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Supervivencia total Meses (n=17) 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses (n=451) 1.00 0.50 0.00 (n=398) (n=435) (n=434) 1.00 0.50 0.00 Supervivencia total 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 1.00 0.50 0.00 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 1.00 0.50 0.00 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Supervivencia total 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 1.00 0.50 0.00 Meses Meses Meses 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 1.00 0.50 0.00 1.00 0.50 0.00 Supervivencia total 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 1.00 0.50 0.00 Meses 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 1.00 0.50 0.00 1.00 0.50 0.00 RHOV Supervivencia total 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 1.00 0.50 0.00 Meses 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 1.00 0.50 0.00 1.00 0.50 0.00 Expresión alta Expresión baja (n=188) (n=57) (n=460) (n=481) (n=41) (n=100) (n=63) (n=64) (n=70) (n=93) (n=103) (n=38) (n=462) (n=367) (n=72) (n=372) (n=41)
Resultados 115 Figura 11. Análisis de supervivencia total de Kaplan Meier en base a la expresión de las Rho GTPasas. Representación de la supervivencia total, sin tener en cuenta eventos de recaída, de pacientes de NB estratificados según la expresión de la proteína de interés Datos de la cohorte 49710. (Valores de p = Bonferroni). En definitiva, como se puede observar en el cuadro resumen (Figura 12A) la expresión de la amplia mayoría de Rho GTPasas se ve desregulada con la progresión tumoral. Estos cambios se asocian, en un grupo mayoritario de Rho GTPasas, de forma inversa a parámetros que indican agresividad o peor pronóstico del neuroblastoma, observándose una expresión significativamente más baja en casos de estadios más avanzados, MYCN amplificado, riesgo alto, recaídas o histología indiferenciada. Tan solo en el caso de las GTPasas RHOD, RHOBTB1, RHOA y RHOG, se encontró una mayor expresión asociada a algunos parámetros de malignidad, como en pacientes de estadios metastásicos o que sufren recaídas (Figura 12A). Adicionalmente, se estudió si existían patrones comunes de expresión de la familia de 20 Rho GTPasas entre diferentes grupos de pacientes. La expresión génica de las 20 Rho GTPasas en conjunto, en diferentes cohortes de pacientes, se analizó mediante la utilización de Heatmaps (Figura 12B, Anexo 2). Se observa que existe un grupo de pacientes dentro del estadio 4 con amplificación del oncogén MYCN que tienen en común un patrón de menor expresión de los genes CDC42, RAC1, RND3, RHOU, RAC2, RHOH y RHOG. Adicionalmente, de forma más general, se observa una alteración del patrón de expresión génico consistente entre diferentes estadios, posiblemente relacionados con parámetros de agresividad en la enfermedad. Este patrón de expresión se conserva entre diferentes bases de datos, como se puede observar detalladamente en los Heatmaps del Anexo 2. 1.00 0.50 0.00 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 (n=310) (n=441) (n=38) (n=460) (n=36) (n=131) (n=427) (n=405) (n=395) (n=426) (n=126) (n=457) p 1.1e-06 p 1.7e-15 p 1.9e-09 p 2.3e-05 p 2.9e-11 p 5.5e-18 p 4.2e-04 p 2.6-03 p 1.000 p 1.0e-13 p 0.013 p 0.044 p 1.7e-08 p 0.026 p 3.4e-14 p 8.3e-08 p 8.8e-04 RHOA RHOB RHOC RHOD RHOH RAC1 RAC2 RAC3 RND1 RND2 RND3 CDC42 RHOJ RHOQ RHOU RHOBTB1 Supervivencia total Meses 1.00 0.50 0.00 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 1.00 0.50 0.00 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 1.00 0.50 0.00 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Supervivencia total Meses (n=17) 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses (n=451) 1.00 0.50 0.00 (n=398) (n=435) (n=434) 1.00 0.50 0.00 Supervivencia total 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 1.00 0.50 0.00 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 1.00 0.50 0.00 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Supervivencia total 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 1.00 0.50 0.00 Meses Meses Meses 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 1.00 0.50 0.00 1.00 0.50 0.00 Supervivencia total 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 1.00 0.50 0.00 Meses 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 1.00 0.50 0.00 1.00 0.50 0.00 RHOV Supervivencia total 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 1.00 0.50 0.00 Meses 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 216 192 168 144 120 96 72 48 24 0 Meses 1.00 0.50 0.00 1.00 0.50 0.00 Expresión alta Expresión baja (n=188) (n=57) (n=460) (n=481) (n=41) (n=100) (n=63) (n=64) (n=70) (n=93) (n=103) (n=38) (n=462) (n=367) (n=72) (n=372) (n=41)
Resultados 116 Figura 12. Análisis resumen de la expresión de Rho GTPasas, utilizando la plataforma R2 (http://r2.amc.nl), en muestras de NB. A) Tabla resumen de la expresión de las Rho GTPasas en relación a diferentes características clínicas del NB señaladas según un código de colores (MES: pérfil génico mesenquimal, ADRN: pérfil génico adrenérgico) y cohortes de pacientes. B) Heatmap representando la variación de expresión de las Rho GTPasas en pacientes de NB y z-score de expresión de la familia en relación al estadio y el estado de MYCN. Patrón de menor expresión de las GTPasas RHOU, RND3, RAC1 y CDC42 encuadrado. Datos de la cohorte GSE45547. RHOB RND2 RND3 RHOBTB2 RHOU CDC42 RHOQ RHOJ RAC2 RHOV RHOC RHOH RAC1 RAC3 RHOG RND1 RHOF RHOA RHOBTB1 RHOD GSE16476 GSE45547 GSE49710 GSE3960 Westerman GSE49710 Westerman GSE16476 GSE45547 GSE49710 GSE3960 Westerman GSE49710 GSE49710 GSE65303 GSE2446 Westerman GSE90803 RHOBTB1 RHOQ RHOB RND1 RHOD RHOJ RHOC RHOA RHOG RHOH RAC2 RHOBTB2 RND2 RAC3 RHOF RHOV RHOU RND3 RAC1 CDC42 MYCN Estadio B) Alta expresión ns Baja expresión A) Est 1 Est 2 Est 3 Est 4 MYCN amp MYCN no amp Score -3 3 RHO GTPASAS Estado metastásico Alto riesgo Amplificación MYCN Indiferenciación Progresión Recaída MES ADRN
Resultados 117 2. Análisis de la red reguladora de la actividad de las Rho GTPasas en NB: GAPs, GEFs, GDIs y efectores La actividad de las proteínas Rho GTPasas se encuentra estrechamente regulada a nivel espaciotemporal por diferentes factores como, por ejemplo, proteínas inhibidoras (GAPs o GDIs), activadoras (GEFs) o efectores. Por lo tanto, la alteración de la expresión o actividad de sus reguladores o efectores puede afectar al correcto funcionamiento de las vías de señalización en las que se encuentran involucradas nuestra familia de proteínas de interés. Dado que la expresión de la familia de las Rho GTPasas parece estar alterada en NB, se realizó un análisis in silico más extenso, con el fin de describir la expresión de genes pertenecientes a la amplia red de regulación de estas proteínas, en pacientes con NB. Para ello, se seleccionó un grupo de genes que incluía los principales GAPs (n=48), GEFs (n=55), GDIs (n=4) y efectores (n=30), teniendo en cuenta la bibliografía existente en cuanto a las mutaciones puntuales descritas en esta familia de proteínas (Molenaar et al., 2012, Anexo 3). Además, se incluyeron todos los reguladores activadores o inhibidores de la actividad GTPasa descritos, de los que se pudo obtener información de expresión en cohortes de muestras de pacientes de NB (Tabla 21, Anexo 3). Tabla 21. Grupo de genes en la red de señalización de las Rho GTPasas seleccionadas para el estudio. Incluyen Rho GTPasas, GEFs, GAPs, GDIs y efectores.
Resultados 118 Este análisis se inició estudiando la expresión de cada uno de los genes que codifican para proteínas reguladoras o efectoras de las Rho GTPasas de los que se disponía información en cohortes de pacientes de NB de manera individual, en relación con algunos parámetros clínicos relacionados con la agresividad de la enfermedad. En primer lugar, se advirtió que la expresión de estos genes correlacionaba a nivel de expresión con algunas de las 20 Rho GTPasas existentes, según los datos de las muestras de pacientes (Anexo 3). Esto sugería que la expresión de algunos genes reguladores podría cambiar junto con otros genes de la familia con los que colaboran en la misma vía de señalización o proceso celular. De este modo, se observó correlación de expresión en pacientes entre algunos reguladores conocidos y la Rho GTPasa con la que interaccionan de forma específica. Para describir esta posible conexión, se realizó un análisis de correlación de genes usando los valores de expresión en cohortes de pacientes de NB: GS45547 (Figura 13), GSE49710, TARGET (Anexo 4), creando un heatmap con estos datos. Este heatmap muestra la existencia de 5 grupos de correlación (clusters), agrupando conjuntos de genes que cambian de expresión siguiendo la misma tendencia en la patología de NB (Figura 13)
Resultados 119 Figura 13. Representación mediante Heatmap de la co-expresión de la red de señalización de las Rho GTPasas y sus reguladores en muestras de NB. Se realizó una correlación de los valores de expresión de la red de señalización de la familia de interés. Datos de la cohorte GSE45457. Se pueden observar diferentes clusters de correlación a nivel de expresión en pacientes de NB, que incluyen Rho GTPasas y reguladores/efectores. Las Rho GTPasas incluidas en cada cluster se señalan en negrita. 1 2 3 4 5 CLUSTER 1. PIK3R1, DOCK4,MYO9A,ARHGAP21 , FAM13B, ARHGEF7, PAK3, OPHN1, RND3, RHOU, RAC1, ARHGAP28, TIAM2, RALBP1, SRGAP1, AGAP4, OBSCN,ARHGEF12,CDC42 BPA,ALS2, CHNA1, DOCK7, ARHGAP32,PAK7,WASF1,P LEKHG5,ARHGEF37,ARHG AP22,ARHGEF10L,ARHGA P23,MCF2L,ARHGEF11,FA RP2,DOCK3,DOCK9,ARHG AP12,SPATA13,VAMP3,CD C42,ARHGEF3,DLC1,RAPG EF5,FGD6,ITSN2,CDC42SE 2,DOCK11,ARHGAP44,ARH GP26,CDC42BPB,RHOQ,R OCK2,XIAP,PAK2,ARHGAP 5,ITSN1,SOS1,ARHGEF2,A RHGEF28,RHOBTB1,WASL ,PARD3 CLUSTER 2. ARHGEF6, ARHGAP15,ARHGDIB,DOC K8, DOCK2, ARAP2, PREX1, ARHGAP4, VAV1, VAV3,ARHGAP30,RAC2,A RHGAP9,TAGAP,RHOH,AR HGAP25,FGD3,ARHGEF1, ARHGAP6,PLEKHG1,ARH GAP18,DOCK1,IQGAP1,AR HGAP24,IQGAP2,ARHGAP 31,RHOJ,STARD8,ARHGA P1,FGD5,STARD13,ARHG EF16,RHOB,RHOC,DOCK6 ,ARHGEF40,ARHGEF26,R HOA,ARHGAP10,WIPF1,LP AR5,RHOG,ARHGEF18,CD C42SE1, ARAP1, GMIP, WAS,FGD2,RHOD,CDC42B PG,CDC42EP2,RND1,PLE KHG2,ARGAP17, SRGAP2 CLUSTER 3. PLEKHG2, ARHGAP17, SRGAP2, LIMK1, PAK6, ARHGAP39, RHOBTB2, CDC42EP4, RND2, PAK1, ARHGEF25, ARHGAP35, ARHGDIG, ARHGEF4 CLUSTER 4. CDC42EP5, TRIO,ARHGAP33,SRGAP3, ROCK1,PLEKHG6,ARHGE F38,ARHGEF39,TIAM1,AR HGEF15,SH3BP1,CDC42E P1,SYDE1,FGD1,RHOV,RA C3,PAK4,ARHGAP27,ARH GDIA,PARD6A, IQGAP3 CLUSTER 5. PLEKHG4B, CDC42EP3,PARD6B,DEPD C1,RACGAP1,ARHGAP11A , ECT2, DEPDC1B
Resultados 120 El cluster 1 contiene genes cuya expresión correlaciona positivamente con la expresión de las Rho GTPasas CDC42, RAC1, RND3, RHOU, RHOQ y RHOBTB1. Dado que CDC42, RAC1, RND3 y RHOU están significativamente expresados a la baja en NB agresivos, cabe suponer que la mayoría de estos genes reguladores también se expresarán menos en las manifestaciones malignas de la enfermedad, y algunos de ellos podrían ser reguladores directos de estas Rho GTPasas o actuar en las mismas vías de señalización. De hecho, la mayoría de los genes presentes en el cluster 1 interaccionan de forma específica con Cdc42 o Rac1, como por ejemplo DOCK9, SPATA13, VAMP3, DLC1, ITSN2, DOCK11, ARHGAP21, ARHGEF7, PAK3, TIAM2, RALBP1, SRGAP1, CDC42BPA, DOCK7, ARHGAP32, PAK7, ARHGAP36, CDC42BPB, PAK2, ITSN1, WASL, y PARD3. A su vez, el cluster 2, más abundante en número, muestra correlación entre la mayoría de las Rho GTPasas restantes, es decir, RAC2, RHOH, RHOJ, RHOC, RHOB, RHOA, RHOG, RHOD y RND1. La tendencia de expresión de este grupo de GTPasas es heterogénea en relación a la progresión de la enfermedad, lo que demuestra la complejidad de la señalización de esta familia en la patología. En el cluster 3 aparecen las Rho GTPasas RHOBTB2 y RND2, y en el 4 RHOV y RAC3. Este heatmap ofrecería una perspectiva global de la expresión génica de estas vías de señalización en NB, lo que podría definir circuitos de expresión comunes de estos genes relacionados con el desarrollo de la patología (Figura 13, Anexos 4, 6 y 7). De manera complementaria a este análisis, con el fin de establecer una conexión más directa entre la alteración de la expresión de esta familia de proteínas en NB con parámetros clínicos discretos en los pacientes, se desarrolló un análisis de red de correlación ponderada (Weighted Correlation Network Analysis, WGCNA). Este análisis fue diseñado en sus inicios con el fin de analizar conjuntos de datos de microarrays, no solo para cuantificar la correlación entre genes y agruparlos jerárquicamente, sino para agrupar genes, expresados de manera similar, en módulos, en relación con otros parámetros, en este caso, parámetros particulares con relevancia clínica. Usando esta aproximación, se obtuvieron cuatro módulos diferentes, utilizando la base de datos GSE45547. En anexos se incluyen los resultados del análisis para los datos de las cohortes GSE49710 y TARGET (Figura 14, Anexos 5,6 y 7).
Resultados 127 Figura 17. Heatmap representando la expresión génica de la red de señalización de las GTPasas en diferentes tipos de patrones de expresión génica asociados a los tipos celulares en NB: ADRN (adrenérgico), MES (mesenquimal), NCC (células de la cresta neural) y línea celular NCC (línea celular de la cresta neural). Rho network: análisis (z-score) del patrón de expresión general del total de genes incluidos en la red de señalización de las Rho GTPasas analizados para cada muestra. Encuadrados los grupos de genes más expresados en MES (enriquecimiento) y grupos menos expresados. Datos de la cohorte GSE90803. 5. Utilidad predictiva de las vías de señalización por Rho GTPasas en el neuroblastoma agresivo Los análisis descritos muestran que la expresión de la familia de las Rho GTPasas, junto a sus reguladores y efectores, se encuentra alterada en NB en relación con parámetros asociados a la agresividad. Adicionalmente, como se trata en el apartado 1.3 de resultados de este trabajo de tesis doctoral, los niveles de expresión de Rho GTPasas pueden estratificar a los pacientes según su supervivencia mediante el análisis de Kaplan Meier (Figura 11). Por este motivo se planteó la hipótesis de si el análisis de la alteración de la expresión de esta familia de genes, podría utilizarse como herramienta pronóstica en pacientes de NB. Para ello, se llevó a cabo un IQGAP2 DOCK11 CDC42EP4 WASL ARHGEF11 FAM13B ARHGAP21 ROCK2 ARHGAP12 IQGAP3 DEPDC1 WIPF1 XIAP RHOF ARHGEF16 LIMK1 DOCK1 ARHGEF10L ARHGEF1 ARHGAP44 CDC42SE2 RAC1 ARHGEF2 ITSN1 ARHGEF18 ARHGDIA ROCK1 RALBP1 PAK4 DOCK9 SPATA13 ARHGEF26 DOCK7 ARHGAP32 GMIP ARHGAP35 TIAM2 DOCK8 WAS TAGAP SRGAP1 ARHGAP22 FGD6 ARHGEF28 PLEKHG1 CDC42BPG RHOH ITSN2 ARHGAP27 SRGAP2 CDC42BPA OPHN1 RHOB SH3BP1 PLEKHG6 PLEKHG2 ARHGAP30 ARHGEF6 CDC42 LPAR5 CDC42SE1 ARHGEF3 FARP2 ARHGAP9 ARHGAP10 PARD3B DOCK6 ARHGAP24 CDC42BPB ARHGAP31 VAMP3 RHOG IQGAP1 DOCK2 CDC42EP1 ARHGAP23 SYDE1 ARHGAP1 ARAP2 RND3 RHOJ LPAR6 RHOQ ARHGEF12 STARD13 ARHGAP17 FGD1 STARD8 RHOD RHOA DLC1 RHOC CDC42EP5 ARHGDIB PLEKHG5 RAC2 ARHGAP18 CDC42EP2 ARHGEF40 ARAP1 FGD5 DOCK3 RHOBTB1 ARHGEF38 ARHGEF37 ARHGEF15 CDC42EP3 ALS2 DOCK4 RAC3 ARHGAP28 ARHGDIG PLEKHG4B ARHGEF4 ARHGEF7 ARHGAP39 PAK7 PAK3 CHN1 MCF2L SRGAP3 RND2 PARD6A ARHGAP33 MYO9A PAK1 ARHGAP6 OBSCN VAV3 ARHGAP25 FGD2 PREX1 VAV1 ARHGAP15 RHOV PAK2 PAK6 RND1 ARHGAP4 TIAM1 RAPGEF5 RHOU PIK3R1 ARHGAP26 SOS1 ARHGEF25 PARD6B WASF1 ARHGEF39 RACGAP1 ECT2 DEPDC1B ARHGAP11A FGD3 AGAP4 Tipo celular gsm2413245 gsm2413244 gsm692872 gsm692857 gsm692865 gsm692863 gsm692859 gsm692868 gsm692870 gsm692873 gsm692854 gsm692866 gsm692871 gsm692864 gsm692876 gsm692867 gsm692862 gsm692877 gsm692861 gsm692860 gsm2413243 gsm2413254 gsm2413252 gsm2413256 gsm2413255 gsm2413253 gsm2413251 gsm692869 gsm2413250 gsm2413249 gsm2413261 gsm2413263 gsm2413262 gsm2413259 gsm2413260 gsm2413258 gsm2413257 gsm2413248 gsm2413247 gsm2413246 gsm2413241 gsm2413242 gsm2413240 gsm358750 gsm358747 gsm358751 gsm358745 gsm358752 gsm692856 gsm692858 gsm692855 gsm2413239 Score -3 3 Rho network ADRN MES NCC Línea celular NCC ARHGAP9 ARHGAP10 PARD3B DOCK6 ARHGAP24 CDC42BPB ARHGAP31 VAMP3 RHOG RHOA IQGAP1 DOCK2 ARHGAP23 SYDE1 ARHGAP1 ARAP2 RND3 RHOC RHOJ Enriquecimiento en MES/NCC Menos expresado en MES/NCC RHOV RHOU TIAM1 PAK2/6 RND1/2
Resultados 128 análisis tratando de dilucidar si se puede identificar una firma de expresión génica mínima asociada a esta familia, que pudiera determinar la supervivencia de los pacientes de NB. Se extrajeron de la base de datos TARGET los niveles de expresión génica de la misma familia de genes seleccionada para los anteriores análisis detallados en la Tabla 21, asociando la expresión a cada muestra y a la supervivencia total (Overall Survival, OS) de cada paciente. Se realizó una regresión de Cox para obtener una selección de genes, pertenecientes a esta familia, cuyos patrones de expresión en conjunto pudieran estratificar a los pacientes según su supervivencia total de forma precisa. La firma génica mínima obtenida incluyó los genes RND3, ARHGEF1, ARHGEF12, ARHGEF28, ARHGEF10L, FGD6, ARHGAP28, AGAP4, IQGAP3, ARHGDIA, PAK1, PAK2, PLEKHG4B y DOCK4 (Tabla 22). Los niveles de expresión de estos genes en conjunto son capaces de estratificar a los pacientes según su supervivencia. Cada gen posee un índice de pronóstico asociado (IP o PI). Este valor establece la contribución de cada gen a la predicción del pronóstico de la supervivencia en los pacientes. Los valores de expresión de los genes junto con el valor de contribución de cada gen al pronóstico (IP) da lugar a un valor final que se utilizaría para establecer el pronóstico de cada paciente (Tabla 22). Tabla 22. Firma de genes, relacionados con la red de señalización de las Rho GTPasas, con capacidad predictiva de la supervivencia total de los pacientes de NB. Se incluye el índice pronóstico asociado (IP). Se describe también la interacción más probable de los reguladores con las Rho GTPasas y la fuente de donde se obtiene esta información (interacción y/o referencia fuente). FIRMA IP Interacción Fuente RND3 -0.0779790 UniProtKB - P61587 (RND3_HUMAN) ARHGEF1 0.0273440 Subfamilia Rho , Cdc42 UniProtKB - Q92888 (ARHG1_HUMAN), Hercyk et al. 2019 ARHGEF12 -0.1031306 Subfamilia Rho UniProtKB - Q9NZN5 (ARHGC_HUMAN), Hipfner et al. 2020 ARHGEF10L -0.3381767 Subfamilia Rho UniProtKB - Q9HCE6 (ARGAL_HUMAN) FGD6 -0.0392346 Cdc42 Muller et al. 2020 ARHGEF28 0.0915955 RhoA UniProtKB - Q8N1W1 (ARG28_HUMAN) ARHGAP28 -0.2042008 Cdc42 Muller et al. 2020 AGAP4 0.1119222 UniProtKB - Q96P64 (AGAP4_HUMAN) IQGAP3 0.0762892 Cdc42, Rac1, Rac3 Morgan et al. 2019 ARHGDIA 0.2458740 RhoA, RhoC, Cdc42, Rac1, RhoG UniProtKB - P52565 (GDIR1_HUMAN) PAK1 -0.1663160 Subfamilia Cdc42 , Rac1,Rac2, RhoU UniProtKB - Q13153 (PAK1_HUMAN), Hipfner et al. 2020 PAK2 0.0934281 Subfamilias Cdc42 , Rac1, RhoU Hipfner et al. 2020 PLEKHG4B 0.1293651 Cdc42 Muller et al. 2020 DOCK4 -0.2734259 Cdc42 and Rac1 Hipfner et al. 2020 , Abraham et al. 2015
Resultados 129 A continuación, se procedió a estudiar la efectividad de la utilización de esta firma de genes para la predicción de la supervivencia en pacientes de NB, utilizando los coeficientes (IP) de cada gen, la expresión de los mismos en la cohorte TARGET y la supervivencia asociada a cada muestra. Como se puede observar en las curvas ROC (abreviatura del inglés, Receiver Operating Characteristic), en todos los casos el valor de predicción de la firma fue superior a 0.74 (de un máximo de 1) para diferentes tiempos, por lo tanto, la utilización de nuestra firma para la predicción de la supervivencia es considerablemente sensible y específica (Figura 18A, Anexo 10). Además, las muestras se dividieron en dos grupos, de alto y bajo riesgo, de acuerdo con su valor total de IP, mediante la realización de un análisis de estratificación de Kaplan Meier (Estratificación = strata en la figura, Figura 18B). Esta estratificación clasificó significativamente a los pacientes según su supervivencia (Figura 18B) (p<0.0001), por lo que la utilización de la expresión de estos genes podría tener relevancia en el pronóstico de la enfermedad. Las muestras con un valor final de índice pronóstico más elevado (IP alto o high) se asocian a pacientes con una peor supervivencia. A continuación, se realizó un análisis de Cox Univariable para comparar la utilización de la firma Rho con otras variables clínicas en su capacidad de predicción de supervivencia. En este caso, el cociente de riesgo (Hazard ratio, Hr) determina el valor de la contribución de las variables clínicas a la predicción del pronóstico. Este cociente de riesgo fue especialmente significativo para el valor de la mediana de nuestra firma génica, o valor IP/PI (Hr = 5.43, p<0.0001), en comparación con otras variables clínicas utilizadas en el pronóstico como el estadio o la amplificación del oncogén MYCN (Figura 18C).
Resultados 130 Figura 18. Análisis de la firma de genes de la red de señalización de Rho en el proceso de training con la base de datos TARGET. A) Análisis de área bajo la curva (AUC) en curvas ROC de la capacidad de predicción del pronóstico de la firma de genes Rho y la supervivencia total de los pacientes de NB durante los tres primeros años desde el diagnóstico (t = tiempo en días, FP = falsos positivos o especifidad, TP = positivos o sensibilidad). B) Análisis de Kaplan Meier utilizando el índice de pronóstico (IP) de la firma de genes Rho. Las muestras con valores más elevados de PI poseen una menor supervivencia que el grupo de muestras que poseen un menor PI (Strata: clasificación de los pacientes en datos de supervivencia según el valor de PI, PI High = altos valores de PI, mayor riesgo en la enfermedad, PI Low = bajos valores de PI, menor riesgo en la enfermedad). C) Cociente de riesgo (Hazard ratio, Hr)
Resultados 131 obtenido de un Análisis de Cox Univariable para el valor de IP junto con otros parámetros clínicos en relación a la supervivencia total de los pacientes (valor de la p = Likelihood ratio test, Wald test and logRank test). Figura 19. Validación de la firma de genes de la red de señalización de Rho en otra cohorte de muestras. A) Análisis de área bajo la curva (AUC) de la capacidad de predicción, de la firma de genes Rho, sobre la supervivencia total de los pacientes de NB durante los tres primeros años desde el diagnóstico (t = tiempo en días, FP = falsos positivos o especifidad, TP = positivos o sensibilidad). B) Análisis de Kaplan Meier utilizando el índice de pronóstico (PI) de la firma de genes Rho. Las muestras con valores más elevados de PI poseen una menor supervivencia que el grupo de muestras que poseen un menor PI (Strata: clasificación de los pacientes en datos de supervivencia según el valor de PI, PI High= altos valores de PI, mayor riesgo en la enfermedad, PI
Resultados 132 Low = bajos valores de PI, menor riesgo en la enfermedad). C) Cociente de riesgo (Hazard ratio, Hr) obtenido de un Análisis de Cox Univariable para el valor de PI junto con otros parámetros clínicos en relación a la supervivencia total de los pacientes (valor de la p = Likelihood ratio test, Wald test and logRank test). Datos de la cohorte GSE49710. Adicionalmente, se realizó un análisis de validación de la firma, para asegurar la utilidad de este grupo de genes en otra cohorte de pacientes (GSE49710). La firma obtenida del primer análisis también fue capaz de predecir la supervivencia de los pacientes en esta nueva cohorte a distintos tiempos (AUC > 0.68), y estratificar significativamente a los pacientes según su supervivencia (p<0.0001) (Figura 19A, B, Anexo 10). Se llevó a cabo, adicionalmente, un análisis de Cox univariable de la firma y otros parámetros clínicos utilizados para la predicción del pronóstico en la cohorte de datos GSE49710, y se pudo observar que también fue significativo para la firma generada (IP/PI Hr=1.3, p<0.0001), aunque sin tanta diferencia con otros parámetros clínicos utilizados, como la amplificación de MYCN o el estadio. Por lo tanto, el estudio de la expresión de este grupo de genes relacionados con la regulación de la familia de las Rho GTPasas podría ser de utilidad para la predicción de la supervivencia en pacientes de NB. La mayoría de genes presentes en esta firma son reguladores de la actividad GTPasa, y no GTPasas propiamente dichas, por lo que con el fin de establecer una relación entre esta firma y su función en la señalización relacionada con las Rho GTPasas, se realizó un Análisis de Enriquecimiento Funcional de Redes de Interacción Proteína-Proteína (Protein-Protein Interaction Networks Functional Enrichment Analysis; Plataforma STRING). Las proteínas con mayor probabilidad de interacción funcional con los integrantes de la firma son Cdc42 (puntuación = 0.999), RhoA (0.999), NGFR o p75 (0.997), RhoC (0.996) y Rac3 (0.996) (Tabla 23). Tabla 23. Análisis de predicción de las proteínas con mayor posibilidad de interacción con los genes pertenecientes a la firma (Plataforma STRING). Neighborhood: grupos de genes que frecuentemente se observan como vecinos a nivel genómico. Gene fusion: genes que aparecen como fusiones en un único marco de lectura. Coocurrence: familias de genes cuyos patrones de ocurrencia son similares entre genomas. Experiments: experimentos de co-purificación, cocristalización o interacción genética importados de la bibliografía. Databases: vías de señalización conocidas, complejos proteicos de bases de datos revisadas.
Resultados 133 Textmining: búsqueda de proteínas que normalmente aparecen mencionadas en conjunto. Homology: homología de unión entre proteínas. Score: puntuación final para la predicción de las interacciones más probables. Las casillas que aparecen en blanco, señalan que no se ha encontrado información acerca de esa proteína en referencia a la característica Tomando todos los análisis in silico anteriores en consideración, podemos concluir que existe una alteración general significativa de la familia de las Rho GTPasas y sus reguladores relacionada con factores asociados a agresividad en NB. En concreto, se observa un patrón de desregulación de la expresión de la familia en relación con la progresión de la enfermedad. Por ejemplo, los genes que codifican para las proteínas Rho GTPasas Cdc42 o RhoB se encuentran menos expresadas en los casos de estadio agresivo, alto riesgo, casos con amplificación del oncogén MYCN o eventos de recaídas. Cdc42 además aparece como una de las más relevantes en los grupos de GTPasas que correlacionan en expresión con algunos de sus reguladores y efectores, y que a su vez se encuentra relacionada con parámetros clínicos. Además, esta GTPasa es la proteína que interacciona con más probabilidad con las proteínas codificadas por los genes incluidos en la firma de supervivencia, por lo tanto, la señalización controlada por Cdc42 parece estar involucrada en la progresión de la enfermedad. Una vez descrita la alteración a nivel de expresión de esta compleja familia de proteínas, en distintas cohortes de pacientes de NB, quisimos estudiar la función biológica que estas proteínas podían estar jugando en la fisiopatología de la enfermedad, utilizando modelos in vitro e in vivo. Proteínas con homología predecida Neighborhood Gene fusion Coocurence Coexpression Experiments Databases Textmining Homology Score CDC42 0.999 RHOA 0.999 NGFR 0.997 RHOC 0.996 RAC3 0.996
Resultados 134 6. Obtención y caracterización de cultivos celulares derivados de xenoinjertos procedentes de pacientes La generación de modelos experimentales de NB, que sean representativos de la enfermedad en los pacientes, sigue siendo un tema de especial interés en el campo. De hecho, se considera que uno de los modelos más establecidos, el ratón transgénico TH-MYCN, se caracteriza por poseer una naturaleza celular mayoritariamente adrenérgica, por lo que no recapitula otros tipos de NB humanos de gran relevancia como los NB de alto riesgo con características mesenquimales (Huertas-Castaño et al., 2019; Jansky et al., 2021). En el contexto de este trabajo de tesis doctoral, con el objetivo de generar un modelo de estudio de NB de mayor relevancia para la patología, se generaron 3 cultivos celulares primarios procedentes de xenoinjertos derivados de muestras de pacientes (PDXs, del inglés Patientderived xenografts; detalles en tabla 9), y crecidos en ratones inmunocomprometidos, según el protocolo indicado en el apartado 5 de Materiales y Métodos. Los cultivos generados a partir de estos tumores xenotransplantados poseían un fenotipo heterogéneo. En ellos se podían observar una mayor proporción de células con morfología neuronal, y otra población, menos abundante, de aspecto más migratorio o mesenquimal (Figura 20A). Se llevó a cabo una caracterización y evaluación funcional de las células aisladas, con el fin de conocer su capacidad tumorigénica y la expresión de marcadores tras el proceso de cultivo. Para ello, en primer lugar, se realizaron tinciones de inmunofluorescencia con marcadores exclusivos de célula humana (mitocondria humana, hMit), marcadores de células del linaje adrenérgico (Dopamina Descarboxilasa (DDC) y -Tubulina tipo III (Tuj-1)), marcador estromal (actina de músculo liso (SMA)), marcadores de célula indiferenciada (CD44 y Nestina (Nes)) y marcador de proliferación (Ki67). (Figura 20B). El porcentaje de expresión del marcador de mitocondria humana hMit para los cultivos NB48T y NB39T era 97.8±2.46% y 99.6±1.56% respectivamente (Media ± SEM%), por lo que se consideró que se había conseguido aislar un cultivo puro de células de origen humano. Las células que no eran positivas para el marcaje de mitocondria humana eran positivas para el marcador SMA. Estas células se consideraron remanentes del estroma celular del ratón en el que se injerta la biopsia original. Así mismo, los porcentajes de células positivas con los marcadores del linaje adrenérgico DDC y Tuj-1 fueron 50.15±20.60% y 46.05±28.28% respectivamente para el cultivo NB39T y de 62.69±17.83% y 47.45±25.19% respectivamente para el cultivo NB48T. La expresión de los marcadores de indiferenciación Nes y CD44 fue 74.80±14.37% y
Resultados 135 6.776±2.06% en el cultivo NB48T, y el porcentaje de células Nes en el cultivo NB39T fue de 58.78±1.65%. En el cultivo NB39T no se identificaron células CD44 positivas mediante inmunofluorescencia. Adicionalmente, se caracterizó la cantidad de células proliferativas en cada cultivo mediante el uso del marcador de proliferación Ki67. Para el cultivo NB48T el porcentaje de células positivas para este marcador fue 34.78±3.88% y para el cultivo NB39T 46.95±14.14%. De forma simultánea, se analizó la expresión de otros marcadores propios de células de NB mediante citometría de flujo. Se utilizó el marcador CD45 de ratón para detectar la presencia de células del estroma celular de ratón. Además, se incluyeron los marcadores CD133 y CD44, propios de células indiferenciadas, GD2, marcador de células de NB y el marcador del linaje simpatoadrenal Tirosina Hidroxilasa (TH). La expresión de marcadores de indiferenciación CD133 y CD44 fue muy parecida a lo ya descrito en otros estudios de NB, entre un 0.1 y un 0.6%, en el que un 0.1% de la población total co-expresaba ambos receptores. La expresión del marcador TH era más variable dependiendo del cultivo, con un 16-70% de las células positivas para este marcador, mientras que un 40% de la población expresaba el marcador de células de NB, GD2 (Figura 20D). Adicionalmente, con estas células primarias obtenidas en cultivo a partir de los PDXs se llevaron a cabo ensayos funcionales de iniciación tumoral y de capacidad de formación de tumoresferas. El cultivo de tumoresferas en condiciones de baja adherencia permite el enriquecimiento de poblaciones celulares de NB de carácter progenitor o indiferenciado, para su caracterización y/o estudio funcional (descrito en el apartado 18 de Materiales y Métodos y en (Amador-Álvarez et al., 2022)). Los cultivos generados conservan la capacidad de volver a formar tumores en ratones inmunocomprometidos tras el proceso de cultivo y de formar tumoresferas durante al menos tres pases consecutivos (Figura 20A, E). La tumoresferas resultantes de estos cultivos se caracterizaron mediante inmunofluorescencia. En las secciones de las esferas podían observarse células que expresaban marcadores de indiferenciación como Nestina y CD44, y otras que expresaban DDC (Figura 20C).
Resultados 136 Figura 20. Caracterización de cultivos celulares derivados de PDX. A) Micrografías de campo claro de: Izquierda. Cultivo adherente del PDX CC NB48T Cultivo adherente 0 50 100 NB48T Cél. ratón HMit SMA Nes Tuj1 DDC Ki67 CD44 0 50 100 NB39T % Céls. positivas % Céls. positivas A) Cél. ratón HMit SMA Nes Tuj1 DDC Ki67 CD44 B) hMit/Tuj1/DAPI CD44/Ki67/DAPI SMA/DDC/DAPI CC hMit Tuj1 CD44 Ki67 SMA DDC CD44/DDC/DAPI CD44/Nes/DAPI CD44 CD44 DDC Nes CC NB39T Tumoresferas NB48T NB48T NB48T NB39T NB39T C) 50 100 150 200 250 FSC-W FSC-A 50 100 150 200 250 SSC-A 50 100 150 200 250 NB48T CD133 CD44 CD133+ CD44+ CD133+ CD44+ TH+ GD2+ 0.0 0.5 1.0 50 100 % Céls. positivas CD133+ CD44+ CD133+ CD44+ TH+ GD2+ 0.0 0.5 1.0 50 100 NB48T NB39T 1 0 2 1 0 3 1 0 4 1 0 5 1 0 2 103 104 105 D) 102 1 0 3 1 0 4 1 0 5 CD133 TH E) 102 103 104 105 0 0 0,1% 63% 0,4%8,5% 49,8% 0,1% 0,2% 0,2% Crecimiento tumoral (mm2) SCID 1394 SCID 1395 SCID 1396 SCID 1397 SCID 1398 SCID 1399 SCID 1400 0 5 10 15 0 50 100 150 200 Tiempo (sem) % Céls. positivas
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Anexos
Anexos 259 Anexo 1.1. Análisis de la expresión de la subfamilia Rho de las Rho GTPasas en base a diferentes parámetros clínicos y cohortes de pacientes de NB. Representación gráfica de la distribución de expresión de la subfamilia Rho en pacientes clasificados según: a) el estadio dentro de la clasificación INSS a la hora del diagnóstico. Datos de la cohorte GSE45547. b) el estado de amplificación del oncogén MYCN. Datos de la cohorte GSE45547. c) el riesgo dentro de la clasificación INRG. Base de datos GSE49470. d) la histología (Hist) de la biopsia. Base de datos TARGET. e) la firma de expresión génica asociadas a los tipos celulares: ADRN (adrenérgico), MES (mesenquimal) y NCC (células cresta neural). Base de datos GSE90803. f) la expresión del estado de la Rho GTPasa en el tumor primario o la recaída. Base de datos GSE65303. g) casos de tumores que progresan frente a tumores que no sufren eventos de progresión o recaída. Base de datos GSE16476. (Boxplots expresado en percentil 10-90. Test estadístico de la t-Student, sin anotación = no significativo, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). 5 10 15 20 5 10 15 20 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 5 10 15 Estadio 1&2 Estadio 3 Estadio 4 Estadio 4s ADRN CCN MES MYCN no amp MYCN amp Progresión No evento Recaída Tumor Alto riesgo Bajo riesgo Hist indiferenciada Hist diferenciada RHOA RHOB RHOC RHOA RHOB RHOC RHOA RHOB RHOC RHOA RHOB RHOC RHOA RHOB RHOC RHOA RHOB RHOC RHOA RHOB RHOC *** ***** *** **** * **** **** **** **** ** ** ** ** **** ** **** **** 2log expresión2log expresión2log expresión a) b) c) d) e) f) g)
Anexos 260 Anexo 1.2. Análisis de la expresión de la subfamilia RhoD de las Rho GTPasas en base a diferentes parámetros clínicos y cohortes de pacientes de NB. Representación gráfica de la distribución de expresión de la subfamilia Rho en pacientes clasificados según: a) el estadio dentro de la clasificación INSS a la hora del diagnóstico. Datos de la cohorte GSE45547. b) el estado de amplificación del oncogén MYCN. Datos de la cohorte GSE45547. c) el riesgo dentro de la clasificación INRG. Base de datos GSE49470. d) la histología (Hist) de la biopsia. Base de datos TARGET. e) la firma de expresión génica asociadas a los tipos celulares: ADRN (adrenérgico), MES (mesenquimal) y NCC (células cresta neural). Base de datos GSE90803. f) la expresión del estado de la Rho GTPasa en el tumor primario o la recaída. Base de datos GSE65303. g) casos de tumores que progresan frente a tumores que no sufren eventos de progresión o recaída. Base de datos GSE16476. (Boxplots expresado en percentil 10-90. Test estadístico de la t-Student, sin anotación = no significativo, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). 0 5 10 15 0 5 10 15 5 6 7 8 9 10 5 6 7 8 9 10 0 5 10 15 0 5 10 5 10 15 Estadio 1&2 Estadio 3 Estadio 4 Estadio 4s ADRN CCN MES MYCN no amp MYCN amp Progresión No evento Recaída Tumor Alto riesgo Bajo riesgo Hist indiferenciada Hist diferenciada RHOD RHOF RHOD RHOF RHOD RHOF RHOD RHOF RHOD RHOF RHOD RHOF RHOD RHOF 2log expresión2log expresión2log expresión ***** **** **** ** *** ** ** ** a) b) c) d) e) f) g)
Anexos 261 Anexo 1.3. Análisis de la expresión de la subfamilia RhoH de las Rho GTPasas en base a diferentes parámetros clínicos y cohortes de pacientes de NB. Representación gráfica de la distribución de expresión de la subfamilia Rho en pacientes clasificados según: a) el estadio dentro de la clasificación INSS a la hora del diagnóstico. Datos de la cohorte GSE45547. b) el estado de amplificación del oncogén MYCN. Datos de la cohorte GSE45547. c) el riesgo dentro de la clasificación INRG. Base de datos GSE49470. d) la histología (Hist) de la biopsia. Base de datos TARGET. e) la firma de expresión génica asociadas a los tipos celulares: ADRN (adrenérgico), MES (mesenquimal) y NCC (células cresta neural). Base de datos GSE90803. f) la expresión del estado de la Rho GTPasa en el tumor primario o la recaída. Base de datos GSE65303. g) casos de tumores que progresan frente a tumores que no sufren eventos de progresión o recaída. Base de datos GSE16476. (Boxplots expresado en percentil 10-90. Test estadístico de la t-Student, sin anotación = no significativo, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 * 0 5 10 15 0 5 10 15 0 5 5 6 7 8 9 10 0 5 10 Estadio 1&2 Estadio 3 Estadio 4 Estadio 4s ADRN CCN MES MYCN no amp MYCN amp Progresión No evento Recaída Tumor Alto riesgo Bajo riesgo Hist indiferenciada Hist diferenciada RHOH RHOH RHOH RHOH RHOH RHOH RHOH 2log expresión 2log expresión2log expresión ** *** **** **** a) b) c) d) e) f) g)
Anexos 262 Anexo 1.4. Análisis de la expresión de la subfamilia Cdc42 de las Rho GTPasas en base a diferentes parámetros clínicos y cohortes de pacientes de NB. Representación gráfica de la distribución de expresión de la subfamilia Rho en pacientes clasificados según: a) el estadio dentro de la clasificación INSS a la hora del diagnóstico. Datos de la cohorte GSE45547. b) el estado de amplificación del oncogén MYCN. Datos de la cohorte GSE45547. c) el riesgo dentro de la clasificación INRG. Base de datos GSE49470. d) la histología (Hist) de la biopsia. Base de datos TARGET. e) la firma de expresión génica asociadas a los tipos celulares: ADRN (adrenérgico), MES (mesenquimal) y NCC (células cresta neural). Base de datos GSE90803. f) la expresión del estado de la Rho GTPasa en el tumor primario o la recaída. Base de datos GSE65303. g) casos de tumores que progresan frente a tumores que no sufren eventos de progresión o recaída. Base de datos GSE16476. (Boxplots expresado en percentil 10-90. Test estadístico de la t-Student, sin anotación = no significativo, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001).
Anexos 263 Anexo 1.4. Análisis de la expresión de la subfamilia Rac de las Rho GTPasas en base a diferentes parámetros clínicos y cohortes de pacientes de NB. Representación gráfica de la distribución de expresión de la subfamilia Rho en pacientes clasificados según: a) el estadio dentro de la clasificación INSS a la hora del diagnóstico. Datos de la cohorte GSE45547. b) el estado de amplificación del oncogén MYCN. Datos de la cohorte GSE45547. c) el riesgo dentro de la clasificación INRG. Base de datos GSE49470. d) la histología (Hist) de la biopsia. Base de datos TARGET. e) la firma de expresión génica asociadas a los tipos celulares: ADRN (adrenérgico), MES (mesenquimal) y NCC (células cresta neural). Base de datos GSE90803. f) la expresión del estado de la Rho GTPasa en el tumor primario o la recaída. Base de datos GSE65303. g) casos de tumores que progresan frente a tumores que no sufren eventos de progresión o recaída. Base de datos GSE16476. (Boxplots expresado en percentil 10-90. Test estadístico de la t-Student, sin anotación = no significativo, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001).
Anexos 264 Anexo 1.6. Análisis de la expresión de la subfamilia Rnd de las Rho GTPasas en base a diferentes parámetros clínicos y cohortes de pacientes de NB. Representación gráfica de la distribución de expresión de la subfamilia Rho en pacientes clasificados según: a) el estadio dentro de la clasificación INSS a la hora del diagnóstico. Datos de la cohorte GSE45547. b) el estado de amplificación del oncogén MYCN. Datos de la cohorte GSE45547. c) el riesgo dentro de la clasificación INRG. Base de datos GSE49470. d) la histología (Hist) de la biopsia. Base de datos TARGET. e) la firma de expresión génica asociadas a los tipos celulares: ADRN (adrenérgico), MES (mesenquimal) y NCC (células cresta neural). Base de datos GSE90803. f) la expresión del estado de la Rho GTPasa en el tumor primario o la recaída. Base de datos GSE65303. g) casos de tumores que progresan frente a tumores que no sufren eventos de progresión o recaída. Base de datos GSE16476. (Boxplots expresado en percentil 10-90. Test estadístico de la t-Student, sin anotación = no significativo, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001). 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 0 5 10 15 0 5 10 15 0 5 10 15 0 5 10 15 Estadio 1&2 Estadio 3 Estadio 4 Estadio 4s ADRN CCN MES MYCN no amp MYCN amp Progresión No evento Recaída Tumor Alto riesgo Bajo riesgo Hist indiferenciada Hist diferenciada RND1 RND2 RND3 RND1 RND2 RND3 RND1 RND2 RND3 RND1 RND2 RND3 RND1 RND2 RND3 RND1 RND2 RND3 RND1 RND2 RND3 2log expresión2log expresión2log expresión *** ** *** **** ******* *** *** **** **** ** ** *** ** **** **** ** * ** * a) b) c) d) e) f) g)
Anexos 271 ggplot2, circlize y complexheatmap del software R y los valores de expresión de las bases de datos. Datos de las cohortes TARGET y GSE49710. Anexo 5. Análisis WGCNA a) Preanálisis de parámetros clínicos y agrupación de pacientes que se contemplan en el análisis. b) Análisis de la topología de redes (network topology) en base a diferentes soft thresholding powers: Scale Free Topology y Mean Connectivity. c) Agrupación de diferentes grupos de genes en relación a su coexpresión y su relación con parámetros clínicos. d) Dendograma de la agrupación de genes con disimilitudes topológicas junto con los módulos correspondientes a cada agrupación preanálisis y postanálisis de simplificación de módulos. Datos de la cohorte GSE45547
Anexos 272 Anexo 6. Análisis de similitud o Jaccard entre los mapas de coexpresión de la familia Rho en diferentes cohortes de pacientes (Anexo 4) y módulos obtenidos del análisis tipo WGCNA de las mismas bases de datos. a) Base de datos GSE49710 b) Base de datos TARGET. (Valor superior = R (valor de correlación), Valor inferior= valor de la p. Escala de -1 a 1 en el análisis WGCNA y de 0 a 1 en análisis de similitud representados en una escala de color ascendente). Anexo 7. Lista de genes incluidos en los módulos obtenidos del análisis WGCNA de la familia Rho de las bases de datos TARGET y GSE49710. TARGET MODULE A: ARHGEF37, ARHGEF39, ECT2, ARHGAP27, RACGAP1, ARHGAP11A, DEPDC1B, CHN1, DEPDC1, SOS1, TIAM1, WASF1, IQGAP3, PAK6, PAK2, LIMK1, PLEKHG4B MODULE B: RHOA, RHOB, RHOC, RHOF, RHOH, CDC42, RHOJ, RAC1, RAC2, RHOG ARHGEF25, ARHGEF26, ARHGEF1, ARHGEF15, ARHGEF3, ARHGEF18, ARHGEF40, ARHGEF6, FGD1, FGD2, FGD3, FGD5, ROCK1, RAPGEF5, VAV1 VAV3, PREX1, STARD13, STARD8, ARHGAP1, ARHGAP30, ARHGAP25, ARHGAP4, ARHGAP33, ARHGAP9, ARHGAP17, ARHGAP10, ARHGAP12, ARHGAP24, ARHGAP15, TAGAP, FAM13B, SRGAP3, ARHGAP6, ARHGAP18, ARAP1, ARAP2, OBSCN, GMIP, SYDE1, TRIO, WAS, PARD3B, SPATA13, IQGAP1, IQGAP2, XIAP, ARHGDIB, PAK7, LPAR5, LPAR6, DOCK6, DOCK1, DOCK8, CDC42EP1, CDC42EP5, CDC42SE1, CDC42SE2, ITSN2, VAMP3, WIPF1, DOCK2, DOCK9, DOCK11 MODULE C: RHOD, RHOQ, RAC3, RND1, RND2, RND3, RHOU, RHOV, RHOBTB1, ARHGEF7, ARHGEF12, ARHGEF2, ARHGEF2, ARHGEF11, ARHGEF16, ARHGEF10L, ARHGEF4, ARHGE38, PIK3R1, FARP2 FGD6, ROCK2, ARHGAP32, ARHGAP26, ARHGAP44, ARHGAP28, ARHGAP21, ARHGAP35, ARHGAP22, RALBP1, AGAP4, SRGAP1, DLC1, MYO9A, OPHN1, MCF2L, TIAM2, WASL, PARD6A, PARD6B , ARHGDIA, ARHGDIG, PAK1, PAK4, PAK3, CDC42BPA, CDC42BPB, CDC42BPG, CDC42EP2, CDC42EP3, CDC42EP4, PLEKHG2, PLEKHG5, PLEKHG6, ITSN1, ALS2 SH3BP1, DOCK4, DOCK7 GSE49710 TARGET
Anexos 273 GSE49710 MODULE A: RHOB, RHOC, RHOF, RHOH, RHOJ, RAC2, RHOG, ARHGEF26, ARHGEF1, ARHGEF18,ARHGEF40, ARHGEF6, ARHGEF16, FGD3, FGD5, VAV1, VAV3, PREX1, STARD13, STARD8, ARHGAP30, ARHGAP25, ARHGAP4, ARHGAP9, ARHGAP17, ARHGAP10, ARHGAP24, ARHGAP31, ARHGAP15, TAGAP, ARHGAP6, ARHGAP18, ARAP1, ARAP2, GMIP, SPATA13, IQGAP1, IQGAP2, ARHGDIB, LPAR5, LPAR6, DOCK6, DOCK1, DOCK8, CDC42SE1, CDC42SE2, PLEKHG1, PLEKHG2, ITSN2, WIPF1, DOCK2, DOCK9 MODULE B: ARHGEF15, ARHGEF2, ARHGEF39, ARHGEF38, FGD1, FGD2, ROCK1, ROCK2, ARHGAP33, ARHGAP27, SRGAP3, SYDE1, SOS1, TIAM1, TRIO, WAS, IQGAP3, ARHGDIA, PAK4, CDC42BPG, CDC42EP1, CDC42EP2, CDC42EP5, PLEKHG6, SH3BP1 MODULE C: RHOA, RND2, ARHGEF25, ARHGEF7, ARHGEF12, ARHGEF3, ARHGEF11, ARHGEF10L, ARHGEF37, PIK3R1, FARP2, FGD6, RAPGEF5, ARHGAP1, ARHGAP32, ARHGAP39, ARHGAP26, ARHGAP12, ARHGAP23, ARHGAP28, ARHGAP21, ARHGAP35, ARHGAP22, RALBP1, AGAP4, FAM13B, SRGAP1, DLC1, MYO9A, OPHN1, MCF2L, OBSCN, CHN1, TIAM2, WASL, WASF1, PARD6B, PARD3B, XIAP, ARHGDIG, PAK1, PAK6, PAK7, PAK2, PAK3, CDC42BPA, CDC42BPB, CDC42EP4, LIMK1, PLEKHG5, ITSN1, ALS2, VAMP3, DOCK3, DOCK4, DOCK7, DOCK11 MODULE D: RHOD, CDC42, RHOQ, RAC1, RAC3, RND1, RND3, RHOU, RHOV, RHOBTB1, ARHGEF28, ARHGEF4, ECT2, ARHGAP44, RACGAP1, ARHGAP11A, SRGAP2, DEPDC1B, DEPDC1 PARD6A, CDC42EP3, PLEKHG4B Anexo 8. Tabla de vías de señalización obtenidas del análisis de enriquecimiento de vías de señalización realizado mediante la plataforma de Gene Ontology (Mi et al., 2019) de los grupos obtenidos del análisis Jaccard en los análisis de coexpresión a partir de la expresión de la familia Rho. Datos de la cohorte GSE45547. Se muestra el nº de referencia de la vía de señalización (REFLIST), el nº de genes coincidentes (upload_1), el nº de genes que estimaba identificar (upload_1 expected), el grado de enriquecimiento de la vía de señalización (upload_1 (fold enrichment) y la estadística (upload_1 raw p value y FDR). Anexo 8_Tesis Doctoral Mara de los Ángeles Gmez Muoz.xlsx
Anexos 274 Anexo 9. Ampliación del heatmap de expresión el grupo de señalización de las Rho GTPasas clasificadas según expresión en diferentes tipos celulares. Adrenérgico IQGAP2 DOCK11 CDC42EP4 WASL ARHGEF11 FAM13B ARHGAP21 ROCK2 ARHGAP12 IQGAP3 DEPDC1 WIPF1 XIAP RHOF ARHGEF16 LIMK1 DOCK1 ARHGEF10L ARHGEF1 ARHGAP44 CDC42SE2 RAC1 ARHGEF2 ITSN1 ARHGEF18 ARHGDIA ROCK1 RALBP1 PAK4 DOCK9 SPATA13 ARHGEF26 DOCK7 ARHGAP32 GMIP ARHGAP35 TIAM2 DOCK8 WAS TAGAP SRGAP1 ARHGAP22 FGD6 ARHGEF28 PLEKHG1 CDC42BPG RHOH ITSN2 ARHGAP27 SRGAP2 CDC42BPA OPHN1 RHOB SH3BP1 PLEKHG6 PLEKHG2 ARHGAP30 ARHGEF6 CDC42 LPAR5 CDC42SE1 ARHGEF3 FARP2 ARHGAP9 ARHGAP10 PARD3B DOCK6 ARHGAP24 CDC42BPB ARHGAP31 VAMP3 RHOG IQGAP1 DOCK2 CDC42EP1 ARHGAP23 SYDE1 ARHGAP1 ARAP2 RND3 RHOJ LPAR6 RHOQ ARHGEF12 STARD13 ARHGAP17 FGD1 STARD8 RHOD RHOA DLC1 RHOC CDC42EP5 ARHGDIB PLEKHG5 RAC2 ARHGAP18 CDC42EP2 ARHGEF40 ARAP1 FGD5 DOCK3 RHOBTB1 ARHGEF38 ARHGEF37 ARHGEF15 CDC42EP3 ALS2 DOCK4 RAC3 ARHGAP28 ARHGDIG PLEKHG4B ARHGEF4 ARHGEF7 ARHGAP39 PAK7 PAK3 CHN1 MCF2L SRGAP3 RND2 PARD6A ARHGAP33 MYO9A PAK1 ARHGAP6 OBSCN VAV3 ARHGAP25 FGD2 PREX1 VAV1 ARHGAP15 RHOV PAK2 PAK6 RND1 ARHGAP4 TIAM1 RAPGEF5 RHOU PIK3R1 ARHGAP26 SOS1 ARHGEF25 PARD6B WASF1 ARHGEF39 RACGAP1 ECT2 DEPDC1B ARHGAP11A FGD3 AGAP4 Tipo celular gsm2413245 gsm2413244 gsm692872 gsm692857 gsm692865 gsm692863 gsm692859 gsm692868 gsm692870 gsm692873 gsm692854 gsm692866 gsm692871 gsm692864 gsm692876 gsm692867 gsm692862 gsm692877 gsm692861 gsm692860 gsm2413243 gsm2413254 gsm2413252 gsm2413256 gsm2413255 gsm2413253 gsm2413251 gsm692869 gsm2413250 gsm2413249 gsm2413261 gsm2413263 gsm2413262 gsm2413259 gsm2413260 gsm2413258 gsm2413257 gsm2413248 gsm2413247 gsm2413246 gsm2413241 gsm2413242 gsm2413240 gsm358750 gsm358747 gsm358751 gsm358745 gsm358752 gsm692856 gsm692858 gsm692855 gsm2413239 Score -3 3 Rho network ADRN MES NCC Línea celular NCC
Anexos 275 (ADRN), mesenquimales (MES), NCC (células de la cresta neural) y línea celular NCC. Datos de la cohorte GSE90803 Análisis ROC Training
Anexos 276 Anexo 10. Análisis completo curvas ROC para los procesos de training y validation en relación a la firma de supervivencia de genes de la familia de las Rho GTPasas en NB. Análisis de área bajo la curva (AUC) de la capacidad de predicción del pronóstico de la firma de genes Rho y la supervivencia total de los pacientes de NB (t = tiempo en días, FP = falsos positivos o especifidad, TP = positivos o sensibilidad). Análisis ROC Validation
Anexos 277 Anexo 11. Análisis proteómica tipo Label Free cuantitativo líneas CHLA 20 control vs CHLA 20 GFP-Cdc42. Hoja 1) Proteínas que cambian de expresión con un valor de fold change >1.5 en la línea +GFP-Cdc42 versus la línea control. Hoja 2 y Hoja 3) Análisis funcional realizado a través de la utilización de la plataforma Gene Ontology (Mi et al. 2019) de las proteínas que aumentan su expresión en la línea +GFP-Cdc42 (up) y de las proteínas que disminuyen su expresión en la línea GFP-Cdc42 (down), respectivamente (fold change > 1.5). Se muestra el nº de referencia de la vía de señalización (REFLIST), el nº de genes coincidentes (upload_1), el nº de genes que estimaba identificar (upload_1 expected), el grado de enriquecimiento de la vía de señalización (upload_1 (fold enrichment) y la estadística (upload_1 raw p value y FDR): Anexo 11_Tesis Doctoral Mara de los Ángeles Gmez Muoz.xlsx
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