Síntesis y caracterización de nuevas formulaciones basadas en la incorporación de sorafenib en nanoestructuras funcionalizadas con manosa y galactosa para el tratamiento de células tumorales hepáticas

SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE NUEVAS FORMULACIONES BASADAS EN LA INCORPORACIÓN DE SORAFENIB EN NANOESTRUCTURAS FUNCIONALIZADAS CON MANOSA Y GALACTOSA PARA EL TRATAMIENTO DE CÉLULAS TUMORALES HEPÁTICAS María Negrete González Tesis Doctoral Sevilla DIRECTORES: Jordi Muntané Relat y Noureddine Khiar TUTOR: Francisco Javier Padillo Ruiz 2 3 Cirugía oncológica. Terapia celular y trasplante de órganos Síntesis y caracterización de nuevas formulaciones basadas en la incorporación de sorafenib en nanoestructuras funcionalizadas con manosa y galactosa para el tratamiento de células tumorales hepáticas TESIS DOCTORAL María Negrete González Sevilla, 2021 4 5 Cirugía oncológica. Terapia celular y trasplante de órganos Síntesis y caracterización de nuevas formulaciones basadas en la incorporación de sorafenib en nanoestructuras funcionalizadas con manosa y galactosa para el tratamiento de células tumorales hepáticas Memoria presentada por la Graduada María Negrete González para optar al título de Doctora por la Universidad de Sevilla 6 7 El presente trabajo ha sido realizado por la Graduada en Química María Negrete González, con DNI 77809716-A, en el grupo de Mecanismos moleculares del hepatocarcinoma y sus estrategias terapéuticas (CTS-1098) en el Instituto de Biomedicina de Sevilla, bajo la dirección del Dr. Jordi Muntané Relat y el Dr. Noureddine Khiar. Los directores del trabajo: Fdo. Jordi Muntané Relat Fdo. Noureddine Khiar 8 9 16 17 A mis padres 18 19 RESUMEN El carcinoma hepatocelular (HCC) representa el 80% de las neoplasias hepáticas primarias que aparecen principalmente en el contexto de la cirrosis hepática crónica. Es la sexta neoplasia más frecuente, la tercera causa de muerte por cáncer y el 7% de las neoplasias registradas. Algunos de los factores de riesgos mas importantes para el desarrollo del HCC son: diversos aspectos demográficos, alteraciones inmunológicas, VHB o la infección crónica por VHC. El tratamiento para esta enfermedad depende del estadio en el que se encuentre el paciente. Sorafenib (Nexavar®, Bayer) es la terapia molecular de primera línea para pacientes que se encuentran en estadio avanzado de HCC. Diversos estudios han concluido que los pacientes que tomaron Sorafenib sobrevivieron un promedio de 10,7 meses, en comparación con los 7,9 meses que sobrevivieron quienes tomaron placebo. Se ha demostrado que Sorafenib induce la muerte celular y reduce la proliferación celular en el rango µmolar en las células de cáncer de hígado. Sin embargo, su administración está asociada a varias complicaciones que son consecuencia de su falta de especificidad celular y las elevadas dosis requeridas debida a su hidrofobicidad intrínseca con el objetivo de mantener la efectividad del tratamiento. Los efectos secundarios más frecuentes de Nexavar son diarrea, erupciones cutáneas, alopecia, infección, «reacción de 20 mano-pie» y fatiga. Aunque menos frecuentes, existen otros riesgos como puede ser ataque cardiaco o perforación gastrointestinal (un agujero que se desarrolla en la parte interna del intestino). La búsqueda de enfoques no invasivos que permitan el uso de sorafenib para tratar el HCC, con efectos tóxicos mínimos o nulos, es un área de interés permanente en la oncología moderna. El advenimiento de la nanomedicina, cuyo objetivo último es transportar una cantidad suficiente de sustancias activas a través de las barreras fisiológicas y alcanzar, de forma selectiva, los tejidos afectados por la enfermedad, ha tenido un impacto significativo en este campo. A lo largo de este estudio se ha desarrollado dos estrategias de direccionamiento activo del sorafenib de gliconanomicelas independientes con sorafenib basadas en su funcionalización hacía los receptores de manosa (pMicMan) o asialoglicoproteína (pMicGal), utilizando gliconanomicelas útiles para inducir la apoptosis y reducir la proliferación celular en células de HCC (HepG2 y Huh7). El estudio mostró que sorafenib, en un rango nanomolar, (10-20 nM) incluido en el vector pMicMan dirigido al receptor de manosa, pero no el fármaco libre ni su encapsulación en pMicGal dirigido al receptor de la asialoglicoproteína, inducía apoptosis y reducía la proliferación celular en células HepG2 y Huh7. Este efecto se relacionó con una mayor incorporación vía endosomal de pMicMan que pMicGal a las células. El procesamiento vía lisosomal reduce la actividad del fármaco en células tumorales hepáticas. Se observó que las dichos nanovectores funcionalizados cargados con Sorafenib, realizaban una liberación controlada en el tiempo, siendo estas del 35% y del 39% de su contenido a las 24 horas en pMicMan y pMicGal respectivamente. 21 Por lo tanto, se concluye que, aunque ambos nanovectores funcionalizados, pMicMan y pMicGal, son útiles para la encapsulación de sorafenib, su presentación en pMicMan promovió una mayor incorporación vía endosomal que la observada con pMicGal lo que permitió bajar la dosis de tratamiento hasta 1.000 veces en células tumorales hepáticas (10 nM). La confirmación de este hallazgo in vivo permitiría reducir los efectos secundarios asociados a su uso. 22 23 ÍNDICE 24 ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................. 27 ABREVIATURAS ..................................................................................................................... 31 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 38 Estadiaje de los pacientes y tratamientos recomendados .................................................. 44 Alteraciones moleculares en el HCC y vías de señalización .............................................. 48 Nanomedicina ........................................................................................................................ 49 OBJETIVOS .............................................................................................................................. 54 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. 58 Expresión del MR y ASGPR ................................................................................................ 62 Síntesis, purificación y caracterización de los nanovectores ............................................. 63 Síntesis de las nanomicelas pMicMan y pMicGal .............................................................. 76 Medida del tamaño de los nanovectores .............................................................................. 76 Determinación de CMC ........................................................................................................ 76 Análisis TEM ......................................................................................................................... 77 Encapsulación de fármacos en los nanovectores ................................................................ 77 Cuantificación de sorafenib mediante HPLC ..................................................................... 78 Evaluación de la liberación espontánea de sorafenib a lo largo del tiempo de pMicMan y pMicGal .................................................................................................................................. 79 Valoración de la incorporación celular de los nanovectores mediada por endosomas ... 79 Medida del tráfico intracelular de pMicMan y pMicGal .................................................. 80 Impacto de la inhibición de la formación de autofagolisosomas en la actividad proapoptótica y antiproliferativa de sorafenib incorporado a pMicMan y pMicGal ..... 81 Ensayo de proliferación celular ........................................................................................... 81 Cuantificación de la muerte celular ..................................................................................... 82 Análisis estadístico ................................................................................................................ 82 RESULTADOS .......................................................................................................................... 84 Síntesis y caracterización de monómeros autoasociativos ................................................. 85 Síntesis y caracterización de micelas recubiertas de manosa y galactosa para la generación de los nanovectores pMicMan y pMicGal ....................................................... 86 Carga de sorafenib y eficacia de encapsulación de las nanomicelas pMicMan y pMicGal ................................................................................................................................................. 90 Expresión del MR y ASGPR en células HepG2 y Huh7 .................................................... 92 Liberación de sorafenib en pMicMan y pMicGal con baja y alta saturación de fármaco ................................................................................................................................................. 93 Impacto de pMicMan y pMicGal cargado con sorafenib en la actividad de la caspasa-3 y la proliferación celular .......................................................................................................... 96 25 Tráfico de pMicMan y pMicGal en células HepG2 ............................................................ 97 Impacto del procesamiento lisosomal de pMicMan y pMicGal cargados con sorafenib en sus propiedades proapoptóticas y antiproliferativas ....................................................... 101 DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 104 CONCLUSIONES ................................................................................................................... 114 BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 117 PRODUCCIÓN CIENTIFICA .............................................................................................. 128 APORTACIONES A CONGRESOS ..................................................................................... 132 ANEXOS (ARTÍCULOS) ....................................................................................................... 137 32 3-metiladenina, 3Me-A Ablación por radiofrecuencia, RFA Ácido desoxirribonucleico, ADN Ácido etilendiaminotetracético, EDTA Ácido poli(láctico-glicolico), PLGA Ácido pentacasadiinoico, PCDA Adenosín trifosfato, ATP Agua deuterada, D2O Albúmina bovina sérica, BSA Antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, HbsAg Antígeno e del virus de la hepatitis B, HbeAg Arginina-glicina-ácido aspártico, RGD Barcelona Clinic Liver Cancer, BCLC Bromodeoxiuridina, BrdU Carcinoma hepatocelular, HCC Carga del fármaco, DL Cirrosis biliar primaria, CBP Cóctel Inhibidor de Proteasas, CIP Colangiocarcinoma humano, HuCC Concentración micelar crítica, CMC Crecimiento de hepatocitos, HGF Cromatografía en capa fina, TLC Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem, LC- Dimetilsulfóxido, DMSO Dipalmitoilfosfatidilcolina, DPPC Dispersión dinámica de la luz, DLS Dominio 2 de homología del factor de crecimiento epidérmico, TIE2 Efecto de permeabilización y retención, EPR Eficiencia de encapsulación, EE Enfermedad hepática por depósito de grasa, EGNA Especies reactivas del oxígeno, ROS Esteatohepatitis no alcohólica, EHNA o NASH Factor de crecimiento derivado de plaquetas, PDGFR Factor de crecimiento endotelial vascular, VEGFR 33 Factor de crecimiento epidérmico, EGF Factor de crecimiento de fibroblastos 19, FGF19 Factor de crecimiento de hepatocitos, HGF Factor de crecimiento de insulina 2, IGF2 Fluorescencia del infrarrojo cercano, NIRF Fluoruro de fenilmetanosulfonilo, PMSF Food and Drug Administration, FDA Función hepática conservada, Child Pugh A Galactosa, Gal Guanosina trifosfato, GTP Índice de polidispersión, PDI Inhibidor de apoptosis ligado a X, XIAP Inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina 2A, CDK2A Inyección percutánea de etanol, PEI Leucemia de células mieloides, Mcl-1 Microscopía electrónica de transmisión, TEM N-acetilgalactosamina, GalNAc N,N-dimetilformamida, DMF N,N-diisopropiletilamina, DIPEA Nanoparticulas Solidas de Lípidos, SLN Performance Status, PS Polidiacetileno, PDA Polietilenglicol, PEG Polifluoruro de vinilideno, PVDF Protein kinase RNA-like ER kinase, PERK Quimioembolización, TACE Quitosano modificado, HMC Receptor de asialoglicoproteína receptor, ASGPR Receptor de manosa, MR Retículo endoplasmático, ER Resonancia magnética nuclear, RMN Supervivencia Global Media, OS Tampón fosfato salino (Phosphate-buffered saline), PBS Tetraetilenglicol, TEC 34 Tetrahidrofurano, THF Transcriptasa inversa de telomerasa, TERT Ultravioleta, UV Virus de la hepatitis A, VHA Virus de la hepatitis B, VHB Virus de la hepatitis C, VHC 35 36 37 38 INTRODUCCIÓN 39 Cáncer primario de hígado El carcinoma hepatocelular o hepatocarcinoma (HCC), es el cáncer primario de hígado más frecuente (90%) que representa la sexta neoplasia maligna más común en todo el mundo y la tercera causa de muerte relacionada con cáncer por detrás del cáncer de pulmón y de mama (1). Alrededor de 700.000 personas mueren cada año debido a HCC, y en países como Estados Unidos y Canadá sigue incrementándose su incidencia y mortalidad (2). El análisis epidemiológico de la enfermedad indica que no presenta una distribución geográfica homogénea, y esto se debe a la heterogénea distribución de los factores de riesgo que están implicados en la aparición del cáncer hepático como el virus de la hepatitis B (HBV) que es más frecuente en Asia y África, y C (HCV) más frecuente en Europa, Norte América y Japón, alcoholismo, obesidad y diabetes de tipo II (3). Existe una distribución geográfica de manera que la incidencia es elevada en países en vías de desarrollo como los del sudeste asiático y el África subsahariana; intermedia en Japón y países europeos del área mediterránea, e inferior en el norte de Europa y Estados Unidos (4). Figura 1. Mapa de la incidencia del cáncer de hígado en el mundo. 40 En la mayor parte de pacientes (90%) el HCC se desarrolla en un contexto de enfermedad hepática crónica con presencia de cirrosis hepática relacionado con diversas etiologías. La mortalidad del HCC es muy elevada, con una tasa de supervivencia a los 5 años del 5-6%. En nuestro entorno, el estadiaje, pronóstico de la enfermedad y propuestas terapéuticas, se rigen con el sistema Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC). La mayor parte de pacientes (70%) se diagnostican en la fase intermedia (BCLC B) y avanzada (BCLC C) de la enfermedad en donde solo son posibles tratamientos paliativos como quimioembolizacion y tratamiento sistémico (5). En las fases iniciales (BCLC 0 y A) son posibles tratamientos locorregionales y quirúrgicos con intención curativa mejorando así la tasa de supervivencia. (6) Figura 2. Esquema de la evolución desde un hígado sano hasta el desarrollo de un carcinoma hepatocelular Los factores de riesgo más importantes para el desarrollo de HCC son (7,8): 1. Diversos aspectos demográficos como la edad del paciente y género masculino, asociado a una mayor exposición a los distintos factores de riesgo (9), mayor índice de masa corporal, niveles elevados de andrógenos y disminuidos de estradiol. 41 2. Alteraciones inmunológicas (trastornos relacionados con las hepatitis autoinmunes). Su incidencia es baja y aparece más frecuentemente en el sexo femenino. 3. El 90% de los HCC aparecen en hígados cirróticos o con fibrosis avanzada con etiologías que promueven más rápidamente la generación de HCC como cuando es de origen viral en comparación con la cirrosis biliar primaria (CBP) (10). La incidencia de HCC sobre hígado no cirrótico es del 10-20% pero se ha observado que, aunque no presentan una cirrosis confirmada mediante biopsia, aparece cierto grado de fibrosis, esteatosis o displasia celular. 4. VHB: se ha estimado que 40 millones de personas son portadoras de este virus especialmente en Asia Oriental y África subsahariana (zona endémica de VHB), y con mayor riesgo relativo de desarrollar un HCC en los portadores crónicos de HbsAg positivo y aún mayor en los portadores HbeAg positivo de forma concomitante. Aunque también influyen factores como la carga del VHB en sangre y la edad del paciente. Por el contrario, el tratamiento del VHB con interferón o análogos de los nucleótidos reduce el riesgo de desarrollar HCC de forma significativa. Las campañas de vacunación en áreas de alta incidencia de HVB como Taiwán han permitido una disminución de la incidencia de HCC hasta el 60% (11,12). 5. La infección crónica por el VHC es la causa más frecuente en las zonas de baja e intermedia prevalencia como Estados Unidos, Europa y el área mediterránea. En los países orientales más del 70% de los pacientes con HCC presentan anticuerpos anti-HVC en suero. El riesgo relativo de desarrollar un HCC es mucho más alto en los pacientes positivos para VHC afectos de cirrosis o fibrosis 48 sobre los receptores relacionados con la angiogénesis, incluyendo VEGFR2 y el receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR1). Regorafenib también inhibe VEGFR1, VEGFR3, RAF, TIE2 (dominio 2 de homología del factor de crecimiento epidérmico), KIT, RET y BRAF. Por lo tanto, regorafenib se dirige a una amplia gama de factores angiogénicos, el microambiente tumoral y las quinasas oncogénicas (43). Otro tratamiento en segunda línea es cabozantinib (Cabometyx®, Ipsen) que ha demostrado ser un inhibidor de tirosina quinasas como VEGFR 1-3, MET y AXL (42). Este fármaco ha mostrado al compararse con resultados con placebo una mejor supervivencia y un mejor resultado en cuanto a tiempo libre de progresión del tumor. Figura 4. Estructura química del sorafenib, Tosilato de sorafenib, Regorafenib y Cabozatinib. Alteraciones moleculares en el HCC y vías de señalización Se han detectado varias alteraciones genéticas que afectan a diversas rutas de señalización celular y que son relevantes en el desarrollo del HCC. Entre ellas cabe citar las mutaciones en los genes CTNNB1 (β-catenina), dominio de interacción rico en AT 1A (ARID1A), ARID1B, AXIN, transcriptasa inversa de telomerasa (TERT), c-MYC, factor de crecimiento epidérmico (EGF), crecimiento de hepatocitos (HGF), así como mutaciones en RAS y TP53, amplificación del factor de crecimiento de fibroblastos 19 49 (FGF19), inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina 2A (CDK2A) y sobreexpresión del factor de crecimiento de insulina 2 (IGF2) debido a modificaciones epigenéticas (44). El HCC resulta de la acumulación media de 50 mutaciones somáticas lo que genera una importante multitud de clones relacionados pero molecularmente diferentes en el tumor lo que conlleva a la aparición de una elevada heterogeneidad molecular inter tumoral observada en el HCC (45,46). Existen varios subtipos moleculares de HCC, que presentan diferentes aberraciones moleculares relacionadas con un potencial replicativo ilimitado, reducción de la apoptosis celular, cambios en el metabolismo celular, estrés celular, inestabilidad cromosómica y deficiencia en la reparación del ADN celular que reduce las posibilidades terapéuticas por la aparición de numerosas resistencias a los tratamientos (22). Varios componentes de las vías de señalización, como Ras/Raf/Mek/Erk, PI3K/Akt/mTOR, VEGF/VEGFR, EGF/EGFR, etc. son objetivos prometedores en el HCC (44,47). HCC expresa un alto nivel de VEGFA, un regulador crucial de la vascularización del tumor. Varias isoformas de VEGFA (en particular VEGFA-165) se han relacionado con la invasividad vascular, el estado de la enfermedad y el desarrollo de HCC (48–50). Uno de los factores más importantes en la hepatocarcinogénesis es la modulación de las vías de señalización oncogénicas y del desarrollo implicadas en la patogénesis del HCC, como las vías de transducción de señales clave Wnt/β-catenina, EGFR-Ras-MAPKK, c- Met, señalización de IGF, señalización Akt/mTOR y cascadas de señalización VEGF y PDGFR (51) Nanomedicina La búsqueda de enfoques no invasivos que permitan el uso de sorafenib para tratar el HCC, con efectos tóxicos mínimos o nulos, es un área de interés permanente en la 50 oncología moderna. El advenimiento de la nanomedicina, cuyo objetivo último es transportar una cantidad suficiente de sustancias activas a través de las barreras fisiológicas y alcanzar, de forma selectiva, los tejidos afectados por la enfermedad, ha tenido un impacto significativo en este campo (52–54). En esta área, el uso de nanopartículas solubles en agua como vectores para la liberación selectiva de compuestos citotóxicos a los tejidos tumorales ha mostrado resultados muy prometedores (55). De hecho, la reducción de efectos secundarios, el aumento de la solubilidad y el tiempo de circulación y la acumulación preferencial en el tejido tumoral debido al efecto de permeabilización y retención (EPR) de los quimioterapéuticos de molécula pequeña notoriamente tóxicos se pueden lograr mediante el direccionamiento de fármacos, ya sea pasivo o activo, utilizando nanopartículas (55). Los tumores sólidos pueden presentar un aumento de la vascularización y la permeabilidad, lo que da como resultado una mayor acumulación de nanopartículas en el espacio tumoral intersticial en comparación con el tejido normal o sano, junto con un drenaje linfático deficiente (56). Sin embargo, la heterogeneidad de los tumores sólidos puede limitar la eficacia de las terapias de nanopartículas basadas en EPR en humanos (57). Se están desarrollando una serie de enfoques basados en nanopartículas y micropartículas para dirigir el sorafenib al HCC. 51 Figura 5. Efecto EPR aumentado en el tejido tumoral con respecto al tejido sano. Estos incluyen liposomas (58), nanopartículas poliméricas (59,60), nanopartículas mesoporosas (61–63), microcápsulas núcleo-capa (64,65), nanopartículas cristalinas líquidas (66), nanopartículas de lípidos sólidos (67–70), y neutrales nanocompuestos anfifílicos basados en ciclodextrina (71). Sin embargo, aún no se ha investigado el desarrollo de nanovectores funcionalizados cargados con sorafenib. Además, si bien la mayoría de los enfoques informados se basan en el direccionamiento pasivo, recientemente se ha demostrado que es menos adecuado para reducir los efectos secundarios de los compuestos antitumorales en comparación con el direccionamiento activo, que se basa en la programación de nanopartículas al unirse a un ligando, que interactúa selectivamente. con receptores de superficie celular (72). Por ello, encontrar dianas biológicas nuevas, específicas, sobreexpresadas con respecto a las células normales, con alta eficiencia endocítica y poca tendencia a sufrir mutaciones es de suma importancia en nanomedicina. Uno de los principales receptores para tal dirección es el ASGPR (73,74) que se encuentra predominantemente en los hepatocitos, HCC y en menor proporción en células no hepáticas (75). En particular, ASGPR pertenece al grupo de receptores con reciclado 52 constitutivo cada 15 minutos con o sin ligandos (76). La función principal de ASGPR es mantener la homeostasis de las glicoproteínas séricas mediando el reconocimiento y endocitosis de una amplia gama de glicoproteínas desialiladas que transportan residuos terminales de galactosa (Gal) o N-acetilgalactosamina (GalNAc) (77). Además, ASGPR juega un papel en las enfermedades infecciosas, ya que se demostró que el VHA y VHB, así como el virus de Marburg, se unen a él, lo que facilita las infecciones hepáticas. Otro receptor importante presente en las células hepáticas es el MR, pero cuya importancia en la patología del cáncer de hígado es poco conocida. El MR, también una lectina de tipo C, se expresa en la superficie de los macrófagos y algunos subconjuntos de células dendríticas inmaduras (78). MR participa en la presentación de antígenos, endocitosis de macrófagos y se considera un sello distintivo de los macrófagos asociados a tumores (79). Un estudio clínico reciente ha demostrado un aumento de la expresión de MR en muestras de cáncer de hígado en comparación con el tejido hepático adyacente sano y que la expresión de MR se asoció significativamente con el tamaño del tumor y la metástasis, lo que convierte a la MR en un receptor atractivo para dirigirse al HCC (80). Las micelas, y más concretamente las micelas poliméricas, ocupan una posición privilegiada entre los sistemas de liberación de fármacos actualmente utilizados, con algunas formulaciones ya en el mercado o en estadios clínicos avanzados, lo que las hace muy atractivas para la implementación de sistemas de glicogestión (81). Entre los inconvenientes que han limitado el uso de micelas en general, y los derivados anfifílicos de bajo peso molecular en particular, como portadores de fármacos está su alta sensibilidad a la dilución. Las aproximaciones que superen este abrumador problema son muy necesarias para la aplicación de estos prometedores sistemas en medicina. En este sentido, los anfífilos diacetileno son muy adecuados, ya que pueden sufrir una fotopolimerización limpia mediante una reacción de adición 1,4 tras irradiación UV o 53 estímulos térmicos. De esta forma, se obtienen nanomateriales funcionales de polidiacetileno (PDA), (82) incluidas las micelas, (83) con mayor estabilidad y propiedades cromáticas interesantes (84). 54 OBJETIVOS 55 Este trabajo tiene como objetivo principal la caracterización y evaluación de la efectividad terapéutica de micelas diseñadas para acceder al MR y ASGPR para la encapsulación de sorafenib en el cultivo de células HepG2 y Huh7, con el objetivo final de verificar si dichas micelas son vehículos idóneos para este fármaco en HCC. Para ello se han abordado los siguientes objetivos parciales: 1. Síntesis y caracterización de las dos formulaciones a. Síntesis y purificación de los precursores micelares b. Caracterización de los precursores micelares c. Encapsulación de sorafenib en las nanomicelas 2. Evaluar la expresión de los receptores en estudio a. Estudiar la expresión de ASGPR en células HepG2 y Huh7 b. Estudiar la expresión de MR en células HepG2 y Huh7 3. Determinar el tráfico intracelular de estos nanotransportadores en células HepG2 a. Incorporación de Rojo del Nilo a las nanomicelas 4. Cuantificar la concentración intracelular de sorafenib en las nanomicelas a. Cuantificar la liberación de sorafenib encapsulado en las nanomicelas 56 5. Valorar la inducción de la apoptosis y reducción de la proliferación celular por sorafenib por las dos formulaciones de micelas realizadas en comparación con el fármaco sin vehiculizar en HepG2 y Huh7 57 64 Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear (1H-RMN, 13C-RMN) se han registrado espectrómetros Bruker DRX-300 (300 MHz), DPX-400 (400 MHz) y DRX-500 (500 MHz) del Instituto de Investigaciones Químicas. Los espectros se han registrado a partir de muestras en disolución en el disolvente deuterado que se indica entre paréntesis. Los desplazamientos químicos se expresan en ppm (δ), usando como referencia la señal residual del disolvente no deuterado. Para la asignación de las estructuras más complejas se han utilizado experimentos bidimensionales de correlación protón-protón (COSY) y protón-carbono (HETCOR) usando secuencias de pulsos estándar. Los espectros de masas (EM) se obtuvieron empleando la técnica de ionización por electrospray (ESI) en un espectrómetro Bruker Esquire6000. Para ello se emplearon disoluciones de las muestras en CH2Cl2, MeOH, o sus mezclas, a concentración en el rango μM. Las muestras se introdujeron mediante inyección directa usando una jeringa Cole-Palmer a un flujo de 120 μL/h. Los espectros de masas de alta resolución (EMAR) fueron realizados por el Servicio de Espectrometría de Masas de la Universidad de Sevilla en un espectrómetro Kratos MS-80-RFA y en un espectrómetro de masas Micromass modelo AutoSpec. Los espectros de UV-Vis se registraron en un espectrómetro UV/Vis Perkin Elmer Lambda 12 del Instituto de Investigaciones Químicas, utilizando como disolvente agua milli-Q (18 μΩ). Los espectros de fluorescencia fueron realizados en el Instituto de Ciencia de Materiales de Sevilla (ICMS) en un Jobin Yvon FLUOROLOG FL3-11 65 fluorimeter equipado con dos monocromadores, a una longitud de onda de excitación 345 nm. Las micrografías obtenidas del microscopio electrónico de transmisión (TEM) se obtuvieron en microscopios Philips CM10 trabajando a 80 kV, éste último en los Servicios Generales de Investigación de la Universidad de Sevilla (CITIUS). Para la preparación de las muestras se colocaron 15 μL de disolución objeto de estudio y 15 μL de una disolución de acetato de uranilo (2%) como agente de tinción, ambos sobre una rejilla de cobre recubierta con una película de carbono. Tras 2 minutos se eliminó el exceso de muestra y aditivo por absorción en un papel de filtro. 59 Esquema 1. Síntesis del neoglicolípido autoasociativa derivado de galactosa 2 a partir del tetraacetato de galactosa 3 (a) BF3 · Et2O, CH2Cl2, 70%; (b) AcOH, Zn, CH2Cl2, 72% (c) DIPEA, TBTU, DMF, 92%; (d) SnCl2, PhSH, Et3N, THF, 52%; (e) PCDA, DIPEA, TBTU, DMF, 62%; (f) MeONa, MeOH, Amberlite IR 120 H+, rend, cuant. d e f HO OOOON3 O c 7 HS N H O OCCl3 O AcO AcO OAc OAc OAc O AcO AcO S OAc OAc N HO O CCl3 O AcO AcO S OAc OAc NH2 O AcO AcO S OAc OAc N H O O OOONH2 O AcO AcO S OAc OAc N H O O OOO H NO O AcO AcO S OAc OAc N H O O OOON3 O HO HO S OH OH N H O O OOO H N O 2 4 + 3 5 6 8 9 10 a b 61 Compuesto 2 Tiogalactopiranósido Compuesto 3 Compuesto 4 Galactosa peracetilada Compuesto 5 Compuesto 6 Derivado de aminoetiltiogalactopi ranósido Compuesto 7 Espaciador bifuncional 5 Compuesto 8 Azido derivado Compuesto 9 O HO HO S OH OH N H O O OOO H N O HS N H O OCCl3 O AcO AcO OAc OAc OAc O AcO AcO S OAc OAc N HO O CCl3 O AcO AcO S OAc OAc NH2 O AcO AcO S OAc OAc N H O O OOON3 O AcO AcO S OAc OAc N H O O OOONH2 62 Compuesto 10 Monómero final peracetilado Tabla. 1. Compuestos sintetizados a lo largo de la síntesis del monómero anfífilo de galactosa autoasociativo 2 Esquema 2. Síntesis del neoglicolípido autoasociativa derivado de manosa 1 a partir del tetraacetato de manosa 11 (a) BF3 · Et2O, CH2Cl2, 50%; (b) 7, DMT-MM, 4-metil-morfolina, THF, 68%; (c) SnCl2, PhSH, Et3N, THF, 65%; (e) PCDA, DMT-MM, 4-metil-morfolina, THF, 60% (f) MeONa, MeOH, Amberlite IR 120 H+, 98%. O AcO AcO S OAc OAc N H O O OOO H NO O AcO AcO AcO OAc SNH2 O SN H AcO AcO AcO OAc OOOON3 O 14 O SN H AcO AcO AcO OAc OOOONH2 O 15 SN HOOOO H N O O 16 SN HOOOO H N O O 1 O AcO AcO AcO OAc O HO HO HO OH ab c d 13 e HS N HO O Me MeMe 11 12 O AcO AcO AcO OAc OAc 63 Compuesto 2 Tiogalactopiranósido Compuesto 11 Manosa peracetilada Compuesto 12 Boc-Cisteamina Compuesto 13 Derivado de aminoetiltiomanopiranósido Compuesto 14 Compuesto 15 Compuesto 16 Monnómero final 1 peracetilado Tabla 2. Compuestos sintetizados a lo largo de la síntesis del monómero anfífilo de galactosa autoasociativo 1 SN HOOOO H N O O O HO HO HO OH O AcO AcO AcO OAc OAc HS N HO O Me MeMe O AcO AcO AcO OAc SNH2 O SN H AcO AcO AcO OAc OOOON3 O O SN H AcO AcO AcO OAc OOOONH2 O SN HOOOO H N O O O AcO AcO AcO OAc 64 La síntesis de los dos monómeros ha sido realizada siguiendo 2 rutas diferentes. Para la síntesis del monómero 1, Esquema 2, se ha seguido una ruta previamente desarrollada en el grupo de Síntesis asimétrica y Nanosistemas Funcionales. Esta ruta que utiliza como producto de partida la manos peracetilada 11, se basa en una reacción de “onepot” de tiglicosidación desprotección del grupo terc-butiloxicarbonilo en una sola etapa reacción. Debido a problemas de separación de los anómeros a y b formados en la reacción de tioglicosidación, se ha desarrollado una nueva aproximación para la síntesis del monómero autoasociativo 2, Esquema 1. En esta aproximación se utiliza como donador de glicosilo la galactosa peracetililada , y la cisteamina tricloroBOC 3 como aceptor de glicosilo, siguiendo el protocolo desarrolado por el grupo de Gildersleeve. 3.3.1 Síntesis de (2-Aminoetil) 2,3,4,6-tetra-O-acetil-α-D-tiomanopiranósido (13) A partir de la manosa acetilada 12 (1 g, 1 eq) en CH2Cl2 anhidro, bajo atmósfera de argón y en agitación, se le añaden 2-(Boc-amino)etanotiol 13 (1.5 eq) y BF3·Et2O (10 eq). La reacción se calienta a reflujo (45 ºC) durante 24 horas, observándose por c.c.f. un nuevo producto con un Rf menor que el producto de partida. El crudo se neutraliza con una disolución acuosa de NaHCO3, se extrajo la fase orgánica con CH2Cl2. Se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se evaporó el disolvente a vacío, obteniéndose el compuesto 13 (0.5 g, 1.23 moles) con un rendimiento del 50% mediante columna cromatográfica en CH2Cl2 /MeOH (30:1). O AcO AcO AcO OAc SNH2 13 65 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 5.46 (sa, 2H, NH2), 5.42-5.15 (m, 3H, H-1, H-4, H-2), 5.09 (dd, 1H, J3,4 = 10.2 Hz, J3,2 = 2.7 Hz, H-3), 4.29-4.23 (m, 1H, H-5), 4.17 (dd, 1H, J6a,6b = 12.5 Hz, J6a,5 = 5.1 Hz, H-6a), 4.00 (d, 1H, J = 12.6 Hz, H-6b), 2.95 (sa, 2H, CH2NH2), 2.84-2.67 (m, 2H, SCH2), 2.04 (s, 3H, CH3COO), 1.98 (s, 3H, CH3COO), 1.94 (s, 3H, CH3COO), 1.87 (s, 3H, CH3COO). 13C RMN (125.7 MHz, CDCl3): δ 170.5 (CO), 169.8 (CO), 169.7 (CO), 169.6 (CO), 82.3 (C1), 70.8 (C4), 69.3 (C3), 69.2 (C5), 66.0 (C2), 62.3 (C6), 39.8 (CH2NH2), 32.1 (SCH2), 20.7 (CH3), 20.6 (CH3), 20.5 (2CH3). EMAR: Calculado para C16H25NO9S 408.1328 [M+H]+, encontrado 408.1326. 3.3.2 Síntesis de (17-Azido-4-oxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaheptadecanil) 2,3,4,6 tetra-O-acetil-α-D- tiomanopiranósido (14) A una disolución del espaciador 7 (320 mg,) en THF (25 mL) se añadió DMT-MM (320mg, 1.15 mmol). Tras 5 minutos de agitación se enfrío la mezcla a 0ºC y se añadió una disolución del amino derivado 13 y 4-metilmorfolina (126 L, 1.1eq). La reacción se agita a temperatura ambiente durante 24 horas, se evapora el disolvente a sequedad y se purificó el producto por cromatografía en columna usando como eluyente una mezcla de CH2Cl2:MeOH (20:1), obteniéndose el compuesto 14 con un rendimiento del 68%. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7.31 (t, 1H, J = 6.5 Hz, NHCO), 5.25-5.20 (m, 3H, H-1, O SN H AcO AcO AcO OAc OOOON3 O 14 66 H-4, H-2), 5.15 (dd, 1H, J3,4 = 10.4 Hz, J3,2 = 3.2 Hz, H-3), 4.32-4.29 (m, 1H, H-5), 4.23 (dd, 1H, J6a,6b = 12.2 Hz, J6a,5 = 5.9 Hz, H- 6a), 4.03 (dd, 1H, J6b,6a = 12.5 Hz, J6b,5 = 1.9 Hz, H-6b), 3.91 (s, 2H, COCH2O), 3.60-3.56 (m, 14H, 7 CH2O), 3.48-3.44 (m, 2H, CH2NH), 3.31 (t, 2H, J = 5.2 Hz, CH2N3), 2.80-2.68 (m, 2H, SCH2), 2.08 (s, 3H, CH3COO), 2.01 (s, 3H, CH3COO), 1.98 (s, 3H, CH3COO), 1.91 (s, 3H, CH3COO). 13C RMN (125.7 MHz,CDCl3): δ 170.5 (CO), 170.1 (CO), 169.8 (CO), 169.7 (CO), 169.6 (CO), 82.4 (C1), 70.9 (C4), 70.8, 70.6, 70.5, 70.4, 70.3, 70.1, 69.9, 69.3 (C3), 69.1 (C5), 66.2 (C2), 62.4 (C6), 50.6 (CN3), 38.1 (CH2NH), 31.0 (SCH2), 20.8 (CH3), 20.6 (CH3), 20.5 (CH3). EMAR: Calculado para C26H42N4O14SNa 689.2316 [M+Na]+, encontrado 689.2289. 3.3.3 Síntesis de (17-Amino-4-oxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaheptadecanil) 2,3,4,6- tetra-O-acetil-α-D- tiomanopiranósido (15) Sobre una disolución de cloruro de estaño (170 mg, 0,9 mmol) en THF (15 mL), se adicionó tiofenol (370 L, 3,6mmol) y Et3N (370 L, 2,76 mmol). Seguidamente, se añadió el compuesto 14 (400mg, 0,6mmol) disuelto en THF (10 mL). Se dejó agitando durante 30 min a temperatura ambiente. La reacción se llevó a cabo bajo atmosfera de argón y se siguió por cromatografía en capa fina (DCM:MeOH 9:1). La mezcla de la reacción se neutralizó con bicarbonato sólido, se filtró y se concentró hasta sequedad. Se purificó el crudo de reacción obtenido mediante cromatografía en columna utilizando como eluyente una mezcla de CH2Cl2:MeOH 9:1, obteniéndose el compuesto 15 como un aceite de color amarillo y con un rendimiento del 65%. 67 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 7.83 (t, 1H, J = 5.0 Hz, NHCO), 5.29-5.22 (m, 3H, H-1, H-4, H-2), 5.15 (dd, 1H, J3,4 = 10.0 Hz, J3,2 = 3.4 Hz, H-3), 4.32-4.31 (m, 1H, H-5), 4.24 (dd, 1H, J6a,6b = 12.0 Hz, J6a,5 = 5.2 Hz, H- 6a), 4.07 (d, 1H, J = 2.0 Hz, H-6b), 4.04 (s, 2H, COCH2O), 3.80 (t, 2H, J = 4.4 Hz, OCH2CH2NH2), 3.66-3.59 (m, 12H, 6 CH2O), 3.48-3.44 (m, 2H, CH2NHCO), 3.14 (t, 2H, J = 4.5 Hz, CH2NH2), 2.83-2.72 (m, 2H, SCH2), 2.10 (s, 3H, CH3COO), 2.03 (s, 3H, CH3COO), 1.99 (s, 3H, CH3COO), 1.92 (s, 3H, CH3COO). 13C RMN (125.7 MHz, CDCl3): δ 170.6 (CO), 170.5 (CO), 169.9 (CO), 169.8 (CO), 169.6 (CO), 82.3 (C1), 70.8, 70.6 (C4), 70.2, 70.1, 70.0, 69.9, 69.6, 69.4 (C3), 69.1 (C5), 66.7 (C2), 66.2, 62.4 (C6), 39.6 (CNH2), 38.2 (CH2NH), 30.9 (SCH2), 20.9 (CH3), 20.7 (CH3), 20.6 (CH3). EMAR: Calculado para C26H44N2O14SNa 640.2516 [M+Na]+, encontrado 640.2489. 3.3.4 Síntesis de (4,19-Dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3,18-diaza-28,30- tritetracontadiinil) 2,3,4,6-tetra-O-acetil- α-D-tiomanopiranósido (16) A una disolución de ácido 10,12-pentacosadiinoico (154 mg, 0,412 mmol) y DMT-MM (114 mg, 0,375 mmol) en THF se añade el compuesto 15 (240 mg, 0, 375 mmol). Posteriormente, se adicionó gota a gota 4-metilmorfolina (41 l, 0,375mmol) y se mantuvo agitando durante 24 h a temperatura ambiente. Se concentra el crudo de reacción O SN H AcO AcO AcO OAc OOOONH2 O 15 74 H-6b), 4.04 (s, 2H, COCH2O), 4.00 (t, 1H, J5,6a = J5,6b = 6.8, H-5 ), 3,81 (t, 2H, J = 4,7 Hz, OCH2CH2NH2), 3,69-3,56 (m, 12H, 6 CH2O), 3,52-3,39 (m, 2H, CH2NH), 3,05- 2,94 (m, 4H, CH2NH2, NH2 ), 2,92-2,67 (m, 2H, SCH2), 2,09 (s, 3H, CH3), 2,00 (s, 3H, CH3), 1,98 (s, 3H, CH3), 1,91 (s, 3H, CH3). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 170,5 (CO), 170,2 (CO), 170,0 (CO), 169,7 (CO), 84,3 (C1), 74,4 (C5), 71,9 (C3), 70,6-70,3 (CH2O), 69,6 (COCH2O), 67,2 (C4), 66,7 (C2), 61,4 (C6), 39,7 (CH2NH2), 39,1 (CH2NH) 30,2 (SCH2), 20,9 (CH3), 20,8 (CH3), 20,7 (CH3) 20,6 (CH3). HRMS: Calc. para C26H45N2O14S 641,2586 [M + H] +, encontrado 641,2576. 3.3.11. Síntesis del compuesto 10 Una solución de ácido 10,12-pentacosadiinoico (1 equivalente), TBTU (1 equivalente) y DIPEA (1,5 equivalentes) en DMF seco (1,6 ml) bajo una atmósfera de argón se agitó a temperatura ambiente durante 15 min. A continuación, se añadió una solución del derivado de aminoglucósido (compuesto 9) (0,16 mmol, 1 equivalente) y DIPEA (1,5 equivalentes) en DMF seca (0,8 ml) a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó durante 24 h, el disolvente se eliminó al vacío y la mezcla obtenida se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida. [α] 20D: -7,1 (c 0,73, CHCl3). RMN 1H (400 MHz, CDCl3): δ 7.26 (t, 1H, J = 5.4, NHCO) 6.16 (t, 1H, J = 5.4, NHCO) 5.39 (d, 1H, J4,3 = 3.3 Hz, H-4 ), 5.18 (t, 1H, J2,3 = J2,1 = 10.0 Hz, H-2), 5.02 (dd, 1H, J3,2 = 10.0 Hz, J3,4 = 3.3 Hz, H-3), 4.53 (d, 1H, J1,2 = 10.0 Hz, H-1), 4.19-4.04 (m, 2H, H-6a, H-6b), 3.97 (s, 2H, COCH2O), 3.94 (t, 1H, J5 , 6a = J5,6b = 6.5, H-5), 3.69-3.54 (m, 12H, 6 CH2O), 3.54- 3.43 (m, 4H, OCH2CH2NH), 3.43-3.35 (m, 2H, SCH2CH2NH), 2.93- 2,68 (m, 2H, SCH2), 2,19 (t, 4H, J = 6,3 Hz, 2 CH2C≡C), 2,15- 2,08 (m, 5H, COCH2CH2, CH3COO), 2,03 (s, 3H, CH3COO), 2,00 ( s, 3H, CH3COO), 1,94 (s, 3H, CH3COO), 1,58 (t, 2H, J = 6,8 Hz, COCH2CH2), 1,51-1,40 (m, 4H, 2 75 CH2CH2C≡C), 1,36-1,29 (m, 26H, 13 CH2), 0,83 (t, 3H, J = 6,5 Hz, CH3CH2). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): δ 173,2 (CO), 170,4 (CO), 170,1 (CO), 167,0 (CO), 169,9 (CO), 169,6 (CO), 84,2 (C1), 81,6 (CH2C≡C ), 79,5 (CH2C≡C), 74,4 (C5), 71,7 (C3) 70,6-70,3 (CH2O), 69,9 (COCH2O), 67,2 (C4), 67,1 (C2), 65,3 (CH2C≡C), 65,2 (CH2C ≡C), 61,3 (C6), 39,1 (CH2NH), 38,9 (SCH2CH2), 36,6 (NHCOCH2CH2), 31,9 (CH2CH2CH3), 30,3 (SCH2), 29,6-28,3, (COCH2CH2CH2), 25,6 (NHCOCH2CH2) 22,6 (CH2CH3) , 20,7 (CH3), 20,6 (2CH3), 20,5 (CH3), 19,1 (2CH2C≡C), 14,1 (CH3CH2). HRMS: Calc. para C51H84N2O15SNa 1019,5485 [M + Na] +, encontrado 1019,5468. 3.3.12. Síntesis de anfifilo 2 El glucósido peracetilado (compuesto 10) disuelto en MeOH se trató con MeONa 1 M hasta que el pH alcanzó 8–9. Después de 30 min, la mezcla de reacción se neutralizó con una resina ácida (forma de hidrógeno Amberlites IR 120), se filtró y el disolvente se eliminó a presión reducida. El compuesto final (compuesto 2) se obtuvo con un rendimiento cuantitativo. [α] 20D: -10,8 (c 0,5, MeOH). RMN 1H (500 MHz, MeOD): δ 4,38 (d, 1H, J1,2 = 10 Hz, H-1), 4,03 (s, 2H, COCH2O), 3,79 (dd, 1H, J6a, 6b = 10 Hz, J6,5 = 6,8 Hz, H-6a), 3,75-3,62 (m, 14H, H-6b, H-4, 6 CH2O), 3,62-3,53 (m, 6H, OCH2CH2NH, SCH2CH2, H-2, H- 5), 3.50 (dd, 1H, J3,2 = 9.3 Hz, J3,4 = 3.8 Hz, H-3) 3.40-3.37 (t, 2H, J = 5.6 Hz, CH2NH), 2.92-2.74 (m, 2H , SCH2), 2.27 (t, 4H, J = 7 Hz, 2 CH2C≡C), 2.22 (t, 2H, J = 7.4 Hz, COCH2CH2), 1.63 (t, 2H, J = 6.3, COCH2CH2), 1.56- 1,48 (m, 4H, 2 CH2CH2C≡C), 1,47-1,27 (m, 26H, 13 CH2), 0,93 (t, 3H, J = 6,3 Hz, CH3). 13C RMN (125,7 MHz, MeOD): δ 175,0 (CO), 171,4 (CO), 86,3 (C1), 79,4 (CH2C≡C), 76,5 (CH2C≡C), 74,9 (C5), 70,6 (C3), 70,2 -69,9 (CH2O), 69,9 (COCH2O), 69,3 (C4), 69,1 (C2), 65,1 (CH2C≡C), 61,4 (C6), 39,0 (CH2NH), 38,3 (SCH2CH2), 35,7 76 (NHCOCH2CH2), 31,8 (CH2CH2CH3), 30,1 (SCH2), 29,8-28,2 (COCH2CH2), 25,6 (NHCOCH2CH2) 22,4 (CH2CH3), 20,7 (CH3), 20,6 (2CH3), 20,5 (CH3), 18,4 (2CH2C≡C), 13,2 (CH3CH2). HRMS: Calc. Para C43H76N2O11SNa 851.5062 [M + Na] +, encontrado 851.5049. Síntesis de las nanomicelas pMicMan y pMicGal El neoglicolípido (1 o 2 de la Figura 5) se disolvió en agua milli-Q por encima de su concentración micelar crítica determinada por el método del pireno. Brevemente, la solución transparente se sonicó durante 30 minutos en oscuridad. La solución coloidal obtenida se sometió a irradiación bajo una lámpara UV a 254 nm durante 1 hora, promoviendo así la fotopolimerización de las funcionalidades de diino en derivados poliméricos de poli (diacetileno). Medida del tamaño de los nanovectores El tamaño de partícula y la distribución de las micelas se midieron usando un sistema Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Se usó un rayo láser a una longitud de onda de 632,8 nm. El ángulo de dispersión se ajustó a 90º cuando se realizaron las mediciones. Los valores se presentan como el tamaño promedio de volumen ± la desviación estándar de tres valoraciones. El error en las mediciones se calculó como el ancho a la altura media del pico dividido por dos. Determinación de CMC La concentración micelar crítica (CMC) de las micelas se determinó utilizando pireno como sonda de fluorescencia extrínseca. La concentración de pireno se mantuvo constante (0.6 10-6M en THF), y la concentración de ambos compuestos varió de 1 x 10- 77 3 M a 0.5 x 10-6 M. Las mediciones de fluorescencia se llevaron a cabo a 25º C usando un espectrofluorómetro Eclipse Varian Cary. A la longitud de onda de excitación fija de 334 nm, los espectros de emisión se escanearon de 300 a 350 nm. Las relaciones de intensidad de fluorescencia de pireno a 339 y 335 nm (I339/I335, I1/I3) se calcularon y se representaron frente al logaritmo de concentración del neoglicolípido. El valor de CMC se determinó a partir de la intersección de las dos líneas tangentes. Análisis TEM Se depositaron 15 μl de una solución diluida de pMicMan y pMicGal en una rejilla de carbono. Luego se añadió 15 μl de una solución de acetato de uranilo al 2 % para teñir negativamente las micelas, y el exceso de líquido se eliminó con papel de filtro. Las imágenes TEM se registraron en aparatos Philips CM 10 o CM 200 con un voltaje de aceleración de 80 kV o 200 kV. Encapsulación de fármacos en los nanovectores La carga de sorafenib implicó la sonicación previa durante 30 minutos bajo oscuridad total a temperatura ambiente de los precursores micelares. Las micelas no polimerizadas se analizaron posteriormente por TEM y DLS y se mantuvieron durante 3 horas bajo luz ultravioleta (254 nm) para la polimerización. El precursor micelar está formado por un doble carbono que contiene dos triples enlaces que se polimeriza en contacto con la luz. Estos dobles enlaces triples forman enlaces covalentes entre sí, lo que da rigidez y consistencia a las micelas. Sorafenib se cargó a baja y alta concentración en ambas nanomicelas. Las micelas cargadas con sorafenib a baja carga, corresponde con una proporción 1:2 de sorafenib con respecto a las micelas, es decir, se añade la mitad de sorafenib con respecto a las micelas. 78 En el caso de las micelas con carga alta, la proporción es de 1:1 con respecto a sorafenib. El fluoróforo, Rojo del Nilo, se añadió a baja carga. La cantidad conveniente de sorafenib o Rojo del Nilo se añadió a las micelas polimerizadas y se dejó durante 24 horas con agitación a 54 °C. Después de completar el procedimiento, el exceso del fármaco se eliminó de las micelas por centrifugación a 92 g durante 20 minutos repitiendo el proceso entre dos y tres veces. Se recogió el sobrenadante que contenía micelas cargadas, se liofilizó y se congeló a -80ºC. Figura 6. Representación esquemática de la formación de micelas fotopolimerizadas recubiertas de manosa y galactosa con la capacidad de dirigirse a receptores de manosa y asialoglicoproteína en las células del HCC. Cuantificación de sorafenib mediante HPLC Sorafenib se cuantificó utilizando el método de cromatografía líquidaespectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). La separación se realizó en una columna analítica Pursuit XRs Ultra C18 (2.8 μm, 100 mm × 2.0 mm) (Cat. 546695, Agilent Technologies, Santa Clara, EE. UU). La fase móvil consistió en una solución de acetonitrilo con ácido fórmico al 0.1% (Cat. 1.59002.2500, EMD Millipore Corporation, 79 Billerica, EE. UU.) (80/20 vol/vol orgánico/acuoso). Las curvas estándar fueron altamente lineales en el rango de 1–10.00 ng/mL. Evaluación de la liberación espontánea de sorafenib a lo largo del tiempo de pMicMan y pMicGal La liberación del fármaco a lo largo del tiempo de las nanomicelas que contienen sorafenib se llevó a cabo diluyendo estas en medio de cultivo y usando tubos de diálisis midi D-Tube TM (Cat. 71506-3, EMD Millipore Corporation, Billerica, Estados Unidos) La liberación se llevó a cabo a 37ºC para imitar condiciones experimentales in vitro. Las muestras fueron recogidas a diferentes tiempos 0, 15 min, 30 min, 60 min, 6 horas, 12 horas y 24 horas. El contenido restante del fármaco dentro de nanomicelas después de dichos tiempos se obtuvo rompiendo las micelas con DMSO. El fármaco se extrajo con una precipitación líquido/líquido con acetonitrilo. Valoración de la incorporación celular de los nanovectores mediada por endosomas La sonda de membrana FM 1-43 es un reactivo excelente para investigar los mecanismos de actividad endocítica. Las células se incubaron con FM1-43 (4 µM) (T3163, Thermo Fisher, Estados Unidos) durante 30 min. La inhibición de la actividad endocítica se realizó usando citocalasina D (8 μM) (C2618, Sigma-Aldrich) y dynasore (80 μM) (324410, Sigma-Aldrich) diluido en DMSO. Los inhibidores se añadieron 10 min antes que las nanomicelas. Los cubreobjetos se lavaron durante 5 minutos con una solución basal de Locke que contenía NaCl 140 mM, HEPES 10 mM, KOH 3 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM y glucosa 10 mM. El pH de la solución se ajustó a 7,3 con NaOH. Todos los productos químicos fueron adquiridos de Sigma. La fluorescencia se midió en un microscopio fluorescente invertido Axiovert 200 (Zeiss, Oberkochen, Alemania) equipado con un conjunto de filtros estándar para FM1-43 (XF115-2; Omega Optical). Las imágenes se capturaron con una cámara CCD ORCA-R2 (Hamamatsu 80 Photonics) controlada por el software HCImage (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japón). Las imágenes se adquirieron a una velocidad de 0,5 Hz, 1344×1024 píxeles (agrupadas 1 × 1), con un tiempo de exposición de 200 ms. Medida del tráfico intracelular de pMicMan y pMicGal El rojo del Nilo se ha utilizado principalmente para estudiar las gotas de lípidos. Sin embargo, también ha brindado información útil sobre el procesamiento endosomal y lisosomal. En este sentido, las nanomicelas se cargaron con rojo del Nilo (N3013, Sigma- Aldrich, Missouri, Estados Unidos). Rojo del Nilo se encontraba en las micelas en baja carga por lo que la cantidad de este marcador era la mitad del monómero. La presencia de nanopartículas en diferentes compartimentos celulares se evaluó utilizando un marcador endosomal (2 µg/ml) (anti-EEA1, E7659, Sigma-Aldrich, Missouri, Estados Unidos), lisosomal (10 µg/ml) (anti-Lamp1, L1418, Sigma-Aldrich) y de autofagosoma (1:50) (anti-BECN-1, sc-48341, Santa Cruz, Texas, Estados Unidos) mediante el procedimiento de tinción conjunta por inmunofluorescencia. Las células se incubaron con nanomicelas que contenían rojo del Nilo sobre un cubreobjeto durante 6 horas a 4ºC y 37ºC y en oscuridad. Tras la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS (LO625-500, Biowest, Nuaillé, Francia) a 37ºC y se fijaron con 500 µl de formol (HT501128-4L, Misuri, Estados Unidos) durante 30 minutos a 4ºC. Antes del bloqueo se realizó los lavados correspondientes. Se realiza el bloqueo de sitios inespecíficos con una solución a base de BSA al 1% en PBS-T (250 µl) durante una hora a temperatura ambiente y en oscuridad. Se inició la incubación con los anticuerpos primarios en una solución de BSA al 5% en PBS-T en cámara húmeda en oscuridad y durante 12 horas. Tras la incubación con el anticuerpo primario y su posterior lavado, se inicia la incubación con el anticuerpo secundario en una solución de BSA al 5% en PBS-T durante 2 horas a temperatura ambiente y en oscuridad. Los cubreobjetos fueron colocados sobre 81 portaobjetos (J2800AMNZ, Thermo-Fisher, Massachusetts, USA). Se usó un medio de montaje que contenía DAPI para teñir el núcleo. Se utilizó un microscopio confocal de escaneo láser espectral Leica TCS-SP2 (Wetzlar, Alemania). Impacto de la inhibición de la formación de autofagolisosomas en la actividad proapoptótica y antiproliferativa de sorafenib incorporado a pMicMan y pMicGal El impacto del desarrollo de autofagolisosomas en presencia sorafenib contenido en las nanomicelas picMan y picGal en la apoptosis y la proliferación celular se evaluó utilizando cloroquina (50 µM), la cual previene la acidificación de los lisosomas, y 3- metiladenina (3Me-A) (5 µM) que inhibe la clase I y III PI3K y generación de autofagolisosoma. Los inhibidores se agregaron 2 horas antes de sorafenib. La inhibición de la actividad endocítica se realizó usando citocalasina D (8 μM) (Ref. C2618, Sigma- Aldrich) y dynasore (80 μM) (Ref. 324410, Sigma-Aldrich) diluido en DMSO. Los inhibidores se añadieron 10 min antes de las nanomicelas. Ensayo de proliferación celular La proliferación celular se midió como resultado de la incorporación de bromodeoxiuridina (BrdU) (11647229001; Roche Diagnostics, Indianápolis, Estados Unidos). Las células se sembraron y trataron en placas de 96 pocillos como se describió previamente. Se añadió BrdU (10 µM) 2 horas antes de la recolección de células para permitir su incorporación en el ADN. El ensayo incluye la desnaturalización de ADN con reactivo comercial FixDenat durante 30 minutos a temperatura ambiente para asegurar la unión adecuada del anticuerpo. Después las células se incubaron 90 minutos con un anticuerpo monoclonal anti-BrdU conjugado con peroxidasa de rábano. Las muestras se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato y se incubaron con una 82 solución de sustrato de peroxidasa que contenía peróxido de hidrógeno, luminol y 4- yodofenol durante 15 minutos a temperatura ambiente hasta el desarrollo del color. La absorbancia se midió a 370 nm usando 492 nm como longitud de onda de referencia usando un lector de microplacas Infinite 200 PRO (TECAN, Männedorf, Suiza). Cuantificación de la muerte celular La actividad de Caspasa-3/7 se determinó usando el ensayo Caspase-Glo® 3/7 (G8091, Promega, Madison, Estados Unidos). El ensayo proporciona un sustrato de caspasa luminogénica y Luciferasa UltraGlo™. El sustrato Caspase-Glo® 3/7 se agregó en el mismo volumen que lisados celulares que contienen proteínas totales, lo que resultó en la generación de una señal luminiscente de "tipo de brillo" que es directamente proporcional a la actividad de caspasa en la muestra. El volumen total se ajustó a 50 µl usando el tampón incluido en el ensayo. Análisis estadístico Todos los resultados se expresan como media±SEM de experimentos independientes (n=4-10). Los datos se compararon mediante el análisis de varianza (ANOVA) con la prueba de diferencia mínima significativa como análisis de comparación múltiple post hoc (homogeneidad de varianzas) o Games-Howell (no homogeneidad de varianzas). En el caso de que la prueba de Shapiro-Wilks mostrara una distribución no normal de los datos, se realizó la prueba Kruskal-Wallis no paramétrico acoplado al análisis post-hoc de U-Man-Whitney con la corrección de Finner. Los grupos significativamente diferentes (p≤0.05) se indicaron con letras diferentes (a, b, c, d, e o f). 83 90 complejo de inclusión pMicGal-Sorafenib registrado en DMSO-d6. (d) Estudio por RMN de protón de la inclusión del tosilato de Sorafenib dentro de la cavidad hidrofóbica de pMicMan. (1) Espectro del tosilato de sorafenib registrado en D2O, (2) Espectro del tosilato de sorafenib registrados en DMSO-d6 (3) Espectro del complejo de inclusión pMicMan-tosilato de sorafenib registrado en D2O, (4) Complejo de inclusión pMicMan-tosilato de sorafenib registrado en DMSO-d6 Carga de sorafenib y eficacia de encapsulación de las nanomicelas pMicMan y pMicGal pMicMan y pMicGal presentan una cavidad interna hidrofóbica formada por la cola hodrocabonada del neoglicolípido, rodeada por restos de PEG y azúcar. El área hidrófoba interna de estas micelas puede albergar moléculas huésped hidrófobas como agentes citotóxicos, agentes de imagen, nanopartículas metálicas u otras biomoléculas [30]. Como tales, pMicMan y pMicGal pueden operar como nanovectores generales para fármacos o candidatos a fármacos poco hidrosolubles que, actualmente, representan el 40-70% de nuevas entidades químicas descubiertas mediante cribado de alto rendimiento. Para este estudio, se añadió sorafenib a una solución de micelas pMicMan o pMicGal en agua milliQ, y se agitó durante 24 h a 54 ° C. La mezcla así obtenida se centrifugó dos veces a 1500 rpm durante 20 minutos para eliminar el fármaco libre y el sobrenadante se liofilizó y se pesó. La cantidad de droga incorporada se determinó mediante HPLC-LS tras la lisis con DMSO del nanovector cargado con fármaco, así como mediante la diferencia de masa entre la micela cargada y la micela vacia. El contenido de fármaco incoporado (DL) y la eficiencia de encapsulación (EE) se calcularon a partir de las siguientes ecuaciones (1) y (2). 𝐸𝐸(%)=𝐶𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑎𝑐𝑡𝑢𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑟𝑜𝑔𝑎 𝐶𝑎𝑟𝑔𝑎 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑥100 (1) 91 𝐷𝐿(%)= 𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑑𝑟𝑜𝑔𝑎 𝑎ñ𝑎𝑑𝑖𝑑𝑎 𝑃𝑀 𝑑𝑒𝑙 𝑚𝑜𝑛ó𝑚𝑒𝑟𝑜 1 + 𝑃𝑀 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑖𝑐𝑒𝑙𝑎 𝑥100 (2) pMicMan presenta un contenido máximo de DL del 63% y un EE del 50% para sorafenib. Asimismo, pMicGal presenta una DL máxima del 42% y una EE del 43%. Sin embargo, hemos comprobado que, utilizando un contenido de carga más bajo, 18% para pMicMan y 13% para pMicGal, se puede lograr una liberación controlada sostenible. Se obtuvo una confirmación adicional de que los fármacos están realmente encapsulados por las micelas mediante el análisis de protón (1HNMR), como se muestra en la figura 6 (c) utilizando pMicGal como nanoportador hidrófobo protegido. Los espectros 1HNMR de micelas pMicGal vacías, micelas pMicGal-sorafenib y sorafenib libre se registraron en D2O y en DMSO-d6 (Figura 6c). Como se muestra en la Figura 6c1 y 6c2, los espectros de las micelas vacías en D2O y DMSOd6 contienen básicamente las señales, correspondientes al monómero 2. El espectro de las micelas pMicGal cargadas con sorafenib registrado en D2O es muy similar al de las micelas vacías (Figura 6c3), sin ninguna señal característica de sorafenib. Sin embargo, al registrar el espectro de las micelas cargadas con sorafenib en DMSOd6 (Figura 6c4), se observan señales adicionales en la zona aromática que coinciden con el espectro de sorafenib junto con las señales de la micela. Aún más indicativos de la capacidad de estas nanomicelas para encapsular sorafenib, son los experimentos llevados a cabo con el tosilato de sorafenib realizando la incorporación de este en ambos vectores. Como ejemplo ilustrativo, la figura 6d recopila los resultados con el nanovector pMicMan y todilato de sorafenib. La diferencia observada en este caso respecto a la inclusión de sorafenib en pMicGal es la aparición de un sistema AB en la zona aromática cuando se toma el espectro en agua deuterada 92 (compárese figura 6c3 y 6d3). Este sistema, que corresponde a los protones aromáticos del grupo tosilo, indica claramente que las micelas son capaces de disociar sorafenib del grupo tosilo y dejar encapsulado sorafenib sin el grupo tosilo. Tomados en conjunto, estos resultados muestran claramente la capacidad de las micelas para funcionar como nanocontenedores para almacenar compuestos altamente hidrofóbicos dentro de su área hidrofóbica protegida. Expresión del MR y ASGPR en células HepG2 y Huh7 Se ha demostrado que MR (87) y ASGPR (88) se expresan principalmente en la superficie de las células HepG2. Nuestro estudio confirmó que MR (Figura 7a) y ASGPR (Figura 7b) se expresan en hepatocitos humanos primarios, células HepG2 y Huh7. La expresión de MR es mayor que la expresión de ASGPR. Figura 8. Expresión de MR (a) y ASGPR (b) en hepatocitos humanos primarios, células HepG2 y Huh7. Se utilizaron diferentes pases de HepG2 y Huh7. La expresión de MR y ASGPR se evaluó mediante análisis de Western-Blot descrito en Material y Métodos. 93 Liberación de sorafenib en pMicMan y pMicGal con baja y alta saturación de fármaco En primer lugar, se determinó la estabilidad de nuestras preparaciones según el grado de saturación con sorafenib. La administración de sorafenib (10 µM) con saturación alta y baja de pMicMan con sorafenib liberó 76% y 35% de su contenido de fármaco al medio de cultivo (24 horas), respectivamente (Figura 8a). La administración de sorafenib (10 µM) con saturación de pMicGal con sorafenib alta y baja liberó 77% y 39% de su contenido al medio de cultivo (24 horas), respectivamente (Figura 8b). En consecuencia, se seleccionó un bajo grado de saturación de ambas nanomicelas para dilucidar sus actividades proapoptóticas y antiproliferativas. También estudiamos la reducción del pH de 7,5 a 4,5 y observamos un aumento adicional en la liberación de sorafenib del 7% y el 24% para pMicMan y pMicGal (24 horas), respectivamente (Figura 8c y 8d). 94 95 Figura 9. Cinética de liberación del sorafenib in vitro de sa carga alta y baja de pMicMan (a) y pMicGal (b). Una carga baja a pH 7,4 y 4,5 de pMicMan (c) y pMicGal (d). El sorafenib se midió usando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). 96 Impacto de pMicMan y pMicGal cargado con sorafenib en la actividad de la caspasa-3 y la proliferación celular Anteriormente nuestro grupo de investigación ha demostrado que la inducción de estrés ER por sorafenib (10 µM) indujo la apoptosis y redujo la proliferación celular en las células HepG2 (88). La administración de pMicMan con sorafenib (pMicMansorafenib) pero no pMicGal con sorafenib (pMicGal-Sorafenib) (10 y 20 nM) fue capaz de aumentar la caspasa-3 (Figura 9a) o reducir la proliferación celular (Figura 9b) en células HepG2 en comparación con las falta de actividad en las células tratadas con fármaco no vectorizadas correspondientes (24 horas) (p≤0,05). Los valores de actividad caspasa-3 e incorporación de BrdU inducida por pMicMan y pMicGal con sorafenib se obtuvieron después de restar el valor correspondiente de nanomicelas vacías sin fármaco (Figura 9a y 9b, respectivamente). 97 Figura 10. Inducción de caspasa-3 (a) y reducción de la proliferación celular (b) por sorafenib no vectorizado, sorafenib que contiene pMicMan y pMicGal en células HepG2. La actividad caspasa-3 y la incorporación de BrdU se determinaron según se describe en la sección de Material y Métodos. La línea celular Huh7 fue tratada en las mismas condiciones de sorafenib. La administración de sorafenib a través de los vectores de transporte pMicMan y pMicGal, indujo un aumento en la caspasa-3 en comparación con el fármaco no vectorizado (Tabla 1). Caspasa-3 (Arbitrary Units/mg protein) 0 nM 10 nM 20 nM Control 1±0,19 Sorafenib 1±0,18 1±0,10 1,03±0,08 pMicMan- Sorafenib 1,04±0,09 1,11±0,11 1,14±0,12 pMicGal- Sorafenib 1,06±0,14 1,07±0,10 1,09±0,11 Tabla 3. Actividad caspasa-3 inducida por sorafenib no encapsulado, pMicMan con sorafenib (pMicMan-Sorafenib) y pMicGal con sorafenib (pMicGal-Sorafenib) en células Huh7. Tráfico de pMicMan y pMicGal en células HepG2 Se utilizó FM 1-43 para evaluar la internalización endosomal de pMicMan y pMicGal en células HepG2 (Figura 10a). Se utilizaron micelas vacías para estos experimentos. La inhibición de los mecanismos de internalización de la endocitosis se evaluó mediante dynasore y citocalasina D. pMicMan y pMicGal se incorporaron activamente a través de mecanismos endosomales, siendo su incorporación más afectada por la inhibición de dinamina usando dynasore que por la inhibición de la polimerización de actina usando citocalasina D (Figura 10b). 98 Figura 11. (a) Incorporación endosomal de pMicMan y pMicGal por inmunofluorescencia usando nanomicelas que contienen FM 1-43. (b) La incorporación endosomal se inhibió preincubando las células durante 10 minutos con dynasore (80 µM) o citocalasina D (8 µM). La incorporación de rojo del Nilo a nanomicelas permite valorar el grado de incorporación celular y tráfico a compartimentos específicos utilizando marcadores 99 endosomales (anti-EEA1), lisosomales (anti-Lamp1) y autofagosómicos (anti-BECN1) mediante inmunofluorescencia. La incorporación endosomal de pMicMan y pMicGal se inhibió a 4ºC en comparación con la observada a 37ºC (Figura 11a). Además, los resultados mostraron que pMicMan se colocalizó extensamente a nivel endosómico y lisosómico, mientras que pMicGal se colocalizó extensamente a nivel autofagolisosómico en relación con las contrapartes correspondientes (6 horas) en HepG2 (Figura 11b). 106 que incluyen hipertensión, hemorragia y problemas gastrointestinales que implican la interrupción del tratamiento, pero generalmente se relacionan con la eficacia clínica (97). La reducción del perfil de efectos secundarios se puede lograr mediante el uso de sistemas de administración de fármacos pasivos, capaces de aumentar la permeabilidad y el tiempo de circulación y la acumulación preferencial en el tejido tumoral a través del llamado efecto de permeación y retención (efecto EPR). Este efecto es una consecuencia del aumento de la vascularización, la arquitectura vascular defectuosa y el drenaje linfático deficiente. Diferentes terapias basadas en nanopartículas, incluidos liposomas, partículas basadas en albúmina, micelas poliméricas y nanopartículas poliméricas administradas a los pacientes, pueden mejorar la seguridad y eficacia de los fármacos (53,98,99). En este sentido, Jiu et al. han desarrollado y comparado varios modelos de nanopartículas biocompatibles cargadas con sorafenib, como los liposomas de ácido poli(láctico-co-glicólico) (PLGA), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), y liposomas hidrófobos de DPPC recubiertos con quitosano modificado (HMC) para optimizar la administración de fármacos y la inducción de la muerte celular en células de carcinoma de células renales con histología de células metastásicas humanas (100). El estudio mostró que las partículas de PLGA cargadas con sorafenib y los liposomas de DPPC recubiertos con HMC exhibieron una destrucción celular significativamente aumentada en comparación con sorafenib solo en concentraciones más bajas (100). Sin embargo, sorafenib incorporado a nanopartículas de dextrano y PLGA, así como al silicio poroso funcionalizado con el tripéptido arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) como ligando, mostró una actividad antiproliferativa similar a la del sorafenib en el colangiocarcinoma humano [HuCC -T1] (101) y células endoteliales EA.hy926 (102), respectivamente. Otro estudio mostró que la estrategia basada en la incorporación de sorafenib en microesferas de PLGA co-encapsulando en nanopartículas ferromagnéticas 107 de óxido de hierro redujo la proliferación celular in vitro y redujo la densidad de microvasos y el área tumoral después de la infusión transcatéter en un modelo experimental basado en el ortotópico implantación de células de hepatoma de rata McA- RH7777 en ratas (103). La generación de nanodiamante recubierto de lípidos anfifílicos, como una nueva nanopartícula derivada de carbono, que incorpora sorafenib demostró un aumento de la concentración de sorafenib de 14,95 veces en el tejido tumoral y un efecto de inhibición eficaz del crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto tumoral mediante inyección subcutánea de BGC-823 células de cáncer gástrico en ratones Balb c inmunodeprimidos (104). También se han desarrollado nanopartículas poliméricas duales cargadas con sorafenib. En este sentido, un núcleo de nanopartículas de polímero híbrido altamente complejo y multifuncional constituido por PLGA y funcionalizado con nanocristales de oro que sirven como andamios para que la doxorrubicina cargada sea recubierta adicionalmente con fosfolípidos ordinarios y fosfolípidos PEGilados (proporción 7/3) los cuales encapsulan sorafenib y PEG-etiquetado con fluoróforos Cy7 para obtener imágenes por fluorescencia del infrarrojo cercano (NIRF), da lugar a una viabilidad celular reducida en líneas celulares de cáncer de vena umbilical humana (HUVEC) (42%) y colon (LS174T) (72%) (24 horas), así como acumulación en el tumor derivado de LS174T en ratones desnudos (105). Otra nanopartícula combinada doble constituida por behenato de glicerilo, fosfatidilcolina de huevo y poloxámero 188 que incorporan sorafenib mostró un comportamiento farmacocinético satisfactorio tras la administración in vivo de acuerdo con la liberación sostenida del fármaco y la alta biodisponibilidad (106). De manera similar, la encapsulación de sorafenib en nanopartículas lipídicas sólidas utilizando palmitato de cetilo como matriz lipídica (6,35 µM) mostró un efecto citotóxico significativo del 40% después de 72 h de incubación en células HepG2 (89). 108 Una gran variedad de factores puede alterar el EPR y tener un efecto negativo sobre la acumulación de nanopartículas en tumores, como la vasculatura del tumor, la presión arterial y el tipo de tumor (lesión primaria frente a lesión metastásica) y ubicación. En consecuencia, el direccionamiento activo mediante la incoporación de un ligando de direccionamiento en las nanopartículas proporciona una terapia más eficaz. Diferentes estudios han desarrollado alternativas que involucran el direccionamiento específico hacía tumores de nanovectores utilizando anticuerpos, péptidos y ligandos con bajo peso molecular (107). Aunque la mayoría de los sistemas de administración de fármacos activos desarrollados para el tratamiento del HCC han utilizado el ASGPR como diana, (53,98) pocos se han utilizado para transportar sorafenib. Entre estos se encuentran las micelas poliméricas derivadas del conjugado polilactida-poliaminoácido galactosilado desarrollado por Craparo et al. (111). Los estudios de biodistribución en ratones demostraron, después de la administración oral de micelas recubiertas de galactosa cargadas con sorafenib, la acumulación preferencial de sorafenib en el hígado (112). Tunki et al (109), han utilizado nanopartículas sólidas de lípidos (SLN) unidas con polietilenglicol (PEGilado) recubiertos de galactosa como sistema de administración del fármaco. Estos sistemas llamados GAL-SSLN fueron cargados con sorafenib y mostraron una citotoxicidad y apoptosis superiores en HepG2 que el sorafenib solo (63). Guan et al (61), por su parte, utilizaron unas nanopartículas de sílice mesoporosas recubiertas con ácido lactobiónico como ligando las cuales se dirigen a ASGPR. Las nanopartículas sensibles al pH utilizadas han mostrado buenos resultados en la co-liberación de sorafenib y ácido ursólico y aumento de la apoptosis celular y regulan negativamente la expresión de proteínas EGFR y VEGFR2 relacionadas con la proliferación celular y la angiogénesis tumoral (113). 109 También se han utilizado otros ligandos para funcionalizar nanovectores hacía células de HCC, así como combinar sorafenib con otras moléculas citotóxicas. La combinación de doxorrubicina y sorafenib en nanopartículas estructuradas núcleo-capa híbridas de lípido-polímero funcionalizada con el tripéptido RGD (Arginina-Glicina- Asparagina) indicó una eficacia antitumoral mejorada en modelos de hepatocarcinogénesis in vivo con una biodisponibilidad mejorada y un tiempo de circulación más prolongado (114). Wang et al. han utilizado nanopartículas recubiertas de lípidos modificadas con RGD (Arginina-Glicina-Asparagina) para la administración conjunta de sorafenib y quercetina contra células de HCC. Estas nanopartículas modificadas con péptido RGD lograron el efecto de inhibición del crecimiento tumoral más significativo in vitro e in vivo (111). La sobreexpresión de los receptores de transferrina en las células de HCC ha permitido que puedan ser vías de funcionalización útiles para la vehiculización de fármacos (112). Malarvizhi et al (116) han desarrollado un nanovector de núcleo-capa funcionalizado a transferrina que encapsula doxorrubicina y sorafenib, y demostraron un efecto sinérgico en el HCC (113). Otro receptor importante de tipo lectina es el MR que se encuentra expresado en macrófagos, células dendríticas y células endoteliales. Este receptor se ha utilizado para el transporte de fármacos manosilados, vectores de genes y antígenos. Aunque se ha demostrado que estos sistemas de transportes de fármacos son eficaces contra las células cancerosas de pulmón, colon y mama, no se ha demostrado la eficacia de los DDS manosilados contra las células del HCC. Además, la incidencia del MR en las enfermedades hepáticas es generalmente poco conocida, lo que sugiere una expresión débil de este receptor en las células hepáticas. Nuestro estudio muestra, sin embargo, que el MR se expresa en los hepatocitos humanos primarios, y las células tumorales HepG2 y Huh7, sino que se expresa más que 110 el ASPGR, que se usa con frecuencia como diana para la administración de nanofármacos al hígado, lo que abre las puertas para su uso como vía de vehiculización de fármacos. Con el fin de revelar si esta característica estructural también es funcional y para validar MR como objetivo para los sistemas de administración de fármacos al HCC, utilizamos dos gliconanovectores pMicMan y pMicGal que exponen manosa y galactosa en su superficie. Estos nanovectores se obtuvieron mediante un enfoque ascendente (bottomup) altamente convergente, en el que el paso clave es la fotopolimerización de monómeros autoasociados que refuerza la parte interna de las nanomicelas aumentando su estabilidad frente a la dilución. Todas las reacciones llevadas a cabo para realizar la síntesis de ambas micelas se han purificado posteriormente para aumentar la actividad de estas. En cada una de las reacciones se realizaron cromatografías de capa fina en gel de sílice, con las cuales controlamos la reacción, tal y como se describe en la metodología. Las micelas se caracterizaron adecuadamente a través de RMN, DLS y TEM. Si bien estos nanovectores han mostrado una alta capacidad de carga de sorafenib, hemos seleccionado una carga baja de sorafenib para realizar nuestros estudios con el fin de minimizar el efecto de la liberación espontánea del fármaco antes de la incorporación a la célula (Figura 8). Curiosamente y en contraste con estudios previos en los que el sorafenib vectorizado era activo en el rango µmolar, la administración de pMicMan, pero no el fármaco incorporado a pMicGal, pudo aumentar la caspasa-3 o reducir la proliferación celular en el rango nanomolar (10-20 nM, 24 horas) en células HepG2 y Huh7 (Figura 9a y 9b). El sorafenib no vectorizado no aumentó la muerte celular ni alteró la proliferación celular en el rango nanomolar en las células HepG2 y Huh7 (p ≤0.05). La principal actividad de sorafenib incorporado a pMicMan estaba relacionada con una mayor incorporación celular vía endosomal (Figura 10). 111 Las células pueden absorber macromoléculas del medio circundante por endocitosis, ya sea a través de endocitosis mediada por receptores en fosas recubiertas de clatrina, internalizadas y generando vesículas recubiertas de clatrina, o bien a través de vías de endocitosis independientes de clatrina basadas en las invaginaciones en caveolas. (114). La formación e internalización de fosas recubiertas de clatrina implica la participación del citoesqueleto de F-actina, (115) así como el proceso de formación de vesículas recubiertas de clatrina depende de la energía y requiere múltiples proteínas de unión a GTP como la dinamina (116). El endosoma temprano permite la endocitosis de material que será posteriormente reciclado de nuevo a la membrana plasmática o secretado, así como degradado por fusión con el lisosoma en pasos posteriores. El uso de FM 1-43 nos permitió rastrear la incorporación endosomal de las nanomicelas. La incorporación endosomal de pMicMan y pMicGal se evitó a 4ºC en comparación con la incubación de las células a 37ºC (Figura 11). La incorporación de pMicMan y pMicGal en menor grado, si se ve muy afectada por el uso de dynasore y citocalasina D, lo que sugiere que vesículas recubiertas de clatrina está involucrado en el proceso de internalización de nanomicelas (Figura 10). La incorporación de rojo del Nilo a nanomicelas permitió la evaluación de su incorporación celular y tráfico a compartimentos específicos utilizando marcadores endosomales (anti- EEA1), lisosomales (anti-Lamp1) y autofagosómicos (anti-BECN1) que fueron valorados por inmunofluorescencia. pMicMan parecía estar colocalizado a nivel endosómico y lisosómico, mientras que pMicGal estaba colocalizado a nivel autofagolisosómico (Figura 11). Curiosamente, el derivado de BODIPY, el cual se caracteriza por sus tres brazos conjugados con unidades de manosa co-ensambladas con Tween 80 para terapia fotodinámica dirigida, también ingresa a la célula a través de endocitosis mediada por 112 MR con acumulación preferencial en los lisosomas en el cáncer de mama MDA-MB-231 (117). En nuestras condiciones, la inhibición de la degradación lisosomal mediante cloroquina aumentó la actividad de caspasa-3 y redujo la proliferación celular con pMicMan, y en menor grado con pMicGal, en HepG2 (Figura 12). Estos datos sugieren que la degradación lisosomal impacta en la eficacia del fármaco en células HepG2. La reducción del pH de 7,4 a 4,5 indujo la liberación in vitro de sorafenib de los nanovectores pMicMan y pMicGal (Figura 8c y 8d). Se ha observado que la incorporación de fármacos en nanovectores que son captados por lisosomas perinucleares se liberar al espacio intracelular (118). 113 114 CONCLUSIONES 115 1) Los nanovectores dirigidos a MR (pMicMan) y ASGPR (pMicGal) son útiles para la encapsulación de sorafenib. 2) La incorporación de sorafenib (10 nM) a nanovectores dirigidos selectivamente a MR (pMicMan) induce apoptosis y reduce la proliferación celular 3) La mayor efectividad de pMicMan en relación con los nanovectores dirigidos a ASGPR (pMicGal) se relaciona con su mayor capacidad de incorporación celular vía endosomal. 4) La liberación de sorafenib se promueve en pH ácido compatible con las condiciones de lisosomas y los autogagolisosomas. 122 sorafenib-loaded poly (Lactic/Glycolic) acid and dppc liposome nanoparticles in the in vitro treatment of renal cell carcinoma. J Pharm Sci. 2015;104(3):1187–96. 59. Mieszawska AJ, Kim Y, Gianella A, Van Rooy I, Priem B, Labarre MP, et al. 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Published by Cell Physiol Biochem Press GmbH&Co. KG Navarro-Villarán et al.: Role of Immunosuppressant and FK506-Binding Protein Complex in Liver Cancer Original Paper Accepted: 29 March 2020 This article is licensed under the Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License (CC BY-NC-ND). Usage and distribution for commercial purposes as well as any distribution of modified material requires written permission. DOI: 10.33594/000000230 Published online: 6 May 2020 © 2020 The Author(s) Published by Cell Physiol Biochem Press GmbH&Co. KG, Duesseldorf www.cellphysiolbiochem.com Molecular Pathways Leading to Induction of Cell Death and Anti-Proliferative Properties by Tacrolimus and mTOR Inhibitors in Liver Cancer Cells Elena Navarro-Villarána,b Patricia de la Cruz-Ojedaa Laura Contrerasa,c Raúl Gonzáleza,b María Negretea María A. Rodríguez-Hernándeza,b Luís M. Marín-Gómeza,b,d José M. Álamo-Martíneza,b,d Antonio Calvoe Miguel A. Gómez-Bravoa,b,d Jesús de la Cruza,c Javier Padilloa,b,d Jordi Muntanéa,b,d aInstitute of Biomedicine of Seville (IBiS), Hospital University “Virgen del Rocío”/CSIC/University of Seville, Seville, Spain, bNetworked Biomedical Research Center Hepatic and Digestive Diseases (CIBEREHD o Ciberehd), Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spain, cDepartment of Genetics, University of Seville, Seville, Spain, dDepartment of General Surgery, Hospital University “Virgen del Rocío”/CSIC/ University of Seville/IBiS, Seville, Spain, eDepartment of General Surgery, Hospital University of Puerto Real, Puerto Real, Spain Key Words Apoptosis • Autophagy • Endoplasmic reticulum stress • Immunosuppressants • Hepatocarcinoma Abstract Background/Aims: Orthotopic liver transplantation (OLT) is the recommended treatment for patients at early stages of hepatocarcinoma (HCC) with portal hypertension and/or increased bilirubinemia, but without vascular-associated diseases. Tumor recurrence, which is the main drawback for the survival of patients submitted to OLT for HCC, has been related to tumor-related variables and the immunosuppressive therapies. We have previously shown that Tacrolimus (FK506) exerts a more potent pro-apoptotic and anti-proliferative effects than the mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitors (Sirolimus and Everolimus) in liver cancer cells. This study identified the role of the immunosuppressant partners such as FK506-binding proteins (FKBPs) in the induction of cell death and arrest of cell proliferation by immunosuppressants in two representative liver cancer cells. Methods: The regulation of endoplasmic reticulum (ER) stress, apoptosis/autophagy, cell proliferation, and FKBPs expression was determined in Tacrolimus-, Sirolimus- and Everolimus-treated primary human hepatocytes, and hepatoma HepG2 and Huh7 cell lines. The functional repercussion of FKBPs on cell death and proliferation was also addressed using the siRNA technology. The assessed Jordi Muntané Ph.D. Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario “Virgen del Rocío”/CSIC/ Universidad de Sevilla, Av. Manuel Siurot s/n, 41013-Seville (Spain) Tel. +34-955923122, Fax +34-955923002, E-Mail [email protected] R. González, M. Negrete and M. A. Rodríguez-Hernández contributed equally to this study. Cell Physiol Biochem 2020;54:457-473 DOI: 10.33594/000000230 Published online: 6 May 2020 458 Cellular Physiology and Biochemistry Cellular Physiology and Biochemistry © 2020 The Author(s). Published by Cell Physiol Biochem Press GmbH&Co. KG Navarro-Villarán et al.: Role of Immunosuppressant and FK506-Binding Protein Complex in Liver Cancer antitumoral properties of the immunosuppressants were associated to microRNAs (miRNAs) pattern. Results: The enhanced pro-apoptotic and anti-proliferative properties of Tacrolimus versus mTOR inhibitors were associated with increased protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK)-related ER stress, Ser15P-p53/p53 ratio and p21 protein expression that may counterbalance the risk of proliferative upregulation caused by enhanced Thr172P-Cdk4/ Cdk4 activation in liver cancer cells. The inhibition of the mTOR pathway by Sirolimus and Everolimus was related to an induction of autophagy; and at a high dose, these drugs impaired translation likely at a very early step of the elongation phase. Tacrolimus and mTOR inhibitors increased the protein expression of FKBP12 and FKBP51 that appeared to play pro-survival role. Interestingly, the administration of immunosuppressants yields a specific pattern of miRNAs. Tacrolimus and mTOR inhibitors decreased miR-92a-1-5p, miR-197-3p, miR-483-3p and miR- 720, and increased miR-22-3p, miR-376a-3p, miR-663b, miR-886-5p, miR-1300 and miR-1303 expressions in HepG2 cells. Conclusion: The more potent pro-apoptotic and anti-proliferative properties of Tacrolimus versus mTOR inhibitors were associated with an increased activation of PERK and p53 signaling, and p21 protein expression. FKBP12 and FKBP51 appeared to be the most relevant partners of Tacrolimus and mTOR inhibitors exerting a pro-survival effect in HepG2 cells. The observed effects of immunosuppressants were related to a specific miRNA signature in liver cancer cells. Introduction Hepatocellular carcinoma (HCC) has been the sixth most common neoplasia in the world, and the fourth most common cause of cancer-related mortality worldwide during 2018 [1]. HCC is the main primary malignancy in the liver causing death in cirrhotic patients [2]. The performance status and hepatic function of the patient, number and size of the nodules, tumor vascular invasion, and the presence of extrahepatic metastasis, are actually used for the staging, prognosis as well as the therapeutic recommendation to the patients with HCC [3]. The curative treatments such as ablation, resection and orthotopic liver transplantation (OLT) are indicated at the very early stage (Barcelona Clinic Liver Cancer or BCLC 0) and early stage (BCLC A) of the disease characterized by the presence of 1-3 tumors less than or equal to 3 cm diameter, good liver function (Child-Pugh A-B), asymptomatic (Performance Status or PS 0), and absence of vascular invasion and extrahepatic metastases. OLT is indicated in patients with potential portal hypertension and/or bilirubinemia, but without vascular-associated diseases [3]. The patients subjected to OLT receive immunosuppressive therapy with Cyclosporin A, Tacrolimus (FK506) or mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitors (Rapamycin or Sirolimus, and Everolimus) to reduce graft rejection. Immunophilins consist of a family of highly conserved proteins that binds to immunosuppressive drugs such as Cyclosporin A, Tacrolimus, and mTOR inhibitors. Cyclophilins and FK506-binding proteins (FKBPs) are the major immunophilins that binds to Cyclosporin A, or Tacrolimus and mTOR inhibitors, respectively [4]. FKBPs are involved in numerous cellular functions, such as protein folding, protein stability, kinase activity, receptor signaling, and protein trafficking, as well as play a role in cancer and chemoresistance [5]. Tacrolimus inhibits antigen receptor-dependent T cell proliferation through binding to the conserved active sites of the canonical FKBP members (FKBP12, FKBP51 and FKBP52), inhibiting its peptidylprolyl cis/trans isomerase (PPIase) activity [6], but also the phosphatase activity of Calcineurin, thereby preventing the calcium/calmodulin-dependent Calcineurinrelated dephosphorylation of the nuclear factor of activated T cells (NFAT). The process downregulates the expression of IL-2, protooncogenes (H-RAS, c-MYC) and receptors for cytokines (IL-2 receptor) in T cells [7]. While binding to the same FKBP partners, Sirolimus and Everolimus exert their immunosuppressive properties by preventing IL-2-dependent T cell proliferation [8]. The immunosuppressive properties of the FKBP/Sirolimus complex are related to the interaction with the mTOR complex [9, 10]. © 2020 The Author(s). Published by Cell Physiol Biochem Press GmbH&Co. KG Cell Physiol Biochem 2020;54:457-473 DOI: 10.33594/000000230 Published online: 6 May 2020 459 Cellular Physiology and Biochemistry Cellular Physiology and Biochemistry © 2020 The Author(s). Published by Cell Physiol Biochem Press GmbH&Co. KG Navarro-Villarán et al.: Role of Immunosuppressant and FK506-Binding Protein Complex in Liver Cancer The aim of the study was the identification of the role of FKBPs in the induction of cell death and anti-proliferative properties induced by immunosuppressants in liver cancer cells. The present study showed that the increased pro-apoptotic and anti-proliferative properties induced by Tacrolimus versus mTOR inhibitors were due to an enhanced protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK)-related endoplasmic reticulum (ER) stress. However, the administration of mTOR inhibitors increased autophagy markers compared to Tacrolimus treatment in HepG2 and Huh7 cell lines. We have also performed siRNA functional studies which showed that FKBP12 and FKBP51 mediate cell survival in immunosuppressive-treated HepG2 cells. We have observed a specific signature of microRNAs (miRNAs) expression upon treatment of HepG2 cells with Tacrolimus and mTOR inhibitors that was associated with the induction of apoptosis and anti-proliferative properties of the treatments. Materials and Methods Drugs Tacrolimus (Ref AT23293, Carbosynth Limited, Berkshire, United Kingdom), Sirolimus (Ref 37094, Sigma-Aldrich, Sant Louis, Missouri, USA), and Everolimus (Ref FE23209, Carbosynth Limited) were dissolved in DMSO (95.8, 91.5 and 80.4 µg/µl, respectively) in order to obtain working solution useful for all the experimental work. Primary human hepatocytes, cell lines and culture conditions Human hepatocytes were prepared from healthy portions of liver resections obtained from three patients (two men and one woman, aged 63±5.2 years) submitted to surgical resection for liver metastasis from colorectal cancer. Isolation of human hepatocytes was based on a two-step collagenase procedure [11]. HepG2 (HB-8065™) cells were obtained from ATCC/LGC Standards (Barcelona, Spain). Huh7 cells were obtained from Apath LLC (New York, New York, USA). Both cells lines were negative for mycoplasma contamination. Cells (100000 cells/cm2) were cultured in MEM with Earle’s salts with L-glutamine (Ref E15-825, PAA Laboratories Inc, Toronto, Ontario, Canada) with 10 % FBS (F7524, Sigma-Aldrich, Lot No: 022M3395, endotoxin <0.2 EU/ml), sodium pyruvate (1 mM) (Ref S11-003, PAA Laboratories Inc), nonessential amino acids (Ref M11-003, PAA Laboratories Inc), Penicillin-Streptomycin solution (100 U/mL- 100 μg/ml) (P11-010, PAA Laboratories Inc), at 37°C in a humidified incubator with 5 % CO2. Drugs were added at a broad range of concentrations (0, 10 nM, 10 µM and 100 µM) 24 h after plating. Cell lysates were obtained at different time points according to the assays. Measurement of apoptosis Caspase-3-associated activity was determined using caspase-Glo® 3 assay systems (G8091, Promega, Fitchburg, Wisconsin, USA). Cells were treated with caspase-Glo® 3 reagent in an “add-mix-measure” format resulting in cell lysis, caspase-3-dependent cleavage of the substrate and generation of a “glow-type” luminescent signal. The signal generated is proportional to the amount of caspase-3 activity. The values are extrapolated into a calibration curve included in the assay. Chemiluminiscence was measured using an Infinite 200 PRO Microplate Reader (TECAN, Männedorf, Switzerland). Evaluation of protein expression markers related to ER stress, autophagy, cell cycle, apoptosis and FKBPs Cells were treated with lysis solution including 50 mM HEPES pH. 7.5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, commercial proteases inhibitor cocktail (P8340-5 ml, Sigma-Aldrich), 1 mM PMSF, 1 mM NaF and 1 mM Na3VO4. Protein expression was determined by SDS-PAGE coupled to Western-blot analysis. Proteins (50-100 mg) were separated by Any kD™ Criterion™ TGX Stain-Free™ Protein Gel, 18 well, 30 µl (#5678124, BioRad, Hercules, California, USA) and transferred to PVDF membranes. The membranes were incubated with the corresponding commercial primary and secondary antibodies coupled to horseradish peroxidase revealing protein content by Clarity™ Western ECL substrate (Ref 170-5061, BioRad) and analyzed in a ChemiDoc™ Touch Imaging System. Antibodies for Western-blot were obtained commercially and included 4E-BP1 (#9452), Thr37/Thr46P-4E-BP1(#9459), Cdk4 (#12790), eIF2α (#5324), Ser51P-eIF2α (#9721) Cell Physiol Biochem 2020;54:457-473 DOI: 10.33594/000000230 Published online: 6 May 2020 460 Cellular Physiology and Biochemistry Cellular Physiology and Biochemistry © 2020 The Author(s). Published by Cell Physiol Biochem Press GmbH&Co. KG Navarro-Villarán et al.: Role of Immunosuppressant and FK506-Binding Protein Complex in Liver Cancer and Ser15P-p53 (#9284) obtained from Cell Signaling Technology (Danvers, Massachusetts, USA); LC3 (PM036) purchased from MBL International (Woburn, Massachusetts, USA); GADD153 (C/EBP homologous protein or CHOP) (sc-575), Beclin (sc-48341), p21 (sc-397) and p53 (sc-6243) obtained from Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas, USA); Thr172P-Cdk4 (PA5-64482) obtained from ThermoFisher (Waltham, Massachusetts, USA); FKBP12 (Ref NB300-508) and FKBP38 (Ref NBP1-77909) obtained from Novus Biologicals (Centennial, Colorado, USA); and FKBP51 (Ref MAB4094) and FKBP52 (Ref MAB4095) obtained from R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, USA). The corresponding secondary antibodies anti-rabbit (sc-2004), anti-mouse (sc-2005) and anti-goat (sc-2768) IgG-HRP labelled were purchased from Santa Cruz. Densitometric analysis was performed using the software Image Lab 6.0 of BioRad. Cell proliferation assay The measurement of bromodeoxyuridine (BrdU) incorporation was used as marker of cell proliferation (Ref 11 647 229 001, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Cells were seeded at low density (12500 cells/cm2) at 37°C in a humidified incubator with 5 % CO2. After 24 h of stabilization cells were treated with drugs including corresponding controls without BrdU. Two hours before evaluation of cell proliferation (12 h) 20 µl of BrdU (10 µM) was added to culture. DNA was denaturalized with 200 µl FixDenat solution included in the commercial assay for 30 min a room temperature. After removal, cells were incubated with 100 µl monoclonal anti-BrdU antibodies conjugated with horseradish peroxidase for 90 min at room temperature. Afterwards, cells were washed with phosphate buffer saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4), and incubated with 100 µl revealing solution including hydrogen peroxide, luminol and 4-iodophenol for 15 min at room temperature. Absorbance was measured at 370 nm, using as reference wavelength 492 nm, and with an Infinite 200 PRO Microplate Reader (TECAN, Männedorf, Switzerland). Assessment of protein translation The protocol for polysome preparation of liver cancer cells was adapted from that we routinely employ for yeast cells [12]. Cells were grown up to 80 % confluency in 150 cm2 dishes. Before cell harvesting, 200 µg/ml cycloheximide was added and incubated for 5 min at 37°C. Each dish was then placed on ice, the medium was collected, and the cultures washed twice with PBS without Ca2+ and Mg2+ containing 200 µg/ml cycloheximide. Then, 800 µl of lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 200 µg/ml cycloheximide, 200 µg/ml heparin, 2 mM DTT, 0.5 % NP40) was added to one dish, cells were scrapped, and transferred to the second dish. Cell lysate was incubated at 4°C with gentle endover-end rotation for 10 min and then centrifuged at 12000 g for 8 min at 4°C in a refrigerated microfuge. The corresponding supernatants were recovered and the A260 measured using a NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). About 10 absorption units of A260 were layered on top of 7-50 % (w/v) sucrose gradients prepared in 50 mM Tris-acetate, pH 7.5, 50 mM NH4Cl, 12 mM MgCl2, 1 mM DTT. The gradients were centrifuged at 260110 g (39000 rpm) in a Beckman SW41 rotor at 4°C for 2 h 45 min. The dissociation of the vacant 80S ribosomes was achieved by addition of high-salt (0.25 M NaCl) concentration within the gradients. Gradient analysis was performed with an ISCO UA-6 system (Isco, Inc. Lincoln, NE, USA) equipped to continuously monitor the A254. Regulation of FKBP expression by siRNA technology Cells were seeded the day before the experimental intervention to reach 60 % confluency at the moment of cell transfection in 24 h. siRNA (25 nM) were mixed with the transfection reagent DharmaFECT 4 Transfection Reagent (77T-2004-02; GE Healthcare Dharmacon, Horizon-Discovery, Lafayette, Colorado, USA) for 20 min at room temperature and transferred to cell culture without antibiotic/antimycotic solution for 24 h. Afterwards, cells were maintained in fully complemented culture medium, and drugs were added 48 h after cell transfection. The siRNA of FKBP12 (on-target plus smart pool Human FKBP1A 2280 siRNA, ref L-009494), FKBP38 (on-target plus smart pool Human FKBP8 23770 siRNA, ref L-009673), FKBP51 (on-target plus smart pool Human FKBP4 2288 siRNA, ref L-006410) and FKBP52 (on-target plus smart pool Human FKBP5 2289 siRNA, ref L-004224), as well as non-targeting siRNA (on-target plus nontargeting siRNA pool, ref 77D-001810-10) used as negative control were also obtained from GE Healthcare Dharmacon. Cell Physiol Biochem 2020;54:457-473 DOI: 10.33594/000000230 Published online: 6 May 2020 461 Cellular Physiology and Biochemistry Cellular Physiology and Biochemistry © 2020 The Author(s). Published by Cell Physiol Biochem Press GmbH&Co. KG Navarro-Villarán et al.: Role of Immunosuppressant and FK506-Binding Protein Complex in Liver Cancer Expression of miRNAs Total RNA was extracted using the miRNeasy kit (Ref 217004, Qiagen, Hilden, Germany). Briefly, HepG2 cells and primary hepatocytes were lysed with QIAzol Lysis Reagent (Ref 79306, Qiagen). Chloroform was added to homogenates and these were centrifuged for 15 min at 12000 g. Upper aqueous phases containing RNA were transferred to clean tubes. After the addition of ethanol, RNA was bound RNeasy Mini spin column (Ref 74104, Qiagen) and washed in subsequent centrifugation steps. Eventually, RNA was eluted in 50 µl of RNase-free water. RNA was quantified using NanoDrop™ One/OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific). Quality control and RNA integrity assessment were performed with 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, California, USA). All samples showed RIN higher than 8. The miRNA expression profiling was obtained by qRT-PCR using the using the TaqMan® OpenArray® Human miRNA Panel (Ref 4470187, Life Technologies, Carlsbad, California, USA) and accessory kits (Applied Biosystems, Foster City, California, United States). Briefly, isolated miRNAs were reversed transcribed into cDNA using the TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Ref 4366596, Life Technologies) and Megaplex RT Primers Human in a set of predefined pools A and B (Ref 4444750, Life Technologies). Prior to PCR, resulting cDNA was pre-amplified with Megaplex PreAmp Primers of gene-specific Human Pools A and B and the TaqMan PreAmp Master Mix (Ref 4391128, Life Technologies). The pre-amplified product was diluted 40 folds and mixed 1:1 v/v with the TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix (Ref 4462159, Life Technologies). Aliquots of the mixture were dispensed on a microfluidic OpenArray 384-well sample plate (Ref 4406947, Life Technologies). Next, TaqMan Open-Array Human MicroRNA Panels were loaded with the OpenArray AccuFill System and the PCR reactions were carried out with QuantStudio™ 12 K Flex OpenArray® Platform (QS12KFlex, Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts, USA) following the manufacturer’s instructions. Thermo Fisher Cloud Relative Quantification software was used to obtain qPCR data. First, expression levels were calculated using the relative threshold cycle (Crt) method. TaqMan® OpenArray® Human miRNA Panel aims to obtain a total of 758 Crt values for each sample, which include 754 unique miRNAs, one negative control (ath-miR159a) and three endogenous positive controls (RNU48, RNU44 and U6). Crt values were normalized using the global mean strategy. Therefore, ΔCrt values were calculated as Crt miRNA-Crt global mean. Samples were clustered according to ΔCrt values of miRNAs expressed in all samples using the Pearson Correlation (uncentered) and average linkage methods with the Cluster (v 3.0) software. Dendogram illustration was created with Java TreeView software. Relative miRNA expression levels between control and experimental groups were calculated by using the ΔΔCrt method and exported for further analysis. Fold change values were calculated as 2-ΔΔCrt. The bioinformatic analysis was also carried out based on significant differentially expressed miRNAs showing ≥2.0-fold or <0.5 fold changes, and with a p-value <0.05 that were used for in silico predictions. Target prediction was done using the TargetScan Database. Only highly conserved predicted targets with a cumulative weighted context score <-0.4 were selected. A gene regulatory network of differentially expressed miRNAs and their targets was constructed using Cytoscape (v3.6.0). In order to investigate the biological functions of miRNA targets, we carried Functional Annotation and Enrichment analysis of Gene Ontology (GO) terms and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathways with the Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID) tool. Results were considered statistically significant when p-value <0.05 and False Discovery Rate (FDR) <0.05. Statistical analysis All results are expressed as mean ± SEM of independent experiments (n=3-8). Data were compared using the analysis of variance (ANOVA) with the Least Significant Difference’s test as post-hoc multiple comparison analysis (homogeneity of variances) or Games-Howell (non-homogeneity of variances). If Shapiro-Wilks´s test showed non-normal distribution of data non-parametric Kruskal-Wallis coupled to U-Man-Whitney post-hoc analysis with Finner´s correction was done. The level of significance was set at *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001. The groups significantly different (p≤0.05) were indicated with different letters. Cell Physiol Biochem 2020;54:457-473 DOI: 10.33594/000000230 Published online: 6 May 2020 462 Cellular Physiology and Biochemistry Cellular Physiology and Biochemistry © 2020 The Author(s). Published by Cell Physiol Biochem Press GmbH&Co. KG Navarro-Villarán et al.: Role of Immunosuppressant and FK506-Binding Protein Complex in Liver Cancer Results The differential proapoptotic and antiproliferative properties of Tacrolimus and mTOR inhibitors were associated with PERK- dependent activation of ER stress in liver cancer cells Our present data confirm previous study showing that Tacrolimus exerted a more potent pro-apoptotic and antiproliferative properties than mTOR inhibitors [13]. The induction of apoptosis was inversely correlated to the reduction of cell proliferation by Tacrolimus and mTOR inhibitors in HepG2 (Fig. 1A and 1B, respectively) and Huh7 (Fig. 1C and 1D, respectively). Primary human hepatocytes were resistant to the pro-apoptotic and anti-proliferative effects of the treatments (Fig. 1E and 1F, respectively). The ER is responsible for protein folding and regulation of intracellular calcium concentrations through the tightly regulation of three ER transmembrane proteins: PERK, ATF6 and inositol-requiring enzyme 1 α (IRE1α) [14, 15]. Our data showed that Tacrolimus (100 µM), and to a lesser extent mTOR inhibitors (100 µM) strongly activated PERK as shown by the Ser51P-eIF2α/eIF2α ratio (Fig. 2A) and GADD153 (CHOP) protein expressions (Fig. 2B) in HepG2 cells. The impact of Tacrolimus and mTOR inhibitors in Huh7 cells followed the same pattern in Ser51P-eIF2α/eIF2α ratio and GADD153 protein expressions as that observed in HepG2 although at lower extend (Fig. 2C and 2D, respectively). The administration of the drugs does not alter ATF6- and IRE1α-dependent pathways in liver cancer cells (data not shown). mTOR signaling appeared to be moderately downregulated in Huh7 than HepG2 cells mTOR kinase activity induces 4E-BP1 phosphorylation, thus promoting CAP-dependent translation [16]. In agreement, the administration of high concentration of Tacrolimus (100 µM), and all tested concentrations of Sirolimus and Everolimus (10 nM, 10 µM and 100 µM) decreased Thr37/Thr46P-4E-BP1/4E-BP1 ratio in HepG2 cells (Fig. 3A). The effect on this ratio was restricted to high drug concentration in Huh7 cells (Fig. 3B). However, the regulation of the Thr37/Thr46P-4E-BP1/4E-BP1 ratio did not fully reflect the impact of polysome profile. As shown Fig. 1. Regulation of caspase-3 activity and BrdU incorporation in Tacrolimus-, Sirolimus- and Everolimus-treated HepG2 (A and B, respectively), Huh7 (C and D, respectively) and primary human hepatocytes (E and F, respectively). Apoptosis and cell proliferation were determined using commercial caspase-3 activity and BrdU incorporation assays respectively as described in Material and Methods. The variables were evaluated at 24 h after treatment administration (0, 10 nM, 10 µM, 100 µM). Results are expressed as mean ± SEM of five independent experiments. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01 and ***p ≤ 0.001 between control and immunosuppressant-treated cells. The groups with different letters (a, b, c or d) were significantly different (p ≤ 0.05). Cell Physiol Biochem 2020;54:457-473 DOI: 10.33594/000000230 Published online: 6 May 2020 463 Cellular Physiology and Biochemistry Cellular Physiology and Biochemistry © 2020 The Author(s). Published by Cell Physiol Biochem Press GmbH&Co. KG Navarro-Villarán et al.: Role of Immunosuppressant and FK506-Binding Protein Complex in Liver Cancer in Supplementary Fig. 1A, doses of the drugs below 100 µM did not significantly alter the polysome profiles in HepG2 cells (for all supplemental material see www.cellphysiolbiochem. com). In contrast, both Tacrolimus and mTOR inhibitors administered at high concentration (100 µM) resulted in abnormal polysome profiles with a dramatic increase of the 80S peak and a reduction of actively translating polysomes in HepG2 (Fig. 4A) and Huh7 (Fig. 4B). This result is consistent with a reduction of global translation in treated cells. Interestingly, salt treatment was not able to dissociate the 80S peak from treated cells in 40S and 60S subunits, strongly suggesting that this peak does not correspond to 80S vacant ribosome but to monosomes, in clear contrast to the result found for control cells (Supplementary Fig. 1B). Altogether, these results suggest that immunosuppressive drugs at high concentration halts early translation elongation phase in HepG2 cells. Differently, in Huh7 cells the polysome profile appeared to be already slightly Fig. 2. Ser51P-eIF2α/eIF2α ratio and GADD153 protein expressions in Tacrolimus-, Sirolimus- and Everolimus-treated HepG2 (A and B, respectively) and Huh7 (C and D, respectively) cells. Treatments were administered at different concentrations (0, 10 nM, 10 µM, and 100 µM). The expression of Ser51P-eIF2α and eIF2α (3 h), and GADD153 (12 h) was evaluated by Western-blot analysis as described in Material and Methods. Results are expressed as mean ± SEM, and blots are representative of five independent experiments. *p ≤ 0.05 and **p ≤ 0.01 between control and immunosuppressant-treated cells. The groups with different letters (a, b, c or d) were significantly different (p ≤ 0.05). Fig. 3. Thr37/Thr46P-4E- BP1/4E-BP1 ratio in Tacrolimus-, Sirolimus- and Everolimus-treated HepG2 (A) and Huh7 (B) cells. Treatments were administered at different concentrations (0, 10 nM, 10 µM, and 100 µM). The protein expression of Thr37/ Thr46P-4E-BP1/4E-BP1 (6 h) was determined by Western-blot analysis as described in Material and Methods. Results are expressed as mean ± SEM, and blots are representative of four independent experiments. *p ≤ 0.05 between control and immunosuppressant-treated cells. The groups with different letters (a, b or c) were significantly different (p ≤ 0.05). Cell Physiol Biochem 2020;54:457-473 DOI: 10.33594/000000230 Published online: 6 May 2020 464 Cellular Physiology and Biochemistry Cellular Physiology and Biochemistry © 2020 The Author(s). Published by Cell Physiol Biochem Press GmbH&Co. KG Navarro-Villarán et al.: Role of Immunosuppressant and FK506-Binding Protein Complex in Liver Cancer downregulated in the presence of low doses of mTOR inhibitors (10 µM) while still not altered at low doses of Tacrolimus (Supplementary Fig. 1C). No profile could be obtained for Huh7 cells treated with Tacrolimus at 100 µM concentration probably reflecting a relevant induction of cell death in these conditions (Fig. 4B). The initiation of autophagy is controlled by the unc-51 like autophagy activating kinase 1 (ULK1)/ULK2 complex, which remains inhibited by mTOR, and is essential for the formation of the phagophore [17]. Thus, as a second readout of the mTOR pathway in hepatoma cells treated with Tacrolimus, Sirolimus and Everolimus, we determined the ratio of LC3II/LC3I and the levels of Beclin, two classical autophagy markers. The administration of mTOR inhibitors increased more significantly than Tacrolimus both parameters in HepG2 (Fig. 5A and 5B) and Huh7 (Fig. 5C and 5D). The LC3II/LC3I ratio appeared to be moderately increased in Huh7 (Fig. 5C) than that observed in HepG2 cells (Fig. 5A). Fig. 4. Polysome profile in Tacrolimus-, Sirolimus- and Everolimus-treated HepG2 (A) and Huh7 (B) cells. Treatments were administered at 100 µM. Polysome profiles (12 h) were obtained following the procedure described in Material and Methods. No polysome profile was observed in Tacrolimus-treated Huh7 cells. Results are expressed as mean ± SEM of three to four independent experiments. Fig. 5. LC3II/LC3I ratio and Beclin protein expressions in Tacrolimus-, Sirolimus- and Everolimus-treated HepG2 (A and B, respectively) and Huh7 (C and D, respectively) cells. Treatments were administered at different concentrations (0, 10 nM, 10 µM, and 100 µM). The protein expression of LC3II, LC3I and Beclin (6 h) was determined by Western-blot analysis described in Material and Methods. Results are expressed as mean ± SEM, and blots are representative of three to five independent experiments. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, and ***p ≤ 0.001 between control and immunosuppressant-treated cells. The groups with different letters (a, b, c, d, or e) were significantly different (p ≤ 0.05). Cell Physiol Biochem 2020;54:457-473 DOI: 10.33594/000000230 Published online: 6 May 2020 465 Cellular Physiology and Biochemistry Cellular Physiology and Biochemistry © 2020 The Author(s). Published by Cell Physiol Biochem Press GmbH&Co. KG Navarro-Villarán et al.: Role of Immunosuppressant and FK506-Binding Protein Complex in Liver Cancer Regulation of cell cycle by Tacrolimus and mTOR inhibitors We have previously shown that the anti-proliferative properties of Tacrolimus were related to a strong cell cycle arrest at G0/G1 phase in HepG2 cells [13]. The regulation of Cdk4/cyclin D complex and the phosphorylation of retinoblastoma protein (pRB) plays a fundamental role in activating E2F transcription factors, G1/S-phase gene expression and growth control [18, 19]. Calcineurin downregulates Cdk4 phosphorylation and its kinase activity [20]. The administration of Tacrolimus drastically upregulated the Thr172P- Cdk4/Cdk4 ratio in HepG2 cells (Fig. 6A). Sirolimus and Everolimus were also able to upregulate Thr172P-Cdk4/Cdk4 but to a lower extent than Tacrolimus (Fig. 6A). p53 is a key transcriptional factor involved in cell cycle arrest mainly through p21 upregulation leading to induction of apoptosis [21]. The expression of wild type p53 was lower in Huh7 compared to that observed in HepG2 cells (Supplementary Fig. 2). The activation of p53 involves its phosphorylation at Ser15. The Ser15P-p53/p53 ratio was increased after administration of the high concentrations of Tacrolimus and mTOR inhibitors in HepG2 cells (6- and 4-folds, respectively) (Fig. 6B). The pattern of inducibility of p21 by treatments were similar in HepG2 and Huh7 cells (Fig. 6C and 6D). The increase of Ser15P-p53/p53 ratio (Fig. 4B) and p21 (Fig. 4C) expression may counterbalance the potential pro-proliferative effect caused by Thr172P-Cdk4/Cdk4 upregulation (Fig. 4A) in HepG2 cells. The expression of p21 in Huh7 (Fig. 6D) was lower than that observed in HepG2 (Fig. 6C). However, a similar p21 pattern of expression upon treatments was observed in both liver cancer cell lines (Fig. 6C and 6D). Role of FKBPs in the regulation of cell death and proliferation in drug-treated liver cancer cells FKBPs play a relevant role in physiopathology, cancer and chemoresistance [5]. The administration of low (10 nM-10 µM) doses of Tacrolimus and mTOR inhibitors moderately but significantly increased the protein expression of FKBP12 (Fig. 7A) and FKBP51 (Fig. 7B) in HepG2 cells. However, FKBP12 (Fig. 7C) and FKBP51 (Fig. 7D) remained close to control levels upon the administration of low doses of Tacrolimus and mTOR inhibitor in Huh7 cells. The expression of FKBP38 and FKBP52 did not changed with the treatments (data not shown). In order to further identify the role of FKBP12 and FKBP51 in our system siRNA Fig. 6. Thr172P-Cdk4/Cdk4 (A) and Ser15P-p53/p53 (B) ratios in Tacrolimus-, Sirolimus- and Everolimus-treated HepG2 cells; as well as p21 protein expression in Tacrolimus-, Sirolimus- and Everolimus-treated HepG2 (C) and Huh7 (D). Treatments were administered at different concentrations (0, 10 nM, 10 µM, and 100 µM). The protein expression of Thr172P-Cdk4 and Cdk4 (6 h), Ser15P-p53 and p53 (12 h), and p21 (12 h) was determined by Western-blot analysis. Results are expressed as mean ± SEM, and blots are representative of three to five independent experiments. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01 and ***p ≤ 0.001 between control and immunosuppressanttreated cells. The groups with different letters (a, b, c, d or e) were significantly different (p ≤ 0.05). Cell Physiol Biochem 2020;54:457-473 DOI: 10.33594/000000230 Published online: 6 May 2020 466 Cellular Physiology and Biochemistry Cellular Physiology and Biochemistry © 2020 The Author(s). Published by Cell Physiol Biochem Press GmbH&Co. KG Navarro-Villarán et al.: Role of Immunosuppressant and FK506-Binding Protein Complex in Liver Cancer technology was applied in HepG2 cells. Interestingly, the knockdown expression of FKBP12 by siRNA increased the LC3II/LC3I ratio (Fig. 8A) in Tacrolimus-treated HepG2 cells, while reduced this ratio and increased caspase-3 activity (Fig. 8B) in HepG2 cells treated with Sirolimus and Everolimus. The knockdown expression of FKBP51 by siRNA reduced BrdU incorporation (Fig. 9A) in control and drug-treated HepG2 cells, and increased caspase-3 activity (Fig. 9B) in drug-treated HepG2 cells. The application of siRNA strategies showed that FKBP12 and FKBP51 mediate cell survival in immunosuppressive-treated HepG2 cells. Fig. 7. FKBP12 and FKBP51 protein expressions in Tacrolimus-, Sirolimus- and Everolimus-treated HepG2 (A and B, respectively) and Huh7 (C and D, respectively) cells. Treatments were administered at different concentrations (0, 10 nM, 10 µM, and 100 µM). The protein expression of FKBP12 and FKBP51 was evaluated by Western-blot analysis as described in Material and Methods. Results are expressed as mean ± SEM, and blots are representative of four to six independent experiments. *p ≤ 0.05 between control and immunosuppressant-treated cells. The groups with different letters (a, b, c or d) were significantly different (p ≤ 0.05). Fig. 8. Impact of FKBP12 downregulation on LC3II/LC3I ratio (A) and caspase-3 activity (B) in Tacrolimus-, Sirolimus- and Everolimus-treated HepG2 cells. The downregulation of FKBP12 was carried using siRNA technologies. Autophagy and apoptosis were determined using the measurement of LC3II/LC3I ratio and commercial caspase-3 activity assay, respectively as described in Materials and Methods. The protein expression of LC3II and LC3I was evaluated by Western-blot analysis as described in Material and Methods. Results are expressed as mean ± SEM of six independent experiments. *p ≤ 0.05 and **p ≤ 0.01 between control and immunosuppressant-treated cells. The groups with different letters (a, b, c, d, e or f) were significantly different (p ≤ 0.05).