Contribución de y-tubulina a la nucleación de microtúbulos desde los centros organizadores de microtúbulos de células animales

CONTRIBUCIÓN DE γ-TUBULINA A LA NUCLEACIÓN DE MICROTÚBULOS DESDE LOS CENTROS ORGANIZADORES DE MICROTÚBULOS DE CÉLULAS ANIMALES Tesis Doctoral Jesús Roca García Sevilla, abril 2022 Índice Índice Abreviaturas ....................................................................................................................... 1 Resumen ............................................................................................................................. 7 Introducción ..................................................................................................................... 11 1. El citoesqueleto de microtúbulos ............................................................................ 13 1.1. Estructura, composición y dinámica de los microtúbulos ............................... 13 2. Centros organizadores de microtúbulos ................................................................. 17 2.1. El centrosoma .................................................................................................. 18 2.2. El aparato de Golgi .......................................................................................... 20 2.3. Otros MTOCs celulares .................................................................................... 22 3. Nucleación de microtúbulos ................................................................................... 24 3.1. γ-tubulina ........................................................................................................ 24 3.2. Composición y estructura de los complejos de γ-tubulina ............................. 29 3.3. Activación de los complejos de γ-tubulina ...................................................... 34 4. Sistema de degradación de proteínas inducible por auxina ................................... 37 Objetivos ........................................................................................................................... 41 Resultados ........................................................................................................................ 45 1. Generación y caracterización de las herramientas empleadas en este estudio para inhibir la expresión de γ-tubulina. .............................................................................................. 47 1.1. Análisis de la expresión de γ-tubulina 1 y γ-tubulina 2 en la línea celular hTERT RPE1. 47 1.2. Generación del sistema de degradación inducible por auxina en la línea celular hTERT RPE1 para degradar la proteína γ-tubulina 1. .............................................................. 49 1.3. Inhibición de la expresión de γ-tubulina 2 mediante ARN de interferencia. .. 63 2. Análisis de la nucleación de microtúbulos desde el centrosoma y el aparato de Golgi en ausencia de γ-tubulina. .......................................................................................................... 69 2.1. Estudio de la nucleación de microtúbulos en ausencia de γ-tubulina. ........... 69 2.2. Análisis de la composición molecular y distribución de los complejos de γtubulina. ......................................................................................................................... 81 Índice 3. γ-tubulina 2 modula la nucleación de microtúbulos desde el aparato de Golgi. .... 83 Discusión ........................................................................................................................... 93 Conclusiones ................................................................................................................... 105 Materiales y métodos .................................................................................................... 109 1. Materiales ............................................................................................................. 111 1.1. Líneas celulares ............................................................................................. 111 1.2. Reactivos ....................................................................................................... 111 1.3. Anticuerpos ................................................................................................... 112 1.4. Plásmidos ...................................................................................................... 114 2. Métodos ................................................................................................................ 115 2.1. Cultivos celulares ........................................................................................... 115 2.2. Manipulación y análisis de ácidos nucleicos ................................................. 115 2.3. Análisis de proteínas ..................................................................................... 119 2.4. Inmunofluorescencia indirecta (IF) de células adheridas a cubreobjetos .... 120 2.5. Transformación transitoria de moléculas de ADN por electroporación ....... 120 2.6. Inhibición de la expresión de proteínas ........................................................ 120 2.7. Degradación de proteínas inducible mediante auxina ................................. 122 2.8. Análisis de la nucleación de microtúbulos .................................................... 128 2.9. Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo.................................. 130 2.10. Microscopía ................................................................................................... 130 2.11. Análisis de imágenes ..................................................................................... 131 2.12. Análisis estadístico ........................................................................................ 133 Bibliografía...................................................................................................................... 135 1 Abreviaturas 2 Abreviaturas 3 Aa Ac ADN AG AKAP450 AMPc Ampicilinar ARN ARNg Aurora A Aurora B BUBR1 CAP350 CAMSAP Cdc42 cDNA CDK1 CDK2 CDK5 CDK5R1 CDK5Rap2 C.elegans CEP63 CEP68 CEP97 CEP120 CEP135 CEP152 CEP192 CEP295 CGN Ch-TOG Aminoácidos Anticuerpo Ácido desoxirribuncleico Aparato de Golgi A-Kinase anchoring protein 450 Adenosín monofosfato cíclico Ampicilina resistente Ácido ribonucleico Ácido ribonucleico guía Aurora quinasa A Aurora quinasa B Mitotic checkpoint serine/threonine-protein kinase BUB1 beta Centrosome-associated protein 350 Calmodulin-regulated spectrin-associated protein Cell division control protein 42 homolog Ácido desoxirribuncleico complementario Cyclin-dependent kinase 1 Cyclin-dependent kinase 2 Cyclin-dependent kinase 5 Cyclin-dependent kinase 5 regulatory subunit 1 CDK5 Regulatory Subunit Associated Protein 2 Caenorhabditis elegans Centrosomal Protein 63 Centrosomal Protein 68 Centrosomal Protein 97 Centrosomal Protein 120 Centrosomal Protein 135 Centrosomal Protein 152 Centrosomal Protein 192 Centrosomal Protein 295 cis-Golgi network Colonic and hepatic tumor overexpressed gene protein Resumen 10 Así, mientras que promueve la nucleación desde el CTR, en el AG actúa como un inhibidor, puesto que su ausencia resulta en un incremento de la nucleación de MTs desde este orgánulo. El análisis exhaustivo de este resultado nos permitió caracterizar el mecanismo que provoca el incremento de nucleación desde el AG cuando se inhibe la expresión de la γ-tubulina 2. Nuestros resultados demuestran que en ausencia de γ-tubulina 2, la isoforma γ-tubulina 1 aumenta su reclutamiento a la membrana del AG a través de un mecanismo dependiente de la proteína AKAP450, considerada esencial para la nucleación de MTs desde el AG. Además, el aumento de la nucleación se suprime cuando eliminamos CDK5RAP2, otra de las proteínas de unión al γ-TuRC, que además es reclutada al AG a través de AKAP450. Por lo tanto, el aumento de la nucleación desde el AG es dependiente de AKAP450 y está mediado por CDK5RAP2. Adicionalmente, hemos realizado un análisis bioquímico de la composición del γ-TuRC en ausencia de cada una de las isoformas de γ-tubulina, en busca de diferencias que pudieran explicar los cambios observados en la tasa de nucleación de MTs. Este análisis indicó que en ausencia de la γ-tubulina 1 la mayoría de la proteína del GCP2, que forma parte del γ-TuRC, se degrada. Sin embargo, en esa condición aún se detecta una cantidad muy baja localizada en el CTR, la cual se pierde en ausencia total de γ-tubulina. También hemos evaluado la repercusión que tiene la ausencia de cada isoforma en el estado de la red de MTs de la célula, que se ve afectada especialmente cuando están ausentes ambas isoformas de γ-tubulina. Por último, hemos estudiado las consecuencias de la ausencia simultánea de ambas isoformas de γ-tubulina sobre la capacidad de nucleación de MTs. Nuestros resultados demuestran que la ausencia total de γ-tubulina inhibe la nucleación tanto desde el centrosoma como desde el AG, confirmando que esta proteína es esencial para la nucleación de MTs en células animales en interfase. 11 Introducción 12 Introducción 13 1. El citoesqueleto de microtúbulos El citoesqueleto de las células eucariotas está formado por distintos tipos de filamentos. Los microtúbulos (MTs) son, junto con la actina, los filamentos intermedios y las septinas, uno de sus cuatro componentes. Los distintos componentes del citoesqueleto cooperan para dar soporte mecánico a la célula y están involucrados en multitud de procesos celulares como la división celular, el transporte de moléculas, la migración o la señalización celular (Dustin, 1980; Fletcher & Mullins, 2010; Woods & Gladfelter, 2021). 1.1. Estructura, composición y dinámica de los microtúbulos Los MTs son filamentos tubulares con un interior hueco, formados por heterodímeros de αβ-tubulina. Los heterodímeros de tubulina interaccionan entre sí mediante contactos longitudinales formando cadenas lineales denominadas protofilamentos, que a su vez, establecen interacciones laterales entre ellos para formar los MTs. In vivo, la mayoría de los MTs están compuestos por trece protofilamentos y poseen una polaridad intrínseca al exponer los monómeros de α-tubulina hacia el extremo (-) (extremo de crecimiento lento), mientras los de β-tubulina se orientan hacia el extremo (+) (de crecimiento rápido) (Amos & Hirose, 2007; Meurer-Grob et al., 2001). Una característica que distingue a los MTs de otros polímeros biológicos es el fenómeno denominado como inestabilidad dinámica (Mitchison & Kirschner, 1984). Los MTs cambian continuamente entre fases de crecimiento (rescate) y decrecimiento (catástrofe) a través de la adición de heterodímeros de tubulina libres al extremo (+), mediante un mecanismo dependiente de la energía de hidrólisis del nucleótido GTP que se encuentra unido a β-tubulina (el monómero de α-tubulina tiene unida una molécula de GTP que no es intercambiable ni hidrolizable) (Nogales, 2015). Durante la polimerización de MTs, la molécula de GTP unida a βtubulina es hidrolizada a GDP, con un periodo de retraso tras la incorporación del dímero de αβtubulina, lo que da lugar a un “capuchón” de GTP (del inglés GTP-cap) en el extremo en crecimiento del MT. El estado de hidrólisis de los dímeros de tubulina determina la estabilidad del MT. Así, mientras la incorporación de GTP-tubulina promueve la estabilidad y polimerización, la hidrólisis o pérdida del “capuchón” induce la despolimerización del MT (Figura I1) (Akhmanova & Steinmetz, 2015). Introducción 14 Los MTs pueden formarse in vitro de manera espontánea a partir de heterodímeros de αβ-tubulina purificados, junto con GTP y Mg2+, cuando se excede una “concentración crítica” (alrededor de 20µM) (Voter & Erickson, 1984). Sin embargo, la concentración de tubulina en las células es mucho menor, lo que convierte este proceso en cinéticamente desfavorable. La polimerización de MTs requiere de mecanismos de regulación para sobrepasar esta barrera energética, y además, controlar en el tiempo y el espacio la formación de nuevos MTs. Un correcto control de la dinámica de los MTs es fundamental para que puedan realizarse correctamente multitud de procesos celulares (Barlan & Gelfand, 2017; de Forges et al., 2012). 1.1.1. Proteínas de unión a microtúbulos (MAPs) El crecimiento o decrecimientos de los MTs, las conexiones que se producen entre ellos y las que establecen con otras estructuras celulares son reguladas espaciotemporalmente por numerosas proteínas con capacidad de unión a estos filamentos. Las proteínas de unión a MTs (MAPs - del inglés MT-associated proteins) pueden clasificarse en función de su localización, donde puede actuar promoviendo su crecimiento, despolimerización o estabilización. Así, hay que distinguir entre proteínas de unión a extremos (+), a extremos (-) y proteínas motoras (Figura I2). Figura I1. Composición y dinámica de los MTs. (A) Izquierda: α- y β-tubulina se asocian y forman heterodímeros libres. Cada tubulina tiene un sitio de unión a nucleótido, GTP siempre en el caso de α-tubulina y GTP o GDP en el de β-tubulina. (B) Los MTs cambian de manera continua entre fases de crecimiento (rescate) y decrecimiento (catástrofe) en un proceso denominado inestabilidad dinámica. Modificado de (Akhmanova & Steinmetz, 2015) A B Introducción 15 - Proteínas de unión a extremos (+) Las proteínas de unión a extremos (+), denominadas proteínas +TIPs, tienen la capacidad de acumularse en el extremo en crecimiento de los MTs, bien de manera directa, bien a través de otras proteínas. Un grupo extensamente estudiado es el de la familia de proteínas EB (del inglés end-binding), que en mamíferos está formado por tres proteínas diferentes: EB1, EB2 y EB3. Este grupo está considerado como el principal regulador de los extremos (+), pues se unen de manera directa a los MTs, y a otros factores que reclutan, para regular y promover la dinámica de crecimiento de los MTs (Duellberg et al., 2016; Mustyatsa et al., 2017). Otra proteína que se acumula en los extremos (+) es la polimerasa de MTs ch-TOG (homóloga de la proteína XMAP215 de Xenopus laevis), denominada así por reconocer la conformación curvada de los extremos en crecimiento donde promueve la adición de tubulina (Al-Bassam et al., 2012; Al-Bassam & Chang, 2011; Brouhard et al., 2008). Esta proteína posee un dominio con cierta afinidad por el cuerpo del MT, que tiene carga negativa, lo que le permite recorrerlo y desplazarse por él hasta el extremo (+), donde favorece la polimerización (Widlund et al., 2011). Otro grupo importante es el las proteínas CLASPs (CLASP1 y CLASP2 en mamíferos, del inglés cytoplasmic linker-associated proteins). Estas proteínas, cuando se encuentran localizadas en los extremos (+), actúan como agentes estabilizadores inhibiendo los eventos de catástrofe de los MTs (Aher et al., 2018). Además, las proteínas CLASP pueden localizarse a lo largo del cuerpo del MT para promover la estabilización de los mismos (Wittmann & Waterman-Storer, 2005). En definitiva, este grupo de proteínas participa de manera conjunta para regular la dinámica y el crecimiento de los MTs. - Proteínas de unión a extremos (-) Como se ha mencionado anteriormente, una de las características que diferencian los extremos de los MTs es la velocidad o dinamismo en su crecimiento. A diferencia de los extremos (+), los extremos (-) de los MTs se caracterizan por un crecimiento lento in vitro, la mayoría de veces inexistente en la célula debido al anclaje de los MTs por este extremo a otros complejos o estructuras (Dammermann et al., 2003; Desai & Mitchison, 1997; Kollman et al., 2011a; Walker et al., 1988). Las proteínas de unión de extremos (-) de los MTs, conocidas como proteínas -TIPs, son las responsables de anclar o estabilizar MTs a través de este extremo. Una de las proteínas más relevantes de este grupo, si no la que más, es la proteína γ-tubulina. Esta proteína se asocia con otras para formar los complejos con forma de anillo denominados γ-TuRC (del inglés γtubulin ring complex), desde los cuales se originan, o nuclean, los MTs de novo. Habitualmente, los MTs permanecen anclados en los lugares donde han sido nucleados, es decir, al γ-TuRC. Este Introducción 16 complejo bloquea el extremo (-) del MT impidiendo su crecimiento o decrecimiento (Wiese & Zheng, 2000). Otro grupo de proteínas -TIPs son las proteínas CAMSAP (del inglés calmodulin-regulated- spectrin-associated protein), que en humanos está formado por CAMSAP1/2 y 3. La asociación de estas proteínas con los MTs por su extremo (-) les permite organizar conjuntos de MTs en estructuras acentrosomales en células diferenciadas como las células epiteliales o las neuronas. Además, estabilizan los MTs ralentizando la polimerización en los extremos (-) que se encuentran libres (Jiang et al., 2014; Tanaka et al., 2012; Yau et al., 2014). Otras proteínas -TIPS relevantes, que reconocen e inhiben el crecimiento de los extremos (-), son las proteínas ASPM (del inglés abnormal spindle-like microcephaly-associated protein), KANSL, Katanin (mediante su unión a las CAMSAP y ASPM) y NuMA (del inglés nuclear mitotic apparatus protein 1) (Jiang et al., 2017; Merdes et al., 1996; Meunier et al., 2015). - Proteínas motoras Las proteínas motoras, aunque algunas pueden regular la dinámica de los MTs, tienen un papel esencial en el transporte de moléculas a través del citoesqueleto de MTs empleando la energía de hidrólisis de la molécula de ATP. En función de la dirección del movimiento, se pueden clasificar en dos grupos distintos. El primer grupo estaría compuesto por aquellas que se desplazan hacia el extremo (+) realizando un movimiento anterógrado, e incluye a las proteínas de la familia de las quinesinas. El otro grupo lo formarían las proteínas motoras con movimiento retrógrado, es decir, que se dirigen hacia el extremo (-) de los MTs, siendo la dineína la más relevante (Paschal et al., 1987; VALE et al., 1985; Wade, 2009). Figura I2. Proteínas de unión a MTs. Representación esquemática de las proteínas de unión de MTs más relevantes, entre las que se puede distinguir las proteínas que se unen al extremo (+), como las EBs, chTOG y las CLASPs; las que interaccionan con el extremo (-) de los MTs, como los complejos de γ-tubulina (γ-TuRC) y las CAMSAP; y las proteínas motoras dineína y quinesina. Tomada de Ezquerra González (http://hdl.handle.net/2445/137438). Introducción 17 2. Centros organizadores de microtúbulos Multitud de procesos celulares como la segregación de los cromosomas durante la división celular, el posicionamiento y transporte de orgánulos o el establecimiento de la polaridad celular dependen de la organización de la red de MTs. La regulación espaciotemporal de la formación de novo de MTs permite establecer distintas arquitecturas al citoesqueleto de MTs (Figura I3). Se define como nucleación al proceso de formación de novo de MTs, que tiene lugar de manera controlada en distintas estructuras celulares denominadas centros organizadores de MTs, o MTOCs (del inglés MT-organizing centers). Además de nuclear MTs, en los MTOCs también se produce el anclaje y estabilización de los mismos. En células animales, los principales MTOCs son el centrosoma (CTR) y el aparato de Golgi (AG), aunque también se produce nucleación de MTs en otras estructuras como la envuelta nuclear, la cromatina y los cinetocoros, los propios MTs y el córtex celular (Wu & Akhmanova, 2017). Figura I3. El citoesqueleto de microtúbulos en distintas fases del ciclo y tipos celulares. Imágenes de microscopía de fluorescencia mostrando la organización de la red de MTs de células animales en interfase (A) y en metafase (B). Imágenes de la organización de los MTs en distintos tipos celulares: células epiteliales MDCK polarizadas (C) y células de plantas de A. thaiana(D). A C B D Introducción 18 2.1. El centrosoma Hace ya más de un siglo, Theodor Boveri describió la importancia para la división celular y la reproducción en Parasacaris equorum de un orgánulo nuevo que llamó centrosoma (Boverim Theodore, 1888). A lo largo del tiempo y de manera extendida, el CTR se ha considerado como el principal MTOC en células animales que proliferan (Bornens, 2012). El CTR se compone de dos centriolos orientados perpendicularmente y de una matriz proteica denominada material pericentriolar (PCM, del inglés pericentriolar material). Ambos centriolos comparten el mismo núcleo central, una estructura cilíndrica simétrica formada por nueve tripletes de MTs (Harven & Bernhard, 1956; Kitagawa et al., 2011), pero difieren en otras (como los apéndices) debido a los eventos de generación y maduración por lo que pasan durante su ciclo de duplicación (Figura I4A y B). Durante cada ciclo de duplicación uno de los centriolos ha sido formado en el ciclo anterior (centriolo hijo), mientras que el otro fue formado en el ciclo previo (centriolo madre) y fue la base para la síntesis del centriolo hijo. El centriolo madre se caracteriza por haber adquirido durante su maduración los denominados apéndices distales y subdistales. Estas estructuras le permiten realizar funciones como cuerpo basal del cilio primario, en el caso de los apéndices distales, o el anclaje de MTs, en el caso de los subdistales (Bornens, 2002; Doxsey, 2001). El PCM se ha visualizado tradicionalmente como un material amorfo que rodea los centriolos. Sin embargo, los estudios con el empleo de microscopía de superresolución han demostrado que las proteínas se estructuran en distintas capas organizadas. Algunos de estos trabajos emplearon anticuerpos frente a distintas regiones o añadieron proteínas fluorescentes en los extremos de las proteínas para estudiar su disposición dentro del PCM (Vasquez-Limeta & Loncarek, 2021). En la figura I4C se ilustran las proteínas que se han estudiado, indicando su localización y orientación en el PCM. Una de las proteínas fundamentales en la organización del PCM es pericentrina (PCNT). Esta proteína es reclutada a través de su dominio C-terminal PACT (pericentrin-AKAP450 centrosomal targeting), que queda orientado hacia el centriolo, y forma una red fibrilar para reclutar y organizar otras proteínas del CTR (Mennella et al., 2012). Algunas de estas proteínas son CDK5RAP2/Cep215, Cep192 y NEDD1, que junto con otras como las proteínas MOZART (MOZART1/GCP9, MOZART2A/GCP7 y MOZART2B/GCP8) intervienen en el reclutamiento de γtubulina al CTR para proporcionar los sitios de anclaje y nucleación de MTs (en el apartado 3 se habla con más detalle sobre la nucleación de MTs). Introducción 19 Figura I4. Estructura, ciclo y organización del centrosoma de células humanas. (A) Representación del centrosoma en interfase. El centriolo madre y el centriolo hijo se encuentran unidos por una matriz proteica o linker durante interfase. El centriolo madre se caracteriza por la presencia de los apéndices y un PCM maduro. (B) El PCM engloba los centriolos y contiene las proteínas necesarias para la nucleación de MTs. La salida del ciclo celular a la fase G0 promueve la formación del cilio, en el que el centriolo madre forma el cuerpo basal. (C) Esquema representativo de distintas proteínas del centrosoma de las que se ha estudiado su localización y posición mediante microscopía de superresolución. Modificadas de (Azimzadeh & Bornens, 2007; Vasquez-Limeta & Loncarek, 2021). A C B Introducción 26 Sin embargo, no se conoce ninguna función específica de esta isoforma, la cual no presenta la misma distribución que las otras γ-tubulinas. Esta isoforma no se localiza en el centrosoma ni interacciona con alguna proteína del γ-TuRC (Ohashi et al., 2016a). Desde su descubrimiento, la función más relevante de la γ-tubulina, y a la vez la más estudiada, ha sido su papel en la formación de MTs. Como se ha mencionado anteriormente, en mamíferos esta proteína se asocia con otras para formar los complejos con forma de anillo denominados γ-TuRC, que sirven de molde para la formación de novo de MTs (en el siguiente apartado se hablará en detalle sobre estos complejos). Otra función relacionada con la dinámica de los MTs atribuye a esta proteína un papel en la regulación del crecimiento de los extremos (+) de los MTs, donde promovería la polimerización mediante un mecanismo que limitaría los eventos de catástrofe (Bouissou et al., 2009a; Bouissou, Vérollet, de Forges, Haren, Bellaїche, et al., 2014). Las funciones de la γ-tubulina no sólo se restringen a la nucleación de MTs, en los últimos años se están descubriendo nuevas implicaciones en relación con la transcripción génica, la respuesta al daño en el ADN, la remodelación de la cromatina y la organización nuclear (Chumová et al., 2019). Con respecto a las funciones específicas de cada una de las isoformas, se consideraba que la mayoría de funciones eran redundantes y por tanto atribuibles tanto a la γ-tubulina 1 como a la γ-tubulina 2, probablemente debido a la gran homología entre las secuencias de ambas proteínas. De hecho, la mayoría de los trabajos no hacían -ni siguen haciendodistinción entre una u otra isoforma y se referían a ellas simplemente como γ-tubulina, entre otras cosas debido a la falta de herramientas específicas para distinguir entre ambas isoformas. La generación de ratones que carecían de γ-tubulina 1 o de γ-tubulina 2 arrojó algo de luz sobre este aspecto. Los trabajos del laboratorio de Shoichiro Tsukita demostraron que, en ausencia de la primera, los embriones dejan de dividirse en la etapa de blastocisto y muestran husos mitóticos desorganizados y aberrantes. Sin embargo, los ratones que carecían de γ-tubulina 2 fueron viables y sólo presentaron leves defectos relacionados con el ritmo circadiano y la conducta (Yuba-Kubo et al., 2005). Estos resultados apoyarían una mayor relevancia de la isoforma 1, expresada ubicuamente en humanos y en la mayoría de los tejidos en mayor proporción que la γ-tubulina 2, y que por ello, sería la responsable de la mayoría de las funciones atribuidas a esta familia de proteínas (Dráberová et al., 2017b; Wise et al., 2000). Desde entonces, varios estudios han abordado la caracterización en detalle de la isoforma γ-tubulina 2, descubriendo funciones específicas pero también algunas redundantes con la isoforma mayoritaria. Con respecto al patrón de expresión de esta isoforma, se ha demostrado Introducción 27 su expresión en diversos tejidos tanto en humano (Figura I9) como en ratón, siendo en el cerebro donde se han detectado niveles más elevados. En línea con esto, la expresión de la γ-tubulina 2 disminuye durante el desarrollo embrionario de ratón hasta la etapa de blastocisto, excepto en el tejido cerebral, donde disminuye pero en menor mediad que en el resto de tejidos. Asimismo, la expresión de esta isoforma aumenta durante la diferenciación inducida de células de neuroblastoma SH-SY5Y a neuronas (mientras que la expresión de γ-tubulina 1 se mantiene más o menos constante durante el proceso de diferenciación) (Dráberová et al., 2017b; Wise et al., 2000). Por otro lado, se ha observado una mayor expresión de la isoforma 2 en ciertas líneas celulares tumorales en las cuales, parece existir una correlación entre estos niveles elevados y la estimulación del crecimiento celular. Sin embargo, los resultados fueron variables y dependientes de la línea celular. Además, se ha descrito que ambos genes, TUBG1 y TUBG2, aumentan su expresión en ciertos tipos de tumores (Giordano & Draber, 2012; Ohashi et al., 2016a). Finalmente, esta isoforma se ha encontrado en las mitocondrias, donde ha sido relacionada con una función regulatoria como repuesta al estrés oxidativo en neuronas (Dráberová et al., 2017b). A pesar de estos esfuerzos, se requieren todavía más estudios que profundicen en el papel diferencial de ambas isoformas en la nucleación de MTs y en el papel específico que juega la isoforma 2 a nivel del sistema nervioso. Con este fin, experimentos de sobreexpresión han mostrado que, al igual que la γ-tubulina 1, esta isoforma interacciona con las proteínas GCP2-5 del γ-TuRC y tiene la capacidad de nuclear MTs. También apuntan a que su capacidad de nucleación podría ser equiparable a la de la γ-tubulina 1, pues la sobreexpresión de la isoforma 2 en células que carecen de la isoforma 1, y que en consecuencia se encuentran bloqueadas en metafase, es capaz de revertir este fenotipo (Figura I10) (Ohashi et al., 2016a; Vinopal et al., 2012a). Figura I9. La isoforma γ-tubulina 2 se expresa ubicuamente en humano. Análisis mediante RTPCR de la expresión de los genes TUBG1 y TUBG1 en células HeLa y distintos tejidos de humano. El carril de la derecha es un control positivo de una mezcla de ARN de dos cepas de S. pombe, una (AH004) que expresa TUBG1 y la otra (HMHG2) que expresa TUBG2. Modificada de (Wise et al., 2000) Introducción 28 Figura I10. La isoforma γ-tubulina 2A interacciona con las proteínas GCP del γ-TuRC, se localiza en el centrosoma y tiene capacidad para nuclear MTs. (A) Análisis mediante western blot de células HEK293T transfectadas con las distintas isoformas de γ-tubulina-FLAG y reveladas con anticuerpos frente a distintas proteínas del γ-TuRC. (B) Imágenes de células HeLa transfectadas con las mismas construcciones que en (A). (C) Proyección máxima de imágenes tomadas de la señal de EB1-GFP a lo largo de un minuto en células U2OS en las que se ha inhibido la expresión de γ-tubulina 1, y en las que se ha rescatado el fenotipo bien expresando γ-tubulina 1 de ratón, bien expresando γ-tubulina 2 humana. (A) y (B) fueron tomadas de (Ohashi et al., 2016a); (C) fue tomada de (Vinopal et al., 2012a) A B C Introducción 29 3.2. Composición y estructura de los complejos de γ-tubulina Los MTs pueden ser nucleados desde distintas estructuras celulares, denominados MTOCs, sobre los cuales ya se ha hablado anteriormente. Multitud de proteínas se asocian en los distintos MTOCs, sin embargo, hay una proteína común en todos ellos, la γ-tubulina (Stearns et al., 1991; Wu & Akhmanova, 2017). Por lo general, esta proteína se asocia con otras, denominadas GCPs (γ-tubulin complex proteins), para formar los complejos de γ-tubulina. Existen dos tipos de complejos de γ-tubulina que se caracterizan por su peso molecular y su composición: los complejos pequeños de γ-tubulina, o γ-TuSCs (γ-tubulin small complexes, de aproximadamente 300KDa), y los complejos con forma de anillo, o γ-TuRCs (γ-tubulin ring complexes, de aproximadamente 2MDa). Los complejos γ-TuSCs, presentes en todos los eucariotas, son hetero-tetrámeros con forma de V compuestos por las proteínas GCP2 y GCP3, que se asocian de manera lateral, cada una de ellas unida a una molécula de γ-tubulina. Más específicamente, GCP2 y GCP3 se organizan formando los brazos del complejo con forma de V, estableciendo interacciones entre sí a través de sus extremos N-terminal, mientras se unen por sus regiones C-terminal con una molécula de γ-tubulina (Kollman et al., 2008). Estos complejos oligomerizan gracias a proteínas que se localizan en los sitios de nucleación, como los SPBs de levaduras. En levaduras, la proteína Spc110, que posee una secuencia conservada de aproximadamente 60 aminoácidos en su extremo N-terminal denominada CM1 (centrosomin motif 1), organiza los γ-TuSCs para formar una estructura con forma de anillo que sirve como base para la formación de MTs (Kollman et al., 2010). MOZART1, una pequeña proteína que carece del dominio CM1, interacciona con el extremo N-terminal de GCP3 y coopera con otras proteínas con dominio CM1 para promover la oligomerización de los γ-TuSCs (Figura I11) (Lin et al., 2016; Masuda et al., 2013). Introducción 30 En organismos superiores, la nucleación de MTs requiere de la existencia de γ-TuRCs ya preformados en el citoplasma, que además de GCP2 y GCP3, incluyen las proteínas GCP4, GCP5 y GCP6 (Kollman et al., 2011b). Los γ-TuRCs contienen otras proteínas además de las GCPs, como son MOZART1, MOZART2A/B, NEDD1, CDK5RAP2 y NME7 (Choi et al., 2010; Fong et al., 2008; Haren et al., 2006; P. Liu et al., 2014; Teixidó-Travesa et al., 2010). Se cree que estos componentes son más periféricos y tienen una función reguladora, participando tanto en el ensamblaje de los γTuRCs citoplásmicos, como en el reclutamiento y activación de los complejos en los MTOCs (Figura I12). Figura I11. Esquema del proceso de ensamblado de los complejos de γ-tubulina en levaduras. En levaduras, γ-tubulina se asocia con GCP2 y GCP3 para formar el γ-TuSC. Estos complejos con forma de V oligomerizan gracias a la interacción con Spc110 (homóloga de CDK5RAP2) en el SPB. MOZART1 interacciona con GCP3 para favorecer la oligomerización de los γ-TuSCs. Tomada de (Farache et al., 2018). Figura I12. En organismos superiores los complejos de γ-tubulina se encuentran ensamblados en el citoplasma, desde son reclutados a los MTOCs. En organismos superiores γtubulina se asocia con GCP2-6 para formar el γ-TuRC. Este complejo es reclutado y activado en los MTOCs celulares para la formación de MTs. Tomada de (Farache et al., 2018) Introducción 31 Debido a los avances técnicos que se han producido en los últimos años, la criomicroscopía electrónica se ha convertido en un método fundamental en la biología estructural, y ha permitido conocer con más detalle la estructura del γ-TuRC. Recientemente, tres estudios independientes han descrito por primera vez la arquitectura molecular del complejo con una resolución casi atómica (Consolati et al., 2020; P. Liu et al., 2020; Wieczorek, Urnavicius, et al., 2020). En ellos se describe cómo el complejo forma una espiral dextrógira abierta que contiene 14 estructuras radiales, que denominan spokes. Cada uno de los spokes contiene una proteína GCP y una copia de γ-tubulina, similar a la estructura del γ-TuSC (Figura I13) (Kollman et al., 2010). Las proteínas GCP se componen de un dominio altamente conservado GRIP1 (gammatubulin ring protein 1) en su región N-terminal y un dominio GRIP2, también conservado, en su zona C-terminal (Figura I13). El dominio GRIP1 constituye la zona principal de contacto entre las proteínas GCP, mientras el dominio GRIP2 se asocia con la γ-tubulina para formar el molde sobre el que se originan los MTs. Según estos estudios (Consolati et al., 2020; P. Liu et al., 2020; Wieczorek, Urnavicius, et al., 2020), la posición y estequiometría de las GCPs en el complejo se establece como GCP(2-3)4-GCP(4-5)-GCP(4-6)-GCP(2-3), dando lugar a una estequiometría 5:5:2:1:1 para las distintas GCPs (Figura I14). El avance en el conocimiento de la composición del γ-TuRC ha permitido rápidamente su reconstrucción mediante sistemas de expresión de proteínas recombinantes en células de insecto, lo que ha permitido conocer cuáles son los componentes mínimos necesarios para la formación del complejo (Wieczorek et al., 2021; Würtz et al., 2021, 2022; Zimmermann et al., 2020). La reconstrucción del γ-TuRC con el empleo de este sistema supone una herramienta C-terminal γ-tubulina N-terminal Figura I13. Estructura y organización general de los dominios de las proteínas GCP humanas. (izquierda) GCP4 está formado por un dominio GRIP1 en su región N-terminal y un dominio GRIP2 en la región C-terminal, que interacciona con una molécula de γ-tubulina. (derecha) Organización de los dominios de las proteínas GCP. Introducción 32 clave para conocer en más detalles alguno aspectos como el proceso de ensamblado o identificar algunas regiones que no se resolvieron en los trabajos previos. Con respecto a los elementos mínimos necesarios para la formación del complejo, estos experimentos han conseguido aislar γ-TuRCs recombinantes, con la misma capacidad para nuclear MTs que los presentes en la célula, expresando únicamente γ-tubulina, GCP2-6, β-actina y MOZART1 (MZT1) (Würtz et al., 2021). Sin embargo, el aislamiento de estos complejos recombinantes mejora su rendimiento cuando se incorpora el complejo RUVBL, que posee actividad similar a las proteínas chaperonas (Zimmermann et al., 2020). Finalmente, la incorporación de otras proteínas descritas en las estructuras endógenas aisladas, como NEDD1, ha posibilitado la descripción de los sitios que ocupan estas proteínas en el γ-TuRC (Wieczorek et al., 2021; Würtz et al., 2022; Zimmermann et al., 2020). En las tres reconstrucciones iniciales de la estructura del γ-TuRC se encontró inesperadamente una estructura asimétrica situada en el interior del lumen del complejo denominada como luminal bridge (Figura I14). Esta estructura conecta distintas partes del complejo y se ha implicado con el proceso de ensamblado. Este módulo se compone de una molécula de actina (β- o γ-actina, debido a la alta homología no ha sido posible identificarla con exactitud), dos moléculas de MZT1 y el extremo N-terminal de GCP6 (esta proteína GCP se distingue de las demás por incluir una inserción de 750 residuos que las otras no poseen). La presencia de actina no se ha relacionado con la formación o mantenimiento de la estructura del γ-TuRC, aunque sí se ha demostrado que su ausencia afecta a la geometría del complejo. De esta manera, cuando se elimina la actina del complejo la nucleación de MTs es menos eficiente (Böhler et al., 2021; Wieczorek et al., 2021; Würtz et al., 2022). Figura I14. Estructura y composición del γ-TuRC. Estructura de la espiral dextrógira del γ-TuRC. Se ilustra la posición de las proteínas GCP, indicando entre paréntesis su posición en la espiral. En rojo se representa la molécula de actina y en rosa la estructura denominada luminal bridge, ambas situadas en el lumen del complejo. La imagen de la izquierda se corresponde a la vista desde arriba del complejo, mientras la de la derecha sería la vista lateral. Tomada de (Zupa et al., 2021). Introducción 33 La resolución estructural del γ-TuRC ha ayudado a conocer mejor el proceso de formación del complejo. Dos estudios, en base a los resultados obtenidos tras el tratamiento con sales en altas concentraciones de γ-TuRCs aislados, han propuesto un modelo de ensamblaje de los complejos. Según este modelo, GCP4, GCP5 y GCP6 formarían en un primer momento un núcleo que reclutaría los complejos GCP2-GCP3 y que definiría la composición y estructura del γ-TuRC (Haren et al., 2020; P. Liu et al., 2020). Sin embargo, cuando se producen γ-TuRCs mediante sistemas de expresión recombinantes, el complejo más simple encontrado consta de 6 spokes: GCP2(7)-GCP3(8)-GCP4(9)-GCP5(10)-GCP4(11)-GCP6(12) (los números entre paréntesis indican la posición de los spokes en la espiral). Para encontrar el núcleo GCP4-GCP6 es necesario eliminar del sistema de expresión a GCP2 y GCP3, por lo es probable que a este núcleo transitorio se unan rápidamente un complejo GCP2-GCP3 para ocupar las posiciones ocho y nueve de la espiral junto con las proteínas del luminal bridge (Würtz et al., 2022). En cualquier caso, la espiral que forman los spokes en el γ-TuRC es asimétrica gracias a la estructura del núcleo GCP4-GCP6, lo que distorsiona la distribución de las moléculas de γ-tubulina con respecto a la geometría simétrica del MTs (Figura I15). La tasa de nucleación in vitro de los γ-TuRCs aislados es mayor que cuando no está presente, pero no alcanza los valores descritos en la célula. Por lo tanto, en las condiciones de los trabajos estructurales se considera que los complejos de γ-tubulina no se encuentran en una conformación competente para nuclear MTs, precisando de algún mecanismo de activación para ello (Consolati et al., 2020; P. Liu et al., 2021; Würtz et al., 2022). Figura I15. Estructura asimétrica del γ-TuRC. La espiral del γ-TuRC es asimétrica debido a la disposición de los spokes en las posiciones 9-14. Se representa la comparación entre la estructura observada en la conformación inactiva (en gris) y la estructura teórica de la conformación activa (en color). Tomada de (Zupa et al., 2021) Introducción 34 3.3. Activación de los complejos de γ-tubulina Los γ-TuRCs se encuentran ya ensamblados en el citoplasma de la célula, sin embargo, la nucleación de MTs no se produce espontáneamente y queda restringida a los distintos MTOCs celulares como el CTR y el AG (Akhmanova & Steinmetz, 2015; Wu & Akhmanova, 2017). Los estudios sobre la estructura del γ-TuRC han permitido conocer que los γ-TuRCs aislados disponen las moléculas de γ-tubulina en una geometría que los hace poco competentes para nuclear MTs, demostrando que la región donde se localizan GCP4, GCP5 y GCP6 se desvía del eje de la hélice del anillo (Thawani & Petry, 2021; Würtz et al., 2022). Por lo tanto, los complejos en el citoplasma se encontrarían en una conformación abierta, que cambiaría mediante un mecanismo combinado de reclutamiento y activación a una conformación cerrada, como parte de la regulación de la nucleación de MTs. Sin embargo, hasta el momento este mecanismo no ha sido encontrado, aunque sí se han descrito algunas proteínas que podrían participar en este proceso. Un grupo de proteínas candidatas son aquellas que contienen el motivo CM1, entre las que se encuentran CDK5RAP2 y myomegalin. CDK5RAP2 y su homólogo Spc110 (S. cerevisiae) son necesarias para una correcta organización de los MTs en el CTR y el AG, y han sido descritas como potenciales activadores de la nucleación gracias a un motivo denominado γ-TuNA (γ-TuRC nucleation activator) (Choi et al., 2010; Fong et al., 2008). Este motivo se localiza dentro del dominio conservado CM1, que se encuentra la región N-terminal de CDK5RAP2 y se une directamente al γ-TuRC (Choi et al., 2010; Consolati et al., 2020; Fong et al., 2008; Wieczorek, Urnavicius, et al., 2020). La expresión de esta secuencia o las proteínas homólogas de CDK5RAP2 aumentan la capacidad de nucleación del γ-TuRC en algunos organismos y tipos celulares, a veces con la necesidad de factores adicionales como la proteína Ran-GTP (Choi et al., 2010; Cota et al., 2016; P. Liu et al., 2020; Lynch et al., 2014; Tovey et al., 2021). Sin embargo, las estructuras resueltas del γ-TuRC obtenidas en presencia del motivo γ-TuNA, o añadiéndolo tras la purificación del complejo, muestran la conformación abierta que no coincide con la geometría del MT. Apoyando la hipótesis de que esta proteína actuaría como un activador de la nucleación, una reciente publicación ha descrito que, tras la interacción del γ-TuNA con el γ-TuRC en una región entre las unidades GCP6(12)-GCP2(13), se producen ciertos cambios conformacionales en el complejo que dispone las moléculas de γ-tubulina en una conformación más parecida a la geometría de los MTs (Wieczorek, Huang, et al., 2020). Finalmente, de manera similar a CDK5RAP2, myomegalin contiene el dominio CM1 que une y recluta γ-tubulina al CTR y el AG (Bouguenina et al., 2017; Roubin et al., 2013; Wu, de Heus, et al., 2016). Sin duda, son necesarios Introducción 35 más estudios para comprender el papel de las proteínas que poseen el dominio CM1 en la activación del γ-TuRC (Figura I16). La proteína NME7 también tiene la capacidad de unirse al γ-TuRC y aumentar su capacidad de nuclear MTs (P. Liu et al., 2014). Sin embargo, al igual que ocurre con el motivo γ-TuNA, a pesar de que esta proteína se encuentra presente al aislar el γ-TuRC, las estructuras descritas del complejo se encuentran en la conformación incompetente para nuclear MTs (P. Liu et al., 2020; Wieczorek, Urnavicius, et al., 2020). Otra proteína sobre la cual se ha descrito cierta capacidad para promover la nucleación de MTs es TPX2 (Roostalu & Surrey, 2017; Tovey & Conduit, 2018). Recientemente, en la especie X. laevis, se ha encontrado que TPX2 contiene una secuencia similar al motivo γ-TuNA, pero dividida en dos por la secuencia de una estructura en hélice. En esta especie, esta proteína está implicada en la formación de MTs desde otros ya existentes (Alfaro-Aco et al., 2017). Los estudios sobre la implicación de TPX2 en la nucleación de MT presentan resultados variables, probablemente por las diferencias en la concentración de la proteína empleadas. Sin embargo, a altas concentraciones, esta proteína provoca una separación de fases en la que promueve tanto la nucleación dependiente como independiente del γ-TuRC (Consolati et al., 2020; Roostalu et al., 2015). Figura I16. Proceso de activación y nucleación de MTs desde el γ-TuRC. El complejo ensamblado se encontraría en una conformación inactiva en el citoplasma. El motivo CM1 de CDK5RAP2 podría estar implicado en el cambio conformacional del γ-TuRC a una conformación activa. TPX2 se une a los dímero de tubulina para estabilizar el MT en formación. Finalmente, XMAP215 (chTOG en humano) se une al γ-TuRC para promover la nucleación en un primer momento, y posteriormente, mediante el reclutamiento de dímeros de tubulina facilitaría la elongación en el extremo (+) del MT. Tomada de (P. Liu et al., 2021) 42 Objetivos 43 El OBJETIVO GLOBAL de la presente tesis es el de estudiar la contribución de la γ-tubulina a la nucleación de microtúbulos desde los principales centros organizadores de microtúbulos de células animales en interfase, es decir, el centrosoma y el aparato de Golgi. Para ello, perseguiremos los siguientes OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1. Generar y caracterizar herramientas que permitan el análisis de la nucleación de MTs de manera rigurosa en células hTERT-RPE1 en ausencia de γ-tubulina. 2. Diseccionar la contribución de la γ-tubulina a la nucleación de microtúbulos desde los diferentes MTOCs celulares. Objetivos 44 45 Resultados 46 Resultados - Cap. 1 47 1. Generación y caracterización de las herramientas empleadas en este estudio para inhibir la expresión de γ-tubulina. En este trabajo se han empleado distintas estrategias para intentar suprimir la expresión de la γ-tubulina en la línea celular hTERT RPE1 (en adelante RPE1). La elección de esta línea celular se debió a que mantiene su genoma diploide y cromosómicamente estable, además de ser el modelo más extendido para estudiar la nucleación de MTs desde el CTR, y sobre todo, desde el AG. En este apartado se detallan las técnicas empleadas para modular los niveles de las isoformas γ-tubulina 1 y γ-tubulina 2 en dicha línea celular. 1.1. Análisis de la expresión de γ-tubulina 1 y γ-tubulina 2 en la línea celular hTERT RPE1. Debido a la ausencia de estudios previos que analizaran la expresión de las dos isoformas de γ-tubulina en células RPE1, nos pareció necesario caracterizar la abundancia de ambas proteínas en esta línea celular. Para ello, utilizamos datos de secuenciación masiva de ARN mensajero (RNA-seq) de células RPE1, que habíamos obtenido previamente en el laboratorio. Los resultados del análisis demostraron la expresión de ambas formas de γ-tubulina, siendo la cantidad de γ-tubulina 1 significativamente mayor que la de γ-tubulina 2 (77 y 23%, respectivamente). Cabe destacar que los niveles de expresión de γ-tubulina 2 fueron similares a los del resto de proteínas que componen el γ-TURC, las proteínas GCPs, excepto GCP2 (Figura R1B). Sin embargo, debido al número de lecturas y el tipo de secuenciación empleada no fue posible analizar la expresión de las dos isoformas de γ-tubulina 2 descritas en la literatura (γ-tubulina 2A y γ-tubulina 2B). Con este fin, usamos el método descrito en (Camacho Londoño & Philipp, 2016) para cuantificar la expresión de isoformas originadas por empalme (o splicing) alternativo mediante PCR cuantitativa (qPCR), combinando parejas de cebadores que aparean específicamente con los ARN mensajeros (ARNm) que codifican cada una de las isoformas con una pareja que amplifica en ambas (Figura R1A). El análisis reveló que la isoforma 2A es prácticamente la única que se expresa en esta línea celular, ya que representa el 95% de γ-tubulina 2 (Figura R1C). Además, gracias a la alta homología que hay entre los ARNm de γ-tubulina 1 y γ-tubulina 2 pudimos usar este método para confirmar los niveles de expresión de las dos formas de γ-tubulina que Resultados - Cap. 1 48 habíamos obtenido por RNA-seq. Los datos fueron muy similares a los obtenidos mediante secuenciación, siendo la abundancia de ARN mensajero de γ-tubulina 1 del 80% y del 20% para γ-tubulina 2. Teniendo en cuenta estos resultados, decidimos poner a punto el sistema de degradación inducible por auxina para degradar γ-tubulina 1, ya que es la forma de γ-tubulina mayoritaria en las células RPE1. Figura R1. Análisis de la expresión de γ-tubulina 1 y γ-tubulina 2 a nivel de ARN mensajero en células RPE1. (A) Representación esquemática de los cebadores empleados en la cuantificación mediante qPCR de la expresión de γ-tubulina 1 y γ-tubulina 2, así como de las isoformas de γ-tubulina 2. Las líneas discontinuas indican el apareamiento en varios tránscritos. (B) Niveles de expresión de γtubulina 1 y γ-tubulina 2, así como de las distintas proteínas GCPs, obtenidos mediante secuenciación masiva RNA-seq. (C) Cuantificación de la expresión de γ-tubulina 1 y ambas isoformas de γ-tubulina 2 por qPCR. Datos obtenidos de tres experimentos independientes. Se representa la media con la desviación estándar. A B C Resultados - Cap. 1 49 1.2. Generación del sistema de degradación inducible por auxina en la línea celular hTERT RPE1 para degradar la proteína γ-tubulina 1. Entre las distintas técnicas que se han desarrollado para inhibir la expresión de proteínas, el sistema de degradación inducible por auxina se ha refinado tanto en los últimos años, que se ha convertido en una de las mejores técnicas para tal fin. Como se detalla en el apartado 4 de la Introducción, este sistema presenta múltiples ventajas frente a otros más clásicos. Por ese motivo, una parte importante del trabajo de esta tesis ha sido poner a punto en el laboratorio el manejo de este sistema de degradación controlada de proteínas. El sistema de degradación inducible por auxina requiere introducir en la célula dos elementos para poder llevar a cabo la degradación específica de una determinada proteína: - Primero, es necesaria la expresión de la proteína sensible a auxina TIR1. Esta proteína posee el dominio F-box que le permite formar un complejo ubiquitina ligasa SCF funcional, junto con el resto de subunidades endógenas conservadas en todas las células eucariotas. Entre las distintas proteínas TIR1 descritas en la literatura, decidimos emplear la proteína OsTIR1 (Oryza sativa TIR1) debido a que está ampliamente caracterizada y ha sido empleada en multitud de trabajos. - Posteriormente, hay que introducir la secuencia mAID (mini Auxin Inducible Degron) en el locus genómico de la proteína que se desea eliminar. A esta se unirán la auxina y la proteína TIR1 para promover su ubiquitinación y degradación vía proteosoma. 1.2.1. Generación de la línea parental hTERT RPE1 OsTIR1. Para la generación de la línea parental RPE1 OsTIR1 (en adelante RPE1 OsTIR1) se emplearon dos plásmidos diferentes: el plásmido pX330-AAVS1, que contiene los elementos necesarios para expresar la endonucleasa Cas9 y el ARN guía para dirigirla al locus AAVS1; y el plásmido “donador” pMK243, que contiene el ADN complementario (ADNc) de la proteína OsTIR1, bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina/doxiciclina, así como el gen de resistencia a puromicina, que permite la selección de aquellas células que han integrado el fragmento de ADN. Toda esta secuencia está flanqueada por las regiones homólogas del locus AAVS1 para dirigir la inserción a este sitio del genoma. Resultados - Cap. 1 50 Elegimos el locus endógeno AAVS1 para la expresión de la proteína OsTIR1 ya que se considera un Safe Harbor Site (SHS), es decir, una región que permite la inserción de genes o elementos genéticos sin que se produzcan fallos en la expresión o defectos en otros genes endógenos. Por otro lado, decidimos expresar la proteína OsTIR1 de forma inducible por doxiciclina, con el fin de evitar que se produzca una degradación basal (en ausencia de auxina), lo que ha sido previamente descrito en este sistema, posiblemente causada por la presencia de productos químicos similares a la auxina en forma de contaminantes en el suero bovino o medios de cultivos (Natsume & Kanemaki, 2017a). Para obtener la línea parental, electroporamos de manera conjunta los dos plásmidos arriba mencionados en las células RPE1. Tras realizar la selección con puromicina de aquellas células que habían incorporado la secuencia OsTIR1, éstas se sembraron en placas de 96 pocillos para obtener clones aislados. Dichos clones fueron analizados por PCR con el fin de identificar clones homocigotos. Para ello, utilizamos dos parejas de cebadores: la pareja de cebadores 1 y 2 sirve para confirmar que ha habido integración, ya que amplificarían solamente si se ha producido la integración, y la pareja de cebadores 3 y 4 amplificarían una banda de 881 pares de bases (pb) en el alelo silvestre, o una banda de 6.292pb en el alelo que incorpora la secuencia OsTIR1 (Figura R3A). En la práctica, esta banda de 6.292pb es muy difícil de obtener usando las condiciones estándar de PCR, así que la ausencia total de bandas en esta segunda PCR nos haría sospechar que se trata de un clon homocigoto. Figura R2. Representación esquemática de los plásmidos necesarios para la generación de la línea parental RPE1 OsTIR1. El plásmido pMK243 contiene, flanqueado por las regiones homólogas (Región homóloga izquierda y derecha – RHI y RHD respectivamente) de locus AAVS1, el ADNc del gen TIR1 procedente de Oryza sativa (OsTIR1) bajo un promotor inducible por doxiciclina y el gen de resistencia a puromicina. El plásmido pX330-AAVS1 contiene los elementos necesarios para expresar la endonucleasa Cas9, así como el ARN guía para dirigirla al locus AAVS1. En la parte inferior de la figura se muestra el locus AAVS1 tras realizarse la integración. Resultados - Cap. 1 51 Como se observa en la Figura R3B, la primera PCR fue positiva en todos los clones aislados, confirmando que se había producido la integración al menos en un alelo del locus AAVS1. Por su parte, la segunda reacción debería dar lugar a una banda de 881pb si el clon es heterocigoto, y previsiblemente, ninguna banda en el caso de los clones homocigotos (ya que como acabamos de mencionar la banda de 6,3kb es muy difícil de obtener). Tal y como se muestra en la figura R3C, la segunda PCR amplificó una banda a la altura esperada para el alelo silvestre en los clones A1 y C3 y ningún producto para los clones F2 y F6. Decidimos probar otras condiciones de reacción y distintas polimerasas para tratar de amplificar la secuencia OsTIR1 completa (Q5 High-fidelity DNA Polymerase - Bioline, MyFy DNA Polymerase - Bioline, MyTaq RedDNA Polymerase - Bioline y Platinum SuperFi II DNA Polymerase - Invitrogen), pero en ningún caso fuimos capaces de obtener el producto de amplificación deseado. Ante esta dificultad, nos propusimos analizar la expresión de OsTIR1 en los diferentes clones a nivel de proteína mediante western blot (WB), usando un anticuerpo específico frente la misma. Como se observa en la figura R3D y 24h después de inducir su expresión añadiendo doxiciclina al medio, los niveles de OsTIR1 en los clones F2 y F6 fueron más elevados que en el clon A1. Este resultado, sumado a que no se amplifica la banda del alelo silvestre, apuntan a que ambos clones (F2 y F6) deben ser homocigotos. Por ello, para continuar con la puesta a punto del sistema de degradación inducible por auxina, decidimos usar el clon F2 como línea parental RPE1 OsTIR1. Resultados - Cap. 1 58 Aunque estaba descrito que añadir una secuencia en el extremo C-terminal de γ-tubulina 1 no afecta ni a su localización ni a su función (Bauer et al., 2016a), realizamos distintos ensayos para comprobar que era así en nuestra línea celular. En primer lugar, analizamos la distribución de la proteína γ-tubulina 1-mAID-mCherry2 mediante inmunofluorescencia (IF) usando anticuerpos específicos. En este punto, es necesario explicar que existen varios anticuerpos comerciales que reconocen a la γ-tubulina. Debido a la alta similitud en la secuencia de aminoácidos de γ-tubulina 1 y γ-tubulina 2, la mayoría de ellos identifican ambas proteínas. Este es el caso del anticuerpo monoclonal GTU88, usado en numerosos estudios y que reconoce ambas formas de γ-tubulina puesto que se generó frente a la región N-terminal que comprende los aminoácidos entre las posiciones 38 y 53. Para estudiar de manera específica γ-tubulina 1 se ha empleado el anticuerpo TU-30, generado contra los residuos 434-440 del extremo C-terminal, y que reconoce exclusivamente esta forma de γtubulina (Dráberová et al., 2017a). Además, gracias a la inserción al final de γ-tubulina 1 de la proteína mCherry2, puede estudiarse específicamente bien siguiendo la fluorescencia endógena de esta proteína fluorescente o bien usando anticuerpos específicos frente a la misma, en el caso de que se quiera amplificar su señal. El anticuerpo de elección en este caso fue el anticuerpo policlonal anti-mCherry generado por la plataforma de anticuerpos recombinantes del Institute Curie en París (Figura R7A). De esta manera, cuando se esté visualizando la fluorescencia endógena de mCherry2 se indicará en la figura como ‘Cherry’, para diferenciarlo de los casos en los que se emplea el anticuerpo, que estará indicado como ‘α-Cherry’. Lamentablemente, hasta la fecha no se dispone de anticuerpos que reconozcan específicamente la isoforma 2 de la γtubulina. Al analizar en células fijadas la localización de la proteína de fusión γ-tubulina 1-mAID- mCherry2, se observa la misma distribución que la de la proteína silvestre en la línea parental. Tanto marcando con anticuerpo GTU88 como con anti-mCherry, la proteína se localiza principalmente en el centrosoma en interfase (Figura R7B), y en los polos y el huso mitótico en células en división (Figura R7C). El marcaje con anti-Cherry también hace evidente la acumulación de γ-tubulina asociada al aparato de Golgi, que ha sido descrita previamente (Figura R7D) (Rıos et al., 2004; Wu, de Heus, et al., 2016). Resultados - Cap. 1 59 A 75 45 63 GTU88 RPE1 OSTIR1 TUBG1 RPE1 α-mCherry F γ-tubulina 1 mAID mCherry2 γ-tubulina 1-mAID-mCherry2 51,7 kDa 7,5 kDa 26,7 kDa ≃ 86 kDa B C Figura R7. La adición de una secuencia de fusión en el extremo C-terminal no altera la distribución y funcionalidad de γ-tubulina 1. (A) Representación esquemática de la secuencia completa de aminoácidos de γ-tubulina 1, γ-tubulina 2A y γ-tubulina 1-mAID-mCherry. Se indican los epítopos de los anticuerpos que se han usado en este estudio, marcando con líneas discontinuas aquellos que reconocen más de una forma de γ-tubulina. (B) Imágenes de inmunofluorescencia de células RPE1 y células RPE1 OsTIR1 TUBG1. Se realizó el marcaje con los anticuerpos GTU88 (verde), anti-mCherry (rojo) y anti-Ninenina (azul). (C) Células RPE1 y RPE1 OsTIR1 TUBG1 fijadas y marcadas con el anticuerpo anti-Cherry. Se muestra la localización de la proteína γ-tubulina 1-mAID-mCherry en células en mitosis. (D) Células RPE1 OsTIR1 TUBG1 fijadas y marcadas con anticuerpos anti-GM130 y anti-mCherry. (E) Células RPE1 y RPE1 OsTIR1 TUBG1 fueron tratadas con nocodazol y fijadas tras el lavado de la droga. Tras la fijación se marcaron con anticuerpos anti-EB1 (verde), anti-mCherry (rojo) y anti-GMAP210 (azul). Las flechas señalan el centrosoma. (F) Extractos totales de células RPE1 y RPE1 OsTIR1 TUBG1 preparados para identificar la proteína γ-tubulina 1-mAID-mCherry con los anticuerpos GTU88 y anti-mCherry. Barras de escala, 10µM. D E Resultados - Cap. 1 60 Experimentos de WB usando los diferentes anticuerpos revelaron una banda a la altura esperada correspondiente al tamaño de la proteína junto con la etiqueta mAID-mCherry2 (Figura R7F), además de algunas bandas de tamaños inferiores, que probablemente correspondan a productos de degradación. Finalmente, comprobamos que la funcionalidad de la proteína no se había visto afectada evaluando la capacidad de nucleación en un ensayo de repolimerización de MTs. Tras despolimerizar todos los MTs mediante un tratamiento con nocodazole y lavar varias veces para eliminar la droga, se deja que se reformen los MTs, que a tiempos cortos (1-5 min) se observan emergiendo desde los diferentes MTOCs celulares (en células RPE1 el centrosoma y el aparato de Golgi). No se observaron diferencias en la capacidad de nucleación en las células RPE1 OsTIR1 TUBG1-mAID-mCherry2, en comparación con la línea celular RPE1 a ninguno de los tiempos analizados. Resultados - Cap. 1 61 - Estudio de la degradación de γ-tubulina 1 en las células RPE1 OsTIR1 γ-tubulina 1- mAID-mCherry2. La degradación inducible que permite este sistema se realiza añadiendo al medio de cultivo la fitohormona ácido indolacético (IAA), que pertenece a la familia de las auxinas. Esta degradación proteica es rápida pero condicionada a unos altos niveles de expresión de la proteína OsTIR1 (Natsume et al., 2016b), que reconoce la secuencia mAID cuando la auxina se encuentra presente. En nuestro caso, la expresión de OsTIR1 está regulada bajo un promotor inducible por doxiciclina, por lo que para degradar γ-tubulina 1 es necesario inducir su expresión previamente. Está descrito que la inducción de OsTIR1 alcanza su máximo valor a las 10 horas (Natsume et al., 2016b) por lo que decidimos añadir doxiciclina al medio de cultivo 16 horas antes para asegurar unos niveles altos de la proteína. Para caracterizar la degradación de γ-tubulina 1 en los tres clones obtenidos se realizaron ensayos de IF y WB a distintos tiempos tras añadir IAA al medio de cultivo. La velocidad y eficiencia de la degradación de la proteína tuvo un comportamiento similar en los tres clones. En los estudios mediante WB, los niveles de γ-tubulina 1 disminuyeron rápidamente en las primeras 4 horas tras inducir la degradación, momento a partir del cual se mantuvo más o menos constante en torno al 10% (Figura R8C). En IF, la intensidad de la señal de γ-tubulina 1 se redujo más rápidamente en el citoplasma que en el CTR, aunque a las 4 horas de añadir IAA al medio la señal de γ-tubulina 1 asociada al mismo era indetectable, incluso usando un anticuerpo anti- Cherry (Figura R8A y B). Sin embargo, y como se ha descrito en la bibliografía (el del degron de ytub) a las 4 horas existía todavía un porcentaje de células en las que no se había inducido la degradación de la proteína (alrededor de un 10%), lo que podría explicar los resultados obtenidos por WB, donde a partir de las 4 horas los niveles se mantienen más o menos constantes. De esta manera decidimos realizar todos los experimentos a las 4 horas tras haber añadido IAA. Como los tres clones aislados presentan un comportamiento homogéneo y su tasa de degradación en respuesta a IAA es similar, elegimos el clon 7F para generar la línea RPE1 TUBG1. Teniendo en cuenta todos los resultados obtenidos, la línea RPE1 TUBG1 constituye una herramienta adecuada para la degradación γ-tubulina 1 y el estudio de su papel en la nucleación de MTs. Resultados - Cap. 1 62 A 0 2 4 t(h) γ-tubulina 1 GM130 75 135 Figura R8. Análisis y caracterización de la degradación de γ-tubulina 1-mAID-mCherry en los clones obtenidos. (A) Extractos totales del clon 7F, recogidos a distintos tiempos tras inducir la degradación de γ-tubulina 1 con auxina. GM130 se utilizó como control de carga. (B) Cuantificación de la abundancia de γ-tubulina 1 mediante WB de los tres clones obtenidos a distintos tiempos de degradación. (C) Ensayo de inmunofluorescencia del clon 7F tras inducir la degradación de γ-tubulina 1 con auxina y marcando con anticuerpo anti-mCherry. Las flechas amarillas indican la localización del centrosoma. Se muestra aumento del área seleccionada, que contiene el centrosoma. Barra de escala, 10µm. (D) Ensayo de degradación en los tres clones obtenidos. Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de γ-tubulina 1 en toda la célula a distintos tiempos tras inducir la degradación con auxina. Para detectar γ-tubulina 1 se marcó con anticuerpo anti-mCherry. C D B Resultados - Cap. 1 63 1.3. Inhibición de la expresión de γ-tubulina 2 mediante ARN de interferencia. Hasta el momento, son muy pocos los artículos que tienen en cuenta la existencia de dos formas diferentes de γ-tubulina, y que plantean su estudio de forma diferencial. De hecho, los estudios que abordan específicamente la expresión de γ-tubulina 2 en células humanas se restringen a células de origen tumoral (referencias) y todos los experimentos están realizados en condiciones de sobreexpresión, debido a la ausencia de anticuerpos que reconozcan esta proteína de manera específica. Hasta el momento, no hay datos sobre la expresión y localización en detalle de esta proteína en la línea celular RPE1. Como se describe en el apartado 1.1 de la sección de Resultados, nuestros experimentos mostraron que la expresión de γ-tubulina 2 a nivel de ARNm constituye un 20% del total de γ-tubulina en células RPE1, pero no se conoce si, como γ-tubulina 1, esta se localiza en el centrosoma o en otras estructuras celulares. Los resultados del apartado anterior han mostrado que la generación de la línea celular RPE1 TUBG1 permite degradar de manera específica y rápida la isoforma γ-tubulina 1. Por ello, nos aprovechamos de este sistema para obtener información acerca de la expresión y localización de γ-tubulina 2 en las células RPE1. Más concretamente, realizamos ensayos de degradación y analizamos las células por IF usando varias combinaciones de anticuerpos. Una combinación incluía el anticuerpo anti-Cherry, para poder seguir la degradación de γ-tubulina 1, junto con el anticuerpo GTU88, que como se ha mencionado anteriormente reconoce ambas formas de γ-tubulina. Como se observa en la figura R9A, tras 4 horas de degradación en presencia de IAA (momento en el que la señal asociada al anti-Cherry es indetectable), todavía se observaba fluorescencia con el anticuerpo GTU88 en el CTR. Este resultado nos hizo pensar A Figura R9. Tras la degradación de γ-tubulina 1 queda marcaje de γ-tubulina en el centrosoma. (A) Centrosoma de células RPE1 OsTIR1 TUBG1 controles y tras 4h de degradación con auxina (IAA) fueron fijadas y marcadas con anticuerpos anti-γ-tubulina (verde) y anti-CP110 (azul). (B) Igual que en (A) pero realizando un marcaje con el anticuerpo TU-30 (verde) y anti-CP110 (azul). B Resultados - Cap. 1 64 que esta señal podía corresponderse a γ-tubulina 2. Para confirmar que esta señal no se debía a una degradación incompleta de γ-tubulina 1 que no detectamos debido a los límites de detección de los anticuerpos, usamos una nueva combinación de anticuerpos. En este caso, realizamos el marcaje de γ-tubulina 1 con el anticuerpo TU-30 y obtuvimos el mismo resultado que usando el anti-Cherry (Figura R9B). Por lo tanto, la ausencia de marcaje con este anticuerpo confirmó que la señal del anticuerpo GTU88 que se observaba en el centrosoma en ausencia de γ-tubulina 1 podía ser debida por la expresión de γ-tubulina 2. Teniendo en cuenta que se ha descrito que γ-tubulina 2 tiene la capacidad de nuclear MTs, al menos en condiciones de sobreexpresión (Vinopal et al., 2012b), consideramos necesario inhibir su expresión con el fin de poder evaluar la contribución global de la γ-tubulina a la nucleación de MTs desde los diferentes MTOCs. En un primer momento, nos propusimos implementar la misma estrategia empleada con la γ-tubulina 1, cambiando la proteína fluorescente por mNeonGreen para poder visualizar las dos isoformas simultáneamente. Sin embargo, esta estrategia no funcionó para esta proteína (en el apartado de la discusión se argumentan las posibles explicaciones para esto). Por este motivo, tomamos de (Ohashi et al., 2016b) la secuencia de un dúplex de siRNA diseñado específicamente frente a γ-tubulina 2 y confirmamos tanto su eficiencia como su especificidad en nuestro sistema. Para ello, probamos distintos tiempos (72 y 96h) así como una doble ronda de transfección del siRNA (72+48h) y cuantificamos mediante qPCR la disminución de la expresión. Como se observa en la gráfica de la figura R10A, la mayor inhibición se consiguió tanto a las 72h como haciendo una doble ronda de transfección. Debido a la alta homología entre las dos formas de γ-tubulina, también comprobamos mediante qPCR que el siRNA no modificaba la expresión de γ-tubulina 1 (Figura R10B). Una vez constatamos que el siRNA era específico de γ-tubulina 2 y establecimos el tiempo óptimo para inhibir la expresión, comprobamos en experimentos de WB la inhibición de la expresión a nivel de proteína (Figura R10C). Como paso previo y dado que no existen anticuerpos disponibles frente a γ-tubulina 2, tuvimos que identificar cual era la banda correspondiente a esta isoforma, al revelar con el anticuerpo que reconoce ambas formas de γ-tubulina (GTU88). Si utilizamos un extracto de células RPE1 silvestres se observan dos bandas a la altura esperada para γ-tubulina. Si analizamos los lisados de células de la línea RPE1 TUBG1 observamos que la banda inferior (la más abundante en células silvestres) desaparece, apareciendo en su lugar una banda en torno a 75KDa, que concuerda con el peso esperado para γ-tubulina 1 con la etiqueta (tal y como también se muestra en la Figura R7D). Además, esta banda es la que se degrada al añadir IAA al medio. Esto apoyaría que la banda correspondiente a γ-tubulina 2 sería la banda Resultados - Cap. 1 65 superior menos intensa que se obtiene al revelar con el anticuerpo GTU88 en las células RPE1. De hecho, en células RPE1 TUBG1 tratadas con el siRNA frente a la γ-tubulina 2 durante 72 horas, esta banda desaparece confirmándose que, tal y como se había descrito ya en otras líneas celulares y condiciones experimentales (Ohashi et al., 2016a), esta banda corresponde a la isoforma γ-tubulina 2. La inhibición de la expresión de la γ-tubulina 2 mediante siRNA también funciona cuando se induce simultáneamente la degradación de la γ-tubulina 1 (último carril del WB). Figura R10. Caracterización de la eficiencia del siRNA de γ-tubulina 2. (A) Análisis por qPCR de la eficiencia del siRNA frente a γ-tubulina 2 a distintos tiempos, con una o dos rondas de transfección. Los valores son relativos a los niveles de GAPDH y expresados en porcentaje. Se muestra en la gráfica el resultado de un experimento. (B) Medición de la especificidad de las secuencias de siRNA frente a γ-tubulina 2 mediante qPCR. Valores de expresión relativos a GAPDH y en porcentaje. En la gráfica se representa la media ± D.E. de dos experimentos. (C) Extractos totales de células RPE1 silvestres y RPE1 TUBG1 tratadas con auxina para degradar γ-tubulina 1 y/o transfectadas con el siRNA frente γ-tubulina 2. Para identificar la γ-tubulina se empleó el anticuerpo GTU88. Como control de carga se empleó βtubulina. A B C Resultados - Cap. 1 66 Finalmente, confirmamos mediante IF que la señal que quedaba en el centrosoma al degradar γ-tubulina 1 se correspondía a γ-tubulina 2. Para ello, combinamos la degradación de γ-tubulina 1 con la transfección del siRNA de γ-tubulina 2. Como esperábamos, la señal del anticuerpo GTU88 que quedaba en los ensayos de degradación desapareció en estas condiciones, por lo que la señal que quedaba en el CTR se correspondía a γ-tubulina 2. En conclusión, la combinación del sistema de degradación inducible mediante auxina junto con el dúplex de siRNA era una estrategia óptima para eliminar eficientemente la γ-tubulina en las células RPE1, de manera que disponíamos de unas condiciones experimentales que nos permitían abordar la nucleación de MTs en ausencia total de γ-tubulina. Esta combinación de herramientas también nos ha proporcionado información acerca de la proporción de cada una de las isoformas en el CTR, así como de su interrelación en el mismo (Figura R11A). Cuando marcamos en células fijadas la γ-tubulina con el anticuerpo GTU88, en condiciones de degradación de γ-tubulina 1 el marcaje que queda, y que ya hemos demostrado que corresponde a la γ-tubulina 2, es aproximadamente un 34% con respecto al control. Al inhibir la expresión de γ-tubulina 2, la señal de GTU88 restante (que en este caso correspondería a la γ-tubulina 1) es de un 63%. Al tratar de eliminar ambas formas de γ-tubulina, la intensidad de fluorescencia en el centrosoma se redujo hasta el 9% (Figura R11B). Hay que destacar que la cantidad de γ-tubulina 1 en el CTR, estimada en base a la fluorescencia de la proteína mCherry2, no se modificó en células sin γ-tubulina 2 cuando se compara con células controles (Figura R11C). Por lo tanto, estos resultados indican que cuando se inhibe la expresión de γ-tubulina 2, la γtubulina 1 no compite por su asociación al centrosoma y no la puede sustituir en este MTOC. Resultados - Cap. 1 67 A B C Figura R11. Caracterización de la eficiencia del siRNA de γ-tubulina 2. (A) Células RPE1 TUBG1 fueron transfectadas con siRNA control (condición control), inducidas para degradar γ-tubulina1 (condición IAA), transfectadas con siRNA frente γ-tubulina 2 (condición siRNA) y transfectadas con este siRNA y degradadas (condición siRNA+IAA). Las células fueron fijadas y marcadas con los anticuerpos GTU88 (verde) y anti-CP110 (azul). Barra de escala, 10 µm. (B) Cuantificación de la intensidad de γ-tubulina en el centrosoma midiendo la señal del anticuerpo GTU88. Se representa la media de tres experimentos independientes. (C) Cuantificación de la intensidad de γ-tubulina 1 en el centrosoma midiendo la señal de la proteína fluorescente mCherry2. Datos de tres experimentos independientes. Se representa la media. Resultados - Cap. 2 74 Teniendo en cuenta que se ha descrito que γ-tubulina tiene un papel en la regulación de la dinámica de los extremos (+) de los MTs (Bouissou et al., 2009b; Bouissou, Vérollet, de Forges, Haren, Bellaïche, et al., 2014), quisimos descartar que su ausencia pudiera estar alterando la localización de EB1 y que los cambios que observábamos fueran un reflejo de modificaciones en de la dinámica de asociación de las proteínas de unión a extremos (+) a los MTs, más que la propia dinámica de nucleación de MTs. Para ello, realizamos nuevamente experimentos de repolimerización de MTs después de un tratamiento con NZ, pero en este caso, visualizando el aster de MTs utilizando un anticuerpo frente a la α-tubulina en lugar de EB1. Dado que αtubulina tiene un pool soluble importante que puede hacer más difícil la cuantificación, previamente a la fijación de las células extrajimos con Triton-x100 la fracción soluble (ver apartado 2.4 de los Materiales y métodos para más detalles). Figura R14. Análisis de la nucleación de MTs desde el CTR en ausencia de γ-tubulina mediante ensayo de repolimerización de MTs. (A) Células RPE1 TUBG1 tratadas para eliminar alguna o ambas formas de γ-tubulina fueron incubadas con nocodazole y posteriormente reincubadas durante 3 minutos en medio fresco tras el lavado de la droga. Las células se fijaron y se marcaron con anti-EB1 (verde), anti-Cherry(rojo) y anti-Ninein(azul). Se muestra la región del centrosoma amplificada. (B) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de EB1 alrededor del centrosoma de tres experimentos independientes como los mostrados en (A). Las líneas rojas representan la media de todos los valores, normalizados respecto a la media del control. Se realizó un análisis ANOVA seguido de una prueba de Dunnett (p<0,0001). (C) Igual que en (A), pero realizando la extracción de la fracción soluble con PHEM-Triton-x100 (0,05%) durante 20 segundos previo a la fijación. Se realizó el marcaje de α-tubulina (verde) y Ninein (azul). A B C Resultados - Cap. 2 75 Al analizar el áster de MTs de esta forma, se observó que la ausencia de γ-tubulina producía los mismos defectos que los observados analizando EB1, tanto in vivo como en células fijadas. Es decir, la disminución de la nucleación de MTs desde el CTR al degradar γ-tubulina 1 es mucho mayor que en células sin γ-tubulina 2. Asimismo, cuando no hay presente ninguna de las dos formas la capacidad de síntesis de novo de MTs desde el CTR se ve prácticamente anulada (Figura R14C). Por tanto, podemos concluir que las alteraciones observadas en ausencia de las isoformas de γ-tubulina reflejan realmente defectos en la capacidad de nucleación de MTs y no son debidos a alteraciones en la dinámica de asociación de proteínas de extremos (+) a los mismos. 2.1.2. Nucleación de microtúbulos desde el aparato de Golgi. El diseño experimental para el análisis de la nucleación de MTs desde el AG fue similar al realizado para el CTR, es decir, una combinación de microscopía in vivo con experimentos de repolimerización en células fijadas. Como se ha indicado anteriormente, para analizar el número de cometas de EB1 que emergían desde el AG usamos lentivirus para expresar la proteína EB1, en este caso unida a la proteína fluorescente iRPF670, junto con la proteína β-1,4-galactosyltransferase-eGFP como marcador de Golgi. A las imágenes obtenidas del video, que se han incluido en la Figura R15, se les han asignado otros colores a la hora de elaborar la figura para mejorar la visualización de los cometas de EB1. Dado que en condiciones normales en células RPE1 el CTR se encuentra íntimamente relacionado con las cisternas del AG, era muy difícil cuantificar el número de cometas nucleados desde la totalidad del AG sin incluir por error cometas de EB1 que provinieran del CTR en el lapso de tiempo analizado. Por ello, en lugar de tener en cuenta la masa total de Golgi, se tomaron 3 regiones del mismo alejadas del CTR, cuantificándose los cometas nucleados desde cada una de ellas y realizándose posteriormente el promedio para cada célula. Los resultados del ensayo mostraron que las células sin γ-tubulina 1 vieron reducida su capacidad para nuclear MTs desde el AG. Sin embargo, a diferencia de lo que ocurría con el CTR, cuya tasa de nucleación se redujo considerablemente en estas condiciones, el AG tenía una capacidad de nucleación del 70% en comparación con las células control. Por el contrario, al inhibir la expresión de la γ-tubulina 2 nos encontramos con un resultado sorprendente e inesperado. Las células que carecían de esta isoforma de γ-tubulina incrementaron Resultados - Cap. 2 76 significativamente la capacidad para nuclear MTs desde el AG, hasta un 183% si se compara con el control. Este aumento de la nucleación en ausencia de γ-tubulina 2 se suprimió cuando degradamos simultáneamente γ-tubulina 1, siendo en estas condiciones la nucleación de MTs de sólo un 15% del total (Figura R15). De estos experimentos concluimos que, como ya pasaba con la nucleación desde el CTR, γ-tubulina es esencial para la nucleación de MTs desde el AG, ya que la ausencia combinada de ambas isoformas redujo masivamente la capacidad de nucleación desde este MTOC. Sin embargo y de forma sorprendente, la contribución de cada una de las isoformas a la nucleación global no parece seguir el mismo patrón que en el caso del CTR. Mientras que la ausencia de γtubulina 1 sí redujo la capacidad de nucleación del AG (aunque en menor medida que la del CTR), la ausencia de γ-tubulina 2 no sólo no provocó una disminución de la capacidad de nucleación, sino que la incrementó hasta un 183%. Este aumento parece ser dependiente de γ-tubulina 1, ya que cuando esta isoforma se degrada de forma simultánea, el resultado total es una disminución masiva de la capacidad de nucleación. Figura R15. Estudio in vivo de la dinámica de nucleación de MTs desde el AG en ausencia de γtubulina. (A) Células RPE1 TUBG1 infectadas para expresar EB1-iRFP (verde, marcador de los extremos (+) de los MTs) y GalT-GFP (morado, marcador del AG) y que carecían de alguna o ambas formas de γ-tubulina. Se adquirieron imágenes en intervalos de un segundo durante un minuto y medio en un microscopio confocal de disco giratorio. A la izquierda se muestran las proyecciones máximas en el tiempo de los cometas de EB1 de una célula completa. A la derecha se enseñan proyecciones máximas de intervalos de 10seg de una región del AG amplificada. Las flechas amarillas indican los cometas de EB1 que emergen del AG. (B) Cuantificación del número de cometas de EB1 que salen desde el AG en tres experimentos independientes como los mostrados en (A). Las líneas rojas representan la media de todos los valores. Los valores están normalizados respecto a la media obtenida en el control. (p<0,0001, análisis ANOVA seguido de una prueba de Dunnett) Resultados - Cap. 2 77 A B Control IAA IAA + siRNA γ-tub2 siRNA γ-tub2 Resultados - Cap. 2 78 Nuevamente, confirmamos estos resultados mediante experimentos de repolimerización de MTs en células fijadas. En el caso del Golgi, estos experimentos tienen una ventaja adicional y es que como consecuencia del tratamiento con NZ, el AG se fragmenta en pilas de cisternas que se dispersan por todo el citoplasma y se separan del CTR, lo que facilita el análisis de la nucleación dependiente del AG. Al contrario de lo que ocurría en la nucleación desde el CTR, si se observaron ligeras diferencias en el análisis en células fijadas con respecto a los resultados que se habían obtenido en los experimentos in vivo. Más concretamente, la ausencia de γtubulina 1 provocó una disminución levemente mayor de la nucleación asociada a las cisternas de Golgi, que se redujo al 58%. Cuando ambas isoformas están ausentes de forma simultánea, la nucleación disminuyó hasta un 17% en comparación con el control. Cabe destacar que al analizar la nucleación de MTs en ausencia de γ-tubulina 2 de nuevo se observó un incremento generalizado en la tasa de nucleación de aproximadamente un 200%, que se reflejaba tanto en un aumento del número de fragmentos de Golgi capaces de nuclear, como un aumento del número de MTs nucleados por cada fragmento de Golgi (Figura R16A). En términos generales, estos datos apoyaban los ya obtenidos en los experimentos in vivo con respecto a la repercusión que tiene en la nucleación de MTs desde el AG la ausencia de cada una de las isoformas de γtubulina (Figura R16C). Finalmente, realizamos los mismos ensayos de repolimerización, pero empleando un anticuerpo frente a la α-tubulina en lugar de la proteína EB1, para confirmar que los datos obtenidos eran reflejo de los cambios en la nucleación de MTs y no de cambios en la asociación de las proteínas de extremos (+) a los MTs. Como esperábamos, los resultados fueron similares a los ya observados analizando EB1, tanto in vivo como en células fijadas, es decir, una disminución de la nucleación en el caso de la ausencia de la γ-tubulina 1, un aumento notable cuando se elimina la γ-tubulina 2 y una reducción masiva al eliminar ambas γ-tubulinas, donde la nucleación prácticamente disminuye a niveles residuales (Figura R16B). Resultados - Cap. 2 79 Figura R16. Análisis de la nucleación de MTs desde el AG en ausencia de γ-tubulina mediante ensayo de repolimerización de MTs. (A) Células RPE1 TUBG1 que carecen de alguna o ambas formas de γtubulina fueron incubadas con nocodazole y posteriormente se dejó que comenzaran a formarse los MTs tras el lavado de la droga. Las células se fijaron y se marcaron con anti-EB1 (verde) y anti- GMAP210(morado). En la esquina inferior derecha se muestra amplificada la región marcada. Las flechas señalan los centrosomas. (B) Igual que en (A) pero las células se permeabilizaron previamente a la fijación para marcar α-tubulina(verde) y GMAP210(morado). La línea discontinua amarilla marca el contorno del núcleo. (C) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de EB1 que colocaliza con el marcaje del AG de tres experimentos independientes como los mostrados en (A). Las líneas rojas representan la media de todos los valores, normalizados respecto a la media del control. Se realizó un análisis ANOVA seguido de una prueba de Dunnett (p<0,0001). A B C Resultados - Cap. 2 80 A lo largo de todos los experimentos realizados para evaluar la capacidad de nucleación dependiente del AG observamos que, sorprendentemente, al eliminar la isoforma γ-tubulina 2 la nucleación se estimula hasta ser aproximadamente el doble de la observada en células control. Debido a lo inesperado del resultado, decidimos confirmar este fenotipo empleando una secuencia distinta para inhibir la expresión de la proteína (y poder excluir que se debiera a algún off target de la secuencia que habíamos empleado). En este caso, en lugar de siRNAs empleamos lentivirus que codificaban otra secuencia de shRNA. 72h después de la infección, la nucleación de MTs desde el AG se analizó utilizando experimentos de repolimerización en células fijadas. Los resultados obtenidos fueron muy similares a los obtenidos anteriormente, observándose nuevamente más MTs saliendo de las cisternas del Golgi en comparación con las células control (Figura R17). Esto confirma que el fenotipo se debe, en efecto, a la ausencia de γ-tubulina 2 y no a algún efecto inespecífico de los siRNAs que habíamos usado en los experimentos. Figura R17. La inhibición de la expresión con otra secuencia de interferencia distinta frente a γtubulina 2 también estimula la nucleación desde el aparato de Golgi. Células RPE1 TUBG1 fueron infectadas con lentivirus control o con lentivirus específicos frente a γ-tubulina 2. Se realizó un ensayo de repolimerización de MTs y las células fijadas se marcaron con anti-EB1 (verde) y anti-GMAP210 (morado). Resultados - Cap. 2 81 2.2. Análisis de la composición molecular y distribución de los complejos de γ-tubulina. Como hemos comprobado, la eliminación de alguna de las isoformas de la γ-tubulina produce distintos cambios en la tasa de nucleación del CTR y el AG. Para comprender mejor estos cambios, decidimos analizar el estado de los γ-TuRCs cuando está ausente alguna de las isoformas de la γ-tubulina, o cuando lo están ambas. En la literatura podemos encontrar diversos trabajos en los que estudian la estabilidad de estos complejos cuando se inhibe la expresión tanto de la γ-tubulina, como de alguna de las otras proteínas que forman parte de ellos, como son las proteínas GCPs. Todos estos estudios coinciden en que la estabilidad del γ-TuRC se ve comprometida en mayor o menor grado cuando se elimina alguna de las GCPs, lo que conlleva la degradación de las GCPs restantes. Por lo tanto, para conocer el estado de los γ-TuRCs decidimos analizar la cantidad total de la proteína GCP2 en extractos totales de células degradadas con IAA, transfectadas con el siRNA frente a la γtubulina 2, o degradadas y transfectadas simultáneamente. Los resultados del análisis reflejaron que la cantidad de GCP2 detectada cuando degradamos la γ-tubulina 1 se redujo aproximadamente al 25%. Sin embargo, cuando inhibimos la expresión de la otra isoforma, los niveles no se vieron prácticamente afectados. Finalmente, en ausencia total de γ-tubulina la práctica totalidad de la proteína GCP2 se había degradado (Figura R18A y B). Por lo tanto, aunque ya se había descrito la pérdida de los γ-TuRCs en ausencia de γ-tubulina, por primera vez se ha evaluado la repercusión de la falta individual de las isoformas de esta proteína, resultando que la estabilidad del γ-TuRC depende en gran medida de la γ-tubulina 1, mientras que la isoforma 2 no la afecta de manera significativa. Además de analizar la cantidad total de GCP2 en ausencia de γ-tubulina, también estudiamos su distribución en células fijadas y en las mismas cuatro condiciones experimentales. En la primera condición, cuando degradamos la γ-tubulina 1, los niveles de GCP2 en el CTR disminuyen a un 32% con respecto al control. En el caso de la ausencia de la γ-tubulina 2, a diferencia de cuando hemos analizado la cantidad total de GCP2, los niveles en el centrosoma se reducen de manera significativa hasta un 67%. En la última condición, cuando eliminamos por completo la γ-tubulina, la detección de GCP2 en el CTR se reduce a niveles residuales de aproximadamente un 9% (Figura 18C y D). En conclusión, al menos en el CTR, los niveles de GCP2 parecen tener una correlación con los de γ-tubulina (Figura R11B), indicando que la cantidad de complejos de γ-tubulina localizado en este MTOC, medida en base a la abundancia de GCP2, es dependiente de los niveles de γ-tubulina. Resultados - Cap. 2 82 Figura R18. La estabilidad del γ-TuRC se ve afectada en ausencia de γ-tubulina. (A) Extractos totales de células RPE1 TUBG1 en las que se inhibió la expresión de una o ambas formas de γ-tubulina, analizados con anticuerpo anti-GCP2 y anti-GM130 (control de carga). (B) Análisis densitométrico de GCP2 de tres experimentos independientes como el mostrado en (C). Los datos corresponden a la media ± DE normalizada con respecto al control. GM130 se utilizó como control de carga. (C) Células RPE1 TUBG1 tratadas para eliminar alguna o ambas formas de γ-tubulina se fijaron y marcaron con anticuerpos anti-GCP2 (verde), anti-Cherry (rojo) y anti-CP110 (azul). (D) Cuantificación de la intensidad de GCP2 en el centrosoma como se muestra en (A). Las líneas rojas representan la media de todos los valores, normalizados respecto a la media del control. Para los análisis estadísticos se realizó un análisis ANOVA seguido de una prueba de Dunnett (p<0,0001). Resultados - Cap. 3 83 3. γ-tubulina 2 modula la nucleación de microtúbulos desde el aparato de Golgi. Los resultados presentados en el capítulo 2, donde se ha abordado el papel de la γtubulina en la nucleación de MTs, muestran que ésta es esencial para la nucleación de MTs tanto desde el CTR como desde el AG, además de revelar diferencias funcionales entre las dos isoformas de γ-tubulina. La γ-tubulina 1, la forma mayoritaria en células RPE1 y la mejor estudiada en la literatura, tiene un papel central en la nucleación pues su eliminación provoca una disminución en la tasa de nucleación tanto del CTR como del AG. Sin embargo, la función de la γ-tubulina 2 es diferente en función del MTOC. Mientras que en el CTR actúa como un estimulador de la nucleación, en el AG su efecto es inesperadamente el inverso, es decir, su ausencia incrementa la nucleación desde este orgánulo (Figura R15 y R16). El hecho de que la ausencia de ambas isoformas de γ-tubulina inhiba completamente la nucleación de MTs, permite descartar la existencia de mecanismos alternativos de nucleación que pudieran estar operando en estas condiciones. Por ello, nos planteamos si el incremento de la nucleación de MTs asociado al AG en ausencia de la γ-tubulina 2 podría estar mediado por la otra isoforma presente en ese caso, esto es, la γ-tubulina 1. Para responder esta cuestión, analizamos en primer lugar la distribución de esta proteína mediante ensayos de IF. Aunque en células fijadas en metanol y marcadas con anticuerpo anti- Cherry se puede observar como la γ-tubulina 1 decora la zona del AG (Figura R7D), realizamos una extracción con saponina previa a la fijación para eliminar la fracción soluble de esta proteína. Al analizar las preparaciones observamos que, como suponíamos, el marcaje de la γ-tubulina 1 en la región del AG en células transfectadas con el siRNA frente a γ-tubulina 2 era más intenso que en las células control (Figura R19A). La cuantificación de la intensidad de fluorescencia de la γ-tubulina 1 en la región delimitada por la golgina GM130 (ver el apartado 14.3 de los materiales y métodos para más detalles) reflejó un aumento de su reclutamiento al AG de aproximadamente el doble en ausencia de la γ-tubulina 2 (Figura R19B). Resultados - Cap. 3 90 En conclusión, la nucleación que se produce desde el AG cuando eliminamos γ-tubulina 2 se produce a través del mecanismo de nucleación en el AG ampliamente descrito, dependiente de AKAP450, puesto que al eliminarla, se impide el reclutamiento de γ-tubulina 1 a las membranas del AG, teniendo como consecuencia la inhibición de la nucleación de MTs desde este orgánulo. Figura R24. El incremento de la nucleación asociada al AG en ausencia de γ-tubulina 2 depende de la vía de AKAP450. (A) Células RPE1 silvestres y knock-out para AKAP450 fueron transfectadas con siRNA control o frente a γ-tubulina 2. Posteriormente, fueron tratadas con nocodazole para realizar un ensayo de repolimerización de MTs. Las células fueron fijadas y marcadas con anticuerpo anti-EB1 (verde), anti-AKAP450 (rojo) y anti-GMAP210 (azul). (B) Células RPE1 silvestres y knock-out para AKAP450 fueron transfectadas con el plásmido pCMV-γ-tubulina 1-flag y se marcaron con anticuerpos anti-flag (verde), anti-AKAP450 (rojo) y anti-GMAP210 (azul). Las flechas amarillas señalan los centrosomas y las líneas discontinuas los contornos de los núcleos. (C) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de γ-tubulina 1-flag en la región del AG delimitada por el marcaje de GMAP210 como el que se muestra en (B). Las líneas rojas representan la media de todos los valores. Datos de un experimento (se cuantificaron al menos 30 células por condición). A B C Resultados - Cap. 3 91 Estudios previos han mostrado que CDK5RAP2, otra de las proteínas de unión a la γtubulina, se localiza en el AG de forma dependiente de AKAP450 (Choi et al., 2010). Además, células knock-out para CDK5RAP2 muestran una disminución de alrededor del 35% en la nucleación asociada al Golgi (Gavilan et al., 2018). Teniendo en cuenta esto, nos planteamos si el aumento en la nucleación de MTs en ausencia de γ-tubulina 2 pudiera estar mediado por CDK5Rap2. Para comprobar esta hipótesis analizamos la nucleación desde el AG en células RPE1 knock-out para CDK5Rap2 disponibles en el laboratorio (Gavilan et al., 2018). Los resultados mostraron que, la transfección del siRNA frente a γ-tubulina 2 en estas células no se acompañó de un aumento en la nucleación, es decir, la actividad de nucleación de MTs asociada al AG fue similar a las células controles y las knock-out para CDK5RAP2 (Figura 25). Esto nos permitió concluir que CDK5RAP2 es de alguna forma responsable del incremento de actividad del AG cuando se inhibe la expresión de γ-tubulina 2. A B Figura R25. La ausencia de CDK5Rap2 contrarresta el aumento de nucleación desde el AG cuando no está presente γ-tubulina 2. (A) Células RPE1 silvestres y knock-out para CDK5Rap2 fueron transfectadas con siRNA control o frente a γ-tubulina 2 y tratadas con nocodazole para realizar un ensayo de repolimerización de MTs. Posteriormente, las células se fijaron y se marcaron con anticuerpo anti-EB1 (verde) y anti- GMAP210 (azul). Las flechas amarillas señalan los centrosomas y las líneas discontinuas los contornos de los núcleos. (B) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de EB1 que colocaliza con las membranas de Golgi tal y como se muestra en A. Las líneas rojas representan la media de todos los valores, relativos a la media del control . Datos correspondientes a un experimento. Resultados - Cap. 3 92 93 Discusión 94 Discusión 95 La investigación activa en el campo de la organización y dinámica del citoesqueleto de MTs está comenzando a responder cuestiones relevantes para comprender mejor el complejo proceso de generación de redes especializadas de MTs gracias a la caracterización de los diversos MTOCs que actúan en distintos tipos de células y diferentes etapas del ciclo celular. Cada MTOC tiene una forma, un tamaño y una distribución adecuados para permitir la organización de un tipo particular de conjunto de MTs. Sin embargo, seguimos sin entender bien cómo se remodelan los MT, cómo se activan o inactivan los MTOC, cómo se forma la variedad de MTOCs acentriolares y cómo todos estos MTOCs se relacionan y coordinan entre sí. En la gran mayoría de células animales en división, el CTR actúa como el principal MTOC celular. Sin embargo, hace ya más de una década se describió que el AG también posee capacidad de nucleación en células en interfase, respondiendo de aproximadamente el 50% de los MTs nucleados en células RPE-1 (Efimov et al., 2007). De hecho, las células diferenciadas a menudo emplean y amplían las vías de formación y estabilización de los MTs que no están relacionados con el CTR, que ya existen en las células que proliferan. La caracterización de los mecanismos moleculares de nucleación y estabilización de MTs en células que se dividen en cultivo, donde el enfoque molecular es mucho más asequible, puede proporcionar una información muy valiosa acerca de la organización y el funcionamiento del citoesqueleto de MTs. Recientemente, nuestro grupo ha abordado la cuestión de cómo las células regulan específicamente la nucleación de MTs desde el AG y desde el CTR durante interfase, así como la coordinación de las actividades de los distintos MTOCs cuando estos coexisten dentro de la misma célula (Gavilan et al., 2018). Para ello, se inhibió la nucleación de MTs en el AG y se analizó su efecto sobre la actividad de nucleación de MTs centrosómica, y viceversa, se eliminó la nucleación de MTs desde el CTR y se examinó el comportamiento del AG. El estudio se centró en las proteínas “receptoras del γ-TuRC” canónicos que están presentes tanto en el AG como en el centrosoma, es decir, PCNT, AKAP450 y CDK5Rap2. Se generaron líneas celulares knock-out simples o dobles en células RPE-1 para cada una de estas tres proteínas. Sorprendentemente, la caracterización de las líneas celulares mutantes reveló un importante papel de todas estas proteínas en la regulación de la nucleación de MTs mediada por el AG, y una contribución mucho más discreta a la nucleación de MTs dependiente del CTR. Estudios adicionales demostraron que CEP192, otra de las proteínas con capacidad de unión al γ-TuRC, desempeñaba un papel mucho más relevante en la nucleación asociada al CTR, ya que su eliminación afectaba significativamente su tasa de nucleación. Aun así, la inhibición de la expresión de CEP192 en un contexto de ausencia de los demás factores redujo la capacidad de nucleación en alrededor de Discusión 96 un 60%, lo que implicaba la existencia de mecanismos adicionales que operaban cuando ninguna de esas proteínas estaba presente, y que al final, eran responsables del 40 % de la capacidad de nucleación de MTs desde el CTR. Esto planteó una cuestión relevante, ¿cuáles serían los mecanismos responsables del 40% de la nucleación del CTR que tiene lugar cuando los principales reclutadores de γ-tubulina (AKAP450, PCNT, CDK5RAP2 y CEP192) no están presentes? Podría ocurrir que la γ-tubulina residual fuera reclutada al CTR por vías aún no caracterizadas, y que estas vías fueran las responsables de la nucleación observada en estas condiciones. Alternativamente, podría ser que la γ-tubulina no fuera el único factor implicado y que existieran vías complementarias de nucleación o estabilización de MTs, alternativos o complementarios a los de la γ-tubulina, que operaran en el CTR. En este mismo trabajo se mostraba que cuando las capacidades de nucleación del CTR y del AG se inhibían de forma simultánea (Inhibiendo la duplicación de los centriolos con la droga centrinone, para generar células sin centrosomas, en la línea knock-out para AKAP450, donde no existe nucleación desde el AG) se observaban agregados de proteínas del PCM con capacidad de reclutar γ-tubulina, y por tanto, de nuclear MTs. Estos agregados eran dependientes de PCNT, ya que al inhibir la expresión de esta proteína los MTs se formaban de forma individual en el citoplasma (MTs citoplásmicos). El número de los MTs citoplásmicos se reducía considerablemente si se trataba de forma simultánea con gatastatina, un inhibidor de la γtubulina. Teniendo en cuenta esto, ¿cuál sería la importancia de la γ-tubulina en la generación de MTs? O dicho de otra manera, ¿podría la nucleación de MTs en las células ocurrir independientemente del γ-TuRC?. Con el fin de elaborar un modelo razonablemente coherente sobre la función y coordinación de los diferentes MTOCs de la célula, nos planteamos abordar todas estas cuestiones. Teniendo en cuenta que la inhibición de la expresión severa y a largo plazo de la γtubulina ha demostrado ser inviable en varios sistemas biológicos (Chinen et al., 2015; Lindström et al., 2018; Rosselló et al., 2018; Yuba-Kubo et al., 2005), como prueba del papel esencial de la γ-tubulina en la homeostasis y división celular, decidimos utilizar el sistema de degradación inducible por auxina, que permite degradar eficiente y rápidamente una proteína de interés. Discusión 97 El sistema degrón inducible por auxina como herramienta para inhibir la expresión de la γ-tubulina en células RPE1. Teniendo en cuenta que las células hTERT-RPE1 son ampliamente usadas para estudiar la nucleación tanto desde el CTR como desde otros MTOCs, decidimos generar una línea celular hTERT-RPE1 knock-in, donde la isoforma mayoritaria de γ-tubulina en estas células (codificada por el gen TUBG1) estuviera fusionada con la secuencia degron inducible por auxina (mAID), además de la proteína fluorescente mCherry2. Nuestros resultados han demostrado que la fusión de la secuencia mAID-mCherry2 en el extremo C-terminal de la γ-tubulina 1 no afecta a su localización ni a su capacidad de nucleación de MTs, de acuerdo con estudios previos donde ya habían insertado la proteína GFP después del último exón en el gen que codifica esta proteína (Bauer et al., 2016b). La proteína γ-tubulina 1-mAID-mCherry2 se localiza en el centrosoma en interfase, así como en los polos y sobre el huso mitótico en mitosis de la misma forma que la proteína silvestre. Este potente sistema nos ha permitido además degradar de manera específica la γ-tubulina 1, sólo cuatro horas después de inducir su degradación con IAA, y sin afectar la estabilidad de la otra isoforma, la γ-tubulina 2. Esto resuelve por un lado el problema de la inhibición de la expresión de la γ-tubulina, a menudo complicada desde el punto de vista técnico debido a la alta estabilidad del pool de la proteína en el CTR, lo que requiere de dos rondas de transfección del dúplex de siRNAs para conseguir una inhibición de la expresión eficiente (Vinopal et al., 2012a). Pero además, nos permite pasar por encima de los problemas derivados de su inhibición a largo plazo arriba mencionados. En contra de lo que pensamos inicialmente, la otra isoforma de γ-tubulina presente en células RPE1 (codificada por el gen TUBG2), aunque mucho menos abundante en comparación con la γ-tubulina 1, sí parece jugar algún papel en la nucleación de MTs en estas células. Tras caracterizar sus niveles de expresión y su localización en las células RPE-1, nos planteamos obtener una línea celular KO de esta proteína, aunque los intentos no fueron exitosos. Hay varias razones que pueden explicar este hecho. Por un lado, es posible que los ARN guías empleados para dirigir la endonucleasa Cas9n no fueran lo suficientemente eficientes. Lamentablemente, el alto grado de similitud en la secuencia de exones entre los genes TUBG1 y TUBG2 no nos permitía abrir mucho el abanico de posibilidades. Por otro lado, la falta de herramientas para detectar específicamente la γ-tubulina 2 dificultó el proceso de selección y comprobación de posibles clones mutantes. En experimentos de IF y teniendo en cuenta sus limitados niveles de expresión fue imposible la identificación de los clones mutantes aun en condiciones de degradación de la isoforma γ-tubulina 1. La selección por PCR tampoco dio resultados positivos. Amplificamos la región circundante al sitio de apareamiento de los ARN guías con el fin de Discusión 98 detectar inserciones o deleciones que fueran evidentes al producir un cambio de tamaño del amplicón, pero ninguno de los clones comprobados mostró tales variaciones. Por lo tanto, decidimos combinar la degradación inducida por IAA de la proteína γ-tubulina 1-mAID-mCherry2 en la línea knock-in, con experimentos de siRNA de la TUBG2, para así poder evaluar el papel de la totalidad de la γ-tubulina en las cuestiones que nos habíamos planteado. Posteriormente, ante los sorprendentes efectos en la nucleación desde el AG en ausencia de la γ-tubulina 2, nos planteamos generar una línea celular knock-in para esta proteína tal y como habíamos hecho para la γ-tubulina 1. Sin embargo, no conseguimos detectar ningún clon aislado que hubiera incorporado la secuencia mAID-mNeonGreen, que es la que habíamos elegido para fusionar a la secuencia de la TUBG2. La selección por citometría de las células que se habían transfectado con el plásmido que contiene la Cas9n (gracias a la expresión de la proteína reportera Ruby) permitió seleccionar una población de células donde potencialmente se produciría la inserción en el locus endógeno de la TUBG2. De hecho, un análisis por PCR de ADN genómico de esta población de células mostraba el producto de amplificación correcto. Sin embargo, los experimentos de IF y de PCR en los clones aislados a partir de esta población no mostraron ningún clon positivo. Nuevamente, la falta de éxito puede deberse a la baja eficiencia de los ARN guías empleados. Alternativamente, puede ser que los bajos niveles de expresión de la TUBG2 no permitieran la selección precisa de las células que habían incorporado la etiqueta mAID-mNeonGreen, pese a que se había elegido la proteína mNeonGreen teniendo en cuenta estos bajos niveles de expresión, por ser mucho más brillante que la mCherry2. Adicionalmente podría ocurrir que la etiqueta insertada afectase a la estabilidad de la γ-tubulina 2 y se viera afectada la viabilidad celular. En este caso, las células positivas dejarían de proliferar y se irían diluyendo en el cultivo, o incluso podrían terminar entrando en apoptosis si los efectos de la ausencia de la proteína fueran muy severos. Cabría pensar que, debido a la alta homología entre las dos isoformas de γ-tubulina, si la inserción no afectó a la γ-tubulina 1 no debiera afectar a la isoforma 2. Sin embargo, la mayoría de diferencias entre las isoformas se concentra en la región C-terminal, por lo que no es descartable que pudiera afectar alguna función específica de esta isoforma. Hace sólo unos meses se ha publicado un estudio, perteneciente al laboratorio del Prof. Goshima que aborda algunas de las cuestiones que sirven de punto inicial de esta tesis y que usa la herramienta del degrón inducible por auxina de la TUBG1 para intentar resolverlas (Tsuchiya & Goshima, 2021). Una diferencia importante entre ese estudio y el trabajo de esta tesis es la línea celular empleada. El estudio del laboratorio de Gohta Goshima ha sido realizado empleando las células de carcinoma de colon HCT116, mientras nosotros hemos utilizado la Discusión 99 línea celular RPE1. Como se ha mencionado en varias ocasiones a lo largo de esta tesis, las células RPE1 son ampliamente usadas para estudiar la nucleación de MTs, además de constituir el sistema de elección para el estudio de la nucleación de MTs desde MTOCs no centrosómicos como el AG. Adicionalmente son células no transformadas, que fueron inmortalizadas mediante expresión de la telomerasa, por lo que presentan mecanismos estrictos de control ante perturbaciones, como por ejemplo daño en el ADN, que causan la parada o salida del ciclo celular en estas células. Por su parte, las células HCT116, como la mayoría de línea celulares de origen tumoral, probablemente puedan sortear mecanismos de control celular. Este hecho podría contribuir a que los autores hayan sido capaces de una línea celular knock-out para la γ-tubulina 2. No nos ha sido posible plantearnos usar el mismo método para tratar de repetirlo en células RPE1 porque tanto la descripción exacta de las herramientas, como los métodos de caracterización (que se limitan a una PCR de ADN genómico) son escasos. En conclusión, los resultados presentados demuestran que el sistema de degradación condicional mediante auxina permite la degradación rápida y eficiente de una proteína de interés en células RPE1. Su implementación para el estudio funcional de la proteína γ-tubulina 1 ha sido satisfactorio, permitiendo degradarla, y además, facilitando la distinción entre esta isoforma y la γ-tubulina 2. Además, la combinación de este sistema de degradación junto con la inhibición de la expresión de la γ-tubulina 2 mediante siRNA, se ha demostrado como una estrategia eficaz para el análisis de la nucleación en ausencia global de γ-tubulina. Caracterización de la expresión de la isoforma γ-tubulina 2 en células RPE1. En la presente tesis, hemos analizado la expresión de la isoforma γ-tubulina 2 en las células RPE1, comprobando que, aunque en menor abundancia que la γ-tubulina 1, esta isoforma se transcribe en esta línea celular. Además, hemos visto por primera vez que la γtubulina 2 se localiza en el CTR de células epiteliales en interfase de manera independiente a la γ-tubulina 1. Los datos disponibles en la literatura cerca de la expresión de esta isoforma de γtubulina difieren bastante en función del modelo de estudio. En humanos, se ha descrito una expresión ubicua de esta isoforma en diferentes tejidos y momentos del desarrollo (Dráberová et al., 2017b; Wise et al., 2000) Otros estudios en ratones restringen su expresión a etapas tempranas del desarrollo y al tejido cerebral en individuos adultos (Vinopal et al., 2012a; Yuba- Kubo et al., 2005). En cualquier caso, nuestros datos indican que, a pesar de ser mucho menos abundante que la γ-tubulina 1, esta proteína tendría funciones específicas, complementarias a las de la isoforma mayoritaria que no requerirían de niveles elevados de expresión. Es 106 Conclusiones 107 PRIMERA. La incorporación en el extremo C-terminal de la proteína γ-tubulina 1 de la secuencia de degradación inducible por auxina mAID fusionada a la proteína mCherry2, no afecta a la localización ni estabilidad de esta proteína, constituyendo una herramienta válida para el análisis in vivo de la localización y dinámica de esta proteína. SEGUNDA. El sistema de degradación inducible por auxina, que permite la degradación controlada y en cuestión de pocas horas de la γ-tubulina 1, emerge como un instrumento extremadamente útil para estudiar el papel de esta isoforma de γ-tubulina a la nucleación de MTs desde diferentes MTOCs. TERCERA. La isoforma γ-tubulina 2 se expresa en células hTERT-RPE1, localizándose en el CTR de manera independiente a la γ-tubulina 1. Esta isoforma también se encuentra en el AG cuando se analiza en sobreexpresión. CUARTA. La γ-tubulina es esencial para la nucleación de microtúbulos en células RPE1 en interfase, tanto desde el CTR como desde el AG, los dos principales MTOCs en esta línea celular. QUINTA. Existen diferencias funcionales entre las dos isoformas de γ-tubulina. Mientras que ambas actúan como activadoras de la nucleación desde el CTR, en el AG tienen funciones opuestas: mientras que la γ-tubulina 1 estimula la nucleación, la γ-tubulina 2 funciona como un inhibidor de la nucleación desde este MTOC. SEXTA. Los mecanismos por los que la ausencia de γ-tubulina 2 estimula la nucleación desde el AG dependen de un mayor reclutamiento de γ-tubulina 1 a este orgánulo. Este aumento de la nucleación es además dependiente de AKAP450, y está mediado por CDK5RAP2. Conclusiones 108 109 Materiales y métodos 110 Materiales y métodos 111 1. Materiales 1.1. Líneas celulares Durante la realización de este trabajo se han utilizado las siguientes líneas celulares: Línea celular Especie Origen/Características Medio Cultivo Procedencia hTERT RPE1 Humana Epitelio pigmentario de retina. No cancerosa. DMEM/F12 ATCC (CRL-4000™) hTERT RPE1 AKAP450 knock-out Humana Línea mutante que no expresa la proteína AKAP450. DMEM/F12 Generada previamente en el laboratorio (Gavilan et al., 2018) hTERT RPE1 CDK5Rap2 knock-out Humana Línea mutante que no expresa la proteína CDK5Rap2 DMEM/F12 Generada previamente en el laboratorio (Gavilan et al., 2018) 293T Humana Epitelio derivado de riñón DMEM Dra. M. Malagón, Universidad de Córdoba. 1.2. Reactivos Las siguientes drogas y reactivos se usaron a las concentraciones que a continuación se indican: Reactivo Descripción Concentración Referencia Nocodazole Compuesto que provoca la despolimerización de los MTs de la célula 10 µM Sigma Ref. M1404 Ampicilina Antibiótico de selección 100 µg/mL Sigma Ref. A9518 Kanamicina Antibiótico de selección 100 µg/mL Sigma Ref. K1377 Puromicina Antibiótico de selección 6 µg/mL Sigma Ref. P8833 Doxiciclina Antibiótico empleado para inducir la expresión de la proteína OsTIR1 1 µg/mL Sigma Ref. D9891 Auxina Fitohormona empleada para degradar proteínas mediante el sistema degrón AID 500 µM Sigma Ref. I3750 Auxinole Compuesto antagonista de la auxina 200 µM TRC Ref. A794595 DAPI Colorante fluorescente que se usa para teñir el ADN 1 µg/mL Roche Ref. 10236276001 Yoduro de Propidio Agente intercalante del ADN empleado para medir contenido de ADN por citometría de flujo 40 µg/mL Sigma Ref. P4170 Materiales y métodos 112 1.3. Anticuerpos 1.3.1. Anticuerpos primarios A continuación se detallan los anticuerpos primarios usados, indicando su información de origen y procedencia. Además, se detallan las diluciones de uso en inmunofluorescencia (IF) en células fijadas en metanol a -20°C y para Western-Blot (WB): Anticuerpo Antígeno Fuente/ Especie Procedencia IF WB Anti-OsTIR1 OsTIR1 Conejo MBL Ref. PD048 - 1:1000 Anti-γ-tubulina (GTU88) γ-tubulina Ratón Sigma Ref. T6557 1:500 1:1000 Anti-mCherry mCherry Conejo Plataforma anticuerpos recombinantes, Institut Curie, París (Francia). Descatalogado. 1:8000 1:1000 Anti-mCherry (B3-hFC2) mCherry Humano Plataforma anticuerpos recombinantes, Institut Curie, París (Francia) Ref. A- R-H#46 1:50 - Anti-Nineína Nineína Humano Plataforma anticuerpos recombinantes, Institut Curie, París (Francia) Ref. A- R-H#28 1:20 - Anti-GM130 GM130 Conejo Dr. Y.Misumi, Fukuoka University, Japan 1:10000 Anti-GM130 GM130 Ratón BD Biosciences Ref. 610822 1:500 - Anti-CP110 CP110 Conejo Proteintech Ref. 12780-1-AP 1:1000 - Anti-γ-tubulina (TU-30) γ-tubulina 1 Ratón Santa Cruz Ref. sc-51715 1:500 - Anti-EB1 EB1 Ratón BD Biosciences Ref. 610534 1:800 - Anti-α- tubulina α-tubulina Ratón Sigma Ref. T6199 1:2000 - Suero RN GMAP210 Humano Generado previamente en el laboratorio (Infante et al., 1999) 1:5000 - Anti-TUBGCP2 (GCP2-01) GCP2 Ratón Antibodies.com Ref. A86579 1:500 1:500 Anti-flag (M2) Flag Ratón Sigma Ref. F1804 1:1000 - A24 AKAP450 Ratón Dr. M.Bornens Institut Curie, París (Francia) 1:20000 - Anti- CDK5Rap2 SC3-2 CDK5Rap2 Conejo Generado previamente en el laboratorio (Gavilan et al., 2018) 1:500 - Materiales y métodos 113 1.3.2. Anticuerpos secundarios Aquí se detallan los anticuerpos secundarios empleados en este trabajo: Secundarios inmunofluorescencia Anticuerpo Origen Fluorocromo Procedencia Anti-Ratón IgG (H+L) Burro Alexa Fluor 488 Jackson InmunoResearch Ref. 715-545-150 Anti-Conejo IgG (H+L) Burro Alexa Fluor 488 Jackson InmunoResearch Ref. 715-545-152 Anti-Conejo IgG (H+L) Burro Cy3 Jackson InmunoResearch Ref. 711-165-152 Anti-Humano IgG (H+L) Burro Cy3 Jackson InmunoResearch Ref. 709-165-149 Anti-Humano IgG (H+L) Burro Alexa Fluor 647 Jackson InmunoResearch Ref. 709-605-149 Anti-Conejo IgG (H+L) Burro DyLight 649 Jackson InmunoResearch Ref. 711-605-152 Secundarios western blot Anticuerpo Procedencia ECL Anti-Raton IgG Amersham Ref. NA931VS ECL Anti-Conejo IgG Amersham Ref. NA934VS Materiales y métodos 114 1.4. Plásmidos Plásmido Características Referencia plFA1 Plásmido de expresión de la proteína Cas9n y dos ARNs guía. Generado ya en el lab. (Gavilan et al., 2018) pCW57-MCS1-P2A- MCS2 Vector de expresión lentiviral inducible por doxiciclina. Permite la expresión de dos genes simultáneamente. Addgene #71782 psPAX.2 Plásmido de empaquetamiento de partículas víricas. Addgene #12260 pMD.2 Plásmido de la envuelta lentiviral. Addgene #12259 pMK292 Plásmido que contiene el ADNc de la secuencia mAID y la proteína mCherry2 para añadirlo como etiqueta usando CRISPR/Cas9 Addgene #72830 pMK243 (Tet- OsTIR1-PURO) Plásmido de expresión de la proteína OsTIR1 bajo el promotor inducible por doxiciclina. Addgene #72835 pX330-AAVS1 Plásmido para expresar la proteína Cas9 y el ARN guía que la dirige al locus AAVS1. Addgene #72833 pCW57-GalT-eGFP- P2A-EB1-iRFP Plásmido de expresión lentiviral con los cDNAs de las proteínas EB1 y el fragmento transmenbrana de GaLT. - pCW57-Centrin2- iRFP-P2A-EB1-eGFP Plásmido de expresión lentiviral con los cDNAs de las proteínas EB1 y Centrin2. - pMK292-TUBG1 Plásmido con los brazos de homología entorno al codón de parada del locus del gen TUBG1. - plFA1-TUBG1 Plásmido para expresar la proteína Cas9n y los ARNs guía que la dirigen al locus del gen TUBG1 - Materiales y métodos 115 2. Métodos 2.1. Cultivos celulares Para el cultivo de las células hTERT RPE1 se utilizó medio DMEM/F12 (Sigma Ref. D8437) suplementado con suero fetal bovino al 10% (Sigma Ref. F7524), L-Glutamina 2mM (Sigma Ref. G7513), estreptomicina 100 µg/mL y penicilina 100U/mL (Sigma Ref. P0781). Las células 293T fueron cultivadas en medio DMEM (Sigma Ref. D5796) suplementado con suero fetal bovino al 10%, L-glutamina 2mM, estreptomicina 100 µg/mL y penicilina 100U/mL. Todos los cultivos se mantuvieron en una atmósfera húmeda a 37°C y con CO2 al 5%. Las líneas celulares empleadas en este trabajo son adherentes por lo que se cultivaron en placas de cultivo de distintos tamaños según requerimientos. Se subcultivaron cada 2-3 días realizando un lavado con PBS con el mismo volumen que el del medio de cultivo y se despegaron añadiendo una décima parte de este volumen de solución estéril de tripsina al 0,25% (Sigma Ref. T4049). Tras 5 minutos a 37°C se neutralizó la reacción con el medio de cultivo correspondiente a la línea células y se sembraron las células a distintas diluciones. 2.2. Manipulación y análisis de ácidos nucleicos 2.2.1. Extracción de ARN total La extracción de ARN total se realizó usando el kit RNAeasy Mini Kit (Quiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se estimó por espectrofotometría (Nanodrop, ND-1000) usando los valores de los ratios 260/280 ≈ 2 y 260/230: 1,8 - 2 como control de calidad del ARN purificado. Además, cada muestra de ARN se corrió en un gel de agarosa al 2% para comprobar su integridad observando las bandas de las subunidades ribosomales 28S y 18S. 2.2.2. Determinación de ARNm mediante RT-qPCR Para eliminar posible contaminación de ADN genómico las muestras de ARN fueron tratadas con DNAsa RQ1 (Promega Ref. M6101) según las instrucciones del fabricante. Para ello se partió de 3µg de ARN total para cada muestra. Tras el tratamiento, se obtuvo el ADN complementario (ADNc). Se realizó la retrotranscripción del ARN usando el sistema Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen Ref. 118080-044) con hexámeros aleatorios de nucleótidos según las instrucciones del fabricante. Materiales y métodos 122 Para la titulación de los virus se infectaron células hTERT RPE1 con una dilución seriada de los virus. Tras 72 horas se extrajo el ADN genómico de las células infectadas y se realizó una qPCR para detectar la integración de los virus usando cebadores frente a las regiones LTR (de Long Terminal Repeat), al gen de la albúmina (estimación del número de células). Para calcular el MOI (de Multiplicity of Infection), los valores obtenidos fueron relativizados al valor de ampificación de la albúmina y a una curva patrón de los cebadores para corregir en función de la eficiencia de amplificación de los mismos. En paralelo, se realizaron extractos totales de las células para comprobar por WB la inhibición de la expresión de la proteína. La óptima inhibición de la expresión de γ-tubulina 2 a las 72 h se consiguió con un MOI de valor 5. 2.7. Degradación de proteínas inducible mediante auxina El sistema de degradación inducible mediante auxina es una técnica actual y novedosa para eliminar proteínas en células humanas. Como se explica en la introducción, para poder usar este sistema se necesitan dos requisitos: 1. Obtener que la línea celular de interés exprese una proteína TIR1, en nuestro caso la proteína OsTIR1 de Oryza sativa. 2. Introducir en el gen cuyo producto proteico se quiere degradar la secuencia mAID para que se expresen juntos, de tal manera que se pueda marcar la proteína de interés para su ubiquitinización y degradación vía proteosoma cuando se añada auxina al medio de cultivo. En ambos pasos es necesario introducir en el genoma elementos exógenos, para lo que aprovechamos la maquinaria de recombinación homóloga de la propia célula. Cuando se realiza un corte empleando el sistema CRISPR/Cas9 en el sitio donde se quiere realizar la integración, si aportamos una secuencia molde algunas células la tomaran para realizar la reparación de la rotura de la hebra de ADN. Esta secuencia molde debe contener la secuencia de las regiones que flanquean al sitio de corte (las llamaremos regiones de homología), y entre ellas, los elementos exógenos que se quieren integrar en el genoma. De esta manera, para ambos pasos utilizamos dos plásmidos, uno que integra el sistema CRISPR/Cas9 y otro que aporta la secuencia molde para la reparación, que hemos llamado plásmido donador. 2.7.1. Generación de la línea celular hTERT RPE1 OsTIR1 Para generar la línea celular hTERT RPE1 OsTIR1 empleamos dos plásmidos disponibles en addgene. Como plásmido donador, empleamos el vector pMK243 (Tet-OsTIR1-Puro) que Materiales y métodos 123 contiene la secuencia de la proteína OsTIR1 bajo un promotor inducible por doxiciclina, además del gen de resistencia a puromicina. Como plásmido de expresión del sistema CRISPR/Cas9 usamos el plásmido pX330-AAVS1, que expresa la endonucleasa Cas9n y el ARN guía para dirigirla al locus AAVS1 del genoma. Se transfectaron 10 millones de células hTERT RPE1 con ambos plásmidos mediante electroporación (ver apartado 8 de esta sección). Para la cotransfección decidimos electroporar ambos plásmidos en una proporción 1:1. Al día siguiente, se cambió el medio de cultivo de las células electroporadas para retirar los restos celulares de las células que no sobrevivieron a la transfección. Este mismo día se sembraron células sin transfectar para usarlas como control de la selección con antibiótico. 72 horas después de la electroporación, una vez que el cultivo celular tenía buen aspecto, se volvió a cambiar el medio y se añadió puromicina a éste y a las células control sin transfectar para realizar la selección de las células que habían integrado la secuencia de la proteína OsTIR1. Una vez que todas las células de la placa control se hubieron muerto, se levantaron las células transfectadas (ver apartado 5 de esta sección) y se sembraron en placas de 96 pocillos mediante dilución límite para obtener clones aislados. A la semana, cuando se comenzaron a ver colonias suficientemente grandes, se comprobó de manera visual que hubiera crecido solo una célula por pocillo. Una vez que las colonias ocupaban la mayor parte de los pocillos se subcultivaron las células de cada pocillo tal y como se detalla en el apartado 5 de esta sección, pero empleando 20µL de tripsina en cada pocillo. De estos 20µL, se tomaron 10µL para extraer el ADN genómico y comprobar mediante PCR la inserción del ADNc de la proteína OsTIR1 en el locus AAVS1. Para esta comprobación se diseñaron dos parejas de cebadores. Una de las parejas daba un producto de amplificación cuando se había producido la integración en al menos uno de los dos alelos de la región AAVS1 (pareja de identificación de integración). La otra pareja siempre producía un producto de amplificación pero de distinto tamaño en función de si se había integrado o no (pareja de identificación de homocigotos), de tal manera que la PCR de un clon heterocigoto daría lugar dos productos de distinto tamaño, mientras (Esquema representativo en la figura R3). En la siguiente tabla se detallan los cebadores empleados en la detección de clones OsTIR1 positivos: Materiales y métodos 124 Detección de la PCR Cebador directo Cebador inverso Identificación de integración CGGACCACTTTGAGCTCTACTGG CGATTTTGACCTTGACATGCTCCC Identificación de homocigotos GGAAGGAGGAGGCCTAAGGA GTTTCCCCTTCCCAGGCAGGTC Tal y como se indica en el apartado 1.2.1 de los Resultados, la dificultad para realizar la comprobación de los clones positivos con la pareja de identificación de homocigotos nos hizo tener que comprobar mediante WB la expresión de la proteína OsTIR1. Para ello, se indujo la expresión de esta proteína con doxiciclina (1 µg/mL) durante 16 horas y se recogieron los distintos clones para realizar extractos celulares (ver apartado 6 de esta sección para más detalles). De los clones que se identificaron como homocigotos, se seleccionó uno para emplearlo como línea hTERT RPE1 OsTIR1. 2.7.2. Generación de la línea celular hTERT RPE1 OsTIR1 TUBG1-mAID-mCherry2 Una ventaja que aporta este sistema de degradación frente a los otros empleados en este trabajo, es que se puede aprovechar este paso para no sólo fusionar la secuencia mAID a la proteína que se pretende degradar, sino que se puede introducir además otras secuencias como etiquetas (flag, HA, etc.) o marcadores fluorescentes. En nuestro caso, además del mAID introdujimos la secuencia de la proteína fluorescente mCherry2. Para la generación de esta línea los plásmidos que empleamos tuvieron que ser construidos de manera específica para dirigir la inserción al locus del gen TUBG1, que codifica para la proteína γ-tubulina 1. De esta manera, al final del proceso conseguimos que la línea hTERT RPE1 OsTIR1 expresara la proteína endógena γ-tubulina 1 fusionada a la secuencia mAID y la proteína fluorescente mCherry2 (ver esquema ilustrativo en la Figura R4). a) Construcción del plásmido plFA1-TUBG1 El plásmido plFA1, generado previamente en el laboratorio, contiene los elementos necesarios para expresar el sistema CRISPR/Cas9. Sin embargo, a diferencia del plásmido pX330- AAVS1 que expresa la proteína Cas9, este plásmido contiene el ADNc de la nicasa Cas9n por lo que es necesario la expresión de dos ARNs guía para cortar las dos cadenas de la hebra de ADN (para más información ver el apartado 1.2.2 de la sección de Resultados). Además, este plásmido Materiales y métodos 125 expresa la proteína fluorescente EGFP, lo que permite evaluar la eficiencia de la transfección y la selección de células positivas mediante citometría de flujo. Para el diseño de los ARNs guía se empleó la herramienta web https://www.atum.bio, indicando que la especie es humano, la secuencia PAM es NGG y la endonucleasa empleada es nicasa. Se introdujeron las 100pb del gen TUBG1 previas al codón de parada y se empleó la pareja de guías que devolvió como resultado la herramienta. Las secuencias de los ARNs guía fueron las siguientes: ARN guía Secuencia 5’-> 3’ Secuencia 3’->5’ Guía sentido directo (forward) ATGAGTACCATGCGGCCACA TACTCATGGTACGCCGGTGT Guía sentido inverso (reverse) GGGAGATTGTGCAGCAGCTC CCCTCTAACACGTCGTCGAG Estos oligonucleótidos fueron encargados a la casa comercial Sigma-Aldrich y, para facilitar la clonación de los mismos, se diseñaron con extremos cohesivos homólogos a los que se generan al digerir el plásmido plFA1 con las enzimas de restricción específicas de los sitios de clonación de los ARNs guía (BbsI y BsaI). Previamente a la clonación de los guías en el plásmido, cada pareja de oligonucleótidos se sometió a un protocolo estándar de hibridación y a continuación se introdujeron mediante ligación en sus dianas correspondientes. b) Construcción del plásmido pMK292-TUBG1 Para generar el plásmido donador, tomamos como base el plásmido pMK292, que ya contiene la secuencia mAID-mCherry2-STOP que queríamos introducir al final del gen TUBG1, e introdujimos los fragmentos de ADN correspondientes a las regiones de homología. La elección de la secuencia de las regiones de homología se realizó tomando alrededor de 1kb hacia ambos sentidos del codón de parada del gen TUBG1. Estas regiones (RHI, región de homología izquierda; RHD, región de homología derecha) se obtuvieron mediante PCR usando como molde ADN genómico extraído de células hTERT RPE1. Para ello se diseñaron cebadores específicos que añadían las dianas de restricción necesarias para realizar la clonación y además, para la amplificación de la RHI tuvimos en cuenta que: Materiales y métodos 126 - El cebador inverso para amplificar la RHI no debe incluir el codón de parada de la proteína endógena para permitir la transcripción hasta el final de la secuencia exógena que se introduce. - Este mismo cebador, debe incluir mutaciones puntuales en la región que reconocen los ARNs guía para evitar la re-edición del genoma una vez producida la recombinación homóloga. Además de amplificar las regiones de homología, también tuvimos que amplificar la secuencia mAID-mCherry2-STOP desde el plásmido pMK292 para añadir dianas de restricción, y una secuencia corta de unión (linker) entre el último exón del gen y la secuencia exógena. La inclusión de un linker se realizó para proporcionar una separación entre ambas secuencias para evitar que se pudiera ver afectada la función de la proteína γ-tubulina 1. De esta manera, la secuencia molde con las dianas de restricción empleadas quedaría de la siguiente manera: SacI – RHI – EcoRI – linker – mAID – mCherry2 – EcoRV – RHD – MluI Los cebadores empleados para construir el plásmido pMK292-TUBG1 fueron: Descripción cebador Secuencia RHI directo CAGGAGCTCGGCCCAACAGGCCCTGTCCTAG RHI inverso CAGGAATTCGCTGCTCCTGGGTGCCCCAGGAGATGTAG TCTGGTCGCGTTGCTGCATGGTACTCATCGATGAGCTG CTGCACGATTTCTCTTGATGTGTCCATCTCATCAAAGTT Tag directo CTACGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGA TCCACCGGTCGCCACCAAGGAGAAGAGTGCTTGTCCTA Tag inverso CAGTTAGATATCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG RHD directo CAGGATATCTAAGTCCCCCAGGACAGGGACCCTC RHD inverso CAGACGCGTTAGGTGGTGTGTGCCTGTGATC Una vez obtenido mediante PCR todos los fragmentos de ADN, se digirieron con las enzimas de restricción indicadas y se ligaron simultáneamente con el plásmido pMK292, Materiales y métodos 127 también digerido con las enzimas correspondientes. De esta manera se obtuvo el plásmido donador pMK292-TUBG1. c) Obtención de la línea celular hTERT RPE1 OsTIR1 TUBG1-mAID-mCherry2 Una vez construidos los dos plásmidos indicados en los anteriores apartados, se partió de 10 millones de células hTERT RPE1 OsTIR1 para co-transfectarlas con estos mismos. La cotransfección se hizo mediante electroporación (ver detalles en el apartado 8 de esta sección) en una proporción plFA1-TUBG1:pMK292-TUBG1 de 1:3 para asegurarnos en la medida de lo posible que durante la selección de células que hayan incorporado el plásmido pLFA1-TUBG1, estas hubieran incorporado el otro también. Al día siguiente de la electroporación se cambió el medio de cultivo para retirar los restos de las células que no sobrevivieron y 48 horas después se realizó una selección mediante citometría de flujo de las células que expresaban EGFP (estas células incorporaron el plásmido plFA1-TUBG1). Se usó el citómetro BD FACSAria III Sorter (BD Biosciences), y el láser Blue488nm junto con el filtro 530/30 como configuración óptica. Para preparar las células para citometría, éstas se recogieron y se centrifugaron a 300G durante 5 minutos y se lavaron con PBS1X. Se volvieron a centrifugar y se resuspendieron en tampón de citometría (PBS1X, EDTA 5mM y 25mM HEPES, pH 7). Se realizó la selección, en la cual se recogieron las células en un tubo el medio de cultivo adecuado al tipo celular. A la semana de la selección, cuando se habían recuperaron las células y crecido lo suficiente, se realizó otra selección por citometría de flujo siguiendo el mismo procedimiento. En esta ocasión se recogieron las células positivas para la proteínas mCherry2, por lo que la configuración óptica empleada fue con el láser Yellow/Green 561nm y el filtro 610/20. Además, aprovechando la capacidad del citómetro de sembrar células únicas, se sembraron las células seleccionadas en placas de 96 pocillos para obtener clones aislados. A la semana de la segunda selección, se comprobó que las colonias que estaban creciendo en las placas de 96 pocillos provinieran de una única célula. Una vez estaban lo suficientemente crecidas, tal y como se hizo en la generación de la línea celular hTERT RPE1 OsTIR1, se aisló genómico de los clones y se comprobó mediante PCR si se había realizado la integración y si esta se había producido en uno o ambos alelos del gen. Esta vez se usó una sola pareja de cebadores que dan un producto de distinto tamaño en función de si se ha realizado la integración o no. Para la comprobación por PCR se emplearon los siguientes cebadores: Materiales y métodos 128 Detección de la PCR Cebador directo Cebador inverso Identificación de clones CTACCATCATGTCAGCCAGC TGTATATGAGAAAGAGATGCGTGA De los clones positivos y homocigotos se seleccionaron tres que presentaban un comportamiento normal (ver Figura R6) y se mezclaron en proporciones iguales para generar la línea celular hTERT RPE1 OsTIR1 TUBG1-mAID-mCherry2. 2.7.3. Degradación de la proteína γ-tubulina 1-mAID-mCherry2 vía sistema AID Para realizar la degradación rápida e inducible de la proteína γ-tubulina 1-mAID- mCherry2, se indujo previamente la expresión de la proteína OsTIR1 con doxiciclina (1µg/mL) durante al menos 16 horas. En este punto es necesario destacar que, como está descrito en la literatura (Natsume & Kanemaki, 2017a), cuando está presente OsTIR1 se produce una degradación basal de la proteína que tenga fusionada la secuencia mAID. Para evitar que la proteína de interés se degrade en ausencia de auxina se ha desarrollado un análogo de esta fitohormona, el auxinol ((Yesbolatova et al., 2019a), que se ha demostrado eficaz evitando la unión de la proteína OsTIR1 con la secuencia mAID. Por lo tanto, junto con la doxiciclina se añadió siempre auxinol (200µM) para mantener los niveles endógenos de γ-tubulina 1. Tras las 16 horas de inducción de OsTIR1, se lavó el auxinol y se añadió auxina al medio de cultivo (500µM). Se recogieron las células a distintos tiempos para analizar la velocidad de la degradación de la proteína. Tras el análisis del tiempo de degradación de la proteína (ver apartado 1.2.3 de la sección de resultados), una vez establecido que a las 4 horas la degradación era completa, todos los experimentos se realizaron tras 4 horas de degradación en presencia de auxina. 2.8. Análisis de la nucleación de microtúbulos 2.8.1. Análisis de la nucleación en células vivas Para analizar la nucleación de MTs en células vivas se prepararon partículas virales para expresar la proteína de extremos (+) de MTs EB1 fusionada a una determinada proteína fluorescente. Además, simultáneamente se expresó como marcador de centrosoma la proteína centrina 2-iRFP (en este caso EB1 estaba fusionado a la proteína EGFP), y como marcador del aparato de Golgi el fragmento transmembrana de la proteína Beta-1,4-galactosyltransferase 1 (GalT)-EGFP (en este caso EB1 se fusionó a la proteína iRFP). Esta expresión simultánea se realizó empleando el plásmido pCW57-MCS1-P2A-MCS2, que permite incluir el ADNc de dos proteínas a ambos lados de la secuencia P2A, que funciona como una señal durante la traducción para Materiales y métodos 129 escindir en ese punto la secuencia polipeptídica que se está produciendo. De esta manera, se produce la expresión de un solo ARNm que durante la traducción da lugar a dos proteínas. Las células RPE1-TUBG1 se transfectaron con el dúplex de siRNA correspondiente y se sembraron en placas µ-Slide 4 Well IbiTreat (Ibidi Ref. 80426). La infección con las partículas lentivirales se realizó 16 horas antes del experimento. Al mismo tiempo, se añadió doxiciclina y auxinol al medio de cultivo para inducir la expresión de OsTIR1. Al día siguiente se cambió el medio de las células por medio DMEM/F12 sin rojo fenol (Sigma Ref. D6434) y se añadió auxina. A las 3 horas la placa se colocó en el microscopio a 37°C y un 5% de CO2 y se dejó durante una hora antes de realizar el experimento. Para el análisis, se grabaron secuencias de imágenes de una duración de 90 segundos, con un intervalo de 1 segundo entre fotogramas, del canal correspondiente a la proteína EB1. De los otros dos canales, el correspondiente a la proteína γ-tubulina 1-mCherry2 y el del marcador de centrosoma/Golgi se tomó una imagen en el primer fotograma del vídeo. Esta se usó para comprobar que γ-tubulina 1-mCherry2 estaba degradada y localizar el orgánulo que se quería analizar. Los experimentos se realizaron eligiendo un único plano que fuera el plano central del marcador de la estructura que se estuviera analizando en ese experimento, es decir, del centrosoma o del aparato de Golgi. 2.8.2. Ensayos de repolimerización de microtúbulos Los ensayos de nucleación de MTs se llevaron a cabo en células cultivadas sobre cubreobjetos, siendo clave en este tipo de experimentos que el cultivo esté en buen estado, que las células estén bien adheridas a los cubreobjetos y que la confluencia sea adecuada a fin de disminuir la variabilidad del experimento. Los MTs se despolimerizaron incubando las células con nocodazole (NZ) a 10 μM durante 3 horas a 37 °C. Transcurrido el tiempo de despolimerización, los cubreobjetos se lavaron 5 veces en medio de cultivo completo frío, incubado en hielo o a 4°C. Para ello, los cubreobjetos se colocaron en un minirack (Coverslip Mini-Rack. Molecular Probes; Ref. C-14784), y con ayuda de una pinza, el mini-rack se sumergió 5 veces rápidamente en el medio frío. Después, los cubreobjetos o bien se fijaron en metanol a -20°C, o se incubaron en placas de cultivo, en las que se había añadido medio de cultivo precalentado a 37°C para llevar a cabo los ensayos de repolimerización. Posteriormente, a distintos tiempos de repolimerización, los cubreobjetos se colocaron de nuevo en el mini-rack y se sumergieron en un recipiente con metanol a -20°C durante 6 minutos. Después de la fijación, las células se procesaron por ensayo de IF como se Materiales y métodos 130 ha descrito anteriormente. Siempre se fijaron cubreobjetos antes de añadir NZ y a tiempo cero como control de la correcta despolimerización. 2.9. Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo Para analizar el ciclo celular se realizó el protocolo de marcaje del ADN de doble cadena mediante yoduro de propidio y se cuantificó la intensidad del marcaje mediante citometría de flujo. El protocolo de preparación de las muestras fue: en primer lugar, las células se tripsinizaron, se recogieron y se centrifugaron a 1.500 rpm durante 5 minutos a 4°C. Luego se hizo un lavado en PBS1x (4 ml a 4°C) y se volvió a centrifugar en las mismas condiciones. Después se eliminó el PBS1x y el pellet de células fue resuspendido en 1 ml de etanol frío al 70% gota a gota y en agitación constante. Las células se dejaron a 4°C al menos 18 horas hasta su marcaje con PI. Para la tinción con PI, las células se centrifugaron 10 minutos a 3.000 rpm, se retiró el etanol y tras un lavado con 2 ml de PBS1x a 4°C, el pellet de células fue resuspendido en 250 μl de PBS1x, sobre los que se añadieron 250 μl de solución de extracción de ADN (190 ml Na2HPO4 0,2 M + 8 ml de Ácido cítrico 0,1 M a pH 7,8). Las células fueron incubadas con esta solución 10 minutos a 37°C. Tras ello, se centrifugaron, se descartó el sobrenadante y se resuspendieron en 250 μl de solución PI/ARNasa (PBS1x + 100 μg/mL ARNasa + 40 μg/mL PI). A continuación, las células se incubaron 30 minutos a 37°C en oscuridad y finalmente fueron analizadas. El equipo empleado para el análisis fue el citómetro BD FACSCalibur configurado con el láser 488nm y el filtro FL3-670LP. 2.10. Microscopía 2.10.1. Microscopía de epifluorescencia Las preparaciones se observaron rutinariamente en un microscopio vertical AxioImager.2 de Zeiss con una lámpara HXP120W, acoplado a una cámara Axiocam 503 monocromática de amplio rango dinámico (14bits: 16384 niveles de grises) y gran campo de visión (1936x1460px). Las adquisiciones se hicieron usando el objetivo de inmersión 63x (Plan- Apochromat 63x /1.40 oil). Para los distintos fluorocromos utilizados se usaron los siguientes filtros: 49DAPI DAPI 52He488 Alexa Fluor 488/GFP 43DsRed Cy3/mCherry2 50Cy5 Alexa Fluor 647/649 Materiales y métodos 131 2.10.2. Microscopía confocal Las imágenes de células fijadas de microscopía confocal fueron adquiridas en un microscopio confocal Leica TCS SP5 que dispone de las siguientes líneas de excitación: 405, 458, 476, 488, 496, 514, 561, 594, 633 nm, y usando un objetivo de inmersión de 63X (HCX PL APO Lambda blue 63x 1.4) a 22°C. Se obtuvieron una serie de cortes seriados además de la proyección máxima. Para las cuantificaciones, se usaron siempre las imágenes en bruto. Para las figuras, las imágenes adquiridas se procesaron con los programas de LAS AF (Leica) y Adobe Photoshop, para ajustar el tamaño, contraste o brillo, siempre a la imagen completa. 2.10.3. Microscopía confocal de disco giratorio (spinning disk) Los experimentos con células vivas fueron realizados en un microscopio confocal de disco giratorio (Spinning disk) compuesto por un microscopio invertido Axio Observer 7 de Zeiss con una cámara monocromática Hamamatsu Orca-Flash 4.0 y empleando un objetivo de inmersión de 63X (Plan-Apo 63X - A.N.:1,40). El equipo dispone de las líneas de excitación 405nm, 488nm, 561nm y 642nm. Dispone también de un incubador para mantener las condiciones experimentales a 37°C y 5% CO2. 2.11. Análisis de imágenes En este apartado se detalla cómo se realizó el análisis de imágenes en este trabajo. Excepto que se indique lo contrario, en todos los análisis se empleó el software ImageJ v.1.53f51 y las imágenes fueron adquiridas con el microscopio de fluorescencia Zeiss Apotome anteriormente descrito. 2.11.1. Análisis de la intensidad de la señal de γ-tubulina 1 en la célula completa Para realizar la cuantificación se dibujaron regiones de interés (ROI) con la herramienta de mano alzada del programa, de tal manera que cada una incluyera una célula completa, y se tomó el valor medio de la intensidad de cada región. Además, para establecer el valor de la fluorescencia de fondo o inespecífica, en cada imagen se dibujó un ROI en una zona donde no hubiera células y se tomó el valor medio de la intensidad. De esta manera, al valor de la intensidad obtenido para cada célula se le restó el valor del fondo de esa imagen, resultando la intensidad de la señal de γ-tubulina 1. 2.11.2. Análisis de la intensidad de distintas proteínas en el centrosoma La cuantificación de proteína en el centrosoma se realizó dibujando ROIs circulares de 3,5µm diámetro centrados en el marcador de centrosoma empleado en cada experimento (por ejemplo, la proteína CP110) de los cuales se tomó el valor de la intensidad media. A la intensidad Bibliografía 138 Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., & Nigg, E. A. (2016a). Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging. The EMBO Journal, 35(19), 2152–2166. https://doi.org/10.15252/embj.201694462 Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., & Nigg, E. A. (2016b). Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging. The EMBO Journal, 35(19), 2152–2166. https://doi.org/10.15252/embj.201694462 Böhler, A., Vermeulen, B. J. A., Würtz, M., Zupa, E., Pfeffer, S., & Schiebel, E. (2021). The gammatubulin ring complex: Deciphering the molecular organization and assembly mechanism of a major vertebrate microtubule nucleator. BioEssays, 43(8), 2100114. https://doi.org/10.1002/bies.202100114 Boncompain, G., & Perez, F. (2013). The many routes of Golgi-dependent trafficking. Histochemistry and Cell Biology, 140(3), 251–260. https://doi.org/10.1007/s00418-013- 1124-7 Bornens, M. (2002). Centrosome composition and microtubule anchoring mechanisms. Current Opinion in Cell Biology, 14(1), 25–34. https://doi.org/10.1016/S0955-0674(01)00290-3 Bornens, M. (2012). The Centrosome in Cells and Organisms. Science, 335(6067), 422–426. https://doi.org/10.1126/science.1209037 Bouguenina, H., Salaun, D., Mangon, A., Muller, L., Baudelet, E., Camoin, L., Tachibana, T., Cianférani, S., Audebert, S., Verdier-Pinard, P., & Badache, A. (2017). EB1-binding– myomegalin protein complex promotes centrosomal microtubules functions. 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