Caracterización de MYBBP como un nuevo gen supresor de tumores

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA MÉDICA Y BIOFÍSICA CARACTERIZACIÓN DE MYBBP1A COMO UN NUEVO GEN SUPRESOR DE TUMORES Blanca Felipe Abrio, licenciada en Biotecnología Tesis doctoral Director: Dr. Amancio Carnero Moya Instituto de Biomedicina de Sevilla 2017 CARACTERIZACIÓN DE MYBBP1A COMO UN NUEVO GEN SUPRESOR DE TUMORES Trabajo realizado en el grupo de Biología Molecular del Cáncer, del Departamento de Oncohematología y Genética del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), para optar al grado de doctora en Biología Molecular y Biomedicina. El trabajo ha sido financiado con una beca de Formación de Personal Universitario (FPU) del Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. Sevilla, Abril de 2017 La doctoranda, El director de la tesis, El tutor de la tesis, Blanca Felipe Abrio Dr. Amancio Carnero Moya Dr. Ricardo Pardal Redondo v RESUMEN El microambiente tumoral es un entorno heterogéneo y dinámico que se caracteriza por las constantes interacciones entre las células tumorales y las células del estroma y los continuos cambios en la distribución de nutrientes esenciales para el desarrollo del tumor. Frecuentemente se producen deficiencias locales y/o temporales en la vascularización del tumor que provocan la ausencia de glucosa, de oxígeno o de otros nutrientes esenciales para el desarrollo del mismo, generando situaciones con altos niveles de estrés celular. La caracterización de los mecanismos moleculares que favorecen la adaptación de las células tumorales a entornos críticos permitiría identificar nuevas dianas con potencial antitumoral. Por este motivo, realizamos un rastreo genético de pérdida de función en ausencia de glucosa en el que identificamos el gen MYB binding protein 1A (MYBBP1A). MYBBP1A es un regulador de factores de transcripción implicado en la regulación de varios procesos biológicos esenciales. En este trabajo hemos analizado muestras de tumores humanos, confirmando que la pérdida de MYBBP1A es un evento genético que se produce en tumores humanos, especialmente en tumores renales. Hemos analizado la expresión de MYBBP1A en una cohorte de 97 pacientes de cáncer renal, en la que hemos observado que la pérdida o reducción de la expresión de MYBBP1A se produce en el 8% de los tumores. Esta pérdida estaba asociada a la aparición de metástasis y peor pronóstico en términos de supervivencia libre de enfermedad y supervivencia global. En base a esta observación y a que se ha descrito que la degradación de MYBBP1A está regulada por pVHL, que se pierde frecuentemente en tumores renales, hemos utilizado líneas celulares de carcinoma renal para estudiar la posible función de MYBBP1A como supresor tumoral. Para estudiar el mecanismo molecular a través del cual MYBBP1A participaría en el proceso de tumorigénesis hemos analizado el efecto de la sobreexpresión y del silenciamiento de MYBBP1A en líneas celulares de carcinoma renal. La sobreexpresión de MYBBP1A suprime el crecimiento celular en todas las líneas celulares utilizadas independientemente del contexto molecular. Por otro lado, el silenciamiento de MYBBP1A induce el aumento de algunas propiedades tumorales en las líneas celulares que expresan c-MYB y no expresan pVHL. En estas líneas la reducción de la expresión de MYBBP1A induce la activación de c-MYB, conduciendo a la activación de la transcripción de sus genes diana CD34 y CXCR4 y al aumento del fenotipo equivalente a célula madre tumoral. Además de inducir el fenotipo de célula madre, hemos encontrado que c-MYB activa la transcripción de PGC-1α. Así mismo, la reducción de MYBBP1A activa a PGC-1α directa e indirectamente. De forma directa, la vi reducción de MYBBP1A permite la actividad de PGC-1α y de forma indirecta aumenta los niveles de PGC-1α a través de la activación de c-MYB. Finalmente, la activación de PGC-1α conduce al cambio metabólico de glucólisis a OXPHOS, el cual es más eficiente para producir ATP en condiciones de limitación de glucosa. Por tanto, la combinación de estos dos efectos como resultado de la disminución de la expresión de MYBBP1A proporciona una ventaja selectiva a las células tumorales. Además, hemos analizado la expresión de MYBBP1A y su correlación con la expresión de genes de vías de señalización implicadas en los procesos de iniciación y desarrollo tumoral. Hemos observado que la expresión de MYBBP1A correlaciona negativamente con la expresión de genes involucrados en el fenotipo de célula madre, identificando un subgrupo de carcinomas de células renales de células claras con un patrón de expresión característico. También hemos encontrado un conjunto de genes regulados transcripcionalmente por c-MYB cuya expresión correlaciona negativamente con MYBBP1A y positivamente con PGC-1α. Además, hemos identificado un subgrupo de tumores, en torno al 8% del total de las muestras, con un patrón de expresión característico: bajos niveles de expresión de MYBBP1A y altos niveles de expresión de PGC-1α y de los genes diana de c-MYB. Por último, hemos observado que la expresión de MYBBP1A correlaciona negativamente con la expresión de genes del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. También hemos encontrado que el 9% de las muestras tumorales presentan bajos niveles de expresión de MYBBP1A y altos niveles de expresión de los genes del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Por tanto, estos análisis bioinformáticos confirman nuestros datos experimentales. vii SUMMARY Tumor microenvironment is heterogeneous and dynamic due to constant tumor and stromal cells interactions and continuous changes in nutrient distribution that are essential for tumor development. Frequently, there is a local and/or temporal lack of efficient vasculature that leads to glucose, oxygen or other nutrients depletion, increasing the stress levels of tumor cells. Characterization of molecular mechanisms that enable tumor cells to adapt to host microenvironments would allow identifying new targets for cancer therapy. To this end, we have performed a genetic loss of function screen in absence of glucose, identifying MYB binding protein 1A (MYBBP1A). MYBBP1A is a regulator of transcription factors involved in the control of several relevant biological processes. In this work we have analyzed the expression of MYBBP1A in human tumors, confirming that MYBBP1A loss is a genetic event found in renal tumors. In a cohort of 97 patients of renal cancer the MYBBP1A expression is lost or reduced in 8% of tumors. This loss was associated with metastasis and poor prognosis, measured by disease free survival and overall survival. Based on this observation and published data that MYBBP1A is a target of pVHL, which is frequently lost in renal tumors, we have used renal carcinoma cell lines to study the possible role of MYBBP1A as a tumor suppressor. In order to study the molecular mechanism through MYBBP1A would take part in tumorigenesis, we analyzed the effect of MYBBP1A overexpression and downregulation in renal carcinoma cell lines. MYBBP1A overexpression suppresses cell growth in all cell lines used regardless of the molecular context. On the other hand, downregulation of MYBBP1A increases some tumor properties in cell lines that express c-MYB and do not express pVHL. In these cell lines downregulation of MYBBP1A induces c-MYB activation, inducing transcriptional activation of its target genes CD34 and CXCR4, which lead to an increase in cancer stem cell-like phenotype. In addition, we have shown that c-MYB induce the transcription of PGC-1α. Hence, MYBBP1A dowrnregulaion activates PGC-1α direct and indirectly. In a direct manner, reduction of the MYBBP1A expression des-represses PGC-1α activity and indirectly increases PGC-1α mRNA levels through c-MYB activation. Finally, PGC-1α activation leads to a metabolic shift from glycolysis to OXPHOS, which is more efficient to produce ATP under glucose limitations. Therefore, combined effects of MYBBP1A downregulation provide selective advantage over other tumor cells. Furthermore, we analyzed MYBBP1A expression and its correlation to the expression of genes of signaling pathways involved in tumor initiation and viii development. We observed that MYBBP1A correlated negatively with the expression of genes involved in stem cell phenotype, detecting a subgroup of clear cell renal cell carcinomas with a characteristic expression pattern. We have also found some genes regulated transcriptionally by c-MYB whose expression correlated negatively with MYBBP1A and positively with PGC-1α expression. In addition, we identified a subgroup of tumors, 8% of all tumor samples, with a characteristic expression pattern: low expression of MYBBP1A and high expression of PGC-1α and c-MYB target genes. Finally, we observed that MYBBP1A expression correlated negatively with the expression of tricarboxylic acid cycle genes. We also detected that 9% of tumor samples showed low expression of MYBBP1A and high expression of tricarboxylic acid cycle genes. This bioinformatic analysis supports our experimental conclusions. ix ÍNDICE RESUMEN .................................................................................................................... v SUMMARY .................................................................................................................. vii ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. xiii ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................... xvi ABREVIATURAS ....................................................................................................... xvii INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1 1. Microambiente tumoral ....................................................................................... 3 2. Metabolismo de las células tumorales ................................................................ 4 2.1. El efecto Warburg ....................................................................................... 5 2.2. Mecanismos moleculares implicados en la reprogramación metabólica ...... 6 2.3. Tumores oxidativos ..................................................................................... 8 3. Papel de PGC-1α en la regulación del metabolismo celular ............................. 10 4. Rastreo genético por pérdida de función en ausencia de glucosa .................... 12 5. Proteína 1A de unión a MYB ............................................................................ 13 5.1. MYBBP1A como regulador de factores de transcripción ........................... 14 5.2. Papel de MYBBP1A en el desarrollo embrionario ..................................... 15 5.3. Papel de MYBBP1A en mitosis ................................................................. 16 5.4. Papel de MYBBP1A en senescencia ......................................................... 17 5.5. Papel de MYBBP1A en la regulación del estado energético intracelular ... 17 5.6. Papel de MYBBP1A en la síntesis de ribosomas ...................................... 18 5.7. Regulación de MYBBP1A ......................................................................... 19 5.8. MYBBP1A y cáncer ................................................................................... 20 OBJETIVOS ............................................................................................................... 23 MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 27 1. Reactivos biológicos usados ............................................................................ 29 2. Técnicas básicas de biología molecular ........................................................... 29 2.1. Transformación de células quimiocompetentes ......................................... 29 2.2. Extracción de ADN plasmídico .................................................................. 30 3. Cultivos celulares ............................................................................................. 31 3.1. Líneas celulares ........................................................................................ 31 3.2. Cultivo y conservación de las líneas celulares .......................................... 31 xvi ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Plásmidos utilizados en esta tesis ................................................................. 29 Tabla 2. Líneas celulares utilizadas en esta tesis ....................................................... 31 Tabla 3. Sondas TaqMan ............................................................................................ 41 Tabla 4. Sondas utilizadas en las matrices de ARN. ................................................... 43 Tabla 5. Anticuerpos utilizados en esta tesis .............................................................. 44 Tabla 6. Ejemplos de mutaciones en el gen MYBBP1A descritas en tumores humanos ................................................................................................................................... 55 Tabla 7. Resumen de las características de la población de estudio. ......................... 59 Tabla 8. Cuantificación de las colonias formadas en el ensayo de clonabilidad tras la sobreexpresión de MYBBP1A. .................................................................................... 68 Tabla 9. Porcentaje de células CD34+ de cada línea celular. ...................................... 85 xvii ABREVIATURAS α-KG: alfa-cetoglutarato aa: aminoácido ACSS1: acetil-CoA sintetasa 2, mitocondrial ADH5: alcohol deshidrogenasa clase 3 ADN: ácido desoxirribonucleico ADNc: ADN codificante ADNr: ADN ribosómico ADP: adenosín-difosfato AMP: adenosín-monofosfato AMPK: proteína quinasa activada por AMP ARN: ácido ribonucleico ARNasa: ribonucleasa A ARNm: ARN mensajero ARNr: ARN ribosómico ATP: adenosín-trifosfato BPGM: bisfosfoglicerato mutasa CCR: carcinoma de células renales CCRcc: carcinoma de células renales de células claras CCRcr: carcinoma de células renales de células cromófobas CCRp: carcinoma de células renales de células papilares CKs: citoquinas CoA: coenzima A CSC: células madres tumorales C-terminal: extremo carboxi terminal de la proteína CXCR4: receptor de quimioquina tipo 4 DLAT: dihidrolipoil-lisina-residuo acetiltransferasa, componente del complejo piruvato deshidrogenasa DLD: dihidrolipoil deshidrogenasa DMEM: medio de cultivo Eagle modificado por Dulbeco DMSO: dimetilsulfóxido xviii EDTA: ácido etilen diamino tetracetico eNoSC: complejo silenciador nucleolar dependiente de energía FACS: citometría de flujo FBS: suero fetal bovino GAPDH: gliceraldehído-3-fosfato GLUT: transportador de glucosa G418: geneticina G6PC: glucosa-6-fosfatasa HIF: factor inducible por hipoxia HK2: hexoquinasa 2 IF: inmunofluorescencia IL: interleuquina IP: inmunoprecipitación LDHA: lactato deshidrogenasa A LB: medio de cultivo de bacterias Luria-Bertani LKB1: quinasa del hígado B1 MAPK: proteína quinasa activada por mitógenos MIFT: factor de transcripción asociado con microftalmia MYBBP1A: por sus siglas en inglés Myb Binding Protein 1A NADPH: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato N-terminal: extremo amino terminal de la proteína NRD: dominio de regulación negativa NRF: factor nuclear de respiración ORF: marco de lectura OXPHOS: fosforilación oxidativa Pb: pares de bases PBS: tampón fosfato alcalino PCGF5: proteína 5 con dominio de dedos de RING del grupo de proteínas Polycomb PCK1: fosfoenolpiruvato carboxiquinasa PCR: reacción en cadena de la polimerasa xix PDH: piruvato deshidrogenasa PDHA1: subunidad alfa del componente E1 del complejo PDH PDHB: subunidad beta del componente E1 del complejo PDH PDK: piruvato deshidrogenasa quinasa PFKM: fosfofructoquinasa, músculo PGAM1: fosfoglicerato mutasa 1 PGC-1α: co-activador del receptor gamma activado por el factor proliferador de peroxisomas PGK1: fosfoglicerato quinasa 1 PHD: prolil-hidroxilasa PKM: piruvato quinasa, músculo pVHL: proteína von Hippel Lindau qPCR: PCR cuantitativa REST: factor de transcripción de silenciamiento de RE1 RO: oncocitoma renal RPMI: medio Roswell Park Memorial Institute RT-PCR: transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa RT-qPCR: transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa SD: desviación estándar SDS: docedil sulfato sódico SG: supervivencia global shARN: horquilla corta de ARN, complementaria a ARNm SLE: supervivencia libre de enfermedad SMAD2: por sus siglas en inglés Mothers Against Decantaplegic homolog 2 SMAD4: por sus siglas en inglés Mothers Against Decantaplegic homolog 4 SMARCAD1: por sus siglas en inglés SWI/SNF-related matrix-associated actindependent regulator of chromatin subfamily A containing DEAD/H box 1 TCA: ciclo de los ácidos tricarboxílicos TCGA: por sus siglas en inglés The Cancer Genome Atlas TMAs: por sus siglas en ingles Tissue Microarrays VHL: von Hippel Lindau xx WB: western blot INTRODUCCIÓN Introducción 2 Introducción 3 1. Microambiente tumoral El cáncer es una enfermedad genética o epigenética compleja que engloba un conjunto de enfermedades con una característica común, el crecimiento descontrolado de determinadas células del organismo. El proceso de iniciación tumoral o tumorigénesis consta de varias etapas en las que se producen una serie de cambios genéticos o epigenéticos que conducen progresivamente a la transformación de células normales en células cancerígenas 1. Los tumores no son un conjunto de células cancerígenas relativamente homogéneas, sino estructuras complejas compuestas por distintos tipos de células especializadas que se comunican entre ellas, generando una red de señalización y un entorno específico, conocido como microambiente tumoral2. En la mayoría de tumores se pueden distinguir los siguientes tipos celulares: - Células cancerígenas: células que han sufrido mutaciones de ganancia o pérdida de función en oncogenes y genes supresores de tumores respectivamente. En general constituyen la mayor parte de la masa tumoral y son las responsables de la progresión del tumor. Entre ellas encontramos las células madres tumorales (CSC): células con capacidad de autorenovación y diferenciación. Presentan las mismas características que las células madres normales, con la diferencia de que los mecanismos que controlan estos procesos están desregulados, originando una continua expansión y producción de células diferenciadas. Constituyen una pequeña población celular del tumor y se cree que son el origen de todas las células que forman el tumor, de la resistencia a agentes quimioterápicos y las causantes de los procesos de recaída y metástasis. - Estroma: células no tumorales que favorecen o impiden la progresión y diseminación del tumor. o Fibroblastos asociados a cáncer: son las células más influyentes del estroma, secretan una amplia variedad de factores solubles que promueven la iniciación tumoral, progresión y metástasis. Sin embargo, en algunos casos pueden secretar moléculas que provoquen el efecto contrario, la supresión del desarrollo tumoral3. o Células endoteliales: células que dan lugar a los vasos sanguíneos que suministran oxígeno y nutrientes a las distintas zonas del tumor. o Pericitos: células mesenquimales que rodean a las células endoteliales, proporcionándoles señalización paracrina y estabilidad. Introducción 4 o Células del sistema inmune: células infiltradas en el tumor que pueden tener actividad pro-tumoral o antitumoral4. La mayoría de las células del sistema inmune que favorecen la progresión del tumor son células del sistema innato, las cuales suministran factores de crecimiento, factores pro-angiogénicos y enzimas que modifican la matriz extracelular, potenciando las propiedades tumorigénicas de las células tumorales. Las interacciones entre las células tumorales y las células del estroma, junto con la distinta distribución espacial y temporal de nutrientes esenciales para el desarrollo del tumor, provocan que el microambiente tumoral sea heterogéneo, dinámico y presente altos niveles de estrés. De este modo, el microambiente en el que se encuentren las células tumorales puede modificar las propiedades tumorigénicas iniciales de las mismas. Las condiciones específicas del microambiente promueven la selección de la célula tumoral que mejor se adapte al entorno, convirtiéndose en el mayor contribuyente a la proliferación y mantenimiento del tumor. En cambio, esa misma célula en un entorno más restrictivo no contribuiría al crecimiento tumoral. Una de las causas de los continuos cambios del microambiente tumoral es el déficit de vascularización durante el inicio y el crecimiento del tumor, que se traduce en falta de oxígeno y nutrientes, dificultando el desarrollo tumoral5. En estos casos, la falta de oxígeno o hipoxia es un factor clave en la fisiología del tumor que promueve la iniciación, progresión tumoral y la resistencia a terapias. Concretamente, la hipoxia está relacionada con cambios en el metabolismo de las células para conseguir una fuente de nutrientes alternativa, que normalmente implica un alto consumo de glucosa. Sin embargo, hasta que se produce la neovascularización el tumor está sometido a bajas concentraciones de glucosa, de forma que las células tienen que adaptar su metabolismo en función de las condiciones restrictivas del medio para sobrevivir. De este modo, habrá células con ciertas mutaciones que les proporcionen una ventaja para adaptarse y proliferar en entornos críticos, favoreciéndose el crecimiento de distintos subclones del tumor en función de las condiciones del medio. Esto aumenta la heterogeneidad entre las células de un mismo tumor y entre las distintas mutaciones que se observan en tumores de un mismo tipo. 2. Metabolismo de las células tumorales La reprogramación metabólica de las células tumorales ha sido identificada en los últimos años como una de las características distintivas del cáncer2. El metabolismo de las células tumorales se ve afectado por las propias mutaciones del tumor y por las Introducción 5 condiciones del microambiente que lo rodea. La activación de oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores provocan la activación de rutas de señalización que controlan el crecimiento celular y la supervivencia. Para poder mantener la elevada tasa de proliferación alcanzada por la modificación de estas vías de señalización, las células necesitan modificar su metabolismo. Además, las condiciones restrictivas del microambiente tumoral, como la hipoxia, la limitación de nutrientes y pH ácido, también contribuyen a la adaptación del metabolismo celular. La finalidad de esta reprogramación es mantener las tres necesidades básicas de las células tumorales: rápida obtención de energía en forma de ATP, altas tasas de biosíntesis de macromoléculas y mantenimiento del balance de estrés oxidativo6. El efecto Warburg es la adaptación metabólica más conocida de las células tumorales pero no es la única. Los constantes cambios que se producen en el microambiente complican la regulación del metabolismo tumoral, siendo la fosforilación oxidativa (OXPHOS) también un factor clave en dicha regulación. Además, se ha propuesto que la fosforilación oxidativa y la glucólisis aeróbica cooperan durante el proceso de tumorigénesis, activándose una forma de obtención de energía u otra según las necesidades energéticas de las distintas etapas que forman parte de este proceso7. 2.1. El efecto Warburg El fenotipo metabólico más estudiado de las células tumorales es el llamado efecto Warburg, el cual consiste en la obtención de energía en forma de ATP mediante la glucólisis en vez de la fosforilación oxidativa, incluso a concentraciones normales de oxígeno8. Una vez producido el piruvato a través de la vía glucolítica, en lugar de ser metabolizado en la mitocondria mediante el ciclo de Krebs, es transformado en lactato por la enzima lactato deshidrogenasa A (LDHA), en un proceso conocido como glucólisis aeróbica. Este cambio facilita una forma rápida de obtener ATP, pero es menos eficaz que la fosforilación oxidativa, obteniéndose menos cantidad de ATP por molécula de glucosa consumida. Para compensar esta menor eficiencia, las células tumorales consumen grandes cantidades de glucosa. La rápida obtención de energía no es la única ventaja que adquieren las células cambiando su metabolismo a la glucólisis aeróbica, también les permite sobrevivir en condiciones irregulares de oxígeno. En el tumor hay muchas zonas hipóxicas, a las que no llega oxígeno hasta que no se generan nuevos vasos sanguíneos. En estas condiciones las células que basan su metabolismo en la fosforilación oxidativa exclusivamente no sobreviven9. Además, el lactato, producto final de la glucólisis Introducción 12 ha propuesto el uso de PGC-1α como biomarcador para el uso de inhibidores de la respiración en el tratamiento de tumores oxidativos42. 4. Rastreo genético por pérdida de función en ausencia de glucosa Se conocen muchos de los mecanismos moleculares implicados en la reprogramación metabólica a glucólisis aeróbica cuando la concentración de glucosa no es limitante, pero no hay mucha información acerca de los factores implicados en el cambio metabólico cuando no hay suficiente glucosa en el microambiente tumoral. Por este motivo, con el fin de identificar señales que puedan superar limitaciones ambientales y aportar un nuevo rumbo en la evolución del tumor, realizamos un rastreo genético por pérdida de función utilizando una librería de ADNc en antisentido para identificar genes críticos en ausencia de glucosa43. Los fragmentos antisentido que permitieron el crecimiento en ausencia de glucosa fueron seleccionados y se identificaron los genes contra los que iban dirigidos dichos antisentidos (Figura 3). Se identificó un fragmento antisentido contra MYBBP1A de 220 nucleótidos localizado en la región 902-1122 de la secuencia codificante del gen. Este antisentido reducía los niveles de la proteína al 50% provocando un evento genético estable que proporcionaba a las células la capacidad de crecer en estas condiciones restrictivas. Figura 3. Rastreo genético realizado para encontrar nuevos genes supresores de tumores implicados en la superación de condiciones restrictivas. Esquema experimental seguido en la identificación de genes que regulan el crecimiento en ausencia de glucosa. Se generó una librería de fragmentos antisentido al azar a partir de ARN polyA total, estos fragmentos se clonaron en un vector retroviral pMARXIVpuro. Se infectaron fibroblastos NIH3T3 en crecimiento exponencial con retrovirus que portaban la librería. Tras seleccionar con puromicina, se sembraron las células a baja densidad en medio de cultivo sin glucosa. Tras pasar un periodo de 15 días, las colonias resistentes capaces de crecer en ausencia de glucosa fueron aisladas. Los provirus independientes que portaban un fragmento antisentido individual se aislaron y se validaron. Introducción 13 5. Proteína 1A de unión a MYB La proteína 1A de unión a MYB (MYBBP1A, por sus siglas en inglés Myb binding protein 1A), también conocida como p160, es una proteína de 160 kDa que se expresa en todos los tejidos. Se localiza predominantemente en el nucléolo, aunque también se ha observado su presencia en el nucleoplasma44. Contiene secuencias de localización nuclear y nucleolar (NLS) en el extremo C-terminal (Figura 4A) y se encuentra anclada al nucléolo a través del ARN, produciéndose su translocación del nucléolo al nucleoplasma cuando hay una disminución en el contenido de ARN por señales de estrés, entre las que se encuentran la ausencia de glucosa o la inhibición de la síntesis de ribosomas45,46. Además, el estrés ribosómico induce el procesamiento de MYBBP1A en sus formas acortadas de 140 kDa y 67 kDa, las cuales se encuentran en el nucleoplasma por perder la señal de localización nucleolar. Figura 4. Estructura y modelo de translocación de MYBBP1A. (A) Esquema de los dominios y sitios de fosforilación de MYBBP1A y sus formas acortadas producidas por corte proteolítico.NLS: secuencia de localización nuclear y nucleolar. (B) Modelo propuesto por Hochstatter et al. MYBBP1A se localiza en el nucléolo de las células proliferativas unida al complejo ribosómico. Sin embargo, en células sometidas a alguna señal de estrés, MYBBP1A se transloca mayoritariamente al nucleoplasma, donde se une a distintos factores de transcripción para interrumpir la progresión del ciclo celular, la proliferación y la producción de energía. MYBBP1A es una proteína muy conservada evolutivamente, presentando cierta homología con la proteína Pol5p de Saccharomyces cerevisiae, involucrada en la producción del ARN ribosómico (ARNr)47. Inicialmente se identificó como una proteína de unión a la proteína codificada por el proto-oncogen c-MYB44 y posteriormente se ha Introducción 14 ido descubriendo su unión a numerosos factores de transcripción. Por este motivo, se piensa que la función de MYBBP1A es la regulación de la actividad de varios factores de transcripción, actuando como regulador de procesos biológicos fundamentales como la división celular, la proliferación y la apoptosis. 5.1. MYBBP1A como regulador de factores de transcripción MYBBP1A se identificó en primer lugar por su unión al proto-oncogen c-MYB. El proto-oncogen c-MYB codifica para el factor de transcripción c-MYB, regulador esencial de células madres y progenitores de la médula ósea, criptas del colon y regiones neurogénicas del cerebro adulto48. Su principal función es mantener el estado proliferativo y las características inmaduras de estas células. Las formas oncogénicas de esta proteína se generan por pérdida del extremo N-terminal, C-terminal o ambos, permaneciendo el dominio de unión al ADN y la región necesaria para la transactivación de la transcripción. En el extremo C-terminal se encuentra el dominio NRD, el cual regula negativamente la transactivación y unión de la proteína al ADN49. Tanto MYBBP1A como su forma acortada de 67 kDa, generada por corte proteolítico en algunos tipos celulares, se unen al NRD de c-MYB. Esta unión se produce a través de los motivos de cremalleras de leucina presentes en el fragmento N-terminal de MYBBP1A y en el NRD de c-MYB44. También se ha descrito que MYBBP1A actúa como represor de PGC-1α. Tanto el dominio N-terminal como el C-terminal de MYBBP1A se unen al dominio de regulación negativa de PGC-1α y reducen su capacidad para estimular la respiración mitocondrial y la expresión de los genes de la cadena de transporte de electrones. Esta regulación negativa se inhibe cuando PGC-1α es fosforilada por p38 MAP quinasa50. Otro factor de transcripción regulado por MYBBP1A es PREP151. Tanto la versión de 160 kDa como la de 67 kDa de MYBBP1A se unen al primer dominio de homología (HR1) de PREP1, inhibiendo su actividad transcripcional y la expresión del gen HoxB2 en las células NT2-D1 tratadas con ácido retinoico. Para unirse a PREP1, MYBBP1A compite con PBX1. MYBBP1A también compite con p300 por la unión a la subunidad RelA/p65 de NF-κB, actuando como represor de su actividad cuando se produce la unión52. Además Mybbp1a actúa como un co-represor de CRY1 en el promotor de period2, inhibiendo la expresión de este gen implicado en la regulación del reloj circadiano53. Por otro lado, MYBBP1A también actúa como activador de algunos factores de transcripción, entre los que se encuentra el receptor de hidrocarburos aromáticos (AhR)54. Introducción 15 También se ha descrito que MYBBP1A juega un papel importante en la acetilación y activación de p5345,55-59. Bajo condiciones de estrés en el nucléolo, producido por la inhibición de la síntesis de ribosomas o por ausencia de glucosa, la transcripción del ARNr se bloquea y se reduce el contenido de ARN en el nucléolo. Esta disminución provoca la translocación de MYBBP1A al nucleoplasma, donde facilita la interacción entre p53 y p300 aumentando la acetilación de p53. Concretamente, el modelo propuesto expone que el estrés en el nucléolo provoca la inactivación de HDM2, lo que conlleva la estabilización de p53 y la formación de dímeros de p53 no acetilados. Una vez translocado al nucleoplasma, MYBBP1A se une a estos dímeros de p53 a través de su región central (aa 643-1150) y C-terminal (aa 1151-1328). Tras producirse esta interacción, se forman dímeros entre unidades de MYBBP1A unidas a los dímeros de p53, dando lugar a la formación de tetrámeros de p53. El co-activador de transcripción p300 se une a estas estructuras, acetila las unidades de p53 y MYBBP1A se disocia del complejo. Por último, el tetrámero de p53 acetilado, unido aún a p300, se une a los promotores de sus genes diana e induce la expresión de genes relacionados con apoptosis y/o parada del ciclo celular53. Finalmente, también se ha estudiado la unión de MYBBP1A a factores implicados en regulación epigenética. Se ha descrito que MYBBP1A es un componente del complejo remodelador de cromatina dependiente de ATP (esBAF), el cual se asocia con procesos de diferenciación y fenotipo de célula madre. Aunque el papel de MYBBP1A en este complejo no está claro, podría estar relacionado con funciones de regulación epigenética60. Asimismo, se ha demostrado que MYBBP1A actúa como regulador de la expresión génica específica del músculo y la diferenciación de los mioblastos mediante su unión a MyoD. La unión de MYBBP1A y MyoD en determinadas regiones de genes que no se expresan en el tejido muscular disminuye la actividad transcripcional de MyoD. Se ha propuesto que MYBBP1A lleva a cabo esta función represora mediante el reclutamiento de modificadores epigenéticos negativos, como HDAC1/2 y Suv39h1, induciendo una estructura de la cromatina menos accesible61. 5.2. Papel de MYBBP1A en el desarrollo embrionario La función de MYBBP1A ha sido estudiada por Mori et al. in vivo62. Para ello, delecionaron el gen mybbp1a en ratones y obtuvieron ratones heterocigotos mybbp1a+/- sanos y fértiles, pero no consiguieron generar ningún ratón mybbp1a-/-. Tras analizar en profundidad los embriones en distintos momentos de desarrollo, a los días 6,5, 9,5 y 11,5, no encontraron embriones homocigotos mybbp1a-/-. También Introducción 16 aislaron blastocitos de los ratones heterocigotos, los mantuvieron en cultivos varios días y los genotiparon sin detectar ningún blastocito mybbp1a-/-. Estos resultados indican que mybbp1a es esencial durante las primeras etapas del desarrollo embrionario de los ratones, concretamente antes de la formación del blastocito. 5.3. Papel de MYBBP1A en mitosis Existen varias observaciones que sugieren que MYBBP1A participa en la regulación de la mitosis. Se ha descrito que MYBBP1A se transloca del nucléolo al nucleoplasma durante la mitosis, situándose en regiones de para-cromosomas en metafase-anafase, donde co-localiza con el marcador de cromatina fosfohistona H362. Además, MYBBP1A es fosforilada por la quinasa Aurora B en el residuo de serina 130363. El pico de esta fosforilación se produce en la transición G2/M y se inhibe por completo cuándo se tratan las células con Danusertib, un inhibidor de las quinasas Aurora. Esta fosforilación de MYBBP1A en G2/M la realiza la quinasa Aurora B exclusivamente, ya que únicamente el silenciamiento de Aurora B y no A o C suprime esta fosforilación. Asimismo, se ha propuesto que MYBBP1A forma parte de un conjunto de proteínas implicadas en la progresión de la mitosis, ya que la reducción de la expresión de MYBBP1A por ARN de interferencia (ARNi) provoca tanto el retraso de la progresión de la mitosis como fallos en el ensamblaje y la estabilidad del huso mitótico. También se ha descrito que la disminución de la expresión de MYBBP1A mediante silenciamiento génico en células Hela reduce el crecimiento celular e incrementa la apoptosis, produciéndose el bloqueo de las células que sobreviven en la transición G2/M del ciclo celular. Al comparar células con niveles reducidos de MYBBP1A con respecto a las células control se observa un aumento de la expresión de genes que inhiben el ciclo celular (CDKN1A, GADD45B y SFN) y la disminución de genes implicados en la reparación del ADN (TOP2A, TOP2B, BRCA1, CDK7 y WEE1). Sin embargo, la disminución de la expresión de MYBBP1A en células NIH3T3 tiene el efecto contrario, la estimulación del crecimiento celular62. Durante la mitosis el núcleo se rompe y las proteínas nucleolares se translocan al citoplasma. Entre estas proteínas se encuentra MYBBP1A, que como se ha mencionado induce la acetilación de p53, siendo esta interacción esencial en el punto de control post-mitótico G1. En este contexto, MYBBP1A participa en la activación de la maquinaria del punto de control cuando la mitosis se prolonga más de lo normal64. Introducción 17 5.4. Papel de MYBBP1A en senescencia Varios datos experimentales apuntan a que MYBBP1A podría estar involucrado en la senescencia celular. En primer lugar, se ha demostrado que MYBBP1A regula la actividad, mediante interacción física, de dos factores clave en el proceso de senescencia: p53 y la subunidad RealA/p65 de NF-kB52,57. En segundo lugar, se ha expuesto que la pérdida de MYBBP1A afecta a la expresión de genes implicados en ciclo celular y respuesta a daño en el ADN, estando algunos de estos genes implicados en senescencia celular también62. Por último, se ha descrito que MYBBP1A se transloca al nucleoplasma en repuesta a daño en el ADN, disminuyendo posteriormente sus niveles en células senescentes65. También se ha observado que el silenciamiento de MYBBP1A por sí mismo no induce senescencia, pero el silenciamiento de MYBBP1A junto con el tratamiento con etopósido provoca un aumento del número relativo de células senescentes. Además, el silenciamiento de MYBBP1A aumenta la resistencia a radioterapia65. 5.5. Papel de MYBBP1A en la regulación del estado energético intracelular Se ha propuesto que el nucléolo actúa como un sensor que conecta el estado energético intracelular con la maquinaria del ciclo celular, siendo MYBBP1A un componente importante de este sensor42. Las células reducen el consumo energético e inducen la parada de ciclo celular cuando existe deficiencia energética con el fin de sobrevivir. En respuesta a la ausencia de glucosa, que se traduce en escasez energética, el complejo silenciador nucleolar dependiente de energía (eNoSC), constituido por las proteínas NML, SIRT1 y SUV39H1, evalúa el estado energético intracelular en base a la relación NAD+/NADH. En situaciones de escasez energética, definida por una proporción elevada de NAD+/NADH, eNoSC se activa a través de la SIRT1 y suprime la transcripción de ARNr. Esto conduce a una reducción de la cantidad de ARN nucleolar que provoca la translocación de MYBBP1A al nucleoplasma. Finalmente, la translocación de MYBBP1A aumenta la acetilación de p53. De este modo, eNoSC actúa como detector y transductor del estado energético intracelular mientras que MYBBP1A realiza el papel de efector activando p53 mediante el aumento de su acetilación. Así, la vía eNoSC-MYBBP1A emerge como una alternativa a la vía LKB1-AMPK. Ambas rutas conducen a la supresión de la biogénesis de ribosomas en respuesta al descenso energético mediante distintos mecanismos, en el caso de la ruta LKB1- AMPK a través de la inhibición de la actividad de mTOR66. Además, AMPK también induce la activación de p53 aumentando la fosforilación de los residuos de serina 15 y Introducción 18 4617. El significado biológico de la existencia de estas dos rutas y el papel de cada una de forma independiente no está claro, aunque ambas podrían compensarse mutuamente mejorando su eficiencia. 5.6. Papel de MYBBP1A en la síntesis de ribosomas La función de MYBBP1A también se ha estudiado en el contexto de la expresión de genes ribosómicos67,68. MYBBP1A se asocia con el complejo ARN polimerasa I y actúa como un regulador negativo de la transcripción del ADNr y como parte activa de la maquinaria de la biogénesis de ribosomas67. Estudios de ganancia y pérdida de función sugieren que MYBBP1A juega un doble papel en el metabolismo del ARNr. En primer lugar regulando el inicio de la transcripción y en segundo lugar participando en el procesamiento adecuado del pre-ARNr. La sobreexpresión de MYBBP1A reduce la carga de la ARN polimerasa I en los genes ribosómicos. Por el contrario, la reducción de MYBBP1A produce la acumulación del precursor del ARNr, 47S pre-ARN, in vivo. Se ha propuesto que la acumulación de este precursor es una consecuencia del aumento de la transcripción por falta de represión de la expresión de genes ribosómicos y por fallos en el procesamiento del ARNr. En relación al mecanismo mediante el cual MYBBP1A regula la expresión de los genes ribosómicos, se ha descrito que MYBBP1A tiene una función epigenética66. En concreto, se ha propuesto que MYBBP1A mantiene las repeticiones del ADNr silenciadas mediante su asociación con HDAC1/2, ya que la reducción de MYBBP1A disminuye los niveles de metilación del ADN y los marcadores de histonas asociados con el silenciamiento génico, alterando la ocupación de los promotores de algunos genes como UBF y HDACs y aumentando la expresión del ARNr. Finalmente, considerando que la transcripción de los genes ribosómicos, el procesamiento del pre-ARNr y el ensamblaje de los ribosomas son los procesos celulares que consumen más energía, la tasa de biogénesis de ribosomas está directamente relacionada con la proliferación celular. En base a esta observación, se ha propuesto el siguiente modelo67(Figura 4B): MYBBP1A se encuentra principalmente asociado a complejos pre-ribosómicos en células proliferativas, donde actuaría como base para el correcto procesamiento del ARNr y para el ensamblaje de factores necesarios para la biogénesis de los ribosomas. Tanto niveles bajos de síntesis de ribosomas en respuesta a señales de estrés como una demanda reducida de ribosomas conducirían al desmantelamiento de las partículas pre-ribosómicas y a la translocación de MYBBP1A al nucleoplasma. Aunque permanezca una pequeña fracción de MYBBP1A en el nucléolo reprimiendo la actividad de la RNA polimerasa I, Introducción 19 la mayoría de las unidades de MYBBP1A estarían en el nucleoplasma, donde regularían la actividad de factores de transcripción como c-MYB, PGC-1α, NF-kB y p53 para interrumpir la progresión del ciclo celular, la proliferación y la producción de energía. 5.7. Regulación de MYBBP1A Se ha identificado mediante la técnica de análisis proteómico ICAT que MYBBP1A es una diana de ubiquitinación del gen supresor de tumores VHL69. Este gen codifica para un componente del complejo proteico E3 ubiquitina-ligasa. Mutaciones de pérdida de función en este gen están asociadas a la enfermedad de von Hippel-Lindau, síndrome de cáncer hereditario caracterizado por alto riesgo de desarrollar tumores muy vascularizados en ojos, cerebro y espina dorsal, así como tumores benignos o malignos en riñón, páncreas y médula adrenal70. La inactivación bialélica de VHL es también frecuente en carcinomas renales y hemangioblastomas esporádicos70,71. Se ha descrito que pVHL se une directamente a MYBBP1A provocando su degradación de forma dependiente de hierro y del proteasoma69. La región de MYBBP1A localizada entre los aminoácidos 632 y 694 es necesaria para que se produzca esta degradación, la cual contiene una secuencia parecida a la que rodea al residuo de prolina que se hidroxila en la proteína HIF-1α para su degradación vía pVHL. También se ha descrito que la mutación en el residuo de prolina 693 de MYBBP1A (Pro693) que provoca su cambio a alanina bloquea la degradación de MYBBP1A por pVHL. En base a esto se ha propuesto que el residuo Pro693 de MYBBP1A es hidroxilado en presencia de hierro y oxígeno, conduciendo a su ubiquitinación por pVHL y a su posterior degradación vía proteasoma. Sin embargo, pVHL no es la única proteína implicada en la regulación de MYBBP1A. PREP1 controla la vida media de MYBBP1A a nivel de estabilidad de proteína, ya que la interacción entre PREP1 y MYBBP1A impide su degradación vía proteasoma. Existen diferentes evidencias experimentales que demuestran esta regulación. Por ejemplo, el músculo de ratones hipomórficos para prep1 presenta niveles reducidos de Mybbp1A. Por el contrario, tienen un aumento de Pgc-1α tanto a nivel de ARNm como de proteína, acompañado del aumento de la expresión del transportador Glut4, responsable de la absorción de glucosa estimulada por insulina en el músculo72. También se ha descrito que Prep1 es un regulador directo e indirecto de los componentes de la fosforilación oxidativa y que Mybbp1a participa en los mecanismo indirectos. La eliminación de Prep1 específicamente en el músculo de ratones provoca un aumento en la expresión de los genes de la cadena respiratoria, Introducción 20 de la capacidad mitocondrial y de los niveles de expresión de Pgc-1α, junto con una reducción significativa de los niveles de Mybbp1a73. 5.8. MYBBP1A y cáncer El gen que codifica para MYBBP1A se encuentra localizado en el brazo corto del cromosoma 17, concretamente en la región 17p13.3 entre los marcadores D17S1828 y D17S938. La pérdida de heterocigosidad en la región 17p13.3 se observa con alta frecuencia (50-80%) en distintos tipos de cáncer, entre los que se encuentran el cáncer esporádico de mama y ovario, meduloblastomas, astrocitomas, osteosarcomas, leucemias, cáncer de vejiga y de pulmón74. Esta pérdida de heterocigosidad sugiere la presencia de uno o más genes supresores de tumores en la región 17p13.3 y MYBBP1A podría ser uno de ellos. Actualmente ya se han descrito algunos contextos en los que MYBBP1A actúa como un gen supresor de tumores. Por ejemplo, la reducción de la expresión de MYBBP1A en la línea celular NIH3T3 induce el aumento del crecimiento celular e incrementa la tumorigénesis mediada por RasV1262. También se ha identificado una doble función de MYBBP1A en la proliferación y en la migración de las células de carcinoma escamoso de cabeza y cuello75. Se ha observado una reducción significativa de los niveles de Mybbp1a en tumores recurrentes de ratones en comparación con los tumores primarios, observándose el mismo resultado en el 50% de las muestras de tumores humanos analizadas. Sorprendentemente, el silenciamiento de MYBBP1A en la línea celular de ratón SCC7 y en varias líneas celulares humanas de este tipo de carcinoma incrementaba la migración de las células pero disminuía el crecimiento celular. Por este motivo, se ha propuesto que las células tumorales con niveles reducidos de MYBBP1A podrían representar una sub-población de células de crecimiento lento pero con gran capacidad migratoria implicada en la recaída y metástasis. El análisis de la base de datos Oncomine revela que la expresión de MYBBP1A correlaciona negativamente con la tumorigénesis en cáncer de mama76. Además, experimentos in vivo e in vitro realizados en líneas celulares de cáncer de mama con expresión normal de p53 muestran un aumento de la tumorigénesis, de la formación de colonias y de la resistencia a anoikis cuando se silencia la expresión de MYBBP1A. En este caso, MYBBP1A podría tener un papel importante en la prevención de formación de tumores en relación a la activación de p53. En condiciones de baja adherencia, MYBBP1A se transloca del nucléolo al nucleoplasma aumentando la Introducción 21 anoikis dependiente de p53, impidiendo de este modo el proceso de formación tumoral. Ensayos de microarrays de tejidos en tumores primarios de pacientes con cáncer de orofaringe muestran una correlación significativa entre bajos niveles de expresión de MYBBP1A y altos niveles de p-AKT Ser473 en pacientes con peor supervivencia libre de enfermedad y peor supervivencia global65. Aunque es necesario hacer más estudios, los autores de este trabajo sugieren que la correlación observada podría ser un indicador de alto riesgo de fallo del tratamiento actual en pacientes con cáncer de orofaringe. También se ha descrito que MYBBP1A es un regulador negativo de la sirtuina 7 (SIRT7)77. Se ha observado que MYBBP1A se une a SIRT7 tanto in vitro como in vivo e inhibe la actividad deacetilasa de la SIRT7 sobre H3K18Ac. En esta unión intervienen los dominios N y C-terminal de SIRT7 y el dominio C-terminal de MYBBP1A. Como se ha descrito que la actividad deacetilasa de la SIRT7 sobre H3K18Ac es necesaria para el mantenimiento de las propiedades fundamentales de las células tumorales, la inhibición de SIRT7 por parte de MYBBP1A sugiere que MYBBP1A ejerce la función de supresor tumoral. Por último, se ha identificado recientemente que MYBBP1A forma parte de la red de proteínas que interaccionan con la tripeptidil peptidasa II (TPPII). TPPII es una aminopeptidasa que participa en la regulación del ciclo celular, la apoptosis y la senescencia y parece que promueve el crecimiento descontrolado de las células tumorales. Esta red estaría compuesta por TPPII, p53, MYBBP1A, CDK2, SIRT7, SIRT6 y CD14778. Se ha sugerido que las interacciones entre estas proteínas participarían en la regulación de la tumorigénesis, la neurodegeneración y el envejecimiento. En un estudio de interacción proteína-proteína se descubrió que TPPII interacciona físicamente con MYBBP1A y la proteína reguladora del ciclo celular CDK2. También se encontró una interacción directa entre MYBBP1A y CDK279. Actualmente se ha descrito que MYBBP1A es una proteína multifuncional implicada en la regulación de varios procesos biológicos como el desarrollo embrionario, el ciclo celular, la mitosis, la biogénesis de ribosomas y el estado energético intracelular, y que realiza estas funciones uniéndose a diversos factores de transcripción. Sin embargo, aún no se ha esclarecido el papel de MYBBP1A en procesos tumorales y cuáles serían las rutas moleculares alteradas por la pérdida de MYBBP1A. Materiales y métodos 28 Materiales y métodos 29 1. Reactivos biológicos usados Plásmidos: los plásmidos usados en esta tesis se describen en la tabla 1. Tabla 1. Plásmidos utilizados en esta tesis Plásmido Secuencia Resistencia eucariotas Origen pcDNA3 pACTMYBBP1A pWZL pWZLMYBBP1A pGene Clip scramble GGAATCTATTCGATGCATAC Neomicina Neomicina Blasticidina Blasticidina Higromicina A. Carnero A. Carnero A. Carnero A. Carnero Quiagen pGene Clip shMYBBP1A1 TGGGATCCGTGAACCTATTCT Higromicina Quiagen pGene Clip shMYBBP1A2 AGCAAAGGTCACCGAGGAACTT Higromicina Quiagen pGene Clip shMYBBP1A3 TTCGCAGACCTCCTGTTGAAT Higromicina Quiagen pGene Clip shMYBBP1A4 TCCCTGTCACGCCTACTTTCT Higromicina Quiagen pRetroSuper (pRS) Puromicina Origene pRS shMYBBP1A GCAGAAGGAGTTCAAGAGACTCCTTCTGC AGCTTGTTCTTTTTGGAA Puromicina A. Carnero pRS shPGC1α TCTGGTACACAAGGCAATAACTCCACCAA Puromicina Origene pBABEpuro Puromicina A. Carnero HA-VHL-pBabe VHL cDNA Puromicina Addgene pcDNA3-2xFlag-human-c-MYB c-MYB cDNA Neomicina Shengao Jin Todos los plásmidos llevaban ampicilina como resistencia bacteriana. Antibióticos: puromicina (Nucliber), blasticidina (Sigma), higromicina (Lifetechnologies), G418 (Quimigen), ampicilina (Sigma). Cepas bacterianas: todos los plásmidos utilizados en la tesis se propagaron en la cepa de E.coli DH5α (Invitrogen). Se crecieron en medio LB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de NaCl pH 7,0) a 37oC, con agitación, durante 16h. 2. Técnicas básicas de biología molecular 2.1. Transformación de células quimiocompetentes A 100 µl de bacterias quimiocompetentes se les añadió una cantidad apropiada de ADN (habitualmente 100 ng de plásmido purificado). La mezcla de bacterias y ADN se incubó durante 30 minutos en hielo y después se dio un choque térmico a 42oC en un termobloque durante 45 segundos. A continuación se mantuvieron las células en hielo durante 2 minutos y se añadieron 900 µl de medio SOC (20 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, glucosa Materiales y métodos 30 20 mM) a temperatura ambiente. Se incubaron 1 hora a 37o C en agitación. Después se centrifugaron durante 2 minutos a 8.000 rpm y se resuspendieron en 100 µl de medio SOC. Se extendió el cultivo en placas de LB-agar con el antibiótico de selección apropiado y se incubaron a 37oC durante 16h. 2.2. Extracción de ADN plasmídico La extracción de ADN se puede realizar a partir de pequeños o grandes volúmenes de cultivos de bacterias, según la cantidad que necesitemos. El protocolo se basa en ambos casos en una lisis alcalina seguida de la precipitación y purificación del ADN en una columna de intercambio iónico (silice-dietilaminoetanol). El ADN se une a la columna en condiciones apropiadas de pH y baja concentración de sales, los contaminantes se eliminan en un lavado con tampón de fuerza iónica intermedia y el ADN se eluye en un tampón de alta concentración de sales. Por último, el ADN se precipita con isopropanol para concentrarlo y eliminar sales. En ambos casos utilizamos el JetStar2.0 Plasmid purification kit de Genomed para midi o maxi, siguiendo las instrucciones del fabricante. Describimos el protocolo brevemente a continuación. Se creció el cultivo líquido en medio selectivo (LB con el antibiótico apropiado según el plásmido) durante 12-16 h a 37oC, con agitación. El volumen de cultivo dependía de si era una maxi o midi (250 o 100 ml respectivamente). Las células se recuperaron por centrifugación durante 5 minutos y se resuspendieron en la solución de resuspensión (Tris HCl 50 mM pH 8,0, EDTA 10 mM, ARNasa A 100 µg/ml). Después se añadió la solución de lisis (NaOH 0,2 M, SDS 1%), mezclando por inversión e incubando 5 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se neutralizó al añadir acetato potásico 3M pH 5.5, mezclando inmediatamente. Después se centrifugó durante 10 minutos y el sobrenadante se vertió en una columna previamente equilibrada, dejándolo caer por gravedad. Después, la columna se lavó dos veces con tampón de lavado (NaCl 1 M, MOPS 50 mM pH 7.0, 15% isopropanol) y el ADN se eluyó con tampón de elución (NaCl 1,25 M, MOPS 50 mM pH 8,5, 15% isopropanol). A continuación, el ADN se precipitó por adición de isopropanol y centrifugación durante 30 minutos a 4ºC. Se lavó con etanol 70% y se centrifugó durante 5 minutos a 4ºC. Finalmente, se secó el pellet de ADN obtenido al aire y se resuspendió en un volumen apropiado de agua destilada libre de nucleasas. Todas las centrifugaciones de este protocolo se realizaron en una centrífuga Evolution RC6 plus a una velocidad de 12.000g. Materiales y métodos 31 3. Cultivos celulares 3.1. Líneas celulares Las características de las líneas celulares utilizadas en el presente trabajo, incluyendo el medio de cultivo, el origen y el tipo celular que representan, se muestran en la tabla 2. Tabla 2. Líneas celulares utilizadas en esta tesis CLS: Servicio de Líneas Celulares; ATCC: Colección Americana de Cultivos Tipo; aa: aminoácido. 3.2. Cultivo y conservación de las líneas celulares Todas las líneas se cultivaron en medio DMEM o RPMI con glutamina estable, suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; Life technologies), 40 µg/ml de penicilina, 40 µg/ml de estreptomicina (Sigma) y 1 µg/ml de fungizona (anfotericina B; Sigma). Las células se crecieron en placas de 10 centímetros (Falcon) y se subcultivaron 1:3 -1:12, según la línea celular, cada 3-4 días mediante tratamiento con tripsina/EDTA 0,025% (Life technologies), en el caso de las líneas de carcinoma renal, o tripsina/EDTA (Sigma) en el caso de la línea Phoenix A. Las células se mantuvieron en un incubador humidificado a 37ºC en una atmósfera de 5% CO2 (Thermo Scientific). Todas las manipulaciones se hicieron en una campana de flujo laminar de Clase II Bio- II-A (nivel de seguridad biológica 2; Telstar). Para su almacenamiento a largo plazo, las células se conservaron en un contenedor de nitrógeno líquido, en criotubos de 2 ml, en su medio de cultivo normal o FBS, con 10% de DMSO. Para periodos de almacenamiento más cortos las células se conservaron a -80ºC. Para descongelar un vial, se sumergió en un baño de agua a Línea celular Especie Tipo celular Medio de cultivo Crecimiento Origen A498 Humana Carcinoma renal DMEM Adherente CLS ACHN Humana Adenocarcinoma renal DMEM+ aa no esenciales Adherente CLS 786-O Humana Carcinoma renal RPMI Adherente Carmen Blanco CaKi-1 Humana Carcinoma renal de células claras RPMI Adherente Carmen Blanco Phoenix A Humana HEK293T que expresan los genes retrovirales gag-pol y env (anfotrópico) DMEM Adherente ATCC Materiales y métodos 32 37oC durante 2 minutos; se centrifugó el contenido en 5 ml de medio y las células se resuspendieron en su medio de cultivo habitual. 3.3. Transfección de células 3.3.1. Transfección por precipitación con fosfato cálcico: la mezcla de CaCl2, ADN y tampón fosfato origina la precipitación de pequeñas partículas insolubles de fosfato cálcico que contienen el ADN condensado80. Estos complejos se adhieren a la membrana plasmática y entran en la célula por fagocitosis. Las células se sembraron el día anterior a la transfección de manera que estuvieran a una confluencia del 70-80% en el momento de la transfección. Entre 2 y 4 horas antes de la transfección se cambió el medio a las células, añadiendo 10 ml de medio fresco completo (para una placa de 10 cm). En un tubo de 15 ml se mezclaron 20µg del ADN correspondiente, 50 µl de CaCl2 2,5M y se llevó a 500 µl con agua Milli- Q estéril. A esto se le añadieron 500 µl de tampón HBS 2X (NaCl 270 mM, HEPES 55 mM, Na2HPO4 1,5 mM, pH 7,04) gota a gota mientras se producían burbujas con una pipeta pasteur de vidrio. Se dejó la mezcla durante media hora para permitir que se formasen los cristales de fosfato cálcico y se añadió sobre el cultivo celular gota a gota. Se dejaron durante 8-16 horas a 37oC y se les cambió el medio. Se incubaron hasta alcanzar las 48 horas desde el momento de la transfección a 37oC para utilizarlas según procediera en cada caso. 3.3.2. Transfección mediante el kit comercial Effectene (Quiagen): la transfección con este kit se basa en la utilización de un potenciador de la condensación del ADN y del reactivo Effectene, compuesto lipídico no liposomal que cubre el ADN condensado con lípidos catiónicos. Este método proporciona una forma eficiente de transferir el ADN dentro de células eucariotas. Se sembraron las células en placas de 6 pocillos el día anterior, para que estuvieran a una confluencia del 50-80% en el momento de la transfección, y se siguió el protocolo indicado por el fabricante. En primer lugar se mezcló el ADN con el potenciador de la condensación del ADN y un tampón que proporcionaba las condiciones de sal óptimas para la condensación del ADN. Se incubó la mezcla durante 2-5 min. A continuación se añadió el reactivo Effectene y se incubó la mezcla durante 5-10 min para permitir la formación de los complejos Effectene-ADN. Posteriormente los complejos se mezclaron con medio completo y se añadieron directamente sobre las células, las cuales se incubaron 24-48 horas a 37ºC para comenzar después el proceso de selección. Materiales y métodos 33 3.3.3. Transfección mediante el kit comercial TransIt-X2 (Mirus): se sembraron las células en placas de 6 pocillos el día anterior, para que estuvieran a una confluencia del 80% en el momento de la transfección, y se siguió el protocolo indicado por el fabricante. Para ello se mezclaron 2,5µg de ADN del plásmido y 250 µl de medio (cantidades para transfectar las células de un pocillo). A continuación se añadió 7,5 µl de TransIT-X2, polímero no liposomal que recubre el ADN favoreciendo su transporte al interior celular, se resuspendió con la pipeta y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se añadió la mezcla gota a gota sobre las células, las cuales se incubaron durante 48 horas a 37ºC para comenzar después el proceso de selección. 3.4. Infección retroviral Se sembraron las células Phoenix A en placas de 10 cm el día previo, para que estuvieran a un 70-80% de confluencia en el momento de la transfección. Se llevó a cabo una transfección transitoria de estas células con el vector retroviral de interés, mediante el protocolo del fosfato cálcico (descrito en el apartado 3.3), para producir las partículas retrovirales. Tras 8-16h de incubación a 37oC, se le cambió el medio a las células (10 ml) y se dejaron 48 h a 32oC. A continuación, el sobrenadante que contenía los virus se pasó por un filtro de acetato de celulosa (0,45 µm, VWR) y se suplementó con un volumen igual de medio fresco y con 8 µg/ml de polibreno (Sigma), policatión que reduce la repulsión electrostática entre el virus y la membrana celular, favoreciendo la unión de los virus. Para la infección, se reemplazó el medio de cultivo de las células receptoras por medio nuevo con el sobrenadante viral y las placas fueron centrifugadas (1 h, 1500 rpm) e incubadas a 32oC durante 8 h. Después, se cambió el medio y se mantuvieron 48 h a 37oC, momento en el que se comenzó con la selección apropiada. 3.5. Selección de células transfectadas o infectadas Tras 48 horas de incubación se tripsinizaron las células, se sembraron a baja densidad en una placa de 10 cm en el caso de las células transfectadas, o se dividieron 1:2 en el caso de las células infectadas, y se comenzó la selección con el antibiótico apropiado. Éste se mantuvo durante el tiempo necesario para que se produjera la muerte de las células sin transfectar y se obtuvieran clones aislados en las placas de las células transfectadas. Posteriormente, se pasaron los clones a monocapa, obteniendo poblaciones celulares con la mezcla de todos los clones obtenidos en una placa. Una vez finalizada la selección, para el mantenimiento, se puede reducir la concentración del antibiótico a la mitad. Materiales y métodos 34 4. Ensayos celulares 4.1. Ensayos de metabolismo Los ensayos descritos en este apartado de realizaron en medio DMEM (Corning) o RPMI (Biowest) sin piruvato, glucosa y glutamina. Según la finalidad del experimento, se suplementó el medio con glutamina estable (Glutamax, Gibco) o glucosa (Sigma) cuando fue necesario. 4.1.1. Ensayo de proliferación en condiciones limitantes de nutrientes Se sembraron 1x104 células en pocillos de 35mm por triplicado en las siguientes condiciones: medio sin glucosa en normoxia, medio sin glutamina con 100mg/L de glucosa en normoxia, medio con glutamina y 100mg/L de glucosa en normoxia y medio con glutamina y 100mg/L de glucosa en hipoxia. A las 24 horas (día 0) se fijaron las células del primer punto y cada 24 horas, se fijó un punto de la curva y se cambió el medio al resto de las placas. Las células se fijaron con glutaraldehido 0,5% y se tiñeron con cristal violeta 1%. Después de lavar y dejar secar las placas, el cristal violeta se disolvió en ácido acético 15% y se cuantificó el número relativo de células midiendo la absorbancia del cristal violeta a 595 nm. Los valores se representaron refiriéndolos al día 0. 4.1.2. Cuantificación de ATP total Se sembraron 5x103 células por pocillo en placas de 96 pocillos blancas con fondo plano y transparente, en medio sin glucosa y en medio sin glutamina con 100 mg/L de glucosa. Tras 18 horas, se cuantificó el ATP total con el kit ab113849 (Abcam) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 50 µl de detergente por pocillo y se colocó la placa en un agitador orbital durante 5 minutos a 700 rpm para lisar las células. A continuación, se añadieron 50 µl de una solución que contiene luciferasa y D-luciferina y se incubó la placa durante 10 minutos en oscuridad. El ATP reacciona con la D-luciferina y la luciferasa emitiéndose luz como producto de la reacción. La luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de ATP presente en la célula. Una vez pasados los 10 minutos de incubación, se cuantificó la luminiscencia en el lector Víctor X3 (PerkinElmer). 4.1.3. Cuantificación de la relación ATP/ADP Se sembraron 5x103 células por pocillo en placas de 96 pocillos blancas con fondo plano y transparente, en medio sin glucosa y en medio sin glutamina con 100 mg/L de glucosa. Tras 18 horas, se cuantificó la relación ATP/ADP total con el kit Materiales y métodos 35 MAK135 (Sigma) siguiendo las instrucciones del fabricante. El protocolo constaba de dos pasos. En el primer paso se eliminó el medio de cultivo de los pocillos y se añadieron 90 µl de la solución ATP. Esta solución contenía detergente, luciferasa y D- luciferina. Las células se lisan con el detergente liberándose el ATP y ADP intracelular. El ATP reacciona con la D-luciferina y la luciferasa emitiéndose luz como producto de la reacción, la cual es proporcional a la cantidad inicial de ATP. Se incubó la placa durante 1 minuto a temperatura ambiente y se cuantificó la luminescencia (RLUA) en un lector de placas. Se dejó la placa durante 10 minutos en oscuridad y se comenzó el segundo paso, en el que se transformó el ADP en ATP por reacción enzimática. Para ello se midió la luminescencia de la placa de nuevo para calcular la luminiscencia de basal (RLUB) antes de transformar el ADP. A continuación se añadieron 5 µl de la enzima ADP, que transforma el ADP en ATP, el cual reaccionó de nuevo con la luciferasa y la D-luciferina como en el primer paso. Finalmente, se incubó la placa durante 1 minuto a temperatura ambiente, se midió la luminiscencia (RLUC) en el lector de placas y se calculó la relación ATP/ADP con la siguiente fórmula: RLUA/ (RLUCRLUB). Todas las medidas de este ensayo se realizaron en el lector Víctor X3 (PerkinElmer). 4.1.4. Ensayo de sensibilidad a rotenona Se sembraron 5x103 células por pocillo en placas de 96 pocillos en medio sin glucosa y en medio sin glutamina con 100 mg/L de glucosa. Se incubaron las células en normoxia y 5% de hipoxia durante 12 horas. A continuación, se trataron las células con concentraciones crecientes de rotenona (Sigma) en un rango de 0-300 µM. Posteriormente, se incubaron las células en normoxia y 5% de hipoxia durante 24 horas. Finalmente, se midió la viabilidad celular con el ensayo de MTS (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. 4.1.5. Recogida de células en condiciones limitantes de nutrientes Se sembraron 1x106 células en placas de 10 cm en medio sin glucosa o en medio sin glutamina con 100 mg/L de glucosa y se cambió el medio diariamente hasta que las células alcanzaron una confluencia del 80%, momento en el que se recogieron las células para su posterior extracción de ARN o proteínas (apartados 6.1 y 7.2 respectivamente). 4.1.6. Cuantificación de ROS mitocondrial Se sembraron 1,5x105 células en placas de 6 pocillos en medio completo, medio sin glutamina con 100 mg/L de glucosa y medio con glutamina y sin glucosa. Se Materiales y métodos 36 incubaron las células en normoxia durante 16-18 horas y se cambió el medio 30 minutos antes de comenzar la tinción con MitoSox Red (Invitrogen). Para ello, se eliminó el medio de cultivo, se lavaron las células con PBS, se añadió 1 ml de MitoSox Red 5 µM, diluido en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), y se incubaron las células durante 15 minutos a 37ºC en oscuridad. A continuación, se tripsinizaron las células y se lavaron dos veces con HBSS. Finalmente, se resuspendieron las células en 500 µl de PBS con 2% FBS y EDTA 5 mM y se examinó la suspensión celular en el citómetro analítico Canto II (BD Biosciences). 4.2. Ensayos de tumorigénesis Todos los ensayos de este apartado, a excepción del ensayo de formación de tumoresferas, se han realizado en dos condiciones diferentes de glucosa: medio con 4500 mg/L de glucosa (Sigma) y medio con 100 mg/L de glucosa (Gibco). 4.2.1. Ensayo de proliferación Se sembraron 1x104 células en pocillos de 35mm por triplicado. A las 24 horas (día 0) se fijaron las células del primer punto y cada 24 o 48 horas, dependiendo de la línea celular, se fijó un punto de la curva. El medio de las placas que permanecían en cultivo se cambió cada 3 días en el caso de las placas de glucosa alta y cada 2 días en las de glucosa baja. Las células se fijaron con glutaraldehido 0,5% y se tiñeron con cristal violeta 1%. Después de lavar y dejar secar las placas, el cristal violeta se disolvió en ácido acético 15% y se cuantificó el número relativo de células midiendo la absorbancia del cristal violeta a 595 nm. Los valores se representaron refiriéndolos al día 0. 4.2.2. Clonabilidad Las células fueron sembradas a baja densidad, 100 ó 1000 células en función de la línea celular, en placas de 10 cm por triplicado y cultivadas en condiciones estándar. El medio se cambió dos veces por semana y después de 10-15 días, se fijaron y tiñeron con cristal violeta. Después de lavar, se cuantificó el número de colonias. 4.2.3. Crecimiento en agar blando Para medir el crecimiento independiente de anclaje se resuspendieron 1x105 células en agarosa D-1 low EEO (iNtRON Biotechnology) 1,4% con medio de cultivo, por triplicado. Este medio con las células se echó encima de una base de medio con agar 2,8% previamente solidificado en pocillos de 35mm. Tras 24 horas, se añadieron Materiales y métodos 37 3ml de medio a cada pocillo, que se cambió dos veces por semana. Tras un mes, se tomaron fotos con un microscopio invertido (Olympus IX-71), se tiñó con cristal violeta 0,05% y se contó el número de colonias. 4.2.4. Ensayo de migración Las células se sembraron en pocillos de 35mm por triplicado y se cultivaron hasta alcanzar una monocapa. En ese momento, se generó una herida usando una punta de pipeta de 20µl. Se tomaron fotografías cada 4-6 horas, en función de la línea celular, hasta que se cerrase la herida por migración celular. Para obtener las fotografías se utilizó un microscopio invertido (Olympus IX-71). Finalmente, se cuantificó el área de la herida sin cerrar a diferentes tiempos. 4.2.5. Análisis y clasificación de clones Las células fueron sembradas a baja densidad, 100 ó 1000 células en función de la línea celular, en placas de 10 cm por triplicado y cultivadas en condiciones estándar. El medio se cambió dos veces a la semana y después de 10-15 días, una vez formados los clones, se observó la morfología de cada clon en un microscopio invertido (Olympus CKX41). Finalmente se hizo un recuento de cada tipo de clon en base a la siguiente clasificación: holoclón, constituido por células con propiedades de célula madre, paraclón, formado por células diferenciadas que no son capaces de reconstituir un cultivo y meroclón, compuesto por células con características intermedias entre holoclones y paraclones81-86. 4.2.6. Ensayo de formación de tumoresferas Se sembraron 3x103 células de la línea celular ACHN, y 5x103 células de las líneas A498, 786-O y CaKi-1, por triplicado en placas de baja adherencia. Las células se resuspendieron en 1 ml de medio MammoCult completo (Stem cell technologies), compuesto por medio basal MammoCult, suplemento de proliferación MammoCult, 4µg/ml de heparina, 0,48µg/ml de hidrocrotisona, 40 µg/ml de penicilina, 40 µg/ml de estreptomicina y 1 µg/ml de fungizona. Las células se cultivaron durante 4 días, momento en el que se tomaron fotos de las esferas formadas en un microscopio invertido (Olympus IX-71) y se cuantificó el número total de esferas. 4.2.7. Ensayo de formación de tumoresferas a partir de una célula aislada La suspensión de 1-2x106 células, previamente tripsinizada, se resupendió en 1 ml de PBS con 2% FBS y EDTA 5 mM. A continuación, se separó la suspensión célula a célula con el citómetro de flujo BD FACSJazz (BD Biosciences). Cada célula se Materiales y métodos 44 7. Técnicas de análisis de expresión a nivel de proteínas 7.1. Anticuerpos Los anticuerpos utilizados en esta tesis, así como su procedencia, especie, tipo (monoclonal o policlonal), aplicaciones y diluciones empleadas se detallan en la Tabla 5. Tabla 5. Anticuerpos utilizados en esta tesis WB: western blot; IP: inmunoprecipitación; IF: inmunofluorescencia. Anticuerpo Proveedor Dilución WB IP IF MYBBP1A (policlonal conejo) MYBBP1A (policlonal ratón) MYB (monoclonal ratón) c-MYB (policlonal conejo) VHL (policlonal conejo) UBTF (policlonal conejo) p53 FL393 (policlonal conejo) Acetil-p53(Lys382) (policlonal conejo) PGC1α (policlonal conejo) LKB1 (monoclonal conejo) AMPK α1+ AMPKα2 (monoclonal ratón) p-AMPK α1 (T183)+ p-AMPKα2 (T172) (policlonal conejo) SGLT1 (policlonal conejo) mTOR (monoclonal conejo) p-mTOR (Ser2448) (monoclonal conejo) S6 proteína ribosomal (monoclonal conejo) p-S6 proteína ribosomal (S235/236) (monoclonal conejo) p38 MAPK p-p38 MAPK (T180/Y182) LC3B p62 α- Tubulina Conejo anti-ratón HRP (policlonal) Cabra anti-conejo HRP (policlonal) Cabra anti-ratón Alexa Fluor 546 (policlonal) Cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 (policlonal) Proteintech 14524-AP Abcam ab89121 Millipore 05-175 Abcam ab117635 Santa cruz sc-5575 Novus biologicals NBP1-82545 Santa cruz sc-6243 Cell signalling 2525 Abcam ab54481 Cell signalling 27D10 Abcam ab80039 Abcam ab72845 Abcam ab14685 Cell signalling 2983 Cell signalling 5536 Cell signalling 2217 Cell signalling 4858 Cell signalling 9212 Cell signalling 9215 Abcam ab48394 Abcam ab109012 Sigma Aldrich T9026 Abcam ab97046 Abcam ab97051 ThermoFisher A21123 ThermoFisher A11008 1:2500 1:1000 1:400 1:1000 1:1000 1:1000 1:1000 1:1000 1:1000 1:1000 1:1000 1:1000 1:1000 1:2000 1:1000 1:1000 1:1000 1:20000 1:10000 1:5000 1:5000 1:1000 1:100 1:50 1:100 1:50 1:50 1:50 1:250 1:250 Materiales y métodos 45 7.2. Extracción de proteína total Las células se lavaron con PBS y se añadió sobre ellas un volumen apropiado de tampón de lisis RIPA (Tris-HCl 25 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, NP-40 1%, desoxicolato de sodio 1%, SDS 1%, Na3VO4 1mM, EDTA 0,5M pH 8,0, cóctel de inhibidores de fosfatasas (Sigma) y cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma)). Se mantuvieron 10 minutos en hielo, en agitación, y se recogieron los lisados en tubos de 1,5 ml. A continuación, se sonicaron las muestras durante 3 ciclos de 10 segundos al 40% de potencia. Posteriormente, los restos de debris celular se eliminaron por centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos a 4ºC y el sobrenadante (extracto proteico) se guardó en alícuotas a -20ºC. 7.3. Western blot La inmunodetección de proteínas se realizó de acuerdo a un protocolo estándar. En primer lugar, se determinó la cantidad de proteína mediante el ensayo de Bradford (Biorad), se disolvieron 30µg de muestra en tampón de carga (Tris-HCl 62.5 mM pH 6,8, glicerol 10%, SDS 1%, 2-mercaptoethanol 5%, azul de bromofenol 0.0025% (Sigma)) y se desnaturalizaron durante 5 minutos a 95ºC. Las proteínas se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida 8-12% (concentración dependiente del tamaño de la proteínas a detectar) en presencia de SDS, utilizando el sistema Mini- Protean Tetra Cell (Biorad). El tampón de electroforesis utilizado contenía Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0,1, pH 8,3). A continuación, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Amersham Protran 0,2 µm), utilizando el equipo Mini Trans-Blot Cell (BioRad). La transferencia se realizó a 400 mA durante 2h en tampón de transferencia (TrisHCl 25 mM, glicina 192 mM, 20% metanol, pH 8,3). Las membranas se bloquearon durante 2h en agitación. El tampón de bloqueo contenía PBS, 0.1% Tween20 y 3% de BSA. Posteriormente, se incubaron toda la noche con la dilución adecuada de anticuerpo primario en tampón de bloqueo y agitación. Al día siguiente, se retiró el exceso de anticuerpo mediante 3 lavados de 10 minutos con PBS-Tween 20 0,1% en agitación. Finalmente, se incubaron las membranas durante una hora con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa diluido en PBS-Tween 20 0,1% y se retiró el exceso de anticuerpo mediante 3 lavados con PBS-Tween 20 0,1% en agitación. La detección se realizó mediante una reacción quimioluminiscente (ECL, Amersham) y la visualización con los equipos Chemidoc o Chemidoc Touch (Biorad). Materiales y métodos 46 7.4. Cuantificación de bandas de western blot Para cuantificar las bandas de proteínas se usó el programa Image lab 5.1 de Biorad. Se seleccionó cada banda de forma indivual, se restó el fondo inespecífico a cada banda cuantificada y siempre se refirió el valor a un control de carga de la misma membrana, α-tubulina. 7.5. Inmunoprecipitación La inmunoprecipitación de proteínas se realizó de acuerdo a un protocolo estándar. En primer lugar, se cuantificó la cantidad de proteína de cada extracto mediante el ensayo de Bradford (Biorad). A continuación, se añadieron 50µl de bolas magnéticas (Cell signaling) en tubos de silicona de 1,5 ml para cada muestra. Se lavaron 2 veces con PBS-BSA (5mg/ml de BSA) con inhibidores de proteasa y fosfatasa (Sigma). Posteriormente, se añadió el anticuerpo diluido en PBS-BSA (dilución según anticuerpo en volumen final de 1 ml) a las bolas magnéticas y se incubaron durante 3 horas a 4oC en agitación. A continuación, se llevaron a cabo 2 lavados con PBS-BSA y se añadió 0,5 mg de proteína total, en volumen final de 500 µl, a las bolas unidas con el anticuerpo. Se incubaron durante toda la noche a 4oC en agitación. Al día siguiente, se separó mediante un imán la matriz formada por la unión bolas-anticuerpo del extracto que contiene las proteínas que no se han unido a la matriz, conservando este extracto (sobrenadante). Se continuó el proceso con la matriz con 2 lavados con PBS. Posteriormente, se realizaron 4 lavados con Igepal 0,2%. Las proteínas unidad a la matriz se eluyeron en 25 µl de tampón de carga 2X (SDS 4%, 2-mercaptoetanol 10%, glicerol 20%, azul de bromofenol 0,004%, Tris-HCl 0,125M pH6, 8) incubando las muestras 10 minutos a 70 oC. Finalmente, se realizó un western blot con las muestras eluidas y las muestras del extracto proteico que no se había unido a la matriz. 7.6. Inmunofluorescencia Se sembraron 3x105 células en placas de 6 pocillos, donde se habían introducido previamente dos cubreobjetos circulares estériles de 1 cm por pocillo, en medio de cultivo con 1000 mg/L de glucosa o 100 mg/L de glucosa. Al día siguiente se lavaron las células con PBS, se fijaron con una solución de paraformaldehído en PBS al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente y se permeabilizaron con tritón X-100 0,5% durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se lavó 2 veces con PBS y se incubaron las muestras en solución de bloqueo (PBS, tritón X-100 0,1%, BSA 3%) durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Posteriormente, se incubó con el Materiales y métodos 47 anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo (dilución según anticuerpo) durante 6-7 horas a 4ºC en agitación. Para estudios de co-localización de dos proteínas, después de la incubación con el primer anticuerpo primario, se realizaron 4 lavados de 5 minutos con PBS-Tritón 0,1%. Acto seguido, se incubó, en las mismas condiciones, con el segundo anticuerpo primario, que debía estar generado en una especie diferente al primer anticuerpo primario. A continuación, se realizaron 4 lavados de 5 minutos con PBS-Tritón 0,1% y se añadió el primer anticuerpo secundario Alexa 546 o 488 diluido en solución de bloqueo (1: 250) durante 2 horas a temperatura ambiente, en oscuridad. Posteriormente, tras lavar 4 veces durante 5 minutos con PBS-Tritón 0,1%, se añadió el segundo anticuerpo secundario, que debía estar marcado con un fluoróforo diferente al del primer anticuerpo secundario y se incubó en las mismas condiciones. Tras 4 lavados con PBS-Tritón 0,1% durante 5 minutos y un lavado con PBS de 5 minutos, los núcleos fueron teñidos con DAPI diluido en PBS (dilución 1:1000) durante 5 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. Finalmente, tras lavar con PBS, se montaron los cristales con solución ProLong Gold (Invitrogen). Las imágenes se obtuvieron con el microscopio confocal Leica TCS-SP2-AOBS y se analizaron con el software LCS Lite. 8. Análisis de muestras de pacientes 8.1. Cohorte de pacientes La cohorte de 97 pacientes, compuesta por muestras de micromatrices de tejido (TMAs) de carcinoma renal y sus correspondientes datos clínicos, se obtuvo del Biobanco del Hospital Universitario Virgen del Rocío-Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS). El comité ético del Hospital Universitario Virgen del Rocío/IBiS aprobó los procedimientos (Código: 0309-N-15). 8.2. Inmunohistoquímica Se cortaron láminas de tres micrómetros de grosor del bloque de TMA y se colocaron en portaobjetos con tratamiento específico para inmunohistoquímica (DAKO, Glostrup). Los portaobjetos se hornearon durante toda la noche a 56ºC, se desparafinaron en xileno durante 20 min, se rehidrataron en una serie graduada de etanol y se lavaron con PBS. A continuación, se llevó a cabo un paso de recuperación de epítopo inducida por calor. Para ello, se calentó el portaobjetos en una solución de de tampón de citrato de sodio a pH 6,5 durante 2 min en una olla a presión convencional. Posteriormente, se incubaron los portaobjetos con proteinasa K durante 10 min y se aclararon en agua corriente fría durante 5 min. A continuación, se inactivó Materiales y métodos 48 la actividad peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno 1,5% diluido en metanol (DAKO) durante 10 minutos. Acto seguido, se incubaron los portaobjetos con el anticuerpo primario anti-MYBBP1A (Proteintech #14524-AP) durante 40 min. Tras esta incubación, se realizó la inmunodetección con el sistema de visualización EnVision (DAKO, Glostrup) usando diaminobenzidina como sustrato, siguiendo las instrucciones del fabricante. La inmunotinción se realizó en un dispositivo de inmunotinción automática TechMate 500 (DAKO). La valoración de las muestras fue realizada por patólogos mediante análisis microscópico semicuantitativo de doble ciego. Se asignaron valores discretos entre 0 (expresión de MYBBP1A nula) y 3 (expresión más alta) en función de la intensidad de la señal. Por último, se hizo la media de las distintas valoraciones de cada muestra. 8.3. Análisis estadístico Las muestras se clasificaron en dos grupos en función de los niveles de expresión de MYBBP1A, definiéndose los grupos MYBBP1A bajo (MYBBP1A ≤ 1) y MYBBP1A normal (MYBBP1A > 1). Para establecer el punto de corte de esta clasificación se utilizó el programa de cálculos estadísticos SPSS 21.0. Posteriormente, se analizaron las variables tipo de tumor, estadio, grado histológico y metástasis en función de los niveles de MYBBP1A con el programa de análisis estadístico Graph Pad Prism 6, aplicándose el test estadístico T-student. Para los análisis de supervivencia se utilizó el programa SPSS 21.0. Se realizaron curvas Kaplan-Meier y se aplicó el test estadístico log-rank para comparar la distribución de la supervivencia entre los grupos MYBBP1A bajo y MYBBP1A normal. Se definió la supervivencia libre de enfermedad (SLE) como el tiempo transcurrido entre la fecha de la cirugía y la fecha de la primera recidiva o evento de progresión y la supervivencia global (SG) como el tiempo transcurrido entre la fecha de la cirugía y la última fecha de seguimiento. Para la supervivencia global se usó como criterio de punto final la muerte causada por la enfermedad. 9. Análisis de bases de datos públicas 9.1. Bases de datos En esta tesis se han utilizado las siguientes bases de datos: cBioPortal (http://www.cbioportal.org/): análisis de mutaciones en tumores humanos87,88. MapLab, aplicación Wanderer (http://maplab.imppc.org/): análisis de niveles de metilación en tumores humanos89. Materiales y métodos 49 NCBl (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/): secuencias de nucleótidos. GeneCards (http://www.genecards.org/): genes humanos. JASPAR ( http://jaspar.binf.ku.dk/cgi-bin/jaspar_db.pl): análisis de sitios de unión de factores de transcripción. 9.2. Análisis en R2 El análisis bioinformático de datos de pacientes de cáncer renal procedentes de bases de datos transcriptómicas públicas se realizó con la plataforma de visualización y análisis genómico R2 (http://hgserver1.amc.nl), desarrollada por el Departamento de Oncogenómica del Centro Médico Académico (AMC) de Ámsterdam. Se utilizaron seis bases de datos de cáncer renal en total. Para simplificar el análisis se agruparon las bases de datos disponibles en tres bases de datos: - Dykema-KORT: unión de dos bases de datos de muestras renales normales y tumorales. Se unieron estas dos bases de datos porque las muestras normales eran las mismas en ambas bases de datos, de forma que se unieron las muestras tumorales únicamente. Ambas bases de datos fueron generadas con la plataforma de Affymetrix u133p2 y normalizadas con el método mas5.0. - EXPO: base de datos de muestras tumorales, generada con la plataforma de Affymetrix u133p2 y normalizada con el método mas5.0. - TCGA: base de datos compuesta por tres bases de datos de muestras tumorales normalizadas, una base de datos de carcinoma renal de células claras, una base de datos de carcinoma renal de células papilares y una base de datos de carcinoma renal de células cromófobas. Todas estas bases de datos fueron generadas con la plataforma tcgars y normalizadas con el método rsem. El análisis de los niveles de expresión de MYBBP1A se realizó en primer lugar con las bases de datos Dykema-KORT y EXPO, ya que son comparables entre ellas por haber sido generadas con la misma plataforma y normalizadas con el mismo método. Se exportaron los valores de expresión de R2 al programa Graph Pad Prism 6, con el que se realizó el estudio estadístico con el test T-student. Se evaluaron los niveles de expresión de MYBBP1A en función del tipo de tumor y del estadio tumoral. Por otra parte se analizó la expresión de MYBBP1A en los distintos subtipos de tumores renales de la base de datos TCGA, comparando la expresión de MYBBP1A en tejido normal y tumoral. Materiales y métodos 50 Para identificar los genes cuya expresión correlacionaba positiva o negativamente con la expresión de MYBBP1A, se analizó la correlación entre MYBBP1A y los genes pertenecientes a los KEGG “Rutas de señalización que regulan la pluripotencia de las células madres”, “Glucólisis y gluconeogénesis” y “Ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) y ciclo del citrato” presentes en la plataforma R2. También se analizó la correlación entre la expresión de MYBBP1A y la expresión de los genes diana de c- MYB, en este caso se añadió la lista de genes diana de c-MYB definida en la base de datos “GeneCards” a la plataforma R2. Se examinaron estas correlaciones en las tres bases de datos y se seleccionaron únicamente aquellos genes que correlacionaban con MYBBP1A en al menos dos de las tres bases de datos analizadas con un p-valor inferior a 0,05. Además, se estudiaron correlaciones individuales entre la expresión de MYBBP1A y algunos genes relevantes en el estudio. Para ello, se exportaron los datos de expresión de R2 de cada una de las bases de datos analizadas a Graph Pad Prism 6, se representaron los niveles de expresión de MYBBP1A frente a cada uno de los genes seleccionados mediante gráficas de dispersión con regresión lineal y se calculó el coeficiente de correlación de Pearson con el p-valor asociado. Los diagramas de Venn se representaron con la herramienta online del grupo de Bioinformática y Genómica evolutiva de la Universidad de Gante (Bélgica) (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/). Las listas de genes obtenidas en la intersección del diagrama de Venn fueron clasificadas por KEGG y ordenadas por pvalor con la herramienta informática Enrichr (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/), desarrollada por el grupo de Biología de sistemas computacional de la escuela de medicina Icahn del Mount Sinai90,91 Finalmente, los “heatmaps” de la expresión de MYBBP1A y las selecciones de genes del KEGG “Rutas de señalización que regulan la pluripotencia de las células madres” y de los genes diana de c-MYB se generaron por distancia ciudad-bloque. Los heatmaps de los genes pertenecientes a los KEGG “Glucólisis y gluconeogénesis” y “Ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) y ciclo del citrato” se generaron por distancia Euclídea. 10. Análisis estadístico Utilizamos el programa informático GraphPad PRISM para todos los análisis estadísticos de los experimentos realizados con las líneas celulares y de los experimentos con xenografts. Para analizar las diferencias entre las líneas transfectadas con el shARN frente a MYBBP1A y las líneas transfectadas con el vector Materiales y métodos 51 control se utilizó el test estadístico T-student para muestras no pareadas o el test T- student con la corrección de Welch. Valores de p inferiores a 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos y se representaron según la siguiente clasificación: p< 0,05 (*), p< 0,01 (**), y p< 0,001 (***). Materiales y métodos 52 RESULTADOS Resultados 60 Para valorar la expresión de MYBBP1A en tumores renales realizamos tinciones inmunohistoquímicas de las muestras de la cohorte de estudio con un anticuerpo contra MYBBP1A. Observamos que tanto la mayoría de las muestras tumorales como las muestras de tejido normal mostraban una tinción clara de MYBBP1A en el núcleo de las células, sin embargo, un pequeño número de casos (8,24%) presentaban una expresión reducida o nula de MYBBP1A (Figura 8A y 8B). Además, al comparar la expresión de MYBBP1A entre las muestras de tejido normal y tumoral de los 4 pacientes con muestras pareadas, observamos una pequeña disminución estadísticamente significativa de la expresión de MYBBP1A en el tejido tumoral (Figura 8C). También observamos que la pérdida de MYBBP1A no está asociada con un determinado subtipo de tumor (Figura 8D). Figura 8. Pérdida de MYBBP1A en carcinomas de células renales. (A) Caracterización inmunohistoquímica de carcinomas de células renales. En la imagen de la izquierda se observa la tinción de una muestra tumoral con expresión normal de MYBBP1A y en la imagen de la derecha se muestra la tinción de una muestra tumoral con nula/baja expresión de MYBBP1A. (B) Análisis cuantitativo de la pérdida de la expresión de MYBBP1A en carcinomas de células renales. Representación de los porcentajes de carcinomas renales con nivel de expresión de MYBBP1A bajo y normal analizados por IHQ. Todas las muestras fueron valoradas según el siguiente criterio: niveles de expresión de MYBBP1A bajo ≤1; niveles de expresión de MYBBP1A normal >1. (C) Disminución de la expresión de MYBBP1A en muestras tumorales. Representación de la media de los niveles de expresión de MYBBP1A en muestras normales y tumorales pareadas (N=4). El test estadístico utilizado fue una T-student (*p>0,05). (D) Tipos de carcinoma de células renales en función de los niveles de MYBBP1A. Representación de la frecuencia de los distintos tipos de carcinomas de células renales en función de los niveles de expresión de MYBBP1A (bajo y normal). Resultados 61 Tampoco hay diferencias en función de los niveles de MYBBP1A en el grado histológico de los tumores (Figura 9A). Sin embargo, la reducción en la expresión de los niveles de MYBBP1A sí está relacionada con el proceso de metástasis en los tumores renales. Las muestras tumorales con niveles de expresión de MYBBP1A bajo presentaban estadios más avanzados de la enfermedad (Figura 9B) y un mayor porcentaje de casos de metástasis que las muestras con niveles de expresión de MYBBP1A normales (Figura 9C y 9D). Por último, los niveles de expresión de MYBBP1A no correlacionaban con el tratamiento recibido ni con el número de líneas de tratamiento recibidas (Figura 9E y 9F). Figura 9. La pérdida de MYBBP1A favorece el fenotipo metastásico. (A) La pérdida de MYBBP1A no está asociada con el grado histológico tumoral. Representación gráfica del grado histológico de las muestras tumorales analizadas en función de los niveles de MYBBP1A. (B) La pérdida de MYBBP1A está asociada a estadios avanzados en carcinomas de células renales. Representación gráfica del estadio de las muestras tumorales en función de los niveles de MYBBP1A. La media de los dos grupos se comparó mediante el test estadístico T-student (*** p<0,001). (C) y (D) La pérdida de MYBBP1A favorece la aparición de metástasis. (C) Representación gráfica del porcentaje de casos de metástasis en función de los niveles de expresión de MYBBP1A, bajo y normal. (D) Representación gráfica del porcentaje de casos de metástasis del total de muestras de cada grupo. (E) Tipos de tratamiento de quimioterapia utilizados y su correlación con los niveles de MYBBP1A. (TK: tirosina quinasa). (F) Número de líneas de tratamiento recibidas. Diagrama de barras que muestra el número de líneas de quimioterapia recibidas en los dos grupos analizados (NT: no tratados; 1L: una línea de quimioterapia; >1L: más de una línea de quimioterapia). Resultados 62 También analizamos la supervivencia libre de enfermedad (SLE), que se corresponde con el tiempo transcurrido entre la fecha de la cirugía y la fecha de la primera recidiva o evento de progresión, y la supervivencia global (SG), que se corresponde con el tiempo transcurrido entre la fecha de la cirugía y la última fecha de seguimiento de los pacientes, en función de los niveles de expresión de MYBBP1A. Al comparar la media de la SLE y SG en ambos grupos observamos un peor pronóstico tanto en SLE como en SG en el grupo de pacientes con niveles bajos de MYBBP1A (Figura 10A). Esta diferencia es más clara cuando analizamos la supervivencia mediante curvas Kaplan-Meier, especialmente en el caso de la SLE, donde podemos observar una menor SLE en el grupo de muestras tumorales con niveles de MYBBP1A bajo próxima a la significancia estadística (Figura 10B). Sin embargo, no obtuvimos resultados estadísticamente significativos probablemente debido a que el número de casos del grupo de niveles de baja expresión de MYBBP1A era muy pequeño. Figura 10. La pérdida de MYBBP1A reduce la supervivencia libre de enfermedad y la supervivencia global. (A) Análisis de la SLE y SG mediante diagrama de cajas y bigotes. Se comparó la media de las variables SLE y SG en los dos grupos analizados (niveles de MYBBP1A bajo y normal) con el test estadístico T-student. (B) Análisis de la SLE y SG mediante curvas Kaplan-Meier. Las curvas muestran una reducción tanto de la SLE como de la SG en el grupo de nivel de expresión de MYBBP1A bajo. Se aplicó el test estadístico log-rank. Resultados 63 Para corroborar estos resultados con datos procedentes de otra cohorte, analizamos la supervivencia global de pacientes con carcinomas renales de células claras de la base de datos pública TCGA mediante una curva Kaplan-Meier, en la que pudimos observar una reducción de la supervivencia global estadísticamente significativa en el grupo de pacientes con bajo nivel de expresión de MYBBP1A (Figura 11). Figura 11. Análisis de la supervivencia global de pacientes con carcinomas renales de células claras de la base de datos pública TCGA. Representación gráfica de una curva Kaplan-Meier que muestra una reducción en la supervivencia global de los pacientes con niveles bajos de MYBBP1A. Todos los resultados obtenidos en este apartado sugieren que MYBBP1A es un gen supresor de tumores cuya pérdida favorece el fenotipo metastásico. 2. MYBBP1A como gen supresor de tumores en células de carcinoma renal 2.1. Caracterización de líneas celulares de carcinoma renal Con objeto de continuar con la caracterización de MYBBP1A, seleccionamos cuatro líneas celulares derivadas de carcinomas de células renales para estudiar experimentalmente el papel de MYBBP1A como gen supresor de tumores. En primer lugar analizamos los niveles de expresión de MYBBP1A y de algunas proteínas que interaccionan con MYBBP1A y tienen un papel relevante en procesos tumorales, como c-MYB, pVHL y p53. Los niveles de MYBBP1A eran homogéneos en todas las líneas. Resultados 64 Sin embargo, sólo las líneas 786-O y A498 presentaban niveles claros de c-MYB. A su vez, estas dos líneas no expresaban pVHL (Figura 12A). Las líneas ACHN y CaKi-1 presentaban las características contrarias, carecían de la expresión de la proteína c- MYB y expresaban altos niveles de pVHL, principalmente de la isoforma 3 de 19 kDa. De acuerdo a datos publicados92, la línea 786-O es la única que tiene la proteína p53 mutada. Aunque se detectó p53 en todas ellas, la línea 786-O presentaba los niveles de p53 más altos, como correspondería a p53 mutada (Figura 12A). También analizamos los niveles de expresión de estas proteínas y de acetilación de p53 en el residuo de lisina 382 tras mantener las líneas celulares en medio con baja concentración de glucosa, sin observar variaciones significativas en sus niveles de expresión con respecto a las distintas condiciones de glucosa en el medio (Figura 12B). Figura 12. Caracterización molecular de las líneas celulares de carcinoma de células renales. (A) Estudio de los niveles de las proteínas MYBBP1A, c-MYB, pVHL, p53 y α-Tubulina a concentración alta de glucosa. Se cultivaron las células en medio con 4500 mg/L de glucosa, se extrajeron las proteínas y se analizaron por western blot. (B) Estudio de los niveles de las proteínas MYBBP1A, c- MYB, pVHL, p53, Ac-p53 y α-Tubulina a concentraciones media y baja de glucosa. Se cultivaron las células en medio con 1000 o 100 mg/L de glucosa respectivamente, se extrajeron las proteínas y se analizaron por western blot. Además, medimos los niveles de ARNm de MYBBP1A, c-MYB, AURKB y VHL en las cuatro líneas celulares por PCR cuantitativa (RT-qPCR) (Figura 13). Observamos que las líneas A498 y 786-O tenían niveles más altos de ARNm de MYBBP1A que las líneas ACHN y CaKi-1. La línea A498 presentaba la expresión más alta del ARNm de c-MYB, sin haber grandes diferencias entre las otras tres líneas celulares. La línea 786-O expresaba el nivel más elevado del ARNm de AURKB y la línea CaKi-1 el nivel más bajo (Figura 13). Finalmente, los niveles de expresión del ARNm de la variante 2 del gen VHL eran homogéneos en las cuatro líneas celulares. Sin embargo, cuando usamos una sonda que medía los niveles de expresión de las variantes 1 y 2, Resultados 65 observamos una diferencia clara entre la línea Caki-1 y las otras 3 líneas celulares, siendo CaKi-1 la línea con mayor expresión (Figura 13). Figura 13. Niveles de expresión de los genes MYBBP1A, c-MYB, Aurora quinasa B (AURKB) y VHL en líneas de carcinoma de células renales. Cuantificación de los niveles de ARNm por RT-qPCR. Se utilizaron dos sondas Taqman para el gen VHL, una que mide las variantes 1 y 2 (V 1,2) del ARNm y otra que se mide únicamente la variante 2 (V2). 2.2. Ausencia de translocación de MYBBP1A al nucleoplasma en condiciones limitantes de glucosa Se ha descrito que MYBBP1A se transloca del nucléolo al nucleoplasma cuando se producen situaciones de estrés, entre las que se encuentra la limitación de la glucosa disponible en el medio 40,52-56. Así pues, decidimos estudiar la translocación de MYBBP1A en nuestras líneas de carcinoma renal a baja concentración de glucosa. Para ello, intentamos reproducir en líneas de carcinoma renal el experimento realizado en líneas de cáncer de mama por Kumazawa et al42. Cultivamos las células a dos concentraciones de glucosa diferentes (1000 mg/L y 100 mg/L) y comparamos la localización de MYBBP1A en ambas situaciones por microscopía de fluorescencia confocal, utilizando la señal de la proteína UBF como control de localización del nucléolo. Sorprendentemente, no observamos una disminución de la cantidad de MYBBP1A en el nucléolo y correspondiente aumento de las cantidad de MYBBP1A en el nucleoplasma al disminuir la concentración de glucosa a 100 mg/L, como estaba descrito que ocurre en líneas de cáncer de mama (Figura 14A). Únicamente observamos diferencias en la localización nucleolar de MYBBP1A en la línea ACHN, en la que detectamos un aumento de la localización nucleolar de MYBBP1A a 100 mg/L de glucosa (Figura 14C). Resultados 66 Figura 14. La disminución de la concentración de glucosa no induce la translocación de MYBBP1A del nucléolo al nucleoplasma. (A) Localización de MYBBP1A en las líneas 786-O, ACHN y CaKi-1 a distintas concentraciones de glucosa. Las células se tiñeron usando anticuerpos contra UBF (control nucleolar), contra MYBBP1A y el colorante DAPI (control nuclear). La tinción no muestra aumento de la cantidad de MYBBP1A en el nucleoplasma a 100 mg/L con respecto a 1000 mg/L de glucosa en ninguna de las líneas celulares. (B) Ejemplo de co-localización de MYBBP1A y UBF usada en la cuantificación. (C) Porcentaje de co-localización de MYBBP1A y UBF en las líneas 786-O y ACHN. Se cuantificó el porcentaje de localización nucleolar de MYBBP1A a través de la co-localización de MYBBP1A y UBF (MYBBP1A+UBF) a distintas concentraciones de glucosa. Se observó el aumento de la localización nucleolar de MYBBP1A en la línea ACHN a 100mg/L de glucosa con respecto a 1000 mg/L de glucosa. El análisis estadístico se realizó con el test Chi-cuadrado (*p<0,05). También comprobamos si se producía un aumento en la cantidad de p53 en el nucleoplasma mediado por MYBBP1A en nuestras líneas celulares al disminuir la concentración de glucosa, ya que se ha descrito que la translocación de MYBBP1A al nucleoplasma induce el aumento de la acetilación y la acumulación de p53 40, 52-56. Cultivamos las células a 1000 y 100 mg/L y estudiamos la localización de MYBBP1A y p53 por microscopía de fluorescencia confocal, sin observar ni la translocación de MYBBP1A al nucleoplasma ni la acumulación de p53 en el nucleoplasma cuando reducíamos la concentración de glucosa a 100 mg/L (Figura 15). Resultados 67 Figura 15. La limitación de glucosa no induce la acumulación de p53 en líneas de carcinoma renal. Se tiñeron las células con DAPI (control nuclear) y con los anticuerpos contra MYBBP1A y p53. No se observó translocación de MYBBP1A al nucleoplasma a 100 mg/L de glucosa con respecto a 1000 mg/L de glucosa y por tanto no se detectó acumulación de p53 en el nucleoplasma. 2.3. Efecto de la sobreexpresión de MYBBP1A Una vez caracterizadas las líneas de carcinoma renal, el siguiente paso consistió en estudiar si la sobreexpresión de MYBBP1A tenía algún efecto en las propiedades tumorales de las células. Para ello transfectamos las cuatro líneas celulares con un vector que expresaba el gen MYBBP1A o con un vector vacío y realizamos un ensayo de clonabilidad para medir la capacidad de crecimiento. Realizamos este experimento con dos vectores diferentes, pcDNA3 y pWZL, que expresaban el gen MYBBP1A con distintos marcadores de selección y distintos promotores de expresión eucariótica. En ambos casos observamos que la sobreexpresión de MYBBP1A reducía el número de Resultados 68 colonias formadas prácticamente a cero (Figura 16). Este efecto se producía en todas las líneas independientemente de si expresaban o no pVHL o c-MYB, indicando que MYBBP1A suprime el crecimiento celular independientemente del contexto molecular. Tabla 8. Cuantificación de las colonias formadas en el ensayo de clonabilidad tras la sobreexpresión de MYBBP1A. El número de colonias formadas por las células que expresaban el vector vacío se tomó de referencia (100%) y el número de colonias formadas por las células que sobreexpresaban MYBBP1A se refirió al 100%. nd: no determinado. 2.4. Efecto de la reducción de la expresión de MYBBP1A y su relación con metástasis Tras observar que la sobreexpresión de MYBBP1A suprimía el crecimiento celular en las líneas de carcinoma renal analizamos el efecto de la reducción de la expresión de MYBBP1A. Para ello, realizamos una transfección estable en las cuatro líneas celulares con varios shARNs contra MYBBP1A. Primero transfectamos la línea 786-O con un vector control que expresaba una secuencia “scramble” que no afecta a la Línea celular pCDNA3 (% colonias) pACTMYBBP1A (% colonias) pWZL (% colonias) pWZLMYBBP1A (% colonias) A498 100 0 nd nd 786-O 100 0 100 14 ACHN 100 0 100 0 CaKi-1 100 0 100 0 Figura 16. La sobreexpresión de MYBBP1A suprime el crecimiento de las líneas celulares de carcinoma de células renales. Imágenes del resultado del ensayo de clonabilidad en las líneas A498, 786- O, ACHN y CaKi-1. Se observan colonias en las líneas transfectadas con el vector vacío, sin observarse colonias en las líneas transfectadas con el ADNc de MYBBP1A (excepto en el caso de la línea 786-O pWZL- MYBBP1A donde se aprecia un número muy reducido de colonias). Resultados 69 expresión de ningún gen de la célula y con 4 shARNs con distintas secuencias contra MYBBP1A y elegimos el shARN que mejor reducía los niveles de MYBBP1A (Figura 17A). A continuación transfectamos el resto de las líneas celulares con el vector control y el shARN seleccionado (shARN4) y validamos la reducción de los niveles de MYBBP1A tanto a nivel de proteína (Figura 17B) como de ARNm (Figura 17C). Figura 17. Validación del shARN contra MYBBP1A. (A)Elección del mejor shARN contra MYBBP1A. Western blot en el que se observa el efecto de los 4 shARN contra MYBBP1A. Tanto el sh1 como el sh4 reducen los niveles de MYBBP1A pero el sh4 produce una reducción mayor. (B) Validación del shARN contra MYBBP1A en las líneas A498, ACHN y CaKi-1. Western blot en el que se observa la reducción de los niveles de MYBBP1A en las líneas transfectadas con el shARN contra MYBBP1A con respecto a las líneas con el vector control. (C) Cuantificación de los niveles de ARNm de MYBBP1A. Validación del efecto del sh4 contra MYBBP1A por RT-qPCR. Se normalizaron los niveles de expresión de las células transfectadas con el sh4 en función de los niveles de las células transfectadas con el vector control. Para el análisis estadístico se utilizó el test t-student. La gráfica muestra la media de 3 repeticiones independientes realizadas en triplicado (*p<0,05). Una vez generadas las líneas estables con niveles reducidos de MYBBP1A o con el vector control, realizamos una serie de ensayos para medir las propiedades tumorales de las células en dos condiciones: concentración alta de glucosa (4500 mg/L) y concentración baja de glucosa (100 mg/L), con objeto de estudiar si las células respondían al estrés por reducción de glucosa de forma diferente al reducir la expresión de MYBBP1A. En primer lugar realizamos una curva de crecimiento de cada línea celular en las distintas condiciones de glucosa para comparar la tasa de proliferación de las líneas que expresaban el vector control y las líneas con niveles bajos de MYBBP1A. Observamos que las líneas A498 y 786-O con niveles reducidos de MYBBP1A crecían más rápido que las líneas con el vector control tanto en glucosa alta como baja, aunque en la línea A498 la diferencia era mayor en glucosa alta y en la línea 786-O en glucosa baja (Figura 18). Sin embargo, las líneas ACHN y CaKi-1 con niveles reducidos de MYBBP1A crecían a la misma velocidad que las líneas control (Figura 18). Resultados 76 Figura 23. Las líneas A498 y 786-O con niveles reducidos de MYBBP1A forman tumores de mayor tamaño que las células control cuando se inyectan en ratones inmunodeprimidos. Se representa la media del volumen tumoral + error estándar de la media. Se muestra una foto representativa de los tumores formados por cada línea celular. Se analizaron los datos con el test estadístico t-student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Figura 24. Las líneas A498 y 786-O con niveles bajos de MYBBP1A favorecen la aparición de metástasis cuando se inyectan en ratones inmunodeprimidos. Diagrama de barras en el que se representa el número de metástasis observadas en cada órgano. Resultados 77 2.5. Efecto de la reducción de la expresión de MYBBP1A en el fenotipo de célula madre Después de observar la relación entre la pérdida de MYBBP1A y el desarrollo de metástasis estudiamos el efecto de la reducción de MYBBP1A en las propiedades de célula madre de las células tumorales, puesto que se ha propuesto que las células madres tumorales son las responsables de los procesos de recaída y metástasis2. En primer lugar analizamos el fenotipo de los clones que se forman al sembrar las células a baja densidad, ya que se ha descrito su relación con las capacidades de crecimiento81-85. En función del fenotipo los clones se clasifican en holoclones, constituidos por células con propiedades de célula madre, paraclones, formados por células diferenciadas que no son capaces de reconstituir un cultivo y meroclones, compuestos por células con características intermedias entre holoclones y paraclones81-86. Para realizar este estudio sembramos las células a baja densidad, analizamos el fenotipo de los clones individuales formados a los 14-20 días y realizamos el recuento de los distintos tipos de clones presentes en cada placa. Observamos el aumento del porcentaje de holoclones en las líneas A498 y 786-O con niveles reducidos de MYBBP1A con respecto a las células control. Este aumento se producía tanto a alta como a baja concentración de glucosa, pero cada línea presentaba un comportamiento distinto, el aumento era mayor a glucosa alta que a glucosa baja en la línea A498 y al revés en la línea 786-O (Figura 25). Sin embargo, no observamos este aumento en las líneas ACHN y CaKi-1 con niveles bajos de MYBBP1A (Figura 25). Por otro lado, se ha descrito la existencia de poblaciones celulares capaces de crecer en suspensión en medio sin suero formando agrupaciones celulares llamadas tumoresferas82,93,94. Estas tumoresferas se caracterizan por su capacidad de autorenovación tras ser disgregadas, por estar enriquecidas en progenitores epiteliales multipotentes95 y por presentar altos niveles de expresión de marcadores de células madre tumorales96. En base a las características que presentan, medimos la formación de tumoresferas en nuestras líneas celulares. Observamos que tanto la línea A498 como la línea 786-O con niveles reducidos de MYBBP1A formaban un mayor número de tumoresferas que las células control (Figura 26). En cambio, no encontramos diferencias en el número de tumoresferas entre las líneas ACHN con niveles bajos de MYBBP1A y las líneas control (Figura 26). Resultados 78 Figura 25. Efecto de la reducción de MYBBP1A en el fenotipo de los clones. A la izquierda se muestran fotos representativas de los holoclones, meroclones y paraclones de las 4 líneas celulares. A la derecha se representa gráficamente la media ± SD de los porcentajes de los distintos tipos de clones de las células control y las células con niveles bajos de MYBBP1A. El experimento fue realizado 3 veces independientes en triplicado y el análisis estadístico se realizó con el test t-student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Figura 26. Efecto de la reducción de los niveles de MYBBP1A en la formación de tumoresferas en líneas de carcinoma de células renales. En la parte superior se muestran fotos representativas de las tumoresferas formadas al crecer las células control y las células con niveles reducidos de MYBBP1A en suspensión en medio sin suero. En la parte inferior se representa la media ± desviación típica del porcentaje del número de esferas formadas en las líneas con niveles bajos de MYBBP1A en relación al número de esferas formadas en las líneas control. Los experimentos se repitieron un mínimo de 3 veces independientes en triplicado. El análisis estadístico se realizó con el test t-student (*p<0,05). Para explorar en mayor profundidad la capacidad de las células de crecer en suspensión en medio sin suero, analizamos la capacidad de formar una esfera a partir de una célula aislada. Con este fin tripsinizamos las células, las separamos por Resultados 79 citometría de flujo y sembramos una célula por pocillo en medio sin suero. A los 30-45 días cuantificamos el número y el tamaño de las esferas formadas. Observamos un aumento en el número y en el tamaño de las esferas en la línea A498 con niveles reducidos de MYBBP1A con respecto a la línea control tanto a glucosa alta como baja (Figura 27). No apreciamos diferencias en el número de esferas entre la línea ACHN con niveles reducidos de MYBBP1A y la línea control, pero el tamaño de las esferas era menor en las células con MYBBP1A bajo (Figura 27). El número de esferas de las células con niveles reducidos de MYBBP1A aumentaba a glucosa alta pero disminuía a glucosa baja con respecto a las células control en la línea CaKi-1, aunque no había diferencias estadísticamente significativas en el tamaño de las esferas en ninguna de las dos concentraciones de glucosa (Figura 27). Sin embargo, no pudimos cuantificar el número de esferas en la línea 786-O con niveles reducidos de MYBBP1A porque en estas células con crecimiento muy rápido el alto consumo de glutamina no permitía mantener la concentración de glutamina estable en el medio en periodos largos de tiempo y las células no crecían bien. Figura 27. Ensayo de formación de esferas a partir de una célula aislada. En la parte izquierda de la figura se muestran fotos representativas de las esferas formadas en cada una de las líneas celulares a glucosa alta (4500 mg/L) y a glucosa baja (100 mg/L). En la parte derecha se representa la media ± desviación típica de la eficiencia de formación de esferas (porcentaje de pocillos con esferas del total de pocillos sembrados). El análisis estadístico se realizó con el test t-student (*p<0,05;**p<0,01; ***p<0,001). N.D.: no determinado. Resultados 80 A continuación medimos la expresión de algunos factores de transcripción implicados en rutas de señalización que regulan la pluripotencia de las células madre (NANOG, OCT4 SOX2, KLF4, MYC Y BMI1)97-102. Observamos un aumento en la expresión de los genes NANOG en las líneas A498 y 786-O con niveles reducidos de MYBBP1A con respecto a las células control (Figura 28). En la línea 786-O con niveles bajos de MYBBP1A se producía también el aumento de la expresión de OCT4 y SOX2 (Figura 28). Sin embargo, no vimos diferencias en la expresión de ninguno de estos genes entre las células control y las células con niveles bajos de MYBBP1A en las líneas ACHN y CaKi-1 (Figura 28). Figura 28. Efecto de la reducción de MYBBP1A en la expresión de genes relacionados con el fenotipo de célula madre. Cuantificación de los niveles de ARNm de los genes NANOG, OCT4, SOX2, KLF4, MYC y BMI1 por RT-qPCR. Las gráficas muestran la relación de los niveles de expresión de cada gen de las células con niveles reducidos de MYBBP1A (sh) entre la expresión de las células control (V). El análisis estadístico se realizó con el test t-student (*p<0,05;**p<0,01; ***p<0,001). Los experimentos se repitieron un mínimo de 3 veces en triplicado También medimos la expresión de genes implicados en la transición epiteliomesénquima (TWIST1, FOXC2, VIM y SNAI1), puesto que se ha descrito que la inducción de este proceso está asociada a la aparición de las células madres tumorales103. La expresión de TWIST1 aumentaba en las líneas A498 y 786-O con niveles reducidos de MYBBP1A con respecto a las células control, pero no observamos este aumento las líneas ACHN y CaKi-1 con bajo MYBBP1A (Figura 29). Sin embargo, observamos un aumento en la expresión de VIM en la línea ACHN con niveles bajos de MYBBP1A en comparación con las células control (Figura 29). Resultados 81 Figura 29. Efecto de la reducción de MYBBP1A en la expresión de genes involucrados en la transición epitelio-mesénquima. Cuantificación de los niveles de ARNm de los genes TWIST1, FOXC2, VIM y BMI1 por RT-qPCR. Las gráficas muestran la relación de los niveles de expresión de cada gen de las células con niveles reducidos de MYBBP1A (sh) entre la expresión de las células control (V). El análisis estadístico se realizó con el test t-student (*p<0,05;**p<0,01; ***p<0,001). Los experimentos se repitieron un mínimo de 3 veces en triplicado Con el fin de corroborar que la reducción de los niveles de MYBBP1A induce la aparición del fenotipo de célula madre en las células tumorales, repetimos algunos de estos experimentos en las líneas 786-O y ACHN transfectadas con el segundo sh. Concretamente realizamos el ensayo de tumoresferas y medimos la expresión de los genes involucrados en la regulación de la pluripotencia de las células madre en los que habíamos observado diferencias significativas. De nuevo observamos un pequeño incremento en el número de tumoresferas formadas por las células con niveles bajos de MYBBP1A con respecto a las células control en la línea 786-O (Figura 30A). También aumentaba la expresión de NANOG y SOX2 en la línea 786-O con niveles reducidos de MYBBP1A en comparación con la línea control, pero este aumento no se producía en la línea ACHN (Figura 230B). Resultados 82 Figura 30. Efecto del segundo shARN frente a MYBBP1A en el fenotipo de célula madre en las líneas 786-O y ACHN. (A) Ensayo de formación de tumoresferas en las líneas 786-O y ACHN. Se muestran fotos representativas de las tumoresferas formadas por cada línea celular. En las gráficas se representa la media + desviación típica del porcentaje del número de esferas formadas en las líneas con niveles bajos de MYBBP1A en relación al número de esferas formadas en las líneas control. Los experimentos se repitieron un mínimo de 3 veces en triplicado. Se realizó el análisis estadístico con el test t-student sin obtener diferencias estadísticamente significativas. (B) Cuantificación de los niveles de ARNm de los genes NANOG, OCT4 y SOX2 por RT-qPCR. Las gráficas muestran los niveles de expresión de cada gen en las células con niveles reducidos de MYBBP1A (sh2) en relación a la expresión de las células control (V2). El análisis estadístico se realizó con el test t-student (*p<0,05). 3. La reducción de MYBBP1A induce la activación de c-MYB Los resultados obtenidos hasta el momento sugieren que en nuestro modelo existe una relación funcional entre MYBBP1A y c-MYB que se traduce en un una ventaja proliferativa de las células tumorales. Para estudiar este efecto biológico en profundidad, analizamos en primer lugar si existía una co-localización de MYBBP1A y c-MYB en las líneas celulares de carcinoma renal a distintas concentraciones de glucosa. Observamos una co-localización clara entre MYBBP1A y c-MYB en el núcleo, específicamente en el nucléolo, de las líneas que contenían altos niveles de c-MYB, A498 y 786-O, en todas las concentraciones de glucosa (Figura 31). No observamos esta co-localización en la línea ACHN, que no expresa c-MYB (Figura 31). Resultados 83 Figura 31. Co-localización nucleolar de MYBBP1A y c-MYB en líneas de carcinoma de células renales con altos niveles de c-MYB. Se tiñeron las células con los anticuerpos contra MYBBP1A y c- MYB y con DAPI (control nuclear). Se observó co-localización entre MYBBP1A y c-MYB en el nucléolo de las líneas A498 y 786-O tanto a 1000 como a 100 mg/L de glucosa. A continuación medimos los niveles de expresión de algunos genes diana de c- MYB, cuya transcripción se produce directamente por la activación c-MYB, como CD34 y CXCR4. Observamos el aumento de la transcripción de estos genes Resultados 84 solamente en las líneas A498 y 786-O con niveles reducidos de MYBBP1A con respecto a las células control, pero no encontramos este efecto en las líneas ACHN y CaKi-1 (Figura 32A). Obtuvimos resultados similares cuando medimos la expresión de estos genes en las líneas 786-O y ACHN transfectadas con el segundo shARN contra MYBBP1A, aumentando la transcripción de CD34 y CXCR4 únicamente en la línea 786-O con niveles reducidos de MYBBP1A en comparación con las células control (Figura 32B). Figura 32. Efecto de la disminución de los niveles de MYBBP1A en la inducción de la transcripción de genes diana de c-MYB. (A) Cuantificación de los niveles de ARNm de los genes diana de c-MYB CD34 y CXCR 4 por RT-qPCR. (B) Cuantificación de los niveles de ARNm de los genes diana de c-MYB CD34 y CXCR4 en las líneas transfectadas con el segundo shARN contra MYBBP1A (sh2) por RT-qPCR. Las gráficas muestran la relación de los niveles de expresión de cada gen en las células con niveles reducidos de MYBBP1A entre la expresión de las células control de 3 experimentos realizados en triplicado. El análisis estadístico se realizó con el test t-student (*p<0,05;**p<0,01; ***p<0,001). Como habíamos observado previamente un aumento de las propiedades biológicas características de las células madres en las líneas con niveles altos de c- MYB y reducidos de MYBBP1A, y se ha descrito que CD34 es un marcador de superficie de células progenitoras de varios tejidos104, estudiamos el porcentaje de células que expresaban CD34. Para ello, medimos por citometría de flujo el porcentaje de células CD34+ de cada línea celular. De nuevo aumentaba el porcentaje de células CD34+ en las líneas A498 y 786-O con niveles bajos de MYBBP1A, sin producirse este aumento en las líneas ACHN y CaKi-1 (Figura 33, Tabla 9). Resultados 85 Figura 33. Efecto de la disminución de los niveles de MYBBP1A en el porcentaje de células CD34+ de las líneas celulares de carcinoma de células renales. Se cuantificó el porcentaje de células CD34+ de cada línea celular por citometría de flujo. Se muestra la media del porcentaje de células CD34+ de las células control (V) y las células con niveles bajos de MYBBP1A (sh) de 3 experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó con el test t-student (*p<0,05;**p<0,01). Tabla 9. Porcentaje de células CD34+ de cada línea celular. Línea celular Células CD34+ (% total) Valor p A498 V 0,296 0,0276 (*) sh 0,881 786-O V 0,023 0,003 (**) sh 0,062 ACHN V 0,035 0,793 sh 0,040 CaKi-1 V 0,129 0,507 sh 0,092 Se muestra la media del porcentaje de células CD34+ de cada línea celular y el resultado del test estadístico t-student aplicado para comparar la media del porcentaje de células CD34+ de las células control y de las células con niveles bajos de MYBBP1A en cada línea celular. Finalmente, como las líneas celulares que presentaban niveles altos de c-MYB no expresaban pVHL, estudiamos la relevancia de pVHL en el fenotipo asociado a la reducción de los niveles de MYBBP1A. En primer lugar analizamos la correlación entre la expresión de MYBBP1A, c-MYB y VHL en la base de datos transcriptómicos pública Dykema-Kort, que contiene muestras renales de tejido normal y tumoral. En esta base de datos no existía ninguna correlación entre la expresión de VHL y la expresión de MYBBP1A o c-MYB en las muestras de tejido normal, sin embargo en las muestras de tejido tumoral tanto MYBBP1A como c-MYB mostraban una tendencia de correlación negativa con VHL (r=-0,27 y r=-0,19), sugiriendo una posible relación negativa entre VHL y c-MYB y entre VHL y MYBBP1A (Figura 34A y 34B). En base a esta observación, sobreexpresamos el ADNc de VHL en la línea 786-O control y en la línea Resultados 92 5. Plasticidad metabólica de células con niveles reducidos de MYBBP1A La plasticidad metabólica consiste en la capacidad de las células en utilizar unas rutas metabólicas u otras en función de las necesidades de la célula y de la disponibilidad de nutrientes. MYBBP1A se aisló en un rastreo genético por pérdida de función en ausencia de glucosa, indicando que su pérdida facilita la adaptación de las células a la ausencia de glucosa. En base a este hecho y a que habíamos observado en nuestro modelo que las células con niveles bajos de MYBBP1A reducían la expresión de los genes de la glucólisis en condiciones limitantes de glucosa, analizamos las rutas metabólicas activadas en las células control y en las células con bajo MYBBP1A a distintas concentraciones de glucosa. Para ello, cultivamos la línea 786-O control y la línea 786-O con niveles reducidos de MYBBP1A en medio con glucosa alta (4500 mg/L) y baja (100 mg/L) y realizamos una PCR con matrices de genes prediseñadas, que incluían sondas para 96 genes pertenecientes a distintas rutas de señalización del metabolismo de la glucosa. Utilizamos la línea 786-O para este experimento porque es una línea que se usa frecuentemente en ensayos de metabolismo y porque era la línea con mayor tasa de crecimiento en las curvas de crecimiento realizadas a glucosa baja. Al comparar la expresión de las células con bajo MYBBP1A con las células control a concentración de glucosa alta, observamos el aumento de la expresión de varios genes del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) (CS, PC, IDH2, MDH2, SUCLA2, SUCLG1, SUCLG2) y de algunos genes implicados en la gluconeogénesis y en la ruta de las pentosas fosfato (Figura 39B). En cambio observamos la disminución de la expresión de dos genes de la glucólisis (HK3, GPI) (Figura 39B). Por otro lado, a glucosa baja encontramos el aumento de la expresión de varios genes involucrados en la gluconeogénesis (FBP1, G6PC, GYS2, PCK1, GCK, PYGM) (Figura 41B), proceso regulado también por PGC-1α108. Finalmente, al comparar las diferencias de expresión entre las células con bajo MYBBP1A y las células control comunes en ambas concentraciones de glucosa, observamos el aumento de la expresión de GALM y GYS2, enzimas implicadas en el metabolismo de la galactosa y del glucógeno respectivamente, y la disminución de la expresión de GPI, enzima que cataliza el segundo paso de la glucólisis, tanto a glucosa alta como baja (Figura 39C). Estos resultados confirman nuestros datos anteriores en relación a la represión de los genes de la glucólisis al reducir los niveles de MYBBP1A y sugieren el aumento del metabolismo oxidativo y de la gluconeogénesis. Resultados 93 Figura 39. PCR array de genes involucrados en el metabolismo de la glucosa en las líneas 786-O control y 786-O con bajo MYBBP1A a glucosa alta y baja. (A) Diagramas de dispersión en los que se representan en rojo los genes sobreexpresados, en verde los genes infraexpresados y en negro los genes sin diferencias de expresión en las células con niveles reducidos de MYBBP1A (sh) con respecto a las células control (V). (B) Tablas en las que se especifican los genes sobreexpresados (rojo) e infraexpresados (verde) en la línea 786-O con niveles reducidos de MYBBP1A (sh) frente a la línea control (V). (C) A la izquierda se representa el diagrama de Venn de los genes sobreexpresados y a la derecha el diagrama de Venn de los genes infraexpresados en la línea con bajo MYBBP1A frente a la línea control tanto a glucosa alta (4500 mg/L) como baja (100 mg/L). Resultados 94 A continuación, evaluamos la capacidad de adaptación de las células con niveles reducidos de MYBBP1A a distintas condiciones de limitación de nutrientes. Cuando cultivamos las líneas 786-O control (V) y 786-O con bajo MYBBP1A (sh) en medio con glutamina y sin glucosa, observamos que las células control no crecían mientras que las células con bajo MYBBP1A crecían rápido (Figura 40A), indicando la reprogramación metabólica a OXPHOS. Encontramos un efecto similar cuando cultivamos las células a baja concentración de glucosa (100 mg/L) y sin glutamina, aunque en esta ocasión las células control mostraban cierto crecimiento al usar la glucosa como fuente de carbono (Figura 40B). La diferencia entre ambas líneas celulares era más evidente cuando cultivamos las células en medio con glutamina y con glucosa baja, presentando las células con bajo MYBBP1A una tasa de proliferación 4 veces mayor que las células control (Figura 40C). Sin embargo en hipoxia, cuando la ventaja que proporciona el oxígeno a las células que basan su metabolismos en OXPHOS desaparece, no existen diferencias en el crecimiento entre las dos líneas celulares (Figura 40D). Observamos resultados similares cuando cultivamos las células transfectadas con el segundo sh en estas condiciones (Figura 40E-F). Figura 40. La reducción de MYBBP1A induce la reprogramación metabólica a OXPHOS en la línea 786-O. (A) Ensayo de curva de crecimiento en medio con glutamina y sin glucosa en normoxia. (B) Curva de crecimiento en medio con glucosa (100 mg/L) y sin glutamina en normoxia. (C) Curva de crecimiento en medio con glutamina y glucosa (100 mg/L) en normoxia. (D) Curva de crecimiento en medio con glutamina y glucosa (100 mg/L) en hipoxia (5%). (E) Curva de crecimiento en medio con glutamina y sin glucosa en normoxia (sh2). (F) Curva de crecimiento en medio con glutamina y glucosa (100 mg/L) en hipoxia (5%) (sh2). Todos los ensayos se realizaron tres veces por triplicado. Se representa la media ± SD. El análisis estadístico se realizó con el test t-student (*p<0,05; **p<0,01). Resultados 95 Para analizar la contribución de la vía de OXPHOS al metabolismo celular en mayor profundidad medimos la sensibilidad de la línea 786-O control y de la línea 786- O con niveles reducidos de MYBBP1A a rotenona, compuesto que inhibe la actividad del complejo I de la cadena de transporte de electrones de la mitocondria109. La rotenona es un compuesto muy tóxico para las células, pero es igual de tóxico para las células control y las células con bajo MYBBP1A en medio con glutamina y sin glucosa, tanto en normoxia (Figura 41A) como en hipoxia (Figura 41B). Sin embargo, cuando cultivamos las células en medio con glucosa baja y sin glutamina en normoxia, las células con bajo MYBBP1A presentan mayor sensibilidad a rotenona que las células control (Figura 41C). En cambio, en hipoxia esta diferencia desaparece, ya que la ausencia de oxígeno impide la reprogramación metabólica a OXPHOS (Figura 41D). Encontramos resultados similares cuando analizamos la sensibilidad a rotenona en la línea 786-O transfectada con el segundo shARN contra MYBBP1A (Figura 41E-H). Figura 41. Efecto de la reducción de MYBBP1A en la sensibilidad a rotenona en la línea 786-O. (A) Ensayo de sensibilidad a rotenona en medio con glutamina y sin glucosa en normoxia. (B) Ensayo de sensibilidad a rotenona en medio con glutamina y sin glucosa en hipoxia (5%). (C) Ensayo de sensibilidad a rotenona en medio con glucosa (100 mg/L) y sin glutamina en normoxia. (D) Ensayo de sensibilidad a rotenona en medio con glucosa (100 mg/L) y sin glutamina en hipoxia. (E) Ensayo de sensibilidad a rotenona en medio con glutamina y sin glucosa en normoxia (sh2). (F) Ensayo de sensibilidad a rotenona en medio con glutamina y sin glucosa en hipoxia (5%) (sh2). (G) Ensayo de sensibilidad a rotenona en medio con glucosa (100 mg/L) y sin glutamina en normoxia (sh). (H) Ensayo de sensibilidad a rotenona en medio con glucosa (100 mg/L) y sin glutamina en hipoxia (sh2). Se representa la media ± SD de cada ensayo. El análisis estadístico se realizó con el test t-student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). Para corroborar la reprogramación metabólica a OXPHOS con otra aproximación experimental cuantificamos la producción de ROS mitoncondrial, puesto que uno de Resultados 96 los productos de la fosforilación oxidativa es la formación de superóxido en la mitocondria. Con esta finalidad, cultivamos las células control y las células con bajo MYBBP1A de las líneas 786-O (c-MYB+ y pVHL-) y ACHN (c-MYB- y pVHL+) en medio con glucosa alta, medio con glucosa baja y medio con glutamina y cuantificamos los niveles de ROS mitocondrial en cada condición por citometría de flujo. Observamos un aumento significativo en la producción de ROS mitocondrial en la línea 786-O con bajo MYBBP1A con respecto a la línea control en medio con glutamina y sin glucosa, pero no encontramos diferencias en ninguna condición en la línea ACHN (Figura 42), indicando que la reducción de MYBBP1A induce el cambio metabólico a OXPHOS en ausencia de glucosa solamente en la línea c-MYB+ 786-O. Figura 42. Efecto de la reducción de MYBBP1A en la producción de ROS mitocondrial. Se cultivaron las células control y las células con bajo MYBBP1A en medio completo, medio con glucosa baja (100 mg/L) y medio con glutamina. Se cuantificaron los niveles de ROS mitocondrial por tinción con mitosox y análisis por citometría de flujo. Se midió la mediana de la intensidad de la señal de mitosox en cada condición. Se muestran los niveles de ROS mitocondrial en medio con glucosa baja y medio con glutamina en relación a la producción de ROS en medio completo en porcentaje. Se representa la media de 3 experimentos independientes ± desviación típica. El análisis estadístico se realizó con el test tstudent (*p<0,05). La reprogramación metabólica de glucólisis a OXPHOS debería traducirse en una mayor producción de ATP en la célula, al ser el ciclo de Krebs más eficiente desde el punto de vista energético, genera 36/38 moléculas de ATP por molécula de glucosa mientras que la glucólisis genera 2 moléculas de ATP por molécula de glucosa consumida. Para confirmar esta hipótesis medimos la cantidad de ATP producida en nuestras células en condiciones limitantes de glucosa. En primer lugar medimos los niveles de ATP de las líneas 786-O control y 786-O con bajo MYBBP1A en distintas condiciones. Observamos una mayor producción de ATP en las células con bajo MYBBP1A cuando crecíamos las células en medio con glutamina y sin glucosa (Figura 43A), pero no observamos este incremento en medio con glucosa baja y sin glutamina Resultados 97 (Figura 43A), sugiriendo que estas células usan preferentemente la glutamina como fuente de producción de ATP. En cambio, cuando medimos el balance ATP/ADP en estas líneas observamos un ligero aumento en este balance en las células con bajo MYBBP1A en comparación con las células control en ambas condiciones, aunque el aumento era más claro cuando las células se encontraban en medio con glutamina (Figura 43B). Posteriormente medimos la producción de ATP en condiciones limitantes de glucosa en el resto de las líneas celulares. Observamos una mayor producción de ATP tanto en medio con glutamina y sin glucosa como en medio con glucosa baja y sin glutamina en la línea A498 con niveles reducidos de MYBBP1A, pero no en la línea ACHN (Figura 43C-D). En la línea CaKi-1 con niveles reducidos de MYBBP1A no aumentaban los niveles de ATP en medio con glucosa baja y sin glutamina, aunque sorprendentemente observamos una mayor producción de ATP en medio con glutamina, sugiriendo la activación de un ruta de degradación de la glutamina alternativa que no requiere la actividad de c-MYB (Figura 43E). Figura 43. Efecto de la reducción de MYBBP1A en la producción de ATP celular. (A) Cuantificación de los niveles de ATP en la línea 786-O en medio con glutamina y sin glucosa y en medio sin glutamina y con glucosa baja (100 mg/L). Se cuantificaron los niveles de ATP en unidades de luminiscencia por concentración de proteína. Se representan los niveles de ATP de las células con MYBBP1A bajo en base a los niveles de ATP de las células control (100%). Se muestra la media de 3 experimentos realizados de forma independiente por triplicado. (B) Cuantificación del balance ATP/ADP en la línea 786-O en medio con glutamina y sin glucosa y en medio sin glutamina y con glucosa baja (100 mg/L). Se cuantificaron los niveles de ATP y ADP en unidades de luminiscencia por concentración de proteína. Se representa el balance ATP/ADP de las células con MYBBP1A bajo en base a los niveles de ATP de las células control (100%). Se muestra la media de 3 experimentos realizados de forma independiente por triplicado. (C) (D) y (E) Cuantificación de los niveles de ATP celular en las líneas A498, ACHN y CaKi-1 en medio con glutamina y sin glucosa y en medio sin glutamina y con glucosa baja (100 mg/L). Se cuantificaron los niveles de ATP en unidades de luminiscencia por concentración de proteína. Se representan los niveles de ATP de las células con MYBBP1A bajo en base a los niveles de ATP de las células control (100%). Se muestra un experimento representativo de 3 experimentos realizados de forma independiente por triplicado. El análisis estadístico se realizó con el test t-student (*p<0,05; **p<0,01). Resultados 98 A continuación, caracterizamos el estado de las rutas LKB1-AMPK y mTOR en nuestro modelo, puesto que se ha descrito que son rutas metabólicas que integran las señales de crecimiento celular con la disponibilidad de nutrientes. Para ello, medimos los niveles de LKB1, AMPK, p-AMPK, mTOR, p-mTOR, S6 y p-S6, efector final de la ruta de mTOR, a glucosa alta y baja. No encontramos diferencias significativas en los niveles de LKB1, AMPK y p-AMPK entre las células control y las células con bajo MYBBP1A en ninguna de las líneas celulares, indicando que MYBBP1A no participa en la regulación de esta vía (Figura 44A). Sin embargo, observamos un aumento en la fosforilación de S6 en las células con bajo MYBBP1A en comparación con las células control en las líneas A498 y 786-O tanto a glucosa alta como baja, mostrando que la reducción de MYBBP1A conduce a la activación de la ruta de mTOR en células tumorales que expresan c-MYB y no expresan pVHL (Figura 44A). Finalmente, tras haber observado que la reducción de MYBBP1A conduce al aumento de la vía de OXPHOS y a la disminución de la glucólisis, exploramos si la reducción de MYBBP1A aumentaba el proceso de autofagia, el cual puede actuar como fuente de precursores para la síntesis de macromoléculas. Con este fin, medimos los niveles de p62 y LC3B en nuestro modelo celular a glucosa alta y baja, pero no encontramos diferencias significativas en los niveles de estas proteínas entre las células con bajo MYBBP1A y las células control en ninguna de las líneas celulares (Figura 44B). Nuestros datos indican que la pérdida de MYBBP1A proporciona mayor plasticidad metabólica a las células para adaptarse a condiciones en las que la concentración de glucosa es limitante, usando glutamina como fuente de carbono y ATP. Sin embargo, sólo las células que expresan c-MYB y no expresan pVHL son capaces de llevar a cabo la reprogramación metabólica de glucólisis a OXPHOS tras la reducción de los niveles de MYBBP1A. Resultados 99 Figura 44. Efecto de la reducción de MYBBP1A en la regulación de rutas metabólicas y de la autofagia. (A) Efecto de la reducción de MYBBP1A en la activación de las rutas LKB1-AMPK y mTOR. Se midieron los niveles de LKB1, AMPK, p-AMPK, mTOR, p-mTOR, S6 y p-S6 en las células con MYBBP1A bajo (sh) y en las células control (V) de las 4 líneas celulares a glucosa alta (4500 mg/L) y baja (100 mg/L) por WB. (B) Cuantificación de los niveles de p-S6. Se muestra la normalización de los niveles de p-S6 (S235/236) utilizando α-Tubulina como control de carga. (C) Efecto de la reducción de MYBBP1A en el proceso de autofagia. Se midieron los niveles de p62 y LC3B en las células con MYBBP1A bajo (sh) y en las células control (V) de las 4 líneas celulares a glucosa alta (4500 mg/L) y baja (100 mg/L) por WB. Resultados 100 6. Análisis de expresión de MYBBP1A en bases de datos públicas de tumores renales Nuestros datos sugerían que la pérdida de MYBBP1A induce el aumento de algunas propiedades tumorales en líneas celulares de carcinoma de células renales que expresan c-MYB. Además, la pérdida de MYBBP1A conduce al aumento de la actividad de c-MYB y PGC-1α en las líneas celulares que no expresan pVHL. Para corroborar en tumores humanos el papel de MYBBP1A en el desarrollo tumoral observado en nuestro modelo celular, realizamos un análisis bioinformático con bases de datos transcriptómicas públicas y con la plataforma de visualización y análisis genómico R2. Analizamos 6 bases de datos de muestras de tumores renales para estudiar tanto los niveles de expresión de MYBBP1A como la correlación entre la expresión de MYBBP1A y genes de rutas de señalización involucradas en la iniciación y el desarrollo tumoral. Con el objetivo de simplificar el análisis agrupamos las bases de datos disponibles en 3 grupos: EXPO (contiene muestras tumorales de varios subtipos de carcinomas de células renales), TCGA (unión de 3 bases de datos, una base de datos de CCRcc, una base de datos de CCRp y una base de datos de CCRcr) y Dykema-Kort (unión de dos bases de datos que contienen muestras normales y tumorales de varios subtipos de carcinomas de células renales). Analizamos los niveles de expresión de MYBBP1A en las bases de datos transcriptómicas de R2. Tanto en la base de datos Dykema-Kort como en la base de datos EXPO no encontramos diferencias significativas al comparar la media de la expresión de MYBBP1A del tejido normal y del tejido tumoral de la mayoría de subtipos, excepto en el subtipo de CCRp, que presentaba mayor expresión de MYBBP1A que el tejido normal. Sin embargo, en la base de datos EXPO observamos un grupo de muestras de CCRcr, CCRcc y CCRp con niveles de MYBBP1A más bajos que el tejido normal. (Figura 45A). Además, en la base de datos EXPO los valores de expresión de MYBBP1A más bajos se encontraban en estadios tumorales avanzados, en los estadios III y IV (Figura 45B). En la base de datos TCGA observamos resultados similares, la media de la expresión de MYBBP1A era mayor en el tejido tumoral que en el tejido normal, pero había un grupo de muestras de CCRcc que presentaban niveles de MYBBP1A más bajos que el tejido normal (Figura 45C). Resultados 101 Figura 45. Niveles de expresión de MYBBP1A en tumores renales humanos. (A) Niveles de expresión de MYBBP1A en distintos subtipos de carcinomas de células renales. Se representan los niveles de expresión normalizados de MYBBP1A de las muestras de tejido normal y de los distintos subtipos de tumores renales de las bases de datos Dykema-Kort y EXPO. El análisis estadístico se realizó con el test t-student (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). (B) Niveles de expresión de MYBBP1A en distintos estadios de tumores renales. Se representan los niveles de expresión normalizados de MYBBP1A de las muestras de tejido normal y de las muestras tumorales de las bases de datos Dykema- Kort y EXPO en función de los distintos estadios tumorales. (C) Niveles de expresión de MYBBP1A en CCRcr, CCRcc y CCRp. Se representan los niveles de expresión normalizados de MYBBP1A de las muestras de tejido normal y de los distintos subtipos de tumores renales de la base de datos TCGA. El análisis estadístico se realizó con el test de Wilcoxon. Datos procedentes de las plataformas R2 y MapLab. Como habíamos encontrado una relación funcional entre MYBBP1A, c-MYB y PGC-1α en las líneas de carcinoma renal que expresaban c-MYB y no expresaban pVHL, estudiamos si existía alguna correlación entre la expresión de estos genes. Para ello analizamos los coeficientes de correlación de Pearson para todas las posibles combinaciones de estos genes (MYBBP1A-c-MYB, MYBBP1A-VHL, c-MYB- VHL, MYBBP1A-PGC-1α, pVHL-PGC-1α, etc.) en todas las bases de datos. No encontramos correlaciones claras, la mayoría de los valores de los coeficientes de correlación de Pearson eran bajos y existía bastante variabilidad de unas bases de datos a otras. La ausencia de correlaciones concluyentes podría deberse a que las interacciones entre estos genes se producen fundamentalmente a nivel de proteína, no de ARNm. Resultados 108 En conjunto, los datos obtenidos del análisis de la bases de datos transcriptómicas de pacientes de cáncer de riñón sugieren que la pérdida de MYBBP1A se asocia con la expresión de genes reguladores del metabolismo oxidativo a través de c-MYB y PGC-1α. . . DISCUSIÓN Discusión 110 Discusión 111 El microambiente tumoral es un entorno heterogéneo y dinámico determinante en el desarrollo tumor, en el que se producen continuamente cambios en la disponibilidad de nutrientes y en los niveles de oxígeno relacionados con la compleja red de vascularización del tumor. Frecuentemente se producen deficiencias locales y/o temporales en la vascularización del tumor que provocan la ausencia de glucosa, de oxígeno o de otros nutrientes esenciales para el desarrollo del tumor. En este entorno crítico, los eventos genéticos que permitan el crecimiento o la supervivencia de las células en estas condiciones les proporcionarán una ventaja selectiva sobre el resto de las células tumorales. La caracterización de los mecanismos moleculares que permiten la adaptación de las células tumorales a entornos críticos permitiría identificar nuevas dianas con potencial antitumoral. Por este motivo, nos centramos en la identificación de genes críticos en la adaptación de las células a ambientes con limitación de nutrientes. Mediante un rastreo genético de pérdida de función encontramos que la disminución de la expresión de MYBBP1A permite el crecimiento de las células en ausencia de glucosa. MYBBP1A es un supresor de tumores que inhibe la actividad de c-MYB. La disminución de MYBBP1A libera la actividad de c-MYB, conduciendo a la activación de la transcripción de los genes regulados transcripcionalmete por c-MYB y al aumento de la población de células madres tumorales. Además, la activación de c- MYB induce la expresión de PGC-1α, regulador de procesos metabólicos cuya actividad también es inhibida por MYBBP1A. De este modo, la pérdida de MYBBP1A provoca la activación de PGC-1α directa e indirectamente, induciendo el cambio metabólico de glucólisis a OXPHOS, el cual es más eficiente para producir energía en condiciones de limitación de glucosa30. Por tanto, la combinación de estos dos efectos causados por la disminución de la expresión de MYBBP1A proporciona una ventaja selectiva a las células tumorales. Hemos comprobado que la pérdida de expresión de MYBBP1A es relevante en tumores humanos. Mediante un análisis de los niveles de ARNm de MYBBP1A en muestras pareadas de tejido normal y tumoral hemos detectado la reducción de expresión de MYBBP1A en tumores de riñón, hígado y páncreas principalmente. Además, se han identificado numerosas mutaciones en el gen MYBBP1A en distintos tipos de tumores humanos, siendo la mayoría mutaciones con cambio de sentido. También se han descrito deleciones con cambio de ORF y otras mutaciones sin cambio de ORF a menor frecuencia. Nuestros resultados y los datos de expresión procedentes de la base de datos TCGA indican que la reducción de MYBBP1A es especialmente relevante en tumores renales. Además, la degradación de MYBBP1A está regulada por el gen supresor de tumores VHL69, el cual se encuentra mutado, Discusión 112 delecionado o silenciado epigenéticamente en el 85% de los CCRcc esporádicos aproximadamente71. En base a estas observaciones hemos analizado una cohorte de pacientes de cáncer renal, detectando la reducción o pérdida de expresión de la proteína MYBBP1A en un 8% de los tumores. También hemos encontrado que la reducción o pérdida de la proteína MYBBP1A está asociada con la aparición de metástasis, puesto que los pacientes con tumores con baja expresión de MYBBP1A presentan estadios avanzados de la enfermedad y una mayor tasa de aparición de metástasis que los pacientes con tumores con niveles de expresión normales de MYBBP1A. Asimismo, los pacientes con tumores con baja expresión de MYBBP1A presentan una clara tendencia de peor pronóstico, tanto SLE como SG, que los pacientes con tumores con niveles normales de MYBBP1A. Este peor pronóstico ha sido confirmado con una curva Kaplan-Meier de SG en pacientes de CCRcc de la base de datos TCGA, en la que hemos observado una disminución estadísticamente significativa de la SG de pacientes con tumores con niveles bajos de MYBBP1A con respecto a pacientes con tumores con niveles normales de MYBBP1A. Esta asociación de la pérdida de MYBBP1A con la aparición de metástasis y peor prognosis apoya nuestros resultados, los cuales indican que la reducción de la expresión de MYBBP1A conduce al aumento de la población de las células madres tumorales. Con el fin de identificar el mecanismo molecular mediante el cual MYBBP1A actúa como un gen supresor de tumores, hemos analizado el efecto de la sobreexpresión y del silenciamiento de MYBBP1A en líneas celulares de carcinoma renal. La sobreexpresión de MYBBP1A suprime el crecimiento celular en todas las líneas celulares utilizadas independientemente del contexto molecular. Por otro lado, la reducción de los niveles de MYBBP1A incrementa las propiedades tumorales, concretamente la proliferación, formación de colonias y crecimiento independiente de anclaje, únicamente en las líneas celulares que expresan c-MYB. También hemos observado la inducción del fenotipo equivalente a célula madre tumoral en las líneas c- MYB+, puesto que la reducción de los niveles de MYBBP1A en estas líneas provoca el aumento del número de holoclones, de la capacidad de formación de tumoresferas y de la expresión de genes relacionados con la regulación de la pluripotencia de las células madres tumorales y con la transición epitelio-mesénquima, como NANOG y TWIST1 respectivamente. Estos resultados manifiestan la relevancia de c-MYB en el mecanismo de acción de MYBBP1A. Al contrario que c-MYB, que se localiza mayoritariamente en el nucleoplasma y se expresa fundamentalmente en la médula ósea, criptas del colon y nichos neurogénicos44,48, MYBBP1A es una proteína que se localiza predominantemente en el nucléolo y se expresa en todos los tejidos44,62. Se ha Discusión 113 descrito que MYBBP1A se localiza en el nucléolo en condiciones normales, produciéndose su translocación al nucleoplasma como consecuencia de la disminución del ARN nucleolar en condiciones de estrés, como situaciones de déficit de glucosa45. Sin embargo, al analizar la localización de MYBBP1A en líneas de carcinoma de células renales mediante microscopía de fluorescencia, no hemos observado la translocación de MYBBP1A del nucléolo al nucleoplasma al disminuir la concentración de glucosa. Esta ausencia de translocación podría deberse a un efecto dependiente del tipo de línea celular, puesto que la translocación de MYBBP1A en respuesta a la disminución de la concentración de glucosa se había realizado en una línea celular de cáncer de mama, o por no haber conseguido las condiciones exactas de estrés por limitación de glucosa en las líneas de carcinoma renal. Sin embargo, los ensayos de inmunofluorescencia revelaron la co-localización de MYBBP1A y c-MYB en el nucléolo de las líneas de carcinoma renal tanto a glucosa alta como a glucosa baja. Este dato apoya la hipótesis de que MYBBP1A actúa como un supresor tumoral inhibiendo la actividad de c-MYB. MYBBP1A se identificó en primer lugar por su unión al dominio NRD de c-MYB a través de motivos de cremalleras de leucina44,110, sugiriéndose que podría actuar regulando la actividad transcripcional de c-MYB44 pero no se ha descrito el efecto de esta posible regulación. En nuestro modelo celular, hemos observado que la reducción de la expresión de MYBBP1A en las líneas que expresan c-MYB se traduce en un aumento de la actividad transcripcional de c-MYB, puesto que aumentan los niveles de ARNm de NANOG, CD34 y CXCR4, genes regulados transcripcionalmente por c- MYB49,111. Tanto c-MYB como NANOG, CD34 y CXCR4 están involucrados en la adquisición y mantenimiento del fenotipo de célula madre48,104,112-121. c-MYB regula los procesos de auto-renovación y diferenciación, impidiendo la diferenciación de las células 48,112-114. NANOG es un factor de transcripción esencial para el mantenimiento de la pluripotencia de las células madres embrionarias115-117. CD34 es una proteína de membrana que se identificó en primer lugar en células progenitoras y células madre hematopoyéticas, pero posteriormente se ha detectado su expresión en células progenitoras de otros tejidos104. Por otra parte, no se han establecido marcadores de superficie específicos de células madres tumorales en tumores renales, pero se ha descrito que CXCR4 es esencial para el mantenimiento de las células madres tumorales renales 118 y varios estudios proponen que sería un buen candidato como marcador específico de células madres tumorales en dichos tumores119-121. En conjunto, la activación de la transcripción de genes diana de c-MYB involucrados en el fenotipo de célula madre junto con el dato de co-localización de MYBBP1A y c-MYB, Discusión 114 apuntan a que MYBBP1A es un represor de c-MYB, de forma que la reducción de la expresión de MYBBP1A induce la activación de c-MYB, siendo el resultado final el aumento del fenotipo de célula madre tumoral. En consonancia estos resultados no se observaron al reducir la expresión de MYBBP1A en líneas celulares que no expresan c-MYB (ACHN y CaKi-1). Al estudiar el efecto de la reducción de la expresión de MYBBP1A in vivo mediante modelos de xenografts, hemos observado un aumento del tamaño tumoral y la aparición de metástasis únicamente al inyectar células que expresaban c-MYB. Este resultado apoya de nuevo nuestra teoría de que la reducción de MYBBP1A aumenta la población de células madres tumorales a través de la activación de c-MYB, ya que se ha descrito que las células madres tumorales son las responsables de los procesos de recaída y metástasis2,122. Además de inducir el fenotipo de célula madre, hemos demostrado que c-MYB activa la transcripción de PGC-1α, puesto que la sobreexpresión de c-MYB produce el aumento de los niveles de ARNm de PGC-1α. Así mismo, la pérdida de MYBBP1A activa a PGC-1α de forma directa e indirecta. De forma directa, se ha publicado que MYBBP1A se une a PGC-1α regulando negativamente su actividad como co-activador transcripcional50. Además, los resultados del ensayo de co-inmunoprecipitación de nuestro modelo celular apuntan en la misma dirección, pues observamos la unión entre MYBBP1A y PGC-1α en condiciones normales y la ausencia de dicha interacción en las líneas celulares con niveles reducidos de MYBBP1A. De este modo, la reducción o pérdida de MYBBP1A aumentaría la actividad de PGC-1α a través de dos mecanismos distintos, la activación de la proteína por su des-represión y el aumento de la transcripción del gen por activación de c-MYB. Por otra parte, se ha descrito que la fosforilación de PGC-1α por p38 MAPK evita la unión de MYBBP1A a PGC-1α, impidiendo su represión a PGC-1α50. En nuestro modelo celular hemos observado el aumento de la fosforilación de p38 al reducir la expresión de MYBBP1A únicamente en las líneas que expresaban c-MYB. Además, se ha descrito que la activación de p38 está relacionada con la vía de señalización de CXCR4123-126, de modo que la activación de c-MYB por pérdida de MYBBP1A podría inducir también la fosforilación de p38 indirectamente al aumentar los niveles de expresión de CXCR4, retroalimentado positivamente la activación de PGC-1α. Esto supondría un tercer mecanismo de activación de PGC-1α tras la pérdida de MYBBP1A. Nuestros resultados concuerdan con un estudio de homeostasis de glucosa en ratones hipomórficos para Prep1, en el que se relaciona el descenso de los niveles de Discusión 115 MYBBP1A con el aumento de la expresión de PGC-1α y GLUT4 tanto a nivel de ARNm como de proteína72. Otra evidencia de la activación de PGC-1α en nuestro modelo es la reducción de la expresión de genes de la glucólisis, puesto que se ha descrito que PGC-1α inhibe la glucólisis en melanoma al disminuir la estabilidad de HIF1α a nivel de proteína, conduciendo a la disminución de la expresión de genes que codifican para enzimas o proteínas relacionadas con la glucólisis y la producción de lactato107. Además de inhibir la glucólisis, la activación de PGC-1α favorece el metabolismo oxidativo35,36,50. Las células c-MYB+ con niveles reducidos de MYBBP1A presentan mayor tasa de proliferación en medio con glucosa baja y en medio con glutamina como única fuente de carbono. Este aumento de la proliferación se produce en normoxia pero no en hipoxia, debido a que en ausencia de oxígeno desaparece la ventaja que proporciona el oxígeno a las células que basan su metabolismo en la respiración aeróbica. Además, estas células presentan mayor sensibilidad a rotenona exclusivamente en presencia de oxígeno, indicando que la respiración mitocondrial es su principal fuente de ATP. Las células c-MYB+ con niveles reducidos de MYBBP1A también producen mayor cantidad de ROS mitocondrial en medio con glutamina como única fuente de carbono, reflejando un incremento en la actividad del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Por tanto, el resultado final de la activación de PGC-1α es el cambio metabólico de glucólisis a OXPHOS. Esta reprogramación metabólica es más evidente cuando las células se encuentran en medio con glutamina como única fuente de carbono, indicando que las células con niveles reducidos de MYBBP1A podrían basar su metabolismo en la glutaminolisis, favoreciendo la adaptación de las células a situaciones de escasez de glucosa. De este modo, la pérdida de MYBBP1A provoca la activación de PGC-1α, directamente al liberarse PGC-1α e indirectamente a través de la activación de c-MYB, la cual induce la reprogramación metabólica a OXPHOS, aumenta la glutaminolisis y la sensibilidad a inhibidores de la cadena respiratoria, sugiriendo así una alternativa terapéutica para este tipo de tumores. Además de regular la biogénesis de la mitocondria y sus funciones, como la respiración mitocondrial, PGC-1α regula la gluconeogénesis. Mediante su unión al factor de transcripción FOXO1, PGC-1α activa la transcripción de genes gluconeogénicos, entre los que se encuentran G6PC y PCK1108. El análisis de expresión de genes implicados en el metabolismo de la glucosa en la línea 786-O muestra que a glucosa baja las células con niveles reducidos de MYBBP1A incrementan la expresión de varios genes de la gluconeogénesis, entre los que se encuentran G6PC, FBP1 y PCK1. La gluconeogénesis se realiza en el hígado (80%) y Discusión 116 en el riñón (20%), pero los aminoácidos a partir de los guales se lleva a cabo la síntesis de glucosa difieren en cada caso, siendo la alanina el principal aminoácido gluconeogénico en el hígado y la glutamina en el riñón127. De este modo, el aumento de la gluconeogénesis por activación de PGC-1α podría favorecer, junto con la reprogramación metabólica a OXPHOS, la proliferación de las células renales con niveles reducidos de MYBBP1A en medio con glucosa baja pero con concentraciones normales de glutamina. Al regular todos estos procesos metabólicos en las células tumorales, PGC-1α participa en el mantenimiento de la homeostasis metabólica y promueve la supervivencia de las células tumorales y la metástasis en microambientes restrictivos41. Sin embargo, la relevancia del papel de PGC-1α en procesos tumorales no reside únicamente en su función como sensor metabólico, sino en la regulación de su actividad por oncogenes y factores de transcripción involucrados en procesos tumorales y en la adquisición de la plasticidad metabólica. Por ejemplo, el factor de transcripción MITF induce la expresión de PGC-1α aumentando la capacidad mitocondrial de un subgrupo de melanomas28. Al contrario, el oncogen MYC reprime la expresión de PGC-1α en células tumorales pancreáticas favoreciendo el metabolismo glucolítico128. MYC ejerce un papel central en la plasticidad metabólica de las células tumorales. En función de las condiciones del microambiente tumoral promueve la glucólisis aeróbica activando la expresión de enzimas de la glucólisis e inhibiendo la expresión de PGC-1α, o induce el metabolismo oxidativo activando la expresión de genes involucrados en la oxidación mitocondrial de la glutamina24,25,31,128. En el contexto de plasticidad metabólica, c-MYB podría actuar de forma contraria a MYC activando la expresión de PGC-1α en condiciones limitantes de glucosa, la cual conduciría al aumento de la respiración mitocondrial y de la gluconeogénesis. Sin embargo, aunque la expresión de PGC-1α está regulada por c-MYB no hemos observado lo opuesto, PGC-1α no regula la expresión de c-MYB. Por tanto, la inducción del fenotipo de célula madre depende de la activación de c-MYB de forma independiente a PGC-1α. También hemos observado que la reducción de MYBBP1A induce la activación de mTOR, quinasa que actúa como un nodo de señalización que integra las señales del microambiente. De este modo, mTOR participa en la regulación de la supervivencia, proliferación y metabolismo de las células tumorales en función de la disponibilidad de aminoácidos, de oxígeno y del estado energético de las células129,130. Se ha descrito que tanto la vía de señalización PI3K como la vía Ras-MAPK activan a Discusión 117 mTOR, mientras que la vía de AMPK inhibe su acción130. En nuestro modelo celular hemos observado que la activación de mTOR por pérdida de MYBBP1A se produce únicamente en líneas celulares que expresan c-MYB y carecen de pVHL. A través de análisis proteómicos se ha identificado que MYBBP1A es una diana de ubiquitinación de pVHL69. La unión de pVHL a MYBBP1A provoca la degradación de MYBBP1A de forma dependiente de hierro y del proteasoma69. También se ha observado que la restauración de la expresión de pVHL en la línea 786-O conduce al aumento del contenido de ADN mitocondrial y de proteínas de la cadena respiratoria, favoreciendo así la producción de ATP mitocondrial131. En base a estos descubrimientos se ha propuesto que tumores deficientes en VHL presentarían niveles estabilizados de MYBBP1A, conduciendo a una mayor represión de PGC-1α y a la reducción de la respiración mitocondrial69. Nuestros resultados demuestran que la reducción de MYBBP1A en líneas celulares que expresan c-MYB y no expresan pVHL induce la activación de PGC-1α, confirmando el papel central de MYBBP1A en la regulación de la respiración mitocondrial a través de PGC-1α. Sorprendentemente, también hemos encontrado una relación de exclusividad entre c-MYB y pVHL, puesto que las líneas que expresan c-MYB no expresan pVHL y viceversa. Se ha descrito que B-MYB, otro miembro de la familia de genes MYB, es otra de las dianas de pVHL para la degradación vía proteasoma132, siendo la interacción entre B-MYB y la isoforma 3 de pVHL (19 kDa) más clara que con la isoforma 1 de pVHL (30 kDa). Además, se ha descrito que todos los miembros de la familia MYB, c-MYB incluido, interaccionan con pVHL132. Sin embargo, en nuestros experimentos no hemos observado cambios significativos en la expresión de c-MYB ni de MYBBP1A al restaurar la expresión de pVHL en la línea 786-O. Esta ausencia de efecto podría deberse a la existencia de varias isoformas de pVHL, ya que al sobreexpresar VHL detectamos la isoforma 1 en vez de la isoforma 3 de pVHL, mientras que en las líneas celulares pVHL+ utilizadas en nuestro estudio, ACHN y CaKi-1, detectamos la isoforma 3. Otros autores también han descrito que la isoforma 3 de pVHL es la que se expresa mayoritariamente en la línea CaKi-1133. El gen VHL da lugar a dos variantes de ARNm (V1 y V2) que codifican para tres isoformas de la proteína. V1 codifica para las isoformas 1 y 3, siendo la isoforma 3 más pequeña porque su traducción comienza en un codón interno del marco abierto de lectura del gen VHL, concretamente en el codón 54133,134. Tanto la isoforma 1 como la 3 actúan como supresores de tumores, pero se diferencian en su localización, la isoforma 1 se encuentra fundamentalmente en el citoplasma mientras que la isoforma 3 se distribuye equitativamente entre el citoplasma y el núcleo133,134. V2 codifica para la isoforma 2, cuyo peso molecular aparente es 23 kDa. Sin embargo, el papel de la Conclusiones 124 10. MYBBP1A es un gen supresor de tumores que inhibe la actividad de c-MYB y PGC-1α, siendo las células tumorales que expresan c-MYB y no expresan pVHL las que se benefician de la pérdida de MYBBP1A. CONCLUSIONS 126 127 1. MYBBP1A expression is lost in some human tumors such as renal, liver and pancreas tumors. 2. The expression of MYBBP1A is lost or reduced in 8% of the renal tumor samples of our cohort of study. Loss or reduction of MYBBP1A is associated to metastasis and poor prognosis. 3. MYBBP1A overexpression suppresses cell growth in renal carcinoma cell lines regardless of the molecular context. 4. Downregulation of MYBBP1A in c-MYB+ and pVHL- renal carcinoma cell lines induces c-MYB activation, leading to transcriptional activation of its target genes and the increment of cancer stem cell-like phenotype. 5. Downregulation of MYBBP1A induces PGC-1α activation directly by desrepressing PGC-1α activity and indirectly by increasing PGC-1α levels through c-MYB-dependent transcription. 6. Downregulation of MYBBP1A induces a metabolic shift from glycolysis to OXPHOS through PGC-1α activation. 7. The expression of MYBBP1A correlates negatively with the expression of SMARCAD1, PGCF5, REST, SMAD2 and SMAD4 in renal tumors. These genes also correlate positively with the expression of PGC-1α. There is a subgroup of clear cell renal cell carcinomas with low expression levels of MYBBP1A and high expression levels of PGC1α, SMARCAD1, PGCF5, REST, SMAD2 and SMAD4. 8. The expression of MYBBP1A correlates negatively with the expression of c- MYB target genes in renal tumors and several of these genes correlates positively with the expression of PGC-1α. These c-MYB target genes are mainly involved in metabolic pathways. 9. The expression of MYBBP1A correlates negatively with the expression of genes of the tricarboxylic acid cycle in renal tumors. 128 10. MYBBP1A is a tumor suppressor that represses c-MYB and PGC-1α activity, being tumor cells that express c-MYB and do not express pVHL the ones that can take advantage of MYBBP1A loss. BIBLIOGRAFÍA Bibliografía 130 Bibliografía 131 1 Hanahan, D. & Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell 100, 57-70 (2000). 2 Hanahan, D. & Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 144, 646- 674, doi:10.1016/j.cell.2011.02.013 (2011). 3 Cammarota, F. & Laukkanen, M. O. Mesenchymal Stem/Stromal Cells in Stromal Evolution and Cancer Progression. Stem Cells Int 2016, 4824573, doi:10.1155/2016/4824573 (2016). 4 Bruno, S., Collino, F., Iavello, A. & Camussi, G. Effects of mesenchymal stromal cellderived extracellular vesicles on tumor growth. Front Immunol 5, 382, doi:10.3389/fimmu.2014.00382 (2014). 5 Carnero, A. & Lleonart, M. The hypoxic microenvironment: A determinant of cancer stem cell evolution. Bioessays 38 Suppl 1, S65-74, doi:10.1002/bies.201670911 (2016). 6 Cairns, R. A., Harris, I. S. & Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer 11, 85-95, doi:10.1038/nrc2981 (2011). 7 Smolkova, K. et al. Waves of gene regulation suppress and then restore oxidative phosphorylation in cancer cells. The international journal of biochemistry & cell biology 43, 950-968, doi:10.1016/j.biocel.2010.05.003 (2011). 8 Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science 123, 309-314 (1956). 9 Kroemer, G. & Pouyssegur, J. Tumor cell metabolism: cancer's Achilles' heel. Cancer cell 13, 472-482, doi:10.1016/j.ccr.2008.05.005 (2008). 10 Fischer, K. et al. Inhibitory effect of tumor cell-derived lactic acid on human T cells. Blood 109, 3812-3819, doi:10.1182/blood-2006-07-035972 (2007). 11 Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L. & Sivridis, E. Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: a metabolic survival role for tumor-associated stroma. Cancer research 66, 632-637, doi:10.1158/0008-5472.CAN-05-3260 (2006). 12 Mazurek, S., Boschek, C. B., Hugo, F. & Eigenbrodt, E. Pyruvate kinase type M2 and its role in tumor growth and spreading. Semin Cancer Biol 15, 300-308, doi:10.1016/j.semcancer.2005.04.009 (2005). 13 Bertout, J. A., Patel, S. A. & Simon, M. C. The impact of O2 availability on human cancer. Nature reviews. Cancer 8, 967-975, doi:10.1038/nrc2540 (2008). 14 Kapitsinou, P. P. & Haase, V. H. The VHL tumor suppressor and HIF: insights from genetic studies in mice. Cell death and differentiation 15, 650-659, doi:10.1038/sj.cdd.4402313 (2008). 15 Kaelin, W. G., Jr. The von Hippel-Lindau tumour suppressor protein: O2 sensing and cancer. Nature reviews. Cancer 8, 865-873, doi:10.1038/nrc2502 (2008). 16 Semenza, G. L. HIF-1: upstream and downstream of cancer metabolism. Current opinion in genetics & development 20, 51-56, doi:10.1016/j.gde.2009.10.009 (2010). 17 Jones, R. G. et al. AMP-activated protein kinase induces a p53-dependent metabolic checkpoint. Molecular cell 18, 283-293, doi:10.1016/j.molcel.2005.03.027 (2005). 18 Kuhajda, F. P. AMP-activated protein kinase and human cancer: cancer metabolism revisited. International journal of obesity 32 Suppl 4, S36-41, doi:10.1038/ijo.2008.121 (2008). 19 Shackelford, D. B. & Shaw, R. J. The LKB1-AMPK pathway: metabolism and growth control in tumour suppression. Nature reviews. Cancer 9, 563-575, doi:10.1038/nrc2676 (2009). 20 Bensaad, K. et al. TIGAR, a p53-inducible regulator of glycolysis and apoptosis. Cell 126, 107-120, doi:10.1016/j.cell.2006.05.036 (2006). 21 Kondoh, H. et al. Glycolytic enzymes can modulate cellular life span. Cancer research 65, 177-185 (2005). 22 Matoba, S. et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science 312, 1650-1653, doi:10.1126/science.1126863 (2006). Bibliografía 132 23 Kim, J. W., Gao, P., Liu, Y. C., Semenza, G. L. & Dang, C. V. Hypoxia-inducible factor 1 and dysregulated c-Myc cooperatively induce vascular endothelial growth factor and metabolic switches hexokinase 2 and pyruvate dehydrogenase kinase 1. Molecular and cellular biology 27, 7381-7393, doi:10.1128/MCB.00440-07 (2007). 24 Dang, C. V., Kim, J. W., Gao, P. & Yustein, J. The interplay between MYC and HIF in cancer. Nature reviews. Cancer 8, 51-56, doi:10.1038/nrc2274 (2008). 25 Li, F. et al. Myc stimulates nuclearly encoded mitochondrial genes and mitochondrial biogenesis. Molecular and cellular biology 25, 6225-6234, doi:10.1128/MCB.25.14.6225-6234.2005 (2005). 26 Le, A. et al. Glucose-independent glutamine metabolism via TCA cycling for proliferation and survival in B cells. Cell metabolism 15, 110-121, doi:10.1016/j.cmet.2011.12.009 (2012). 27 Caro, P. et al. Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma. Cancer cell 22, 547-560, doi:10.1016/j.ccr.2012.08.014 (2012). 28 Vazquez, F. et al. PGC1alpha expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress. Cancer cell 23, 287-301, doi:10.1016/j.ccr.2012.11.020 (2013). 29 Marin-Valencia, I. et al. Analysis of tumor metabolism reveals mitochondrial glucose oxidation in genetically diverse human glioblastomas in the mouse brain in vivo. Cell metabolism 15, 827-837, doi:10.1016/j.cmet.2012.05.001 (2012). 30 Jose, C., Bellance, N. & Rossignol, R. Choosing between glycolysis and oxidative phosphorylation: a tumor's dilemma? Biochim Biophys Acta 1807, 552-561, doi:10.1016/j.bbabio.2010.10.012 (2011). 31 Wise, D. R. et al. Myc regulates a transcriptional program that stimulates mitochondrial glutaminolysis and leads to glutamine addiction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105, 18782-18787, doi:10.1073/pnas.0810199105 (2008). 32 Obre, E. & Rossignol, R. Emerging concepts in bioenergetics and cancer research: metabolic flexibility, coupling, symbiosis, switch, oxidative tumors, metabolic remodeling, signaling and bioenergetic therapy. The international journal of biochemistry & cell biology 59, 167-181, doi:10.1016/j.biocel.2014.12.008 (2015). 33 Jin, L., Alesi, G. N. & Kang, S. Glutaminolysis as a target for cancer therapy. Oncogene 35, 3619-3625, doi:10.1038/onc.2015.447 (2016). 34 Puigserver, P. et al. A cold-inducible coactivator of nuclear receptors linked to adaptive thermogenesis. Cell 92, 829-839 (1998). 35 Scarpulla, R. C. Metabolic control of mitochondrial biogenesis through the PGC-1 family regulatory network. Biochim Biophys Acta 1813, 1269-1278, doi:10.1016/j.bbamcr.2010.09.019 (2011). 36 Ventura-Clapier, R., Garnier, A. & Veksler, V. Transcriptional control of mitochondrial biogenesis: the central role of PGC-1alpha. Cardiovasc Res 79, 208-217, doi:10.1093/cvr/cvn098 (2008). 37 Nakamura, M. T., Yudell, B. E. & Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by longchain fatty acids. Prog Lipid Res 53, 124-144, doi:10.1016/j.plipres.2013.12.001 (2014). 38 Gerhart-Hines, Z. et al. Metabolic control of muscle mitochondrial function and fatty acid oxidation through SIRT1/PGC-1alpha. The EMBO journal 26, 1913-1923, doi:10.1038/sj.emboj.7601633 (2007). 39 Jager, S., Handschin, C., St-Pierre, J. & Spiegelman, B. M. AMP-activated protein kinase (AMPK) action in skeletal muscle via direct phosphorylation of PGC-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 12017-12022, doi:10.1073/pnas.0705070104 (2007). Bibliografía 133 40 Puigserver, P. et al. Cytokine stimulation of energy expenditure through p38 MAP kinase activation of PPARgamma coactivator-1. Molecular cell 8, 971-982 (2001). 41 Tan, Z. et al. The Role of PGC1alpha in Cancer Metabolism and its Therapeutic Implications. Mol Cancer Ther 15, 774-782, doi:10.1158/1535-7163.MCT-15-0621 (2016). 42 Wolf, D. A. Is reliance on mitochondrial respiration a "chink in the armor" of therapyresistant cancer? Cancer cell 26, 788-795, doi:10.1016/j.ccell.2014.10.001 (2014). 43 Leal, J. F. et al. Cellular senescence bypass screen identifies new putative tumor suppressor genes. Oncogene 27, 1961-1970, doi:10.1038/sj.onc.1210846 (2008). 44 Tavner, F. J. et al. Molecular cloning reveals that the p160 Myb-binding protein is a novel, predominantly nucleolar protein which may play a role in transactivation by Myb. Molecular and cellular biology 18, 989-1002 (1998). 45 Kumazawa, T. et al. Novel nucleolar pathway connecting intracellular energy status with p53 activation. The Journal of biological chemistry 286, 20861-20869, doi:10.1074/jbc.M110.209916 (2011). 46 Yamauchi, T., Keough, R. A., Gonda, T. J. & Ishii, S. Ribosomal stress induces processing of Mybbp1a and its translocation from the nucleolus to the nucleoplasm. Genes Cells 13, 27-39, doi:10.1111/j.1365-2443.2007.01148.x (2008). 47 Shimizu, K. et al. The fifth essential DNA polymerase phi in Saccharomyces cerevisiae is localized to the nucleolus and plays an important role in synthesis of rRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 9133-9138, doi:10.1073/pnas.142277999 (2002). 48 Ramsay, R. G. & Gonda, T. J. MYB function in normal and cancer cells. Nature reviews. Cancer 8, 523-534, doi:10.1038/nrc2439 (2008). 49 Zhou, Y. & Ness, S. A. Myb proteins: angels and demons in normal and transformed cells. Front Biosci (Landmark Ed) 16, 1109-1131 (2011). 50 Fan, M. et al. Suppression of mitochondrial respiration through recruitment of p160 myb binding protein to PGC-1alpha: modulation by p38 MAPK. Genes & development 18, 278-289, doi:10.1101/gad.1152204 (2004). 51 Diaz, V. M. et al. p160 Myb-binding protein interacts with Prep1 and inhibits its transcriptional activity. Molecular and cellular biology 27, 7981-7990, doi:10.1128/MCB.01290-07 (2007). 52 Owen, H. R. et al. MYBBP1a is a novel repressor of NF-kappaB. J Mol Biol 366, 725-736, doi:10.1016/j.jmb.2006.11.099 (2007). 53 Hara, Y. et al. Molecular characterization of Mybbp1a as a co-repressor on the Period2 promoter. Nucleic Acids Res 37, 1115-1126, doi:10.1093/nar/gkn1013 (2009). 54 Jones, L. C., Okino, S. T., Gonda, T. J. & Whitlock, J. P., Jr. Myb-binding protein 1a augments AhR-dependent gene expression. The Journal of biological chemistry 277, 22515-22519, doi:10.1074/jbc.M200740200 (2002). 55 Kuroda, T. et al. RNA content in the nucleolus alters p53 acetylation via MYBBP1A. The EMBO journal 30, 1054-1066, doi:10.1038/emboj.2011.23 (2011). 56 Holmberg Olausson, K., Nister, M. & Lindstrom, M. S. p53 -Dependent and - Independent Nucleolar Stress Responses. Cells 1, 774-798, doi:10.3390/cells1040774 (2012). 57 Ono, W. et al. Nucleolar protein, Myb-binding protein 1A, specifically binds to nonacetylated p53 and efficiently promotes transcriptional activation. Biochem Biophys Res Commun 434, 659-663, doi:10.1016/j.bbrc.2013.04.006 (2013). 58 Ono, W. et al. The nucleolar protein Myb-binding protein 1A (MYBBP1A) enhances p53 tetramerization and acetylation in response to nucleolar disruption. The Journal of biological chemistry 289, 4928-4940, doi:10.1074/jbc.M113.474049 (2014).