Implicación del quorum sensing en las propiedades simbióticas de Rhizobium tropici CIAT 899

Departamento de Microbiología Facultad de Biología IMPLICACIÓN DEL QUORUM SENSING EN LAS PROPIEDADES SIMBIÓTICAS DE RHIZOBIUM TROPICI CIAT 899 Trabajo de Fin de Grado Alicia Aunión Domínguez Sevilla, Septiembre 2018 1 ÍNDICE 1. RESUMEN ..............................................................................................................................2 2. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................2 3. OBJETIVOS ...........................................................................................................................8 4. MATERIALES Y MÉTODOS ..............................................................................................8 4.1. Bacterias, medios y condiciones de cultivo .......................................................................8 4.2 Técnicas para el estudio de los sistemas de QS bacterianos .............................................10 4.3 Estudio de las propiedades simbióticas con P. vulgaris y Leucaena spp. .........................11 4.4 Obtención de los mutantes para los genes traIA y traIB mediante PCR solapante ...........13 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..........................................................................................16 5.1 Ensayos con las plantas ....................................................................................................16 5.2 Ensayos β-galactosidasa para la cuantificación de la producción de AHL por distintos mutantes derivados de CIAT 899 ...........................................................................................19 5.3 Construcción de mutantes por deleción de los genes traIA y traIB de CIAT 899 mediante PCR solapante ........................................................................................................................22 5.3.1 Estudio de la producción de AHL de cepas derivadas de CIAT 899 por deleción de los plásmidos a y b .............................................................................................................22 6. PERSPECTIVAS DE FUTURO .........................................................................................24 7. CONCLUSIONES ................................................................................................................24 8. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................26 8.1 Bibliografía de la portada y el índice no nombradas anteriormente ..................................30 2 1. RESUMEN Los rizobios son todas aquellas bacterias residentes en el suelo que son capaces de fijar nitrógeno atmosférico cuando establecen relaciones simbióticas con plantas leguminosas. Uno de los factores que puede intervenir en el establecimiento de estas relaciones es la percepción de quórum, que se refiere a la capacidad de comunicación que presentan estos organismos unicelulares y que les permite conocer el nivel de densidad celular que existe en la población, para así poder regular un gran número de procesos. Para ello, es necesario que sinteticen una serie de moléculas llamadas autoinductores, que las bacterias expulsarán al medio extracelular para llevar a cabo la comunicación. Este trabajo se centra en el estudio de la percepción de quórum de una estirpe concreta: Rhizobium tropici CIAT 899. Se pretende comprobar cuáles son los genes que intervienen en la síntesis de los autoinductores de esta especie, moléculas del tipo acil homoserina lactonas (AHL), así como conocer cuáles son los efectos de la alteración en la producción de estas moléculas en la simbiosis con judía (Phaseolus vulgaris) y leucena (Leucaena spp.) 2. INTRODUCCIÓN El término “Quorum sensing” (QS) apareció por primera vez en una revisión realizada por Fuqua, Winans y Greenberg, publicada el Journal of Bacteriology en 1994 (Barreto, 2011) y corresponde al término en inglés que hace referencia a la capacidad de las bacterias para conocer su densidad de población y, en función de su número, regular la expresión de determinados genes. Los procesos regulados por QS suelen implicar comportamientos multicelulares (como el crecimiento y el desarrollo de “biofilms”), interacciones entre bacterias o interacciones de bacterias con sus hospedadores eucarióticos. La señalización mediante QS requiere la síntesis, intercambio y precepción de compuestos bacterianos denominados autoinductores (AI) o moléculas señal de QS, que se sintetizan de forma constitutiva a una velocidad muy baja. Sin embargo, en el momento en el que la población aumenta, las concentraciones de AI alcanzan un valor umbral que permite al resto de bacterias detectar una concentración celular crítica y, en respuesta, interaccionar con los genes diana para poner en marcha la expresión de genes necesaria para llevar a cabo una función concreta. Al alcanzar ese valor umbral, un factor de transcripción (proteína R) interacciona con el AI e induce la transcripción de los genes regulados por la percepción de quórum, pero también los genes clave para la síntesis del 3 autoinductor (gen I), de forma que se crea un bucle de retroalimentación positiva que acelera la respuesta (Waters y Bassler, 2005). Esquematizado en la Figura 1a se muestra el caso de Vibrio fischeri. Mientras que la mayoría de las bacterias Gram positivas usan AI de tipo peptídico, las bacterias Gram negativas usan N-acil homoserina lactonas (AHL) como AI (Figura 1b), moléculas formadas por un anillo lactona hidrofílico y una cadena carbonada de diferente longitud (C4 a C18) que le da a la molécula una gran hidrofobicidad. El carbono 3 puede no estar sustituido, sustituido con un grupo carbonilo o hidroxilado, e incluso a veces se encuentran dobles enlaces en la cadena lipídica. En los últimos años se han descrito otras moléculas usadas como AI en muchas bacterias (Brameyer et al., 2015), y algunos ejemplos se muestran en la Figura 1b: el autoinductor-2 de V. harveyi (AI-2), quinolonas (PQS), el ácido metil dodecanoico, el éster metílico del ácido hidroxilpalmítico (PAME) y el péptido autoinductor 1 (AIP-1) de Staphylococcus aureus. FIGURA 1. a) Detección de quórum en V. fischeri. LuxI produce 3-oxo-C6-HSL (AHL, esferas amarillas), que interactúa específicamente con el regulador transcripcional LuxR, lo que conduce a la expresión del operón luxICDABE y la bioluminiscencia. b) Ejemplos de señales QS de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. (1) N-acil homoserina lactona (AHL). (2) N-(3- hidroxiacil) homoserina lactona (3-hidroxi-AHL). (3) N-(3-oxoacil)-l-homoserina lactona (3- oxo-AHL). (4) El autoinductor-2 (AI-2) de furanosil borato de V. harveyi (5) Las quinolonas de Pseudomonas (PQS), 2-heptil-3-hidroxi-4 (1H)-quinolona. (6) Ácido metil dodecanoico. (7) Éster metílico del ácido hidroxil-palmítico (PAME). (8) Péptido autoinductor 1 (AIP-1) de Staphylococcus aureus; las letras dentro de las bolas indican aminoácidos de este péptido cíclico, pequeña señal de QS (Whiteley et al., 2017). 4 Diferentes especies bacterianas pueden producir las mismas AHL o AHL con estructuras y propiedades similares, lo que sugiere que se produce una comunicación entre poblaciones. Se ha visto que la detección de quórum a través de AHL es más común entre las bacterias asociadas a las plantas que en la población general de bacterias del suelo. Además, en el suelo, los microorganismos forman comunidades en las que los productores de AHL interactúan con bacterias capaces de degradar estas moléculas y, por lo tanto, interfieren con la detección del quórum. Las enzimas que degradan AHL se denominan lactonasas o acilasas en función de su modo de acción, y se han encontrado en diferentes especies de bacterias del suelo, como en el fitopatógeno Agrobacterium tumefaciens. En esta bacteria la transferencia por conjugación de su plásmido Ti, que porta la mayoría de los determinantes de patogenicidad, está regulada por el sistema de QS constituido por los genes traI (sintetasa de la 3-oxo-octanoilhomoserina lactona (3- oxo-C8-HSL)) y traR. Además, presenta un gen traM (que se une al regulador TraR bloqueando su unión a 3-oxo-C8-HSL) y dos genes que sintetizan lactonasas que degradan la 3-oxo-C8-HSL. Todo ello indica que la transferencia del plásmido Ti está regulada por diversos factores entre los que son importantes la densidad celular y otros compuestos de la planta como las opinas (Dessaux y Faure, 2018). En las bacterias Gram negativas asociadas a las plantas, el QS mediado por AHL es empleado tanto por bacterias simbióticas como por patógenas o de control biológico para regular fenotipos como la virulencia, la competencia en la rizosfera, la conjugación, la secreción de enzimas hidrolíticos y la producción de metabolitos secundarios (González y Venturi, 2013). No obstante, además de intervenir en la comunicación entre las comunidades bacterianas, las AHL influyen sobre los hospedadores eucarióticos induciéndoles diferentes cambios fisiológicos y actuando como señales entre reinos. Se ha descrito que, en las plantas, la respuesta a las AHL depende de la longitud de la cadena del ácido graso (Mathesius et al., 2003; Zarkani et al., 2013). A las bacterias que en ausencia de nitrógeno combinado pueden fijar nitrógeno atmosférico (N2) en simbiosis con plantas leguminosas se les denomina rizobios. Se trata de bacterias Gram negativas pertenecientes al phylum Proteobacteria. En comparación con otros géneros, los rizobios producen una gran variedad de moléculas de AHL. Las AHL sintasas pueden catalizar la producción de AHL a partir de dos sustratos: S-adenosil- L-metionina (SAM), que proporciona el anillo de homoserina lactona, y una proteína transportadora de grupos acilos (acil-ACP) procedentes de la biosíntesis de ácidos grasos, 5 que es el precursor de la cadena lateral de acilo graso. De esta forma, existen una gran diversidad de AHL en función de la cadena lateral (Calatrava-Morales et al., 2018). En la asociación con la leguminosa, la bacteria induce en la planta el desarrollo de un nuevo órgano denominado nódulo, en cuyo interior se produce la fijación biológica del N2. La interacción comienza con un diálogo molecular entre la planta y el rizobio que conlleva la expresión coordinada de un gran número de genes. La formación del nódulo implica un reconocimiento específico entre la bacteria y la planta, la invasión de las células de la planta por la bacteria y otros cambios en la estructura y bioquímica de ambos organismos (Masson-Boivin et al., 2009; Oldroyd et al., 2011). Las raíces de las leguminosas liberan flavonoides, compuestos aromáticos que atraen específicamente a los rizobios que, como respuesta, sintetizan y secretan los factores de nodulación, lipoquitooligosacáridos, LCO o factores Nod (NF), que inician la cascada de cambios transcripcionales sobre las raíces de las plantas compatibles (Wasson et al., 2006; Oldroyd, 2013; Liu y Murray, 2016). Estos cambios permiten a los rizobios entrar en las células radicales donde se diferencian a bacteroides, células especializadas en la fijación de N2 que son mantenidas por los fotosintatos de la planta. El proceso se resume en la Figura 2. Los NF están constituidos por 4 a 5 unidades de N-acetil-glucosamina, con un ácido graso de distinta longitud sustituyendo a la molécula del extremo no reductor y varias otras sustituciones, específicas de especie, tanto en el extremo reductor como en el no reductor (Dénarié et al., 1996). Mientras los genes comunes nodABC son los responsables de la síntesis del esqueleto de los factores Nod, son los denominados genes nod específicos los que modifican el esqueleto cambiando la longitud o saturación del ácido graso, o añadiendo grupos acetilos, metilo, carbamoilos, sulfato o glicosilos. Las variaciones estructurales de los NF son uno de los determinantes de la especificidad de hospedador (Perret et al., 2000; D’Haeze y Holsters, 2004), aunque también son importantes en la determinación de la especificidad los polisacáridos superficiales, exopolisacáridos, lipopolisacáridos y los polisacáridos capsulares (Fauvart y Michiels, 2008; Gibson et al., 2008). 6 FIGURA 2. Etapas de desarrollo de los nódulos de guisante (indeterminado, izquierdo) y de soja (determinado, derecho). Los pelos de la raíz emergentes exudan flavonoides, que atraen rizobios compatibles y los estimulan a producir factores de nodulación (NF). El pelo radicular se deforma y forma un bolsillo, en el cual los rizobios quedan atrapados. El tubo de infección se inicia en el bolsillo permitiendo que los rizobios entren en la planta. Los tubos de infección avanzan hacia el primordio nodular y liberan los rizobios que posteriormente se diferencian en bacteroides que fijan nitrógeno (Ferguson et al., 2010). Un punto clave en la interacción rizobio-leguminosa es la inducción de la expresión de los genes nod mediada por las proteínas NodD, reguladores transcripcionales que, una vez activados por los flavonoides, se unen a las denominadas cajas nod, motivos conservados corriente arriba de los operones nod (Long, 1996). Las proteínas NodD de diferentes rizobios reconocen diferentes flavonoides, lo que supone otro nivel de especificidad (Peck et al., 2006). Numerosos trabajos han demostrado que, además de las señales simbióticas ya mencionadas, la regulación mediante QS es un elemento más en el proceso de intercambio 7 de señales, jugando un papel importante en la preparación y coordinación de los rizobios durante el establecimiento de la simbiosis (González y Marketon, 2003). Este trabajo se centrará en estudiar el QS de R. tropici CIAT 899, un rizobio singular por presentar un amplio rango de nodulación que incluye a Leucaena leucocephala, Lotus japonicus y Macroptilium atropurpureum, además de Phaseolus vulgaris; por ser una bacteria altamente tolerante a factores ambientales, como altas temperaturas, acidez o salinidad, y por producir una gran variedad de factores Nod. Cabe destacar que CIAT 899 produce factores Nod incluso en ausencia de flavonoides en condiciones de estrés abiótico como la acidez o la alta concentración de sal (Guasch- Vidal et al., 2013). Se sabe que, cuando CIAT 899 es cultivado en presencia de sal o apigenina (un flavonoide inductor de genes nod de CIAT 899), existen similitudes en los patrones de activación de genes simbióticos importantes (Pérez-Montaño et al., 2016). Gracias a la secuenciación del genoma de esta estirpe y de trabajos anteriores, se sabe que CIAT 899 cuenta con cinco genes nodD diferentes: nodD1 a nodD5. De los cinco, nodD1 parece ser el más importante simbióticamente y se encuentra cercano al operón nodABC. Es el responsable de la activación de los genes de nodulación en presencia de flavonoides purificados y de exudados de raíces o semillas de P. vulgaris, L. leucocephala y M. atropupureum. De forma contrapuesta, nodD2 está implicado en la activación de los genes de nodulación en condiciones de estrés salino de una manera independiente del flavonoide (Del Cerro et al., 2017; Ormeño-Orrillo et al., 2012). Así, las mutaciones en cada uno de los genes nodD han puesto de manifiesto que nodD1 es necesario para nodular L. leucocephala, L. japonicus y M. atropurpureum; pero el mutante en nodD1 sigue nodulando P. vulgaris y L. burtii. Por otro lado, el mutante en nodD2 produce menos nódulos en P. vulgaris, lo que sugiere que puede tener un papel en la simbiosis. En cuanto al resto de los genes nodD, nodD3 y nodD5 fueron identificados como activadores de nodD1, mientras que nodD4 podría actuar como activador o represor en función del ambiente (Del Cerro et al., 2015b, 2015a). También es importante destacar que todos los sistemas de secreción T4SS de tipo F (conjugativos) identificados en los genomas de CIAT 899 incluyen los genes traI, traR y traM, lo que indica que están regulados por mecanismos de QS mediante AHL. Así, se han encontrado dos copias del gen traI: traIA, que se encuentra en el plásmido a, y traIB, localizado en el plásmido b (el simbiótico). Un hecho llamativo es la localización de una secuencia de inserción (IS256) inserta corriente arriba de traR del plásmido simbiótico 8 de la bacteria, lo que puede haber alterado su promotor conduciendo a la represión constitutiva del sistema de conjugación de dicho plásmido (Ormeño-Orrillo et al., 2012; Del Cerro et al., 2017). En este trabajo se pretende conocer de qué manera afectan las condiciones del medio de cultivo a la síntesis de AHL en CIAT 899 y varios tipos de mutantes, concretamente aquellos que tienen afectado alguno de los cinco genes nodD y uno que cuenta con un gen de lactonasa introducido. Por otro lado, con un test en judía y otro en leucena se podrá comparar hasta qué punto la ausencia de AHL provocada por la actividad lactonasa puede interferir en el proceso de nodulación, por lo que se comparará el grado de nodulación de CIAT 899 con el del mutante con el gen de la lactonasa. 3. OBJETIVOS 1. Conocer el papel del QS mediado por AHL en la simbiosis de CIAT 899 con judía y leucena. 2. Conocer los tipos de AHL sintetizadas por CIAT 899. 3. Comprobar si la producción de AHL está regulada por alguno de los genes nodD descritos en CIAT 899. 4. Diseño de estrategias para la mutación de los genes de síntesis de AHL descritos en el genoma de CIAT 899. 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Bacterias, medios y condiciones de cultivo Para llevar a cabo el ensayo se utilizaron las bacterias y los plásmidos reflejados en la Tabla 1. Los rizobios se cultivaron a una temperatura de 28ºC en los medios de cultivo TY o YM (Tabla 2). Este último fue suplementado, cuando fue necesario, con el flavonoide apigenina, inductor de los genes de nodulación de CIAT 899 (1 μg/mL), o con 300 mM de NaCl. En ocasiones fue necesario utilizar antibióticos, reflejados en las características de las estirpes utilizadas (Tabla 1). Las estirpes de E. coli fueron cultivadas a 37ºC en medio LB (Tabla 2). El pH de todos los medios de cultivo se ajustó a 6,8-7,0 y se esterilizaron en el autoclave durante 20 minutos a una atmósfera de presión (121ºC). 15 3. Unión de los cebadores al ADN de cadena simple a la temperatura recomendada por el fabricante (Tib Molbiol) durante 30 segundos. 4. Polimerización del ADN a 72 ºC variando el tiempo de polimerización en función del tamaño del ADN a amplificar (1 minuto/kb). 5. Repetición del ciclo de polimerización (desde el paso 2), 35 veces más. 6. Polimerización del ADN a 72 ºC durante 2-5 minutos. El volumen de la mezcla de reacción varió dependiendo del experimento. Como norma general, 25 μL de mezcla reacción contenían los cebadores usados a una concentración de 0,2 μM, dNTPs a 0,2 mM, tampón de PCR 1X y 0,1 U de Taq polimerasa. Electroforesis del ADN. Se llevó a cabo en geles de agarosa, preteñidos con bromuro de etidio, desde el 0,6% hasta el 1,5% (m/v) en tampón TAE 0,5X dependiendo del peso molecular de los fragmentos que se quisieron identificar (Maniatis et al., 1982). Las muestras de ADN mezcladas con el tampón de carga se añadieron a los pocillos del gel. Como patrones de referencia se usaron diferentes marcadores de peso molecular. La electroforesis se llevó a cabo utilizando el aparato Mupid-21 (Cosmo Bio) a 50 ó 100 V. Las bandas se visualizaron en un transiluminador de luz UV a 260 nm. A continuación se capturaron las imágenes utilizando el aparato de captación de imágenes Gel Doc XR+ (Bio-Rad). Soluciones empleadas: Tampón TAE Tris-HCl 30mM, 0,002% (v/v) EDTA 0,5M pH 8, ácido acético glacial 0,00114% (v/v). Ajustar el pH a 8. Tampón de carga Azul de bromofenol 0,25% (m/v), xileno cianol FF 0,25% (m/v), glicerol 30% (v/v). Purificación del ADN. Se llevó a cabo a partir de la purificación directa de lo obtenido a partir de la PCR o recuperando el material genético del gel de agarosa. Para recuperar el ADN de un gel de agarosa, se cortó la porción de éste que contenía la banda deseada. En ambos casos el ADN se purificó mediante el kit Wizard SV gel and PCR clean-up system siguiendo las instrucciones del fabricante. Ligación del ADN. Para clonar un fragmento de ADN en un vector, las moléculas de ADN ya digeridas con las enzimas de restricción adecuadas y purificadas se mezclaron en las proporciones adecuadas y se les añadió 1/10 del volumen final del tampón de 16 ligación y 1 μL (1 U/μL) de la ligasa de T4 (New England Bioline). La mezcla se incubó durante 24 horas a temperatura ambiente. Los productos de la reacción se utilizaron para transformar células competentes de E. coli. Transformación bacteriana. El producto de la ligación fue añadido a bacterias competentes por tratamiento con cloruro de litio y, tras incubar el cultivo en hielo durante 20 minutos, fue sometido a un choque térmico a 42ºC durante 90 segundos. Luego permaneció de nuevo en hielo durante 5 minutos. Para que las bacterias se recuperaran se inocularon en LB líquido y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Para terminar, se sembraron en una placa de LB con Km (30 μg/mL) y con X-gal (30 μl de una solución de 40 μg/mL de dimetilformamida). Tras la incubación, se seleccionaron y purificaron las colonias de color blanco. Extracción del ADN plasmídico. La extracción de plásmidos se realizó utilizando el kit Wizard Plus SV Minipreps (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Conjugación bacteriana. Se mezclaron 800, 100 y 200 μL, respectivamente, de cultivos crecidos con los antibióticos adecuados de Rhizobium (receptor), E. coli (pRK2013), portadora del plámido auxiliar, y E. coli DH5α, portadora del plásmido a transferir. Se centrifugaron juntos y, posteriormente, las células sedimentadas se resuspendieron en 800 μL de H2O estéril y se volvieron a centrifugar para poder eliminar el antibiótico de cada medio. Tras esto, las células se depositaron en forma de gota en una placa de TY para formar un parche de conjugación, favoreciendo así el crecimiento de Rhizobium. El resultado de la conjugación fue sembrado en césped en una placa de TY para seleccionar a todos los rizobios que hubieran incorporado el plásmido. 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1 Ensayos con las plantas En la Figura 4 se muestran los resultados de los test de nodulación de judía y leucena, y en la Figura 5, el aspecto de las plantas al final de los ensayos. Como se puede apreciar, CIAT 899 (pME6863) desarrolló un significativamente menor número de nódulos en las plantas de judía que provocaron una disminución, también significativa, del peso seco de la parte aérea de la planta. Sin embargo, eso no ocurrió en el caso de la leucena, en la que no se apreciaron diferencias ni en el número de nódulos ni en el peso seco de la parte aérea frente a la estirpe silvestre. La presencia del gen que codifica la lactonasa reduce las posibilidades de la misma de nodular en la planta. Como 17 consecuencia, la planta no dispondrá de todo el nitrógeno que necesita para un crecimiento adecuado, como se puede apreciar en el caso de la judía. Por el contrario, en leucena no se observan dichos resultados, lo que podría ser debido a un tiempo de crecimiento insuficiente. FIGURA 4. Diferencias entre la producción de nódulos y el peso seco de la parte aérea de las plantas de leucena y judía al ser inoculadas con CIAT 899 o CIAT 899 (pME6863). Los asteriscos indican la existencia de diferencias significativas al nivel α = 5% con respecto a CIAT 899 utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. Plantas sin inocular: NI. a NI CIAT 899 (pME6368) CIAT 899 18 FIGURA 5. a) Imagen del test de nodulación en judía. De izquierda a derecha: 2 plantas inoculadas con CIAT 899, 2 plantas inoculadas con CIAT (pME6863) y 1 planta sin inocular b) Imagen del test de nodulación en leucena. De izquierda a derecha: planta sin inocular, planta inoculada con CIAT 899 (pME6368) y planta inoculada con CIAT 899. Las AHL rizobiales pueden considerarse señales simbióticamente importantes, aunque en algunos casos su contribución es sutil y puede reflejar diferencias relacionadas con el metabolismo de las AHL en lugar de mecanismos reguladores directos. En general, el papel de la regulación de QS en la simbiosis Rhizobium-leguminosa sigue siendo desconcertante pero, aunque está claro que el control de la expresión génica dependiente de la densidad de población afecta a comportamientos importantes en los rizobios, la regulación mediada por AHL no siempre es esencial para la simbiosis, como se puede observar en el caso de CIAT 899 con la planta de leucena. De hecho, numerosos estudios han comprobado que las mutaciones en genes similares de diferentes especies de rizobio tienen efectos distintos sobre la interacción con sus leguminosas hospedadoras, e incluso dentro de la misma especie se puede encontrar un rango diferente de sistemas QS (Calatrava-Morales et al., 2018). Así, en el caso de Mesorhizobium tianshanense CCBAU060A, mutantes defectivos en la producción de AHL también mostraron la reducción del número de nódulos en Glycyrriza uralensis (Cao et al., 2008). Igualmente, mutantes de R. etli CNPA para el gen cinI sólo estaban afectados en la actividad reductora de acetileno de sus nódulos, sin afectar significativamente al desarrollo de la planta de judía, aunque sus ensayos fueron de pocos días (21 días) (Daniels et al., 2002), y en el caso de S. fredii SMH12 tanto el mutante en traI como el silvestre portador del gen de la lactonasa presentaron una reducción de la nodulación de la soja, sólo significativa en el caso de la bacteria con la lactonasa. No obstante, la mutación en raiI de R. etli provocó un aumento en la nodulación (Rosemeyer et al., 1998). Esta diversidad sugiere que no puede haber un paradigma unificador de lo que está controlado por QS en estas bacterias, b NI CIAT 899 (pME6368) CIAT 899 19 aunque todas presentan la característica común de que todas las AHL sintasas y reguladores de respuesta identificados en rizobios pertenecen a las familias de proteínas LuxI y LuxR respectivamente (Calatrava-Morales et al., 2018). 5.2 Ensayos β-galactosidasa para la cuantificación de la producción de AHL por distintos mutantes derivados de CIAT 899 En la Figura 6 se muestran los resultados de la producción de AHL por la estirpe CIAT 899 silvestre y sus respectivos mutantes (CIAT 899 (pME6863), nodD1, nodD2, nodD3, nodD4, nodD5, nodD12 y nodD123) en diferentes medios de cultivo. Como se puede observar, CIAT 899 (pME6863), como cabía esperar, no produjo o a muy bajo nivel AHL en ninguna de las condiciones; el mutante en nodD1 presentó una disminución en la producción frente a la estirpe silvestre en todas las condiciones, siendo más acusada en presencia de apigenina. Esta menor producción de AHL también se observó en el doble mutante nodD1D2 (y el triple mutante nodD1D2D3), aunque la disminución por la presencia de la apigenina también se observó en la estirpe silvestre. También se observaron diferencias en el mutante nodD5 cuando crecía en YM3, y en el triple mutante nodD123 cuando crecía con sal. En cuanto a los medios de cultivo en sí, se puede apreciar que una mayor concentración de manitol (YM10) no influyó en la producción de AHL. Por el contrario, se apreció un aumento en dicha síntesis cuando las bacterias crecieron con altas concentraciones de sal, y una ligera disminución con apigenina. Este último resultado indicaría que la presencia de la planta (apigenina) parece inhibir de alguna manera la producción de AHL, por lo que la producción óptima de AHL es dependiente de NodD1, pero se vería disminuída cuando NodD1 “se une” al flavonoide inductor. A la vista de los resultados, se seleccionaron a los mutantes nodD1 y nodD2 para continuar su estudio en mayor profundidad. Los resultados obtenidos tras cinco ensayos β-galactosidasa, independientes cada uno con sus tres réplicas, se muestran en la Figura 7. Se observa una disminución significativa en la producción del mutante nodD1 en todos los medios, a excepción de las bacterias crecidas en un medio con apigenina, pero esa menor producción no fue significativa en el mutante nodD2. Es por ello que se realizaron comparaciones de la producción de AHL llevada a cabo por la estirpe silvestre en los diferentes medios (Figura 8), de forma que se puede apreciar que, a pesar de que la producción de AHL aumenta notablemente con sal, es con apigenina cuando la disminución es relevante. La menor producción de AHL debida al flavonoide no guarda 20 relación con la menor eficiencia simbiótica de CIAT 899 (pME6863), salvo que la producción de AHL se vea rectificada por otros componentes de los exudados de la planta diferentes a la apigenina. FIGURA 6. Diferencias en la producción de AHL expresadas en unidades Miller (U) en los distintos medios de cultivo de CIAT 899 y los mutantes CIAT 899 (pME6863), nodD1, nodD2, nodD3, nodD4, nodD5, nodD12 y nodD123. Las bacterias se cultivaron en los medios YM3 (medios YM con 3g de manitol), YM10 (medio YM con 10g de manitol), YS (medio YM3 con 300 mM NaCl) e YA (medio YM3 con apigenina). FIGURA 7. Diferencias en la producción de AHL en los distintos medios de cultivo de CIAT 899 y los mutantes CIAT 899 nodD1 y nodD2. Los valores de producción han sido relativizados, de forma que la producción de CIAT 899 adquiere un valor numérico 1 en YM3 e YM10. Los medios YS e YA no adquieren ese valor debido a que son YM3 modificados, luego se comparan con los valores de CIAT 899 en el medio YM3. Los asteriscos indican la existencia de diferencias significativas al nivel α = 5% con respecto a CIAT 899 utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. 21 FIGURA 8. Diferencias observadas en la producción de AHL por CIAT 899 en los diferentes medios de cultivo. Los valores de producción han sido relativizados, de forma que la producción de CIAT 899 adquiere un valor numérico 1 en YM3 e YM10. Los medios YS e YA no adquieren ese valor debido a que son YM3 modificados, luego se comparan con los valores de CIAT 899 en el medio YM3. Los asteriscos indican la existencia de diferencias significativas al nivel α = 5% con respecto a la producción en YM3 utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. Estos resultados se contraponen con otros estudios llevados a cabo en otras bacterias, como es el caso de la estirpe de S. fredii SMH12. Se trata de un rizobio con un amplio rango de nodulación que incluye la soja. En presencia del flavonoide inductor de los genes nod, genisteína, se mejora la producción global de AHL, detectándose moléculas como C14-HSL sólo en cultivos bacterianos complementados con genisteína. Además, SMH12 posee al menos un gen traI, que es responsable de la síntesis de 3-oxo-C8-HSL, y al menos dos genes de tipo luxI no identificados implicados en la síntesis de C8-HSL y C14-HSL (Pérez-Montaño et al., 2011). Cabe destacar que en esta bacteria se observaron cambios en la expresión de traI en presencia del flavonoide genisteína, que no se observaron ni en el caso del mutante nodD1 ni en la cepa de lactonasa, sugiriendo que la inducción de la transcripción tiene lugar a través de NodD1 y que los sistemas QS son necesarios para la mejora de la expresión génica, probablemente debido a la retroalimentación positiva típica de los sistemas QS a alta densidad celular. Por todo ello, los autores sugieren que los flavonoides inductores de genes nod mejoran la transcripción de ciertos genes de síntesis de AHL de SMH12 (Pérez- Montaño et al., 2014). 22 5.3 Construcción de mutantes por deleción de los genes traIA y traIB de CIAT 899 mediante PCR solapante Hasta la fecha se han conseguido amplificar y purificar los fragmentos 1-2 y 3-4 circundantes a los genes traIA y traIB, así como la amplificación conjunta de los dos fragmentos en uno sólo (1-4), la digestión de dichos fragmentos 1-4 y su clonación en el plásmido pK18mob:sacB (Figura 9). Sin embargo y, a pesar de numerosos intentos, no se ha conseguido la transferencia de dicho plásmido para la posterior deleción de los genes traIA y traIB de CIAT 899. FIGURA 9. Mutantes confirmados para los genes traIA (a) y traIB (b). Presentan una banda de menor tamaño que la estirpe silvestre (CIAT 899). 5.3.1 Estudio de la producción de AHL de cepas derivadas de CIAT 899 por deleción de los plásmidos a y b Como se citó con anterioridad, el gen traIB se localiza en el plásmido simbiótico mientras que traIA se localiza en el plásmido a. Es por ello que se ha llevado a cabo el estudio desde otra perspectiva, de forma que se han utilizado bacterias curadas de uno o de los dos plásmidos con el fin de comprobar si esas cepas siguen produciendo AHL. Concretamente, se utilizó la bacteria RSP900, curada para el plásmido simbiótico, y SVQ587, curada tanto para el plásmido simbiótico como para el plásmido a. En primer lugar, se llevaron a cabo amplificaciones de los genes traIA y traIB en ambas estirpes, utilizando como control CIAT 899. Como se muestra en la Figura 10, RSP900 sólo amplificó traIA dado que carece del plásmido simbiótico, mientras que SVQ587 no amplificó ninguno de los genes traI. Por tanto, RSP900 debe comportarse como un mutante simple de traIB, lo que también permitiría deducir el tipo de molécula AHL que se sintetiza a partir de traIA, y la segunda como un doble mutante traIA/traIB. a b CIAT 899 Candidatos traIA CIAT 899 Candidatos traIB 1,52 Kb 0,88 Kb 1,41 Kb 0,85 Kb 23 FIGURA 10. Electroforesis en gel de agarosa de las bacterias curadas. A la izquierda del marcador de 1 Kb se muestra la PCR para traIA, y a la derecha del marcador de 1 Kb se muestra la PCR para traIB, en comparación con el ADN genómico de CIAT 899. La ausencia de bandas en la zona derecha confirma que ninguna de las dos bacterias presenta el plásmido simbiótico, pues traIB se encuentra en dicho plásmido. Además, SVQ587 tampoco presenta el plásmido a, pero sí se encuentra en RSP900, debido a que es en ésta última en donde se observan bandas de amplificación para el gen traIA, que se encuentra en ese plásmido. Una vez comprobadas ambas bacterias curadas se procedió a la extracción con diclorometano de las AHL a partir de sobrenadantes de cultivos en YM3 de CIAT 899, RSP900 y de SVQ587, su análisis mediante TLC y su revelado con el biosensor NT1 (pZLR4). Como se muestra en la Figura 11, mientras CIAT 899 parece producir al menos una molécula de tipo AHL, que por su movilidad podría corresponder a la oxo-C8-HSL (molécula que se ha demostrado en varias especies que es la sintetizada por traI), RSP900 parece producir la misma AHL pero en menor cantidad, seguramente debido a la ausencia de traIB. SVQ587 no parece producir ninguna molécula, lo que estaría justificado por la ausencia de los genes traIA y traIB. La producción de AHL llevada a cabo por estas bacterias también se comprobó mediante ensayos β-galactosidasa, lo que permitió confirmar los resultados (Figura 12). FIGURA 11. TLC en la que se muestra la producción de las moléculas de AHL. De izquierda a derecha: CIAT 899, RSP900, SVQ587, CIAT (pME6863) y control con C8-HSL (abajo) y C6- HSL (arriba). CIAT 899 CIAT 899 RSP900 SVQ587 RSP900 SVQ587 24 FIGURA 12. Diferencias en la producción de AHL en los distintos medios de cultivo de CIAT 899 y los mutantes RSP900 y SVQ587. Los valores de producción han sido relativizados, de forma que la producción de CIAT 899 adquiere un valor numérico 1 en YM3. El medioYA no adquiere ese valor debido a que se trata de YM3 modificado, luego se compara con los valores de CIAT 899 en el medio YM3. Los asteriscos indican la existencia de diferencias significativas al nivel α = 5% con respecto a CIAT 899 utilizando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney. 6. PERSPECTIVAS DE FUTURO Tras la realización de este trabajo se ha abierto una nueva línea de investigación con respecto a las relaciones simbióticas que presenta R. tropici CIAT 899 con sus leguminosas hospedadoras, incluyendo a los genes implicados en dicho proceso, entre ellos los genes nodD. 7. CONCLUSIONES Los resultados obtenidos en este trabajo nos permiten obtener las siguientes conclusiones: 1. CIAT 899 portadora del gen de la lactonasa carece de AHL y está afectada en su simbiosis con la judía, provocando un menor número de nódulos y plantas con menor peso seco que la estirpe silvestre. Sin embargo, estas diferencias no se pudieron observar en el caso de las plantas de leucena, al menos tras dos meses de crecimiento. Cada planta lleva a cabo la simbiosis de forma diferente, de hecho la judía forma nódulos determinados y la leucena indeterminados, lo que quiere decir que los efectos de las AHL producidas por CIAT 899 sobre la planta pueden variar. 2. La producción de AHL por CIAT 899 parece ser dependiente del gen nodD1, de modo que mutantes en este gen producen significativamente menos cantidad de AHL que la estirpe silvestre en todas las condiciones. 3. El flavonoide apigenina, inductor de los genes de nodulación de CIAT 899, inhibe la producción de AHL de CIAT 899 y este efecto podría ser debido a su interacción con NodD1. De hecho, que en presencia de flavonoides dicha