Efectos de la acumulación del péptido Beta amiloide en tejido cerebral de ratones PS1xAPP modelos de la Enfermedad de Alzheimer

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD DE SEVILLA EFECTOS DE LA ACUMULACIÓN DEL PÉPTIDO BETA AMILOIDE EN TEJIDO CEREBRAL DE RATONES PS1xAPP MODELOS DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER. Memoria presentada por el Ldo. Sebastián Jiménez Muñoz, para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Sevilla, 29 de Septiembre de 2015 α7nAChR: subunidad α7 del receptor nicotínico de acetilcolina Aβ, Abeta: péptido β-amiloide Aβi: péptido β-amiloide intracelular AAC: Angiopatía amiloide cerebral. ACE: Enzima convertidora de angiotensina. Alzheimer’s Disease ADAM: del inglés A desintegrin and metalloprotease ADDL: del inglés Amiloide-β Derived Diffusible Ligands). DNA: Ácido desoxirribonucleico. AICD: dominio intracelular del APP ANOVA: análisis de la varianza (del inglés ANalysis Of VAriance) AMPA: receptor del ácido α-amino-3-hidroxi-5- metilo-4-isoxazolpropiónico. APOE: Apolipoproteína E APH-1: del inglés pharynx-defective -1. Subunidad del complejo gamma secretasa. APP: Proteína precursora del péptido β-amiloide. Arg-1: Arginasa 1. ARN: Ácido ribonucleico. BACE: enzima de corte del APP en el sitio beta BDNF: factor neurotrófico derivado del cerebro. bFGF: Factor de crecimiento de fibroblastos básico. BHE: Barrera hemato encefálica. CA: Cuerno de Ammon CD: del inglés cluster of differentiation CDK5: Quinasa dependiente de ciclina 5. cDNA: DNA complementario. CE: Corteza entorrinal CH3LI: del inglés Chitinase-3-like protein 1. ChAT: colinacetiltransferasa. CLU: Clusterina. CTF: fragmento C-terminal CX3CR1: del inglés CX3C chemokine receptor 1. DAB: 3-3’-diaminobencidina tetrahidrochlorhídrico DEPC: Dietilpirocarbonato DN: densidad numérica EA: dnfermedad de Alzheimer ECE: Enzima convertidora de endotelina. ELISA: del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ERK: del inglés extracellular-signal-regulated kinases FAD: Alzheimer familiar (del inglés, Familial Alzheimer’s Disease) FAS-L: Ligando de FAS. GABA: Ácido gamma amino butírico GAPDH: del inglés glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GD: giro dentado GDNF: del inglés glial cell line-derived neurotrophic factor GFAP: Proteína glial fibrilar ácida (del inglés glial GSK-3: Quinasa glucógeno sintasa 3 h: hilio del giro dentado HIPP: interneuronas del hilo asociadas a la vía perforante (del inglés hilar interneurons of performant pathway) HMG-CoA: 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A HSP: Proteína del choque térmico (del inglés Heat schok protein) Iba1: del inglés ionized calcium binding adapter molecule 1 IDE: Enzima degradadora de insulina IFN-γ: Interferón gamma Ig: Inmunoglobulina IGF-1: Factor de crecimiento insulínico de tipo 1 (del inglés insulin-like growth factor-1) IL: Interleuquina iNOS: Sintasa del óxido nítrico inducible KI: knock-in KO: knockout LAMP2: del inglés Lysosome-associated membrane protein 2 LC3: del inglés Light chain 3 LCR: Líquido cefaloraquídeo. LDL: Lipoproteína de baja densidad. Del inglés Low density lipoprotein. LDLR: Receptor de lipoproteína de baja densidad. Li: Litio. LMW-Aβ: del inglés low molecular weight Aβ LPS: .Lipopolisacárido. Lond; L: Mutación London de APP LTD: depresión a largo plazo LTP: potenciación a largo plazo m: capa molecular del giro dentado M1: estadio clásico de activación de los macrófagos M2: estadio alternativo de activación de los macrófagos MAP: Proteína de union a microtúbulos MCI: del inglés Mild cognitive impairment MHC: Complejo mayor de histocompatibilidad MMP: Metaloproteasas de matriz MRC: del inglés mannose receptor 1. MSR-1: del inglés macrophage scavenger receptor 1. MT: Microtúbulos NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato. ND: nummerical density NEP: Neprelisina. NF: Neurofilamento NFs: Factores neurotróficos NFTs: Ovillos neurofibrilares (del inglés neurofibrillary tangles) NGF: Factor de crecimiento nervioso NMDA: Ácido N-metil-D-aspártico NO: óxido nítrico NPY: Neuropéptido Y Publicación I…………………………………………………………………………..60 Resumen I…………………………………………………………………………….72 Resultados: Capitulo II. ............................................................................................... 74 Objetivos II…………………………………………………………………………….75 Publicación II………………………………………………………………………….76 Resumen II……………………………………………………………………………87 Resultados: Capitulo III ............................................................................................... 89 Objetivos III……………………………………………………………………………90 Publicación III…………………………………………………………………………91 Resumen III………………………………………………………………………….107 Resultados: Capitulo IV. ........................................................................................... 109 Objetivos IV………………………………………………………………………….110 Publicación IV……………………………………………………………………….111 Resumen IV…………………………………………………………………………128 d. Discusión……………………………………………………………………………...130 1. Respuesta inflamatoria en SNC en los ratones transgénicos PS1xAPP modelo de la enfermedad de Alzheimer a los 6 y 18 meses de edad. ........................................ 132 1.1. La microglía en contacto directo con las placas extracelulares del péptido Aβ se activa a un fenotipo alternativo M2 (independientemente de la edad del animal) mientras que la microglía entre placas se activa a un fenotipo clásico M1 sólo a edades avanzadas. ............................................................................................... 132 1.2. Efecto de las formas oligoméricas solubles del péptido β-amiloide sobre la microglía interplaca. .............................................................................................. 134 2. La fracción soluble extracelular S1 de los ratones PS1xAPP produce efectos antagónicos sobre la ruta de señalización pro-supervivencia PI3K/AKT a los 6 y 18 meses de edad. ........................................................................................................ 136 3. Efecto del tratamiento crónico oral de litio sobre la patología relacionada con la EA en ratones PS1xAPP ................................................................................................ 140 4. Influencia del protocolo de homogeneización usado para generar la fracción S1 sobre el contenido de formas solubles del péptido Aβ. ............................................. 142 e. Conclusiones………………………………………………………………………...147 f. Bibliografía…………………………………………………………………………….152 ÍNDICE DE FIGURAS. Figura 1.1. Alois Alzheimer y su paciente…………………………………...……………….3 Figura 1.2. Distribución de los tipos de demencia………………………………………….5 Figura 3.1. Esquema comparativo de un cerebro humano sano y otro de un enfermo de EA…………………………………………………………………………………………….9 Figura 3.2. Estadios de Braak……………………………………………………..………..10 Figura 3.3. Placas neuríticas de un ratón transgénico de la EA…………..……………12 Figura 3.4. Formación de ovillos neurofibrilares…………………………………………..14 Figura 4.1. Esquema estructural de la Proteína Precursora del péptido β-amiloide (APP)………………………………………………………………………………………...…22 Figura 4.2. Procesamiento de la Proteína Precursora del péptido β-Amiloide (APP)..23 Figura 5.1. Esquema del gen MAPT y de las diferentes isoformas de Tau………..…29 Figura 6.1. Fenotipos de Activación microglial……………………………………………35 Figura 7.1. Posible sucesión de eventos que conforman la hipótesis de la cascada amiloide………………………………………………………………………………………..43 a. Introducción Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 3 1. ANTECEDENTES; LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER. La enfermedad de Alzheimer (EA) fue descrita por primera vez en 1907 por el psiquiatra y neurólogo Alois Alzheimer (Alzheimer A., 1907). La primera paciente diagnosticada con esta enfermedad fue Auguste Deter de 51 años de edad, que murió cuatro años después en estado total de invalidez tras sufrir pérdida progresiva de memoria, desorientación espacio-temporal, cuadros graves de alucinaciones y delirios, paranoia y trastornos de la conducta y del lenguaje. El análisis anatómico patológico del cerebro de esta paciente reveló la presencia de depósitos extracelulares (placas seniles) y agregados fibrilares intracelulares (ovillos) localizados principalmente en la corteza cerebral e hipocampo. Actualmente estas lesiones histopatológicas se usan como los principales marcadores de esta enfermedad. De hecho, la ausencia de marcadores biológicos para la enfermedad de Alzheimer, hace que el análisis neuropatológico post-mortem sea crucial para el diagnóstico definitivo de la enfermedad. No fue hasta 1910 cuando el psiquiatra alemán Emil Kraepelin dio nombre a esta nueva entidad clínica y patológica, conocida actualmente como Enfermedad de Alzheimer (EA). La EA se puede definir como un proceso neurodegenerativo progresivo e irreversible caracterizado por la pérdida de memoria, de habilidades intelectuales y de Figura 1.1. Alois Alzheimer y su paciente. El Dr. Alois Alzheimer (1864-1915) a la derecha y Auguste Deter (1850-1906) a la izquierda. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 4 razonamiento, así como por la presencia de desorientación espacio-temporal, cambios de humor, alteraciones conductuales, afasia (disminución progresiva de la capacidad del lenguaje), apraxia (alteración de los gestos e incapacidad de realizar tareas rutinarias) y agnosia (incapacidad de reconocimiento de personas o cosas) (Reiman y Caselli, 1999; Van Strien y col., 2009). Estas alteraciones se deben a daños selectivos en regiones cerebrales implicadas en estos procesos, tales como el hipocampo, la corteza entorrinal, la amígdala y el telencéfalo basal. El curso clínico de la EA suele durar 8-10 años, pudiendo llegar hasta los 25 (Gies y Lessick, 2009). La muerte del paciente suele atribuirse a enfermedades no relacionadas o indirectamente relacionadas, sólo un 20% de las muertes son directamente atribuibles a la demencia o a las complicaciones durante la fase terminal (Reiman y Caselli, 1999) como la malnutrición y la neumonía. La EA representa hoy en día la forma más común de demencia entre las personas mayores de 65 años, así como una de las patologías neurodegenerativas más graves que afecta a este sector de la población. Los pacientes manifiestan un deterioro progresivo hasta perder la capacidad de desempeñar una vida autónoma e independiente, quedando en estado vegetativo durante los últimos meses, e incluso años, de su vida. Por ello, esta enfermedad es generalmente incapacitante y, en consecuencia, requiere de la ayuda de familiares o servicios especializados. A nivel mundial hay aproximadamente 44,35 millones de personas que padecen demencia (World Alzheimer Report, 2013), entre estas la enfermedad de Alzheimer es la más común constituyendo el 60-70 % de los casos de demencia (OMS; 20012). (Fig. 1.2) entre las personas mayores de 65 años. La prevalencia de la enfermedad está por debajo del 1% en individuos menores de 65, pero muestra un incremento casi exponencial con la edad, y en personas de 85 años la incidencia es del 30% en el mundo occidental, ascendiendo al 63,9% en personas mayores de 90 años (Prince y col., 2013). Estos datos hacen que la EA sea un grave problema de salud pública que se agravará en el futuro debido al aumento progresivo de la esperanza de vida actual, al envejecimiento de la población, y al elevado coste económico, sanitario y social que supone el cuidado de un enfermo de EA. Todo esto ha convertido a esta enfermedad en el tercer problema de salud más grave en los países desarrollados (detrás de los accidentes cardiovasculares y el cáncer). Existen alrededor de 800.000 enfermos diagnosticados en España y 35 millones a nivel mundial. Se calcula que en el año 2050, 115 millones de personas en el mundo se encontrarán afectadas por esta enfermedad. (Neugroschl y Sano, 2010; ver http://www.alz.org/downloads/facts_figures_2014.pdf) Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 5 Actualmente la EA no tiene tratamiento farmacológico eficaz, es una enfermedad incurable debido en gran parte a la falta de dianas terapéuticas conocidas. Existen medicamentos que mejoran los síntomas, pero ninguno es totalmente efectivo. A mediados de los años 70 se estableció la hipótesis colinérgica de la EA, que consideraba que la mayoría de los síntomas de la enfermedad eran producidos por la pérdida de un gran número de neuronas colinérgicas (Whitehouse y col., 1981; Arendt y col., 1985). A raíz de estos hallazgos se empezaron a utilizar fármacos inhibidores de la acetilcolinesterasa para tratar la enfermedad, aunque más tarde se demostró que sólo en el 50% de los pacientes tratados con dichos fármacos se produce un retraso parcial en el déficit cognitivo. Por tanto el sistema colinérgico no es una buena diana terapéutica para combatir la sintomatología de la enfermedad. Un tratamiento eficaz debería evitar, o al menos retrasar, la pérdida de contactos sinápticos y la muerte neuronal progresiva que se produce en esta enfermedad, lo que mejoraría significativamente la calidad de vida del paciente y de sus familiares-cuidadores y reduciría enormemente los costes socio-sanitarios y asistenciales. Se hace necesario continuar con la investigación de las causas que inician esta patología y la búsqueda de posibles dianas terapéuticas que posibiliten el desarrollo de fármacos eficaces. Figura 1.2. Distribución de los tipos de demencia. Estudio poblacional de prevalencia de demencias. Del informe: “Estado del arte de la enfermedad de Alzheimer en España”. PWC (2013). Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 6 2. TIPOS DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER. Se distinguen dos tipos de EA, el Alzheimer familiar (FAD del inglés Familial Alzehimer Disease) y el Alzheimer esporádico. Ambas formas de Alzheimer poseen los mismos síntomas y poseen las mismas lesiones histopatológicas, pero difieren en la edad de inicio, la incidencia y las causas por la que aparecen (ver revisiones Gomez- Isla y col., 2008; Perl 2010; Ballard y col., 2011; Bagyinszky y col., 2014). 2.1. Alzheimer familiar o FAD. Esta forma de la enfermedad se caracteriza por un comienzo temprano, generalmente antes de los 60 años, por eso también es conocido como presenil o de inicio temprano. Representa menos del 5% de los casos de EA. Este tipo de EA se transmite hereditariamente con carácter autosómico dominante. En la actualidad se conocen tres genes, cuyas mutaciones causan FAD; estos genes codifican para la Proteína Precursora Amiloide (APP), Presenilina 1 (PS1) y la Presenilina 2 (PS2) (ver revisiones O’Brien y Wong, 2011; Karch y col., 2014; Calero y col., 2015). Todas estas proteínas están implicas en el producción del péptido β-amiloide (Aβ), ya que la primera se trata de su precursor y la segunda y tercera forman parte del complejo gamma-secretasa que procesa el APP hasta Aβ. La alteración de cualquiera de estas proteínas lleva a una generación y acumulación no fisiológica de Aβ que se agregan para formar placas extracelulares de Aβ características de la EA. En la actualidad se han descrito 32 mutaciones en APP, 185 en PS1 y 13 en PS2 que generan FAD. (Cruts et al., 2012; http://www.molgen.vib-ua.be/ADMutations). - Proteína Precursora del Péptido Amiloide (APP): Este gen está localizado en el cromosoma 21 (Goate y col., 1991). En él se describió la primera mutación relacionada con el Alzheimer, pero sólo afecta al 10% de los enfermos de FAD. Se han descubierto 32 mutaciones implicadas con esta versión presenil de la enfermedad. La implicación de este gen es tal, que su duplicación en los casos de trisomía del cromosoma 21 es suficiente para causar daños a edades tempranas como ocurre en los enfermos de Síndrome de Down que pueden desarrollar demencia (ver revisión Thinakaran y Koo, 2008). Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 13 3.2. Ovillos neurofibrilares de TAU. Son agregados intracelulares, formados por filamentos helicoidales emparejados y filamentos rectos cuyo componente mayoritario es la proteína Tau hiperfosforilada (Spillantini and Goerdert, 2013). Tau es una proteína asociada a microtúbulos (MAP: microtubule associated protein), cuya función es estabilizar los microtúbulos del citoesqueleto colaborando en la generación y mantenimiento de la estructura de los axones, siendo fundamental en el transporte axonal y en la regulación sináptica (Spires- Jones and Hyman, 2014). Para formar los ovillos Tau se disocia de los microtúbulos, probablemente mediante su hiperfosforilación. Al ser insolubles tienden a agregarse formando pares de filamentos helicoidades (PHF) y pasan de tener una localización axonal a somatodendrítica, donde estos filamentos se unen formando los ovillos neurofibrilares intracelulares (NFTs) característicos de la EA (Morishima-Kawashima e Ihara, 2002). (Fig. 3.4.) Al fosforilarse tau y disociarse de los microtúbulos se produciría una pérdida de función de los mismos, con lo que se generan fallos en el transporte axonal y muerte neuronal (Gotz, 2001; Spires-Jones et al., 2009). Además, una extensa hiperfosforilación de Tau inhibe la actividad del proteasoma aumentando de esta forma el efecto negativo de la hiperfosforilación de Tau (Gendron y Petrucelli, 2009; Wang y col., 2013). Podemos encontrar Tau hiperfosforilada acumulada en el cuerpo neuronal como NTFs, en las dendritas como neuropil threads, en los axones de las neuronas con degeneración neurofibrilar y las neuritas distróficas asociadas a los depósitos extracelulares de Aβ dando lugar a las placas neuríticas. (Duyckaerts y col., 2009). La agregación de Tau también se ve potenciada por otras modificaciones postraduccionales como la glicosilación, acetilación y ubiquitinación entre otras (Iqbal y Grundke-Iqbal, 2008; Wang y col., 2013). Debido a la presencia de estos NTFs intracelulares formados por la proteína Tau hiperfosforilada la EA es considerada una taupatía (Lee y col., 2001), término que agrupa a distintas enfermedades con depósito anormal de Tau hiperfosforilada en neuronas y células gliales. Existen unas 40 mutaciones de Tau ligadas a la demencia frontotemporal, mientras que ninguna ha sido descrita en casos de FAD. Muchos investigadores sugieren que estas alteraciones en el citoesqueleto producen la patogénesis propia de EA, relacionando la muerte neuronal con la presencia de los ovillos neurofibrilares (Spires-Jones et al., 2009). Por otro lado, la aplicación de Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 14 métodos estereológicos en cerebros de enfermos de Alzheimer han revelado que el número de neuronas perdidas excede al número de neuronas que contienen ovillos, indicando que la perdida neuronal en la EA podría ser independiente de la formación de ovillos (Morishima-Kawashima and Ihara, 2002). De hecho, a pesar de las anormalidades en el citoesqueleto, las neuronas que contienen ovillos pueden sobrevivir durante años, aunque no estemos seguro de que mantengan su integra su función. Datos recientes sugieren que son las formas solubles, tanto de Aβ como de Tau fosforilada pueden jugar un papel más importante que las placas y los ovillos (ambos insolubles) sobre el daño sináptico y la demencia (McDonald y col., 2012). Indicando que más que la formación de ovillos o placas es la acumulación anormal de formas solubles en las sinapsis la que puede estar más relacionada con la muerte neuronal (Perez-Nievas y col., 2013; Spires-Jones y Hyman, 2014). Además los niveles de Tau fosforilado en líquido cefalorraquídeo (LCR) se correlacionan de forma directa con los procesos neurodegenerativos producidos en la EA (Brunden y col., 2009; Matsuo y col., 1994). Figura 3.4. Formación de ovillos neurofibrilares. Tau está unida a microtúbulos estabilizándolos y con localización preferentemente axonal. Al hiperfosforilarse se separan de los microtúbulos desestabilizando a los mismos. En primer lugar forman los PHF que al unirse generan los NFTs, implicados en la degeneración neuronal. A. Indica como estaría Tau en el axón de una neurona sana, mientras que B representa la desorganización de los microtúbulos que desencadenaría un proceso de degeneración neuronal. (Modificado de Querfurth y LaFerla, 2010). Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 15 Como hemos visto en la Fig. 3.2 en los enfermos de Alzheimer existe un patrón de deposición de los ovillos, que comienza en la corteza entorrinal y avanza hacia el hipocampo y corteza asociativa, afectándose en estadios avanzados las áreas sensoriales primarias (Spires-Jones y Hyman, 2014). 3.3. Pérdida sináptica. En la enfermedad de Alzheimer se produce una gran pérdida de conexiones sinápticas que producen los fallos en las funciones cognitivas y de memoria característicos de la enfermedad. Esta pérdida sináptica fue referida por primera vez a principio de los años 90 por varias investigaciones que describieron una disminución de las sinapsis y de proteínas implicadas en ellas en la corteza frontal, temporal y en giro dentado. En ellas se comprobaba que dicho hallazgo patológico correlacionaba mejor con la demencia asociada a EA (DeKosky y Scheff, 1990; DeKosky y col., 1996; Masliah y col., 1994; Terry y col., 1991). Se han reportado pérdidas de un 30% en la densidad sináptica (Davies y col., 1987) y la disminución de inmunorreactividad para sinaptofisina en hipocampo y corteza de personas que presentaban deterioro cognitivo leve o EA leve (Overk y Masliah, 2014). Estos datos pueden mostrar que anterior a la muerte neuronal existen fallos a nivel sináptico, y que son estas modificaciones las que mejor correlacionan con las deficiencias cognitivas de los pacientes (Tampellini y Gouras, 2010). En la actualidad se reconoce que son estos defectos a nivel sináptico la base del declive cognitivo que se produce en EA ya que afectan a la plasticidad sináptica de las neuronas, que no es otra cosa que la capacidad de realizar nuevas sinapsis con otras células para cambiar la intensidad de una señal y que son la fundamentales para los distintos tipos de memoria y aprendizaje. La potenciación a largo plazo (LTP) y la depresión a largo plazo (LTD) participan de manera activa en la plasticidad sináptica y están mediadas principalmente por los receptores NMDA y AMPA de glutamato. En la respuesta LTP se produce una potenciación de la sinapsis que conlleva al aumento de receptores AMPA post sinápticos. La respuesta LTD, por el contrario, produce un debilitamiento de la respuesta sináptica con la consiguiente internalización de receptores AMPA y NMDA. La pérdida de integridad sináptica en aquellas zonas relacionadas con el aprendizaje y la formación de recuerdos, como son el hipocampo y la neocorteza, pueden ser la causa del síntoma inicial más importante de la EA: la pérdida de memoria. A lo largo de la evolución de la Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 16 patología se produce una alteración generalizada de la plasticidad sináptica, así como de todos los mecanismos implicados en su funcionamiento (Dudai and Morris, 2013). Tanto Tau, como el péptido Aβ parecen tener un papel relevante en el correcto mantenimiento de las sinapsis en individuos sanos. Tau está claro que con su función estabilizadora de los microtúbulos está implicada en un correcto funcionamiento del transporte axonal. El péptido Aβ parece participar en el desarrollo natural de las sinapsis y en la plasticidad sináptica, aunque los mecanismos no están claros. Lo que está claro es que niveles elevados de este péptido disminuyen la excitabilidad neuronal, provocando la internalización de receptores AMPA. Esto provoca depresión sináptica y pérdida de espinas dendríticas, provocando la interrupción de la LTP imprescindible en la plasticidad sináptica asociada con los procesos de memoria y aprendizaje (Small, 2008). Además se ha demostrado que la presencia de Aβ oligomérico provoca una reducción de la densidad de espinas dendríticas y una pérdida de sinapsis electrofisiológicamente activas en cultivo de neuronas principales del hipocampo, mientras que la adición de monómeros no tiene el mismo efecto (Shankar y col., 2007). Referente a Tau, se ha descrito recientemente su implicación en la internalización de los receptores NMDA en la terminal postsináptica (Spires-Jones and Hyman, 2014). Además, hay estudios que demuestran la posible implicación de Tau en la sinaptotoxicidad producida por Aβ (Ittner et al., 2010; Roberson et al., 2011). En este sentido varios autores han descrito que la degeneración sináptica es más específica en regiones con una previa desorganización de microtúbulos y han demostrado que el efecto de Aβ es menos tóxico en modelos que no sobre expresan Tau. Al parecer son las formas solubles de estas proteínas, y no las formas fibrilares y agregadas, tanto de Tau fosforilada como de Aβ las causantes de la pérdida sináptica (revisado en Crimins et al., 2013). Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 17 3.4. Perdida neuronal. En la EA se produce una extensa y selectiva degeneración neuronal que afecta a regiones y tipos celulares concretos (Duyckaerts y col., 2009). Las principales áreas afectadas son: 3.4.1. Pérdidas en la corteza entorrinal e hipocampo: En los casos preclínicos de EA, caracterizados por la presencia de algunas placas amiloides y ovillos neurofibrilares y ausencia de demencia, la región CA1 del hipocampo y la corteza entorrinal no presentan una dismininucíón significativa en el número de neuronas (Giannakopoulos et al., 1998). Sin embargo a estos niveles las neuronas colinérgicas del telencéfalo basal (Whitehouse y col., 1981) y las noradrenérgicas del locus coeruleus (German y col., 1992) ya están afectadas. En la fase intermedia de EA se producen en la corteza entorrinal un pérdida neuronal del 32%, principalmente en las capas II y IV, con una disminución del 57% y 41% respectivamente. En la fase avanzada de la patología, la pérdida neuronal en la corteza entorrinal alcanza el 69%, y al igual que en los estadios moderados, afecta principalmente a las capas II y IV, con un 87% y un 69% de muerte respectivamente, mientras que la pérdida total del resto de las capas es del 63% (Gómez-Isla et al., 1996). En el caso de la capa CA1 del hipocampo la muerte neuronal sólo se produce en los estadios avanzados de la patología, aunque el 60% de las neuronas de la capa piramidal de CA1 parecen no afectarse (West et al., 1994; Von Gunten et al., 2006). 3.4.2. Área neocorticales de asociación: El patrón de progresión de la EA en estas zonas es el siguiente: primero se afecta la corteza temporal, posteriormente la corteza frontal y, finalmente a la corteza somatosensorial. En los estadios tempranos de la enfermedad se produce una disminución bilateral del 15% de la sustancia gris en la corteza temporal y parietal, mientras que la corteza motora o sensorial primaria apenas se ven afectadas (<5%). Un año más tarde, imágenes de resonancia realizadas en un mismo individuo mostraron que la corteza frontal pasaba de tener una pérdida neuronal del 6% a más del 15%, mientras las áreas motoras y sensoriales permanecían sin daños (Thompson y col., Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 18 2003). Por tanto, el lóbulo temporal es especialmente susceptible a la EA. La vulnerabilidad de estas áreas de asociación neocortical posiblemente se deba a la conexión funcional que tienen con las estructuras límbicas, zona de inicio de la patología. El declive cognitivo se correlaciona estrechamente con la pérdida neuronal. Las causas y los mecanismos de muerte neuronal se desconocen, aunque poseen un papel importante la generación de especies reactivas de oxígeno, la sobre activación de receptores de aminoácidos excitadores como el glutamato y el incremento en la concentración citoplasmática de calcio. Esta pérdida neuronal y los cambios sufridos a nivel sináptico que se observan con la progresión de la EA se pueden monitorizar mediante imágenes de resonancia magnética. Y esto ha permitido describir el patrón de progresión de la patología (Thompson y col., 2003). Se podría resumir como se expone a continuación: - Se expande a través del cerebro con una secuencia temporal-frontal- sensomotora. La pérdida de sustancia gris se produce primero en las regiones temporal y parietal, siendo el hipocampo y la corteza entorrinal las zonas más tempranas y severamente afectadas. Más tarde, el déficit afecta a la corteza temporal y frontal, y finalmente, a las cortezas sensomotora y visual. - El hemisferio cerebral izquierdo pierde sustancia gris más rápidamente que el derecho, consistente con una afectación más severa de este hemisferio en la EA. - Hay regiones cerebrales, como la corteza sensomotora, donde no aparece daño hasta muy avanzada la enfermedad. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 19 3.5. Otras formas en las que podemos encontrar el péptido β-amiloide. El péptido Aβ además de estar formando parte de las placas extracelulares insolubles que hemos mencionado anteriormente se pueden encontrar en otros estados, como por ejemplo en formas solubles tanto dentro de las células como por el parénquima cerebral. 3.5.1. Formas solubles extracelulares del péptido β-amiloide. En la actualidad se piensa que la presencia de la placas extracelulares de Aβ no son la causa principal de los problemas sinápticos, de pérdida neuronal y respuesta inflamatoria que nos podemos encontrar en EA (esto no se corresponde con lo defendido hasta el momento en la Hipótesis de la cascada amiloide), ya que no siempre correlaciona el número de placas extracelulares de Aβ con la severidad de la patología (Mucke y col., 2000). El péptido Aβ no sólo se puede encontrar en forma insoluble, se han descrito formas tóxicas solubles de Aβ oligomérico (ADDLs) que pueden difundir por el parénquima cerebral provocando activación de la respuesta inflamatoria, pérdida sináptica y fallos cognitivos en las fases tempranas de la EA (Haass y Selkoe, 2007; Benilova y col., 2012; Viola y Klein, 2015). En cuanto al proceso de oligomerización-fibrilización, distintos estudios sugieren que las proteínas amiloides se agregan formando distintos intermediarios (ver revisión Sakono y Zako, 2010) de entre 8 KDa (dímeros) y 100 kDa (Shankar y col., 2008). Brevemente, en primer lugar, la asociación de pequeños n-oligómeros solubles (LMW-Aβ, del inglés Low Molecular Weight), resultaría en ensamblajes de peso molecular más alto, incluyéndose en este grupo a las estructuras anulares, paranúcleos, ligandos difusibles derivados del Aβ (ADDLs, del inglés Aβ-derived difusible ligands, cuyos niveles correlacionan bien con los fallos cognitivos y pueden inhibir la LTP en el hipocampo) (Lambert y col., 1998; Haass y Selkoe, 2007), Aβ*56 (Lesné y col., 2006), amiloesferoides (Noguchi y col., 2009), y las protofibrillas (PFs; Walsh y col., 1997). Éstas excederían los límites de solubilidad y se depositarían como fibrillas amiloides en conformación de hoja β plegada (ver revisión Goldsbury y col., 2005). Los mecanismos por los cuales se producen estos ensamblajes no están claramente definidos. 3.5.2. Acumulación intracelular del péptido β-amiloide. El péptido β-amiloide también se puede encontrar a nivel intracelular (Aβi) aunque sea mayoritaria su acumulación en las placas extracelulares. La presencia de Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 20 Aβi es frecuente en neuronas que contienen ovillos neurofibrilares lo que puede indicar que ambas patologías estén relacionadas (Blurton-Jones y LaFerla, 2006). La acumulación puede darse por una falta de liberación tras la generación de Aβ a partir del APP que se puede encontrar en distintos compartimentos celulares. Los endosomas son un sitio probable de generación de Aβ, ya que su pH ácido es idóneo para la actividad de BACE-1. APP podría ser internalizada por endocitosis y mediante proteólisis generar Aβ, si se bloquea dicha internalización se reducen los niveles de Aβ (revisión LaFerla y col., 2007). Pero esta acumulación de Aβi también podría producirse por una captación del Aβ extracelular captado por receptores específicos para Aβ, algunos ejemplos son: la subunidad α7 del receptor nicotínico (α7nAChR; Wang y col., 2000), el receptor LDLR de APOE (Zerbinatti y col., 2006) o los receptores NMDA (Bi y col., 2002). El Aβi se acumula predominantemente en los cuerpos multi vesiculares de las neuronas, donde se asocia con la patología sináptica (Takahashi y col., 2002). Estos cuerpos se pueden fusionar con la membrana plasmática liberando el Aβ al espacio extracelular. Podríamos estar frente a un acontecimiento temprano en la EA (Bayer y Wirths, 2010), ya que aparece en las células piramidales del hipocampo y la corteza entorrinal (regiones con afecciones patológicas más evidentes) de pacientes con defectos cognitivos leves y los niveles parecen descender con la formación de las placas. Esta acumulación intracelular se da, incluso, en individuos sanos (ver revisión LaFerla y col., 2007). No se conoce el efecto que puede tener este Aβi, aunque puede afectar a la función mitocondrial y del proteasoma, provocar problemas sinápticos, y potenciar la hiperfosforilación de Tau (LaFerla y col., 2007), provocar déficits en la LTP (Billings y col., 2005) e incluso muerte neuronal (Li y col., 2009b; ver revisión Bayer y Wirths, 2010). La liberación al medio puede actuar como semillas de inicio de la formación de placas, e incluso constituir una forma de propagar el péptido β-amiloide a través de distintas zonas del cerebro (Rajendran y Annaert, 2012). Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 21 4. BIOGÉNESIS Y DEGRADACIÓN DEL PÉPTIDO β-AMILOIDE. El péptido Aβ contiene entre 39 y 43 aminoácidos y es un producto derivado del metabolismo natural de la proteína precursora del péptido β-amiloide (APP) (De Strooper, 2010). Este péptido se origina a partir de la una región de APP localizada tanto en el dominio extracelular como en el transmembrana (Fig. 4.1), es precisamente ésta la que le confiere propiedades agregativas. La producción del péptido β-amiloide no es un proceso patológico, sino que se genera de forma natural apareciendo tanto en plasma como en el líquido cefalorraquídeo de individuos sanos. Incluso durante el envejecimiento normal estos péptidos de Aβ insolubles se depositan en el parénquima cerebral y en la pared de los vasos sanguíneos cerebrales (Selkoe, 2004; Gomez-Isla y col., 2008). Se están realizando trabajos para intentar aclarar cuál es el papel fisiológico del Aβ. Se sugiere que podría tener un papel importante en el mantenimiento de la tasa basal y en la regulación de la liberación de vesículas desde terminales presinápticos excitatorios (Abramov y col., 2009). Además, se le atribuye un papel como regulador negativo a niveles postsinápticos cuando se encuentra a altas concentraciones (ver revisión Palop y Mucke, 2010). De hecho, se ha descrito que concentraciones picomolares de Aβ mejoran la plasticidad sináptica y la memoria (Puzzo y col., 2008; Morley y col., 2010). Por otro lado, los monómeros de Aβ42 parecen ejercer un papel neuroprotector (Giuffrida y col., 2009). Todos estos datos apuntan a una posible pérdida de función del Aβ como otra causa posible del inicio de la patología de la EA. La isoforma más frecuente es la de 40 aminoácidos (Aβ40) con Val40 en el extremo C- terminal, la de 42 aminoácidos (Aβ42) sólo constituye el 10% del total. Estos dos aminoácidos lo hacen más hidrofóbico, por lo que tiene mayor tendencia a agregarse y formar fibras. Las mutaciones descritas en FAD actúan aumentando la producción relativa de Aβ42 frente al Aβ40 (Ashe y Zahs, 2010). El proceso de formación de la placa no se conoce en la actualidad. A pesar de esto se consideran factores importantes el aumento de la producción extracelular de Aβ (especialmente de la isoforma Aβ42) y la disminución en el aclaramiento del mismo. Además de depender de la formación progresiva de ADDLs (Amiloide-β Derived Diffusible Ligands), de fibras de Aβ y de complejos ApoE-Aβ (Thal et al., 2006). Por esto es fundamental conocer el proceso mediante el cual se genera el péptido Aβ y los mecanismos que pueden eliminarlo. A continuación vamos a hablar de las proteínas que están implicadas en la biogénesis de las distintas isoformas de péptido β-amiloide, y también en su degradación-aclaramiento. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 22 4.1. Proteína precursora del péptido β-amiloide (APP). Esta proteína pertenece a una familia de proteínas transmembrana tipo I altamente conservada tanto en vertebrados como en invertebrados. Aunque podemos encontrar distintas isoformas y variantes dependiendo de la especie animal todas comparten una misma estructura: un largo dominio globular extracelular (con el extremo N-terminal), un segmento transmembrana y un corto dominio citosólico donde se encuentra el extremo C-terminal. (Gralle and Ferreira, 2007). El gen de APP se localiza en el cromosoma 21, y puede generar 10 isoformas alternativas, aunque tres son las más frecuentes APP695, APP751 y APP770 (Tanzi y col., 1988; revisado en Yamada y Nabeshima, 2000), con 695, 751 y 770 aminoácidos respectivamente. La proteína APP se expresa en la mayoría de células del organismo pero las isoformas 751 (APP751) y 770 (APP770) aminoácidos se expresan principalmente en células no neurales, mientras que la isoforma de 695 aminoácidos (APP695) se expresa predominantemente en neuronas (Haass et al., 1991). Figura 4.1. Esquema estructural de la Proteína Precursora del péptido β-amiloide (APP ). Presenta tres dominios principales. Un dominio extracelular N-terminal, un dominio transmembrana y un dominio citosólico. El dominio extracelular contiene a su vez una serie de dominios funcionales, una región de estructura plegada al azar y el dominio β-amiloide (Aβ), que presenta parte de su estructura en el dominio extracelular y parte transmembrana. La imagen muestra la secuencia del péptido β-amiloide humano, indicando los puntos de corte de las diferentes enzimas implicadas en el procesamiento de APP. Figura tomada de Lazarov et al., 2012. Extracelular Citosol Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 29 5. PROTEÍNA TAU: ESTRUCTURA, FUNCIÓN Y FOSFORILACIÓN. 5.1. Estructura de Tau. Tau pertenece a la familia de las proteínas asociadas a microtúbulos: MAPs (Microtubule associated proteins), expresándose de forma predominante en las neuronas. Está codificada en el gen MAPT localizado en el cromosoma 17 (Neve y col., 1986). En el cerebro humano el procesamiento alternativo de su ARNm puede generar 6 isoformas. (ver revisiones Duyckaerts y col., 2009; Wang y col., 2013). Cada isoforma se caracteriza por la presencia o ausencia de fragmentos (N) de 29 ó 58 aminoácidos en el extremo amino-terminal, y de una secuencia de 31-32 aminoácidos que se repite 3 ó 4 veces en el extremo carboxilo-terminal (R), que constituye el “dominio de unión a microtúbulos”. (Fig. 5.1). Durante el desarrollo neuronal Tau va cambiando de isoforma y de localización, de forma que durante el desarrollo fetal esta proteína se encuentra por todo el citosol celular (tanto en soma como en el axón) pero a medida que la neurona madura pasa a localizarse de forma casi exclusiva a lo largo del axón neuronal. Figura 5.1. Esquema del gen MAPT y de las diferentes isoformas de Tau . El gen MAPT puede dar lugar a 6 isoformas de Tau tras el procesamiento alternativo de su ARNm. Figura modificada de Luna-Muñoz et al., 2013. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 30 5.2. Función de la proteína Tau. Su función es estabilizar los microtúbulos (MTs) del citoesqueleto y favorecer su polimerización (ver revisión Scholz y Mandelkow, 2014), por lo que es crítica para la supervivencia celular, ayudando a mantener la estructura interna de la célula y siendo fundamental en el transporte axonal y en la regulación sináptica (Spires-Jones and Hyman, 2014). En condiciones fisiológicas Tau se asocia a los microtúbulos través del dominio de unión a microtúbulos y los estabiliza promoviendo su ensamblaje. Tras su unión a microtúbulos el extremos amino-terminal de Tau queda libre pudiendo interaccionar con distintas proteínas del citoesqueleto, proteínas de membrana o proteínas kinasas (revisado por Scholz and Mandelkow, 2014).También se han atribuido a Tau distintas funciones en procesos de señalización y de organización del citoesqueleto, que parecen depender del estado de fosforilación en las repeticiones del dominio de unión a microtúbulos (Morris et al., 2011). Al fosforilarse tau y disociarse de los microtúbulos se produciría una pérdida de función de los mismos, con lo que se generan fallos en el transporte axonal y muerte neuronal (Gotz, 2001; Spires-Jones et al., 2009). Además, la agregación de Tau inhibe la actividad del proteasoma aumentando de esta forma el efecto negativo de la hiperfosforilación de Tau (Gendron y Petrucelli, 2009; Wang y col., 2013). La agregación de Tau también se ve potenciada por otras modificaciones postraduccionales, como glicosilación, acetilación y ubiquitanación entre otras (Iqbal y Grundke-Iqbal, 2008; Wang y col., 2013). 5.3. Fosforilación de Tau. El estado de fosforilación de cualquier proteína depende de la actividad de las enzimas quinasas y fosfatasas que actúan sobre ella. Hay más de 20 quinasas que pueden fosforilar a Tau y que se pueden dividir en 4 grupos: PDPKs (quinasas dependientes de prolina), no-PDPKs, quinasas que fosforilan residuos de tirosina y quinasas que fosforilan residuos de serina o treonina. De estas, las más estudiadas son la proteína quinasa dependiente de ciclina (CDK-5) y la quinasa glucógeno sintasa 3β (GSK-3) (Kimura y col., 2014), ambas son PDKs. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 31 - GSK-3β. Esta enzima pertenece al grupo de la PDPKs, y fosforila residuos localizados en las regiones de tau que están implicadas en la unión a microtúbulos. Esta enzima también interacciona con la presenilina 1 (PS1) participando por tanto en la producción de Aβ (Corbo y Alonso, 2011). - Cdk-5. También pertenece al grupo de las PDPKs y está formada por una subunidad catalítica (que es la propia Cdk-5) y el polipéptido p25 o p35 que actúa como unidad reguladora. El péptido p25 procede del procesamiento N-terminal de un péptido de mayor tamaño p35 llevado a cabo por la enzima calpaina proteasa dependiente de calcio. Fueron los estudios de Imahori y Uchida en 1997, los que pusieron de manifiesto la participación de Cdk5 en la enfermedad de Alzheimer al comprobar que las hiperfosforilaciones de Tau se producían en los mismos residuos sobre los que actuaba esta quinasa, y al reportar una acumulación de p25 en enfermos de AD. Varios estudios han descrito una mayor actividad enzimática del complejo formado por Cdk5-p25 que el Cdk5-p35 (revisado por Kimura et al., 2014). La existencia de grandes cantidades de Aβ o estrés oxidativo en las células, puede provocar una desregulación en la actividad de las quinasas de Tau, provocando su hiperfosforilación. Además, se ha propuesto que el metabolismo de APP regula la proteostasis de Tau (Moore y col., 2015). Tau tiene 80 residuos de serina o treonina además de 5 de tirosina con posibilidad de ser fosforilados. Esto residuos se encuentran la mayoría rodeando el dominio de unión a microtúbulos. La hiperfosforilación anómala de Tau produce un cambio conformacional que dificulta su unión a microtúbulos y desestabiliza la estructura axonal, formando agregados que interrumpen el transporte axonal (Scholz and Mandelkow, 2014). Cuando se desorganizan los microtúbulos, Tau al ser insoluble, tiende a agregarse formando los conocidos NTFs característicos de la patología de EA. El estado de fosforilación de tau es regulado por diversas fosfatasas. En el cerebro humano, las fosfatasas más abundantes son PP2A y PP1 (Liu C. y col., 2013). A su vez PP2A regula la actividad de varias kinasas, entre ellas CaM-kinasa II, PKA y ERK1/2. Se ha observado que la actividad de PP2A está reducida en los cerebros de pacientes con EA. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 32 6. RESPUESTA INFLAMATORIA. NEUROINFLAMACIÓN. La inflamación se desencadena frente a diversos estímulos tras ponerse en marcha los mecanismos moleculares y celulares de la respuesta inmune innata. La respuesta inflamatoria es necesaria para la defensa del organismo y es beneficiosa si está regulada y se resuelve en un periodo de tiempo adecuado. El problema es cuando esta respuesta se vuelve crónica, excesiva o inapropiada, es entonces cuando pasa de ser beneficiosa a convertirse en patológica. El sistema nervioso central (SNC) ha sido considerado durante muchos años un sistema inmunoprivilegiado, ya que la barrera hemato encefálica (BHE) restringe el acceso de mediadores y células inmunes al tejido cerebral (Glezer et al., 2007). Actualmente se sabe que, al igual que en el resto del organismo, un patógeno/lesión en el SNC es capaz de activar una respuesta inmune innata y desarrollar una respuesta inflamatoria que en este caso llamaremos neuroinflamación. Como la BHE restringe el acceso de células del sistema inmune periférico al interior del cerebro, el SNC tiene la capacidad per se de generar una respuesta inmune innata ante cualquier tipo de lesión/daño, y/o infección. Para ello la células microgliales (fagocitos mononucleares residentes) liberan, en respuesta al antígeno, una serie de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias, fagocíticas, citotóxicas y reguladoras de linfocitos T. Además de la microglía, los astrocitos también tienen un papel importante en el desarrollo de la respuesta neuroinflamatoria. Mediante la liberación de citoquinas y quimioquinas, la microglía y los astrocitos participan en el reclutamiento de células del sistema inmune periférico (macrófagos, células dendríticas, linfocitos, etc.) al SNC (Kielian 2006). Si el proceso neuroinflamatorio sobreactivado podría generar parte del daño celular y producir la pérdida de la función neuronal observado en la EA (Heneka y O’Banion, 2007; Perry y col., 2010; Heneka y col., 2015b; Heppner y col., 2015), al igual que ocurre en otras enfermedades neurodegenerativas, como el Parkinson (Mena y García de Yebenes, 2008). De forma general se puede clasificar la respuesta inmune en innata o adaptativa. La respuesta inflamatoria que caracteriza a la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas, incluida la EA, implica la activación de componentes de la respuesta inmune innata (a través de la microglía y astroglía; Heneka y col., 2015a), mientras que la respuesta inmune adaptativa y la infiltración de linfocitos T se da en menor grado. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 33 Aunque la neuroinflamación no sea la principal causante de la neurodegeneración que se produce en la EA, existen múltiples evidencias que sugieren que desempeña un papel importante en la patogénesis de la misma (Nuzzo et al., 2014). Numerosos investigadores piensan que la neurodegeneración observada en los pacientes de EA está mediada por una respuesta inflamatoria crónica de las células de la glía activadas por los depósitos de β-amiloide (Butovsky y col., 2005; Sastre y col., 2006). Estos depósitos extracelulares de Aβ generan una activación de la microglía y la aparición de astrocitos reactivos, que pueden generar productos tóxicos que provoquen la muerte neuronal, tales como citoquinas inflamatorias, aminoácidos excitadores y ROS (Mrak y Griffin, 2005). Si fuese este Aβ el que inicia el proceso inflamatorio, serían las zonas en las que más Aβ se deposita, como el hipocampo, el subículo y la corteza entorrinal, las que muestran mayor activación microglial. Además, este proceso se ha asociado con la formación de placas de Aβ y ovillos neurofibrilares, ya que un ambiente inflamatorio puede activar las quinasas de Tau (ver revisión McNaull y col., 2010). En la actualidad aún se desconoce si la neuroinflamación es una consecuencia secundaria al proceso de neurodegeneración en la EA o es al contrario, siendo la inflamación una de las causas que provocan su aparición y desarrollo al generar muerte neuronal (Wyss-Coray, 2006; Glass y col., 2010). El SNC posee un sistema inmune endógeno coordinado por células inmunocompetentes (Shie y Woltjer, 2007; Rogers y col., 2007; Deane y Zlokovic, 2007; Eikelenboom y col., 2006). Los responsables de la neuroinflamación pueden dividirse en: - Componentes celulares del SNC: microglía, células dendríticas, astrocitos y neuronas. - Mediadores inflamatorios: citoquinas liberadas por los componentes celulares anteriores. 6.1. Componentes celulares del sistema inmune del SNC. 6.1.1. Microglía. Son células mieloides residentes en el SNC. La microglía representa entre un 0.5 y un 16.6% del total de células presentes en el cerebro humano, esta gran variabilidad es debida a una elevada diferencia en la distribución regional, presentando en general una mayor densidad en la sustancia blanca que en la sustancia gris (Mittelbronn et al., 2001). Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 34 Aunque aún no se conocen todas sus funciones en el SNC las células microgliales se consideran los “macrófagos del cerebro” (Ginhoux et al., 2010) constituyendo un claro agente protector. Entre sus funciones conocidas, destaca su participación en el sistema inmune innato como primera línea de defensa del SNC. La microglía tiene la capacidad de detectar y fagocitar patógenos, a la vez que activa la respuesta inflamatoria y recluta al resto de células inmunomoduladoras. También actúa sobre la proliferación, motilidad, migración, comunicación entre células y proteostasis. En un cerebro adulto y sano, las células de la microglía se encuentran en un estado quiescente, con una morfología ramificada y una escasa expresión de moléculas asociadas a la función de macrófagos. Sin embargo, estudios recientes han revelado que la microglía residente posee procesos o ramificaciones altamente móviles, por lo que no se encuentran en estado de reposo, sino en una situación de escaneo o inspección continuo del entorno, sondeando su medio para detectar la posible llegada de algún tipo de daño. De esta forma, mientras que el soma permanece siempre en la misma posición las prolongaciones son capaces de barrer todo el entorno que las rodea. Cuando estas prolongaciones detectan una alteración la célula microglial cambia a un estado inflamatorio en el que su principal función es neutralizar al agente causante del daño. De esta forma rodea al patógeno/lesión con sus prolongaciones y se activan una serie de vías de señalización en el interior de la celular que ponen en marcha la liberación de citoquinas inflamatorias con el fin de activar al resto de células implicadas en la respuesta inmune (Gomez-Nicola and Perry, 2015). La capacidad fagocítica de la microglía le permite limpiar el entorno de células muertas y de restos celulares que en el caso de quedarse en el parénquima podrían desencadenar una respuesta pro-inflamatoria. Desde este punto de vista, esta función fagocítica se puede considerar beneficiosa, sin embargo la microglía también fagocita células dañadas que aún no han muerto, produciendo una alteración en la sinapsis que puede llegar a ser neuropatológica, aunque por otro lado, una función importante de la microglia es su participación en la saneamiento y remodelación de las sinapsis tras la muerte de neuronas y células gliales que ocurre de manera fisiológica durante el desarrollo cerebral postnatal (Gomez-Nicola and Perry, 2015). El efecto del envejecimiento sobre la microglía no conlleva necesariamente la pérdida de estas funciones, sino que implica una disfunción de las mismas y una respuesta hiperreactiva (Gomez-Nicola y Perry, 2015). De hecho, se ha observado que la microglía muestra cambios morfológicos y moleculares con el envejecimiento y Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 35 progresión de la EA, una mayor capacidad proliferativa y la presencia de microglía distrófica”, caracterizada por la fragmentación, pérdida de prolongaciones, etc. (Baron y col., 2014; Mosher y Wyss-Coray,2014; Streit y col., 2014), algo que también se ha observado en modelos de la EA. En la AD se produce una activación de la respuesta inmune innata microglial previa a la manifestación de la patología (Cribbs et al., 2012). Esta respuesta inflamatoria se mantiene a lo largo de la enfermedad y puede adoptar distintos fenotipos. A día de hoy existen dudas sobre si la microglía adopta estrictamente un solo fenotipo o puede modificarlo, y sobre los factores que hacen que la microglía cambie de un fenotipo a otro (Gómez-Nicola and Perry, 2015). Atendiendo a sus funciones y a las citoquinas liberadas, la microglia activada se clasifica en dos fenotipos: El fenotipo clásico (M1), típico de una respuesta proinflamatoria y citotóxica, que produce citoquinas y quimioquinas proinflamatorias, y el fenotipo alternativo (M2), que genera una respuesta inflamatoria contenida, pro-supervivencia, regeneradora y antiinflamatoria, liberando citoquinas anti-inflamatorias y factores tróficos. Figura 9. Fenotipos de Activación microglial. Fenotipo M1, Respuesta Inflamatoria Clásica. Fenotipo M2a, Respuesta Inflamatoria Alternativa: Protectora y antiinflamatoria. Fenotipo M2b, Respuesta Inflamatoria Alternativa: Regeneradora. Fenotipo M2c, Respuesta Inflamatoria Alternativa: Inmunomoduladora. Figura modificada de Kraft-Terry et al., 2009 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 36 6.1.1.1. Fenotipo Clásico o M1. Se produce tras la exposición a IFN-ɣ, TNF-α, y/o ligandos de los receptores TLRs (toll like receptor). Como consecuencia, las células microgliales producen la liberación de una serie de factores neurotóxicos, que incluye especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno, óxido nítrico, citoquinas y quimioquinas, entre ellas TNF-α, IL-1β, IL-6, IL- 12, IFN-γ, IFN-β1, FAS-L, TRAIL y CH3L1 (Varnum and Ikezu, 2012), Todos estos factores tienen como finalidad la activación y mantenimiento de una respuesta inflamatoria tóxica que proteja al SNC del agente dañino. Sin embargo, si dicha respuesta inflamatoria se descontrola puede provocar daño celular y neurodegeneración debido a la presencia de esos factores citotóxicos. La respuesta microglial M1 es similar a la activación de linfocitos Th1, y en ambas se produce un ciclo de activación entre las distintas células implicadas, creando un círculo vicioso de potenciación de la respuesta proinflamatoria (Cherry y col., 2014). Como ya hemos mencionado, el fenotipo M1 tiene como objetivo presentar y eliminar al patógeno, y ello implica el aumento de expresión de ciertas proteínas, como MHC-II, la enzima óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) o el receptor CD86 entre otras. Aunque generalmente la microglía activa M1 implica un aumento en la expresión de marcadores proinflamatorios y una disminución de proteínas antiinflamatorias (Cherry y col., 2014), hay autores que describen que dicha microglía puede expresar tanto marcadores clásicos como alternativos (Weekman y col., 2014). 6.1.1.2. Respuesta inflamatoria Alternativa o M2. La respuesta alternativa inhibe la activación clásica de las células inmunes y promueve la reparación del tejido y la recuperación de la homeostasis, mediante la liberación de citoquinas y receptores antiinflamatorios y factores de crecimiento (Imai y col., 2007; Chhor y col., 2013). El fenotipo M2 se clasifica a su vez en tres subtipos según los mediadores responsables de su activación (Fig. 6.1.) y los marcadores característicos que expresan (Colton y col., 2006). A pesar de estar dividido en tres grupos, el fenotipo M2 tiene una función conjunta que es neutralizar al agente causante de la lesión sin dañar al tejido cerebral (Cherry y col., 2014). Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 37 - M2a. Esta respuesta se induce por IL4 e Il13 a través de los receptores TLRs. Se observa un aumento en la expresión de genes que tienen como objetivo evitar que se genere mayor respuesta inflamatoria y mantener un entorno neuroprotector. Entre ellos está Arginasa-1 (Arg-1) que disminuye la producción de NO; IGF-1 (Insulin growth factor-1), IL4, IL13 y MRC-1 (Mannose Receptor 1). Este estado de activación presenta capacidad fagocítica, necesaria para la eliminación del patógeno y de los restos celulares que hayan quedado como resultado de la respuesta inflamatoria citotóxica. Algunos de los receptores implicados en la fagocitosis son MSR- 1 (macrophage scavenger receptor-1), SiRPβ-1 (Signal Regulatory Protein β-1) y CD36. TREM-2 y CD33 son dos receptores, implicados en la fagocitosis de Aβ, que han sido descritos como factores de riesgo de la EA. - M2b. Este fenotipo es el menos conocido. La activación de este fenotipo es dependiente del inmuno-complejo, los TLRs y/o el receptor IL-1R (revisado por Boche et al., 2013). Se caracteriza por la falta de expresión de marcadores típicos M2, aunque presentan una expresión alta de IL-10 y baja de IL-12, característico de una polarización M2 (Mosser y Edwards, 2008). Este fenotipo, además, se ha relacionado con la activación de linfocitos Th2. - M2c. Esta polarización tiene lugar gracias a la estimulación de IL-10 y TGF-β, dos potentes citoquinas antiinflamatorias. La actividad de estas células podría asociarse a una función regeneradora y reguladora de la respuesta inmune, que se pone en marcha una vez que las células polarizadas a M1 han hecho su función. TGF-β además se ha asociado a una mayor capacidad fagocítica de la microglía. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 38 6.1.1.3. Papel de la microglia en la patología de la enfermedad de Alzheimer. La implicación de la microglía en el desarrollo de la EA no se conoce con exactitud, y su papel debe ser entendido como dual y muy complejo, esto es lo nos hace pensar los datos que se tienen en la actualidad. Algunas de sus actuaciones son beneficiosas, pero otras, directa o indirectamente, pueden generar un ambiente citotóxico perjudicial para las neuronas. Está claro que el péptido Aβ puede atraer y activar a la microglía (Malm y col., 2005; Meyer-Luehmann y col., 2008). Las prolongaciones de la microglía rodeando a la placa podrían constituir una barrera para evitar su expansión y contener la toxicidad de la misma. Es un hecho que las áreas de placas no cubiertas por microglía son menos compactas y están asociadas con una distrofia axonal más severa (Condello y col., 2015). La protección no queda en esta barrera física constituida por las prolongaciones celulares, ya que la fagocitosis activa del Aβ oligomérico (Frautschy y col., 1992; Mandrekar y col., 2009), y la actividad proteolítica de las enzimas que pueden secretar la microglía (Yang y col., 2011), no sólo actuarían reduciendo la polimerización del Aβ, sino que también tendría efecto sobre el posible crecimiento de la placa (Simard y col., 2006; Bolmont y col., 2008). Todo esto se apoya por la presencia de receptores en las células microgliales que reconocen al péptido Aβ (Yu y Ye, 2015) y de enzimas, como la neprelisina, que son capaces de degradarlo. Si la microglía desempeña un papel importante en el aclaramiento de Aβ en la EA, sería lógico pensar que la acumulación de dicho péptido en los estadios avanzados de la enfermedad puede ser indicativo de una deficiente actividad fagocítica microglial. Aunque en la actualidad no está claro si la microglía tiene la capacidad de degradar intracelularmente el Aβ internalizado o si esta capacidad se encuentra disminuida con el envejecimiento y progresión de la enfermedad. Son distintos estudios los que involucran a la microglía con la EA, por ejemplo correlacionando ciertas variaciones genéticas en TREM2 (Triggering receptor expressed on myeloid cells 2), proteína reguladora de la fagocitosis en microglía y macrófagos, con un mayor riesgo para la EA (Guerreiro y col., 2013; Jonsson y col., 2013). También existen pruebas del papel del receptor microglial de quimocinas CX3CR1 (la unión de CX3CL1 neuronal a este receptor inhibe la activación clásica) en la pérdida neuronal, un ratón knockout para éste, no muestra muerte neuronal y presenta una menor carga amiloide (Fuhrmann y col., 2010; Liu y col., 2010; Cho y col., 2011). Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 45 difundir a través del parénquima cerebral causando toxicidad neuronal incluso en aquellas zonas libres de placas. 7.2. Hipótesis de la neurodegeneración del citoesqueleto de las neuronas. Según ésta todo comienza con la hiperfosforilación de la proteína Tau dando lugar a los NTFs. La desorganización de los microtúbulos produciría fallos en el transporte axonal que conduciría a la muerte neuronal con la liberación de Tau. Esta liberación anómala de Tau podría promover la agregación de Aβ continuando la cascada (ver revisión Gendron y Petrucelli, 2009). 7.3. Hipótesis colinérgica. Gracias a esta hipótesis se han desarrollado los inhibidores de la acetilcolinesterasa (Bartus, 2000), uno de los pocos medicamentos usados en el tratamiento de la EA. Estos medicamentos son incapaces de parar la progresión de la enfermedad y sólo producen ciertas mejoras en la sintomatología inicial. Este fracaso constituye las principales razones para invalidar esta hipótesis que se propuso al observar una disminución de la actividad de la enzima de síntesis de este neurotransmisor en la corteza cerebral e hipocampo de pacientes, que correlacionaba con el daño cognitivo (Coyle y col., 1983), y una degeneración de neuronas colinérgicas en el telencéfalo basal (Whitehouse y col., 1982). Además la acetilcolina es uno de los principales neurotransmisores del SNC y periférico, implicado en el aprendizaje y la memoria. El sistema colinérgico está implicado también en la modulación de la expresión de factores neurotróficos importantes en la supervivencia neuronal (Craig y col., 2011). 7.4. Hipótesis neurovascular. La hipoperfusión cerebral aparece durante el envejecimiento con una disminución del flujo sanguíneo de aproximadamente 0,5% por año, y ésta puede ser crítica para la supervivencia neuronal (Iadecola, 2004). La hipótesis neurovascular considera central el papel de enfermedades cerebrovasculares en el desarrollo de la EA, y se basa en estudios epidemiológicos que ligan los problemas vasculares con ésta (Deschaintre y col., 2009), en el solapamiento de los síntomas e histopatología de la demencia vascular y la EA (Kalaria, 2002), y en el hecho de que la EA suele aparecer asociada con una extensa angiopatía amiloide cerebral o ACC (deposiciones de Aβ en los vasos sanguíneos; Jiang y col., 2008). Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 46 7.5. Hipótesis inflamatoria. Propone que la inflamación contribuye a la patogénesis inicial de la EA, ya que en los pacientes se han observado niveles altos de citoquinas proinflamatorias y un incremento de células microgliales activas alrededor de las placas. Dos estudios muestran una correlación negativa entre la función cognitiva y la activación de la microglía (Edison y col., 2008; Yokokura y col., 2011), aunque los resultados no son concluyentes (ver revisión Varnum e Ikezu, 2012). Además, esta hipótesis también se apoya en el hecho de que pacientes tratados con drogas antiinflamatorias presentan una menor incidencia de la EA (Morales y col., 2014). 7.6. Otras hipótesis de la EA. Recientemente se han propuesto otras hipótesis explicativas, como la hipótesis calpaína-catepsina (Yamashima, 2013) o la del estrés oxidativo (Padurariu y col., 2013). Sin embargo, las teorías basadas en un único factor propuestas no se adecuan a los síntomas clínicos y neuropatológicos. McDonald (2002) ha propuesto un modelo basado en cofactores. Este modelo propone que son una combinación de diferentes de factores de riesgo de la EA (estrés, disfunción colinérgica, dieta, etc.) los que producen las variantes de la enfermedad. Una de las fortalezas de este modelo es que puede explicar las diferencias individuales observadas entre los pacientes y la diferente respuesta al tratamiento. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 47 8. MODELOS ANIMALES DE LA ENFEMEDAD DE ALZHEIMER. El desarrollo de estos modelos es fundamental en las investigaciones que se realizan sobre la EA. Por un lado permiten estudiar la evolución temporal de la enfermedad desde los estadios más tempranos, y por otro, son una herramienta necesaria para probar el efecto in vivo de posibles terapias desarrolladas para combatir la EA. (Yamada y Nabeshima, 2000; Webster y col., 2014). En los últimos años se están desarrollando multitud de modelos de la EA, ninguno de ellos reproduce todos los efectos que la misma tiene en humanos, pero sí que están proporcionando una valiosa información sobre su patogénesis. Existen desde modelos espontáneos como monos viejos (Voytko y Tinkler, 2004), perros (Cummings y col., 1996) o ratones con senescencia acelerada; modelos invertebrados, como Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans (Alexander y col., 2014), Drosophila melanogaster (Crowther y col., 2004), o vertebrados como el pez cebra (Newman y col., 2014); modelos in vitro; modelos inducidos químicamente (Kausahl y col., 2013); aunque los más empleados para el estudio de esta enfermedad son los modelos transgénicos (Tg.) murinos, que portan las mutaciones encontradas en los pacientes de la EA familiar (ver revisiones Duyckaerts y col., 2008, Ashe y Zahs, 2010; Elder y col., 2010b; Bilkei- Gorzo, 2014; Neha y col., 2014; Webster y col., 2014). Estos modelos, difieren en el fondo genético de los animales utilizados, en la mutación seleccionada, en el promotor utilizado, y en la técnica empleada para su obtención, por lo que existen grandes diferencias en las características neuropatológicas que manifiestan. Los principales modelos desarrollados son: 8.1. Ratones transgénicos PS1. Estos ratones sobre-expresan una forma mutada de la PS1 humana. Como consecuencia presentan una razón de Aβ42/Aβ40 incrementada, pero no desarrollan placas extracelulares del péptido β-amiloide (Borchelt y col., 1997), esto puede ser debido a que el Aβ murino presenta propiedades de agregación distintas al humano (Jankowsky y col., 2007). Debido a la falta de patología de placas, los ratones transgénicos PS1 han sido menos utilizados que los APP. No obstante, estos modelos muestran pérdida neuronal y sináptica relacionada con la edad, así como patología vascular y déficits en la neurogénesis hipocampal (ver revisión Elder y col., 2010a). En este sentido, Chui y col. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 48 (1999), fueron los primeros en describir un fenotipo neurodegenerativo en el ratón transgénico PS1L286V, mostrando una pérdida neuronal en el hipocampo y la neocorteza. Además, se ha mostrado una pérdida sináptica en modelos con la mutación M146L (Rutten y col., 2005) y A246E (Priller y col., 2007). Se ha propuesto que las mutaciones en PS incrementan la susceptibilidad neuronal al daño excitotóxico, ya que las neuronas con mutaciones en PS1 liberan una cantidad excesiva de calcio desde el RE (Small, 2009). Por otro lado, se ha observado una reducción en la fosforilación del residuo Ser9 de GSK-3β que se relaciona con un incremento en su actividad enzimática, en modelos PS1 (Tanemura y col., 2006; Dewachter y col., 2008), dando lugar a la hiperfosforilación de Tau. Además, se ha mostrado un incremento en el estrés oxidativo y la peroxidación lipídica y proteica en ratones PS1. Por último, se han detectado déficits de aprendizaje y memoria en modelos trasngénicos para PS, aunque son sutiles (ver revsión Elder y col., 2010a). 8.2. Ratones transgénicos APP. Estos ratones sobre-expresan la forma mutada y/o no mutada de esta proteína. En la actualidad existen más de 40 tipos diferentes de animales transgénicos APP y más de 20 que expresan APP junto con otros genes relacionados, como PS1 y TAU (www.alzforum.org). Nos vamos a centrar en el análisis de uno de estos ratones transgénicos, el modelo APP23 que sobre-expresa la isoforma humana APP751 con la doble mutación Swedish bajo control del promotor Thy-1 murino (Sturchler-Pierrat y col., 1997). Este modelo presenta depósitos de Aβ a los 6 meses y déficits cognitivos desde los 3 meses de edad (Prut y col., 2007). También presenta activación de la glía (Bornemann y col., 2001), pérdida sináptica, hiperfosforilación de Tau (aunque no aparecen ovillos) y neuritas distróficas (Sturchler-Pierrat y Staufenbiel, 2000). La pérdida neuronal es moderada en la neocorteza y el hipocampo (Bondolfi y col., 2002), pero acusada en el locus coeruleus (Heneka y col., 2006). Además, este modelo muestra una prominente angiopatía amiloide (Beckmann y col., 2003). Sin lugar a dudas estos modelos transgénicos son mejores que los PS1 al compartir más rasgos (aunque no todos) con la patología observada en los humanos. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 49 8.3. Ratones transgénicos bigénicos PS1/APP. Estos modelos sobre-expresan ambas proteínas humanas mutadas. En este caso las manifestaciones patológicas de la enfermedad aparecen a edades comprendidas entre los 4 y 6 meses, lo que los convierte en modelos más interesantes. Por ejemplo desarrollan depósitos de Aβ mucho antes que los animales de la misma edad que expresan sólo uno de los genes mutados (Borchelt y col., 1996; Matarin y col., 2015). Sin embargo siguen sin reproducir totalmente la patología de la EA, ya que no presentan ni ovillos neurorfiblilares, ni muerte neuronal masiva. Vamos a hablar a continuación de dos de estos modelos. El modelo doble transgénico PS1M146L/APPSL (que sobre-expresa PS1M146L, bajo el promotor HMG-CoA reductasa, junto con la isoforma 751 del APP con la doble mutación Swedish y la mutación London), generado por el grupo de Blanchard y col., (2003), presenta muerte neuronal en hipocampo y corteza entorrinal (Ramos y col., 2006; Moreno-González y col., 2009; Baglietto-Vargas y col., 2010). En este modelo aparecen las placas extracelulares a partir de los 3-4 meses, y presenta activación de la glía desde edades muy tempranas (Jiménez y col., 2008). Aunque no presenta ovillos neurofibrilares. El modelo PS1dE9/APPSWE, bajo elpromotor PrP en un única inserción genómica, presenta déficits cognitivos a los 3 meses (Jankowsky y col., 2001) con fallos en el laberinto acuático de Morris a los 12 (Lalonde y col., 2005). Las placas de Aβ están presente desde las 6-8 semanas, muestra una intensa activación de la glía (Ruan y col., 2009) y neuritas positivas para Tau (Kurt y col., 2003). No obstante, no presenta una pérdida neuronal masiva, aunque algunas poblaciones presentan déficits significativos, como las neuronas catecolaminérgicas del locus coeruleus (O’Neil y col., 2007) y las interneuronas del hipocampo (Popovic y col., 2008). El modelo 5xFAD, fue descrito por Oakley y col. (2006) y presenta la doble mutación sueca y las mutaciones Florida (I716V) y London (V717I) en el gen APP, y dos mutaciones en PS1 (M146L+L286V). Desarrolla déficits cognitivos a los 3 meses de edad (Ohno y col., 2006) y Aβ intracelular a los 1,5 meses, con deposición extracelular a partir de los 2 meses. Además, presenta pérdida neuronal a partir de los 9 meses, que afecta a las neuronas noradrenérgicas (Kalinin y col., 2012) y colinérgicas (Devi y Ohno, 2010), así como de células piramidales en la corteza cerebral y el subículo (Oakley y col., 2006). Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Introducción 50 8.4. Ratones transgénicos basados en Tau. Estos ratones sobre-expresan la proteína humana componente principal de los NTFs. Sin embargo, al sobre-expresar tau silvestre, sólo se ha conseguido desarrollar ovillos en un modelo y a partir de los 24 meses (Gotz, 2001). A pesar que no se identificado ninguna mutación en Tau en los pacientes de Alzheimer, los ovillos neurofibrilares sólo se encuentran en animales transgénicos que sobre-expresan la forma humana mutada de TAU. Al igual que ocurre en los transgénicos APP y PS1xAPP, los transgénicos tau tampoco desarrollan pérdida neuronal masiva. Por lo tanto, ninguno de estos modelos reproducen al completo todas las manifestaciones patológicas que caracterizan a la enfermedad de Alzheimer. 8.5. Ratones transgénicos tri-génicos PS1/APP/Tau. Para intentar conseguir la manifestación conjunta de placas de Aβ y ovillos neurofibrilares se desarrolló un modelo triple transgénico, 3xTg-AD, con mutaciones en los genes para APP (APPSWE), Tau (P301L) y PS1 (M146L), bajo el promotor Thy-1.2 de ratón (Oddo y col., 2003). Este modelo muestra daños cognitivos a los 3-5 meses (Webster y col., 2014). En este modelo la progresión de la patología es comienza con la acumulación de Aβ intracelular, seguido de la hiperfosforilación de Tau, deposición de Aβ extracelular y aparición de NFTs (Oddo y col., 2003; Mastrangelo y Bowers, 2008). Además presenta una pérdida noradrenérgica (Manaye y col., 2013) y colinérgica (Girao da Cruz y col., 2012), y activación microglial. Sin embargo, no hay una pérdida neuronal en el hipocampo, aunque si presenta disfunción sináptica. Este modelo ofrece la posibilidad de probar la interacción entre Aβ y Tau (Oddo y col., 2007), aunque la expresión de los tres genes a la vez, no permite analizar la implicación patológica de cada uno en la EA. Un año después, Boutajangout y col. (2004), desarrollaron otro animal triple transgénico sin mutaciones en TAU (PS1M146L, APP751SL, hTAu3R), que muestra placas a partir de los 2,5 meses, acumulación somato-dendrítica de Tau, neuritas distróficas con Tau hiperfosforilado. Sin embargo, no existen NFTs ni a los 18 meses. b. Objetivos Generales Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Objetivos Generales 54 1. Estudio de la respuesta inflamatoria en hipocampo del doble transgénico, modelo de la Enfermedad de Alzheimer, PS1M146L/APP751SL. Evaluación de la misma con el transcurso de la edad del animal, y caracterización del cambio fenotípico sufrido en la activación de la microglial. 2. Evaluación del efecto tóxico producido por la acumulación de formas oligoméricas solubles a edades avanzadas en el modelo transgénico murino PS1M146L/APP751SL de la enfermedad de Alzheimer. Estudio de la modulación de la ruta PI3K/Akt-GSK-3β mediada por la fracción soluble extracelular S1 obtenidas en ratones dobles transgénicos jóvenes (6 meses de edad) y viejos (18 meses de edad). 3. Efecto del tratamiento crónico mediante la ingesta oral de Litio en los ratones PS1M146L/APP751SL modelos de la enfermedad de Alzheimer. Caracterización de cambios sufridos en la patología propia de la enfermedad de Alzheimer observado en este modelo animal transgénico. 4. Evaluación del contenido de Aβ en la fracción soluble en muestras post mortem de hipocampo de enfermos de EA y ratones transgénicos modelo de EA. Análisis de la posible repercusión, sobre el contenido de formas solubles de Aβ, del protocolo inicial de homogeneización del tejido usado en la preparación de las fracciones solubles S1. Estudio in vitro del efecto de estas fracciones S1 obtenidas mediante distintos protocolos de homogeneización. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo I 61 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo I 62 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo I 63 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo I 64 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo I 65 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo I 66 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo I 67 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo I 68 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo I 69 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo I 70 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo II 77 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo II 78 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo II 79 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo II 80 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo II 81 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo II 82 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo II 83 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo II 84 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo II 85 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo II 86 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo III 93 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo III 94 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo III 95 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo III 96 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo III 97 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo III 98 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo III 99 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo III 100 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo III 101 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo III 102 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 109 Resultados: Capitulo IV. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 110 OBJETIVOS IV Evaluación del contenido de Aβ en la fracción soluble en muestras post mortem de hipocampo de enfermos de EA y ratones transgénicos modelo de la enfermedad. Análisis de la posible repercusión, sobre el contenido de formas solubles de Aβ, del protocolo inicial de homogeneización del tejido usado en la preparación de las fracciones solubles S1. Estudio in vitro de estas fracciones S1 obtenidas mediante distintos protocolos de homogeneización. a. Determinación de los niveles presentes en la fracción soluble de muestras de enfermos de EA obtenidas mediante procesos de homogeneización suaves. b. Estudio del efecto del protocolo de homogeneización inicial del tejido sobre el contenido de las distintas especies de Aβ presentes en la fracción soluble S1. c. Caracterización de la capacidad estimuladora y tóxica de las distintas fracciones solubles obtenidas usando diversos protocolos de homogenización sobre cultivos celulares in vitro. Este trabajo se presenta como artículo. Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 111 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 112 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 113 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 114 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 115 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 116 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 117 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 118 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 125 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 126 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 127 Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Resultados. Capítulo IV 128 RESUMEN IV A modo de resumen podemos decir que: Al comparar el efecto sobre la cantidad de especies de Aβ presentes en las fracciones solubles usando condiciones suaves (manualmente con Dounce) en comparación con homogeneizaciones más agresivas (sonicación a distintas intensidades) concluimos que: 1. Las técnicas más agresivas producen la liberación de péptidos Aβ a partir de las placas de extracelulares. Esta liberación pueden generar artefactos, ya que producirían un paso de Aβ de la placa hasta la fracción soluble, generando un artefacto experimental que nada tiene que ver con las condiciones fisiológicas in vivo. 2. Estas fracciones solubles obtenidas con protocolos que pueden afectar a la integridad de la placa son capaces de producir la estimulación de respuesta inflamatoria clásica y muerte neuronal en experimentos in vitro, mientras que las obtenidas mediantes métodos suaves no. d. Discusión Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Discusión 132 1. Respuesta inflamatoria en SNC en los ratones transgénicos PS1xAPP modelo de la enfermedad de Alzheimer a los 6 y 18 meses de edad. En los cerebros de pacientes de EA se produce un incremento de células microgliales activas alrededor de las placas de Abeta, así como un aumento en los niveles de citoquinas pro-inflamatorias, por lo que muchos los autores proponen que la inflamación contribuye a la patogénesis inicial de dicha patología. Aunque los resultados no son concluyentes, existen diversos estudios que muestran una correlación negativa entre las alteraciones en la función cognitiva y la activación de la microglía en la EA (Edison y col., 2008; Yokokura y col., 2011, Varnum e Ikezu, 2012). Apoyando esta hipótesis, estudios en pacientes que toman antiinflamatorios de forma habitual han mostrado una menor incidencia de la enfermedad de Alzheimer en estos pacientes(Morales y col., 2014)..Sin embargo otros estudios no corroboran los mismos resultados (pon biblio) Por lo tanto resulta de vital importancia determinar si la función microglial juega un papel beneficioso o perjudicial en el inicio y la progresión de la EA, a fin de poder proponer mecanismos de regulación de su actividad como posible diana terapéutica de dicha patologia (Condello y col., 2015). En el primer trabajo presentado en este manuscrito, hemos realizado la caracterización del estado de activación de la microglía en el modelo transgénico PS1M146L/APP751SL, detectando un claro paralelismo, tanto espacial como temporal, entre la deposición de Aβ en placas extracelulares y la activación de la microglía (Simard y col., 2006). 1.1. La microglía en contacto directo con las placas extracelulares del péptido Aβ se activa a un fenotipo alternativo M2 (independientemente de la edad del animal) mientras que la microglía entre placas se activa a un fenotipo clásico M1 sólo a edades avanzadas. A edades tempranas, la microglía activa se concentra EXCLUSIVAMENTE rodeando e infiltrando a estas placas, y se mantiene en estado de reposo en las regiones interplacas. En este sentido, experimentos in vivo mediante microscopia multifoton, han revelado que la formación de placas está seguida de una rápida activación y reclutamiento de la microglia a la misma (Meyer-Luehmann y col., 2008). Además, recientemente se ha demostrado que las placas de Abeta son capaces de atraer y estimular a la microglía al poseer en su superficie diversos receptores que reconocen al péptido Aβ (Yu y Ye, 2015). Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Discusión 133 Nuestros resultados muestran que la microglía asociada a placas se activa a un estado alternativo M2, caracterizada por la expresión de marcadores alternativos como YM-1 y la ausencia de factores cito-tóxicos (TNF-α, TRAIL, FASL e iNOS), datos que concuerdan con los obtenidos por otros autores (Imai y col., 2007; Chhor y col., 2013). A edades avanzadas (18 meses), la microglía activa que rodea a la placa continúa siendo YM-1 positivas y TNF-α negativas. Por tanto concluimos que en el modelo animal PS1xAPP las células microgliales en contacto directo con las placas de Abeta presentan un estado de activación alternativo independientemente de la edad del animal. Este fenotipo de activación microglial M2 se manifiesta además por un incremento en la expresión de IL-4, citoquina liberada por los linfocitos Th2 y astrocitos activados, y que participa en la activación microglial a un fenotipo M2 (Iribarnen y col., 2005; Butovsky y col., 2005; Ponomarev y col., 2007; Lyons y col., 2007 a,b.). Hay que destacar que, a edades tempranas, en el modelo PS1xAPP la expresión de IL-4 está limitada a los astrocitos activos que rodean a la placa, mientras que a edades avanzadas la expresan además los linfocitos T CD3+ que concentrados alrededor de las placas. En conjunto, estos resultados parecen indicar que la IL-4 producida por los astrocitos, y por las células CD3+ en animales viejos, podrían controlar la activación de la microglía hacia el fenotipo alternativo no inflamatorio, sin llegar a descartar que la placa por si sola fuese capaz de realizar dicho efecto. El factor o factores que produce la activación de los astrocitos están aún por determinar. Desde un punto de vista fisiológico la activación alternativa M2 parece ejercer una función neuro-protectora (Cherry y col., 2014, y otros artículos, pon unos cuantos mas). En presencia de IL-4 la microglía produce factores tróficos, como IGF-1 (Butovsky y col., 2006; Zhao y col., 2006; Chhor y col., 2013); además, reduce la toxicidad del péptido Aβ tanto in vitro como in vivo (Iribarnen y col., 2005; Butovsky y col., 2005, 2006; Lyons y col., 2007a,b) y potencia su fagocitosis (Koenigsknecht-Talboo y Landreth, 2005; Mandrekar y col., 2009). En nuestro trabajo hemos observado un aumento tanto en la expresión de IGF-1 alrededor de las placas de Aβ, como en la fagocitosis del péptido Abeta por la microglía activa que rodea las placas. Dichos resultados son apoyados por Bolmon y col. (2008), que demuestran que la microglía activa participa activamente en la internalización del Aβ de las placas influyendo de esta manera en el mantenimiento del tamaño de las mismas. Apoyando esta idea se ha demostrado en distintos modelos transgénicos de EA que la ablación de distinto genes implicados en el reclutamiento de células microgliales (como los genes del receptor TLR2, o de CCR2) producen un incremento en los niveles de Aβ42, acelerando los daños en la memoria e incrementando la patología vascular amiloide (ElKhoury y col., 2007; Richard y col.,2008). Además existen diversos estudios que correlacionan ciertas variaciones Tesis Doctoral. Compendio de Publicaciones Discusión 134 genéticas en TREM2 (Triggering receptor expressed on myeloid cells 2, proteína reguladora de la fagocitosis en microglía y macrófagos), con un mayor riesgo de padecer la EA (Guerreiro y col., 2013; Jonsson y col., 2013). Nosotros proponemos que la activación alternativa de la microglía asociada a la placa podría actuar limitando la toxicidad del Aβ mediante varios mecanismos posibles: - generando una barrera física, ya que se ha demostrado que las áreas de placas no cubiertas por microglía son menos compactas y están asociadas con una distrofia axonal más severa (Condello y col., 2015). - y/o ayudando a mantener niveles bajos de Aβ extracelular debido a su capacidad fagocítica (Simard y col., 2006; Mandrekar y col., 2009),. Esta función neuro-protectora microglial podría estar mediada por el aumento en la expresión de IGF-1. Apoyando esta hipótesis, se ha demostrado que la vacunación con acetato de glatirámero, fármaco utilizado para el tratamiento de la esclerosis múltiple que potencia la respuesta Th2, produce un aumento en la expresión de IL-4 y reduce las placas de Aβ (Butovsky y col., 2006). 1.2. Efecto de las formas oligoméricas solubles del péptido β-amiloide sobre la microglía interplaca. Cuando estudiamos la respuesta microglial en el modelo PS1xAPP a los 18 meses de edad, además de la activación M2 alrededor de la placa, se produce una activación de la microglía interplaca con un fenotipo Th1 caracterizado por un aumento en la expresión de TNF-α (y posiblemente de otros factores inflamatorios relacionados con TNF-α). Por tanto, a edades avanzadas coexisten dos poblaciones de células microgliales activas, lo que posiblemente esté reflejando la existencia de distintos activadores microgliales; Por un lado, las placas, que de forma directa o indirecta a través de IL-4, podrían estimular la microglía hacia un fenotipo M2 no citotóxico. Y por otro lado, un agente, posiblemente difusible, responsable de la activación generalizada interplaca con carácter citotóxico tipo M1 (Cherry y col., 2014), y que podría corresponder a las formas solubles tóxicas de Aβ oligomérico como ha sido propuesto por diversos autores (Haass y Selkoe, 2007; Benilova y col., 2012; Viola y Klein, 2015). De hecho nuestros resultados a edades tempranas muestran niveles muy bajos de Aβ42 soluble y de formas oligoméricas que aumentan significativamente a los 18 meses de edad. Esta activación microglial interplaca podría estar reflejando una respuesta